WO2011043538A2 - 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 및 이의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 등에 관한 것이다. 또한 본 발명은 상기 세포밖 소포체를 이용하여 염증성 호흡기질환 및 폐암 등을 진단, 예방, 및/또는 치료하는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 호흡기질환 동물 모델을 제조하고, 상기 동물 모델을 이용하여 호흡기질환에 대한 예방 또는 치료 후보 약물의 검색 및/또는 발굴을 가능하게 하며, 호흡기질환에 대한 예방 및/또는 치료용 백신, 호흡기질환의 원인물질을 진단하는 방법, 호흡기질환의 발생 및 악화를 예방하기 위한 목적으로 실내 공기 중의 세포밖 소포체의 활성을 억제 또는 상기 세포밖 소포체를 제거하는 방법 등을 제공한다.

Description

실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물 및 이의 용도
본 발명은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물, 및 상기 세포밖 소포체를 이용하여 염증성 호흡기질환 등을 진단, 예방, 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다.
실내 공기의 질 (indoor air quality)은 건축물 (buildings)을 포함한 구조물 (structures)의 내부와 주변 공기의 질 (air quality)을 의미하며 특히, 거주자 또는 서식자의 건강 및 안락한 생활과 관련이 있다. 실내 공기에는 몸에 유해한 기체, 미세먼지, 세균, 곰팡이 등이 오염되어 있다. 유해한 기체로는 벤젠, 포름알데하이드, 펜타클로로벤젠, 부틸아세테이트, 톨루엔 크셀렌, 스틸렌 등과 같은 휘발성 유기화합물 (volatile organic chemicals, VOC), 라돈 등이 알려져 있다. 생물학적 오염물질 (biological contaminants)로는 세균, 곰팡이, 바이러스, 집먼지진드기, 바퀴, 동물의 비듬, 타액, 꽃가루 등이 포함된다. 특히 집먼지진드기, 곰팡이, 애완동물 (pet), 바퀴 (cockroach), 세균 등에서 분비되는 물질이 크기가 마이크로미터 또는 그 이하인 경우 흡입되어 면역반응을 유도하여 염증성 호흡기질환을 일으킨다.
실내 공기에는 인간, 애완동물, 집먼지진드기, 바퀴 등을 포함한 다양한 생명체의 피부, 위장관, 호흡기계 등에 서식하고 있는 여러 종류의 세균 및 곰팡이와 더불어 건축물을 포함한 구조물의 내부와 주변에 서식하거나 유입된 다양한 종류의 세균 및 곰팡이가 존재한다.
실내 공기에 서식한다고 알려진 세균으로는 바실러스(Bacillus sp.), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 스타필로코커스 호미니스(Staphylococcus hominis), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 루테올라(Pseudomonas luteola, 스트렙토마이세테스(Streptomycetes), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae), 대장균 (Escherichia coli) 등이 포함된다.
또한, 상기 실내 공기에 존재하는 다양한 세균 또는 이들에서 유래한 내독소 (lipopolysaccharide, LPS)나 펩티도글리칸 (peptidoglycan) 등에 의해 면역세포 및 폐 표피 세포에서 염증성 사이토카인의 생성이 유도됨이 알려져 있다.
한편, 그람 음성 세균은 상시 외부로 세포밖 소포체 (outer membrane vesicles)를 분비하며, 그람 음성 세균에서 분비되는 세포밖 소포체는 구형의 인지질 이중층으로 되어 있으며 그 크기는 20-200 nm 이다. 상기 세포밖 소포체는 LPS 뿐만 아니라 숙주의 염증반응을 조절할 수 있는 외막 단백질 (outer membrane protein)을 가지고 있다. 최근 본 발명자들은 그람 양성 세균이 외부로 세포밖 소포체를 분비하고, 프로테옴 분석을 통해 소포체 내에는 염증을 유도하는 단백질이 포함되어 있음을 보고한 바 있다.
염증성 호흡기질환은 크게 상기도에 발생하는 비염 및 부비동염, 하기도에 발생하는 천식 및 기관지염, 소기도에 발생하는 세기관지염, 폐실질에 발생하는 폐기종, 폐렴 등으로 분류할 수 있다. 임상적으로 기도폐색을 초래하는 질환으로, 가역적인 기도폐색을 특징으로 하는 천식과 비가역적 기도폐색을 특징으로 하는 만성 폐쇄성폐질환 (chronic obstructive pulmonary disease, COPD)으로 분류할 수 있고, 만성폐쇄성폐질환의 원인 질환으로 만성폐쇄성기관지염, 만성폐쇄성세기관지염, 폐기종 등이 포함된다. 천식의 원인물질과 관련해서 실내 공기 중에 존재하는 단백질 (알레르겐)이 중요하다고 알려져 있고, 만성폐쇄성폐질환의 원인과 관련해서 흡연과 같은 자극성 인자가 중요하다고 알려져 있다.
천식과 만성폐쇄성폐질환의 발생에 있어서 염증의 중요성은 이미 보고되어 있으나, 염증의 양상이 다르다고 알려져 있다. 천식인 경우에는 호산구성 염증이, 만성폐쇄성폐질환인 경우에는 비호산구성 또는 호중구성 염증이 중요하다고 알려져 있다. 그러나, 중증 천식환자에선 오히려 호중구성 염증이 중요하고, 특히 비가역적 기도폐색을 동반한 천식환자에서 호중구성 염증이 중요하다고 보고되었다. 특히 만성적인 폐염증의 발생에 있어서는 기도 및 폐실질에 발생하는 면역기능 이상이 중요한 것으로 알려져 있으며, 본 발명자 등은 호산구성 염증의 발생에는 Th2 면역반응이, 호중구성 염증의 발생에는 Th1 및 Th17 면역반응이 중요함을 보고한 바 있다.
또한 염증이 암을 일으킨다는 사실은 오래 전부터 제기되었고, 최근에는 장내에 서식하는 세균에서 유래한 독소에 대한 Th17 면역반응에 의해 대장암이 발생한다고 보고되었고, 위에 공생한다고 알려진 Helicobacter pylori에 의해서 만성위염뿐만 아니라 위암도 발생한다고 알려지게 되었다. 만성폐쇄성폐질환과 폐암의 병인과 관련해서 동일한 원인인자에 의해 발생하는 질병군이라는 가설이 제기되고 있는데, 최근 임상연구에서는 흡연과 상관없이 만성폐쇄성폐질환 자체가 폐암 발생의 중요한 위험인자라는 사실이 이를 뒷받침한다.
본 발명자들은, 실내 공기에는 각종 세균 등에서 분비되는 세포밖 소포체가 존재하고 상기 세포밖 소포체가 포유동물에 흡입시 염증성 호흡기질환을 일으킨다는 사실을 발견함으로써, 이에 기초하여 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체를 포함하는 조성물, 및 상기 세포밖 소포체를 이용하여 염증성 호흡기질환 등을 진단, 예방, 및/또는 치료하는 방법 등을 제공하고자 한다.
구체적으로, 본 발명은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 호흡기질환 동물 모델을 제조하고, 상기 동물 모델을 이용하여 호흡기질환에 대한 예방 또는 치료 후보 약물을 스크리닝하는 방법 등을 제공하고자 한다. 또한 본 발명은 호흡기질환에 대한 예방용 또는 치료용 백신, 호흡기질환의 원인물질을 진단하는 방법, 호흡기질환의 발생 및 악화를 예방하기 위한 목적으로 실내 공기 중의 세포밖 소포체의 활성을 억제 또는 상기 세포밖 소포체를 제거하는 방법, 실내 공기 중의 세포밖 소포체의 농도를 측정하여 호흡기질환의 발생과 관련된 실내 공기의 질을 평가하는 방법 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명의 일 측면은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물을 제공한다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물의 분비물, 꽃가루, 사람의 비듬, 꽃가루 등에서 유래할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 세균에서 분비될 수 있으며, 상기 세균은 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물의 분비물, 식물, 사람의 비듬에서 서식하는 세균일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 2종 이상의 세균에서 분비된 세포밖 소포체의 혼합물일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세균은 스타필로코커스 (Staphylococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세테스 (Streptomycetes), 및 코리네박테리움 (Corinebacterium)을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 마이크로코커스 리래 (Micrococcus lylae), 엔터로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 루테오라 (Pseudomonas luteola), 및 대장균 (Escherichia coli) 을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 곰팡이에서 분비되는 것을 포함한다. 상기 곰팡이에서 분비되는 세포밖 소포체는 실내 먼지에 서식하는 곰팡이에서 분비되는 것일 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세균 또는 곰팡이 유래 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 분리한 것일 수 있으며, 상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 자연적으로 분비되는 것 및 인공적으로 분비되는 것을 포함한다.
본 발명의 다른 측면은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 제조된 질병 모델을 제공한다.
상기 본 발명의 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 동물 모델은 마우스일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 질병은 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 기관지염, 만성폐쇄성폐질환, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암 등을 포함한다.
상기 본 발명의 투여는 비강, 구강, 및 기관(trachea)으로 투여하는 것을 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 이용하여 질병 예방 또는 치료 후보 약물을 탐색하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 질병은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의해 발생 또는 악화되는 비염, 부비동염, 비인두암, 기관지염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암 등을 포함한다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 상기 본 발명의 동물질병 모델에 후보 약물을 투여하는 것을 특징으로 한다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 체외에서 세포에 처리할 때 후보 약물을 처리하는 것을 특징으로 한다. 상기 세포는 염증세포, 상피세포, 및 섬유모세포 등을 포함한다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 탐색 방법은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체와 함께 후보 물질을 투여한 후, 염증 관련 매개체의 수준을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 질병을 예방 또는 치료하기 위하여 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 백신을 제공한다.
상기 본 발명의 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 질병은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 폐암 등을 포함한다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질병은 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 부비동염, 기관지확장증, 폐렴 등을 포함한다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 형질전환된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 감염 예방 또는 치료용 백신을 제공한다.
상기 본 발명의 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 감염은 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 감염을 포함하며, 일 예로 병원 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 감염을 들 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 감염은 세균 또는 곰팡이에 의한 부비동염, 기관지염, 기관지확장증, 폐렴, 및 패혈증 등을 포함한다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 형질전환된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 것을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시킬 목적으로 약물을 병용 투여하여 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 이용하여 상기 세포밖 소포체에 의한 질병의 발생 또는 악화에 관련된 원인인자를 진단하는 방법을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 이용하여 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 감염의 발생 또는 악화에 관련된 원인인자를 진단하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 세포밖 소포체에 의한 질병은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암 등을 포함한다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질병은 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 부비동염, 기관지확장증, 및 폐렴 등을 포함한다.
상기 세균 또는 곰팡이에 의한 감염은 부비동염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 폐렴, 및 패혈증 등을 포함한다.
상기 본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 진단방법은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 포함된 유전물질의 염기서열을 분석하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 유전물질은 16S rRNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 진단방법은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 포함된 단백질을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예에 따르면, 상기 진단방법은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 대한 면역반응을 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 면역반응 측정은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 대한 항체를 측정하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 진단은 실내 먼지를 이용하여 수행될 수 있다. 또한 상기 진단은 객담에서 유래한 시료, 흉수에서 유래한 시료, 콧물에서 유래한 시료, 소변에서 유래한 시료, 및 혈액에서 유래한 시료 등을 이용하여 수행될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은, 질병의 발생 및 악화를 예방하기 위한 목적으로 실내 공기 중의 세포밖 소포체의 활성을 억제, 또는 상기 세포밖 소포체를 제거하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 질병은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암 등을 포함한다.
상기 세포밖 소포체의 활성 제거는 세포밖 소포체에 열을 처리하거나 세포밖 소포체에 특이적으로 작용하는 화학물질을 처리하여 수행될 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 화학물질은 세포밖 소포체 내 단백질, LPS (lipopolysaccharide), 및 펩티도글리칸의 활성을 억제하는 물질 등을 포함하며, 상기 LPS 활성 억제 화학물질은 폴리믹신 B (polymyxin B)일 수 있다.
상기 본 발명의 일 구현예로, 상기 세포밖 소포체의 활성을 제거하는 장치를 이용할 수 있다. 상기 장치는 상기 세포밖 소포체에 열을 처리하거나 세포밖 소포체에 특이적으로 작용하는 화학물질을 처리하는 방법 등을 이용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 본 발명의 다른 구현예로 상기 세포밖 소포체를 제거하는 장치를 이용할 수 있다. 상기 장치는 미세필터를 포함할 수 있으며, 그 구멍의 크기(pore size)는 10 nm 내지 200 nm 일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 측면은 호흡기질환의 발생 또는 악화와 관련된 실내 공기의 질을 평가하는 방법으로, 실내 공기 중의 세포밖 소포체의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 일 구현예로, 상기 세포밖 소포체의 농도 측정은 세포밖 소포체의 유전물질을 측정함으로써 수행될 수 있으며, 상기 유전물질은 16S rRNA 일 수 있다.
상기 본 발명의 다른 구현예로 상기 세포밖 소포체의 농도 측정은 세포밖 소포체의 단백질을 측정함으로써 수행될 수 있다.
상기 본 발명의 또 다른 구현예로 상기 세포밖 소포체의 농도 측정은 현미경으로 세포밖 소포체의 수를 측정함으로써 수행될 수 있으며, 상기 현미경으로 고해상도 광학현미경 또는 전자현미경을 이용할 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 질병을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
상기 본 발명의 세포밖 소포체는 전술한 바와 같다.
상기 본 발명의 질병은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암 등을 포함한다.
상기 본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 질병은 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 부비동염, 기관지확장증, 폐렴, 및 패혈증 등을 포함한다.
상기 본 발명의 투여는 피하주사 및 점막투여 등을 포함한다.
본 발명자들은 실내 공기 중에 세균 등에서 유래하는 세포밖 소포체가 존재하고, 상기 세포밖 소포체(특히, 그람 음성 세균유래 세포밖 소포체)가 흡입되었을 때, 폐에 Th17 및/또는 Th1 면역반응을 유도하고, 이로 인해 호중구성 폐염증이 발생하여 중증 천식과 만성폐쇄성폐질환 등의 호흡기질환이 발생한다는 사실을 발견하고 이에 기초하여 본 발명을 완성하였으며, 따라서 본 발명의 실내 공기유래 세포밖 소포체를 응용하여 다음과 같은 다양한 효과를 얻는 것이 가능하다.
구체적으로, 본 발명은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 호흡기질환 동물 모델을 제조하고, 상기 동물 모델을 이용하여 호흡기질환에 대한 예방 또는 치료 후보 약물을 검색 및 발굴하는 것을 가능하게 한다. 즉, 질병을 예방 또는 치료하는 약물을 개발하기 위해서는 정확한 원인물질을 파악하는 것이 매우 중요하다. 예를 들어, 원인물질을 체외에서 세포에 투여하는 과정에서 후보 약물을 처리하여 효능을 검증할 수 있고, 상기 동물모델에 후보 약물을 투여하여 효능을 검증할 수 있다. 따라서 본 발명은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 질병을 예방 또는 치료하는 약물을 개발하기 위하여 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체를 이용한 체외 스크리닝 시스템 및/또는 동물 모델을 통해 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의해 발생하는 호흡기질환을 예방 또는 치료하기 위한 약물을 효율적으로 발굴할 수 있게 한다.
또한 본 발명은 중증천식, 만성폐쇄성폐질환, 폐암 등의 호흡기질환의 원인인자를 정확히 진단하는 것을 가능하게 한다. 즉, 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체의 유전물질 염기서열 분석, 단백질 분석, 또는 면역반응 측정을 통하여 호흡기질환의 원인인자를 진단하는 방법으로의 응용이 가능하다.
질병의 원인인자를 정확히 파악하는 것은 질병을 예방 또는 치료할 수 있는 백신 개발에 필수적이다. 바이러스성 감염질환인 경우에 원인 바이러스를 약독화한 형태로 체내로 투여함으로써 바이러스에 대한 면역반응을 유도하여 예방 백신을 개발하여 사용하고 있으며, 현재 바이러스에 의해 발생하는 질환을 예방 백신으로 효율적으로 예방할 수 있게 되었다. 본 발명은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체가 호흡기질환의 원인인자라는 사실을 통해 세포밖 소포체를 응용하여 체내에서 일어나는 면역반응을 조절함으로써 효율적인 백신 개발을 가능하게 한다.
또한 본 발명은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체가 호흡기질환의 원인인자라는 사실을 통해 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체의 농도를 측정함으로써 호흡기질환의 발생 또는 악화와 관련된 실내 공기의 질을 평가하는 것을 가능하게 한다. 이에 더하여, 열처리 또는 화학물질 처리가 가능한 공기 정화장치 등을 통하여 실내 공기 중의 세포밖 소포체의 활성을 억제하거나 병원성 세포밖 소포체를 제거함으로써 호흡기질환의 발생 및 악화를 예방 또는 치료하는 것이 가능하다.
도 1은 채집한 실내 먼지에서 세포밖 소포체를 분리하는 과정을 나타낸 것이다.
도 2는 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체의 모양과 크기를 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 실내 먼지를 마우스의 비강으로 투여하여 염증성 호흡기 질환(폐염증)을 유도하는 과정을 나타낸 것이다.
도 4는 실내 먼지를 마우스의 비강으로 투여 시 기관지폐포세척액(BAL fluid)에서 염증세포 수를 측정한 것이다.
도 5는 실내 먼지를 마우스의 비강으로 투여하여 염증성 호흡기 질환(폐염증) 유도 시, 폐조직에서 CD4+ T 세포에서의 사이토카인 발현을 intracellular cytokine staining으로 측정한 결과이다.
도 6은 마우스 대식세포에 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체(Dust-EV)와 수용성 성분(Dust-soluble)을 처리하여, 분비된 사이토카인 양을 엘라이자 방법으로 측정한 결과이다.
도 7은 마우스 대식세포에 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체(Dust-EV)를 처리 시 세포밖 소포체를 투여하는 용량이 증가함에 따라 TNF-α와 IL-6의 분비량이 증가하는 것을 나타낸 결과이다.
도 8은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체(Dust-EV)에 polymyxin B (PMB) 또는 열(heat) 처리한 후 마우스 대식세포에 투여하였을 때, TNF-α와 IL-6의 분비량을 측정한 결과이다.
도 9는 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체(Dust-EV)에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하기 위한 프로토콜이다.
도 10은 도 9의 프로토콜에 따라 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체(Dust-EV)에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하기 위하여, 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액 (BAL fluid)에서 염증세포 수를 측정한 것이다.
도 11은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체(Dust-EV)를 반복 투여하여 유도한 in vivo 후천면역반응 및 이의 결과로 발생하는 폐염증 발생에 세포밖 소포체 및 소포체내 LPS의 역할을 평가하기 위한 프로토콜이다.
도 12는 도 11의 프로토콜에 따라 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체(Dust-EV) 및 소포체에 polymyxin B (PMB) 처리에 의한 폐염증의 발생을 평가한 것으로써, 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액(BAL fluid)에서 염증세포 수를 나타낸 것이다.
도 13은 도 11의 프로토콜에 따라 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체(Dust-EV) 및 소포체에 polymyxin B (PMB) 처리에 의한 후천면역반응을 평가하기 위하여, 국소 림프절에서 면역세포를 분리하여 면역세포에서 IFN-γ와 IL-17의 발현양상을 intracellular cytokine staining으로 평가한 결과를 나타낸 것이다.
도 14는 도 11의 프로토콜에 따라 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체(Dust-EV) 및 소포체에 polymyxin B (PMB) 처리 시, 실내 먼지에서 분리한 소포체에 대한 혈청 내 특이 항체를 ELISA 방법으로 측정한 결과이다.
도 15는 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체(Dust-EV)에 대장균의 16s rRNA 및 대장균 유래 소포체(E.coli-OMV) 특이 항체에 반응하는 단백질이 존재함을 보여주는 결과이다.
도 16은 대장균유래 세포밖 소포체 1회 비강 투여 시 염증성 사이토카인의 분비를 기관지폐포세척액 (BAL fluid)에서 측정한 결과이다.
도 17은 대장균유래 소포체(EC-EV)를 3주간 반복적으로 투여하였을 때 발생하는 폐염증을 평가하기 위한 프로토콜이다.
도 18은 대장균유래 소포체(EC-EV)를 반복적으로 투여 시 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액 (BAL fluid)에서 염증세포 수를 나타낸 것이다.
도 19는 고용량의 대장균 유래 세포밖 소포체(EC-EV)를 4주간 반복 투여하였을 때 조직학적인 변화를 평가하기 위한 프로토콜이다.
도 20은 도 19의 프로토콜에 따라 대장균 유래 소포체(EC-EV) 투여 시, 폐조직에서 폐포의 파괴를 특징으로 하는 폐기종이 발생함을 보여주는 결과이다.
도 21은 집먼지진드기에 존재하는 세포밖 소포체를 분리하기 위한 프로토콜이다.
도 22는 집먼지진드기에서 분리한 세포밖 소포체의 모양과 크기를 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)과 동적 광산란법 (dynamic light scattering, DLS) 으로 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 23은 마우스 대식세포에 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체 (HDM-EV) 처리 시 사이토카인 양을 측정한 결과이다.
도 24는 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체(HDM-EV)에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하기 위하여, 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액 (BAL fluid)에서 염증세포 수를 나타낸 그림이다.
도 25는 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체(HDM-EV)에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하기 위하여, 기관지폐포세척액(BAL fluid)에서 사이토카인의 생성을 측정한 결과이다.
도 26은 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체(HDM-EV)에 의한 in vivo 후천면역반응을 평가하기 위하여, 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액(BAL fluid)에서 염증세포 수를 나타낸 그림이다.
도 27은 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체(HDM-EV)에 의한 in vivo 후천면역반응을 평가하기 위하여, 기관지폐포세척액에서 Th17 세포에서 분비되는 IL-17의 생성을 측정한 결과이다.
도 28은 실내 먼지에서 세균과 곰팡이를 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 29는 실내 먼지에 서식하는 세균을 분리하여 동정하기 위한 과정을 나타낸 것이다.
도 30은 포도상구균유래 세포밖 소포체(S-EV) 및 열처리한 소포체에 의한 in vitro 선천면역반응을 평가하기 위하여, 마우스 대식세포에 상기 세포밖 소포체 투여 시 TNF-α와 IL-6를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 31은 포도상구균유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하기 위한 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 32는 도 30의 프로토콜에 따라 포도상구균유래 세포밖 소포체(S-EV)를 비강으로 투여하고 기관지폐포세척액(BAL fluid)에서 염증세포 수를 측정한 결과이다.
도 33은 도 30의 프로토콜에 따라 포도상구균유래 세포밖 소포체(S-EV)에 의한 IL-6의 분비를 기관지폐포세척액 (BAL fluid)에서 측정한 결과이다.
도 34는 포도상구균유래 세포밖 소포체에 의한 면역반응의 발생에 소포체 내 단백질 또는 열에 저항하는 성분의 역할을 평가하기 위한 프로토콜을 나타낸 것이다.
도 35는 도 33의 프로토콜에 따라 포도상구균유래 세포밖 소포체(S-EV)에 열처리를 한 후 비강 투여하였을 때, 기관지폐포세척액 (BAL fluid)에서 염증세포 수를 측정한 결과이다.
도 36은 도 33의 프로토콜에 따라 포도상구균유래 세포밖 소포체(S-EV)에 열처리를 한 후 비강 투여하였을 때, 기관지폐포세척액(BAL fluid)에서 IL-6의 양을 엘라이자방법을 통해 측정한 결과이다.
도 37은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 1 μg을 1주일 간격으로 3회 복강 투여하는 과정에서 마우스 혈액 내에 소포체 특이 항체의 양을 측정한 그래프이다.
도 38은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IFN-g 양을 나타낸 그래프이다.
도 39는 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 백신을 투여한 마우스 비장세포에 체외에서 대장균유래 세포밖 소포체 처리시 분비되는 IL-17 양을 나타낸 그래프이다.
도 40은 대장균(EC) 감염에 의한 패혈증 모델에서 마우스 치사율을 나타난 결과이다.
도 41은 대장균(EC) 복강 투여에 의한 패혈증 모델에서 패혈증으로 인한 치사율에 대장균유래 세포밖 소포체 (EC_EV) 백신의 효능을 나타낸 그래프이다.
도 42는 대장균(EC) 복강 투여에 의한 패혈증 모델에서 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 접종 유무에 따른 혈액 내 대장균 수(CFU)를 나타난 그래프이다.
도 43은 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV)를 접종한 마우스에서 고용량의 대장균유래 세포밖 소포체 (5 μg)를 반복적으로 (3회) 복강 투여한 후 6 시간에 마우스 혈청에서 IL-6를 측정한 결과이다.
실내 공기에 존재하는 유해물질을 흡입하였을 때, 호흡기질환이 발생한다. 알레르기반응은 면역학적 과민반응을 특징으로 하고, 단백질을 단독으로 흡입하였을 때 면역관용이 유도되지만, 선천면역반응에 의해 단백질에 대한 면역관용 대신 면역반응을 유도하는 물질이 단백질과 함께 흡입되었을 때 단백질에 대한 기억을 특징으로 하는 후천면역반응 (감작)이 발생한다. 단백질에 대한 감작이 유도되면, 낮은 농도의 단백질이 흡입되어도 단백질에 대한 면역반응으로 염증을 유발할 수 있다. 실내 공기에 존재하는 유해물질 중에서 기체인 경우에는 기체 자체의 독성에 의해 염증이 유도되지만, 후천면역반응에 의한 염증을 유도하지 않는다. 반면 실내 공기에 존재하는 생물학적 오염물질은 선천면역반응을 유도하는 물질과 단백질을 같이 갖고 있어 선천면역반응과 후천면역반응을 동시에 유도할 수 있는 특징이 있다. 그러나, 아직까지 실내 공기에 세균 등에서 유래하는 세포밖 소포체가 존재하거나, 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체가 호흡기질환의 원인물질이라는 사실이 보고된 적은 없다. 본 발명자들은 실내 공기 중에 세균 등에서 유래하는 세포밖 소포체가 존재하고, 이를 흡입하였을 때 호흡기질환이 유도된다는 사실을 처음으로 밝혀내어 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
한편, 염증은 호산구의 침윤 여부에 따라 호산구성 및 비호산구성 (또는 호중구성) 염증으로 구별할 수 있다. 만성 염증은 대개 단백질에 대한 과민반응 (후천면역반응)을 특징으로 하는 면역기능 이상에 의해 발생하고, 호산구성 염증은 단백질에 대한 Th2 면역반응, 호중구성 염증은 Th17 및/또는 Th1 면역반응의 결과로 발생한다.
본 발명자들은 실내 먼지를 흡입하였을 때 호중구성 염증이 유도되고, 실내 먼지에 존재하는 성분 중에서 세포밖 소포체가 호중구성 염증을 일으키는 주 원인인자이고, 세포밖 소포체의 활성이 그람 음성 세균에서 유래하는 내독소 (endotoxin 또는 lipopolysaccharide, LPS)의 활성을 길항하는 약물 (polymyxin B)을 처리하였을 때 억제된다는 사실에 기초하여, 실내 공기에 존재하는 그람 음성 세균유래 세포밖 소포체가 호중구성 염증반응을 특징으로 하는 호흡기질환을 일으키는 원인물질이라는 사실을 최초로 규명하였다.
호중구성 폐염증은 비가역적 기도폐색을 동반한 중증천식과 만성폐쇄성폐질환의 발생에 중요한 병태생리이다. 흡연과 상관없이 호중구성 염증을 특징으로 하는 만성폐쇄성폐질환은 폐암 발생의 중요한 위험인자로서, 실제로 만성폐쇄성폐질환자의 1/3은 폐암으로 사망하게 된다. 또한, Th17 면역반응 및 이로 인한 호중구성 염증에 의해 대장암이 발생한다는 동물실험결과가 최근에 보고되었다. 이는 폐에 발생하는 Th17 면역반응 및/또는 호중구성 염증은 중증천식과 만성폐쇄성폐질환의 병인에 중요할 뿐만 아니라, 폐암 발생과도 밀접한 관련이 있음을 의미한다.
본 발명은 실내 공기 유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물, 및 상기 세포밖 소포체를 이용하여 염증성 호흡기질환 등을 진단, 예방, 및/또는 치료하는 방법 등을 제공한다.
본 발명에서, "실내"란 건축물 (buildings)을 포함한 구조물 (structures)의 내부와 주변을 포함하는 의미이며, "실내 공기"란 실내 먼지뿐만 아니라, 실내에 서식하는 집먼지진드기, 바퀴, 애완동물, 식물, 사람 등에서 분비되는 물질을 포함하는 의미이다.
본 발명에서, "실내 공기유래 세포밖 소포체"란 건축물을 포함한 구조물의 내부와 주변에 있는 공기에 존재하는 세포밖 소포체를 포함하는 의미하며, 예를 들어 실내 공기유래 세포밖 소포체는 실내 공기에 서식하는 세균에서 분비된 세포밖 소포체, 또한 실내에 서식하는 집먼지진드기, 바퀴, 애완동물, 식물, 사람 등에 존재하는 세균이 분비하여 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체를 포함하며, 크기가 원래의 세포보다 작은 것을 특징으로 하나, 이에 제한되는 것은 아니다.
실내 공기에는 여러 가지 세균과 곰팡이가 서식할 뿐만 아니라 인간, 애완동물, 집먼지진드기, 바퀴 등을 포함한 다양한 생명체의 피부, 소화기, 호흡기 등에 서식하고 있는 여러 종류의 세균 및 곰팡이와 더불어 건축물을 포함한 구조물의 내부와 주변에 서식하거나 유입된 다양한 종류의 세균과 곰팡이가 존재한다. 실내 특히, 침대 매트리스와 카펫트 등에는 많은 양의 먼지가 존재하고 먼지에는 다양한 세균과 곰팡이가 서식할 뿐만 아니라 집먼지진드기와 같은 동물에서 분비되는 물질이 존재한다. 진공청소기를 이용하여 실내 먼지를 얻은 후 거즈를 이용하여 머리카락 등 크기가 큰 물질을 제거한 후 배양하였다. 이때 실내 먼지에 다수의 곰팡이와 세균이 배양되었다. 또한, 크기가 큰 물질을 제가한 실내 먼지를 생리식염수 (phosphate buffer saline, PBS)에 녹인 다음 여러 번의 원심분리과정을 거쳐 세포밖 소포체를 추출하였다. 투과전자현미경 사진을 통해 실내 공기에서 분리한 세포밖 소포체는 50-100 nm 크기를 가진 구형 모양임을 확인하였다.
또한 실내에 있는 먼지가 염증성 호흡기 질환을 발생시키는 지를 평가하기 위해 C57BL/6 마우스에 먼지를 3주 동안 비강으로 투여하였다. 먼지를 마지막으로 비강투여 한 다음 24시간 경과 후 평가하였을 때, 마우스의 기관지폐포세척액 (bronchoalvelolar lavege fluid, BALF)에서 염증세포 수가 증가하고, 특히 호중구의 수가 눈에 띄게 증가하는 것이 관찰되었다. 상기 결과로부터 실내에 있는 먼지가 호중구 침윤을 특징으로 하는 염증성 호흡기 질환(폐염증)을 유도함을 확인하였다.
상기의 호흡기질환을 일으키는 면역학적 기전을 평가하기 위하여 T 세포에서 발현되는 사이토카인을 플로우 사이토메트리(Flow cytometry) 방법으로 평가하였다. T 세포에 의한 후천면역반응은 크게 IFN-γ를 분비하는 Th1 세포, IL-4, IL-5, IL-13 등을 분비하는 Th2 세포, 및 IL-17을 분비하는 Th17 세포에 의한 면역반응으로 나눌 수 있다. 먼지에 의해 발생한 호중구성 폐염증은 주로 IL-17을 생성하는 CD4+T 세포 (Th17 세포)와 IFN-γ를 분비하는 Th1 세포에 의해 매개되는 염증반응임을 알 수 있었다. Th1 및 Th17 면역반응은 기도 및 폐실질에 호중구성 염증을 특징으로 하는 염증성 호흡기질환 (천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 폐렴 등) 및 폐암의 발생에 중요한 역할을 하는데, 특히 Th1 염증은 폐기종의 발생에 중요하고, Th17 염증은 폐암의 발생에 중요하다고 알려져 있다.
실내 먼지에 의한 염증반응 유도와 관련하여 실내 먼지에 존재하는 세포밖 소포체와 수용성 성분의 역할을 평가하기 위하여 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 먼지에서 분리한 세포밖 소포체와 수용성 인자를 투여하였을 때, TNF-alpha의 분비는 모두에서 증가하였으나, IL-6의 분비는 주로 세포밖 소포체를 투여한 경우에 증가하였다. 이는 IL-6을 기반으로 한 면역반응 및 염증의 발생에 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체가 중요함을 의미한다.
실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체는 실내 공기에 서식하고 있는 세균 또는 인간, 애완동물, 집먼지진드기, 바퀴 등을 포함한 다양한 생명체에 서식하거나 건축물을 포함한 구조물의 내부와 주변에 서식하는 여러 종류의 세균에 의해 분비될 수 있다. 이러한 세포밖 소포체는 세균 단백질, LPS, 펩티도글리칸 등과 같은 물질을 갖고 있어, 염증반응을 유도할 수 있다.
실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 in vitro 선천면역반응을 평가하기 위해 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체를 처리하였다. 대식세포는 염증을 유도할 수 있는 TNF-α 및 IL-6 등을 분비하며 상기 세포밖 소포체 처리시 TNF-α 및 IL-6의 양이 세포밖 소포체의 용량에 비례하여 증가됨을 알 수 있었다.
IL(interleukin)-6는 염증반응시 초기에 분비되는 염증성 사이토카인으로 초기 염증반응의 척도역할을 하며, Th17 cell 면역반응에 의해 호중구성 염증을 유도하는데 중요한 매개체로 알려져 있다. 또한 IL-6는 체내 세포에서 STAT3 signaling을 증가시켜 폐세포의 증식, 혈관신생, 면역반응 억제 등을 통해 폐암의 발생과 관련이 되고, 뿐만 아니라 IL-6는 항원에 대한 T 세포의 후천면역반응의 발생에서 naive T 세포가 Th17 세포로 분화하는데 중요한 역할을 한다.
따라서 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체가 대식세포에서 IL-6의 양을 증가시킨다는 사실은 상기 세포밖 소포체가 염증반응을 유도하여 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 폐렴 등의 염증성 호흡기질환뿐만 아니라 폐암 등을 발생시킬 수 있음을 의미한다.
상기에 언급한 바와 같이 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체는 염증반응을 유도할 수 있는 여러 단백질과 LPS 등의 물질을 포함할 수 있으므로 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의해 유도되는 염증반응에서 상기 물질들의 역할을 평가하였다.
Polymyxin B는 LPS의 작용기인 lipid A에 반응하여 LPS의 기능을 억제하는 역할을 한다. 이에 근거하여, 마우스 대식세포에 먼지에서 분리한 세포밖 소포체와 polymyxin B를 함께 처리했을 때, 세포밖 소포체에 의해 유도되는 IL-6 및 TNF-α의 분비가 저해되었는데, 이는 그람 음성 세균에서 유래한 세포밖 소포체가 상기 매개체를 분비하는데 중요함을 의미한다.
한편, 세포밖 소포체에는 여러 가지 단백질이 존재하는데 소포체에 존재하는 단백질의 역할을 평가하기 위하여 100℃로 20분 동안 가열한 세포밖 소포체를 마우스 대식세포에 처리하였다. 상기 소포체에 열처리를 한 경우, TNF(Tumor necrosis factor) -alpha의 분비는 감소하였으나, IL-6의 분비는 오히려 증가하였다. 이는 TNF-alpha의 분비에는 소포체 내 단백질이 중요하지만, IL-6의 분비에는 열에 내성을 갖는 소포체 성분이 중요함을 의미한다.
또한 실내 공기에서 분리한 세포밖 소포체를 실험동물에게 투여하여 호흡기질환 동물 모델을 제조할 수 있다. 이와 관련하여, 먼지에서 분리한 세포밖 소포체를 마우스에 투여하여 폐염증의 발생 및 IL-6의 분비에 대한 영향을 평가하였다. 다양한 농도의 세포밖 소포체를 마우스의 기도로 투여하였을 때 농도에 따라 염증세포의 유입이 증가됨을 확인하였고, 세포밖 소포체를 투여한 마우스에서 IL-6의 생성량이 증가하였다. 상기 결과는 in vitro 실험에서 소포체에 의해 염증세포에서 IL-6 분비가 증가되는 현상이 in vivo 시스템에서도 재현됨을 의미한다.
실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체를 반복적으로 투여하였을 때 염증성 호흡기질환의 발생여부를 평가하였다. 소포체를 3주간 기도로 투여하였을 때 호중구성 염증이 발생하였다. 반면, Polymyxin B와 소포체를 같이 투여하였을 때에는 염증이 현저히 억제되는 것으로 나타났다. 이는 염증의 발생에 그람 음성 세균에서 유래한 세포밖 소포체가 중요함을 의미한다.
또한, 폐염증의 발생에 관여하는 면역학적 병인을 평가한 결과, 먼지에서 분리한 소포체를 투여한 경우에는 폐조직 내 IFN-γ 및 IL-17을 발현하는 T 세포가 현저히 증가하였으며, polymyxin B를 상기 소포체와 같이 투여한 경우에는 상기 세포의 침윤이 현저히 감소하였다. 상기 결과는 먼지에 존재하는 세포밖 소포체에 의해 발생하는 호중구성 폐염증이 Th1 및 Th17 면역반응에 의해 유도되고, 이의 발생에는 소포체내 LPS 성분이 중요한 역할을 함을 의미한다.
또한, 실내 공기에서 유래한 세포밖 소포체 특이 항체를 측정한 결과, 소포체를 투여한 경우 소포체 특이 IgG1 및 IgG2a 항체가 유의하게 증가하였고, 이는 polymyxin B를 소포체와 같이 투여한 경우에는 현저히 감소하였다. 상기 결과는 실내 먼지에 존재하는 세포밖 소포체가 기도로 흡입되었을 때 혈청 내 소포체 특이 항체가 형성되고, 이의 생성에는 소포체내 LPS 성분이 중요한 역할을 함을 의미한다.
대장균은 그람 음성 세균으로서 장내에 존재하는데, 실내 먼지에 대장균이 존재하고, 대장균이 세포밖 소포체를 분비하는 것이 보고된 바 있다. 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체에 대장균 유래 세포밖 소포체가 존재하는지를 평가하였다. 대장균 유래 세포밖 소포체에 특이적으로 존재하는 16S rRNA에 대한 primer로 유전형을 분석하였을 때, 양성소견을 보였다. 또한, 대장균 유래 세포밖 소포체에 대한 항체를 만들고, 이를 이용하여 먼지에서 분리한 세포밖 소포체 단백질에 대한 Western Blot을 시행하였을 때, 먼지에서 분리한 세포밖 소포체 내 단백질이 대장균 유래 소포체 특이 항체와 결합하였다. 상기 결과는 실내 먼지에는 대장균 유래 세포밖 소포체가 존재함을 의미한다. 대장균은 주로 대장에 서식하는 균으로써 집먼지진드기, 바퀴, 애완동물, 사람 등의 장에 서식하면서 지속적으로 세포밖 소포체를 분비한다. 이는 집먼지진드기 등이 대변을 통해 대장균유래 세포밖 소포체를 지속적으로 분비함을 의미한다.
대장균 유래 세포밖 소포체를 1회 기도로 투여하여 염증매개체 분비를 체내에서 평가하였을 때, 세포밖 소포체의 투여용량에 비례하여 TNF-alpha와 IL-6의 분비가 증가하였다.
대장균 유래 세포밖 소포체를 반복 투여하였을 때 염증성 호흡기질환이 발생하는 지를 평가하기 위하여, 3주간 일주일에 2회씩 비강 투여하였을 때, 기관지폐포세척액에서 염증세포의 수가 대장균 유래 세포밖 소포체의 투여용량에 의존적으로 증가하였다.
상기의 방법에서 고용량 (100 ng)의 세포밖 소포체를 4주간 반복 투여하여 폐기종의 발생을 평가하였을 때, 세포밖 소포체를 투여한 경우에 페기종이 발생하였다. 이는 실내 먼지에 대장균 유래 세포밖 소포체와 같은 병원성 소포체가 높은 농도로 존재하여 이를 흡입하였을 때, 비가역적 기도폐색을 초래하는 폐기종이 유도됨을 의미한다.
실내 먼지 유래 세포밖 소포체는 먼지에 존재하는 여러 세균에 의해 생성될 수도 있고, 실내 공기에 존재하는 집먼지진드기, 바퀴, 인간, 애완동물 등을 포함한 다양한 생명체에 서식하는 세균이 세포밖 소포체를 분비할 수 있다.
본 발명자들은 실내 먼지에 서식하는 집먼지진드기에서 세포밖 소포체를 분리하였다. 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체에 의한 in vitro 면역반응을 평가하기 위하여, 세포밖 소포체를 마우스 대식세포에 처리하였다. 대식세포에서 TNF-alpha와 IL-6의 분비가 소포체의 농도에 비례하여 증가되었다. 또한, 소포체에 의해 분비되는 상기의 염증매개체는 LPS를 길항하는 polymyxin B 처리에 의해 억제되었다. 이는 집먼지진드기에서 유래하는 세포밖 소포체가 호흡기질환을 유도할 수 있고, 이에는 그람 음성 세균에서 분비된 세포밖 소포체가 포함되어 있음을 의미한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 집먼지진드기에서 유래하는 세포밖 소포체는 in vitro 실험에서 선천면역반응을 유도함을 알 수 있었다. 이를 in vivo 시스템에서 재현됨을 평가하기 위해 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체를 1회 마우스의 기도로 투여하여 선천면역반응을 평가하였다. 세포밖 소포체의 농도에 의존적으로 폐에 염증세포 침윤이 증가하였고, 이와 함께 염증매개체인 TNF-γ 및 IL-6의 분비도 증가하였다.
상기 in vivo 시스템에서의 선천면역반응결과를 토대로, 집먼지진드기유래 세포밖 소포체를 반복적으로 흡입 투여하였을 때 폐염증의 발생 여부를 평가한 결과, 집먼지진드기유래 세포밖 소포체를 3주간 투여하였을 때 호중구성 폐염증이 유도되었고, 이와 함께 IL-17 분비도 증가되었다.
상기 결과로부터, 집먼지진드기에서 유래하는 세포밖 소포체에 의해 호중구성 폐염증이 발생하고, 이는 주로 Th17 면역반응에 의해 매개되는 현상임을 알 수 있다.
본 발명자들은 실내 먼지에 서식하는 세균을 분리, 그람 양성 세균의 존재를 동정하였다. 그 결과 그람 양성 세균으로 포도상구균 (Staphylococcus aureus, S.aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis) 등이 동정되었다.
포도상구균은 그람 양성 세균으로서 최근에 본 발명자들이 세포밖 소포체를 분비함을 최초로 보고한 바 있다. 포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 in vitro 면역반응을 평가하기 위하여, 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 마우스 대식세포에 처리하였다. 포도상구균 유래 소포체에 의하여 대식세포에서 TNF-alpha와 IL-6의 분비가 증가되었다. 상기 결과는 포도상구균 유래 세포밖 소포체가 염증성 호흡기질환 및 폐암을 유도할 수 있음을 시사한다.
상기에서 살펴본 바와 같이, 포도상구균에서 유래하는 세포밖 소포체는 in vitro 실험에서 선천면역반응을 유도함을 확인하였다. 이를 in vivo 시스템에서 확인하기 위해 서로 다른 농도 (1 μg, 10 μg) 의 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 마우스의 기도로 투여하였다. 세포밖 소포체의 투여량이 증가함에 따라 마우스의 폐로 유입된 염증세포가 증가하였고 특히 호중구의 과도한 유입을 확인할 수 있었다. 기관지폐포세척액에서 IL-6의 분비량 역시 세포밖 소포체의 농도가 증가함에 따라 증가하였다.
상기 결과로부터, 포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의해 폐염증이 발생함이 확인되었으며, IL-6 에 의한 Th17 후천면역반응과의 관련성도 예상할 수 있다.
이에 더하여, in vivo 시스템에서의 포도상구균 유래 세포밖 소포체 내 단백질의 역할을 확인하기 위해 열처리한 세포밖 소포체를 마우스의 기도로 투여하였다. 이때, 폐암 및 단백질 특이 Th17 후천면역반응을 일으키는데 핵심 역할을 하는 IL-6의 생성량이 모두 감소함을 확인하였다. 상기 결과로부터, 먼지 흡입에 의해 발생하는 Th17 면역반응에 의한 폐염증 발생에 있어서 포도상구균 유래 세포밖 소포체 내의 단백질은 IL-6의 생성을 증가시키는 역할을 한다는 것을 알 수 있다.
질병의 원인인자를 규명함은 원인인자를 이용한 면역조절을 가능하게 한다. 본 발명자들은 실내 공기에 존재하는 대장균유래 세포밖 소포체가 흡입되었을 때 염증성 호흡기질환이 유발됨을 확인하였다. 대장균유래 세포밖 소포체를 저 용량으로 주사하였을 때 세포밖 소포체 특이 항체가 형성되고, 소포체에 대한 특이 T 세포반응으로 IFN-γ 과 IL-17을 분비하는 Th1 및 Th17 면역반응이 유도되었다. 이에, 대장균유래 세포밖 소포체를 백신으로 하여 미리 주사한 후, 대장균 감염을 유도하였을 때, 대장균 감염이 현저히 억제되었다. 또한, 상기 소포체 백신을 미리 투여하였을 때, 대장균유래 세포밖 소포체의 혈관 흡수에 의해 일어나는 염증매개체 분비가 유의하게 억제되었다. 이는 세균유래 세포밖 소포체를 주사함으로써 면역반응을 유도하고, 이를 통해 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 질병뿐만 아니라 실내 공기에 존재하는 세균에 대한 감염을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 실내 먼지에서 세포밖 소포체 추출 및 특성 규명
본 발명자들은 실내 공기에 세포밖 소포체가 존재하는지 여부를 확인하기 위해 실내 먼지에서 세포밖 소포체를 분리, 동정하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 진공청소기를 사용해 특정 주거지의 침구에 존재하는 먼지를 수거하였다. 진공청소기의 필터 내 존재하는 먼지를 깨끗한 유리병에 옮겨 담고 질량을 측정하였다. 실내 먼지 5 g을 200 ml PBS가 들어있는 비커에 4℃, 12시간 동안 녹여내었다. 이후 일차적으로 거즈를 이용하여 큰 이물질들을 걸러내고, 걸러져 나온 용액을 고속원심분리 튜브 (high speed centrifuge tube)에 나눠 담은 후, 4℃, 10,000 x g에서 15분 동안 고속원심분리 (high speed centrifugation)를 연속으로 2번 수행하였다. 180 ml 가량의 상층액을 구멍 크기가 0.45 μm인 멤브레인 필터 (membrane filter)를 1회 통과 시킨 후, 70 ml 용량의 초원심분리 튜브 (ultracentrifuge tube)에 나눠 담고 4℃, 100,000 x g에서 4시간 동안 초원심분리 (ultracetrifugation)를 하였다. 상층액은 버리고 튜브 아래에 존재하는 침전물을 PBS로 녹여 세포밖 소포체를 추출하였다.
실내 먼지 유래 세포밖 소포체 특성 규명을 위한 세포밖 소포체 분리 시, 수크로즈 쿠션 방법으로 추가 정제를 수행하였다. 35 ml 용량의 초원심분리 튜브에 0.5 ml의 2.5 M 수크로즈와 1 ml의 0.8 M 수크로즈, 32 ml의 이물질이 제거된 용액을 순서대로 넣고, 4℃, 100,000 x g에서 4시간 동안 초원심분리를 하였다. 초원심분리 후 세포밖 소포체는 그것의 밀도에 의해 2.5 M 수크로즈 층과 0.8 M 수크로즈 층 사이에 위치하였다. 튜브의 윗쪽부터 용액을 제거하여 세포밖 소포체가 포함된 층을 분리하였다.
도 1은 실내 먼지에서 세포밖 소포체를 얻은 과정을 나타낸 것이다. 도 2는 실내 먼지 유래 세포밖 소포체의 모양과 크기를 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM)으로 촬영한 결과를 나타낸 것으로, 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 50-100 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 실내 먼지에 세포밖 소포체가 존재하며 이는 실내 공기에 세포밖 소포체가 존재함을 의미한다.
실시예 2. 실내에서 채집한 먼지에 의한 염증성 호흡기 질환 (폐염증) 유도
본 발명자들은 실내에서 채집한 먼지가 포유동물에서 염증성 호흡기 질환을 일으키는지 여부를 평가하기 위한 실험을 수행하였다.
구체적으로, 실내 먼지 또는 40 μm filter를 통과한 실내 먼지 100 ng을 30 μl의 PBS에 녹였다. 마우스는 C57BL/6, 6주령 female 각 군당 5마리를 사용하여 PBS (phosphate buffered saline)에 녹인 먼지를 0, 1, 7, 8, 14, 15일에 기도로 투여하였고 16일 째 마우스에서 폐염증을 측정하였다. 이때 PBS를 투여한 마우스를 대조군으로 하고 상기 먼지를 투여한 마우스를 실험군으로 사용하였다.
케타민 (ketamin)과 자일라진 (xylaxine)을 혼합한 마취액을 마우스의 복강에 투여하여 마취한 후, 흉부를 절개하고 기관을 노출시켜 카테터를 기도에 삽입하고 결찰시켰다. 무균성 생리식염수를 1 ml씩 2회 주입하고 기도를 세척하여 기관지폐포세척액을 얻었다. 기관지폐포세척액을 4℃에서 800 x g로 10분간 원심분리한 뒤, 세포 펠렛 (cell pellet)을 PBS 용액에 풀었다. 상기 세포 펠렛을 사이토스핀 (cytospin)하여 슬라이드에 도말하고, 디프 퀵 (Diff Quick) 염색을 시행하여 광학현미경 1000배 시야에서 300개 이상의 염증세포를 관찰하여 대식세포, 림프구, 호중구, 호산구로 분류하여 각 염증 세포 수를 측정하였다.
도 3은 실내 먼지를 마우스의 비강으로 투여하여 염증성 호흡기질환 (폐염증)을 유도하는 과정을 나타낸 것이며, 도 4는 기관지폐포세척액에서 염증세포 수를 측정한 것이다.
도 4에 나타난 바와 같이, 먼지를 비강으로 투여한 경우에 폐염증이 발생 (BAL cells 증가)함을 알 수 있었고, 특히 호중구 (neutrophil) 침윤이 두드러지게 나타났다. 또한, 먼지를 40 μm filter를 통과 시켜 크기가 큰 물질을 제거하여 비강으로 투여하였을 때 (filtered dust), 호중구 침윤을 특징으로 하는 호중구성 폐염증이 발생하였다. 이는 호중구성 폐염증을 유도하는 물질은 실내 먼지에 존재하는 물질 중에서 40 μm 미만의 성분임을 의미한다.
상기 결과로부터, 실내에서 채집한 먼지가 포유동물에 흡입되었을 때, 호중구성 염증을 특징으로 하는 호흡기질환이 유발될 수 있음을 알 수 있다.
실시예 3. 실내에서 채집한 먼지에 의한 호중구성 폐염증의 면역학적 발생기전
상기 실시예 2의 결과로부터 실내 먼지에 의해 포유동물에서 호중구성 폐염증이 유발됨을 확인하였으며, 이와 관련하여 본 발명자들은 그 면역학적 기전을 밝히는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실시예 2의 방법을 통해 폐염증을 유도한 마우스에서 폐를 적출하였다. 적출된 폐 조직은 면도날로 다진 후 콜라게나제 타입 IV (collagenase type IV)를 첨가하고 37℃에서 10분 동안 배양하였다. 그 후 셀스트레이너 (cell strainer)를 이용하여 조직에서 세포를 분리한 후 4℃에서 800 x g로 10분간 원심분리 하였다.
원심분리한 폐세포는 적혈구 용해용액에 10분 동안 넣어 적혈구를 파괴하였다. 그 후 다시 상기의 조건으로 원심분리를 하였다. Hematocytometer를 이용하여 세포를 세고 2 x 106/ml의 농도로 RPMI1640와 10% FBS (fetal bovine serum), 항생물질 (antibiotics)이 들어있는 용액에 풀어놓았다. 세포를 48 well plate에 넣기 하루 전 48 well plate에 CD3와 CD28에 대한 항체를 각 1 μg/ml의 농도가 되도록 PBS를 사용하여 희석한 후 well당 250 μl를 넣고 10~18시간 동안 4℃를 유지시켜 항체를 well에 coating시켰다.
폐세포가 상기의 농도로 준비되면 항체가 coating되어 있는 48 well plate를 PBS로 씻어주어 plate 바닥에 coating되지 않고 free form으로 돌아다니는 항체를 제거하였다. 그 후 폐세포를 넣어주고 4시간 후 세포 밖으로 단백질 등의 물질이 분비되는 것을 저해하는 brefeldin A를 10 μg/ml 넣어 2시간 더 배양하여 세포 밖으로 분비되는 사이토카인을 세포 안으로 가둬두었다. 배양을 끝낸 세포는 형광이 달린 CD4 (FITC), CD8 (PE-Cy5), CD3 (APC) 항체를 이용하여 폐세포의 표면에 있는 각 단백질을 염색하였다. 30분이 지나면 4℃에서 800 x g로 10분간 원심분리하여 씻어낸 후 4% formalin을 이용하여 세포 표면에 구멍을 뚫어 사이토카인에 대한 항체가 잘 들어갈 수 있게 해 주었다. Formalin을 10분간 처리한 후 형광이 달린 IFN-γ(PE), IL-4 (PE), IL-10 (PE), IL-17 (PE) 항체를 이용하여 사이토카인을 30분동안 염색하였다. FACS Calibur를 사용하여 폐로 유입된 T 세포에서 사이토카인의 발현을 측정하였다.
도 5는 상기의 방법으로 CD4+ T 세포에서의 사이토카인 발현양을 Flow cytometry 방법으로 측정한 결과이다. 도 5의 filtered dust 는 상기 실시예 2에서와 같이 먼지를 40 μm filter를 통과시킨 것이다. T 세포에 의한 후천면역반응은 크게 IFN-γ를 분비하는 Th1세포, IL-4를 분비하는 Th2세포, 및 IL-17을 분비하는 Th17세포에 의한 반응으로 나눌 수 있다.
도 5에 나타난 바와 같이, 먼지에 의해 폐염증을 유도한 마우스는 대조군 (PBS)에 비해 IFN-γ와 IL-17을 발현하는 CD4+ T 세포가 폐조직에서 증가하였고, 먼지를 40 μm 크기로 필터링한 경우에는 IL-17을 발현하는 CD4+ T 세포가 더욱 증가하였다. 이는 실내 먼지에 의해 발생한 호중구성 폐염증은 IFN-γ와 IL-17을 생성하는 CD4+T 세포 (Th1과 Th17 세포)에 의해 일어난다는 것을 의미한다. Th1과 Th17 면역반응은 기도 및 폐실질에 발생하는 염증성 호흡기질환인 중증천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 폐렴 등의 발생뿐만 아니라 폐암의 발생에 있어 중요한 면역학적 과민반응으로서, Th1세포에서 분비되는 IFN-γ는 폐기종의 발생에 중요하고, Th17세포에서 분비되는 IL-17은 폐암의 발생에 중요한 역할을 한다.
상기 결과로부터, 실내 먼지가 Th1 및 Th17 면역반응을 유도하여 호중구성 폐염증을 특징으로 하는 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 폐렴 등의 염증성 호흡기질환과 폐암을 일으키게 된다는 것을 알 수 있다.
실시예 4. 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 in vitro 선천면역반응
상기 실시예 1에서 실내 먼지, 즉 실내 공기에 세포밖 소포체가 존재함을 확인하였으며 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체에 의한 in vitro 선천면역반응을 평가하였다. 이를 위해 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체를 처리하였다.
먼저 실내 먼지를 PBS에 녹인 후, 세포밖 소포체와 수용성 성분을 분리하였다. 상기의 소포체와 수용성 성분에 의한 선천면역반응을 평가하기 위하여 세포밖 소포체와 수용성 성분을 마우스 대식세포에 처리하여 상층액을 모아 사이토카인의 양을 측정하여 도 6에 나타내었다.
구체적으로, 마우스 대식세포 (RAW264.7)를 1 x 105이 되도록 24 well plate에 24시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후 DMEM배지에 먼지에서 분리한 세포밖 소포체 (Dust-EV, 0.1 ㎍/ml) 및 수용성 성분 (Dust-soluble, 8 ㎍/ml)을 각각 처리한 후 15시간 동안 배양하였다. 배양액을 모아 4℃에서 800 x g로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 모아 사이토카인의 양을 엘라이자 (enzyme linked immunosorbant assay, ELISA) 방법을 통해 측정하였다.
도 6에 나타난 바와 같이, 실내 먼지에서 분리한 소포체와 수용성 성분에 의해 TNF-α의 분비가 증가되었던 것과 달리, IL-6의 분비는 주로 소포체에 의해 유도됨을 알 수 있다. 이는 IL-6를 기반으로 하는 염증질환의 발생에 실내 먼지에 존재하는 세포밖 소포체가 중요함을 의미한다.
이에 더하여, 상기와 동일한 방법을 사용하여 세포밖 소포체 100 ng/ml과 1 μg/ml 처리 후 사이토카인의 양을 측정한 결과, 소포체를 투여하는 용량이 증가함에 따라 TNF-α와 IL-6의 분비량이 증가하는 것을 확인하였다 (도 7 참조).
한편, 그람 음성 세균의 외막 (outer membrane)에는 LPS가 존재하고, 실내 먼지에는 LPS가 포함되어 있으며, LPS가 선천면역반응을 유도한다는 사실은 잘 알려져 있다. 도 8은 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체에 의한 면역반응에 있어서의 LPS 역할 (LPS 역할 저해제; polymyxin B, PMB)과 단백질의 역할 (열처리를 통한 파괴)을 평가한 결과이다. 소포체에 의한 TNF-α의 분비는 PMB 또는 열을 처리한 경우 모두에서 현저히 감소하였다. 반면, 소포체에 의한 IL-6의 분비는 PMB를 처리한 경우에는 현저히 감소하였으나, 열처리를 한 경우에는 오히려 증가하였다.
실시예 3의 결과로부터, 실내 먼지가 Th17 면역반응을 유도하여 호중구성 폐염증을 유발하는 것을 예상할 수 있다. 이에 더하여, 상기 실시예 4의 결과로부터, 실내 먼지에 의한 Th17 면역반응에 의한 호중구성 폐염증은 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체에 의해 IL-6의 분비가 증가된 것과 관련이 있음을 의미한다. 즉, 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체가 T 세포를 Th17으로 분화시키는데 핵심이 되는 사이토카인인 IL-6의 분비를 증가시키고 그 결과 Th17 면역반응을 유도하여 결과적으로 호중구성 폐염증을 발생시킨다는 것을 예상할 수 있다. 또한 이러한 염증성 호흡기질환을 유도하는 병원성 소포체는 LPS를 함유하고 있는 소포체가 중요함을 의미한다.
실시예 5. 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응
본 발명자들은 실시예 4에서 확인한 in vitro 선천면역반응에 더하여 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하기 위한 실험을 도 9의 실험 프로토콜에 따라 수행하였다.
구체적으로, C57BL/6, 6주령 female 마우스(각 군당 4마리)를 사용하여 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체 0.01, 0.1, 1 mg 을 PBS 30 ㎕에 녹여 비강으로 1회 투여한 후 24시간 이후에 평가하였다. 이때 PBS를 투여한 마우스를 대조군으로 사용하였다. 상기의 방법에 따라 마취액을 이용하여 마우스를 마취한 후 기관지폐포세척액을 얻었다. 기관지폐포세척액을 4℃에서 800 x g로 10분간 원심분리한 뒤, 세포 펠렛 (cell pellet)을 PBS 용액에 풀어 유입된 염증세포 수를 측정하였다.
도 10은 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액(BAL)에서 염증세포 수를 측정한 결과이다. 도 10에 나타난 바와 같이, 대조군 (PBS)에 비하여 세포밖 소포체를 투여한 경우(Dust-EV), 소포체의 용량에 비례하여 기관지폐포세척액에 염증세포 수가 증가함을 알 수 있다. 또한 Th17 면역반응을 일으키는 핵심 사이토카인인 IL-6의 경우, 세포밖 소포체 투여량에 비례하여 그 분비량이 증가하는 것을 알 수 있다.
상기 결과로부터, in vitro 시스템 및 in vivo 시스템에서 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체가 선천면역반응을 유도한다는 사실을 확인하였고, 나아가 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체가 IL-6 의 분비를 촉진시키고 이로 인해 Th17 면역반응이 유도되어 호중구성 폐염증을 특징으로 하는 호흡기질환을 일으키는 것이 명백하다.
실시예 6. 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 in vivo 후천면역반응
도 11에 나타낸 프로토콜에 따라, 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체에 의한 in vivo 후천면역반응을 평가하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, C57BL/6, 6주령 female 마우스 (각 군당 4마리)에 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체 1 ㎍을 PBS 30 ㎕에 녹여 비강으로 일주일에 2회씩 3주간 투여하여, 마지막 투여 24시간에 평가하였다. 또한, LPS를 함유하고 있는 세포밖 소포체의 역할을 평가하기 위하여 소포체에 PMB를 처리하여 이를 투여한 실험을 동시에 수행하였다.
도 12는 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액에서 염증세포 수를 나타낸 것으로, 대조군 (PBS)에 비하여 세포밖 소포체 투여군 (Dust-EV)에서 염증세포 수가 현저히 증가한 것을 확인할 수 있다. 또한 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체에 PMB를 처리하였을 때 (Dust-EV+PMB), 소포체에 의해 증가된 염증세포 수가 현저히 감소되었다. 이는 실내 공기에 존재하는 소포체에 반복 노출되었을 때 호중구성 폐염증이 발생하고, 이의 발생에는 LPS를 함유하고 있는 소포체가 중요함을 의미한다.
이에 더하여, 본 발명자들은 폐염증의 발생에 관련된 면역학적 병인기전을 평가하기 위하여 국소 림프절에서 면역세포를 분리하여 면역세포에서 IFN-γ와 IL-17의 발현양상을 평가한 결과를 도 13에 나타내었다. 그 결과, 먼지에서 분리한 소포체를 투여한 경우 PBS를 투여한 경우에 비하여 국소 림프절 내 T 세포 수가 현저히 증가하였고, 특히 IFN-γ와 IL-17을 발현하는 T 세포가 현저히 증가하였다. 또한, 세포밖 소포체에 PMB를 처리한 경우에는 국소 림프절 내 T 세포 수가 감소하였고, IFN-γ와 IL-17을 발현하는 T 세포 수도 현저히 감소하였다.
도 14는 혈청내에 존재하는 실내 먼지에서 분리한 소포체 특이 항체를 ELISA 방법으로 측정한 결과이다. 그 결과, 실내 먼지에서 분리한 소포체를 투여한 경우 소포체 특이 IgG1 및 IgG2a 양이 현저히 증가하였고, 이는 소포체에 PMB를 처리한 경우에는 PBS를 투여한 군과 비슷한 정도로 감소하였다.
상기 결과는 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 폐염증은 호중구성 염증을 특징으로 하고, 이는 Th1 및 Th17 면역반응에 의해 발생하고, 이를 일으키는 데에는 LPS를 함유하고 있는 소포체가 중요함을 의미한다. 또한, 실내 공기에 존재하는 소포체를 흡입하였을 때 혈청내 소포체 특이 IgG1 및 IgG2a 항체가 증가함을 알 수 있어, 혈청에서 소포체 특이 항체를 측정함으로써 반복적으로 노출된 병원성 소포체를 진단할 수 있다.
실시예 7. 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 대장균 유래 세포밖 소포체의 존재
상기 실시예 5 및 실시예 6의 결과로부터, 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응 및 후천면역반응의 발생에 LPS를 함유하고 있는 소포체가 중요함을 알 수 있었다. LPS는 그람 음성 세균의 외막에 존재하는 물질로서 LPS를 함유하고 있는 소포체는 그람 음성 세균에서 유래함이 자명하다.
대장균은 그람 음성 세균으로서 실내 공기에 존재하고, LPS를 함유하는 세포밖 소포체를 분비하며, 소포체 내에는 LPS 뿐만 아니라 면역 및 염증반응을 유도하는 단백질을 함유하고 있음을 본 발명자들이 보고한 바 있다. 이에, 본 발명자들은 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체에 대하여 대장균 유래 세포밖 소포체의 존재를 평가하였다.
실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체 내에 대장균 유래 소포체의 존재를 평가하기 위하여, 대장균 특이적인 16s rRNA primer를 사용하여 유전형을 평가하였다. 구체적으로, 먼지에서 분리한 세포밖 소포체를 100 ℃ 에서 20분 동안 가열하여 DNA와 RNA를 용출시키고 이를 주형 (template)로 cDNA를 합성하였다. 합성한 cDNA를 주형으로 대장균 특이적인 16s rRNA primer를 넣고 94 ℃ (40 초)와 72 ℃ (40 초)를 40회 사이클로 2 step polymerase chain reaction (PCR)을 시행하였다.
그 결과, 대장균에서 유래한 세포밖 소포체 (E.coli-EV)와 유사하게 실내 먼지에서 분리한 세포밖 소포체(Dust-EV)에도 대장균의 16s rRNA가 존재함을 확인하였다 (도 15 참조).
또한, 실내 먼지에서 분리한 소포체에 대하여 대장균 유래 소포체에 함유된 단백질의 존재를 확인하였다. 이를 위하여, 대장균 유래 소포체에 의해 생성된 항체 (anti-E.coli EV Ab)를 사용하여 웨스턴 블럿 (Western Blot)을 시행한 결과, 실내 먼지에 세균 등을 포함하고 있는 pellet 성분과 실내 먼지에서 분리한 소포체 에 대장균 유래 소포체 특이 항체에 반응하는 단백질이 존재함을 확인하였다(도 15 참조).
상기 결과로부터, 실내 공기에는 대장균에서 유래한 세포밖 소포체가 존재함이 명백하다.
실시예 8. 대장균 유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응
실시예 7에서 실내 공기에는 대장균 유래 세포밖 소포체가 존재함을 알 수 있었고, 이를 토대로 대장균 유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하였다.
대장균유래 세포밖 소포체는 대장균 배양액에서 추출하였다. 구체적으로, 대장균을 3 ml LB 용액이 들어있는 시험관에 37 ℃, 4 시간 동안 배양한 후에 그 중 10 μl씩을 500 ml LB 용액이 들어 있는 2L 삼각 플라스크 8 개에 옮겨 37 ℃, 4 시간 동안 배양하였다. 배양액을 350 ml 용량 고속원심분리 튜브 12 개에 나눠 담은 후, 4 ℃, 5,000 x g에서 15 분 동안 연속으로 2 번 수행하였다. 4 L 가량의 상층액을 구멍 크기가 0.45 μm인 멤브레인 필터 (membrane filter)를 1회 통과 시킨 후, 100 kDa 이하의 분자만 통과 시킬 수 있는 퀵스탠드 시스템을 (Quixstand system) 사용하여 300 ml 양까지 농축하였다. 농축액을 0.22 μm의 구멍 크기를 가진 멤브레인 필터에 1회 통과 시킨 후, 50 ml 용량의 초원심분리 튜브 (ultracentrifuge tube)에 나눠 담은 후 4℃, 150,000 x g에서 3시간 동안 초원심분리 (ultracetrifugation)를 하였다. 상층액은 버리고 튜브 아래에 존재하는 침전물을 PBS로 녹여 장내 대장균 유래 세포밖 소포체를 추출하였다. 　
면역반응을 측정하기 위하여, C57BL/6, 6주령 female 마우스(각 군당 4마리)를 사용하여 상기의 방법으로 추출한 대장균 유래 세포밖 소포체 1, 10, 100 ng 을 PBS 30 ㎕에 녹여 비강으로 1회 투여한 후 2, 8, 24시간 이후에 매개체의 분비를 평가하였다. 이때 PBS를 투여한 마우스를 대조군으로 사용하였다. 상기의 방법에 따라 마취액을 이용하여 마우스를 마취한 후 기관지폐포세척액 (BAL fluid)을 얻었다.
도 16은 대장균 유래 세포밖 소포체에 의한 염증성 사이토카인의 분비를 기관지폐포세척액에서 측정한 결과이다. 그 결과, 소포체를 투여한 경우에 대조군에 비하여 8시간째 기관지폐포세척액 내 TNF-α와 IL-6의 양이 증가하였고, 이는 소포체의 용량에 비례하여 증가함을 알 수 있다.
실시예 9. 대장균 유래 세포밖 소포체 반복 투여에 의한 폐염증
실시예 8에서 대장균 유래 소포체가 용량의존적으로 Th17 면역반응을 유도하는 IL-6의 분비를 유도한다는 사실에 기초하여 대장균 유래 소포체를 반복적으로 투여하여 폐염증을 평가하였다.
도 17에 나타낸 프로토콜과 같이, C57BL/6, 6주령 female 마우스 (각 군당 4마리)에 대장균 유래 세포밖 소포체 10, 100 ng 을 PBS 30 ㎕에 녹여 비강으로 일주일에 2회씩 3주간 투여한 후, 마지막 소포체 투여 24시간째 평가하였다.
도 18은 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액에서 염증세포 수를 나타낸 것으로, 대조군 (PBS)에 비하여 대장균 유래 세포밖 소포체 투여군 (EC-EV)에서 염증세포 수가 증가하고, 이는 소포체의 투여 용량에 의존적으로 증가함을 알 수 있다.
실시예 10. 대장균 유래 세포밖 소포체에 의한 폐기종
실시예 9에서 대장균 유래 세포밖 소포체를 기도로 3주간 반복 투여하였을 때, 용량의존적으로 폐염증이 발생한다는 사실에 기초하여, 고용량의 소포체를 4주간 반복 투여하여 구조적인 변화를 평가하였다.
도 19에 나타낸 프로토콜과 같이, C57BL/6, 6주령 female 마우스 (각 군당 4마리)에 대장균 유래 세포밖 소포체 100 ng을 PBS 30 ㎕에 녹여 비강으로 일주일에 2회씩 4주간 투여한 후 24시간째 조직학적 변화를 평가하였다.
도 20은 폐조직에서 폐포의 파괴를 보여주는 결과로서, 대장균 유래 소포체를 투여한 경우에 대조군에 비하여 폐포의 파괴를 특징으로 하는 폐기종이 발생함dmf 알 수 있고, 이를 chord length로 정량한 경우에 소포체를 투여한 경우에 대조군에 비하여 chord length가 크게 증가함을 알 수 있다.
상기 결과는 대장균 유래 세포밖 소포체를 비교적 높은 농도로 반복적으로 노출시키는 경우에 비가역적 기도폐색을 초래하는 폐기종이 발생함을 의미한다.
실시예 11. 실내 공기에 서식하는 집먼지진드기에서 crude extract 제조 및 세포밖 소포체 추출 및 특성 규명
본 발명자들은 실내에서 서식하는 집먼지진드기(house dust mite, HDM)에 세포밖　소포체가 존재하는지 여부를 알아보기 위하여 집먼지진드기에서 세포밖 소포체를 추출하여 특성을 규명하는 실험을 수행하였다.
구체적으로, 연세대학교 의용절지동물 소재은행에서 집먼지진드기 20 g을 구입하여 깨끗한 비커에 옮겨 담고 500 ml PBS를 넣은 후, 4℃, 24시간 동안 교반하였다. 이 후, 고속원심분리 튜브 (high speed centrifuge tube)에 나눠 담은 후, 4℃, 10,000 x g에서 15분 동안 고속원심분리 (high speed centrifugation)를 연속으로 2번 수행하였다. 450 ml 가량의 상층액을 구멍 크기가 0.22 μm인 멤브레인 필터 (membrane filter)를 1회 통과 시킨 후, 70 ml 용량의 초원심분리 튜브 (ultracentrifuge tube)에 나눠 담고 4℃, 100,000 x g에서 3시간 동안 초원심분리 (ultracetrifugation)를 하였다. 상층액은 버리고 튜브 아래에 존재하는 침전물을 PBS로 녹여 세포밖 소포체를 추출하였다.
집먼지진드기 유래 세포밖 소포체 특성 규명을 위한 세포밖 소포체 분리 시, opti-prep 용액을 이용하여 추가 정제를 수행하였다. 10 ml 용량의 초원심분리 튜브에 분리한 침전물을 녹인 4.8 ml의 50% opti-prep 용액과 3 ml의 40% 그리고 2.5 ml의 10% opti-prep 용액을 순서대로 넣고, 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초원심분리를 하였다. 초원심분리 후 40% opti-prep 층과 10% opti-prep 층 사이에 흰색 층이 위치하는 것을 확인하였다. 튜브의 위쪽부터 1 ml씩 나누어 담은 후, opti-prep solusion을 제거하기 위해 각각 9 ml의 PBS와 섞은 후, 10 ml 용량의 초원심분리 튜브에 담고 4℃, 100,000 x g에서 2시간 동안 초원심분리 (ultracetrifugation)를 하였다. 상층액을 버리고 튜브 아래쪽에 존재하는 침전물을 다시 1 ml의 PBS에 녹여 세포밖 소포체를 추출하였다.
도 21은 집먼지진드기에서 세포밖　소포체를 얻는 과정을 나타낸 것이다. 도 22는 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체의 모양과 크기를 투과전자현미경 (transmission electron microscope, TEM) 및 동적 광산란법 (dynamic light scattering, DLS) 을 이용하여 측정한 결과를 나타낸 것으로, 지질 이중층으로 이루어져 있으며, 크기가 100-200 nm이고 대체로 구형을 이루고 있음을 알 수 있다.
상기 결과는 집먼지진드기 extract에 세포밖 소포체가 존재함을 보여주는 결과이다.
실시예 12. 실내 공기에 서식하는 집먼지진드기유래 세포밖 소포체에 의한 in vitro 선천면역반응
실시예 11에서 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체가 존재함을 알 수 있었고, 집먼지진드기에서 분리한 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하였다. 이를 위해 마우스 대식세포 (RAW 264.7)에 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체를 처리하였다.
구체적으로, 마우스 대식세포 (RAW264.7)를 1 x 105이 되도록 24 well plate에 24시간 동안 배양하였다. PBS로 세척한 후, DMEM배지에 집먼지진드기에서 분리한 세포밖 소포체 (HDM-EV) 100 ng, 1 μg, 10 μg을 각각 처리한 후 15시간 동안 배양하였다. 배양액을 모아 4℃에서 800 x g로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 모아 사이토카인의 양을 엘라이자 (enzyme linked immunosorbant assay, ELISA) 방법을 통해 측정하였다.
도 23에 나타난 바와 같이, 집먼지진드기에서 분리한 소포체에 의해 TNF-α와 IL-6의 분비가 유도됨을 알 수 있으며, 처리 용량이 증가함에 따라 TNF-α와 IL-6의 생성이 증가함을 확인하였다.
실시예 13. 실내 공기에 서식하는 집먼지진드기유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응
실시예 11에서 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체가 존재함을 알 수 있었고, 실시예 12에서 집먼지진드기 유래 소포체에 의한 면역반응을 확인할 수 있었다. 이를 토대로 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응을 평가하였다.
구체적으로, C57BL/6, 6주령 female 마우스(각 군당 5마리)를 사용하여 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체 0.1, 1, 10 μg 을 PBS 30 μl 에 녹여 비강으로 투여한 후 12시간 이후에 염증세포 침윤과 매개체의 분비를 평가하였다. 이때 PBS를 투여한 마우스를 대조군으로 사용하였다. 상기의 방법에 따라 마취액을 이용하여 마우스를 마취한 후 기관지폐포세척액 (BAL fluid)을 얻었다.
도 24는 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체에 의한 염증을 평가한 결과이다. 폐염증의 지표인 기관지폐포세척액에서 염증세포 수를 나타낸 것이다. 도 24에 나타난 바와 같이, 대조군 (PBS)에 비하여 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체 투여군 (EV)에서 염증세포 수가 증가하였고, 이는 소포체의 투여 용량에 비례하여 증가함을 알 수 있다.
도 25는 사이토카인의 분비를 기관지폐포세척액에서 측정한 결과이다. 도 25에 나타난 바와 같이, 소포체를 투여한 경우에 대조군에 비하여 BAL fluid내 TNF-α와 IL-6의 양이 증가하였고, 이는 소포체의 용량에 의존적으로 증가함을 알 수 있다. 특히 10 ug 의 소포체를 투여한 군에서 TNF-α와 IL-6의 양이 유의하게 증가한 것을 확인하였다.
실시예 14. 실내 공기에 서식하는 집먼지진드기유래 세포밖 소포체 반복 투여에 의한 폐염증
실시예　13에서 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체에 의한 면역반응을 확인할 수 있었으며, 이를 토대로 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 후천면역반응을 평가하였다.
구체적으로, C57BL/6, 6주령 female 마우스(각 군당 5마리)를 사용하여, 실시예 13에서 효과가 있었던 집먼지진드기 유래 세포밖 소포체 10 μg을 하루 1회 3일 비강으로 투여하여 감작시킨 후, 2주 동안 주 2회 비강으로 투여하였다. 24시간 이후에 염증세포 침윤 및 염증매개체의 분비를 평가하였으며, 이 때 PBS를 투여한 마우스를 대조군으로 사용하였다. 상기의 방법에 따라 마취액을 이용하여 마우스를 마취한 후 기관지폐포세척액 (BAL fluid)을 얻었다.
도 26은 염증세포의 침윤을 보여주는 결과로서, 집먼지진드기 유래 소포체(HDM EV)를 투여한 경우 대조군(PBS)에 비해 기관지폐포세척액 내 염증세포 수가 크게 증가하였고, 특히 호중구 수가 현저히 증가되어 있었다.
도 27은 후천면역반응의 유형을 분석하기 위해서 기관지폐포세척액에서 사이토카인의 생성량을 엘라이자 방법으로 측정한 결과로서, Th17 세포에서 분비되는 IL-17이 집먼지진드기유래 세포밖 소포체 투여에 의해 유의하게 증가됨을 확인할 수 있었다.
상기 결과는 집먼지진드기에 존재하는 세포밖 소포체가 흡입되었을 때, Th17 면역반응을 매개로 하는 호중구성 폐염증이 발생함을 의미한다.
실시예 15. 실내 먼지에서 세균과 곰팡이 배양 및 세균 동정
실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체는 실내 먼지에 존재하는 여러 세균 또는 곰팡이에 의해 생성될 수 있다. 본 발명자들은 진공청소기를 사용해 특정 주거지의 침구에 존재하는 먼지를 수거하였다. 진공청소기의 필터 내 존재하는 먼지를 깨끗한 유리병에 옮겨 담고 질량을 측정하였다. 실내 먼지 5 g을 200 ml PBS가 들어있는 비커에 4℃, 12시간 동안 녹여내고 거즈를 이용하여 크기가 큰 물질을 제거하였다. 먼지액을 1로 하고 농도를 1/10씩 희석하여 세균과 곰팡이가 자랄 수 있는 배양액이 있는 plate에 먼지액을 도말하였다. 일정시간이 지난 후 자라난 세균과 곰팡이을 확인하였다. 도 28 에 나타난 바와 같이 실내 먼지에 여러 세균과 곰팡이가 서식하고 있음을 알 수 있었다.
이후, 본 발명자들은 실내 먼지에 서식하는 세균을 분리, 동정하는 실험을 수행하였다. 실내 먼지에서 서식하는 세균을 분리하는 방법을 도 29에 나타내었다. 구체적으로, 침대에서 모은 먼지를 실시예 1과 같은 방법으로 녹인 후 gauze를 이용하여 크기가 큰 물질을 제거하였다. 이때의 먼지액을 1로 하고 농도를 1/10씩 희석하여 세균이 자랄 수 있는 배양액이 있는 plate에 먼지액을 도말하였다. 일정시간이 지난 후 크기와 색이 다른 여러 colony를 확인하였고 각 colony를 접종하여 3ml의 영양액이 들어있는 시험관에 37℃에서 배양하였다. 생화학적 방법을 이용하여 세균을 동정하는 미생물자동검사 시스템 VITEK 장비를 이용하여 먼지에 서식하는 세균을 동정하였다. 그 결과 그람 양성 세균으로 Staphylococcus aureus, Staphylococcus hominis 등을 동정하였다.
이를 통해 먼지에 있는 세포밖 소포체는 그람 양성 세균에서 분비되는 것을 포함하고 있음을 예측할 수 있다.
실시예 16. 포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 in vitro 면역반응 및 소포체 내 단백질 역할
최근 본 발명자들은 그람 양성 세균인 포도상구균이 세포밖 소포체를 분비함을 최초로 발견하여 보고하였다. 실내 공기에 존재하는 그람 양성 세균 유래 세포밖 소포체에 의한 호흡기질환 발생에의 역할을 평가하기 위하여 포도상구균 배양액에서 실시예1의 방법으로 포도상구균에서 분비되는 세포밖 소포체를 분리하여 호흡기질환의 병인에 대한 역할을 평가하였다.
구체적으로, 포도상구균을 3 ml의 영양액이 들어있는 시험관에 접종한 후 37oC에서 6 시간 동안 배양한 후에, 그 중 5 ml을 500 ml 영양액이 들어는 2 L 삼각 플라스크에 옮겨 37oC, 4시간 동안 배양하여 흡광도 (600 nm) 값이 1.0이 되도록 하였다. 배양액을 500 ml 용량의 고속원심분리 튜브 (high speed centrifuge tube)에 담은 후 4oC에서 10,000 x g로 20분 동안 원심분리를 하였다. 세균을 제거한 상층액을 구멍 크기가 0.45 μm인 멤브레인 필터 (membrane filter)에 1회 통과 시킨 후, 100 kDa 분자량 이하의 단백질을 제거할 수 있는 멤브레인을 장착한 퀵스탠드 시스템을 (Quixstand system) 사용하여 25배 농축하였다. 농축액을 0.22 μm의 구멍 크기를 가진 멤브레인 필터에 1회 통과 시킨 후, 70 ml 용량의 초원심분리 튜브 (ultracentrifuge tube)에 담고 4oC에서 150,000 x g로 3시간 동안 초원심분리 (ultracetrifugation)하였다. 침전물을 PBS (phosphate buffered saline)로 현탁 (resuspension)한 후 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 얻었다.
포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 in vitro 면역반응을 평가하기 위하여, 마우스 대식세포 (RAW264.7)를 1 x 105이 되도록 24 well plate에 24시간 동안 하고 PBS로 세척하여 FBS(fetal bovine serum)를 제거한 후 DMEM배지에 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 1, 10 μg/ml 로 처리하여 대조군으로 사용하였다. 이때 100℃에서 20분간 끓여 열에 약한 성분의 기능을 제거한 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 처리한 세포를 실험군으로 사용하였다. 각 세포밖 소포체를 15시간 동안 처리한 후 배양액을 모아 4℃에서 800 x g로 10분 동안 원심분리하고 상층액을 모아 사이토카인의 양을 엘라이자 (enzyme linked immunosorbant assay, ELISA)방법을 통해 측정하였다. 도 29은 각각 대표적인 염증성 사이토카인인 TNF-α와 IL-6를 측정한 결과를 나타낸 것이다.
도 30에 나타난 바와 같이, TNF-α의 경우, 열을 처리한 세포밖 소포체 (Heat-S-EV) 1 μg/ml을 처리한 군은 그 생성량이 1/2 이하로 감소하였지만, 10 μg/ml을 처리한 군은 큰 차이가 없었다. 반면, IL-6의 경우, 포도상구균 유래 세포밖 소포체에 열을 처리한 군 (Heat-S-EV)에서, IL-6의 생성량이 소포체의 농도에 관계없이 현저하게 감소하는 것을 알 수 있다.
상기 결과는 포도상구균 유래 세포밖 소포체 내 단백질 또는 열에 약한 성분이 IL-6를 통한 염증반응을 일으키는데 중요한 역할을 함을 의미한다.
실시예 17. 포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 선천면역반응 및 폐염증
포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 in vivo 면역반응을 평가하기 위하여, C57BL/6, 6주령 female (각 군당 3마리)을 사용하였고, PBS에 녹인 포도상구균 유래 세포밖 소포체 1, 10 μg을 마우스 기도로 투여한 군을 실험군, PBS를 기도로 투여한 군을 대조군으로 사용하였다. 세포밖 소포체를 1회 투여한 후 다음 날 마우스에서 초기 폐염증과 사이토카인 IL-6의 양을 측정하였다 (도 31의 실험 프로토콜 참조).
도 32는 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 기도로 투여하고 기관지폐포세척액에서 염증을 평가한 결과이다. 그 결과, 세포밖 소포체를 기도로 투여한 군(S-EV)에서 농도에 비례하여 기관지폐포세척액에서 염증세포 수가 증가하였다. 특히, 염증세포 중에서 호중구 수가 현저히 증가됨을 알 수 있다.
또한, 기관지폐포세척액에서 Th17 면역반응에서 핵심물질인 IL-6의 생성량을 엘라이자 방법으로 확인할 결과, 도 33에 나타난 바와 같이, 포도상구균 유래 세포밖 소포체(S-EV)의 농도에 비례하여 IL-6의 분비량도 증가하는 것을 알 수 있다.
상기 결과로부터, 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 포유동물에 흡입시켰을 때 호중구성 폐염증이 발생하고, 또한 포도상구균 유래 세포밖 소포체가 Th17 면역반응에서 핵심역할을 하는 IL-6의 생성을 증가시킴을 알 수 있다.
실시예 18. 포도상구균 유래 세포밖 소포체에 의한 선천면역반응의 발생에 있어서 단백질 또는 열에 약한 성분의 역할
상기 실시예 16의 in vitro 실험에 더하여, 선천면역반응의 발생에 포도상구균 유래 세포밖 소포체 내 단백질 역할을 in vivo 실험을 통해 검증하였다.
구체적으로, 마우스는 C57BL/6, 6주령 female (각 군당 3마리)을 사용하였고 세포밖 소포체 1, 10 μg을 마우스 기도로 투여한 군을 대조군으로 사용하였다. 세포밖 소포체를 100℃에서 20분간 끓인 군을 실험군으로 사용하였다. 마우스에 세포밖 소포체를 1회 투여한 후 다음 날 마우스에서 초기 폐염증과 사이토카인 IL-6의 양을 측정하였다 (도 34의 실험 프로토콜 참조).
도 35는 포도상구균 유래 세포밖 소포체를 기도로 투여하고 기관지폐포세척액에서 염증반응을 평가한 결과이다. 그 결과, 열처리를 한 세포밖 소포체 10 μg를 기도로 처리한 군 (Heat-S-EV 10μg)과 대조군 (S-EV 10μg)과는 폐염증 (기관지폐포세척액에서 염증세포 수)에 큰 차이가 없었다.
도 36은 기관지폐포세척액에서 IL-6의 양을 엘라이자방법을 통해 측정한 결과를 나타낸 것으로, 폐염증 결과와는 달리 열처리를 한 포도상구균 유래 세포밖 소포체 (1 μg, 10 μg)를 투여한 군에서 대조군에 비해 IL-6의 생성량이 현저히 감소함을 확인하였다.
상기 결과로부터, 포도상구균 유래 세포밖 소포체의 단백질 또는 열에 약한 성분이 IL-6를 통한 면역반응 및 염증성 호흡기질환의 발생에 중요한 역할을 함을 재확인하였다.
실시예 19. 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 면역학적 특성
실시예 8의 방법에 따라 분리한 대장균유래 세포밖 소포체 1 mg 을 일주일 간격으로 3 주 동안 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 10마리)의 복강에 주입하였다. 매 주입 6 시간, 24 시간, 7 일 후 마우스 혈액을 얻어 혈액 내 존재하는 세포밖 소포체 특이적인 항체를 측정하였다. 대장균 유래 소포체 200 ng이 코딩된 검정색 96 웰 플레이트에 1% BSA/PBS로 1:500 희석된 마우스 혈청을 넣어 상온에서 두 시간 배양한 후, peroxidase가 결합된 마우스 항체를 통해 관찰하였다.
도 37은 마우스 혈액 내 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 특이 항체 양을 시간에 따라 관찰한 결과이다. 도 37에 나타난 바와 같이, 세포밖 소포체 특이 항체는 1회 세포밖 소포체 투여 7 일 이후부터 형성되기 시작하였으며, 두 번째와 세 번째 세포밖 소포체 투여 후에 더욱 많은 항체가 형성되어 세 번째 소포체 백신 접종 완료 7 일 후에 가장 높은 항체 형성 정도를 보였다.
상기의 방법으로 세 번의 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 접종이 완료된 7 일 후 마우스에서 비장세포를 분리하였다. 분리된 비장세포 (2 x 104)에 대장균 유래 세포밖 소포체 100 ng을 넣어 72 시간 동안 배양 한 후, 비장세포가 분비하는 면역 반응 관련 사이토카인인 IFN-g, IL-17, IL-4의 양을 각각 ELISA 방법으로 측정하였다.
도 38은 마우스 비장세포에 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 처리시 분비되는 IFN-g 양을 나타낸 결과이다. 도 38에 나타난 바와 같이, 대장균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포에서 IFN-g 의 분비가 증가하였다.
도 39는 마우스 비장세포에 대장균유래 세포밖 소포체(EC_EV) 처리시 분비되는 IL-17 양을 나타낸 결과이다. 도 39에 나타난 바와 같이, 대장균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에서 얻은 비장세포에 비해 세포밖 소포체를 접종한 마우스에서 얻은 비장세포에서 IL-17의 분비가 증가하였다.
상기 결과로부터, 대장균유래 세포밖 소포체 접종시 세균 감염에 대한 방어기전인 B 세포에서 생성되는 항체 반응과 T 세포 면역반응이 유도됨을 확인하였다. 특히, T 세포 면역반응은 세균감염에 대한 방어에 중요한 IFN-g 를 분비하는 Th1 면역반응과 IL-17을 분비하는 Th17 면역반응이 대장균유래 세포밖 소포체 접종에 의해 효율적으로 유도되었다.
실시예 20. 대장균 감염에 의한 패혈증에 대한 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능
대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 평가하기 위하여 대장균 감염에 의한 패혈증 동물모델을 확립하였다. 대장균 1 x 106, 1 x 108, 1 x 1010 CFU를 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 10마리)의 복강으로 주입하여 5 일 동안 8 시간 간격으로 마우스 생존율을 관찰하였다.
도 40은 대장균(EC) 감염에 의한 마우스 치사율을 나타낸 결과이다. 도 40에 나타난 바와 같이, 대장균 1 x 1010 CFU 주입 시 마우스가 24 시간 안에 사망하였고, 대장균 1 x 106, 1 x 108 CFU 주입한 경우 마우스의 생존에는 영향이 없었다.
실시예 19의 방법에 따라 대장균유래 세포밖 소포체 0.5, 1 μg을 일주일 간격으로 3주 동안 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 10마리)의 복강에 주입하였다. 세 번의 대장균유래 세포밖 소포체 접종이 완료된 7일 후, 대장균 1 x 1010 CFU를 복강으로 주입하여 5 일 동안 8 시간 간격으로 마우스 생존율을 관찰하였다. 도 41은 상기의 방법으로 확립된 대장균 감염에 의한 패혈증 발생에 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능을 관찰한 결과이다. 도 41에 나타난 바와 같이, 5일 후 대장균유래 세포밖 소포체가 접종되지 않은 마우스의 생존율 20%에 비해 대장균유래 세포밖 소포체가 접종된 마우스 그룹의 생존율은 80―100 % 였다.
상기 방법에 따라, 대장균유래 세포밖 소포체 1 μg를 일주일 간격으로 세 번 복강으로 접종 한 후, 대장균 1 x 1010 CFU를 마우스 복강으로 주입하여 6 시간 후에, 혈액 내에 존재하는 대장균 개수를 측정하여 도 42에 나타내었다.
도 42에 나타난 바와 같이, 대장균유래 세포밖 소포체 접종 시, 대장균유래 세포밖 소포체가 접종되지 않은 마우스에서 얻은 혈액 내 대장균 수에 비해 소포체가 접종된 마우스의 혈액 내 대장균의 수가 현저히 감소되었다.
상기 결과는 대장균에서 유래하는 세포밖 소포체를 백신으로 미리 투여하였을 때, 대장균에 의한 감염을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.
실시예 21. 대장균유래 세포밖 소포체에 의한 염증의 발생에 대한 대장균유래 세포밖 소포체 백신의 효능
대장균유래 세포밖 소포체에 의한 염증의 발생에 소포체 백신의 효능을 평가하기 위하여, 실시예 19의 방법에 따라 대장균유래 세포밖 소포체 1 μg을 일주일 간격으로 세 번 C57BL/6 (male, 6 주, 그룹당 5 마리)의 복강으로 주사하여 접종한 후, 대장균유래 세포밖 소포체를 복강으로 투여한 후 혈액에서 염증매개체 분비를 측정하였다.
도 43은 대장균유래 세포밖 소포체가 접종된 마우스에 고용량의 대장균유래 세포밖 소포체 (5 μg, 세 번) 주입 6 시간 후, 마우스 혈액을 채취하여 혈청 내 Th17 면역반응을 유도하는 염증매개체인 IL-6 양을 측정한 결과이다. 대장균유래 세포밖 소포체를 접종하지 않은 마우스 그룹에 비해 대장균유래 세포밖 소포체를 접종한 그룹에서 혈청 내 IL-6 양이 현저히 감소하였다.
상기 결과는 저용량의 대장균유래 세포밖 소포체를 백신으로 미리 투여하였을 때, 대장균유래 세포밖 소포체에 의해 발생하는 염증을 효율적으로 예방할 수 있음을 의미한다.
이상의 설명은 본 발명의 기술 사상을 예시적으로 설명한 것에 불과한 것으로서, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위 내에서 다양한 수정, 변경 및 치환이 가능할 것이다. 따라서, 본 발명에 개시된 실시예 및 첨부된 도면 등은 본 발명의 기술 사상을 한정하기 위한 것이 아니라 설명하기 위한 것이고, 이러한 실시예 및 첨부된 도면 등에 의하여 본 발명의 기술 사상의 범위가 한정되지 아니한다는 것은 당업자에게 명백하다.
본 발명의 실내 공기유래 세포밖 소포체를 이용하여 염증성 호흡기 질환 등을 진단, 예방, 및/또는 치료할 수 있다. 구체적으로, 본 발명의 실내 공기유래 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 호흡기질환 동물 모델을 제조하고, 상기 동물 모델을 이용하여 호흡기질환에 대한 예방 또는 치료 후보 약물을 효율적으로 검색 및/또는 발굴하는 것이 가능하다. 또한 본 발명은 중증천식, 만성폐쇄성폐질환, 폐암 등의 호흡기질환의 원인인자를 정확히 진단하는 것을 가능하게 하며, 나아가 상기 질병을 예방 및/또는 치료할 수 있는 백신 개발에 이용될 수 있다.

Claims (113)

  1. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 조성물.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물의 분비물, 사람의 비듬, 및 꽃가루로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래하는 것인 조성물.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 세균에서 분비되는 것인 조성물.
  4. 제 3항에 있어서,
    상기 세균에서 분비되는 세포밖 소포체는 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물, 식물, 및 사람의 비듬으로 이루어진 군에서 선택되는 것에 서식하는 세균에서 분비되는 것인 조성물.
  5. 제 3항에 있어서,
    상기 세균에서 분비되는 세포밖 소포체는 2종 이상의 세균에서 분비된 세포밖 소포체의 혼합물인 조성물.
  6. 제 3항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 (Staphylococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세테스 (Streptomycetes), 및 코리네박테리움 (Corinebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  7. 제 3항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 마이크로코커스 리래 (Micrococcus lylae), 엔터로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 슈도모나스 루테오라 (Pseudomonas luteola), 및 대장균 (Escherichia coli)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 조성물.
  8. 제 1항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 곰팡이에서 분비되는 것인 조성물.
  9. 제 8항에 있어서,
    상기 곰팡이에서 분비되는 세포밖 소포체는 실내 먼지에 서식하는 곰팡이에서 분비되는 것인 조성물.
  10. 제 1항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 분리한 것인 조성물.
  11. 제 10항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 자연적으로 분비된 것인 조성물.
  12. 제 10항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 인공적으로 분비된 것인 조성물.
  13. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 동물에게 투여하여 제조된 질병 모델.
  14. 제 13항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물, 사람의 비듬, 및 꽃가루로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래하는 것인 질병 모델.
  15. 제 13항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것인 질병 모델.
  16. 제 13항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 먼지, 집먼지진드기, 바퀴, 애완동물, 및 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 것에 서식하고 있는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것인 질병 모델.
  17. 제 13항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 2종 이상의 세균 또는 곰팡이에서 분비된 세포밖 소포체의 혼합물인 질병 모델.
  18. 제 15항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 (Staphylococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세테스 (Streptomycetes), 및 코리네박테리움 (Corinebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 질병 모델.
  19. 제 15항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 마이크로코커스 리래 (Micrococcus lylae), 엔터로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 및 슈도모나스 루테오라 (Pseudomonas luteola), 대장균 (Escherichia coli)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 질병 모델.
  20. 제 13항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 분리한 것인 질병 모델.
  21. 제 20항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 자연적으로 분비된 것인 질병 모델.
  22. 제 20항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 인공적으로 분비된 것인 질병 모델.
  23. 제 13항에 있어서,
    상기 질병은 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 질병 모델.
  24. 제 13항에 있어서,
    상기 동물은 마우스인 질병 모델.
  25. 제 13항에 있어서,
    상기 투여는 비강, 구강, 또는 기관(trachea)으로 투여하는 것인 질병 모델.
  26. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 이용하여 질병 예방 또는 치료 후보 약물을 탐색하는 방법.
  27. 제 26항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물, 사람의 비듬, 및 꽃가루로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래하는 방법.
  28. 제 26항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것인 방법.
  29. 제 26항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 먼지, 집먼지진드기, 바퀴, 애완동물, 및 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 것에 서식하고 있는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것인 방법.
  30. 제 26항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 2종 이상의 세균에서 분비된 세포밖 소포체의 혼합물인 방법.
  31. 제 28항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 (Staphylococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세테스 (Streptomycetes), 및 코리네박테리움 (Corinebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  32. 제 28항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 마이크로코커스 리래 (Micrococcus lylae), 엔터로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 및 슈도모나스 루테오라 (Pseudomonas luteola), 대장균 (Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  33. 제 26항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 분리한 것인 방법.
  34. 제 33항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 자연적으로 분비된 것인 방법.
  35. 제 33항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 인공적으로 분비된 것인 방법.
  36. 제 26항에 있어서,
    상기 질병은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의해 발생 또는 악화되는 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  37. 제 26항에 있어서,
    상기 방법은 제 13항의 질병 모델에 후보 약물을 투여하는 것을 특징으로 하는 방법.
  38. 제 26항에 있어서,
    상기 방법은 실내 공기유래 세포밖 소포체를 체외에서 세포에 처리할 때 후보 약물을 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
  39. 제 38항에 있어서,
    상기 세포는 염증세포, 상피세포, 또는 섬유모세포인 방법.
  40. 제 26항에 있어서,
    상기 방법은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체와 함께 후보 약물을 투여한 후, 염증 관련 매개체의 수준을 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  41. 제 40항에 있어서,
    상기 염증 관련 매개체가 TNF(Tumor necrosis factor) -alpha 또는 IL(I nterleukin) -6 인 방법.
  42. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 질병 예방 또는 치료용 백신.
  43. 제 42항에 있어서,
    상기 질병은 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.
  44. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물의 분비물, 사람의 비듬, 및 꽃가루로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래하는 것인 백신.
  45. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것인 백신.
  46. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 먼지, 집먼지진드기, 바퀴, 애완동물, 및 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 것에 서식하고 있는 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것인 백신.
  47. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 2종 이상의 세균에서 분비된 세포밖 소포체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 백신.
  48. 제 45항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 (Staphylococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세테스 (Streptomycetes), 및 코리네박테리움 (Corinebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
  49. 제 45항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 마이크로코커스 리래 (Micrococcus lylae), 엔터로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 및 슈도모나스 루테오라 (Pseudomonas luteola), 대장균 (Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
  50. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 분리한 것인 백신.
  51. 제 50항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 자연적으로 분비된 것인 백신.
  52. 제 50항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 인공적으로 분비된 것인 백신.
  53. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 형질전환된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것인 백신.
  54. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것인 백신.
  55. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 것인 백신.
  56. 제 42항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 약물을 병용 투여하여 사용하는 것을 특징으로 하는 백신.
  57. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포함하는 감염 예방 또는 치료용 백신.
  58. 제 57항에 있어서,
    상기 감염은 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 감염인 백신.
  59. 제 58항에 있어서,
    상기 감염은 병원 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 감염인 백신.
  60. 제 57항에 있어서,
    상기 감염은 세균 또는 곰팡이에 의한 부비동염, 기관지염, 기관지확장증, 폐렴, 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 백신.
  61. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것을 특징으로 하는 백신.
  62. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 먼지에 서식하고 있는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것을 특징으로 하는 백신.
  63. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 2종 이상의 세균에서 분비된 세포밖 소포체의 혼합물인 것을 특징으로 하는 백신.
  64. 제 61항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 (Staphylococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세테스 (Streptomycetes), 및 코리네박테리움 (Corinebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
  65. 제 61항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 마이크로코커스 리래 (Micrococcus lylae), 엔터로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 및 슈도모나스 루테오라 (Pseudomonas luteola), 대장균 (Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 백신.
  66. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 분리한 것인 백신.
  67. 제 66항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 자연적으로 분비된 것인 백신.
  68. 제 66항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 인공적으로 분비된 것인 백신.
  69. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 형질전환된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것인 백신.
  70. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 세균 또는 곰팡이에서 유래하는 것인 백신.
  71. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 화학물질이 처리된 것인 백신.
  72. 제 57항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 효능을 증가시키거나 부작용을 감소시키기 위하여 약물을 병용 투여하는 것을 특징으로 하는 백신.
  73. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 이용하여 상기 세포밖 소포체에 의한 질병의 발생 또는 악화에 관련된 원인인자를 진단하는 방법.
  74. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 이용하여 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에 의한 감염의 발생 또는 악화에 관련된 원인인자를 진단하는 방법.
  75. 제 73항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체에 의한 질병은 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 폐암, 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  76. 제 74항에 있어서,
    상기 세균 또는 곰팡이에 의한 감염은 부비동염, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지확장증, 폐렴, 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  77. 제 73항 또는 제 74항에 있어서,
    상기 진단은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체의 유전물질의 염기서열을 분석하는 것인 방법.
  78. 제 73항 또는 제 74항에 있어서,
    상기 진단은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체의 단백질을 측정하는 것인 방법.
  79. 제 73항 또는 제 74항에 있어서,
    상기 진단은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 대한 면역반응을 측정하는 것인 방법.
  80. 제 79항에 있어서,
    상기 면역반응 측정은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 대한 항체을 측정하는 것인 방법.
  81. 제 73항 또는 제 74항에 있어서,
    상기 진단은 실내 먼지를 이용하는 것인 방법.
  82. 제 73항 또는 제 74항에 있어서,
    상기 진단은 환자의 혈액에서 유래한 시료를 이용하는 것인 방법.
  83. 제 73항 또는 제 74항에 있어서,
    상기 진단은 환자의 객담, 콧물, 또는 소변에서 유래한 시료를 이용하는 것인 방법.
  84. 실내 공기유래 세포밖 소포체의 활성을 제거하는 것을 포함하는, 질병의 발생 또는 악화를 예방하는 방법.
  85. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 제거하는 것을 포함하는, 질병의 발생 또는 악화를 예방하는 방법.
  86. 제 84항 또는 제 85항에 있어서,
    상기 질병은 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 폐암, 및 패혈증으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  87. 제 84항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체의 활성 제거는 세포밖 소포체에 열을 처리하는 것을 포함하는 방법.
  88. 제 84항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체의 활성 제거는 세포밖 소포체에 특이적으로 작용하는 화학물질을 처리하는 단계를 포함하는 방법.
  89. 제 88항에 있어서,
    상기 화학물질은 세포밖 소포체 내 단백질, LPS (lipopolysaccharide), 또는 펩티도글리칸의 활성을 억제하는 물질인 것을 특징으로 하는 방법.
  90. 제 89항에 있어서,
    상기 LPS 활성 억제 화학물질은 폴리믹신 B (polymyxin B)인 것을 특징으로 하는 방법.
  91. 제 84항에 있어서,
    상기 방법은 상기 세포밖 소포체의 활성을 제거하는 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  92. 제 91항에 있어서,
    상기 장치는 제 87항 내지 제 90항 중 어느 한 항의 방법을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  93. 제 85항에 있어서,
    상기 방법은 상기 세포밖 소포체를 제거하는 장치를 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  94. 제 93항에 있어서,
    상기 장치는 미세필터를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  95. 제 94항에 있어서,
    상기 미세필터는 그 구멍 크기(pore size)가 10 nm 내지 200 nm 인 것을 특징으로 하는 방법.
  96. 호흡기질환의 발생 또는 악화와 관련된 실내 공기의 질을 평가하는 방법으로, 실내 공기 중의 세포밖 소포체의 농도를 측정하는 것을 특징으로 하는 방법.
  97. 제 96항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체의 농도 측정은 세포밖 소포체의 유전물질을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  98. 제 97항에 있어서,
    상기 유전물질은 16S rRNA 인 것을 특징으로 하는 방법.
  99. 제 96항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체의 농도 측정은 세포밖 소포체의 단백질을 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  100. 제 96항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체의 농도 측정은 현미경으로 세포밖 소포체의 수를 측정함으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  101. 제 100항에 있어서,
    상기 현미경은 고해상도 광학현미경 또는 전자현미경을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
  102. 실내 공기유래 세포밖 소포체를 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 예방 또는 치료 방법.
  103. 제 102항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내먼지, 집먼지진드기, 곰팡이, 바퀴, 애완동물, 사람의 비듬, 및 꽃가루로 이루어진 군에서 선택되는 것으로부터 유래하는 방법.
  104. 제 102항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 공기에 존재하는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것인 방법.
  105. 제 102항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 실내 먼지, 집먼지진드기, 바퀴, 애완동물, 및 식물로 이루어진 군으로부터 선택된 것에 서식하고 있는 세균 또는 곰팡이에서 분비되는 것인 방법.
  106. 제 102항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 2종 이상의 세균에서 분비된 세포밖 소포체의 혼합물인 방법.
  107. 제 104항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 (Staphylococcus), 마이크로코커스 (Micrococcus), 엔테로코커스 (Enterococcus), 슈도모나스 (Pseudomonas), 스트렙토마이세테스 (Streptomycetes), 및 코리네박테리움 (Corinebacterium)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  108. 제 104항에 있어서,
    상기 세균은 스타필로코커스 아우레우스 (Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 호미니스 (Staphylococcus hominis), 마이크로코커스 리래 (Micrococcus lylae), 엔터로코커스 패칼리스 (Enterococcus faecalis), 슈도모나스 스투체리 (Pseudomonas stutzeri), 및 슈도모나스 루테오라 (Pseudomonas luteola), 대장균 (Escherichia coli)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 방법.
  109. 제 102항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 분리한 것인 방법.
  110. 제 109항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 자연적으로 분비된 것인 방법.
  111. 제 109항에 있어서,
    상기 세포밖 소포체는 세균 또는 곰팡이 배양액에서 인공적으로 분비된 것인 방법.
  112. 제 102항에 있어서,
    상기 질병은 실내 공기에 존재하는 세포밖 소포체에 의해 발생 또는 악화되는 비염, 부비동염, 비인두암, 천식, 만성폐쇄성폐질환, 기관지염, 기관지확장증, 세기관지염, 폐렴, 및 폐암으로 이루어진 군에서 선택되는 것인 방법.
  113. 제 102항에 있어서,
    상기 투여는 피하주사 또는 점막투여인 것을 특징으로 하는 방법.
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