WO2021167262A1 - 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제 방법 및 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법 - Google Patents

뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제 방법 및 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법 Download PDF

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nucleoside hydrolase
nucleoside
pectobacterium
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이원재
김은경
이경아
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서울대학교 산학협력단
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    • G01N2500/04—Screening involving studying the effect of compounds C directly on molecule A (e.g. C are potential ligands for a receptor A, or potential substrates for an enzyme A)

Definitions

  • the present invention relates to a nucleoside hydrolase inhibitor, a composition for inhibiting toxicity of pathogenic microorganisms comprising the same, a composition for preventing or treating pathogenic microbial infection, a composition for controlling plant diseases, and pathogenic microorganism toxicity comprising the step of treating the composition It relates to a method for inhibiting, a method for controlling a plant disease, and a method for screening a nucleoside hydrolase inhibitor.
  • Intestinal microbial interactions are complex and evolutionarily conserved phenomena found in all metazoans. Although it is clear that the gut microbiome is deeply involved in a diverse range of host physiology, the detailed molecular mechanisms of host-microbial interactions that determine symbiosis or dysbiosis are largely unknown. This is partly due to the lack of a genetic model system that can look at both the host and microbial aspects.
  • Drosophila provides a powerful genetic model of gut-microbe interactions for understanding the symbiotic and gut microbiome/pathogenic interactions between the gut and microbes.
  • Drosophila has a relatively simple commensal predominance of the Lactobacillaceae and Acetobacteraceae families. These commensal bacteria affect many aspects of host physiology, such as immunity, development, metabolism and behavior.
  • intestinal epithelium epithelium
  • epithelium epithelium
  • epithelium epithelium
  • Ecc15 belonging to the genus (Pectobacterium) (Erwinia carotovora subspecies carotovora 15) and Pseudomonas yen Tomo Fira (Pseudomonas entomophila) and the opportunities that arise in such a natural It can have pathogenic interactions with opportunistic pathogens.
  • Drosophila gut immunity plays a pivotal role in the fight against invading pathogens by a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family (dual oxidase, DUOX) generating reactive oxygen species (ROS) against microorganisms.
  • ROS reactive oxygen species
  • IMD immune deficiency pathway
  • AMP antimicrobial peptides
  • MAMPs Microbe-associated molecular patterns
  • PGN peptidoglycan
  • DAP diaminopimelic acid
  • DAP-type PGN is not a pathogen-specific molecular pattern as it is commonly found in both symbiotics such as Acetobacter and pathogens such as Ecc15. As both bacteria can activate the IMD pathway, this pathway does not fully explain the mechanism by which the intestinal epithelium differentiates commensal from pathogens.
  • Uracil can act as a ligand to initiate complex signaling pathways for DUOX activation in intestinal cells (Ha et al., Coordination of multiple dual oxidase-regulatory pathways in responses to commensal and infectious microbes in drosophila gut. Nature immunology 10 , 949-957., 2009; Lee et al., Inflammation-Modulated Metabolic Reprogramming Is Required for DUOX-Dependent Gut Immunity in Drosophila.Cell Host Microbe 23, 338-352., 2018; Lee et al., Bacterial uracil modulates Drosophila DUOX-dependent gut immunity via Hedgehog-induced signaling endosomes.
  • This DUOX-activated signaling pathway is the target of the PLC ⁇ -Ca 2+ pathway, the hedgehog-cadherin 99C pathway and the rapamycin-autophagy 1-mediated lipolytic pathway. includes In addition to its antimicrobial role, DUOX-dependent ROS promotes pathogen clearance by acting as a ligand for the reactive chemical receptor TrpA1 (Du et al., TrpA1 Regulates Defeat of Food-Borne Pathogens under the Control of the Duox Pathway. PLoS genetics 12., 2016).
  • uracil and ribose are produced by the catabolism of bacterial nucleoside hydrolase (NH) using extracellular uridine in the intestinal lumen, and are different from pathogens.
  • symbionts evade DUOX activation by not producing uracil because of their lack of functional NH activity, and NH as a signal for bacterial-cell communication and pathogen toxicity essential for commensal-to-pathogen conversion in vivo.
  • NH nucleoside hydrolase
  • One object of the present invention is to provide a nucleoside hydrolase (NH) inhibitor.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for inhibiting the toxicity of pathogenic microorganisms comprising a nucleoside hydrolase inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing or treating pathogenic microbial infection comprising the nucleoside hydrolase inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a composition for controlling plant diseases comprising the nucleoside hydrolase inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for inhibiting the toxicity of pathogenic microorganisms comprising the step of treating a non-human subject with a composition comprising the nucleoside hydrolase inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for controlling a plant disease comprising the step of treating an individual with a composition comprising the nucleoside hydrolase inhibitor as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a nucleoside hydrolase; contacting the nucleoside hydrolase with a test substance; When the expression or activity of the nucleoside hydrolase in contact with the test substance and the nucleoside hydrolase in the control not in contact with the test substance is decreased, the test substance is treated as a nucleoside hydrolase inhibitor It is to provide a screening method for a nucleoside hydrolase inhibitor, comprising the step of selecting a candidate substance.
  • Another object of the present invention is to provide a symbiont of pathogenic microorganisms in which any one or more genes selected from the group consisting of NH1, NH2, udp and deoD genes in pathogenic microorganisms are deleted.
  • Another object of the present invention is to provide a quorum sensing inhibitor of pathogens, including a nucleoside hydrolase inhibitor.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor according to the present invention is capable of inhibiting pathogenic bacteria, that is, pathogenic microorganism toxicity, or converting pathogenic pathogens into non-pathogenic commensal bacteria.
  • Composition for inhibiting toxicity of pathogenic microorganisms comprising the same , a composition for preventing or treating pathogenic microbial infection, a composition for controlling plant disease, a method for inhibiting pathogenic microbial toxicity comprising the step of treating the composition, a method for controlling plant disease, and the mechanism according to the present invention is nucleo It can be applied as a screening method for side hydrolase inhibitors.
  • FIG. 1 is a diagram showing that pathogens induce "uridine-in and uracil-out" metabolic flow.
  • A Metabolomic profiles after intestinal Ecc15 infection were presented as heat maps. Flies were orally infected with sucrose solution in the absence or presence of Ecc15 for 2 h. As a result of metabolomic analysis of intestinal lumen using CETOF-MS (Capillary Electrophoresis Time-of Flight Time Spectrometry), a total of 152 metabolites were detected. Each metabolite was classified into eight metabolic processes.
  • Nucleotide metabolic processes are enriched by up- and down-regulated metabolites after intestinal infection. Bars represent -log 10 ( p- values), where p- values determined using DAVID software indicate the importance of processes enhanced by up- and down-regulated metabolites.
  • C Differential levels of up- and down-regulated metabolites involved in nucleotide metabolism are shown as heat maps. Color bars represent the log 2- fold change in metabolite levels after intestinal infection relative to control levels at each time point.
  • Uridine and uracil are indicated by arrows.
  • Uracil is derived from extracellular uridine by Ecc15. Ecc15 was cultured in M9 minimal medium containing uridine (D) or isotopically labeled uridine (E). The positions of radioactive N and C are shown in red. Uridine, uracil and ribose molecules in the culture supernatants were analyzed at different time points using LC-MS/MS analysis. Data are presented as mean ⁇ SD of at least 3 experiments. ND, not detected.
  • Figure 2 is a diagram showing that pathogens induce "uridine-in and uracil-out" metabolic flow.
  • Acetobacteraceae pathogen members secrete uracil for DUOX (dual oxidase; DUOX; a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family) activation.
  • DUOX dual oxidase
  • DUOX a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family
  • Bacteria were cultured in mannitol medium containing 15 N labeled uridine for 8 h, and 15 N labeled uracil in the culture supernatant was quantified using LC-MS/MS analysis.
  • C Results of heat map analysis of genes related to nucleotide metabolic pathways using whole genome information. Genes from different bacteria were compared with the corresponding genes from Gluconobacter morbifer ( G. morbifer ), and the percentage of amino acid sequence identity is indicated by blue gradient bars. Red color indicates genes that are absent (ie, less than 40% identical) in a given bacterial genome.
  • FIG. 3 is a diagram showing that bacterial NH activity induces intestinal bacterial dysbiosis.
  • AD NH activity in pathology acts as a colitogenic factor responsible for intestinal pathology and early host death.
  • the NH gene of the pathogen (pathobionts) G. morbifer WT deletion was produced by G. morbifer ⁇ NH.
  • G. morbifer ⁇ complement of NH mutant was accomplished by making the G. morbifer ⁇ -NH NH NH The gene is introduced.
  • In vitro uracil secretion capacity was determined using 15 N-labeled uridine (A), ROS production capacity (B), intestinal cell apoptosis (C) and host survival (D).
  • EH Absence of nucleoside catabolism in Acetobacteraceae is necessary for gut-microbial symbiosis.
  • A. asteurianus NupC_NH was prepared by introducing the NH and NupC genes of G. morbifer into A. pasteurianus WT.
  • In vitro uracil secretion capacity was measured using 15 N-labeled uridine (E), ROS production capacity (F), intestinal cell apoptosis (G) and host survival (H).
  • Ecc15 ⁇ 4 is a diagram showing that the nucleoside catabolism of Ecc15 is required for uracil secretion and bacterial metabolism regulation.
  • A In vitro secretion of uracil from Ecc15 requires nucleoside catabolism activity. By deleting the NH 2 gene and the two NP gene of Ecc15 WT it was produced Ecc15 ⁇ 4. Complement of Ecc15 ⁇ 4 has been achieved by the introduction of the NH gene produced Ecc15 ⁇ 4_NH. Bacteria were cultured in M9 minimal medium containing uridine for the indicated times, and uridine and uracil levels in the culture supernatants were quantified using LC-MS/MS analysis.
  • Flies were orally infected with different pathogens (about 2 ⁇ 10 9 CFU for Pseudomonas aeruginosa , P. aeruginosa and about 1 ⁇ 10 10 CFU for other bacteria) for 2 hours.
  • Intestinal luminal fluid was analyzed to quantify uracil and uridine levels via LC-MS/MS analysis.
  • (EF) represents a relative ratio of the Related Gene Ontology Biological process of the 320 differentially expressed genes between the Ecc15 Ecc15 ⁇ 4 according to (gene ontology biological processes, GOBP) .
  • the terms GOBP for level 1 (E) and level 2-4 (F) were used for general cellular and metabolic processes, respectively.
  • FIG. 5 is a diagram showing that nucleoside catabolism activity is required for acyl homoserine lactone (AHL)-dependent quorum sensing (QS) activation, and toxic gene expression is required in an RbsR-dependent manner.
  • A Nucleoside catabolism is required for the production of AHL-type quorum sensing molecules.
  • cultures or the Ecc15 Ecc15 ⁇ 4 culture supernatant at different growth point with the E. coli strain pSB401 (bioluminescence-based biosensors AHL type QS), to use a light emitting system to measure the bioluminescence.
  • Ecc15 ⁇ 4 The non-nucleoside catabolic activity Ecc15 mutation (Ecc15 ⁇ 4) was used as a control. Data are presented as mean ⁇ SD of at least 3 experiments.
  • Evf expression is under the control of nucleoside catabolism, RbsR and ExpIR dependent QS system. Expression levels of evf were analyzed using qPCR (E) and Pevf::GFP reporter activity (F).
  • E qPCR
  • F Pevf::GFP reporter activity
  • the target gene expression of Ecc15 WT was arbitrarily set to 1, and the result was expressed as a relative expression level. Bars are expressed as mean ⁇ SD (*** P ⁇ 0.001) of at least three independent experiments.
  • FIG. 6 is a diagram showing that nucleoside catabolism activity is required for the conversion of bacteria QS and commensal pathogens in the intestine.
  • A Nucleoside catabolism activity is required for QS activation in vivo in the intestinal lumen. Paris was oral infection with WT or Ecc15 Ecc15 ⁇ 4 with a bioluminescent reporter strain E. coli pSB401. Bioluminescence imaging of live flies was obtained 1.5 h after infection. Each dot represents an individual fly and the horizontal line represents the mean value. *** P ⁇ 0.001 (ANOVA). Representative images are shown.
  • B Nucleoside catabolism activity is required for toxic gene activation in vivo in the intestinal lumen.
  • Ecc15 WT or Ecc15 ⁇ 4 carrying Pevf :: GFP reporter was used for oral infections for 2 hours using larvae or flies. Fluorescence intensities of individual fields were measured via confocal microscopy. Each dot represents an individual animal and the horizontal line represents the mean value. *** P ⁇ 0.001 (ANOVA). Representative confocal images are shown.
  • C Effect of bacterial nucleoside catabolism on developmental rate. Bacteria of the indicated genotypes were added to sterile embryos and the rate of pupa formation was monitored every 12 hours. Ecc15 ⁇ 4 has improved the speed of the host development similar to the growth-promoting symbiotic fungus A. pomorum.
  • Pathogens can use NupC and NH to induce “uridine-in and uracil-out” metabolic flows.
  • uridine-derived ribose activates RbsR for bacterial cell-to-cell communication (via QS activation) and QS-dependent pathogenesis.
  • host intestinal cells recognize the presence of pathogens by sensing uridine-derived uracil.
  • Uracil serves as a ligand for DUOX activation and subsequent generation of bactericidal ROS.
  • a kind of arms race occurs between host defense (uracil-dependent microbial ROS) and pathogen toxicity (ribose-dependent evf toxin).
  • Pathogens can use NupC and NH to induce “uridine-in and uracil-out” metabolic flows, which lead to chronic DUOX activation, intestinal cell damage and premature host death.
  • symbiotic members lacking nucleoside catabolism can interact with intestinal cells without DUOX activation. All members of the Acetobacter family (pathogens or symbionts) do not have a QS system.
  • FIG. 8 is a diagram showing that Drosophila intestinal luminal uridine is highly likely derived from host intestinal cells.
  • A Nucleoside levels in luminal fluid measured without intestinal infection. Conventional (CV) flies (5 days old) were orally ingested with 5% sucrose for 2 h before preparing the intestinal lumen.
  • B Intestinal luminal uridine is not derived from gut bacteria or nutrients. CV or GF flies (3 days old) were fed either a standard cornmeal yeast diet or a holy dick diet lacking uridine for 10 days (ie, 13 day old CV or GF flies were used for uridine measurement).
  • 10 is a gene involved in primary metabolism is a diagram showing the up-regulated significantly in Ecc15 ⁇ 4. 1, the level of expression of 11 genes involved in primary metabolism was determined by qPCR analysis using Ecc15 WT, Ecc15 ⁇ 4, ⁇ Ecc15 RbsR and Ecc15 ⁇ ExpIR.
  • the primary metabolic genes are as follows: purH (Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase, GJS26_00239), pgm (Phosphoglucomutase, GJS26_01330), pgk (Phosphoglycerate kinase, GJS26_03794), nJSpyk (Pyruvate kinase, GJS26_01172), adk (Pyruvate kinase, GJS26_01172).
  • FIG. 11 is a diagram showing that RbsR and ExpIR (but not luxs) are required for conversion to commensal pathogens in the intestine.
  • A Effect of RbsR regulator and quorum sensing on developmental rate. Bacteria of the indicated genotypes were added to sterile (GF) embryos and the percentage of pupa formation was monitored every 12 hours.
  • B Effect of RbsR modulators and quorum sensing on animal size. Bacteria of the indicated genotypes were added to GF embryos and larval size was measured 108 hours after spawning. Each dot represents an individual fly and the horizontal line represents the mean value. *** P ⁇ 0.001 (ANOVA). NS, not significant. Representative images are shown. Conventional (CV) flies were used as controls. Deletion of ExpIR is sufficient to induce pathogen-community conversion but not LuxS, indicating that ExpI-dependent quorum sensing is required for bacterial pathogenicity.
  • FIG. 12 is a diagram illustrating the role of nucleoside catabolism on the QS-dependent toxicity of P. aeruginosa PAO1.
  • a single NH gene was identified in the genome of P. aeruginosa PAO1.
  • the pqsL-PAO1 strain was used (Hazan, et al., Auto Poisoning of the Respiratory Chain by a Quorum-Sensing-Regulated Molecule Favors Biofilm Formation and Antibiotic Tolerance. Current biology : CB 26, 195-206., 2016).
  • By deleting the NH gene was produced PAO1 ⁇ NH.
  • PAO1 ⁇ NH_NH was prepared by introducing the gene into the NH NH ⁇ PAO1 mutants.
  • (AB) Shows the activity of toxic factors. Elastase activity (A) and pyocyanin production (B) were measured in the presence or absence of NH activity. Elastase activity and pyocyanin production were measured using culture supernatants.
  • FIG. 13 is a diagram showing the function of the NH (Nucleoside hydrolase) enzyme activity inhibitor of pathogens.
  • A Structural formula of NH enzyme activity inhibitor.
  • B The degree to which the NH enzyme decomposes the corresponding substrate, uridine, was measured by spectrophotometric assay. When only the enzyme and uridine were added to the reaction (None), the uridine concentration was rapidly decreased by the activity of the enzyme. On the other hand, when the inhibitor, DMAPIR, was added at various concentrations, it was confirmed that the enzyme activity was inhibited in proportion to the concentration.
  • Ecc15 Erwinia carotovora subsp. carotovora 15, belonging to the genus Pectobacterium ) is not only a pathogen of Drosophila, but also a plant pathogen that can cause disease in a wide range of plants. Since the genus Pectobacterium is known to cause several plant diseases, including soft rotting, in plants, it was confirmed whether these plant diseases could be controlled by inhibiting NH enzyme activity.
  • Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 15 Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 15 , Pcc15
  • Pectobacterium chrysanthemi Pch, which has been reported to cause diseases in ornamental plants, bulbs of plants, etc.
  • Pectobacterium atro causing blackleg of potato Seb tikum (Pectobacterium atrosepticum), about a known Peck tobak Te Solarium beta basul to cause disease in sugar beet target the room (Pectobacterium betavasulorum, Pbe) bacteria in the same way as the (D) causing soft rot in potatoes reduced by DMPAPIR
  • One aspect of the present invention for achieving the above object provides a nucleoside hydrolase (NH) inhibitor.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention may be a compound represented by the following Chemical Formula 1, and may include, without limitation, a compound represented by the following Chemical Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • R may be a phenyl group unsubstituted or substituted with di(C 1 -C 2 alkyl)amino.
  • the C 1 -C 2 alkyl may be, for example, —CH 3 , —CH 2 CH 3 , —CH 2 CH 3 —CH 3 , and the like.
  • R is a compound having the present invention.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention may include a compound represented by the following Chemical Formulas 2 to 8, and a compound represented by the following Chemical Formulas 2 to 8, or a pharmaceutically acceptable compound thereof. salts may be included without limitation.
  • Formula 2 is DMPAIR ((2S,3S,4R,5R)-2-(4-(dimethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol, MW: 252.31)
  • Formula 3 is DMMAPIR ((2S,3S,4R,5R)-2-(3-(dimethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol)
  • Formula 4 is DEPAPIR ((2S, 3S,4R,5R)-2-(4-(diethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol)
  • Chemical Formula 5 is DEMAPIR ((2S,3S,4R,5R)-2- (3-(diethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol)
  • Chemical Formula 6 is MEAPIR((2S,3S,4R)
  • the intestinal microflora most bacteria are harmless or beneficial (hereinafter “symbionts”), while other bacteria are conditionally (especially when they dominate) pathogenic (hereinafter “pathobionts”). Accordingly, the intestinal epithelium must control pathogens while maintaining peaceful cohabitation with commensals in the face of an immunological dilemma.
  • the innate immune system which consists of pathogen recognition by a microbe-associated molecular pattern (MAMP) and subsequent activation of an antimicrobial response to pathogen antagonism, has been well documented in the mucosal immunity of other metazoans, including Drosophila. Given that all microbes, without exception, have MAMPs, current knowledge of the innate immune system based on MAMP recognition explains how the gut distinguishes pathogens from commensal and how the gut activates pathogen-specific antimicrobial responses. can not do.
  • MAMP microbe-associated molecular pattern
  • microbe-contact mucosal intestinal epithelium may recognize pathogens and induce microbial ROS production by sensing pathogen-specific metabolic activity that can produce pathogen-specific metabolites such as uracil. .
  • pathogen-specific metabolic activity has never been explained, and it is difficult to explain why the pathogen specifically releases uracil.
  • the present invention relates to “uridine-in and uracil-out (uridine-in) and uracil-out ( out)" metabolic flow (Fig. 7) is required to improve inter-bacterial communications and bacterial pathogenesis in Drosophila, and uridine-derived uracil is a double oxidase ( While a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family, dual oxidase, DUOX) is required on the host side for ROS-dependent generation of reactive oxygen species (ROS), uridine-derived ribose is quorum sensing, on the bacterial side.
  • ROS reactive oxygen species
  • nucleoside hydrolase As used herein, the term "nucleoside hydrolase (NH)” is also called nucleoside N-ribohydrolases (NRHs; EC 3.2.2.-), and nucleosides It refers to a glycosidase that catalyzes the cleavage of the N-glycosidic bond at the side and enables the recycling of nucleobase and ribose. The process of recycling nucleosides and nucleobases is also called salvaging as a way to conserve energy.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention may be characterized in that it inactivates a quorum sensing signal of a pathogen.
  • the transcript analysis results show that the absence of uridine metabolism positively or negatively modulates a wide range of bacterial metabolic processes ( FIG. 4 ).
  • the first down-regulation of up-regulation, and quorum sensing process of the metabolic activity is observed in Ecc15 ⁇ 4, which indicates that the inverse correlation exists between the primary metabolic activity and quorum sensing.
  • primary metabolic activity was higher in bacterial quorum sensing-mutant strains than in control strains, suggesting that quorum sensing functions as a metabolic brake.
  • Ecc15 ⁇ 4 and the quorum sensing-mutant was found similar metabolic pattern (that is, the first up-regulation of primary metabolism genes) among bacteria, suggesting an association between uridine metabolism and quorum sensing.
  • ribose is not secreted from bacterial cells after uridine catabolism ( Figure 1).
  • RbsR which has been identified to be involved in nucleoside catabolism-dependent regulation of quorum sensing, is likely activated by uridine-induced ribose, which is required for the complete expression of important genes involved in quorum sensing activation, such as ExpR. (Fig. 5).
  • Ecc15 ⁇ 4 down regulation of ExpR / ExpI system may explain the low production of the acyl homoserine lactone (acyl homoserine lactone, AHL) (Fig. 5).
  • Communication between bacterial cells through quorum sensing plays a pivotal role in bacterial pathogenesis.
  • nucleoside catabolism is a novel in vivo quorum sensing regulatory system required for in vivo quorum sensing activation and subsequent toxic gene expression in the intestinal lumen (FIG. 6). Nucleoside importance of side catabolism is additionally being to confirm the removal of uridine Physicochemical activity as observed in Ecc15 ⁇ 4 is sufficient to induce a phenotypic transition to the symbiotic bacteria to promote growth in the pathogen life-threatening Proven.
  • Intestinal uridine is an indicator that bacteria are in their living environment, as we confirm that uridine, which is abundantly present in the gut lumen, is readily utilized by bacterial nucleoside catabolism to induce ribose production and subsequent quorum sensing activation. can be (Fig. 7).
  • the degree of decomposition of uridine, a substrate, by adding the compound together with an NH enzyme As a result of the analysis, when only the enzyme and uridine were added to the reaction (None), the uridine concentration was rapidly decreased by the activity of the enzyme. was confirmed to be inhibited (FIGS. 13B-C).
  • the minimum concentration that can inhibit the enzyme activity is measured to be ⁇ 1 ⁇ M for DMAPIR (DM), ⁇ 100 ⁇ M for BnIR, and ⁇ 100 ⁇ M for PAPIR, which is about 100 times more effective in the case of DMAPIR. It was confirmed that the degree was excellent. In the case of BnIR, it was confirmed that the inhibitory function was similar to that of the existing PAPIR.
  • nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention has significantly superior nucleoside hydrolase inhibitory effect compared to the conventional nucleoside hydrolase inhibitor.
  • Another aspect of the present invention provides a composition for inhibiting the toxicity of pathogenic microorganisms comprising the nucleoside hydrolase inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof of the present invention as an active ingredient.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention may be a compound represented by Formula 1, and may include, without limitation, the compound represented by Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, it may include the compound represented by Formulas 2 to 8, and may include, without limitation, the compound represented by Formulas 2 to 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention can inhibit pathogenic microbial toxicity through nucleoside hydrolase inhibition or convert pathogenic pathogens into non-pathogenic commensal bacteria.
  • the pathogenic microorganism may be a microorganism expressing a nucleoside hydrolase, and specifically, if it is an intestinal microorganism expressing a nucleoside hydrolase, it is not particularly limited, for example, Pectobacterium or Pseudomonas It may be a microorganism of the genus ( Pseudomonas ).
  • the Peck tobak Te Solarium in microorganisms Ecc15 Erwinia carotovora subspecies carotovora 15
  • Peck tobak Te Leeum Art by Seb tikeom Pectobacterium atrosepticum
  • Peck tobak Te Solarium Caro sat borum Pectobacterium carotovorum
  • Peck tobak Te Solarium wasabi kids Pectobacterium wasabiae
  • Erwinia amylovora Erwinia amylovora
  • Erwinia pyrifoliae Erwinia pyrifoliae
  • PAO1 Pseudomonas syringae
  • Pseudomonas syringae Pseudomonas syringae
  • Pseudomonas tolaasii Pseudomonas tolaasii
  • Pseudomonas agarici Pseudomonas agarici
  • composition is selected from i) a nucleoside hydrolase inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof, ii) an agent that inhibits the expression of a nucleoside hydrolase or a gene encoding the same, or iii) a combination thereof.
  • a nucleoside hydrolase inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof ii) an agent that inhibits the expression of a nucleoside hydrolase or a gene encoding the same, or iii) a combination thereof.
  • an agent that inhibits the expression of a nucleoside hydrolase or a gene encoding the same iii) a combination thereof.
  • One or more may be included as an active ingredient.
  • the agent inhibiting the nucleoside hydrolase is an oligopeptide, monoclonal antibody, polyclonal antibody, chimeric antibody, ligand, PNA (peptide) that specifically binds to the nucleoside hydrolase. nucleic acid) or an aptamer;
  • the agent for inhibiting the expression of the gene encoding the nucleoside hydrolase is siRNA (small interference RNA), shRNA (short hairpin RNA) or miRNA that specifically binds to the gene encoding the nucleoside hydrolase. (microRNA), but is not limited thereto.
  • an antibody is a term known in the art and refers to a specific protein molecule directed against an antigenic site.
  • an antibody refers to an antibody that specifically binds to the nucleoside hydrolase of the present invention, and such an antibody is obtained by cloning each gene into an expression vector according to a conventional method to the marker gene. It can be obtained by obtaining the protein encoded by the protein, and prepared by a conventional method from the obtained protein. This also includes partial peptides that can be made from the protein.
  • the form of the antibody of the present invention is not particularly limited, and a part thereof is also included in the antibody of the present invention as long as it has polyclonal antibody, monoclonal antibody or antigen-binding property, and all immunoglobulin antibodies are included.
  • Antibodies of the invention include functional fragments of antibody molecules as well as complete forms having two full-length light chains and two full-length heavy chains.
  • a functional fragment of an antibody molecule refers to a fragment having at least an antigen-binding function, and includes Fab, F(ab'), F(ab') 2 and Fv.
  • siRNA refers to a small RNA fragment with a size of 21-25 nucleotides produced by cleaving double-stranded RNA by Dicer, which specifically binds to mRNA having a complementary sequence and inhibits expression. .
  • siRNA can be synthesized chemically or enzymatically. The method for preparing siRNA is not particularly limited, and methods known in the art may be used.
  • the siRNA used in the present invention is a complete form having a polynucleotide pairing per se, that is, a form introduced into cells through two transformation processes in which siRNA is directly synthesized in vitro, or one form to have this form after administration in vivo
  • a form in which the single-stranded oligonucleotide fragment and its reverse complement can be derived from a single-stranded polynucleotide separated by a spacer for example, an siRNA expression vector prepared so that the siRNA is expressed in a cell or a PCR-derived siRNA
  • the expression cassette may be in the form of being introduced into a cell through a transformation or infection process. The determination of how to prepare siRNA and introduce it into a cell or animal may depend on the purpose and cellular biological function of the target gene product.
  • shRNA is a single-stranded RNA having a length of 45 to 70 nucleotides, and synthesized oligo DNA that connects a 3-10 base linker between the sense of the target gene siRNA base sequence and the complementary nonsense sequence.
  • miRNA refers to an approximately 22 nt untranslated RNA that acts as a post-transcriptional suppressor through base binding with the 3' untranslated region (UTR) region of mRNA.
  • the method for preparing miRNA is not particularly limited, and methods known in the art may be used.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor DMAPIR of the present invention confirmed that the activity of elastase, which is a representative virulence factor of the pathogen PAO1, decreased in proportion to the treatment concentration of elastase (Fig. 13H).
  • the composition may be in any one or more forms selected from the group consisting of liquids, granules, powders, emulsions, oils, wettable powders, and coatings, and any suitable excipients commonly used in compositions for inhibiting pathogenic microorganism toxicity are added may be included, and such excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffers, stabilizing agents, or isotonic agents, but is not limited thereto.
  • the content of the active ingredient included in the composition of the present invention is not limited as long as the composition has an effect of inhibiting pathogenic microorganism toxicity, but based on the total weight of the final composition, 0.0001 to 99.9% by weight, more specifically 0.01 to 80% by weight can be included as
  • composition for inhibiting the toxicity of pathogenic microorganisms may be provided as a quasi-drug composition.
  • the quasi-drug composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent if necessary in addition to the above components.
  • a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent is not limited as long as it does not impair the effects of the present invention, and includes, for example, fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, surfactants, lubricants, sweeteners, fragrances, preservatives, etc. may include
  • the "pharmaceutically acceptable carrier” may mean a carrier, excipient or diluent that does not inhibit the biological activity and properties of the injected compound without irritating the organism, and specifically, non-naturally occurring carrier).
  • the type of carrier usable in the present invention is not particularly limited, and any carrier commonly used in the art and pharmaceutically acceptable may be used.
  • Non-limiting examples of the carrier include saline, sterile water, Ringer's solution, buffered saline, albumin injection solution, dextrose solution, maltodextrin solution, glycerol, ethanol, and the like. These may be used alone or in mixture of two or more.
  • composition comprising a pharmaceutically acceptable carrier may be in various oral or parenteral formulations.
  • formulation it is prepared using diluents or excipients, such as commonly used fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrants, and surfactants.
  • solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and such solid preparations include at least one excipient, for example, starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, It may be prepared by mixing gelatin or the like.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid formulations for oral use include suspensions, solutions, emulsions, and syrups.
  • various excipients such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives may be included.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • Witepsol Macrogol, Tween 61, cacao butter, laurin fat, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the quasi-drug composition of the present invention may include, but is not limited to, disinfectant cleaner, shower foam, ointment, wet tissue, coating agent, etc. It may be appropriately selected from the techniques of
  • Another aspect of the present invention provides a composition for preventing or treating pathogenic microbial infection comprising the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention may be a compound represented by Formula 1, and may include, without limitation, the compound represented by Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, it may include the compound represented by Formulas 2 to 8, and may include, without limitation, the compound represented by Formulas 2 to 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention can inhibit pathogenic microbial toxicity through nucleoside hydrolase inhibition or convert pathogenic pathogens into non-pathogenic commensal bacteria.
  • the pathogenic microorganism may be a microorganism expressing a nucleoside hydrolase, and specifically, if it is an intestinal microorganism expressing a nucleoside hydrolase, it is not particularly limited, for example, a microorganism of the genus Pectobacterium or Pseudomonas.
  • the microorganism of the genus Pectobacterium may be Ecc15, Pectobacterium atrocepticum, Pectobacterium carotoborum, Pectobacterium wasabiae, Erwinia amylobora, Erwinia pirifoliae, etc., and one For example, it may be Ecc15, and the like, and the Pseudomonas genus microorganism may be PAO1, Pseudomonas syringae, Pseudomonas tolassi, Pseudomonas agarici, etc., and may be, for example, PAO1, etc., but is not limited thereto.
  • the degree of decomposition of uridine, a substrate, by adding the compound together with an NH enzyme As a result of the analysis, when only the enzyme and uridine were added to the reaction (None), the uridine concentration was rapidly decreased by the activity of the enzyme. was confirmed to be inhibited (FIGS. 13B-C).
  • the minimum concentration that can inhibit the enzyme activity is measured to be ⁇ 1 ⁇ M for DMAPIR (DM), ⁇ 100 ⁇ M for BnIR, and ⁇ 100 ⁇ M for PAPIR, which is about 100 times more effective in the case of DMAPIR. It was confirmed that the degree was excellent. In the case of BnIR, it was confirmed that the inhibitory function was similar to that of the existing PAPIR.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor DMAPIR of the present invention confirmed that the activity of elastase, a representative virulence factor of the pathogen PAO1, decreased in proportion to the treatment concentration of elastase ( 13H).
  • prevention refers to any action that inhibits or delays the onset of pathogenic microbial infection by administration of the pharmaceutical composition according to the present invention
  • treatment refers to pathogenic microbial infection by administration of the pharmaceutical composition. It refers to any action that improves or beneficially changes the symptoms of the suspected and affected individual.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an appropriate carrier, excipient or diluent commonly used in the preparation of the pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition is each formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, etc., external preparations, suppositories and sterile injection solutions according to conventional methods to be used. can
  • carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia gum, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, etc., and these solid preparations include at least one excipient in the extract and its fractions, for example, starch, calcium carbonate, It is prepared by mixing sucrose or lactose, gelatin, etc.
  • lubricants such as magnesium stearate and talc are also used.
  • Liquid formulations for oral use include various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, and preservatives, in addition to water and liquid paraffin, which are simple diluents commonly used for suspensions, solutions, emulsions, syrups, etc. have.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solutions, suspensions, emulsions, freeze-dried preparations, and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspending agents include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • As the base of the suppository witepsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin, glycerogelatin, and the like can be used.
  • the content of the active ingredient included in the pharmaceutical composition of the present invention is not limited as long as the pharmaceutical composition has a preventive or therapeutic effect on pathogenic microbial infection, but 0.0001 to 99.9% by weight, more specifically 0.01, based on the total weight of the final composition to 80% by weight.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means sufficient to treat or prevent a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment or prevention. means the amount, and the effective dose level is the severity of the disease, the activity of the drug, the patient's age, weight, health, sex, the patient's sensitivity to the drug, the administration time of the composition of the present invention used, the route of administration and the rate of excretion Treatment period , factors including drugs used in combination with or concurrently with the composition of the present invention and other factors well known in the medical field.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, and may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents. and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect with a minimum amount without side effects.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention may be, for example, 0.1 to 500 mg/kg body weight of the pharmaceutical composition of the present invention administered to animals, including humans, per day, but is not limited thereto.
  • the frequency of administration of the composition of the present invention is not particularly limited thereto, but may be administered once a day or administered several times in divided doses. The above dosage does not limit the scope of the present invention in any way.
  • the administration route of the pharmaceutical composition may be administered through any general route as long as it can reach the target tissue.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is not particularly limited thereto, but depending on the intended route, such as intraperitoneal administration, intravenous administration, intramuscular administration, subcutaneous administration, intradermal administration, oral administration, intranasal administration, intrapulmonary administration, rectal administration, etc. can be administered through
  • the composition may be administered by any device capable of transporting the active substance to a target site, tissue or cell.
  • Another aspect of the present invention provides a composition for controlling plant diseases comprising the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, as an active ingredient.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, of the present invention may be a compound represented by Formula 1, and the compound represented by Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof, is not limited thereto. may include Specifically, it may include the compound represented by Formulas 2 to 8, and may include, without limitation, the compound represented by Formulas 2 to 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention is capable of inhibiting the toxicity of pathogenic microorganisms causing plant diseases through inhibition of nucleoside hydrolases, or converting pathogenic pathogens causing plant diseases into non-pathogenic commensal bacteria.
  • the plant disease may be caused by microbial infection.
  • Microorganisms that cause the plant diseases may be a microorganism that expresses a nucleoside hydrolase, and thus is not particularly limited, and for example, specification may be tobak Te Solarium in (Pectobacterium) or Pseudomonas species (Pseudomonas) microorganism.
  • the Pectobacterium genus microorganism is, for example, Pectobacterium kerotovorum subsp. brasilliense (Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense, Pcb), Pectobacterium kerotovorum subspecies carotoborum 15 (Pectobacterium carotovorum subsp.
  • Pseudomonas may be, for example , Pseudomonas syrigae , Pst, etc., but is not limited thereto.
  • composition may further comprise an antibiotic.
  • composition for controlling plant diseases of the present invention contains a nucleoside hydrolase inhibitor as an active ingredient, the concentration or dose of the antibiotic is adjusted to the existing concentration or There are economic and environmental advantages in that it can be used at a lower capacity than the capacity.
  • the antibiotic may be used without limitation as long as it is an antibiotic exhibiting a plant disease control effect, but may be, for example, neomycin, ribostamycin, streptomycin, etc., but is not limited thereto.
  • DMPAPIR and BnIR which are nucleoside hydrolase inhibitors of the present invention, are plant pathogens Pectobacterium kerotoborum subsp. brasilliense (Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense, Pcb), Pectobacter Rium kerotoborium subspecies carotoborum 15 ( Pectobacterium carotovorum subsp.
  • the composition may be in any one or more forms selected from the group consisting of liquids, granules, powders, emulsions, oils, wettable powders, and coatings, and any suitable excipients commonly used in compositions for controlling plant diseases may be added.
  • excipients may be, for example, preservatives, wetting agents, dispersing agents, suspending agents, buffers, stabilizing agents or isotonic agents, and the like, but are not limited thereto.
  • the content of the active ingredient included in the composition of the present invention is not limited as long as the composition has a plant disease control effect, but is based on the total weight of the final composition in an amount of 0.0001 to 99.9% by weight, more specifically 0.01 to 80% by weight. may be included.
  • Another aspect of the present invention provides a method for inhibiting pathogenic microbial toxicity, comprising the step of treating an individual other than a human with the composition for preventing or treating pathogenic microbial infection of the present invention.
  • the composition of the present invention may be in any one or more forms selected from the group consisting of liquids, granules, powders, emulsions, oils, wettable powders, and coatings, and the method is not particularly limited and the form of the composition may be appropriately selected and performed according to the
  • the composition of the present invention may be administered alone or in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered single or multiple. Taking all of the above factors into consideration, it is important to administer an amount that can obtain the maximum effect with a minimum amount without side effects, and the treatment (spray) amount or treatment time interval may vary depending on the individual and can be easily determined by those skilled in the art. have.
  • Another aspect of the present invention provides a method for treating a pathogenic microbial infection, comprising administering the composition for preventing or treating a pathogenic microbial infection of the present invention to an individual other than a human.
  • Another aspect of the present invention provides a method for controlling plant diseases, comprising the step of treating an individual with the composition for controlling plant diseases of the present invention.
  • the composition of the present invention may be in any one or more forms selected from the group consisting of liquids, granules, powders, emulsions, oils, wettable powders, and coatings, and the control method is not particularly limited and the composition may be appropriately selected and performed according to the form of Specifically, the control method may be any one or more selected from the group consisting of foliage treatment, soil treatment, immersion treatment, eggplant treatment, and agricultural equipment treatment, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention may be treated alone or administered in combination with other control agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional control agents, and may be administered single or multiple.
  • the preferred treatment amount of the composition of the present invention can be appropriately adjusted by those skilled in the art in consideration of the growth level of plants, the cultivated land environment, the degree of onset of plant virus disease, and the like, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention may be one that is generally treated with plants at a concentration of 0.5 to 1000 ⁇ M (1 mM) per plant, but is not limited thereto.
  • a concentration of 1 to 100,000 times specifically, a concentration of 100 to 50,000 times, more specifically, a concentration of 500 to 10,000 times than the concentration during treatment on a plant Concentration can be manufactured, stored, and transported, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention is to provide a nucleoside hydrolase; contacting the nucleoside hydrolase with a test substance; When the expression or activity of the nucleoside hydrolase in contact with the test substance and the nucleoside hydrolase in the control not in contact with the test substance is decreased, the test substance is treated as a nucleoside hydrolase inhibitor It provides a screening method for a nucleoside hydrolase inhibitor, comprising the step of selecting a candidate substance.
  • the candidate nucleoside hydrolase inhibitor may inhibit the activity of a nucleoside hydrolase degrading uridine so that uridine is not degraded.
  • compositions for converting a pathogenic microorganism into a symbiotic comprising an agent for inhibiting the expression of a nucleoside hydrolase or a gene encoding the same.
  • the agent inhibiting the nucleoside hydrolase is an oligopeptide, monoclonal antibody, polyclonal antibody, chimeric antibody, ligand, PNA or aptamer that specifically binds to the nucleoside hydrolase;
  • the agent for inhibiting the expression of the gene encoding the nucleoside hydrolase may be siRNA, shRNA, or miRNA that specifically binds to the gene encoding the nucleoside hydrolase, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a symbiotic bacteria of pathogenic microorganisms in which any one or more genes selected from the group consisting of NH1, NH2, udp and deoD genes in pathogenic microorganisms are deleted.
  • a pathogenic microorganism when a gene encoding a nucleoside hydrolase of the present invention including any one or more of the NH1, NH2, udp and/or deoD genes is deleted or its activity is inhibited, the pathogenic microorganism, that is, , it is possible to convert pathogens exhibiting pathogenicity into symbiotic bacteria exhibiting nonpathogenicity, as described above.
  • the NH1, NH2, udp and deoD genes have, contain, or consist essentially of the nucleotide sequences of SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, and SEQ ID NO: 4, respectively. of) can be
  • the NH1, NH2, udp and deoD genes have 70% or more, 75% or more, 80% or more, 85% of homology or identity with the sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4 or more, 90% or more, 95% or more, 96% or more, 97% or more, 98% or more, and less than 100% of the base sequence, or SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 3 or SEQ ID NO: 4
  • nucleotide sequence having such homology or identity and exhibiting efficacy corresponding to the NH1, NH2, udp and deoD genes some sequences are deleted, modified, substituted, conservatively substituted, or variants having an added nucleotide sequence are also present. It is obvious that they are included within the scope of the invention.
  • NH1, NH2, udp and deoD polypeptides encoded by the NH1, NH2, udp and deoD genes include, or consist of, the amino acid sequence of SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7 and SEQ ID NO: 8. It may be necessarily made, but is not limited thereto.
  • the pathogenic microorganism may be a microorganism of the genus Pectobacterium or genus Pseudomonas, and specifically may be Ecc15, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides a quorum sensing inhibitor of a pathogen, comprising the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor of the present invention may be a compound represented by Formula 1, and may include, without limitation, the compound represented by Formula 1, or a pharmaceutically acceptable salt thereof. Specifically, it may include a compound represented by Formulas 2 to 8, and may include, without limitation, a compound represented by Formulas 2 to 8, or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor may inactivate a quorum sensing signal of a pathogen, as described above.
  • the Drosophila intestine was infected with Ecc15 (Erwinia carotovora subspecies carotovora 15), a Drosophila opportunistic pathogen, and then the luminal fluid of the fruit fly midgut was subjected to TOF.
  • Ecc15 Erwinia carotovora subspecies carotovora 15
  • MS time-of flight time spectrometry
  • Ecc15 strain is ampicillin 100 ⁇ g/ml, kanamycin 30 ⁇ g/ml, apramycin 25 ⁇ g/ml, tetracycline 20 ⁇ g/ml, rifampicin 50 ⁇ g/ml And chloramphenicol (chloramphenicol) 35 ⁇ g / ml was cultured in LB or minimal M9 medium at 30 °C.
  • Drosophila 5-6 days old were orally infected for 2 h with a sucrose solution containing 10 10 CFU or less of Ecc15, and no more than 150 dissected female midguts ( Intestinal luminal fluids were obtained from the midguts.
  • the dissected midgut was cut into 4-5 pieces and further incubated in ice-cold phosphate buffered saline (PBS) solution for 10 minutes to obtain diffused luminal fluid.
  • PBS ice-cold phosphate buffered saline
  • the diffused luminal fluid was centrifuged at 4,000 rpm for 1 min and filtered through a 0.2 ⁇ m cellulose acetate filter (ADVANTEC) for metabolomic analysis (Human Metabolome Technologies Inc.).
  • ADVANTEC 0.2 ⁇ m cellulose acetate filter
  • Metabolites were divided into two biological replicates per sample [gut luminal fluids from non-infected gut, (NI lumen) and gut luminal fluids from infected gut, I luminal fluid. )) with an Agilent CETOF-MS system (Capillary Electrophoresis Time-of Flight Time Spectrometry, Agilent Technologies Inc.) in positive and negative ion mode. Peaks detected in CETOF-MS analysis were extracted using automated integrated software (MasterHands version 2.16.0.15 developed by Keio University) to obtain peak information including m/z, migration time (MT) and peak area. did. The abundance of 158 metabolites detected in the NI and I luminal fluids was calculated as the peak area.
  • metabolites between NI and I luminal fluids were identified as absolute log 2 -fold-changes > 1 (2-fold) or metabolites detected only in NI or I luminal fluid.
  • metabolite groups eg, nucleotides and amino acids
  • enrichment analysis was performed using Fisher's exact test and groups with p -values less than 0.05 were selected.
  • uridine from the gut lumen is rapidly taken up by bacterial cells (i.e., uridine-in), leading to catabolism of uridine to ribose and uracil, and uracil to these cells. is secreted by (ie, uracil-out).
  • Ecc15 was cultured in minimal medium containing uridine, and uridine, uracil and D-ribose obtained from the culture supernatant or intestinal lumen obtained from 30 midguts were electrosprayed. interface) was analyzed using Agilent 6460 Triple Quadrupole mass spectrometry (Agilent Technologies, USA). Separation was performed on an XSelect® HSS T3 2.5 ⁇ m (2.1 ⁇ 100 mm, 2.5 ⁇ m particle size, Island Waters) column.
  • samples were mixed with 1 ⁇ L of the internal standard (5-bromouracil contained at 500 ⁇ g/mL in water) and vortexed for 5 min in ethyl acetate (ethyl acetate): isopropyl alcohol (isopropyl alcohol) 9: 1 (v/v) mixture was extracted with 1 mL. Each sample was centrifuged at 13,000 rpm at 4 °C for 10 min. An 800 ⁇ L aliquot of the upper organic layer was evaporated to dryness at 36 °C under nitrogen gas. The residue was dissolved in 50 ⁇ L of water containing 0.2% acetic acid and vortexed for 5 min.
  • the internal standard 5-bromouracil contained at 500 ⁇ g/mL in water
  • ethyl acetate isopropyl alcohol (isopropyl alcohol) 9: 1 (v/v) mixture was extracted with 1 mL.
  • Each sample was centrifuged at 13,000 rpm at 4 °C for 10
  • the supernatant of each sample and standard solution was injected into the LC-MS/MS system.
  • the column temperature was maintained at 30 °C and the injection volume was set to 1 ⁇ L.
  • the mobile phase (A) was water containing 0.2% acetic acid
  • the mobile phase (B) was acetonitrile containing 0.2% acetic acid.
  • the flow rate was 0.2 mL/min in gradient mode: 0-5 min, 0% (B); 10 min, 15% (B); 10.1-15 min, 0% (B).
  • samples were mixed with 50 ⁇ L of internal standard (6-13C-fructose (6-13C-fucose) contained at 500 ng/mL in water) and then 5 mM 3 mixed in 100 ⁇ L of methanol.
  • -Amino-9-ethylcarbazole (3-amino-9-ethylcarbazole, AEC)
  • 50 ⁇ L of a 10 mM NaCNBH 3 solution 50 ⁇ L of a 10 mM NaCNBH 3 solution
  • 10 ⁇ L of acetic acid were sequentially mixed.
  • reaction mixture was incubated at 60 °C for 60 min, each tube was cooled on ice for 1 min, followed by 300 ⁇ L of water and 300 ⁇ L of dichloromethane-hexane (2:1, v/v) solvent. was added. Each sample was vortexed for 5 minutes and centrifuged at 10,000 rpm for 5 minutes. A 100 ⁇ L aliquot of the upper aqueous phase was injected into the LC-MS/MS system. The column temperature was maintained at 40 °C and the injection volume was set to 1 ⁇ L.
  • Mobile phase (A) was water with 0.1% formic acid and mobile phase (B) was acetonitrile with 0.1% formic acid.
  • the flow rate was 0.2 mL/min in gradient mode: 0 min, 25% (B); 8 min, 100% (B); and 8.1-15 min, 25% (B). The total run time was 15 minutes.
  • the 15 N-uridine and 13 C-uridine levels in the culture supernatant gradually decreased during the culture period of 4 hours ( FIG. 1E ).
  • the content of 15 N-uracil in the culture supernatant gradually increased during the same period, confirming that uracil secreted from Ecc15 cells was actually derived from absorbed 15 N-uridine.
  • 13 C-ribose was not detectable in the culture supernatant ( FIG. 1E ), confirming that the ribose moiety was not secreted after cleavage of uridine in Ecc15 cells.
  • GF flies were constructed as previously described (Ryu, et al., Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science 319, 777-782., 2008).
  • To prepare GF flies approximately 2x10 7 bacterial cells were washed twice with sterile PBS and administered to sterile food vials containing GF embryos.
  • GF flies were reared in autoclaved standard cornmeal medium or holidic medium (Piper, et al., A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat Methods 11, 100-105., 2014).
  • nucleoside metabolic pathways were different between the symbiotic group and the pathogen group (FIG. 2C).
  • nucleoside hydrolase converts nucleosides to nucleosides and ribose
  • nucleoside permease NiC, transports nucleosides into cells
  • adenine deaminase Four genes: adenine deaminase, AdeC, converts adenine to hypoxanthine) and cytidine deaminase (Cdd, converts cytidine to uridine) are pathogen members was present only in (Fig. 2C).
  • pathogen-specific NupC and NH genes provide a mechanism by which pathogens can induce uridine-in and uracil-out metabolic flows for DUOX activation (Fig. 2D). ). Comparative genomic analysis results may explain why commensal bacteria lacking the NupC and NH genes could not import extracellular uridine and produce uracil from uridine.
  • The, site-specific mutation induction (site-directed mutagenesis) mutation (G. morbifer ⁇ NH, NH Gmo ⁇ ) of the pathogen G. morbifer no NH activated by to determine the direct involvement of the NH activity in uracil-out of the pathogen produced.
  • site-specific mutation induction (site-directed mutagenesis) mutation G. morbifer ⁇ NH, NH Gmo ⁇
  • G. morbifer no NH activated by to determine the direct involvement of the NH activity in uracil-out of the pathogen produced.
  • in-frame deletion mutants of G. morbifer were constructed using homologous recombination.
  • the disruption plasmid was demethylated using dam-/dcm- E. coli (NEB, C2925i) and introduced into G. morbifer by electroporation. Deletion of the target gene was confirmed by PCR and sequencing analysis. To the complement of G.
  • morbifer ⁇ NH NH by placing the genes of the Pseudomonas aeruginosa (Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa) under the control of the constitutive promoter from PntpII vector pCM62 was prepared pCM62-PntpII :: NH.
  • pCM62-PntpII :: NH By demethylating plasmid pCM62-PntpII :: NH introduced in G. morbifer ⁇ NH was prepared G. morbifer ⁇ NH_NH.
  • apoptosis index was calculated as a percentage of the number of apoptotic cells to the total number of cells.
  • pasteurianus was cultured in YPGD medium (containing 0.5% glycerol, 0.5% polypeptone, 0.5% glucose and 0.5% yeast extract), and then Escherichia coli , E. coli) was transformed into pCM62-PntpII::NH_NupC by triparental mating using HB101/pKR2013 (Matsutani, et al., J Biotechnol 165, 109-119., 2013). Bacteria were then selected in YPGD medium supplemented with tetracycline (20 ⁇ g/ml) and acetic acid (0.1% (v/v)). Using the prepared strain, DUOX-dependent ROS generation was analyzed in the same manner as in Example 4 and whether intestinal cell apoptosis was performed in the same manner as in Example 5.
  • Apa NH_NupC can induce uridine-in and uracil-out metabolic flow and subsequent DUOX-dependent ROS generation (Fig. 3E). -F).
  • GF flies single-transduced with Apa NH_NupC showed a significant increase in intestinal cell apoptosis, resulting in higher mortality than GF flies single-transduced with Apa WT (Fig. 3G-H).
  • the Drosophila gut naturally interacts with opportunistic pathogens such as Ecc15.
  • Ecc15 Based on the ability of Ecc15 to induce uridine-in and uracil-out metabolic flux in vitro (Fig. 1D-E), to investigate the role of uridine catabolism in pathogenic bacteria, First, genes involved in nucleoside catabolism were investigated. Since the genome information of Ecc15 is not yet available, a draft genome sequence information was established through a whole-genome shotgun strategy (according to DDBJ/EMBL/GenBank WNLC00000000).
  • Ecc15 As a result of the analysis of the Ecc15 genome, it was confirmed that the bacteria possessed two NH genes (NH1 and NH2 genes). In addition to these genes, Ecc15 also contains two nucleoside phosphorylase (NP) genes (udp, deoD genes) capable of converting nucleosides into nucleobases and ribose 1-phosphate. ) was retained.
  • NP nucleoside phosphorylase
  • Ecc15 (Ecc15 ⁇ 4) was produced by using the suicide vector pDM4 (Milton, et al.,. Journal of bacteriology 178, 1310-1319., 1996).
  • Ecc15 ⁇ 4 is Uridine-in and uracil-out metabolic flux could not be induced (Fig. 4A), suggesting that NH and NP activities are required for the catabolism of extracellular uridine.
  • Uridine-in (in), and uracil - to examine whether in this out (out) flow metabolism in vivo, that is, whether the pathogen is working in vivo when introduced in Chapter lumen, Ecc15 ⁇ 4 and The Ecc15 ⁇ 4_NH the introduction of the NH gene Ecc15 ⁇ 4 mutants by the method of example 1 by oral infection the infected section and to measure the levels of uracil and uridine lumen liquid of the front and rear sheet infection.
  • Ecc15 ⁇ 4_NH was constructed by cloning the full length vector pTac3 NH gene under the control of the lac promoter to produce a pTac3-Plac :: NH, and introducing the pTac3-Plac :: NH Ecc15 the ⁇ 4 strains.
  • Ecc15 ⁇ 4_NH showed the Ecc15 ⁇ 4 low uracil / us is the Dean ratio significantly restore high uracil observed upon infection / uridine ratio When it is used in the field infected (Fig. 4B).
  • Ecc15 ⁇ 4, ⁇ Ecc15 4_NH and control group DUOX-dependent ROS generation was confirmed in the same manner as in Example 4 using a pathogen.
  • Ecc15 ⁇ 4 are dependent DUOX- was confirmed that there could be induced ROS production (Fig. 4C), nucleoside Ewha ability was confirmed that the relevant DUOX- activated abilities.
  • nucleoside-in and nucleobase-out metabolic flows occur through bacterial nucleoside catabolism, but are not present in Drosophila symbionts, and only in pathogens different from symbionts. It can be seen that this is a common feature.
  • RNA-Seq RNA- Sequence
  • the cDNA library was prepared with the Ribo-Zero Bacteria Truseq TM Stranded Total RNA H/M/R Prep Kit (Illumina) according to the manufacturer's protocol.
  • the cDNA library was sequenced using an Illumina Hi-Seq 2500.
  • the Illumina CASAVA pipeline version 1.8.2 was used for base-calling and cutadapt (version 2.6) was used to discard reads containing the Illumina adapter sequence.
  • the resulting reads were mapped to Ecc15 contig sequences using the TopHat aligner (version 2.1.1) with default options.
  • the "expressed" gene was identified in Ecc15 or Ecc15 ⁇ 4 to FPKM> 1 gene.
  • the FPKM value was converted to log 2 -FPKM.
  • log 2 -FPKM values were normalized using the quantile normalization method (Bolstad, BM, Irizarry, RA, Astrand, M., and Speed, TP (2003).
  • a comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19, 185-193.). was then identify DEG between Ecc15 and Ecc15 ⁇ 4 to an absolute log 2 -fold-changes> 0.58 ( 1.5-fold).
  • DEG enrichment analysis of gene ontology biological processes (GOBP) for genes was performed using Fisher's exact test, and GOBPs with a p -value of less than 0.05 were selected.
  • nucleoside catabolism is required for downregulation of primary metabolic activity and upregulation of QS processes, and QS activation is required to maintain adequate levels of core metabolism.
  • nucleoside catabolic activity may be needed for QS
  • nucleoside damage to the QS activity caused by the absence of side-catabolic is the the activation of the first metabolic processes observed in Ecc15 ⁇ 4 was assumed to be induced.
  • Ecc15 produces two types of QS molecules: acyl homoserine lactone (AHL) produced by ExpI and autoinducer-2 (AI-2) produced by LuxS enzyme. known (Anal Bioanal Chem 387, 415-423., 2007).
  • bioluminescent-based QS biosensors in particular lux-based biosensors, E. coli pSB401 (Winson, et al., Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid) sensors for investigating N-acyl homoserine lactone -mediated quorum sensing.
  • Vibrio Harvey (Vibrio harveyi, V. harveyi) MM32 strain (Miller, et al., Salmonella typhimurium recognizes a chemically Determination of levels of AHL and AI-2 by allowing them to emit bioluminescence upon recognition of AHL and AI-2 using a distinct form of the bacterial quorum-sensing signal AI-2. Mol Cell 15, 677-687, 2004) did.
  • V. harveyi MM32 in AB broth Bassler, BL, Wright, M., and Silverman, MR (1994). Sequence and function of LuxO, a negative regulator of luminescence in Vibrio harveyi.
  • ExpI- AHL-dependent level is significantly higher (Fig. 5A) in the culture supernatant than Ecc15 Ecc15 ⁇ 4 culture supernatant.
  • Fig. 5A ExpI- AHL-dependent level in the culture supernatant than Ecc15 Ecc15 ⁇ 4 culture supernatant.
  • the LuxS- dependent AI-2 levels between Ecc15 and Ecc15 ⁇ 4 culture supernatant did not show a difference.
  • Ecc15 ⁇ LuxS an Ecc15 mutant (Ecc15 ⁇ LuxS ) in which the AI-2-synthetic enzyme LuxS is deleted was used as a negative control, and bioluminescence by AI-2 QS molecules produced in bacteria was measured.
  • Ecc15 ⁇ LuxS was constructed using the pDM4 suicide vector.
  • Ecc15 is known to produce a major AHL-type, 3-oxo-C6-HSL (N-(3-oxo-hexanoyl)-L-homoserine lactone) (Barnard and Salmond, Quorum sensing in Erwinia species. Anal Bioanal Chem 387, 415-423., 2007), 3-oxo-C6-HSL was quantitatively analyzed using LC-MS/MS. Specifically, Ecc15 and Ecc15 ⁇ 4 were cultured in M9 medium with 1 mM uridine supplemented.
  • Bacterial cells were centrifuged at 6,000 rpm for 5 min and then quantitative analysis of 3-oxo-C6-HSL was performed using 500 ⁇ l of the culture supernatant. After liquid-liquid extraction to extract 3-oxo-C6-HSL from bacterial culture supernatant, take 500 ⁇ L of standard solution and filtered bacterial culture supernatant to 5 ⁇ L of C7-HSL (contained at 100 pg/mL in water) and then extracted with 1 mL of ethyl acetate. Only 800 ⁇ L of the upper organic layer was taken and evaporated to dryness under nitrogen gas at 40 °C. The residue was dissolved in 250 ⁇ L of water containing 0.1% formic acid.
  • the chromatography method using this method maintains the initial mobile phase composition of 10% (B) for 1 min and increases linearly to 90% (B) in 6 min, then finally returns to 10% (B) in 7.5 min and for 7.5 min. Equilibration was performed. The total run time was 15 minutes. The retention times of 3-oxo-C6-HSL and C7-HSL (used as internal standards) were 5.87 and 7.62, respectively. Qualitative and quantitative analyzes were performed by Agilent Mass Hunter software.
  • Ecc15 ⁇ 4 was carried out to investigate how the impact on it represents a reduced production of AHL, nucleoside production and catabolism is AHL AHL- QS-dependent signaling.
  • Ecc15 WT was reduced to Ecc15 WT, was analyzed by qPCR analysis using Ecc15 ⁇ 4 and ⁇ Ecc15 RbsR.
  • bacteria were cultured in M9 medium supplemented with 1 mM uridine, and fluorescence real-time PCR was performed to quantify gene expression using SYBR Green (Bioline). The rpoB gene was used as an internal control.
  • Ecc15 ⁇ RbsR is It was constructed using the pDM4 suicide vector.
  • Ecc15 is an entomopathogen that can persist in the fruit fly gut.
  • Erwinia virulence factor Erwinia virulence factor , evf
  • Erwinia virulence factor is known to act as a major virulence gene (Baset et al., A single gene that promotes interaction of a phytopathogenic bacterium with its insect vector, Drosophila melanogaster. EMBO Rep 4, 205 -209., 2003), causing bacterial pathogenesis.
  • AHL-type QS molecules and AI-2-type QS in bacteria (Ecc15 ⁇ ExpIR or Ecc15 ⁇ LuxS) mutating in the ExpI pathway or the LuxS pathway molecules could not be produced.
  • a reporter plasmid carrying GFP was introduced into this QS mutant under the control of the evf promoter region (Pevf::GFP). Specifically, the evf promoter (608 bp) fused to GFP was cloned into the pTac vector to construct pTac-Pevf::gfp.
  • evf was introduced into the gene expressing the pTac-Pevf :: gfp for analysis in vitro and in vivo in Ecc15 WT, Ecc15 ⁇ 4, ⁇ Ecc15 RbsR, Ecc15 ⁇ ⁇ ExpIR and Ecc15 LuxS.
  • Bacteria were cultured in M9 medium supplemented with 1 mM uridine and GFP signal was analyzed using a SPECTRAL Ami X Molecular Imaging (Spectral Instruments Imaging).
  • nucleoside catabolism acts upstream of the AHL-dependent QS pathway
  • nucleoside catabolism is required for full activation of the AHL-dependent evf gene in vitro.
  • Example 13 Confirmation of induction of conversion from pathogens to symbiotic bacteria by removal of bacterial nucleoside catabolism
  • Intestinal symbionts such as Acetobacter affect various features of host physiology, such as development and metabolism, and can be identified by whether the host survives, develops, and grows under conditions such as protein malnutrition.
  • GF flies were prepared by adding 2x10 7 CFU or less of A. pomorum , Ecc15 or Ecc15 mutants to GF embryos. Pupae formation was monitored every 12 h. The body size of the GF larvae was measured at the developmental time point 108 h after spawning. For larval development experiments, a protein malnutrition diet containing low yeast (1.5% (v/v) yeast) and lacking bokinin and propionic acid was used. Adult female flies (5-6 days old) were used for in vivo ROS measurements, metabolite analysis and confocal image analysis.
  • G. morbifer ⁇ NH, G. morbifer ⁇ 4NH_NH or A. pasteurianus NH_NupC to measure the service life.
  • G. morbifer and A. pasteurianus carrying a mock vector (pCM62 carrying a tetracycline resistance marker) were used as controls.
  • GF flies were transferred to fresh sterile medium supplemented with 20 ⁇ g/ml tetracycline every 4-5 days. Survival was monitored over time in at least three independent cohorts of approximately 25 flies each.
  • GF flies or GF flies associated with specific bacterial strains were reared on autoclaved standard cornmeal medium or Holidic medium.
  • Ecc15 ⁇ 4 or ⁇ Ecc15 RbsR single-GF was prepared, introduced embryo.
  • Ecc15 ⁇ 4 or ⁇ Ecc15 RbsR single - the GF fly symbiotic bacteria (A. pomorum) - introduced compared to the GF flies exhibited completely normal larval development (Fig. 6C-E).
  • PAO1 P. aeruginosa
  • a single NH gene was identified in the genome of P. aeruginosa PAO1.
  • the pqsL-PAO1 strain was used (Hazan, et al., Auto Poisoning of the Respiratory Chain by a Quorum-Sensing-Regulated Molecule Favors Biofilm Formation and Antibiotic Tolerance. Current biology : CB 26, 195-206., 2016).
  • PAO1 ⁇ NH was produced by deleting the NH gene.
  • PAO1 ⁇ NH_NH was produced by introducing a gene into a NH NH ⁇ PAO1 mutants.
  • the amount of pyocyanin and the activity of elastase were measured.
  • the amount of pyocyanin was measured as previously described (Smith, et al., Induction and inhibition of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing by synthetic autoinducer analogs. Chem Biol 10, 81-89., 2003). Specifically, Pseudomonas aeruginosa was grown in LB medium at 37° C. for 12 hours, and 5 ml of the culture supernatant was extracted with 3 ml of chloroform and then re-extracted with 1 ml of 0.2N HCl. The absorbance of the extracted solution was measured at 380 nm.
  • Elastase B activity was measured as previously described (Smith et al., 2003). Specifically, P. aeruginosa was cultured in M9 medium supplemented with 1 mM uridine at 37 ° C. for 8.5 hours, and the culture supernatant was filtered, followed by elastin-congo red solution together with 200 ° C. After stirring at rpm for 12 hours, elastase activity was measured at 495 nm.
  • the level of AHL with an acyl chain length of C4 was measured in the culture supernatant of PAO1 using the lux-based E. coli AHL biosensor pSB536.
  • quorum sensing activation is also regulated by NH enzyme activity in the pathogen P. aeruginosa , and as a result, the quorum sensing-dependent representative virulence factor of P. aeruginosa, elastase B activity and toxin pyocyanin production This PAO was significantly reduced in ⁇ NH , demonstrating that the host lethality fell.
  • NH enzyme and uridine (None, negative control), NH enzyme and uridine together with NH enzyme activity inhibitor DMAPIR (DM) 0.5, 1, 2.5, 10, 100 ⁇ M, BnIR 10, 50, 100 ⁇ M, Alternatively, as a positive control, PAPIR 10, 50, 100 ⁇ M, which is an NH inhibitor of the protozoan parasite Leishmania reported in previous studies, was added as a positive control, and the NH enzyme activity was measured by spectrophotometric assay.
  • DMAPIR NH enzyme activity inhibitor
  • PAPIR 10 50, 100 ⁇ M which is an NH inhibitor of the protozoan parasite Leishmania reported in previous studies
  • the minimum concentration that can inhibit the enzyme activity is measured to be ⁇ 1 ⁇ M for DMAPIR (DM), ⁇ 100 ⁇ M for BnIR, and ⁇ 100 ⁇ M for PAPIR, which is about 100 times more effective in the case of DMAPIR. It was confirmed that the degree was excellent.
  • DM DMAPIR
  • BnIR the inhibitory function is similar to that of the existing PAPIR, but the inhibitor production process is much easier than that of PAPIR, indicating that it is valuable as an effective inhibitor.
  • Ecc15 belonging to the genus Pectobacterium is not only a Drosophila pathogen, but also a plant pathogen that can cause disease in a wide range of plants. Since the genus Pectobacterium is known to cause several plant diseases, including soft rotting, in plants, it was confirmed whether these plant diseases could be controlled by inhibition of NH enzyme activity.
  • the handle 10 6 mutant strains (Ecc15 ⁇ 4) removal of the wild type strain (ECCWT) and NH enzymatic activity of CFU than on potatoes, respectively, and also processing the DMPAPIR of 0.1 mM (100 ⁇ M), 1 mM (1000 ⁇ M) After 48 hours, the degree of softness (rotting vol.) of the potatoes was measured.
  • Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense , Pcb which can cause disease in a wide range of plants
  • Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum 15 Pectobacterium carotovorum subsp.
  • PAO1 P. aeruginosa
  • PAO1 was cultured with or without DMAPIR (DM) treatment to obtain a culture supernatant, and the supernatant and elastin-congo red (elastin-congo red) reacted to measure the elastase activity of PAO1.
  • DM DMAPIR
  • nucleoside hydrolase inhibitor acts on pathogens of the genus Pectobacterium and Pseudomonas to effectively inhibit the activity of nucleoside hydrolases, and as a result, quorum sensing-dependent It has been demonstrated that the etiology is suppressed.
  • the nucleoside hydrolase inhibitor according to the present invention can inhibit the toxicity of pathogens, that is, pathogenic microorganisms, or convert pathogens exhibiting pathogenicity into symbiotic microorganisms indicating non-pathogenicity, inhibiting the toxicity of pathogenic microorganisms including the same It can be applied to a composition for preventing or treating a pathogenic microbial infection, a composition for controlling a plant disease, a method for inhibiting the toxicity of pathogenic microorganisms comprising the step of treating the composition, a method for controlling a plant disease, and the mechanism according to the present invention is It can be applied as a screening method for nucleoside hydrolase inhibitors.

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Abstract

본 발명은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물, 식물병 방제용 조성물, 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 독성 억제 방법, 식물병 방제 방법 및 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 병원균, 즉, 병원성 미생물 독성을 억제하거나, 병원성을 나타내는 병원균을 비병원성을 나타내는 공생균으로 전환할 수 있는 바, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물, 식물병 방제용 조성물, 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 독성 억제 방법, 식물병 방제 방법으로 적용할 수 있으며, 본 발명에 따른 기전은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법으로 적용할 수 있다.

Description

뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제 방법 및 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법
본 발명은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물, 식물병 방제용 조성물, 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 독성 억제 방법, 식물병 방제 방법 및 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
장내 미생물 상호 작용은 모든 후생동물(metazoans)에서 발견되는 복잡하고 진화적으로 보존된 현상이다. 장내 미생물 군집은 다양한 범위의 숙주 생리에 깊이 관여한다는 것이 명백하지만, 공생(symbiosis) 또는 장내 세균 불균형(dysbiosis)을 결정하는 숙주-미생물 상호 작용의 상세한 분자 메커니즘은 크게 알려져 있지 않다. 이는 부분적으로 숙주 측면과 미생물 측면 양자를 볼 수 있는 유전자 모델 시스템이 없기 때문이다.
이와 관련하여 초파리(Drosophila)는 장과 미생물 사이의 공생 및 장내 세균 불균형/병원성 상호 작용을 이해하는 데 있어 장-미생물(gut-microbe) 상호 작용의 강력한 유전자 모델을 제공한다. 초파리는 락토바실러스(Lactobacillaceae)와 아세토박터(Acetobacteraceae) 과(科)가 우세한 비교적 간단한 공생균들(commensal)을 가지고 있다. 이러한 공생 박테리아는 면역, 발달, 대사 및 행동과 같은 숙주 생리의 여러 측면에 영향을 미친다. 이러한 공생 장-미생물 상호 작용에 더하여, 장 상피(epithelia)는 펙토박테리움속(Pectobacterium)에 속하는 Ecc15(Erwinia carotovora subspecies carotovora 15) 및 슈도모나스 엔토모피라(Pseudomonas entomophila)와 같은 자연적으로 발생하는 기회 병원균(opportunistic pathogen)와 병원성 상호 작용을 가질 수 있다.
장-미생물 상호 작용 동안, 장내 선천성 면역은 미생물을 제어하기 위해 쉽게 활성화된다. 초파리 장내 면역은 이중 산화 효소(a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family, dual oxidase, DUOX)가 미생물에 대항하는 ROS(reactive oxygen species)를 생성함으로써 침입 병원균에 대항하는 데 중추적인 역할을 한다. 이러한 ROS-기반 면역에 더하여, 면역 결핍(immune deficiency, IMD) 경로는 또한 항균성 펩타이드(antimicrobial peptides, AMP)를 생산함으로써 장 항균성 반응에 관여한다. 기존 연구에서 장-미생물 상호 작용 동안 ROS-기반 면역이 AMP-기반 면역과 상승적으로 작용한다는 것이 밝혀졌다. 두 면역계는 미생물의 도전에 반응하여 특이적으로 활성화된다. 펩티도글리칸(peptidoglycan, PGN)과 같은 미생물-도입 분자 패턴(Microbe-associated molecular pattern, MAMP)은 IMD 경로를 활성화시키는 것으로 알려져 있다. 예를 들어, 그람 음성 박테리아의 막에서 발견되는 일반적인 구조인 DAP(diaminopimelic acid)-타입 PGN은 AMP 생산을 위해 IMD 경로 활성화를 시작하는 PGN 인식 단백질에 의해 인식된다.
그러나, DAP-타입 PGN은 아세토박터(Acetobacter)와 같은 공생균과 Ecc15와 같은 병원균에서 모두 일반적으로 발견되기 때문에 병원균-특이적 분자 패턴은 아니다. 두 박테리아 모두 IMD 경로를 활성화할 수 있기 때문에, 이 경로는 장 상피가 병원균으로부터 공생균을 구별하는 메커니즘을 충분히 설명하지 못한다.
선행 연구에 따르면 DUOX는 Ecc15에 반응하여 활성화되지만 아세토박터에 반응하여 정지 상태를 유지한다. 이는 DUOX-의존적 ROS 생성이 병원균 특이적임을 나타낸다. 이 연구에 따르면 박테리아 유래 우라실은 DUOX의 리간드 역할을 하며 공생 박테리아가 아닌 병원성 박테리아는 우라실(Uracil)을 방출한다. 이러한 데이터는 박테리아-유래 우라실이 공생균으로부터 병원균을 구별하기 위해 숙주에 의해 사용되는 병원균-특이적 신호임을 나타낸다. 우라실은 장 세포에서 DUOX 활성화를 위해 복잡한 신호 전달 경로를 개시하기 위한 리간드로서 작용할 수 있다(Ha et al., Coordination of multiple dual oxidase-regulatory pathways in responses to commensal and infectious microbes in drosophila gut. Nature immunology 10, 949-957., 2009; Lee et al., Inflammation-Modulated Metabolic Reprogramming Is Required for DUOX-Dependent Gut Immunity in Drosophila. Cell Host Microbe 23, 338-352., 2018; Lee et al., Bacterial uracil modulates Drosophila DUOX-dependent gut immunity via Hedgehog-induced signaling endosomes. Cell Host Microbe 17, 191-204., 2015). 이러한 DUOX-활성화 신호 경로는 PLCβ-Ca2+ 경로, 헷지호그-카데린 99C(hedgehog-cadherin 99C) 경로 및 라파마이신-자가포식 1-매개 지방분해(rapamycin-autophagy 1-mediated lipolytic) 경로의 표적을 포함한다. DUOX-의존적 ROS는 항균성 역할 외에도 반응성 화학 수용체(reactive chemical receptor) TrpA1에 대한 리간드 역할을 하여 병원균 제거를 촉진한다(Du et al., TrpA1 Regulates Defecation of Food-Borne Pathogens under the Control of the Duox Pathway. PLoS genetics 12., 2016).
DUOX 의존성 면역에 대한 주요 리간드로서 박테리아-유래 우라실의 중요성에도 불구하고, 공생 박테리아가 아닌 병원성 박테리아가 우라실을 방출하는 방법 및 이유는 현재 알려져 있지 않다.
본 발명자들은 우라실과 리보스(Ribose)가 장 내강에서 세포외(extracellular) 우리딘(Uridine)을 사용하는 박테리아 뉴클레오사이드 가수분해효소(nucleoside hydrolase, NH)의 이화 작용에 의해 생성되고, 병원균과는 달리, 공생균은 기능적인 NH 활성의 부족 때문에 우라실을 생성하지 않음으로써 DUOX 활성화를 회피하며, in vivo에서 공생균으로부터 병원균으로의 전환에 필수적인 세균-세포 간 의사소통 및 병원균 독성에 대한 신호로 NH에 의해 생성된 리보스의 신규한 역할을 확인하고 이를 토대로 뉴클레오사이드 가수분해효소를 억제할 경우 병원성 미생물의 생장에는 영향 없이 병원성(독성)만을 억제할 수 있음을 확인하였을뿐만 아니라, 신규한 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 발견하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 뉴클레오사이드 가수분해효소(nucleoside hydrolase, NH) 억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물 독성 억제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 독성 억제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 유효성분으로 포함하는 조성물을 개체에 처리하는 단계를 포함하는 식물병 방제 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 뉴클레오사이드 가수분해효소를 제공하는 단계; 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 시험물질과 접촉시키는 단계; 상기 시험물질과 접촉한 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 및 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군에서 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소의 발현 또는 활성이 감소된 경우, 상기 시험물질을 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 하나의 목적은 병원성 미생물에서 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 결실된, 병원성 미생물의 공생균을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 포함하는, 병원균의 쿼럼 센싱 저해제를 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 병원균, 즉, 병원성 미생물 독성을 억제하거나, 병원성을 나타내는 병원균을 비병원성을 나타내는 공생균으로 전환할 수 있는 바, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물, 식물병 방제용 조성물, 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 독성 억제 방법, 식물병 방제 방법으로 적용할 수 있으며, 본 발명에 따른 기전은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법으로 적용할 수 있다.
도 1은 병원균이 "우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out)" 대사 흐름을 유도하는 것을 나타내는 도이다. (A) 장 Ecc15 감염 후 대사체학 프로파일을 히트 맵으로 나타내었다. 파리는 2 시간 동안 Ecc15의 부재 또는 존재하에 수크로스(sucrose) 용액으로 구강 감염되었다. 장 내강액을 CETOF-MS(Capillary Electrophoresis Time-of Flight Time Spectrometry)를 사용하여 대사체학 분석한 결과 총 152 개의 대사 산물이 검출되었다. 각 대사 산물은 8 가지 대사 과정으로 분류되었다. 각 대사 과정에서 대사 산물의 수가 표시되었으며, 색상 막대는 각 시점에서 대조군과 비교하여 장 감염 후 대사 산물 수준의 log2 배 변화 기울기를 나타내고, 회색 막대는 분석에서 검출되지 않은 대사 산물을 나타낸다. (B) 뉴클레오타이드 대사 과정은 장 감염 후 상향 및 하향 조절된 대사 산물에 의해 풍부해진다. 막대는 -log10(p 값)을 나타내며, 여기서 DAVID 소프트웨어를 사용하여 결정된 p 값은 상향 및 하향 조절된 대사 산물에 의해 강화되는 프로세스의 중요성을 나타낸다. (C) 뉴클레오타이드 대사에 관여하는 상향 및 하향 조절 대사 산물의 차등 수준을 히트 맵으로 나타내었다. 색상 막대는 각 시점에서 대조군 수준에 비해 장 감염 후 대사 산물 수준의 log2 배 변화 기울기를 나타낸다. 우리딘과 우라실은 화살표로 표시된다. (D-E) 우라실은 Ecc15에 의해 세포 외 우리딘에서 파생된다. Ecc15는 우리딘 (D) 또는 동위원소 표지된 우리딘 (E)을 함유하는 M9 최소 배지에서 배양되었다. 방사성 N과 C의 위치는 빨간색으로 표시된다. 배양 상등액의 우리딘, 우라실 및 리보스 분자는 LC-MS/MS 분석을 사용하여 다른 시점에서 분석되었다. 데이터는 최소 3 회 실험의 평균±SD로 표시된다. ND, 감지되지 않음.
도 2는 병원균(pathobionts)가 "우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out)" 대사 흐름을 유도하는 것을 나타내는 도이다. (A-B) 아세토박터과(Acetobacteraceae)의 병원균 구성원은 DUOX(dual oxidase; DUOX; a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family) 활성화를 위해 우라실을 분비한다. (A) 박테리아는 15N 표지된 우리딘을 포함하는 만니톨 배지에서 8 시간 동안 배양되었고, 배양 상청액의 15N 표지된 우라실은 LC-MS/MS 분석을 사용하여 정량화되었다. (B) 1.5 시간 동안 표시된 박테리아(약 1 x 1010 CFU)를 경구 섭취 한 후 R19S 염료를 사용하여 장 DUOX 의존성 ROS 생성을 측정하였다. 데이터는 평균±SD로 표시되었다. ND, 감지되지 않음; NS, 유의하지 않음; *** P <0.001 (분산 분석(ANOVA)을 사용하여 분석됨). (C) 전체 게놈 정보를 사용하여 뉴클레오타이드 대사 경로에 관련된 유전자의 히트 맵 분석한 결과이다. 서로 다른 박테리아의 유전자를 글루코노박터 모비퍼(Gluconobacter morbifer, G. morbifer)의 해당 유전자와 비교했으며 아미노산 서열 동일성의 백분율은 파란색 그라데이션 막대로 표시되었다. 붉은 색은 주어진 박테리아 게놈에 없는(즉, 40 % 미만의 동일성) 유전자를 나타낸다. 화살표로 표시된 4 개의 유전자(NH, NupC, AdeC 및 Cdd)만이 모든 병변 구성원에 존재하지만 모든 공생 구성원에는 존재하지 않았다. (D) 우라실 생성 및 병변 구성원에서의 방출을 위한 뉴클레오사이드 수입 및 이화 경로의 다이어그램이다.
도 3은 세균성 NH 활성이 장내 세균 불균형(dysbiosis)를 유발하는 것을 나타내는 도이다. (A-D) 병리의 NH 활성은 장 병리와 초기 숙주 사망을 담당하는 대장 형성(colitogenic) 인자로 작용한다. 병원균(pathobionts) G. morbifer WT의 NH 유전자가 결실되어 G. morbifer △NH가 제작되었다. G. morbifer △NH 돌연변이체의 보완은 NH 유전자가 도입되어 G. morbifer △NH-NH를 제작함으로써 달성되었다. 15N 표지된 우리딘 (A), ROS 생산 능력 (B), 장 세포 아폽토시스(apoptosis) (C) 및 숙주 생존 (D)을 사용한 시험관내 우라실 분비 능력을 결정하였다. (E-H) 아세토박터과(Acetobacteraceae)에서 뉴클레오사이드(nucleoside) 이화 작용의 부재는 장-미생물 공생을 위해 필요하다. 우라실 분비 능력을 유도하기 위해 A. pasteurianus WT에 G. morbifer의 NH 및 NupC 유전자를 도입하여 A. asteurianus NupC_NH를 제작하였다. 15N 표지된 우리딘 (E), ROS 생산 능력 (F), 장 세포 아폽토시스 (G) 및 숙주 생존 (H)을 사용한 시험관 내 우라실 분비 능력을 측정하였다. 데이터 (C, D, G 및 H)는 표시된 박테리아 균주와 단일 결합된 무균 파리를 사용하여 얻었으며, ANOVA (A, B, F) 또는 Welch의 t-검정 (E)을 사용하여 분석되었다. 값은 최소 세 번의 독립적인 실험의 평균 ± SD (*** P <0.001)로 표시된다. (C 및 G)에서 각 점은 개별 파리를 나타내고 수평선은 평균값을 나타낸다. *** P <0.001 (ANOVA). (D 및 H)에서 수명에 대한 로그 순위 분석(Kaplan-Meier 방법)은 G. morbifer WT-와 G. morbifer △NH-도입 GF 파리 간의 생존율에 유의한 차이를 나타낸다. *** P <0.001. (D) 그리고 A. asteurianus WT-와 A. pasteurianus NH_NupC 관련 GF 파리 (* P <0.05) (H). ND, 감지되지 않음; NS, 유의하지 않음.
도 4는 Ecc15의 뉴클레오사이드 이화 작용은 우라실 분비와 박테리아 대사 조절에 필요함을 나타내는 도이다. (A) Ecc15로부터의 시험관내 우라실 분비에는 뉴클레오 사이드 이화 작용 활성이 필요하다. Ecc15WT의 2 개의 NH 유전자와 2 개의 NP 유전자를 결실시켜 Ecc15△4를 제작하였다. Ecc15△4의 보완은 NH 유전자를 도입하여 Ecc15△4_NH를 제작함으로써 달성되었다. 박테리아는 표시된 시간 동안 우리딘을 포함하는 M9 최소 배지에서 배양되었고, 배양 상청액의 우리딘 및 우라실 수준은 LC-MS/MS 분석을 사용하여 정량화되었다. (B) Ecc15로부터의 생체 내 우라실 분비에는 뉴클레오사이드 이화 작용 활성이 필요하다. 파리는 표시된 박테리아에 2 시간 동안 구강 감염되었다. LC-MS/MS 분석을 통해 우라실 및 우리딘 수준을 정량화하기 위해 장 내강액을 사용하였다. (C) 뉴클레오사이드 이화 작용 활성은 장 감염 후 생체 내 ROS 생성에 필요하다. 1.5 시간 동안 표시된 박테리아(약 1 x 1010 CFU)를 경구 섭취한 후 R19S 염료를 사용하여 장 DUOX 의존적 ROS 생성을 측정하였다. (D) 생체 내 우라실 분비는 다른 병원균에 의한 장내 감염 후 관찰된다. 파리는 2 시간 동안 서로 다른 병원균(녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)의 경우 약 2 Х 109 CFU, 다른 박테리아의 경우 약 1 Х 1010 CFU)에 구강 감염되었다. LC-MS/MS 분석을 통해 우라실 및 우리딘 수준을 정량화하기 위해 장 내강액을 분석하였다. (E-F) 관련 유전자 존재론 생물학적 과정(gene ontology biological processes, GOBP)에 따라 Ecc15와 Ecc15△4 사이에 320 개의 차별적으로 발현된 유전자의 상대적 비율을 나타낸다. 레벨 1 (E) 및 레벨 2-4 (F)의 GOBP 용어는 각각 일반적인 세포 과정과 대사 과정에 사용되었다. (G) Ecc15△4에서 상향 조절되거나 하향 조절된 유전자에 의해 강화된 생물학적 과정이다. 막대는 -log10(p 값)을 나타내며 DAVID 소프트웨어의 p 값은 상향 및 하향 조절된 유전자에 의해 강화되는 과정의 중요성을 나타낸다. (H) 다른 대사 과정에 관련된 상향 및 하향 조절된 유전자의 차별적 발현을 보여주는 히트 맵이다. 색상 막대는 Ecc15 균주에 비해 Ecc15△4 균주의 mRNA 발현 수준의 log2 배 변화 기울기를 나타낸다. (B-D)에서 데이터는 ANOVA를 사용하여 분석되었다. 값은 최소 3 회의 독립적인 실험의 평균±SD (* P <0.05, ** P <0.01, *** P <0.001)로 표시된다. ND, 감지되지 않음; NS, 유의하지 않음.
도 5는 뉴클레오사이드 이화 작용 활성은 아실 호모세린 락톤(acyl homoserine lactone, AHL) 의존 쿼럼 센싱(quorum sensing, QS) 활성화에 필요하며 RbsR 의존 방식으로 독성 유전자 발현이 필요함을 나타낸 도이다. (A) 뉴클레오사이드 이화는 AHL 유형 쿼럼 센싱 분자의 생산에 필요하다. 서로 다른 성장 시점에서 Ecc15 또는 Ecc15△4의 배양 상등액을 E. coli pSB401 균주(생체 발광 기반 AHL 유형 QS 바이오 센서)와 함께 배양하고, 발광계를 사용하여 생물 발광을 측정하였다. 생물 발광 이미징을 위해, pSB401 균주를 세균 배양 상등액(배양 10.5 시간 후 수득됨)과 함께 2 시간 동안 배양하였다. AHL 합성 ExpI 효소가 결실된 Ecc15 돌연변이(Ecc15△ExpIR)를 음성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 최소 3 회 실험의 평균±SD로 표시된다. (B) 박테리아가 생산하는 3-oxo-C6-HSL(N-(3-oxo-hexanoyl)-L-homoserine lactone)의 측정 결과이다. 다른 성장 시점에서 Ecc15 또는 Ecc15△4의 배양 상등액을 사용하여 LC-MS/MS를 통해 3-oxo-C6-HSL 수준을 정량화하였다. 데이터는 최소 3 회 실험의 평균±SD로 표시된다. (C) 뉴클레오사이드 이화 작용 및 리보스 조절 전사 조절자는 글로벌 QS 조절자의 발현에 필요하다. ExpR 및 VqsM 유전자의 발현 수준은 Ecc15WT, Ecc15△4 및 Ecc15△ExpIR을 사용한 qPCR 분석으로 분석되었다. Ecc15WT에서 표적 유전자 발현은 임의로 1로 하였으며, 그 결과는 상대적인 발현 수준으로 표시된다. 막대는 최소 3 회의 독립적인 실험의 평균±SD(*** P <0.001)로 표시된다. (D) RbsR은 AHL 유형 QS 분자의 생산에 필요하다. 다양한 성장 시점에서 Ecc15 또는 Ecc15△4의 배양 상청액을 E. coli pSB401 균주와 함께 배양하고, 발광 계를 사용하여 생물 발광을 측정하였다. 생물 발광 이미징을 위해, pSB401 균주를 세균 배양 상등액(배양 10.5 시간 후 수득됨)과 함께 2 시간 동안 배양하였다. 뉴클레오사이드 이화 작용 활성이 없는 Ecc15 돌연변이(Ecc15△4)를 대조군으로 사용하였다. 데이터는 최소 3 회 실험의 평균±SD로 표시된다. (E-F) Evf 발현은 뉴클레오사이드 이화 작용, RbsR 및 ExpIR 의존 QS 시스템의 제어하에 있다. evf의 발현 수준은 qPCR (E) 및 Pevf::GFP 리포터 활성 (F)을 사용하여 분석되었다. Ecc15WT의 표적 유전자 발현은 임의로 1로 하였으며, 그 결과는 상대적인 발현 수준으로 표시되었다. 막대는 최소 세 번의 독립적인 실험의 평균±SD(*** P <0.001)로 표시된다.
도 6은 뉴클레오사이드 이화 작용 활성은 장에서 세균 QS 및 공생 병원균으로의 전환에 필요함을 나타낸 도이다. (A) 뉴클레오사이드 이화 작용 활성은 장 내강에서 생체 내 QS 활성화에 필요하다. 파리는 생물 발광 리포터 E. coli pSB401 균주와 함께 Ecc15WT 또는 Ecc15△4로 구강 감염되었다. 살아있는 파리의 생물 발광 이미징은 감염 후 1.5 시간에 얻어졌다. 각 점은 개별 파리를 나타내고 수평선은 평균 값을 나타낸다. *** P <0.001 (ANOVA). 대표 이미지가 표시되었다. (B) 뉴클레오사이드 이화 작용 활성은 장 내강에서 생체 내 독성 유전자 활성화에 필요하다. Pevf::GFP 리포터를 운반하는 Ecc15WT 또는 Ecc15△4는 유충 또는 초파리를 사용하여 2 시간 동안 구강 감염에 사용되었다. 개별 장의 형광 강도는 공초점 현미경을 통해 측정되었다. 각 점은 개별 동물을 나타내고 수평선은 평균값을 나타낸다. *** P <0.001 (ANOVA). 대표적인 공 초점 이미지가 표시된다. (C) 세균성 뉴클레오사이드 이화 작용이 발달 속도에 미치는 영향을 나타낸다. 표시된 유전자형의 박테리아를 무균 배아에 첨가하고 번데기 형성 비율을 12 시간마다 모니터링하였다. Ecc15△4는 성장 촉진 공생균 A. pomorum과 유사하게 숙주 발달 속도를 향상시켰다. (D-E) 박테리아 뉴클레오사이드 이화 작용이 동물 크기에 미치는 영향을 나타낸다. 지정된 유전자형의 박테리아를 무균 배아에 첨가하고 애벌레 크기를 산란 후 108 시간에 측정하였다. 각 점은 개별 동물을 나타내고 수평선은 평균값을 나타낸다. *** P <0.001 (ANOVA). NS, 유의하지 않음. 대표 이미지가 표시된다 (E).
도 7은 다른 장-미생물 상호 작용에 대한 박테리아 뉴클레오사이드 이화 작용의 역할에 대한 모델을 나타낸 도이다. 병원균은 NupC 및 NH를 사용하여 "우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out)" 대사 흐름을 유도할 수 있다. 병원균 측면에서, 우리딘 유래 리보스는 박테리아 세포 간 통신(QS 활성화를 통해) 및 QS 의존성 발병을 위해 RbsR을 활성화한다. 숙주 측에서 숙주 장 세포는 우리딘 유래 우라실을 감지하여 병원균의 존재를 인식한다. 우라실은 DUOX 활성화 및 후속 살균 ROS 생성을 위한 리간드 역할을 한다. 숙주 방어(우라실 의존성 미생물 ROS)와 병원균 독성(리보스 의존성 evf 독소) 사이에는 일종의 군비 경쟁이 발생한다. 병원균은 NupC 및 NH를 사용하여 "우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out)" 대사 흐름을 유도할 수 있으며, 이는 만성 DUOX 활성화, 장 세포 손상 및 조기 숙주 사망을 초래한다. 그러나, 뉴클레오사이드 이화 작용이 없는 공생 구성원은 DUOX 활성화 없이 장 세포와 상호 작용할 수 있다. 아세토박터과(병원균 또는 공생균)의 모든 구성원에는 QS 시스템이 없다.
도 8은 초파리 장 내강 우리딘은 숙주 장 세포에서 유래되었을 가능성이 높음을 나타낸 도이다. (A) 장 감염 없이 측정된 내강액의 뉴클레오사이드 수준이다. 기존(CV) 파리(5 일령)는 장 내강액을 준비하기 전에 2 시간 동안 5 % 자당과 함께 경구 섭취되었다. (B) 장 내강 우리딘은 장내 세균이나 영양에서 파생되지 않는다. CV 또는 GF 파리(3 일령)를 표준 옥수수 가루 효모 사료 또는 10 일 동안 우리딘이 부족한 홀리 딕 사료(즉, 13 일령 CV 또는 GF 파리가 우리딘 측정에 사용됨)를 급이하였다. CV 파리와 비교할 때 GF 파리의 장 내강에서 더 높은 수준의 우리딘이 검출되었으며, 이는 우리딘이 장내 세균에서 유래하지 않음을 나타낸다. 또한, 표준 식이 요법과 홀리딕 식이 요법 사이에 우리딘 수준의 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 장 내강 우리딘이 식이에서 파생되지 않음을 나타낸다. 모든 실험에서 30 개의 중장에서 얻은 장 내강 유체를 사용하여 LC-MS/MS 분석을 통해 뉴클레오 사이드 수준을 정량화하였다. 데이터는 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다.
도 9는 박테리아에서 생산된 AI-2 QS 분자에 의한 생물 발광 측정 결과, Ecc15와 Ecc15△4 배양 상등액 사이에 LuxS 의존성 AI-2 수준의 차이는 관찰되지 않았다. 다양한 성장 시점에서 Ecc15 또는 Ecc15△4의 배양 상청액을 Vibrio harveyi MM32 균주(생체 발광 기반 AI-2-타입 QS 바이오 센서)와 함께 배양하고, 발광계를 사용하여 생물 발광을 측정하였다. AI-2-합성 효소 LuxS가 결실된 Ecc15 돌연변이(Ecc15△LuxS)를 음성 대조군으로 사용하였다. 데이터는 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다.
도 10은 1 차 대사에 관여하는 유전자는 Ecc15△4에서 크게 상향 조절됨을 나타낸 도이다. 1 차 대사에 관여하는 11 개 유전자의 발현 수준은 Ecc15WT, Ecc15△4, Ecc15△RbsR 및 Ecc15△ExpIR을 사용한 qPCR 분석에 의해 결정되었다. 상기 1 차 대사 유전자는 다음과 같다: purH(Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase, GJS26_00239), pgm(Phosphoglucomutase, GJS26_01330), pgk(Phosphoglycerate kinase, GJS26_03794), adk(Pyruvate kinase, GJS26_01172), pyk(Pyruvate kinase, GJS26_01172) n아(Nucleoside-diphosphate kinase, GJS_03171), carA(carbamoyl phosphate synthase A, GJS26_03753), nrdB(Ribonucleoside-diphosphate reductase, GJS_01196), udk(Uridine kinase, GJS_01409), add(Adenosine deaminase, CJS_02167) atpE(GJS26_04373). Ecc15WT에서 표적 유전자 발현은 임의로 1로 하였으며, 그 결과는 상대적인 발현 수준으로 표시된다. 막대는 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균±SD로 표시된다.
도 11은 RbsR 및 ExpIR(luxs는 아님)은 장에서 공생 병원균으로의 전환에 필요함을 나타낸 도이다. (A) RbsR 레귤레이터 및 쿼럼 감지가 발달 속도에 미치는 영향이다. 표시된 유전자형의 박테리아를 무균(GF) 배아에 첨가하고 번데기 형성의 백분율을 12 시간마다 모니터링하였다. (B) 동물 크기에 대한 RbsR 조절기 및 쿼럼 감지의 영향이다. 표시된 유전자형의 박테리아를 GF 배아에 첨가하고 애벌레 크기를 산란 후 108 시간에 측정하였다. 각 점은 개별 파리를 나타내고 수평선은 평균 값을 나타낸다. *** P <0.001 (ANOVA). NS, 유의하지 않음. 대표 이미지가 표시된다. 기존(CV) 파리가 대조군으로 사용되었다. ExpIR의 삭제는 LuxS가 아니라 병원균-공동체 전환을 유도하기에 충분하며, 이는 ExpI 의존적 쿼럼 감지가 박테리아 병원성에 필요함을 나타낸다.
도 12는 P. aeruginosa PAO1의 QS 의존적 독성에 대한 뉴클레오사이드 이화작용 활성의 역할을 나타낸 도이다. 단일 NH 유전자는 P. aeruginosa PAO1의 게놈에서 확인되었다. P. aeruginosa의 자가분해 및 자가응집 행동을 피하기 위해 pqsL-PAO1 균주가 사용되었다(Hazan, et al., Auto Poisoning of the Respiratory Chain by a Quorum-Sensing-Regulated Molecule Favors Biofilm Formation and Antibiotic Tolerance. Current biology : CB 26, 195-206., 2016). NH 유전자를 결실시켜 PAO1△NH를 제작하였다. PAO1△NH_NH는PAO1△NH 돌연변이체에 NH 유전자를 도입하여 제작하였다. (A-B) 독성 인자의 활성을 나타낸다. 엘라스타제 활성 (A) 및 피오시아닌 생산 (B)은 NH 활성의 유무에서 측정되었다. 엘라스타제 활성 및 피오시아닌 생산은 배양 상청액을 사용하여 측정되었습니다. (C) QS 활성 분석 결과이다. 배양 상청액에서 아실 사슬 길이가 C4인 AHL의 수준은 lux 기반 대장균 AHL 바이오 센서 pSB536을 사용하여 측정되었다. (D) 장 감염 후 숙주 생존 결과이다. 성인 암컷 파리(5-6 일령)를 지시된 박테리아로 구강 감염시켰다. (A-B)에서 값은 적어도 3 회의 독립적인 실험의 평균±SD(*** P <0.001, ** P <0.005)로 표시된다. (D)에서 수명에 대한 로그 순위 분석(Kaplan-Meier 방법)은 생존율에서 유의한 차이를 나타낸다(***P < 0.001).
도 13은 병원균의 NH(Nucleoside hydrolase) 효소 활성 억제제의 기능을 나타낸 도이다. (A) NH 효소 활성 억제제의 구조식. (B) NH 효소가 해당 기질인 우리딘을 분해하는 정도를 분광광도법(spectrophotometric assay)를 통해 측정하였다. 효소와 우리딘만을 넣어 반응시킨 경우(None), 효소의 활성에 의해 빠르게 우리딘 농도가 감소하였다. 반면 억제제인 DMPAPIR를 여러 농도로 같이 넣어준 경우에는 그 농도에 비례하여 효소 활성이 억제되는 것을 확인하였다. (C) 새롭게 개발한 NH 효소 활성 억제제인 BnIR과 기존의 연구에서 보고 된 원생 기생충 Leishmania의 NH 억제제인 PAPIR의 억제 정도를 분광광도법으로 비교하였다. 각각 억제제의 효소 활성을 저해할 수 있는 최소 농도(minimal inhibitory concetration)는 DMPAPIR의 경우 ~1 M, BnIR의 경우 ~100 M, PAPIR의 경우 ~100 M로 측정되었다. DMPAPIR의 경우 유효성이 약 100배 정도 우수한 것을 확인할 수 있으며, BnIR의 경우 억제하는 기능은 기존의 PAPIR와 비슷하나 억제제의 생성 과정이 PAPIR에 비해 훨씬 용이하여 유효 저해 물질로서 가치가 있음을 알 수 있다. (D) Ecc15(Erwinia carotovora subsp. carotovora 15, 펙토박테리움속(Pectobacterium)에 속함)는 초파리의 병원균일 뿐 아니라 넓은 범위의 식물에서 병을 일으킬 수 있는 식물 병원균이기도 하다. 펙토박테리움속(Pectobacterium)은 식물에서 무름병(soft rotting)을 비롯 여러 식물 질병을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 식물 질병이 NH 효소 활성 억제에 의해 방제될 수 있는지 확인하였다. 감자에 106 CFU 이하의 야생형균(ECCWT)과 NH 효소 활성을 제거한 돌연변이 균(Ecc15△4)을 각각 처리하고 또한 0.1 mM, 1 mM의 DMPAPIR를 처리하여 48시간 후 감자가 무른 정도(rotting vol.)를 측정한 결과, 돌연변이 균(Ecc15△4) 또는 Ecc15와 억제제를 같이 처리한 경우 야생형균이 일으키는 무름병은 10% 이하로 발생하여 발병이 감소된 것을 확인하였다. (E) 펙토박테리움속에 속한 여러 다른 종들 에서도 DMPAPIR가 NH 효소 활성을 억제하는 방법을 통하여 질병이 억제되는지 확인하였다. 다양한 범위의 식물에서 질병을 일으킬 수 있는 펙토박테리움 케로토보륨 아종 브라질리엔스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense, Pcb), 펙토박테리움 케로토보륨 아종 카로토보룸15(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum15, Pcc15) 와 관상식물, 식물의 구근 등에서 질병을 일으킬 수 있는 것으로 보고된 펙토박테리움 크리산테미(Pectobacterium chrysanthemi, Pch), 감자의 검은다리 질병(blackleg of potato)을 일으키는 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 사탕무에서 질병을 일으키는 것으로 알려진 펙토박테리움 베타바술로룸(Pectobacterium betavasulorum, Pbe) 균들을 대상으로 (D)와 같은 방법으로 감자에서 무름병을 일으키는 정도가 DMPAPIR에 의해 감소하는지 측정한 결과, 펙토박테리움속에 속한 여러 다른 종의 균주의 병원성을 해당 억제제를 통해 크게 감소시킬 수 있음을 확인하였다. (F) 또 다른 NH 효소 활성 억제제인 BnIR의 감자 무름병에 미치는 영향을 (D)와 같은 방법으로 측정한 결과, BnIR 또한 Ecc15에 의한 감자의 무름병을 크게 저해할 수 있는 것을 확인하였다. (G) 또 다른 대표적인 식물 병원균인 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syrigae, Pst)에서 NH 효소 활성이 균의 독성에 중요한 영향을 미치는지 확인하였다. 슈도모나스 시링가에는 다양한 식물에서 괴사나 수지병(gummosis)를 일으키는 것으로 보고되고 있다. 대표적인 잎 식물 모델인 애기장대(Arabidopsis)의 잎에 상처를 내고 2X106 CFU 이하의 야생형 균(PstWT)와 NH 효소 활성을 제거한 돌연변이 균(Pst△NH)를 각각 도입하거나 또는 0.1 mM, 1 mM의 DMPAPIR를 야생형 균과 같이 처리 하여 일주일 후 식물 잎의 괴사가 진행되 정도를 관찰한 결과, 돌연변이 균(Pst△NH)과 DMPAPIR를 같이 처리한 경우 야생형 균이 유발하는 식물 잎 괴사가 감소된 것을 확인하였다. (H) 병원균인 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, PAO1)에서도 NH 효소 활성 억제제가 작용하는지 확인하였다. PAO1균을 NH 효소 활성 억제제 처리 또는 처리하지 않고 배양하여 배양 상등액을 얻고, 상등액과 엘라스틴-콩고 레드(elastin-congo red)를 반응시켜 PAO1의 엘라스타제의 활성을 측정한 결과, PAO1의 대표적인 독성 인자인 엘레사트제의 활성 억제제 처리농도와 비례하여 감소하는 것을 확인하였다.
이를 구체적으로 설명하면 다음과 같다. 한편, 본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 하나의 양태는 뉴클레오사이드 가수분해효소(nucleoside hydrolase, NH) 억제제를 제공한다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 하기 화학식 1 로 표시되는 화합물일 수 있고, 하기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다.
[화학식 1]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000001
상기 R은 비치환 또는 디(C1-C2 알킬)아미노로 치환된 페닐기일 수 있다.
상기 C1-C2 알킬은, 예를 들면, -CH3, -CH2CH3, -CH2CH3-CH3 등일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 R은
Figure PCTKR2021001159-appb-I000002
으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
전술한 바에 따라, 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 하기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물을 포함할 수 있고, 하기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다.
[화학식 2]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000003
[화학식 3]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000004
[화학식 4]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000005
[화학식 5]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000006
[화학식 6]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000007
[화학식 7]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000008
[화학식 8]
Figure PCTKR2021001159-appb-I000009
본 발명에 있어서, 상기 화학식 2는 DMPAIR((2S,3S,4R,5R)-2-(4-(dimethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol, MW: 252.31), 상기 화학식 3은 DMMAPIR((2S,3S,4R,5R)-2-(3-(dimethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol), 상기 화학식 4는 DEPAPIR((2S,3S,4R,5R)-2-(4-(diethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol), 상기 화학식 5는 DEMAPIR((2S,3S,4R,5R)-2-(3-(diethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol), 상기 화학식 6은 MEPAPIR((2S,3S,4R,5R)-2-(4-(methylethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol), 상기 화학식 7은 MEMAPIR((2S,3S,4R,5R)-2-(3-(methylethylamino)phenyl)-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol), 상기 화학식 8은 BnIR((2S,3S,4R,5R)-2-benzyl-5-(hydroxymethyl)pyrrolidine-3,4-diol, MW:223.27)로 명명될 수 있다.
장내 미생물 중에서, 대부분의 박테리아는 무해하거나 유익하나(이하, "공생균(symbionts)"), 다른 박테리아는 조건부(특히 그들이 우세할 때) 병원성을 나타낸다(이하, "병원균(pathobionts)"). 이에, 장 상피는 면역학적 딜레마에 직면하여 공생균과의 평화로운 동거를 유지하면서 병원균을 제어해야 한다.
미생물-도입 분자 패턴(Microbe-associated molecular pattern; MAMP)에 의한 병원균 인식 및 병원균 길항에 대한 항미생물 반응의 후속 활성화로 구성되는 선천성 면역계는 초파리를 포함한 다른 후생동물의 점막 면역에 잘 설명되어 있다. 모든 미생물이 예외없이 MAMP를 가지고 있다는 점을 감안할 때, MAMP 인식에 기초한 선천적 면역계에 대한 현재의 지식은 장이 어떻게 병원균을 공생균과 구별하는지, 그리고 장이 어떻게 병원균 특이적으로 항균성 반응을 활성화시키는지를 설명하지 못한다. 이전 연구는 병원균과 기회병원성 공생균이 DUOX 활성화를 위한 리간드 역할을 하는 우라실 대사 산물을 방출하는 반면, 공생균은 우라실을 방출하지 않음으로써 DUOX 활성화를 피함을 보여 주었다(Lee et al., Bacterial-derived uracil as a modulator of mucosal immunity and gut-microbe homeostasis in Drosophila. Cell 153, 797-811., 2013).
이러한 발견은 미생물-접촉 점막 장 상피가 우라실과 같은 병원균-특이적 대사 산물을 생성할 수 있는 병원균-특이적 대사 활성을 감지함으로써 병원균을 인식하여 미생물 ROS 생성을 유도할 수 있는 흥미로운 가능성을 제기한다. 그러나, 병원균-특이적 대사 활성의 존재는 설명된 적이 없으며, 병원균이 우라실을 특이적으로 방출하는 이유를 설명하기가 어렵다.
이러한 배경 하에서, 본 발명은 장의 내강 우리딘(gut luminal uridine)을 사용하는 세균성 뉴클레오사이드 가수분해효소에 의한 뉴클레오사이드 이화 작용(catabolism)인 “우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out)" 대사 흐름(도 7)이 초파리(Drosophila)에서 박테리아간 의사소통(inter-bacterial communications) 및 세균성 병인을 향상시키는 데 필요함을 최초로 확인하고, 우리딘 유래 우라실(uracil)이 이중 산화 효소(a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family, dual oxidase, DUOX) 의존적 ROS(reactive oxygen species) 생성을 위해 숙주 측에서 요구되는 반면, 우리딘 유래 리보스(ribose)는 박테리아 측에서 쿼럼 센싱(quorum sensing, QS) 및 독성 유전자 발현을 유도한다는 것을 발견했다. 박테리아 뉴클레오사이드 가수분해효소의 유전자를 결실시키는 것만으로도 in vivo에서 공생에서 병원균으로의 전이를 차단하기에 충분하다. 또한, 주요 공생 박테리아에는 장내 미생물 공생을 달성하는데 필요한 뉴클레오사이드 이화 작용이 없다는 것을 발견하였다. 이와 같이, 본 발명은 전술한 세균성 뉴클레오사이드 이화 작용의 새로운 역할을 발견함으로써 숙주-미생물 상호 작용의 다른 맥락에서 공생에서-병원균으로의 전이의 분자 메커니즘을 최초로 밝힌 것에 의의가 있다.
본 발명에서 용어, "뉴클레오사이드 가수분해효소(nucleoside hydrolase, NH)"는 뉴클레오사이드 N-리보하이드롤라제(nucleoside N-ribohydrolases, NRHs; EC 3.2.2.-)로도 명명되며, 뉴클레오사이드에서 N-글리코사이드 결합의 절단을 촉매하여 핵 염기(nucleobase)와 리보스(ribose)의 재활용을 가능하게하는 글리코시다제를 의미한다. 뉴클레오사이드와 핵 염기가 재활용되는 과정은 에너지를 보존하는 방법으로 구제(salvaging)라고도 명명된다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 병원균의 쿼럼 센싱 신호를 비활성화하는 것을 특징으로 하는 것일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 전사체 분석 결과에 따르면, 우리딘 대사의 부재는 광범위한 박테리아 대사 과정을 긍정적 또는 부정적으로 조절한다(도 4). 구체적으로, 1 차 대사 활동의 상향 조절 및 쿼럼 센싱 과정의 하향 조절이 Ecc15△4에서 관찰되며, 이는 1 차 대사 활성과 쿼럼 센싱 사이의 역상관성이 존재함을 나타낸다. 이와 관련하여, 1 차 대사 활성은 대조군 균주보다 박테리아 쿼럼 센싱-돌연변이 균주에서 더 높았으며, 이는 쿼럼 센싱이 신진 대사 브레이크로 기능하는 것을 시사한다. 이 개념에 따라, Ecc15△4와 쿼럼 센싱-돌연변이 박테리아 사이에서 유사한 대사 패턴(즉, 1 차 대사 유전자의 상향 조절)을 발견했으며, 이는 우리딘 대사와 쿼럼 센싱 사이의 연관성을 시사한다.
우라실과 달리, 리보스는 우리딘 이화 작용 후 박테리아 세포에서 분비되지 않는다(도 1). 뉴클레오사이드 이화 작용에 의존하는 쿼럼 센싱 조절에 관여하는 것으로 확인된 RbsR은 우리딘-유도 리보스에 의해 활성화될 가능성이 있으며, 이는 ExpR과 같은 쿼럼 센싱 활성화에 관여하는 중요한 유전자의 완전한 발현에 필요하다(도 5). Ecc15△4에서 ExpR/ExpI 시스템의 하향 조절은 아실 호모세린 락톤(acyl homoserine lactone, AHL)의 낮은 생산을 설명할 수 있다(도 5). 쿼럼 센싱을 통한 박테리아 세포 간 의사소통은 박테리아 병인에 중추적인 역할을 한다. 쿼럼 센싱의 시험관 내 조절은 비교적 잘 확립되어 있지만, 숙주 조직 내에서의 생체 내 조절에 대한 이해는 적다. 이에, 본 발명은 뉴클레오사이드 이화 작용이 생체 내 쿼럼 센싱 활성화 및 장 내강 내의 후속 독성 유전자 발현에 필요한 새로운 생체 내 쿼럼 센싱 조절 시스템임을 밝혀냈다(도 6). 뉴클레오사이드 이화 작용의 중요성은 Ecc15△4에서 관찰된 바와 같이 우리딘 이화 활성의 제거가 생명을 위협하는 병원균에서 성장을 촉진하는 공생균으로의 표현형 전환을 유도하기에 충분하다는 것이 확인됨으로써 추가로 입증되었다.
박테리아 측면에서 박테리아는 성공적인 감염을 보장하기 위해 박테리아가 어떠한 외부환경(즉, 장내 병원균의 경우 장 상피)에 있는지를 인식해야 한다. 장 내강에 풍부하게 존재하는 우리딘이 세균성 뉴클레오사이드 이화 작용에 의해 쉽게 이용되어 리보스 생산 및 후속 쿼럼 센싱 활성화를 유도하는 것을 확인함에 따라, 장 내 우리딘은 박테리아가 생체 환경임을 인지하는 지표일 수 있다(도 7).
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제인 DMPAPIR 및 BnIR의 NH 효소 활성 억제 효과를 확인하기 위해 상기 화합물을 NH 효소와 함께 첨가하여 기질인 우리딘을 분해하는 정도를 분석한 결과, 효소와 우리딘만을 넣어 반응시킨 경우(None)에는 효소의 활성에 의해 빠르게 우리딘 농도가 감소하였으나, NH 효소 활성 억제제를 여러 농도로 첨가한 경우에는 그 농도에 비례하여 효소 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 13B-C). 효소 활성을 저해할 수 있는 최소 농도(minimal inhibitory concetration)는 DMPAPIR(DM)의 경우 ~1 μM, BnIR의 경우 ~100 μM, PAPIR의 경우 ~100 μM로 측정되어, DMPAPIR의 경우 유효성이 약 100배 정도 우수한 것을 확인하였다. BnIR의 경우 억제하는 기능이 기존의 PAPIR와 유사한 것을 확인하였다.
이에 따라, 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제 효과가 기존의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제에 비해 현저히 우수함을 알 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물 독성 억제용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물일 수 있고, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물을 포함할 수 있고, 상기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제를 통해 병원성 미생물 독성을 억제하거나, 병원성을 나타내는 병원균을 비병원성을 나타내는 공생균으로 전환할 수 있다.
상기 병원성 미생물은 뉴클레오사이드 가수분해효소를 발현하는 미생물일 수 있고, 구체적으로 뉴클레오사이드 가수분해효소를 발현하는 장내 미생물이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 펙토박테리움속(Pectobacterium) 또는 슈도모나스속(Pseudomonas) 미생물일 수 있다. 상기 펙토박테리움속 미생물은 Ecc15(Erwinia carotovora subspecies carotovora 15), 펙토박테리움 아트로셉티컴(Pectobacterium atrosepticum), 펙토박테리움 카로토보룸(Pectobacterium carotovorum), 펙토박테리움 와사비애(Pectobacterium wasabiae), 어위니아 아밀로보라(Erwinia amylovora), 어위니아 피리폴리애(Erwinia pyrifoliae) 등일 수 있고, 일 예로 Ecc15 등일 수 있으며, 상기 슈도모나스속 미생물은 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa, PAO1), 슈도모나스속 시린개(Pseudomonas syringae), 슈도모나스 톨라아시(Pseudomonas tolaasii), 슈도모나스 아가리시(Pseudomonas agarici) 등일 수 있고, 일 예로 PAO1 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 i) 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염, ii) 뉴클레오사이드 가수분해효소 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 제제, 또는 iii) 이의 조합 중 선택되는 어느 하나 이상을 유효성분으로 포함할 수 있다.
상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 억제하는 제제는 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭(chimeric) 항체, 리간드, PNA(Peptide nucleic acid) 또는 앱타머(aptamer)이고; 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 제제는 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 siRNA(small interference RNA), shRNA(short hairpin RNA) 또는 miRNA(microRNA)일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명서 용어, "항체"는 당해 분야에서 공지된 용어로서 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 본 발명의 목적상, 항체는 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소에 대해 특이적으로 결합하는 항체를 의미하며, 이러한 항체는, 각 유전자를 통상적인 방법에 따라 발현벡터에 클로닝하여 상기 마커 유전자에 의해 코딩되는 단백질을 얻고, 얻어진 단백질로부터 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다. 여기에는 상기 단백질에서 만들어질 수 있는 부분 펩티드도 포함된다. 본 발명의 항체의 형태는 특별히 제한되지 않으며 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체 또는 항원 결합성을 갖는 것이면 그것의 일부도 본 발명의 항체에 포함되고 모든 면역 글로불린 항체가 포함된다.
본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 있어서, "siRNA"는 이중가닥의 RNA가 다이서에 의해 절단되어 생성되는 21-25 뉴클레오티드 크기의 작은 RNA 조각으로 상보적인 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 억제하는 것을 말한다. 본 발명의 목적상, mRNA에 특이적으로 결합하여 상기 유전자의 발현을 억제하는 것을 의미한다. siRNA는 화학적으로 또는 효소학적으로 합성될 수 있다. siRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명에서 사용되는 siRNA는 그 자체로 폴리뉴클레오타이드 페어링을 갖는 완전한 형태, 즉 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 두 형질전환 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태이거나, 생체 내에 투여된 후 이러한 형태를 갖도록 하나의 단일쇄 올리고뉴클레오타이드 단편과 이의 역방향(reverse) 상보물이 스페이서에 의해 분리된 단일쇄 폴리뉴클레오타이드로부터 유도될 수 있는 형태, 예를 들어 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-유도된 siRNA 발현 카세트를 형질전환 또는 감염(infection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입되는 형태일 수 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.
본 발명에 있어서, "shRNA"는, 45 내지 70 뉴클레오티드의 길이를 가지는 단일가닥의 RNA로서 타겟유전자 siRNA 염기서열의 sense와 상보적인 nonsense 사이에 3-10 개의 염기 링커를 연결하는 올리고 DNA를 합성한 후 플라스미드 벡터에 클로닝하거나 또는 shRNA를 레트로바이러스인 렌티바이러스(lentivirus) 및 아데노바이러스(adenovirus)에 삽입하여 발현시키면 루프(loop)가 있는 헤어핀(hairpin) 구조의 shRNA(short hairpin RNA)가 만들어지고 세포 내의 Dicer에 의해 siRNA로 전환되어 RNAi 효과를 나타내는 것을 의미한다. shRNA(small hairpin RNA)를 포함한 발현 컨스트럭트/벡터는 당분야에서 공지된 방법으로 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서 "miRNA(microRNA)"는, mRNA의 3' 비번역 영역(UTR) 부위와의 염기결합을 통해 전사 후 억제자 역할을 하는 대략 22 nt의 비번역 RNA를 의미한다. miRNA의 제조방법으로는 특별히 한정되지 않으며, 당업계에 공지된 방법을 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 DMPAPIR은 병원균인 PAO1의 대표적인 독성 인자인 엘라스타제의 활성이 엘라스타제의 처리 농도와 비례하여 감소하는 것을 확인하였다(도 13H).
상기 조성물은 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제, 및 도포제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 형태일 수 있고, 병원성 미생물 독성 억제 용도를 갖는 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 포함된 유효성분의 함량은 조성물이 병원성 미생물 독성 억제 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
상기 병원성 미생물 독성 억제용 조성물은 의약외품 조성물로 제공될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물에는 상기 성분 외에 필요에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더욱 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제는 본 발명의 효과를 해하지 않는 한 제한되지 않으며, 예를 들어 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제, 윤활제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
상기 "약학적으로 허용 가능한 담체"는 생물체를 자극하지 않으면서, 주입되는 화합물의 생물학적 활성 및 특성을 저해하지 않는 담체, 부형제 또는 희석제를 의미할 수 있으며, 구체적으로, 비자연적 담체(non-naturally occuring carrier)일 수 있다. 본 발명에 사용 가능한 상기 담체의 종류는 특별히 제한되지 아니하며 당해 기술 분야에서 통상적으로 사용되고 약학적으로 허용되는 담체라면 어느 것이든 사용할 수 있다. 상기 담체의 비제한적인 예로는, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충식염수, 알부민 주사 용액, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등을 들 수 있다. 이들은 단독으로 사용되거나 2 종 이상을 혼합하여 사용될 수 있다.
약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 상기 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 구체적으로, 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 액체 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 의약외품 조성물은 소독 청결제, 샤워폼, 연고액, 물티슈, 코팅제 등을 예시할 수 있으나 이에 제한되는 것이 아니며, 의약외품의 제제화 방법, 용량, 이용방법, 구성성분 등은 기술분야에 공지된 통상의 기술로부터 적절히 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물일 수 있고, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물을 포함할 수 있고, 상기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제를 통해 병원성 미생물 독성을 억제하거나, 병원성을 나타내는 병원균을 비병원성을 나타내는 공생균으로 전환할 수 있다.
상기 병원성 미생물은 뉴클레오사이드 가수분해효소를 발현하는 미생물일 수 있고, 구체적으로 뉴클레오사이드 가수분해효소를 발현하는 장내 미생물이라면 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 펙토박테리움속 또는 슈도모나스속 미생물일 수 있다. 상기 펙토박테리움속 미생물은 Ecc15, 펙토박테리움 아트로셉티컴, 펙토박테리움 카로토보룸, 펙토박테리움 와사비애, 어위니아 아밀로보라, 어위니아 피리폴리애 등일 수 있고, 일 예로 Ecc15 등일 수 있으며, 상기 슈도모나스속 미생물은 PAO1, 슈도모나스속 시린개, 슈도모나스 톨라아시, 슈도모나스 아가리시 등일 수 있고, 일 예로 PAO1 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제인 DMPAPIR 및 BnIR의 NH 효소 활성 억제 효과를 확인하기 위해 상기 화합물을 NH 효소와 함께 첨가하여 기질인 우리딘을 분해하는 정도를 분석한 결과, 효소와 우리딘만을 넣어 반응시킨 경우(None)에는 효소의 활성에 의해 빠르게 우리딘 농도가 감소하였으나, NH 효소 활성 억제제를 여러 농도로 첨가한 경우에는 그 농도에 비례하여 효소 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 13B-C). 효소 활성을 저해할 수 있는 최소 농도(minimal inhibitory concetration)는 DMPAPIR(DM)의 경우 ~1 μM, BnIR의 경우 ~100 μM, PAPIR의 경우 ~100 μM로 측정되어, DMPAPIR의 경우 유효성이 약 100배 정도 우수한 것을 확인하였다. BnIR의 경우 억제하는 기능이 기존의 PAPIR와 유사한 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 일 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 DMPAPIR은 병원균인 PAO1의 대표적인 독성 인자인 엘라스타제의 활성이 엘라스타제의 처리 농도와 비례하여 감소하는 것을 확인하였다(도 13H).
본 발명에서의 용어, "예방"이란 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 병원성 미생물 감염의 발병을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미하고, "치료"란 상기 약학 조성물의 투여에 의해 병원성 미생물 감염의 의심 및 발병 개체의 증상이 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 약학 조성물은, 약학 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명에서, 상기 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물과 이의 분획물들에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는 데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물에 포함된 유효성분의 함량은 약학 조성물이 병원성 미생물 감염에 대한 예방 또는 치료 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 약제학적으로 유효한 양으로 투여될 수 있는데, 본 발명의 용어 "약제학적으로 유효한 양"이란 의학적 치료 또는 예방에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료 또는 예방하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 질환의 중증도, 약물의 활성, 환자의 연령, 체중, 건강, 성별, 환자의 약물에 대한 민감도, 사용된 본 발명 조성물의 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율 치료기간, 사용된 본 발명의 조성물과 배합 또는 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적으로 또는 동시에 투여될 수 있다. 그리고 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하다.
본 발명의 약학 조성물의 투여량은 예를 들어, 본 발명의 약학 조성물을 사람을 포함하는 동물에 하루 동안 0.1 내지 500 mg/체중 kg으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물의 투여 빈도는 특별히 이에 제한되지 않으나, 1일 1회 투여하거나 또는 용량을 분할하여 수회 투여할 수 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
상기 약학 조성물의 투여 경로는 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여도 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 특별히 이에 제한되지 않으나, 목적하는 바에 따라 복강내 투여, 정맥내 투여, 근육내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 경구 투여, 비내 투여, 폐내 투여, 직장내 투여 등의 경로를 통해 투여 될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 부위, 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는 식물병 방제용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염은는 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물일 수 있고, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물을 포함할 수 있고, 상기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제를 통해 식물병을 유발하는 병원성 미생물 독성을 억제하거나, 식물병을 유발하는 병원성을 나타내는 병원균을 비병원성을 나타내는 공생균으로 전환할 수 있다.
상기 식물병은 미생물 감염에 의해 발생하는 것일 수 있다.
상기 식물병을 유발하는 미생물은 뉴클레오사이드 가수분해효소를 발현하는 미생물일 수 있고, 이에 특별히 제한되지 않으나, 예를 들면 펙토박테리움속(Pectobacterium) 또는 슈도모나스속(Pseudomonas) 미생물일 수 있다. 상기 펙토박테리움속 미생물은 예를 들면 펙토박테리움 케로토보륨 아종 브라질리엔스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense, Pcb), 펙토박테리움 케로토보륨 아종 카로토보룸 15(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum15, Pcc 15), 펙토박테리움 크리산테미(Pectobacterium chrysanthemi, Pch), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 펙토박테리움 베타바술로룸(Pectobacterium betavasulorum, Pbe) 등일 수 있고, 슈도모나스속 미생물은 예를 들면 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syrigae, Pst) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 항생제를 추가로 포함할 수 있다.
종래 식물병 방제를 위해서는 다량의 항생제 투여 또는 살포가 불가피하였으나, 본 발명의 식물병 방제용 조성물은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 유효성분으로 포함함에 따라, 항생제의 농도 또는 용량을 기존 사용 농도 또는 용량보다 낮춰서 사용할 수 있는 점에 경제적, 환경적으로 이점이 있다.
상기 항생제는 식물병 방제 효과를 나타내는 항생제라면 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들면, 네오마이신(neomycin), 리보스타마이신(ribostamycin), 스트렙토마이신(streptomycin) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 구현예에서, 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제인 DMPAPIR 및 BnIR은 식물 병원균인 펙토박테리움 케로토보륨 아종 브라질리엔스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense, Pcb), 펙토박테리움 케로토보륨 아종 카로토보룸 15(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum15, Pcc 15), 펙토박테리움 크리산테미(Pectobacterium chrysanthemi, Pch), 및 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 펙토박테리움 베타바술로룸(Pectobacterium betavasulorum, Pbe)에 의한 식물병의 발병을 현저히 감소시켰다(도 13).
상기 조성물은 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제, 및 도포제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 형태일 수 있고, 식물병 방제 용도를 갖는 조성물에 통상 사용되는 임의의 적합한 부형제를 추가로 포함할 수 있으며, 이러한 부형제는, 예를 들어 보존제, 습윤제, 분산제, 현탁화제, 완충제, 안정화제 또는 등장화제 등일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물에 포함된 유효성분의 함량은 조성물이 식물병 방제 효과를 가지는 한 제한되지 않으나, 최종 조성물 총 중량을 기준으로 0.0001 내지 99.9 중량%, 보다 구체적으로는 0.01 내지 80 중량%의 함량으로 포함될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 병원성 미생물 독성 억제 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 방법에 있어서, 본 발명의 조성물은 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제, 및 도포제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 형태일 수 있으며, 방법은 특별이 제한되지 않고 상기 조성물의 형태에 따라 적절하게 선택되어 수행될 수 있다.
상기 방제 방법에 있어서, 본 발명의 조성물은 단독으로 처리하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 처리(살포)량 또는 처리 시간 간격은 개체에 따라 다를 수 있고, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물을 인간을 제외한 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 병원성 미생물 감염의 치료 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 본 발명의 식물병 방제용 조성물을 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 방제 방법에 있어서, 본 발명의 조성물은 액제, 입제, 분제, 유제, 오일제, 수화제, 및 도포제로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상의 형태일 수 있으며, 방제 방법은 특별이 제한되지 않고 상기 조성물의 형태에 따라 적절하게 선택되어 수행될 수 있다. 구체적으로, 상기 방제 방법은 경엽처리, 토양처리, 침지처리, 가지처리, 및 농기구 처리로 이루어지는 군 중에서 선택되는 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 방제 방법에 있어서, 본 발명의 조성물은 단독으로 처리하거나 다른 방제제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 방제제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기 요소를 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 처리(살포)량 또는 처리 시간 간격은 식물체에 따라 다를 수 있고, 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다. 본 발명의 조성물의 바람직한 처리량은 식물체의 생육정도, 경작지 환경, 식물바이러스병의 발병 정도 등을 고려하여 당업자에 의해 적절하게 조절할 수 있으며, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 일반적으로 식물체당 0.5 내지 1000 μM(1 mM)의 농도로 식물체에 처리되는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 조성물을 제조, 보관, 및 운반할 경우 일반적으로 식물체에 처리시 농도보다 1 내지 100,000배의 농축 농도, 구체적으로는 100 내지 50,000배의 농축 농도, 보다 구체적으로는 500 내지 10,000배의 농축 농도로 제조, 보관, 및 운반할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 뉴클레오사이드 가수분해효소를 제공하는 단계; 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 시험물질과 접촉시키는 단계; 상기 시험물질과 접촉한 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 및 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군에서 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소의 발현 또는 활성이 감소된 경우, 상기 시험물질을 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 후보물질은 우리딘을 분해하는 뉴클레오사이드 가수분해효소의 활성을 억제하여, 우리딘이 분해되지 않도록 하는 것일 수 있다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 뉴클레오사이드 가수분해효소 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 제제를 포함하는, 병원성 미생물의 공생균으로의 전환용 조성물을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 억제하는 제제는 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소에 특이적으로 결합하는 올리고펩타이드, 모노클로날 항체, 폴리클로날 항체, 키메릭 항체, 리간드, PNA 또는 앱타머이고; 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자의 발현을 억제하는 제제는 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합하는 siRNA, shRNA 또는 miRNA일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 병원성 미생물에서 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 결실된, 병원성 미생물의 공생균을 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
병원성 미생물 내에서, 상기 NH1, NH2, udp 및/또는 deoD 유전자 중 어느 하나 이상을 포함하는 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소를 코딩하는 유전자를 결실 또는 이의 활성을 억제시킬 경우, 병원성 미생물, 즉, 병원성을 나타내는 병원균을 비병원성을 나타내는 공생균으로 전환할 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
상기 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 염기서열을 가지거나, 포함하거나, 이루어지거나, 상기 염기서열로 필수적으로 이루어질(essentially consisting of) 수 있다.
구체적으로, 상기 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열을 가지거나 포함하거나, 또는 서열번호 1 또는 서열번호 2 또는 서열번호 3 또는 서열번호 4의 서열과 상동성 또는 동일성이 70% 이상, 75% 이상, 80% 이상, 85% 이상, 90% 이상, 95% 이상, 96% 이상, 97% 이상, 98% 이상, 및 100% 미만인 염기서열로 이루어지거나 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 이러한 상동성 또는 동일성을 가지며 상기 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자에 상응하는 효능을 나타내는 염기서열이라면, 일부 서열이 결실, 변형, 치환, 보존적 치환 또는 부가된 염기서열을 갖는 변이체도 본 발명의 범위 내에 포함됨은 자명하다.
상기 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자가 코딩하는 NH1, NH2, udp 및 deoD 폴리펩티드는 서열번호 5, 서열번호 6, 서열번호 7 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하거나, 이루어지거나, 상기 아미노산 서열로 필수적으로 이루어질 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 병원성 미생물은 펙토박테리움 속 또는 슈도모나스 속 미생물일 수 있고, 구체적으로 Ecc15일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 또 하나의 양태는 본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 포함하는, 병원균의 쿼럼 센싱 저해제를 제공한다.
여기에서 사용되는 용어는 전술한 바와 같다.
본 발명의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 상기 화학식 1 로 표시되는 화합물일 수 있고, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다. 구체적으로, 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물을 포함할 수 있고, 상기 화학식 2 내지 화학식 8로 표시되는 화합물, 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 제한 없이 포함할 수 있다.
상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 병원균의 쿼럼 센싱 신호를 비활성화하는 것일 수 있으며, 이에 대해서는 전술한 바와 같다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
실시예 1. 병원균에 의한 "우리딘(uridine)-인(in) 및 우라실(uracil)-아웃(out)" 대사 흐름의 유도 확인
병원균에 의한 우리딘 및 우라실 대사 흐름 유도 여부를 확인하기 위해, 초파리기회 병원균인 Ecc15(Erwinia carotovora subspecies carotovora 15)로 초파리 장을 감염시킨 후, 초파리 중장(midgut)의 내강액(luminal fluid)을 TOF-MS(Time-of Flight Time Spectrometry)와 결합된 모세관 전기 영동(capillary electrophoresis; CE)을 수행하였다.
구체적으로, 초파리(Drosophila)는 Bloomington Drosophila stock center's 표준 옥수수 가루 배지에서 25 ℃로 사육하였다. 노랑초파리의 백색 돌연변이(Drosophila melanogaster White Mutant w 1118, Drosophila melanogaster w 1118)를 대조군 동물로 사용하였다.
Ecc15 균주는 암피실린(ampicillin) 100 μg/ml, 카나마이신(kanamycin) 30 μg/ml, 아프라마이신(apramycin) 25 μg/ml, 테트라사이클린(tetracycline) 20 μg/ml, 리팜피신(rifampicin) 50 μg/ml 및 클로람페니콜(chloramphenicol) 35 μg/ml을 포함하는 LB 또는 최소 M9 배지에서 30 ℃로 배양하였다.
초파리 장을 감염시키기 위해, 1010 CFU 이하의 Ecc15를 포함하는 수크로스(sucrose) 용액으로 초파리(5-6 일령)를 2시간 동안 구강 감염시키고, 구강 감염 전후 150 개 이하의 해부된 암컷 중장(midguts)으로부터 장 내강액(gut luminal fluids)을 얻었다. 해부된 중장을 4-5 조각으로 잘게 썰어 빙냉 PBS(phosphate buffered saline) 용액에서 10 분 동안 추가로 배양하여 확산된 내강액을 얻었다. 확산된 내강액을 4,000 rpm에서 1 분간 원심분리하고 대사체학 분석(Human Metabolome Technologies Inc.)을 위해 0.2 μm 셀룰로오스 아세테이트 필터(ADVANTEC)를 통해 여과하였다. 대사 산물은 샘플당 2 종류의 생물학적 복제물[감염되지 않은 장의 장 내강액(gut luminal fluids from non-infected gut, (NI 내강액) 및 감염된 장의 장 내강액(gut luminal fluids from infected gut, I 내강액))에서 양이온 및 음이온 모드의 Agilent CETOF-MS 시스템(Capillary Electrophoresis Time-of Flight Time Spectrometry, Agilent Technologies Inc.)으로 측정되었다. CETOF-MS 분석에서 검출된 피크는 m/z, 이동 시간(migration time, MT) 및 피크 면적을 포함한 피크 정보를 얻기 위해 자동 통합 소프트웨어(Keio University에서 개발한 MasterHands 버전 2.16.0.15)을 사용하여 추출하였다. NI 및 I 내강액에서 검출된 158 개의 대사 산물의 풍부함을 피크 면적으로 계산하였다. 이후 NI와 I 내강액 사이의 DE(differentially expressed) 대사 산물을 절대 log2-fold-changes > 1 (2 배) 또는 NI 또는 I 내강액에서만 검출된 대사 산물로 식별하였다. DE에 의해 농축된 대사 산물 그룹(예를 들면, 뉴클레오타이드 및 아미노산)을 확인하기 위해, Fisher의 exact test를 사용하여 농축 분석을 수행하고 p-값이 0.05 미만인 그룹을 선택하였다.
그 결과, Ecc15 감염 후 장 내강 대사체(metabolome) 중, 뉴클레오타이드 대사 경로에 속하는 대사 물질(metabolite)에서 가장 중요한 변화가 관찰되었다(도 1A-B). 또한, Ecc15 감염 후, 리보스 고리에 부착된 우라실 분자인 뉴클레오사이드(예를 들면, 우리딘)의 수준이 크게 감소하면서, 핵 염기(nucleobase)(예를 들면, 우라실)의 수준이 크게 증가하였다(도 1C).
이러한 결과는 장 내강(gut lumen)의 우리딘이 박테리아 세포에 의해 신속하게 흡수되어(즉, 우리딘-인(in)), 우리딘의 리보스 및 우라실로의 이화 작용을 유도하고 우라실은 이들 세포에 의해 분비됨(즉, 우라실-아웃(out))을 시사하는 것이다.
다음으로, 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름을 추가로 조사하기 위해, Ecc15 배양 상등액 내 우라실 및 우리딘 수준을 탠덤 질량 분석법(tandem mass spectrometry)과 결합된 LC-MS/MS((liquid chromatography-tandem mass spectrometry))를 사용하여 측정하였다. 구체적으로, Ecc15을 우리딘을 함유하는 최소 배지에서 배양하고, 배양 상층액 또는 30개 중장으로부터 확보한 장 내강액에서 얻은 우리딘, 우라실 및 D-리보스(D-ribose)를 전기 분무 인터페이스(electrospray interface)가 있는 Agilent 6460 Triple Quadrupole 질량 분석법(Agilent Technologies, USA)을 사용하여 분석하였다. 분리는 XSelect® HSS T3 2.5 μm(2.1 x 100 mm, 2.5 μm 입자 크기, Island Waters) 컬럼에서 수행되었다.
우리딘 또는 우라실의 분석을 위해 샘플을 내부 표준 물질(물에 500 μg/mL로 포함된 5-브로모라실(5-bromouracil)) 1 μL와 혼합하고 5 분 동안 볼텍스(vortex) 혼합한 에틸 아세테이트(ethyl acetate) : 이소프로필 알코올(isopropyl alcohol) 9 : 1 (v/v) 혼합물 1 mL로 추출하였다. 각 샘플은 13,000 rpm으로 4 ℃에서 10 분 동안 원심 분리되었다. 상부 유기층의 800 μL 분취량(aliquot)을 36 ℃에서 질소 가스 하에서 증발 건조시켰다. 잔류물을 0.2 % 아세트산을 함유하는 50 μL의 물에 용해시키고 5 분 동안 볼텍싱하였다. 각 샘플 및 표준 용액의 상등액을 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다. 컬럼 온도는 30 ℃로 유지하고 주입량은 1 μL로 설정하였다. 이동상(A)는 0.2 % 아세트산(acetic acid)을 함유한 물이었고, 이동상(B)는 0.2 % 아세트산을 함유한 아세토니트릴(acetonitrile)이었다. 유속은 구배 모드에서 0.2 mL/분 : 0-5 분, 0 % (B); 10 분, 15 % (B); 10.1-15 분, 0 % (B)이었다.
리보스 분석을 위해 샘플을 50 μL의 내부 표준 물질(물에 500 ng/mL로 포함된 6-13C-프룩토스(6-13C-fucose))와 혼합한 다음 100 μL의 메탄올에 혼합된 5 mM 3-아미노-9-에틸카르바졸(3-amino-9-ethylcarbazole, AEC), 50 μL의 10 mM NaCNBH3 용액 및 10 μL의 아세트산을 순서대로 혼합하였다. 반응 혼합물을 60 ℃에서 60 분 동안 배양하고, 각 튜브를 1 분 동안 얼음에서 냉각시킨 후 300 μL의 물과 300 μL의 디클로로메탄-헥산(dichloromethane-hexane)(2 : 1, v/v) 용매를 첨가하였다. 각 샘플을 5 분 동안 볼텍싱하고 10,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리하였다. 상부 수성상의 100 μL 분취량을 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다. 컬럼 온도는 40 ℃로 유지하고 주입량은 1 μL로 설정하였다. 이동상(A)는 0.1 % 포름산을 함유한 물이었고 이동상(B)는 0.1 % 포름산을 함유한 아세토니트릴이었다. 유속은 구배 모드에서 0.2 mL/분 : 0 분, 25 % (B); 8 분, 100 % (B); 및 8.1-15 분, 25 % (B) 이었다. 총 실행 시간은 15분이었다.
그 결과, 배양 상등액의 우라실 수준은 Ecc15 배양 후 점차적으로 증가하는 반면, 우리딘은 배양 상등액에서 완전히 사라지는 것을 확인하였다(도 1D).
다음으로, 배설된 우라실이 흡수된 세포 외 우리딘으로부터 직접 유래되는지를 조사하기 위해, 핵 염기 모이어티(15N-우리딘) 또는 리보스 모이어티(13C-우리딘)에서 동위원소를 운반하는 방사성 우리딘(15N-우리딘, 13C-우리딘, 15N-우라실 및 13C-리보스)을 함유하는 만니톨 배지에서 Ecc15를 8 시간 동안 배양하였다. 이후, 배양 상등액에서 15N-우리딘, 13C-우리딘, 15N-우라실 및 13C-리보스 수준을 LC-MS/MS 분석을 사용하여 정량화하였다.
그 결과, 4 시간의 배양 기간 동안 배양 상등액에서 15N-우리딘과 13C-우리딘 수준이 점차 감소하였다(도 1E). 반면, 동일 기간에서 배양 상등액 중의 15N-우라실 함량은 점진적으로 증가하여, Ecc15 세포로부터 분비된 우라실이 실제로 흡수된 15N-우리딘으로부터 유래됨을 확인하였다. 핵 염기 모이어티와 대조적으로, 배양 상등액에서 13C-리보스는 검출할 수 없었으며(도 1E), 이는 Ecc15 세포 내에서 우리딘의 절단 후 리보스 모이어티는 분비되지 않음을 확인하였다.
이러한 결과는 병원성 Ecc15가 세포외 우리딘을 흡수하고 리보스 및 우라실로 이화시킬 수 있음을 시사하였다. 또한 리보스가 아닌 우라실은 박테리아 세포에서 분비되었다.
다음으로, 초파리 장 내강 우리딘의 유래를 확인하기 위해, CV(conventional) 파리와 무균(Germ free, GF) 파리의 장 내강 우리딘을 비교하였다. GF 파리는 이전에 설명한 대로 제작하였다(Ryu, et al., Innate immune homeostasis by the homeobox gene caudal and commensal-gut mutualism in Drosophila. Science 319, 777-782., 2008). GF 파리를 제작하기 위해 박테리아 세포 약 2x107 개를 멸균 PBS로 2회 세척하고 GF 배아가 들어있는 무균 식품 바이알에 투여하였다. GF 파리는 고압 멸균된 표준 옥수수 가루 배지 또는 홀리딕(holidic) 배지에서 사육하였다(Piper, et al., A holidic medium for Drosophila melanogaster. Nat Methods 11, 100-105., 2014).
그 결과, CV 파리와 비교할 때 GF 파리의 장 내강에서 더 높은 수준의 우리딘이 검출되었으며, 이는 우리딘이 장내 세균에서 유래하지 않음을 나타낸다. 또한, 표준 식이 요법과 홀리딕 식이 요법 사이에 우리딘 수준의 유의한 차이가 관찰되지 않았으며, 이는 장 내강 우리딘이 식이에서 파생되지 않음을 나타낸다(도 8).
실시예 2. 병원균에 의한 "우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out)" 대사 흐름 및 이중 산화 효소(dual oxidase; DUOX; a member of the nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase family) 활성화 간의 관련성 여부 확인
미생물 게놈에 대한 NCBI 데이터베이스에서, 아세토박터과(Acetobacteraceae) 패밀리의 약 100 종에 대한 게놈 정보가 현재 이용 가능하다.
이러한 게놈이 확인된 아세토박터과 중 10 종의 박테리아를 선택하여, 박테리아 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름과 장내 DUOX 활성화 간의 관계를 조사하였다. 구체적으로, 생체 내에서 DUOX 의존적 ROS(reactive oxygen species) 생성을 측정하기 위해 장의 R2 영역을 이전에 설명한대로 HOCl(hypochlorous acid) 특이적 로다민(rhodamine) 기반 R19S 염료로 염색하였다(Lee, et al. Bacterial-derived uracil as a modulator of mucosal immunity and gut-microbe homeostasis in Drosophila. Cell 153, 797-811., 2013). DUOX 활성은 R19S 양성 장의 백분율로 표시되었다.
그 결과, 7 종의 박테리아가 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름을 나타내는 반면 3 종의 박테리아는 그렇지 않다는 것을 확인하였다(도 2A). 중요하게도, 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름을 나타내는 7 종의 박테리아 모두 장내 DUOX-의존적 ROS 생성을 유도하였다(도 2B).
이러한 결과는 박테리아의 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름이 장에서 DUOX 활성화를 유도하는 능력과 유관함을 나타낸다. 이 결과에 기초하여, 이들 아세토박터과 구성원을 숙주 장에 미치는 영향에 따라 2 개의 별개 그룹, 즉, DUOX 활성화를 초래하는 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름을 유도할 수 있는 기회병원성 공생미생물(병원균, pathobiont) 그룹 및 이러한 대사 흐름이 없어 DUOX 활성화가 없는 공생균 그룹으로 나눌 수 있다.
실시예 3. 아세토박터과의 병원균과 공생균 구성원 간의 비교 유전체 분석
병원균-특이적 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름의 분자 메커니즘을 이해하기 위해 뉴클레오사이드 대사에 초점을 맞춘 비교 유전체 분석을 수행하였다. 구체적으로, 뉴클레오타이드 대사 경로에 관여하는 52 개 단백질에 대한 글루코노박터 모비퍼(Gluconobacter morbifer, G. morbifer)의 아미노산 서열을 NCBI 단백질 서열 데이터베이스에서 수집하였다. 다른 박테리아에서 상기 단백질의 보존을 평가하기 위해 G. morbifer의 서열을 BLASTP 프로그램을 사용하여 9 개의 다른 아세아토박테리아과(Aceatobacteraceae) 구성원의 단백질 서열로 매핑하여, 9 개의 박테리아에서 E-값이 가장 낮은 단백질은 잠재적인 오솔로그(ortholog)로 선택하였다. 각 오솔로그에 대해 일치하는 아미노산 수를 총 아미노산 수로 나눈 값으로 동일성 백분율을 계산하였다. 아세아토박테리아과 균주는 만니톨 배지에서 30 ℃로 배양하였다.
그 결과, 뉴클레오사이드 대사 경로, 특히, 피리미딘 이용률 및 퓨린/피리미딘 전환이 공생균 그룹과 병원균 그룹 간에 차이가 있었다(도 2C). 특히, 뉴클레오사이드 가수분해효소(nucleoside hydrolase, NH, 뉴클레오사이드를 뉴클레오사이드 및 리보스로 전환), 뉴클레오사이드 퍼미아제(nucleoside permease, NupC, 세포 내로 뉴클레오사이드 수송), 아데닌 데아미나제(adenine deaminase, AdeC, 아데닌(adenine)을 하이포잔틴(hypoxanthine)으로 전환) 및 시티딘 데아미나제(cytidine deaminase, Cdd, 시티딘(cytidine)을 우리딘으로 전환)의 4개의 유전자는 병원균 구성원에만 존재하였다(도 2C).
이를 바탕으로, 병원균-특이적 NupC 및 NH 유전자가 병원균이 DUOX 활성화를 위해 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름을 유도할 수 있는 메커니즘을 제공함을 알 수 있다(도 2D). 비교 유전체 분석 결과는 NupC 및 NH 유전자가 없는 공생균이 세포외 우리딘을 가져올 수 없었던 이유와 우리딘으로부터 우라실을 생성할 수 없는 이유를 설명할 수 있다.
실시예 4. 병원균의 우라실 아웃에서 NH 활성 참여 여부 확인
병원균의 우라실 아웃에서 NH 활성의 직접 참여를 확인하기 위해, 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)에 의해 NH 활성이 없는 병원균 G. morbifer의 돌연변이(G. morbifer △NH , Gmo△NH)를 제작하였다. 구체적으로, G. morbifer의 프레임 내 결실 돌연변이체는 상동성 재조합을 사용하여 제작하였다. 파괴 플라스미드는 dam-/dcm-E.coli(NEB, C2925i)를 사용하여 탈메틸화되고 전기천공(electroporation)에 의해 G. morbifer에 도입되었다. 표적 유전자의 결실은 PCR 및 시퀀싱 분석으로 확인하였다. G. morbifer △NH의 보완을 위해, 녹농균(Pseudomonas aeruginosa, P. aeruginosa)의 NH 유전자를 pCM62 벡터에서 구성적 PntpII 프로모터의 제어하에 배치하여 pCM62-PntpII::NH를 제작하였다. 플라스미드 pCM62-PntpII::NH를 탈메틸화하고 G. morbifer △NH에 도입하여 G. morbifer △NH_NH를 제작하였다.
박테리아 세포로부터 우라실 아웃을 조사한 결과, 야생형 모균주(G. morbifer WT, GmoWT)에서 관찰된 우라실 아웃이 Gmo△NH에서 완전히 폐지되었음을 확인하였다(도 3A). 또한, NH 유전자를 재도입할 경우(G. morbifer △NH_NH , Gmo△NH_NH), Gmo△NH의 손상된 우라실 아웃 능력이 회복되었다(도 3A). Gmo△NH는 GmoWT 또는 Gmo△NH_NH와 달리 우라실 아웃이 확인되지 않을 뿐만 아니라, 장내 ROS 생성을 유도할 수 없었다(도 3B).
이러한 결과는 박테리아 NH 활성이 우라실 아웃 및 후속 DUOX-의존적 ROS 생성에 필요하다는 것을 알 수 있다.
실시예 5. 병원균의 NH 활성과 장 병리(gut pathology) 및 콜리토제닉(colitogenic) 인자 간의 관련성 여부 확인
병원균의 NH 활성이 장 병리의 직접적인 원인인지를 조사하기 위해, GmoWT 또는 Gmo△NH와 각각 단일-도입된 GF 파리 간의 장 세포 손상율을 비교하였다.
구체적으로, GmoWT 또는 Gmo△NH와 각각 단일-도입된 45 일령 암컷 GF 파리의 중장을 PBS에서 절개하고, Click-iTTM Plus TUNEL 분석 키트(Invitrogen Inc. C10618)를 사용하여 아폽토시스(apoptosis) 분석을 수행하였다. 아폽토시스 지수는 총 세포 수에 대한 아폽토시스 세포 수의 백분율로 계산하였다.
그 결과, GmoWT 단일-도입된 GF 파리에서 관찰된 높은 장 세포 아폽토시스 비율이 Gmo△NH 단일-도입된 GF 파리에서는 거의 나타나지 않음을 확인하였다(도 3C). 장 병리 결과와 동일하게, GmoWT 단일-도입된 GF 파리는 Gmo△NH 단일-도입된 GF 파리보다 수명이 짧았다(도 3D). 따라서, NH 활성의 제거는 병원균에서 공생균으로의 박테리아 표현형 전환을 유도하기에 충분함을 확인하였다. 또한, 돌연변이 병원균에 NH 활성의 재도입(Gmo△NH_NH)은 GmoWT 단일-도입된 파리에서 관찰되는 수준과 유사한 장 세포 손상 및 높은 사망률과 같은 모든 숙주 병리를 복원하기에 충분하였다(도 3C-D).
이러한 결과는 병원균의 NH 활성이 장 병리 및 초기 숙주 사망을 야기하는 콜리토제닉 인자로 작용하는 것을 시사하였다.
실시예 6. 장-미생물 공생과 아세토박터과의 뉴클레오사이드 이화 작용 간의 관련성 여부 확인
상기 실시예의 결과에 기초하여, 공생균에서 관찰된 바와 같이 우리딘 이화 작용(예를 들어, NH 및 NupC)에 관여하는 핵심 유전자의 부재가 만성 DUOX 활성화를 피함으로써 숙주 장과 평화롭게 상호 작용할 수 있다고 가정하고, 이 가설을 테스트하기 위해, 아세토박터 파스테우리아너스(Acetobacter pasteurianus, A. pasteurianus) 공생균에 NH 및 NupC 유전자를 도입한 균주(A. pasteurianus NH_NupC, ApaNH_NupC)를 제작하였다. 구체적으로, A. pasteurianus NH_NupC를 제작하기 위해 A. pasteurianus는 YPGD 배지(0.5 %의 글리세롤, 0.5 %의 폴리펩톤, 0.5 % 포도당 및 0.5 % 효모 추출물 함유)에서 배양된 후, 대장균(Escherichia coli, E. coli) HB101/pKR2013(Matsutani, et al., J Biotechnol 165, 109-119., 2013)을 사용하는 삼친주교배(triparental mating)에 의해 pCM62-PntpII::NH_NupC로 형질전환되었다. 이후, 테트라사이클린(20 μg/ml) 및 아세트산(0.1 %(v/v))이 보충 된 YPGD 배지에서 박테리아를 선택하였다. 제작된 균주를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 DUOX-의존적 ROS 생성 여부 및 실시예 5와 동일한 방법으로 장 세포 아폽토시스 여부를 분석하였다.
그 결과, 야생형 모균주(ApaWT)와 달리, ApaNH_NupC는 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름 및 후속 DUOX-의존적 ROS 생성을 유도할 수 있음을 확인하였다(도 3E-F).
또한, ApaNH_NupC와 단일-도입된 GF 파리는 장 세포 아폽토시스가 크게 증가하여, ApaWT와 단일-도입된 GF 파리보다 더 높은 사망률을 나타내었다(도 3G-H).
이들 결과는 공생균에서 NH 및 NupC의 이소성 발현이 우라실-생산 능력을 확립하기에 충분함을 확인하고, 이로부터 공생균에서 병원균으로의 박테리아 표현형 전환을 유도하는 것을 알 수 있으며, 또한 NH-뉴클레오사이드 이화 작용의 부재는 만성 DUOX 활성화를 피함으로써 장-미생물 공생에 필요함을 알 수 있다.
실시예 7. 병원균에 의한 장의 내강 우리딘(luminal uridine) 이화의 NH-의존 여부 확인
초파리 장은 장내 미생물 이외에도, 자연적으로 Ecc15와 같은 기회 병원균과 상호 작용한다. Ecc15가 시험관내에서 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름을 유도할 수 있음에 기초하여(도 1D-E), 병원성 박테리아에서 우리딘 이화 작용의 역할을 조사하기 위해, 먼저 뉴클레오사이드 이화 작용에 관여하는 유전자를 조사하였다. Ecc15의 게놈 정보가 아직 이용 가능하지 않기 때문에, 전체 게놈 샷건 전략(whole-genome shotgun strategy, DDBJ/EMBL/GenBank WNLC00000000에 의거)을 통해 게놈 서열 정보 초안을 확립하였다.
Ecc15 게놈의 분석 결과 박테리아가 2 개의 NH 유전자(NH1, NH2 유전자)를 보유하는 것을 확인하였다. 이들 유전자 이외에, Ecc15는 또한 뉴클레오사이드를 핵 염기 및 리보스 1-포스페이트(ribose 1-phosphate)로 전환시킬 수 있는 2 개의 뉴클레오사이드 포스포릴라제(nucleoside phosphorylase, NP) 유전자(udp, deoD 유전자)를 보유하였다.
이에, 2 개의 NH 유전자 및 2 개의 NP 유전자가 모두 없는 4 중 돌연변이 Ecc15(Ecc15△4)를 pDM4 자살 벡터를 사용하여 제작하였다(Milton, et al.,. Journal of bacteriology 178, 1310-1319., 1996). Ecc15△4는 우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름을 유도할 수 없었으며(도 4A), 이는 세포외 우리딘의 이화 작용을 위해서는 NH 및 NP 활성이 요구됨을 시사하였다.
우리딘-인(in) 및 우라실-아웃(out) 대사 흐름이 생체 내에서, 즉, 병원균이 장 내강에 도입될 때 생체 내에서 작동하는지 여부를 조사하기 위해, Ecc15△4 및 NH 유전자를 Ecc15△4 돌연변이체에 도입한 Ecc15△4_NH를 실시예 1의 방법으로 구강 감염시켜 장 감염을 발생시키고, 장 감염 전후의 내강액의 우라실 및 우리딘 수치를 측정하였다. Ecc15△4_NH는 전체 길이 NH 유전자를 lac 프로모터의 제어하에 pTac3 벡터에 클로닝하여 pTac3-Plac::NH를 제작하고, 상기 pTac3-Plac::NH를 Ecc15△4 균주에 도입하여 제작하였다.
그 결과, 장 감염이 없는 경우, 우리딘 수치는 높았고 우라실은 거의 감지할 수 없었으며, 장 내강에서 우라실/우리딘 비율은 매우 낮았다(도 4B). 반면, 장 감염 후에는 우리딘 수치가 크게 감소함에 따라 우라실 수치가 크게 증가하여 우라실/우리딘 비율이 높아졌다(도 4B). 이러한 결과는 Ecc15가 생체 내 장 내강에서 우라실을 아웃시키는 것을 입증하였다.
그러나, Ecc15△4가 장 감염에 사용되었을 때에는 우라실/우리딘 비율이 추가로 증가되지 않았다(도 4B).
또한, Ecc15△4_NH가 장 감염에 사용되었을 때에는 Ecc15△4 감염 시 관찰된 낮은 우라실/우리딘 비율이 크게 복원되어 높은 우라실/우리딘 비율을 나타내었다(도 4B).
이러한 결과는 Ecc15 병원균의 NH 활성이 장의 내강 내로 우라실을 생산 및 분비하기 위해 내강 우리딘을 사용함으로써 생체 내 뉴클레오사이드 이화 작용을 유도하는 것을 입증하였다.
다음으로, Ecc15△4, Ecc15△4_NH와 대조군으로 병원균를 이용하여 실시예 4와 동일한 방법으로 DUOX-의존적 ROS 생성 여부를 확인하였다. 그 결과, Ecc15△4가 DUOX-의존적 ROS 생성을 유도할 수 없다는 것을 확인하였고(도 4C), 뉴클레오사이드 이화 능력이 DUOX-활성화 능력과 유관함을 확인하였다.
또한, 다른 병원균(살모넬라 엔테리카(Salmonella typhimurium, S. typhimurium), 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens, S. marcescens), 시겔라 플렉스네리(Shigella flexneri, S. flexneri), E. coli O157, 및 P. aeruginosa)가 장 내강에 도입되었을 때는 감염으로 인한 우라실/우리딘 비율 증가가 관찰되었다(도 4D).
상기 결과를 종합하면, 뉴클레오사이드-인(in) 및 핵 염기-아웃(out) 대사 흐름은 박테리아 뉴클레오사이드 이화 작용을 통해 발생하지만 초파리 공생균에는 존재하지 않으며, 공생균과 상이한 병원균만의 공통적인 특징임을 알 수 있다.
실시예 8. 뉴클레오사이드 이화 작용과 1차 대사 경로의 하향 조절 및 쿼럼 센싱(quorum sensing, QS)의 상향 조절 간의 관련성 여부 확인
뉴클레오사이드 이화 작용이 공생균에 없는 새로운 병원균-특이적 대사임을 고려하여, 병원성 박테리아의 생리학적 측면에서 뉴클레오사이드 이화 작용의 역할을 조사하기 위해, Ecc15 및 Ecc15△4를 사용하여 고해상도 RNA-서열(RNA-Seq) 분석을 수행하였다. 구체적으로, Ecc15 및 Ecc15△4는 30 ℃의 1 mM 우리딘이 보충된 M9 배지에서 후기 지수기(late-exponential phase)(OD600 = ~ 1.5)로 성장하였다. RNA는 TRIzol(Invitrogen)을 사용하여 추출하고 37 ℃에서 30 분 동안 2U의 TURBO DNase(Ambion)로 처리하였다. 마지막으로 RNA는 RNeasy MiniElute 키트(Qiagen)로 정제 및 농축되었다. cDNA 라이브러리는 제조업체의 프로토콜에 따라 Ribo-Zero Bacteria TruseqTM Stranded Total RNA H/M/R Prep Kit(Illumina)로 제작하였다. cDNA 라이브러리는 Illumina Hi-Seq 2500을 사용하여 시퀀싱되었다. Illumina CASAVA 파이프 라인(버전 1.8.2)은 base-calling에 사용되었고 cutadapt(버전 2.6)는 Illumina 어댑터 시퀀스가 포함된 reads를 폐기하는 데 사용되었다. 결과 판독 값은 기본 옵션과 함께 TopHat 정렬기(버전 2.1.1)를 사용하여 Ecc15 contig 시퀀스에 매핑되었다. 정렬 후, HTSeq (버전 0.6.1)를 사용하여 유전자 기능에 대한 매핑된 reads를 계산하고 라이브러리 크기 및 유전자 길이를 사용하여 개수를 정규화하여 매핑된 백만 조각 당 전사체 킬로베이스 당 추정된 조각(fragments per kilobase of transcript per million, FPKM)을 계산하였다. mRNA 시퀀싱의 원시 데이터는 Gene Expression Omnibus 데이터베이스(GSE140194)에 2020년 4월 7일자로 기탁되었다.
또한, '발현된' 유전자를 Ecc15 또는 Ecc15△4에서 FPKM> 1 인 유전자로 식별하였다. 이러한 발현 유전자의 경우 FPKM 값에 FPKM 값을 추가한 후 FPKM 값을 log2-FPKM으로 변환하였다. log2-FPKM 값은 분위수 정규화 방법(quantile normalization method)을 사용하여 정규화되었다(Bolstad, B.M., Irizarry, R.A., Astrand, M., and Speed, T.P. (2003). A comparison of normalization methods for high density oligonucleotide array data based on variance and bias. Bioinformatics 19, 185-193.). 이후 Ecc15와 Ecc15△4 사이의 DEG를 절대 log2-fold-changes> 0.58 (1.5-fold)로 식별하였다. DEG가 나타내는 세포 과정을 확인하기 위해 Fisher의 exact test를 사용하여 유전자에 대한 유전자 존재론 생물학적 과정(gene ontology biological processes, GOBP)의 농축 분석을 수행하고 p-값이 0.05 미만인 GOBP를 선택하였다.
그 결과, 도 4E-H에 나타낸 유전자가 뉴클레오사이드 이화 작용이 없는 상태에서 극적으로 상향 및 하향 조절됨을 발견하였다. 기능적 풍부 분석(Functional enrichment analysis)은 뉴클레오사이드 이화 작용의 부재가 상이한 생물학적 과정들 중에서 "대사 과정(metabolic process)"(65.2 %)을 가장 크게 향상시켰음을 나타내었다(도 4E). 특히, 세포 아미노산 대사 과정(28.2 %), 핵 염기-함유 소분자 대사 과정(22.0 %) 및 탄수화물 대사 과정(19.2 %)은 Ecc15와 비교할 때 Ecc15△4에서 가장 빈번하게 과활성화되었다(도 4F-H). 그러나, QS 프로세스는 Ecc15△4에서 하향 조정되었다(도 4H). 즉, 1차 대사에 관여하는 유전자는 하향 조절된 QS을 갖는 Ecc15△4에서 크게 상향 조절되었다.
이러한 결과는 뉴클레오사이드 이화 작용이 일차 대사 활성의 하향 조절 및 QS 과정의 상향 조절에 필요하고, QS 활성화가 적절한 수준의 코어 대사를 유지하기 위해 필요하다는 것을 시사하였다.
실시예 9. 아실 호모세린 락톤(acyl homoserine lactone-type)-타입 쿼럼 센싱 분자의 완전한 생산과 뉴클레오사이드 이화 작용 간의 관련성 여부 확인
상기 실시예의 결과에 기초하여, 뉴클레오사이드 이화 작용 활성이 QS에 필요할 수 있고, 뉴클레오사이드 이화 작용의 부재에 의해 야기된 QS 활성의 손상은 Ecc15△4에서 관찰된 과활성화된 1차 대사 과정을 유도할 수 있다고 가정하였다.
이 가설을 확인하기 위해, Ecc15△4 및 Ecc15의 QS 분자 수준을 직접 측정하였다. Ecc15는 ExpI에 의해 생산된 아실 호모세린 락톤(acyl homoserine lactone, AHL)과 LuxS 효소에 의해 생산된 오토인듀서-2(autoinducer-2, AI-2)의 2 가지 유형의 QS 분자를 생산하는 것으로 알려져 있다(Anal Bioanal Chem 387, 415-423., 2007). 이들 분자를 측정하기 위해, 생물 발광-기반 QS 바이오센서(bioluminescent-based QS biosensors), 특히 럭스(lux) 기반 바이오센서, E. coli pSB401(Winson, et al., Construction and analysis of luxCDABE-based plasmid sensors for investigating N-acyl homoserine lactone-mediated quorum sensing. FEMS Microbiol Lett 163, 185-192., 1998) 및 비브리오 하베이(Vibrio harveyi, V. harveyi) MM32 균주(Miller, et al., Salmonella typhimurium recognizes a chemically distinct form of the bacterial quorum-sensing signal AI-2. Mol Cell 15, 677-687, 2004)를 사용하여 각각 AHL 및 AI-2 인식시 생물 발광을 방출하도록 함으로써, AHL 및 AI-2의 수준을 결정하였다. V. harveyi MM32는 30 분 동안 AB broth(Bassler, B.L., Wright, M., and Silverman, M.R. (1994). Sequence and function of LuxO, a negative regulator of luminescence in Vibrio harveyi. Molecular microbiology 12, 403-412.)에서 배양하였다. 생물 발광은 MicroLumat Plus LB 96V 마이크로 플레이트 발광계(Berthold Technologies, UK)를 사용하여 측정하였다. 데이터는 각 샘플의 발광 값의 상대적 광 단위(relative light units, RLU)로 표현되었다. E. coli pSB401을 세균 배양 상등액과 함께 2 시간 동안 배양하고 NightOWL II LB 983 이미징 시스템(Berthold Technologies, UK)을 사용하여 생물 발광 이미징을 수행하였다.
그 결과, ExpI-의존적 AHL 수준이 Ecc15△4 배양 상등액보다 Ecc15 배양 상등액에서 현저히 높았다(도 5A). 그러나, Ecc15 및 Ecc15△4 배양 상등액 사이의 LuxS-의존적 AI-2 수준에서는 차이가 나타나지 않았다.
다음으로, AI-2-합성 효소 LuxS가 결실된 Ecc15 돌연변이(Ecc15△LuxS)를 음성 대조군으로 하고, 박테리아에서 생산된 AI-2 QS 분자에 의한 생물 발광을 측정하였다. Ecc15△LuxS는 pDM4 자살 벡터를 사용하여 제작하였다.
그 결과, Ecc15와 Ecc15△4 배양 상등액 사이에 LuxS 의존성 AI-2 수준의 차이는 관찰되지 않았다(도 9).
이러한 결과는 Ecc15△4가 AHL-타입 QS 분자의 생산 기능이 손상되었으나 AI-2-타입 QS 분자의 생산에는 그렇지 않음을 나타내었다.
다음으로, Ecc15는 주요 AHL-타입인 3-oxo-C6-HSL(N-(3-oxo-hexanoyl)-L-homoserine lactone)를 생산하는 것으로 알려진 바(Barnard and Salmond, Quorum sensing in Erwinia species. Anal Bioanal Chem 387, 415-423., 2007), 3-oxo-C6-HSL를 LC-MS/MS를 이용하여 정량 분석하였다. 구체적으로, Ecc15 및 Ecc15△4는 1 mM 우리딘이 보충된 M9 배지에서 배양하였다. 박테리아 세포를 6,000 rpm에서 5 분 동안 원심분리한 다음 배양 상등액 500 μl을 사용하여 3-oxo-C6-HSL의 정량 분석을 수행하였다. 세균 배양 상등액으로부터 3-oxo-C6-HSL을 추출하기 위해 액체-액체 추출한 후, 500 μL의 표준 용액 및 여과된 박테리아 배양 상등액을 취하여 5 μL의 C7-HSL(물에 100 pg/mL로 포함)과 혼합한 다음 1 mL의 에틸 아세테이트로 추출하였다. 상부 유기층 800 μL만 취해 40 ℃의 질소 가스 하에서 증발 건조시켰다. 잔류물을 0.1 % 포름산을 함유하는 250 μL의 물에 용해시켰다. 이를 2 분 동안 초음파 처리하고 5 분 동안 볼텍스한 후, 상등액을 전기 분무 인터페이스가 있는 Agilent 6460 삼중 사중 극자 질량 분석법(Agilent Technologies, USA)을 사용하여 분석하였다. 컬럼 온도를 30 ℃로 유지하면서 XSelect® HSS T3 2.5 μm (2.1 x 100 mm, 2.5 μm 입자 크기, Island Waters) 컬럼에서 분리를 수행하였다. 이동상(A)는 0.1 % 포름산을 포함하는 물이었고 이동상(B)는 0.1 % 포름산을 포함하는 아세토니트릴이었다. 이를 이용한 크로마토그래피 방법은 초기 이동상 조성 10 % (B)를 1 분 동안 유지하고 6 분 안에 90 % (B)로 선형으로 증가한 다음, 7.5 분 안에 최종적으로 10 % (B)로 복귀하고 7.5 분 동안 평형화하여 수행되었다. 총 실행 시간은 15 분이었다. 3-oxo-C6-HSL 및 C7-HSL(내부 표준 물질로 사용)의 머무름 시간은 각각 5.87 및 7.62이었다. 정성 및 정량 분석은 Agilent Mass Hunter 소프트웨어에 의해 수행되었다.
그 결과, 3-oxo-C6-HSL는 Ecc15△4에서 크게 손상되었으며(도 5B), 이는 뉴클레오사이드 이화 작용이 AHL-타입 QS 분자의 완전한 생산에 필요함을 시사하였다.
실시예 10. 뉴클레오사이드 이화 작용을 통해 생성된 리보스와 쿼럼 센싱 활성 간의 관련성 여부 확인
Ecc15△4는 감소된 AHL 생산을 나타내므로, 뉴클레오사이드 이화 작용이 AHL 생산 및 AHL-의존적 QS 신호 전달에 어떠한 영향을 미치는지 조사하였다.
QS의 2 가지 글로벌 조절자(global regulators)인 ExpR(Exp의 다운스트림(downstream)으로 작용하는 QS-의존적 전사 조절자)과 VqsM(QS 신호 및 독성의 신규 AraC-타입 조절자)의 발현을 Ecc15WT, Ecc15△4 및 Ecc15△RbsR을 사용한 qPCR 분석으로 분석하였다. 구체적으로, 1 mM 우리딘이 보충된 M9 배지에서 박테리아를 배양하고, SYBR 그린(Bioline)을 사용하여 유전자 발현을 정량하기 위해 형광 실시간 PCR을 수행하였다. rpoB 유전자는 내부 대조군으로 사용하였다. Ecc15△RbsR는 pDM4 자살 벡터를 사용하여 제작하였다.
그 결과, ExpR 및 VqsM의 발현은 Ecc15△4에서 크게 손상되었다(도 4H 및 5C). ExpR-AHL 복합체가 AHL 생산을 포함하여 QS 경로 활성화를 유도한다는 것을 고려할 때, Ecc15△4에서 관찰된 감소된 AHL 생산은 ExpR의 발현 감소에 기인한 것을 알 수 있다.
이러한 결과는 글로벌 QS 조절제의 완전한 활성화를 위해 뉴클레오사이드 이화 작용이 필요하다는 것을 나타내었다.
다음으로, 1차 대사에 관여하는 11 개 유전자(purH(Phosphoribosylaminoimidazolecarboxamide formyltransferase, GJS26_00239), pgm(Phosphoglucomutase, GJS26_01330), pgk(Phosphoglycerate kinase, GJS26_03794), adk(Pyruvate kinase, GJS26_01172), pyk(Pyruvate kinase, GJS26_01172) n아(Nucleoside-diphosphate kinase, GJS_03171), carA(carbamoyl phosphate synthase A, GJS26_03753), nrdB(Ribonucleoside-diphosphate reductase, GJS_01196), udk(Uridine kinase, GJS_01409), add(Adenosine deaminase, CJS_02167) atpE(GJS26_04373))의 발현 수준을 Ecc15WT, Ecc15△4, Ecc15△RbsR 및 Ecc15△ExpIR을 사용한 qPCR 분석에 의해 결정하였다. Ecc15△ExpIR는 pDM4 자살 벡터를 사용하여 제작하였다. Ecc15WT에서 표적 유전자 발현은 임의로 1로 하였으며, 그에 대한 상대적인 발현 수준으로 표시하였다.
그 결과, 도 10과 같이, 1차 대사와 관련한 11개의 유전자의 발현은 Ecc15△4, Ecc15△RbsR 및 Ecc15△ExpIR에서 Ecc15WT 에 비해 크게 증가되었다.
다음으로, 주요 QS 조절자의 발현에 영향을 미치는 뉴클레오사이드 이화 작용에 의한 기전을 조사하였다. 뉴클레오사이드 이화 활성이 세포외 우리딘으로부터 세포내 리보스를 생성할 수 있기 때문에, 리보스-조절 전사 조절자인 RbsR이 QS 조절자의 전사 조절에 관여한다는 가설을 세웠다. 이 가설을 확인하기 위해 Ecc15△RbsR을 제작하여 RbsR이 없는 경우 ExpR 및 VqsM 발현을 조사하였다. Ecc15△RbsR는 pDM4 자살 벡터를 사용하여 제작하였다.
그 결과, Ecc15△4에서 관찰된 것과 같이, Expr과 VqsM 발현이 Ecc15△RbsR에서 크게 감소된 것으로 나타났으며(도 5C), 이는 RbsR이 이러한 QS 조절자의 완전한 발현에 필요함을 나타내었다. 이와 일관되게, Ecc15△4에서 관찰된 것과 같이, AHL-의존적 생물 발광 활성이 Ecc15△RbsR에서 크게 감소됨을 확인하였다(도 5D).
이러한 결과들은 뉴클레오사이드 이화 활성에 의해 생성된 리보스가 QS 조절자를 상향 조절하고 RbsR-의존적으로 QS 기전 활성을 유도하는 것을 시사하였다.
실시예 11. 뉴클레오사이드 이화 작용과 병원균 독성 유전자의 완전한 발현 간의 관련성 여부 확인
Ecc15는 초파리 장에서 지속될 수 있는 곤충병원균(entomopathogen)이다. 어위니아 병독성 인자(Erwinia virulence factor, evf)는 주요 병독성 유전자로서 작용하는 것으로 알려져 있으며(Basset et al., A single gene that promotes interaction of a phytopathogenic bacterium with its insect vector, Drosophila melanogaster.EMBO Rep 4, 205-209., 2003), 박테리아 병인을 유발한다.
이에 기초하여, evf 유전자가 특정 QS 경로의 제어를 받는지 조사하기 위해, ExpI 경로 또는 LuxS 경로에서 돌연변이를 일으키는 박테리아(Ecc15△ExpIR 또는 Ecc15△LuxS)에서 AHL-타입 QS 분자 및 AI-2-타입 QS 분자를 생산할 수 없도록 하였다. 이러한 QS 돌연변이체에 evf 프로모터 영역(Pevf::GFP)의 제어 하에 GFP를 운반하는 리포터 플라스미드를 도입하였다. 구체적으로, GFP에 융합된 evf 프로모터(608 bp)를 pTac 벡터에 클로닝하여 pTac-Pevf::gfp를 제작하였다. evf 유전자 발현을 in vitro 및 in vivo에서 분석하기 위해 pTac-Pevf::gfp를 Ecc15WT, Ecc15△4, Ecc15△RbsR, Ecc15△ExpIR 및 Ecc15△LuxS에 도입하였다. 박테리아는 1mM 우리딘이 보충된 M9 배지에서 배양되었고 GFP 신호는 SPECTRAL Ami X 분자 영상기 (Spectral Instruments Imaging)를 사용하여 분석하였다.
초파리 장에서 박테리아 evf 유전자 발현을 분석하기 위해 유충 또는 성체 파리를 2 시간 동안 Pevf::GFP 리포터를 운반하는 1010 CFU 이하의 박테리아(Ecc15WT 또는 Ecc15△4)로 구강 감염시켰다. 전체 내장을 PBS에서 해부하고 포르말린으로 고정하였다. Zeiss LSM 700 공초점 현미경을 사용하여 각 장의 공초점 형광 이미지를 분석하였다. 중장 R2 영역의 GFP 수준은 ZEN 소프트웨어를 사용하여 정량화되었다.
그 결과, Pevf::GFP 리포터 활성이 Ecc15△ExpIR에서 심각하게 하향 조절되지만 일반적으로 Ecc15△LuxS로 표현됨을 확인하였다(도 5F).
이러한 결과는 주요 독성 유전자 발현이 주로 AHL-타입 QS 시스템의 제어하에 있음을 입증하였다.
다음으로, 뉴클레오사이드 이화 작용이 AHL-의존적 QS 경로의 업스트림에서 작용한다는 것을 고려하여, 뉴클레오사이드 이화 작용이 시험관내 AHL-의존성 evf 유전자의 완전한 활성화를 위해 필요한지를 조사하였다.
그 결과, Pevf::GFP 리포터 활성 및 evf 유전자 발현이 Ecc15와 비교하여 Ecc15△4 및 Ecc15△RbsR에서 심각하게 손상되었다(도 5E-F).
이러한 결과는 뉴클레오사이드 이화 활성 및 후속 RbsR 활성이 QS-의존적 독성 유전자 발현에 필요함을 시사하였다.
실시예 12. 뉴클레오사이드 이화 작용과 생체 내 쿼럼 센싱-의존적 독성 간의 관련성 여부 확인
뉴클레오사이드 이화 작용으로 제어되는 QS 활성화가 실제로 생체 내에서, 즉, 장 내강 내에서 발생하는지를 조사하기 위해, 장 감염 후 AHL 생산을 조사하였다. 장에서 AHL 생산을 시각화하기 위해, QS 바이오센서 E. coli pSB401 균주와 함께 구강 Ecc15 감염을 수행하였다. 구체적으로, 중기 지수기(mid-exponential phase)(OD600 = ~ 0.5)의 Ecc15WT, Ecc15△4 및 E. coli pSB401을 이용하여 구강 감염 실험을 수행하였다. 암컷 파리(5-6 일령)를 Ecc15WT 또는 Ecc15△4(5x109 CFU 이하)에 E. coli pSB401(5x109 CFU 이하)과 함께 1.5 시간 동안 구강 감염시켰다. 살아있는 동물의 생물 발광 영상화는 NightOWL II LB 983 영상화 시스템(Berthold Technologies, UK)을 사용하여 얻었다.
그 결과, Ecc15 섭취 후 장 내강에서 높은 수준의 AHL-의존적 생물 발광을 검출하였다(도 6A). 반대로, Ecc15△4 섭취 후에는 AHL-의존성 생물 발광을 거의 감지할 수 없었으며(도 6A), 이는 장 내강 내 QS 활성화는 뉴클레오 사이드 이화 작용에 의존한다는 것을 시사하였다.
다음으로, Ecc15가 장 내강에 들어갔을 때 박테리아에서 QS-의존적 evf 발현을 확인하기 위해, 중기 지수기의 2 개의 Pevf::GFP 리포터 박테리아를 제작하였다(Ecc15-Pevf::GFP 및 Ecc15△4-Pevf::GFP).
이 성장 시점에서, Pevf::GFP 발현 수준은 기본적이었으며 2 개의 리포터 박테리아 사이에서 유사하였다. 그러나, 상기 2 개의 박테리아가 장 내강에 도입되었을 때, Ecc15-Pevf::GFP와 Ecc15△4-Pevf::GFP의 Pevf::GFP 발현에서 현저한 차이가 나타났다(도 6B). Ecc15-Pevf::GFP 박테리아에서는 대부분 중장의 앞부분에서 강렬한 GFP 발현이 확인되었으나, Ecc15△4-Pevf::GFP 박테리아에서는 약한 GFP 발현만 관찰되었다(도 6B).
이러한 결과는 Ecc15의 뉴클레오사이드 이화 작용이 장과 미생물 사이의 생체 내 상호 작용 동안 QS 및 독성 유전자 발현에 필요하다는 것을 입증하였다.
실시예 13. 세균성 뉴클레오사이드 이화 작용의 제거에 의한 병원균에서 공생균으로의 전환 유도 여부 확인
아세토박터와 같은 장내 공생균은 발달 및 신진 대사와 같은 숙주 생리의 다양한 특징에 영향을 미치는 바, 단백질 영양 실조와 같은 조건 하에서 숙주의 생존 여부, 발달 속도 및 성장 여부를 통해 확인할 수 있다.
GF 파리는 GF 배아에 A. pomorum, Ecc15 또는 Ecc15 돌연변이의 2x107 CFU 이하를 추가하여 제작하였다. 번데기의 형성은 매 12 시간마다 모니터링되었다. 산란 후 108 시간의 발육 시점에서 GF 유충의 몸 크기를 측정 하였다. 애벌레 발달 실험을 위해, 낮은 효모(1.5 %(v/v) 효모)를 함유하고 보키닌(bokinin) 및 프로피온산(propionic acid)이 결핍된 단백질 영양 실조 식이를 사용하였다. 성인 암컷 파리(5-6 일령)를 생체 내 ROS 측정, 대사체 분석 및 공초점 이미지 분석에 사용하였다.
또한, 수명을 측정하기 위해 GF 파리는 G. morbifer △NH, G. morbifer △4NH_NH 또는 A. pasteurianus NH_NupC와 단일 도입되었다. 모의(mock) 벡터를 운반하는 G. morbifer 및 A. pasteurianus(테트라사이클린 내성 마커를 운반하는 pCM62)를 대조군으로 사용하였다. GF 파리는 4-5 일마다 20 μg/ml 테트라사이클린이 보충된 신선한 무균 배지로 옮겨졌다. 각각 약 25 마리의 파리로 구성된 3 개 이상의 독립적인 코호트(cohort)에서 생존 여부를 시간의 흐름에 따라 모니터링하였다. GF 파리 또는 특정 박테리아 균주와 관련이 있는 GF 파리는 고압 멸균된 표준 옥수수 가루 배지 또는 홀리딕 배지에서 사육하였다.
그 결과, 단백질 영양 실조와 같은 조건 하에서 GF 파리는 생존할 수 있지만, 발달 속도 및 성장이 지연된다(도 6C-E). 이러한 발달 결함은 정상적인 미생물 총(즉, CV 파리) 또는 A. pomorum(즉, A. pomorum-도입 GF 파리)의 존재 하에서 완전히 구제된다(도 6C-E). 그러나, Ecc15가 GF 파리에서 대량 서식할 때, Ecc15-도입 GF 파리는 성장 정지 및 심각한 애벌레 치사율(> 50 % 치사율)을 포함하여 GF 파리보다 더 극적인 병리학적 변화를 나타내었다(도 6C).
또한, NH 유전자를 Ecc15△4에 재도입할 때, 숙주 병리가 나타난 것은(도 6C-E), 뉴클레오사이드 이화 작용이 병원균의 독성에 필요하다는 것을 입증하였다.
다음으로, 뉴클레오사이드 이화 작용에 의해 유도된 QS 활성화가 이러한 병인에 관여하는지를 평가하기 위해, Ecc15△4 또는 Ecc15△RbsR 단일-도입된 GF 배아를 제작하였다.
그 결과, Ecc15△4 또는 Ecc15△RbsR 단일-도입된 GF 파리는 공생균(A. pomorum)-도입 GF 파리와 비교할 때 완전히 정상적인 애벌레 발달을 나타내었다(도 6C-E).
다음으로, Ecc15WT, Ecc15△RbsR, Ecc15△ExpIR 및 Ecc15△LuxS 유전자형의 박테리아를 GF 배아에 첨가하고 번데기 형성의 백분율을 12 시간마다 모니터링하였다.
그 결과, 도 11A-B와 같이, Ecc15△RbsR, Ecc15△ExpIR 단일-도입된 GF 파리는 완전히 정상적인 애벌레 발달을 나타내었으며, Ecc15△LuxS 단일-도입된 경우는 야생형 가 단일-도입된 바와 같이 숙주 병인을 보이는 것을 확인할 수 있다.
상기 결과는 ExpIR의 결실이 LuxS가 아니라 병원균-공동체 전환을 유도하기에 충분하며, 이는 ExpI 의존적 쿼럼 감지가 박테리아 병원성에 필요함을 나타낸다.
또한 이러한 결과는 병원균에서 세균성 뉴클레오사이드 이화 활성을 제거하는 것이 초파리 장에서 병원균에서 공생균으로의 전환을 유도하기에 충분함을 시사하였다.
다음으로, P. aeruginosa(PAO1)의 QS 의존적 독성에 대한 뉴클레오사이드 이화작용 활성의 역할을 확인하였다. 단일 NH 유전자는 P. aeruginosa PAO1의 게놈에서 확인되었다. P. aeruginosa의 자가분해 및 자가응집 행동을 피하기 위해 pqsL-PAO1 균주가 사용되었다(Hazan, et al., Auto Poisoning of the Respiratory Chain by a Quorum-Sensing-Regulated Molecule Favors Biofilm Formation and Antibiotic Tolerance. Current biology : CB 26, 195-206., 2016). PAO1△NH는 NH 유전자를 결실시켜 제작되었다. PAO1△NH_NH는 PAO1△NH 돌연변이체에 NH 유전자를 도입하여 제작되었다.
독성 인자의 활성을 확인하기 위해 피오시아닌의 양 및 엘라스타제의 활성을 측정하였다.
구체적으로, 피오시아닌의 양을 이전에 설명한대로 측정하였다(Smith, et al., Induction and inhibition of Pseudomonas aeruginosa quorum sensing by synthetic autoinducer analogs. Chem Biol 10, 81-89., 2003). 구체적으로, 녹농균을 LB 배지에서 37 ℃로 12 시간 동안 성장시키고, 5 ml 배양 상등액을 3 ml의 클로로포름으로 추출한 다음 1 ml의 0.2N HCl로 재추출하였다. 추출된 용액의 흡광도를 380 nm에서 측정하였다.
엘라스타제 B 활성을 이전에 설명한대로 측정하였다(Smith et al., 2003). 구체적으로, P. aeruginosa은 1 mM 우리딘이 보충된 M9 배지에서 37 ℃로 8.5 시간 동안 배양하고, 배양 상등액을 여과한 후, 엘라스틴-콩고 레드(elastin-congo red) 용액과 함께 37 ℃에서 200 rpm 으로 12 시간 동안 교반배양한 다음 495 nm에서 엘라스타제 활성을 측정하였다.
lux 기반 대장균 AHL 바이오센서 pSB536을 사용하여 PAO1의 배양 상청액에서 아실 사슬 길이가 C4인 AHL의 수준을 측정하였다.
또한, 성인 암컷 파리(5-6 일령)를 지시 된 박테리아로 구강 감염시키고, 숙주 생존 여부를 분석하였다.
그 결과, 도 12와 같이, 병원균 P. aeruginosa에서도 NH 효소 활성에 의해 쿼럼 센싱 활성화가 조절 되며 그 결과 P. aeruginosa의 쿼럼 센싱 의존적인 대표적 독성인자인 엘라스타제 B의 활성과 독소 피오시아닌 생성이 PAOΔNH에서 현저하게 감소되어 숙주의 치사율이 떨어진다는 것을 입증하였다.
실시예 14. 병원균의 NH 효소 활성 억제제의 효과 검정
도 13A의 화합물이 NH 효소 활성 억제 효과가 있는지를 확인하기 위해, 억제제 첨가시 NH 효소가 기질인 우리딘을 분해하는 정도를 분석하였다.
구체적으로, NH 효소 및 우리딘(None, 음성 대조군), NH 효소 및 우리딘과 함께 NH 효소 활성 억제제인 DMPAPIR(DM) 0.5, 1, 2.5, 10, 100 μM, BnIR 10, 50, 100 μM, 또는 양성 대조군으로 기존의 연구에서 보고된 원생 기생충 레이시마니아(Leishmania)의 NH 억제제인 PAPIR 10, 50, 100 μM을 첨가하여 NH 효소 활성을 분광광도법(spectrophotometric assay)를 통해 측정하였다.
그 결과, 효소와 우리딘만을 넣어 반응시킨 경우(None)에는 효소의 활성에 의해 빠르게 우리딘 농도가 감소하였으나, NH 효소 활성 억제제를 여러 농도로 첨가한 경우에는 그 농도에 비례하여 효소 활성이 억제되는 것을 확인하였다(도 13B-C). 효소 활성을 저해할 수 있는 최소 농도(minimal inhibitory concetration)는 DMPAPIR(DM)의 경우 ~1 μM, BnIR의 경우 ~100 μM, PAPIR의 경우 ~100 μM로 측정되어, DMPAPIR의 경우 유효성이 약 100배 정도 우수한 것을 확인하였다. BnIR의 경우 억제하는 기능은 기존의 PAPIR와 비슷하나 억제제의 생성 과정이 PAPIR에 비해 훨씬 용이하여 유효 저해 물질로서 가치가 있음을 알 수 있다.
실시예 15. 병원균의 NH 효소 활성 억제제의 효과 검정
펙토박테리움속에 속하는 Ecc15는 초파리의 병원균일 뿐 아니라 넓은 범위의 식물에서 병을 일으킬 수 있는 식물 병원균이기도 하다. 펙토박테리움속은 식물에서 무름병(soft rotting)을 비롯 여러 식물 질병을 일으킬 수 있는 것으로 알려져 있기 때문에 이러한 식물 질병이 NH 효소 활성 억제에 의해 방제될 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 감자에 106 CFU 이하의 야생형균(ECCWT)과 NH 효소 활성을 제거한 돌연변이 균(Ecc15△4)을 각각 처리하고 또한 0.1 mM(100 μM), 1 mM(1000 μM)의 DMPAPIR를 처리하여 48시간 후 감자가 무른 정도(rotting vol.)를 측정하였다.
그 결과, Ecc15△4 또는 Ecc15 및 DMPAPIR를 같이 처리한 경우 야생형균이 일으키는 무름병은 발병이 10% 이하로 감소된 것을 확인하였다(도 13D).
다음으로, 펙토박테리움속에 속한 여러 다른 종들에서도 DMPAPIR가 NH 효소 활성을 억제하는 방법을 통하여 질병이 억제되는지 확인하였다. 다양한 범위의 식물에서 질병을 일으킬 수 있는 펙토박테리움 케로토보륨 아종 브라질리엔스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense, Pcb), 펙토박테리움 케로토보륨 아종 카로토보룸 15(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum15, Pcc 15)와 관상식물, 식물의 구근 등에서 질병을 일으킬 수 있는 것으로 보고된 펙토박테리움 크리산테미(Pectobacterium chrysanthemi, Pch), 감자의 검은다리 질병(blackleg of potato)을 일으키는 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 사탕무에서 질병을 일으키는 것으로 알려진 펙토박테리움 베타바술로룸(Pectobacterium betavasulorum, Pbe)를 대상으로 상기와 동일한 방법으로 감자에서 무름병을 일으키는 정도가 DMPAPIR에 의해 감소하는지 측정하였다.
그 결과, 펙토박테리움속에 속한 여러 다른 종의 균주의 병원성이 DMPAPIR에 의해 현저히 감소됨을 확인하였다(도 13E). 또한, BnIR에 의해서도 무름병 발병이 크게 감소하는 것을 확인하였다(도 13F).
또 다른 대표적인 식물 병원균으로써 다양한 식물에서 괴사나 수지병(gummosis)를 일으키는 것으로 보고된 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syrigae, Pst)에서 NH 효소 활성이 균의 독성에 중요한 영향을 미치는지 확인하였다. 구체적으로, 대표적인 잎 식물 모델인 애기장대(Arabidopsis)의 잎에 상처를 내고 2X106 CFU 이하의 야생형 균(PstWT)와 NH 효소 활성을 제거한 돌연변이 균(Pst△NH)를 각각 도입하거나 또는 0.1 mM, 1 mM의 DMPAPIR(DM)를 야생형 균과 동시 처리하여 일주일 후 식물 잎의 괴사가 진행되는 정도를 관찰하였다.
그 결과, 돌연변이 균(Pst△NH)과 DMPAPIR(DM)를 같이 처리한 경우 야생형 균이 유발하는 식물 잎 괴사가 감소된 것을 확인하였다(도 13G).
병원균인 P. aeruginosa(PAO1)에서도 NH 효소 활성 억제제가 작용하는지 확인하기 위해, PAO1을 DMPAPIR(DM) 처리 또는 처리하지 않고 배양하여 배양 상등액을 얻고, 상등액과 엘라스틴-콩고 레드(elastin-congo red)를 반응시켜 PAO1의 엘라스타제의 활성을 측정하였다.
그 결과, PAO1의 대표적인 독성 인자인 엘라스타제의 활성이 NH 효소 활성 억제제의 처리 농도와 비례하여 감소하는 것을 확인하였다(도 13H).
이러한 결과로부터 본 발명에 따른 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제게가 펙토박테리움속(屬)과 슈도모나스속의 병원균에 작용하여 뉴클레오사이드 가수분해 효소의 활성을 효과적으로 저해하며, 결과적으로 쿼럼 센싱 의존적인 병인이 억제되는 것을 입증하였다.
또한, 본 발명에 따른 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 병원균, 즉, 병원성 미생물 독성을 억제하거나, 병원성을 나타내는 병원균을 비병원성을 나타내는 공생균으로 전환할 수 있는 바, 이를 포함하는 병원성 미생물의 독성 억제용 조성물, 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물, 식물병 방제용 조성물, 상기 조성물을 처리하는 단계를 포함하는 병원성 미생물 독성 억제 방법, 식물병 방제 방법으로 적용할 수 있으며, 본 발명에 따른 기전은 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법으로 적용할 수 있다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (19)

  1. 하기 화학식 1 로 표시되는, 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제(nucleoside hydrolase, NH):
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021001159-appb-I000010
    상기 R은 비치환 또는 디(C1-C2 알킬)아미노로 치환된 페닐기.
  2. 제1항에 있어서, 상기 R은
    Figure PCTKR2021001159-appb-I000011
    으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것인, 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제.
  3. 제1항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제는 병원균의 쿼럼 센싱 신호를 비활성화하는 것을 특징으로 하는 것인, 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제.
  4. 제1항의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 병원성 미생물 독성 억제용 조성물.
  5. 제1항의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 병원성 미생물 감염의 예방 또는 치료용 조성물.
  6. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 펙토박테리움속(Pectobacterium) 또는 슈도모나스속(Pseudomonas) 미생물인 것인, 조성물.
  7. 제1항의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 식물병 방제용 조성물.
  8. 제7항에 있어서, 상기 식물병은 펙토박테리움속(Pectobacterium) 또는 슈도모나스속(Pseudomonas) 미생물에 의해 발생하는 것인, 식물병 방제용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 식물병은 펙토박테리움 케로토보륨 아종 브라질리엔스(Pectobacterium carotovorum subsp. brasilliense, Pcb), 펙토박테리움 케로토보륨 아종 카로토보룸 15(Pectobacterium carotovorum subsp. carotovorum15, Pcc 15), 펙토박테리움 크리산테미(Pectobacterium chrysanthemi, Pch), 펙토박테리움 아트로셉티쿰(Pectobacterium atrosepticum), 펙토박테리움 베타바술로룸(Pectobacterium betavasulorum, Pbe) 및 슈도모나스 시링가에(Pseudomonas syrigae, Pst)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 미생물에 의해 발생하는 것인, 식물병 방제용 조성물.
  10. 제7항에 있어서, 상기 조성물은 항생제를 추가로 포함하는 것인, 식물병 방제용 조성물.
  11. 제4항의 조성물을 인간을 제외한 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 병원성 미생물 독성 억제 방법.
  12. 제7항의 조성물을 개체에 처리하는 단계를 포함하는, 식물병 방제 방법.
  13. 뉴클레오사이드 가수분해효소를 제공하는 단계;
    상기 뉴클레오사이드 가수분해효소를 시험물질과 접촉시키는 단계;
    상기 시험물질과 접촉한 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 및 상기 시험물질과 접촉하지 않은 대조군에서 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소의 발현 또는 활성이 감소된 경우, 상기 시험물질을 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 후보물질로 선별하는 단계를 포함하는, 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제 후보물질은 우리딘이 분해되지 않도록 하는 것인, 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제의 스크리닝 방법.
  15. 병원성 미생물에서 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 유전자가 결실된, 병원성 미생물의 공생균.
  16. 제15항에 있어서, 상기 NH1, NH2, udp 및 deoD 유전자는 각각 서열번호 1, 서열번호 2, 서열번호 3, 및 서열번호 4의 염기서열로 이루어진 것인, 병원성 미생물의 공생균.
  17. 제15항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 펙토박테리움 속(Pectobacterium sp.) 또는 슈도모나스 속(Pseudomonas sp.) 미생물인 것인, 병원성 미생물의 공생균.
  18. 제17항에 있어서, 상기 병원성 미생물은 Ecc15(Erwinia carotovora subspecies carotovora 15)인 것인, 병원성 미생물의 공생균.
  19. 제1항의 뉴클레오사이드 가수분해효소 억제제를 포함하는, 병원균의 쿼럼 센싱 저해제.
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