WO2014182078A1 - 장 면역활성 조절용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

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Definitions

  • the present invention is an effective antimicrobial composition or active oxygen species scavenger against uracil non-secreting (URA-) bacteria, including uracil, uracil precursors, uracil analogues or opportunistic infectious pathogens that secrete uracil as an active ingredient. It relates to a composition for preventing cell damage caused by uracil-secreting (URA +) bacteria, comprising as a component.
  • the present invention comprises a food or feed for antimicrobial or cell damage prevention, comprising the composition, a method for regulating double oxidase activity, reactive oxygen species generation or reactive oxygen species level of cells and double oxidase activity, active oxygen
  • the present invention relates to a method for producing a cell in which species generation or reactive oxygen species level is regulated, and a method for providing information on whether an isolated bacterium is pathogenic.
  • epidermal intestinal epithelium has a complex microbial environment, ranging from autochthonous bacteria to allogeneous bacteria.
  • indigenous bacteria adapt to the host intestinal environment evolutionarily, colonizing the intestine and continually adhering to the intestine, while exogenous bacteria are temporarily injected into the intestine and flow along the digestive pathways.
  • host organisms have developed an intestinal immune system to favor intestinal microbial homeostasis against such a diverse and endless influx of microorganisms.
  • dDUOX NADPH oxidase double oxidase
  • the present inventors have a mechanism for regulating the dual oxidase, there is a G ⁇ q-PLC ⁇ -Ca 2+ mediated signaling that first regulates the activity of the dual oxidase, MEKK1-MKK3-p38 MAPK to regulate the expression of the dual oxidase It has been revealed that there is a mechanism through the sequential activity of (Ha et al., Dev Cell 16, pp386-397, 2009; Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009b).
  • IMD immune deficiency
  • DUOX-dependent intestinal immune activity resulting in nuclear transfer of Relish and NF-kappaB proteins, and ultimately promotes AMP production.
  • DUOX-dependent ROS and IMD-dependent AMPs work synergistically or complementarily in the intestine.
  • the IMD activity is known to be promoted by peptidoglycan on the bacterial surface.
  • DUOX was not activated by peptidoglycan.
  • GPCRs G-protein-coupled receptors
  • the present inventors confirmed that the double oxidase promotes the oxidative secretion of intestinal cells during microbial infection, and plays a direct role in intestinal immune activity. However, it is not known why the intestinal immune activity caused by the double oxidase is not activated by the symbiotic microorganisms, and what is the molecular mechanism causing the immune activity.
  • uracil is one of the nucleobases constituting the pyrimidine-based RNA, complementary to the adenine of the DNA in the transcription process to form mRNA. Uracil is not used for any particular medical purpose.
  • fluorouracil (5'-Fluorouracil, 5'-FU), an analogue to uracil, acts as an antagonist to pyrimidine-based nucleobases, through nucleic acid metabolic antagonism such as DNA synthesis inhibition or RNA dysfunction. It is used as a representative chemical anticancer agent. It is known that the fluorouracil analogue of uracil may cause disorders of the gastrointestinal mucosa, but it is only known to prevent cell division and drop out due to cell degeneration.
  • the present inventors have made intensive efforts to identify bacteria-derived ligands that promote intestinal immune activity, thereby confirming that the increase of reactive oxygen species and the immune activity by double oxidase in the intestine are regulated by uracil secreted by bacteria.
  • the present invention was completed by first revealing the relationship between uracil levels and reactive oxygen species levels and intestinal immune activity.
  • One object of the present invention is to provide an antimicrobial composition against uracil non-secreting (URA-) bacteria, which comprises an uracil, uracil precursor, uracil analogue or opportunistic pathogen secreting uracil as an active ingredient.
  • UAA- uracil non-secreting
  • Another object of the present invention is to provide a composition for preventing cell damage caused by uracil-secreting (URA +) bacteria, comprising a reactive oxygen species trapping agent (ROS scavenger) as an active ingredient.
  • a reactive oxygen species trapping agent ROS scavenger
  • Still another object of the present invention is to provide an antimicrobial food or feed comprising the antimicrobial composition.
  • Still another object of the present invention is to provide a food or feed for preventing cell damage, comprising the composition for preventing cell damage.
  • Another object of the present invention is to provide a method for reducing the level of free radical species in a cell, comprising the step of treating a free radical species scavenger.
  • Another object of the present invention is to provide a method for reducing the level of free radical species in a cell, comprising the step of treating a free radical species scavenger.
  • Still another object of the present invention is to provide a method for providing information on whether an isolated bacterium is pathogenic.
  • composition according to the present invention has the effect of preventing the pathology caused by bacteria according to a mechanism that is not known at all.
  • FIG. 1 shows that opportunistic pathogens secrete ligands that activate the DUOX-dependent intestinal immune response, unlike combiogenic microorganisms.
  • Data were analyzed by ANOVA followed by Tamhane's T2 post hoc test, with values representing mean ⁇ SEM ( * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.001).
  • NS means no significance.
  • FIG. 1A shows live bacteria (FIG. 1A), formalin-fixed dead bacteria (FIG. 1B) or bacterial culture supernatants (FIG. 1C) w 1118 (control). Or UAS-DUOX-RNAi / +; After treatment with Da-GAL4 (DUOX-RNAi) Drosophila species, ROS production was observed through R19S staining.
  • 1D shows Dipt-lacZ (control) and Dipt-lacZ;
  • the activation of systemic immune deficiency (IMD) signaling was confirmed in imd 1 (IMD -/- ) Drosophila species. Dipt expression was confirmed by LacZ staining and quantitative PCR ( ⁇ SEM) 9 hours after the culture supernatant.
  • FIG. 2 shows the measurement of DUOX-dependent ROS production for various bacteria.
  • Figure 2a is a major antimicrobial R19S ROS in OSCN in mammalian epithelial cells - a diagram checking whether the reaction specifically to the (right panel) - OCl generated in the (left panel) or DUOX- dependent HOCL.
  • FIG. 2C is a spatial analysis of DUOX-dependent ROS generation, 1.5 hours after oral administration of 5% sucrose solution alone or live bacteria ( E. carotovora to 5 ⁇ 10 8 cells) to adult Drosophila (5-6 days old) Production of DUOX-dependent ROS was confirmed via R19S staining. ROS occurred centrally in the anterior midgut.
  • E. carotovora and Pseudomonas entomophila were widely used as pathogens.
  • human opportunistic bacteria E. faecalis-1 (KCTC # 3195); E. faecalis-2 (Ferrandon Laboratory, France); Vibrio fluvialis (KCTC # 2473); Klebsiella pneumoniae (KCTC # 2619); Shigella sonnei (KCTC # 2518); Pseudomonas aeruginosa PAO1 (Manoil laboratory, University of Washington); Sarratia marcescens (ATCC # 27117) was also confirmed.
  • Figure 3 confirms whether uracil acts as a pathogen-derived ligand for DUOX-dependent intestinal immune activation.
  • FIG. 3A is an HPLC analysis experiment for separating ROS-induced factors by E. carotovora , and analyzed ROS generation in the anterior midgut 1.5 hours after treating the HPLC-purified fraction. Data were analyzed by ANOVA followed by Tukey's post hoc test, with values representing mean ⁇ SEM ( *** P ⁇ 0.001). Peaks of interest (asterisks) were subjected to spectral analysis using a photodiode array detector (blue).
  • Figure 3c confirms that uracil increases intracellular Ca 2+ in Drosophila S2 cells. Cells were treated with uracil (20 nM) at specific time points (arrows).
  • 3D is a diagram confirming that uracil promotes the activity of p38, w 1118 (control)
  • phosphorylated p38 was analyzed after uracil treatment (20 nM for 2 hours) to MEKK1-/-Drosophila species.
  • 3E confirms that uracil promotes expression of DUOX, w 1118 (control)
  • MEKK1-/-Drosophila species were treated with uracil (20 nM for 2 hours), and after 1 hour, the expression level of DUOX was analyzed by quantitative PCR ( ⁇ SEM, ** P ⁇ 0.005).
  • 3F confirms that uracil promotes PLC ⁇ -DUOX-dependent ROS production.
  • w 1118 control
  • UAS-DUOX-RNAi UAS-DUOX-RNAi
  • DUOX-RNAi Da-GAL4
  • norpA 7 PLC ⁇ ⁇ / ⁇ Drosophila species (20 nM for 1.5 h
  • Data was analyzed by ANOVA followed by Tamhane's T2 post hoc test, with values representing mean ⁇ SEM ( ** P ⁇ 0.005).
  • FIG. 4A is a 2D 1 H- 13 C heteronuclear multiple linkage correlation (HMBC) spectrum analysis diagram for ROS-induced fraction of E. carotovora purified by HPLC. By analyzing this, it can be seen that the ROS-induced fraction of E. carotovora purified by HPLC contains uracil.
  • HMBC heteronuclear multiple linkage correlation
  • Figure 4b is a diagram showing the results of analysis using mass spectrometry (MS) for the ROS-induced fraction of E. carotovora purified by HPLC.
  • MS mass spectrometry
  • 4C is a diagram comparing 1D 1H-NMR spectra between ROS-induced fractions of uracil and uracil of E. carotovora purified by HPLC.
  • Streptococcus pyogenes isolated from humans; Lactobacillus gasseri (KCTC # 3163); Lactobacillus acidophilus ( KCTC # 3164); Chryseobacterium indologenes (KCTC # 2905); Enterococcus casseliflavus (KCTC # 3552); Lactobacillus reuteri (KCTC # 3678); Edwardsiella tarda (KCTC # 12267); Ewingella americana (KCTC # 12690); Vibrio fluvialis (KCTC # 2473); Empedobacter brevis (KCTC # 2489); Shigella sonnei (KCTC # 2518); Klebsiella pneumoniae (KCTC # 2619); Streptococcus vestibularis (KCTC # 3650); Aneurinibacillus aneurinolyticus (KCTC # 3883); Bacillus alcalophil
  • FIGS. 5A-5C show that uracil is an agent specific for DUOX-dependent intestinal innate immunity.
  • the data in FIGS. 5A-5C were analyzed by ANOVA followed by Tamhane's T2 post hoc test, with values representing mean ⁇ SEM ( *** P ⁇ 0.001).
  • FIGS. 5A and 5B confirm ROS generation after 20 nM of various nucleobases 5a and pyrimidine analogs 5b, respectively, for 15 minutes.
  • Figure 5c is a W 1118 (control) or G ⁇ q -/- Drosophila treated with 20 nM of uracil for 1.5 hours after ROS generation, comparing the amount of ROS produced, confirming that G ⁇ q is a necessary factor for uracil-induced ROS generation.
  • Figure 6 is a comparative analysis of native E. carotovora and mutant species .
  • FIG. 6A is a schematic representation of a screening strategy for separating uracil trophic variant from E. carotovora 's Tn5 variant library. Approximately 6,000 variant clones are first cultured in M9 minimal medium with or without uracil, and then the uracil nutritional component of each clone is identified. Accordingly, the URA-variant of the present invention was identified.
  • FIG. 6B was performed inverse PCR according to the method disclosed at http://labs.fhcrc.org/gottschling/General%20Protocols/ipcr.html to identify the Tn5 transposon insertion site of the URA-variant.
  • Primers used for this are KAN-2 forward primer; 5'-ACC TAC AAC AAA GCT CTC ATC AAC C-3 '(SEQ ID NO: 1) and KAN-2 reverse primer; 5'-GCA ATG TAA CAT CAG AGA TTT TGA G-3 '(SEQ ID NO: 2). Tracking the insertion position through sequencing, it was confirmed that the position of the pyrE gene.
  • Figure 6c is a diagram confirming that the in vitro growth rate of the prepared E. carotovora -pyrE :: Tn5 strain is similar to the native type E. carotovora .
  • Data from three independent experimental results were analyzed by Student's t-test, with mean ⁇ SEM. As a result, there was no significant difference between the URA-mutant strain and the native strain.
  • FIG. 6D shows scanning electron microscopic (SEM) analysis of native or URA- variant E. carotovora strains.
  • 6E shows the results of bacterial attachment to non-biological surfaces (polystyrene plastics). This was confirmed by crystal violet dyeing. Data from three independent experimental results were analyzed by Student's t-test, with mean ⁇ SEM. N.S. means no significance.
  • Figure 6f is a view confirming the minimum inhibitory concentration of the antimicrobial peptide Cecropin.
  • Minimal inhibitory concentrations (CICs) of Cecropin A1 were tested for adaptability by two-fold standard dilution for Cecropin A1 concentrations after inoculation with the strain. After incubation at 30 ° C. for 18 hours, minimal inhibitory concentrations were identified. Proliferation was measured at 620 nm (OD 620 ) using an ELISA reader (Molecular Devices Emax, CA, USA).
  • Figure 6g confirms that the natural strain and the URA- strain activates systemic immune deficiency (IMD) signaling at a similar level.
  • IMD systemic immune deficiency
  • the comparative expression level is the mean ⁇ SEM derived from the results of at least three independent experiments. NS means no significance.
  • FIG. 6h confirms that the native strain and the URA- strain activate similar levels of immune deficiency (IMD) signaling in the intestine.
  • IMD immune deficiency
  • Figure 6i is a diagram confirming the insertion position by separating the guanine nutrient-constituting mutant strain and adenine nutrient-containing mutant strain, respectively.
  • Each variant was isolated and sequenced using the strategy of FIG. 6A using M9 minimal medium with or without guanine and adenine to determine the guanine trophogenic strain ( E. carotovora-guaA :: Tn5, top panel) and Analysis of the sites where Tn5 was inserted in the adenine trophogenic strain ( E.
  • Tn5 in each variant was guanine monophosphate synthetase (guaA) and phosphoribosyl aminoimidazole-succinocarboxamide synthase (purC). ) was inserted into the gene.
  • guaA guanine monophosphate synthetase
  • purC phosphoribosyl aminoimidazole-succinocarboxamide synthase
  • Figure 6j confirms that the ROS-producing ability of guanine trophic mutant strains and adenine trophic mutant strains is similar to that of native E. carotovora .
  • Adult Drosophila (5-6 days old) was orally administered with the native or the trophogenic mutant strain bacteria (5 x 10 8 cells for each strain), and was colonized by HOCL - specific R19S staining at 1.5 hours after administration.
  • ROS production was visualized to determine the ratio of ROS-positive fields.
  • Data were analyzed by ANOVA followed by Tamhane's T2 post hoc test, with values representing mean ⁇ SEM ( *** P ⁇ 0.001).
  • FIGS. 7A, 7C and 7D were analyzed by ANOVA followed by Tukey's post hoc test and the values represent mean ⁇ SEM ( * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.001).
  • Figure 7c is a diagram analyzing the proliferation of intestinal stem cells (ISCs) through PH3 staining.
  • FIG. 7D is a diagram analyzing the differentiation into barrier hair cells.
  • Su (H) Gbe -LacZ and Prospero were analyzed using Su (H) Gbe-LacZ Drosophila. The percentage of (DAPI-positive) LacZ-positive or Prospero-positive cells per 100 cells was measured.
  • FIG. 7E analyzed Upd3 promoter activity and STAT reporter gene (GFP) activity at 4 hours after administration using Drosophila carrying Upd3-gal4> UAS-GFP or 2XSTAT-GFP genes.
  • Figure 8a is a time series comparative quantification of PH3-positive dividing intestinal stem cells in the midgut. Anti-PH3 antibodies were used to compare and quantify intestinal stem cells of the mitotic phase of uninfected Drosophila (sucrose only, 16 hours after administration) as 1.
  • 8C is a time series comparison of apoptosis rates through TUNEL analysis.
  • E. carotovora-pyrE :: Tn5 induces higher host mortality than the native pathogen ( E. carotovora ).
  • E. carotovora-guaA :: Tn5 and E. carotovora-purC :: Tn5 were used as guanine and adenine nutritive variants, respectively.
  • w 1118 (Control) and UAS-DUOX-RNAi / +; Da-GAL4 (DUOX-RNAi) Drosophila species was used.
  • Kaplan-Meier data obtained were subjected to log rank analysis (P ⁇ 0.001, E. carotovora vs E.
  • carotovora-pyrE Tn5; E. carotovora-pyrE :: Tn5 vs E. carotovora-pyrE :: Tn5 + uracil or E. carotovora-pyrE :: Tn5 + pyrE).
  • 9C shows intestinal cell death following chronic uracil administration using sterile (Germ-free, GF) animals with various genetic backgrounds (GF-control, GF-DUOX-RNAi or GF-PLC ⁇ -/- ) Drawing.
  • Apoptosis index (20 days of chronic uracil administration) was analyzed by ANOVA followed by Tamhane's T2 post hoc test and the value represents mean ⁇ SEM ( * P ⁇ 0.05).
  • FIG. 9D shows host mortality following chronic uracil administration using germ-free (GF) animals of various genetic backgrounds (GF-control, GF-DUOX-RNAi or GF-PLC ⁇ -/- ).
  • GF-control GF-DUOX-RNAi
  • GF-PLC ⁇ -/- GF-PLC ⁇ -/- .
  • FIG. 10 is a diagram confirming the physiological effect of uracil on intestinal cells.
  • FIGS. 10B and 10C were analyzed via student's t-test and the values represent mean ⁇ SEM ( *** P ⁇ 0.001). NS means no significance. Each experiment was repeated at least three times independently.
  • FIG. 10B is a diagram of proliferation of intestinal stem cells (ISCs) through PH3 staining.
  • ISCs intestinal stem cells
  • 10c is a diagram analyzing the differentiation into barrier hair cells.
  • Su (H) Gbe -LacZ and Prospero were analyzed using Su (H) Gbe-LacZ Drosophila. The percentage of (DAPI-positive) LacZ-positive or Prospero-positive cells per 100 cells was measured.
  • FIG. 10D analyzed Upd3 promoter activity at 4 hours after administration using Drosophila carrying Upd3-gal4> UAS-GFP gene.
  • 10E analyzed the activity of STAT reporter gene (GFP) at 4 hours after administration using Drosophila with 2XSTAT-GFP gene.
  • 10F shows different genetic backgrounds (w 1118 (control)) Or UAS-DUOX-RNAi / +; Da-GAL4 (DUOX-RNAi))
  • a germ-free (GF) animal was used to confirm that intestinal cell death following chronic uracil administration occurred DUOX-dependently.
  • the adult fruit flies (5-6 days old) were orally administered with a 5% sucrose solution containing different concentrations of uracil for 7 days.
  • the cell death index (20 days of chronic uracil administration) was analyzed by ANOVA followed by Tamhane's T2 post hoc test, with values representing mean ⁇ SEM ( *** P ⁇ 0.001).
  • NS means no significance. Each experiment was performed at least three times independently.
  • 10G shows a different genetic background (w 1118 (control)) Or UAS-DUOX-RNAi / +; Da-GAL4 (DUOX-RNAi))
  • a germ-free (GF) animal was used to confirm that the mortality of the host following chronic uracil administration occurred DUOX-dependently.
  • the adult fruit flies (5-6 days old) were given sterile foods containing different concentrations of uracil for 7 days. Survival was observed over time in 3 or more independent cohort groups, each containing approximately 25 Drosophila.
  • Figure 11 confirms that intestinal habitat G.morbifer can act as a natural commensal bacterium causing colitis by chronic DUOX activity due to its continuous uracil secretion. Data were analyzed by ANOVA followed by the Tamhane's T2 post hoc test (FIGS. 11A, 11C and 11D) or Tukey's post hoc test (FIG. 11B), with values representing mean ⁇ SEM ( * P ⁇ 0.05, ** P ⁇ 0.005, *** P ⁇ 0.001).
  • FIG. 11A shows ROS generation by G.morbifer in various genetic Drosophila species (w 1118 (control), UAS-DUOX-RNAi / +; Da-GAL4 (DUOX-RNAi), or norpA 7 (PLC ⁇ ⁇ / ⁇ )).
  • w 1118 control
  • UAS-DUOX-RNAi UAS-DUOX-RNAi
  • Da-GAL4 Da-GAL4
  • norpA 7 PLC ⁇ ⁇ / ⁇
  • Figure 11b is a wide range of genetic fruit fly species; G.morbifer by the (w 1118 (control group), UAS-DUOX-RNAi / + Da-GAL4 (DUOX-RNAi), or norpA 7 (PLC ⁇ - - /) ) Apoptosis It is a figure which confirmed the index.
  • FIG. 11C is a diagram confirming that the ROS-related monomorphism associated with ROS generation disappears when G.morbifer URA- variant ( G.morbifer-carA :: Tn5) is used in an experiment based on GF-control animals.
  • Figure 11d is a graph confirming that has a single associated lost related apoptosis index in the case where the URA- variant (G.morbifer-carA :: Tn5) of G.morbifer In an experiment based on a GF-control animals.
  • FIG. 11E confirms that the URA- variant of G.morbifer ( G.morbifer-carA :: Tn5) colonizes the intestinal epithelium as much as the native G.morbifer . Based on the GF-control animals, the number of CFUs in the midgut was measured on day 13 by G.morbifer or G.morbifer-carA :: Tn5. Data was analyzed using the Mann-Whitney U-test.
  • FIG. 12 is a diagram showing the coexistence of G. morbifer or A. pomorum and ROS and a method for generating uracil nutritional G.morbifer variants.
  • G.morbifer -GFP and A.pomorum -GFP were prepared.
  • w1118 Control
  • Da-GAL4 Da-GAL4
  • norpA 7 PLC ⁇ -/-
  • Sterile animals Control, DUOX-RNAi and PLC ⁇ -/-
  • Figure 12a is a view confirming the entire length of the sterile animals, it can be seen that the G.morbifer and ROS coexist predominantly in the mid- length of the full-length.
  • FIG. 12B is a diagram illustrating the upper parts of iron and copper cells, and morphologically large cells are known as cells in which copper is accumulated.
  • G.morbifer coexists with ROS in the anterior midgut of control flies. No production of ROS was observed in the G.morbifer-monolinked PLC ⁇ -DUOX signaling variant Drosophila or A.pomorum - monolinked control Drosophila.
  • FIG. 12C is a diagram confirming that A. pomorum bacteria are colonized with particular emphasis on the anterior midgut region of the midgut region.
  • FIG. 12C is a diagram confirming that A. pomorum bacteria are colonized with particular emphasis on the anterior midgut region of the midgut region.
  • the preparation of the uracil nutritional G. morbifer variant discloses the preparation of the uracil nutritional G. morbifer variant. Screening strategies for separating uracil nutritional variants are disclosed. According to the recently completed G.morbifer genome sequence (Kim et al., J Bacteriol 194, 1245, 2012), the G.morbifer carA gene has 51% amino acid sequence homology with E. coli carA gene. Can be. Mutations were introduced into the carA gene, specifically, the G.morbifer carA variant containing the transposon in the open reading frame of the carA gene was screened using the Rows and Columns PCR screening method.
  • CarA gene primers used for this purpose are carA forward primer; 5'-CGG ACT GGA AGC CGT CCG CAA ATG GCG-3 '(SEQ ID NO: 3) and carA reverse primer; 5'-CGA AAC GCT CGA AAA GAT AGA AAC TGT C-3 '(SEQ ID NO: 4).
  • primers used to confirm the insertion site of the Tn5 transposon are KAN-2 forward primer; 5'-ACC TAC AAC AAA GCT CTC ATC AAC C-3 '(SEQ ID NO: 1) and KAN-2 reverse primer; 5'-GCA ATG TAA CAT CAG AGA TTT TGA G-3 '(SEQ ID NO: 2). This gave G. morbifer-carA :: Tn5 variant candidate clones.
  • FIG. 12E is a schematic diagram of the G.morbifer-carA :: Tn5 variant candidate clones identified using the EZ :: TN5TM ⁇ KAN-2> Tnp TransposomeTM Kit (Epicentre) to confirm that transposons were inserted between the carA genes. Drawing.
  • FIG. 13 confirms that intestinal habitat L.brevis can act as a natural commensal bacterium that causes colitis due to chronic DUOX activity due to its continuous uracil secretion.
  • the carA gene from the 71st amino acid was prepared using a two-step homologous recombination method (Barthelmebs et al., Appl Environ Microbiol 66, pp3368-3375, 2000).
  • L.brevis ⁇ carA strain was prepared from which the 281th amino acid was removed.
  • FIG. 13A shows that colonization of native L.brevis is PLC ⁇ -dependent, unlike the URA- L.brevis variant ( L.brevis ⁇ carA ) in different genetic Drosophila species (w 1118 (control) or norpA 7 (PLC ⁇ ⁇ / ⁇ )).
  • Figure 3 confirms that it promotes chronic ROS generation.
  • Sterile animals with different genetic backgrounds GF-control, GF-PLC ⁇ ⁇ / ⁇
  • symbiotic bacteria ⁇ 10 6 CFU.
  • FIG. 13B shows the results of a single association of different genetic Drosophila species (GF-control or GF-PLC ⁇ ⁇ / ⁇ ) with native L.brevis or URA-L.brevis variants ( L.brevis ⁇ carA ). Data were analyzed by ANOVA followed by Tukey's post hoc test, with values representing mean ⁇ SEM ( *** P ⁇ 0.001). NS means no significance. Each experiment was performed at least three times independently.
  • Figure 13c confirms that the URA-L.brevis variant ( L.brevis ⁇ carA ) colonizes the intestinal epithelium as much as the native L.brevis .
  • FIG. 13D confirms that chronic activity of PLC ⁇ -DUOX signaling by L.brevis-derived uracil is a direct cause of host mortality.
  • Different genetic Drosophila species GF-control or GF-PLC ⁇ ⁇ / ⁇
  • L.brevis ⁇ carA L.brevis ⁇ carA
  • survival rates were observed over time in 3 or more independent cohort groups each containing approximately 25 Drosophila.
  • P ⁇ 0.01 between L.brevis monoassociation and URA- L.brevis ⁇ carA monoassociation based on GF-control.
  • P 0.694
  • FIG. 14 is a schematic of models for intestinal-microbial coexistence and intestinal-microbial pathogenicity by uracil.
  • Bacterial contact can be divided into four categories. That is, when intestinal immunity is activated by URA + exogenous bacterial contact (A), when insufficient intestinal immunity occurs by URA- exogenous bacterial contact (B), when intestinal immunity is chronically activated by URA + indigenous bacterial contact (C) and URA- indigenous bacterial contacts result in immune adaptation and intestinal-microbial symbiosis.
  • the present invention provides an antimicrobial composition against uracil non-secreting (URA-) bacteria comprising uracil, uracil precursors, uracil analogs or opportunistic infectious pathogens secreting uracil as an active ingredient. do.
  • UAA- uracil non-secreting
  • uracil refers to one of the nucleobases constituting the pyrimidine-based RNA, consisting of the formula C 4 H 4 N 2 O 2 , by complementarily binding to the adenine of the DNA in the transcription process constitute mRNA.
  • uracil may include all of uracil, uracil precursors, and uracil analogs as long as they function to promote ROS generation through PLC ⁇ -DUOX signaling.
  • uracil may be used with a uracil precursor, uracil analogue, or a non-pathogenic microorganism that produces uracil, and may be used together with existing antimicrobial compositions and antimicrobial substances.
  • uracil precursor refers to a substance that is converted to uracil after a biological or chemical specific reaction, and specifically, may be a substance that is converted to uracil by an in vivo mechanism when administered in vivo. In addition, it may be a material having chemical stability and easy storage in the composition state than uracil.
  • uracil analogue may include any substance similar to uracil that functions to promote ROS production through uracil-like PLC ⁇ -DUOX signaling in vivo. In addition, it may be a material having chemical stability and easy storage in the composition state than uracil.
  • the term "opportunistic infectious pathogen secreting uracil” is based on the harmlessness of the microorganism when administered to a living body, and microorganisms having the ability to secrete uracil may be included without limitation. This is because uracil derived from the microorganism can promote immune activity of contacted cells through the function of promoting ROS generation through PLC ⁇ -DUOX signaling, thereby promoting immune activity against other pathogenic bacteria.
  • DUOX dual oxidase
  • Mechanisms that enhance the immune activity of the cells of the uracil, uracil precursors, uracil analogues, and opportunistic infectious pathogens that secrete uracil may be in intestinal cells, for example, intestinal epithelial cells.
  • the uracil, uracil precursor, uracil analogue or non-pathogenic microorganism producing uracil may be to activate PLC ⁇ and / or dual oxidase (DUOX) in intestinal cells, and activation of the double oxidase is intestinal cells It may be to increase the level of reactive oxygen species (ROS).
  • ROS reactive oxygen species
  • uracil non-secreting (URA-) bacteria means not only bacteria that must be supplied separately in order to grow the bacteria, but also bacteria that do not secrete uracil in a specific environment as a whole.
  • the bacterium in the culture of the bacterium, it means a bacterium which does not activate PLC ⁇ -DUOX signaling because it does not have the ability to secrete uracil rather than synthesize uracil. That is, due to the property of not synthesizing or secreting uracil, it means a bacterium that also does not activate immune activity through promoting ROS production through PLC ⁇ -DUOX signaling. Failure to activate immune activity increases the chance of survival without being attacked by ROS.
  • the uracil nonsecreting bacterium may be an allogeneous bacterium.
  • exogenous bacteria refers to bacteria that do not function to colonize epithelial cells (colonization, indigenization), even if they are introduced from the foreign country and contact with epithelial cells to cause symptoms or reactions. In other words, it refers to a bacterium that does not have a property of forming a bacterial species by being fixed at a specific part of a host cell.
  • antibacterial means the ability to resist bacteria, and means all mechanisms made to defend against the action of microorganisms such as bacteria and fungi.
  • the term "bacteria” is a bacterium belonging to a bacterium, the most technological species among living organisms, most of which are pathogenic bacteria and retain the characteristics of prokaryotes, but do not have structures such as nuclear membranes, mitochondria, and chloroplasts.
  • the size varies from 0.5 ⁇ m to 0.5 mm.
  • the bacterium includes, for example, Staphylococcus aureus , Escherichia coli , Pseudomonas aeruginosa , but the action of the microorganism by the composition of the present invention. This includes without limitation the microorganisms being defended.
  • the antimicrobial composition of the present invention may be a pharmaceutical composition.
  • the antimicrobial composition of the present invention may contain not only the active ingredient of the present invention but also one or more known active ingredients having antimicrobial activity.
  • the antimicrobial composition of the present invention may further include a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • compositions or vehicles such as diluents, excipients, solvents or encapsulating materials.
  • the composition of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent in addition to the active ingredient described above for administration.
  • the carrier, excipient and diluent may include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, Polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the antimicrobial compositions of the present invention may be formulated in the form of powders, granules, tablets, capsules, suspensions, emulsions, syrups, aerosols, oral formulations, external preparations, suppositories, or sterile injectable solutions according to conventional methods.
  • it may be prepared using conventional diluents or excipients such as fillers, extenders, binders, wetting agents, disintegrating agents, and surfactants.
  • Solid preparations for oral administration include, but are not limited to, tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like.
  • Such solid preparations may be prepared by mixing at least one excipient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like with the compound of Formula 1 or 2.
  • excipients such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, gelatin and the like
  • lubricants such as magnesium stearate and talc may also be used.
  • Liquid preparations for oral use include, but are not limited to, suspending agents, solvents, emulsions, syrups, and the like, and various excipients, such as wetting agents, sweeteners, fragrances, It can be prepared by adding a preservative or the like.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized formulations and suppositories.
  • non-aqueous solvent and suspending agent propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, injectable esters such as ethyl oleate and the like can be used.
  • base of the suppository utopsol, macrogol, tween 61, cacao butter, laurin butter, glycerogelatin and the like can be used.
  • the antimicrobial composition of the present invention may be administered orally or parenterally (eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically) according to a desired method, and the dosage is based on the condition and weight of the patient.
  • parenterally eg, applied intravenously, subcutaneously, intraperitoneally, or topically
  • the dosage is based on the condition and weight of the patient.
  • the form of the drug, the route of administration and the duration it may be appropriately selected by those skilled in the art. It may be administered once or several times daily as needed, and may be used alone or in combination with methods using surgery, hormonal therapy, drug treatment and biological response modifiers for the prevention or treatment of bacteria.
  • the antimicrobial composition of the present invention may be a quasi-drug composition. That is, the present invention provides a quasi-drug composition for the purpose of preventing or improving an infectious disease caused by bacteria.
  • the quasi-drug composition of the present invention can be used together with other quasi-drugs or quasi-drug components, and can be suitably used according to a conventional method.
  • the mixed amount of the active ingredient may be appropriately determined depending on the purpose of use (prevention, health or therapeutic treatment).
  • the quasi-drug composition may be a disinfectant cleaner, shower foam, gagreen, wet tissue, detergent soap, hand wash, humidifier filler, mask, ointment or filter filler, but is not limited thereto.
  • the invention is an infection caused by or caused by a uracil non-secreting (URA-) microorganism or a microorganism with low uracil secretion, comprising administering to a subject an antimicrobial composition of the invention in a therapeutically effective amount.
  • UAA- uracil non-secreting
  • prevention means any action that inhibits or delays the onset of an infectious disease caused by the bacterium by administration of a composition
  • treatment means a condition caused by a bacterial infection by administering the composition.
  • mammals birds, and the like, including cattle, pigs, sheep, chickens, dogs, humans, etc. It means all animals, including humans that can develop, and by administering a composition of the present invention to a subject, the disease can be effectively prevented or treated.
  • the present invention provides an uracil-secreting (URA +) bacterium comprising an uracil scavenger, an uracil antagonist and / or a component capable of lowering uracil levels in vivo as an active ingredient. It provides a composition for preventing cell damage.
  • UAA + uracil-secreting
  • the uracil trapping agent, uracil antagonist, or component capable of lowering uracil levels in vivo is not limited to removing uracil secreted from uracil-secreting bacteria, lowering uracil levels, or inhibiting uracil function. Include. Through this, activation of PLC ⁇ , activation of DUOX and / or generation of ROS by uracil secreted from uracil-secreting bacteria can be suppressed.
  • the present invention provides a composition for preventing cell damage caused by uracil-secreting (URA +) bacteria, including an active oxygen species scavenger as an active ingredient.
  • UAA + uracil-secreting
  • ROS scavenger includes, without limitation, a substance that removes or deactivates reactive oxygen species. This may be to lower the level of reactive oxygen species produced and promoted by double oxidase activated by uracil derived from uracil secreting bacteria.
  • the reactive oxygen species scavenger is that containing uric acid, bilirubin, vitamin C, vitamin E, carotene, lycopene, rutin, catechin, flavonoids, copper, zinc, manganese, magnesium, iron and selenium May be, but is not limited thereto.
  • the active oxygen species refers to an oxygen species having a high oxidative power in an unstable state. Active oxygen species have a strong reactivity and can react with lipids, proteins, nucleic acids, etc., which are major constituents in vivo, and cause damage.
  • the reactive oxygen species may be produced by cells to attack foreign microorganisms, but even if the cells are attacked by foreign substances, cells may also be denatured and killed as they are chronically exposed to reactive oxygen species. In the present invention, it may be HOCL, which is an active oxygen species produced by activating PLC ⁇ and / or dual oxidase (DUOX).
  • uracil-secreting (URA +) bacteria refers to bacteria that have the ability to produce uracil necessary for their own survival as well as to secrete it to the outside.
  • uracil in the present invention, as having the ability to produce and secrete uracil, means a bacterium that secretes uracil to cells in vivo and activates immune activity through ROS production promotion through PLC ⁇ -DUOX signaling activated by uracil do. By activating the immune activity, it promotes the ROS production of the cell, and raises the ROS level of the cell.
  • the uracil-secreting bacterium may be an autochthonous bacterium.
  • autochthonous bacterium refers to a bacterium that has a characteristic of colonizing epithelial cells by contacting epithelial cells by being introduced from foreign countries. In other words, it refers to a bacterium that has a property of forming a bacterial species by being fixed at a specific site of a host cell.
  • An indigenous bacterium generally refers to a bacterium that has been adapted to survive in vivo in response to evolutionary adaptation to an in vivo environment.
  • it includes symbiotic bacteria, and in the case of symbiotic bacteria to settle in the host's living body to function to help the mechanism that is beneficial to the survival of the host.
  • cows contain various microorganisms that digest the cellulose of plants, and these microorganisms have a symbiotic relationship that plays an essential role in the survival of the host cow by converting the cellulose of the plant into an absorbable form.
  • cell damage includes all kinds of cell damage caused by uracil-secreting bacteria, and may be, for example, but not limited to, oxidative stress by reactive oxygen species.
  • the cells may be intestinal cells, for example intestinal epithelial cells.
  • Cell damage in the present invention may be due to increased reactive oxygen species by activation of PLC ⁇ and / or dual oxidase (DUOX) by uracil-secreting bacteria.
  • prevention means any action that inhibits cell damage or delays the disease caused by the bacteria by administration of the composition.
  • composition for preventing cell damage of the present invention may be a pharmaceutical composition.
  • composition for preventing cell damage of the present invention is not only the active oxygen species trapping agent of the present invention but also a known effective ingredient having antibacterial activity against various antioxidants or uracil-secreting bacteria that can protect cells from oxidative stress. It may contain more than one species.
  • composition for preventing cell damage of the present invention may further comprise a pharmaceutically acceptable carrier, excipient or diluent.
  • pharmaceutically acceptable carrier in the present invention is similar to that described above.
  • formulation of the pharmaceutical composition, the method of administration and the like are also similar to those described above.
  • the present invention provides a food or feed for antimicrobial against uracil non-secreting (URA-) bacteria, including the antimicrobial composition.
  • UAA- uracil non-secreting
  • the uracil nonsecreting bacteria is similar to the above description.
  • the antimicrobial food comprising the antimicrobial composition of the present invention is not particularly limited, and the content of the composition included in the food additive is also not particularly limited, and these are required by those skilled in the art in view of the ease of infection and the degree of infection of various bacteria. Can be easily determined accordingly.
  • Examples of the food comprising the antimicrobial composition of the present invention include meat, sausage, bread, chocolate, candy, snacks, confectionery, pizza, ramen, other noodles, gums, dairy products including ice cream, various soups, drinks, tea, Drinks, alcoholic beverages and vitamin complexes, and the like, may include all of the health functional foods in the conventional sense, may include foods used as feed for animals.
  • the natural carbohydrate can be glucose, monosaccharides such as fructose, maltose, disaccharides such as sucrose, polysaccharides such as dextrin, cyclodextrin, and sugar alcohols such as xylitol, sorbitol, erythritol.
  • the ratio of the natural carbohydrate is not limited thereto, but may be, for example, about 0.01 to 0.04 g, specifically 0.02 to 0.03 g, per 100 ml of food containing the antimicrobial composition of the present invention.
  • the sweetener may be a natural sweetener such as taumartin, stevia extract and a synthetic sweetener such as saccharin, aspartame.
  • Foods containing the antimicrobial composition of the present invention in addition to the above are various nutrients, vitamins, electrolytes, flavoring agents, coloring agents, pectic acid and salts thereof, alginic acid and salts thereof, organic acids, protective colloidal thickeners, pH regulators, stabilizers, Preservatives, glycerin, alcohols, carbonation agents used in carbonated drinks, and the like. Others may contain pulp for the production of natural fruit juices, fruit juice drinks and vegetable drinks.
  • the antimicrobial feed that can be used for the antimicrobial composition is not particularly limited, and the content of the antimicrobial composition included in the feed is also not particularly limited, these in consideration of the ease of infection, the degree of infection of various bacteria One skilled in the art can easily determine as needed.
  • the present invention provides a food or feed for preventing cell damage caused by uracil-secreting (URA +) bacteria, comprising the composition for preventing cell damage.
  • UAA + uracil-secreting
  • the cell damage preventing food comprising the composition for preventing cell damage of the present invention is not particularly limited, and the content of the composition included in the food additive is not particularly limited, and they are various degrees of oxidative stress, degree of cell damage. In view of the above, a person of ordinary skill in the art can easily determine the configuration as needed.
  • Food containing the composition for preventing cell damage of the present invention is similar to that described in the food containing the antimicrobial composition.
  • the cell damage preventing feeds that can be used for the cell damage preventing composition is not particularly limited, and the content of the cell damage preventing composition included in the feed is not particularly limited, and they are used for various oxidative stress In view of the extent and the extent of cell damage, those skilled in the art can easily determine as needed.
  • the invention provides a method of promoting dual oxidase activity of a cell comprising treating the cell with a uracil, uracil precursor, uracil analogue or non-pathogenic microorganism that produces uracil.
  • the present invention also provides a method of promoting the generation of reactive oxygen species in a cell, comprising treating the cell with a uracil, uracil precursor, uracil analog, or non-pathogenic microorganism that produces uracil.
  • the cell may be ex vivo , in vivo or in vitro .
  • the cells may be, for example, intestinal cells, and may be intestinal stem cells or intestinal epithelial cells.
  • PLC ⁇ and / or DUOX are activated by the mechanism described above, and the activation of DUOX promotes the production of ROS. This can activate the immune activity of the cell.
  • the present invention provides a method of treating a cell with free radical species compared to a control that has not been treated with an active oxygen species trapping agent, the method comprising treating the cell with a uracil trapping agent, uracil antagonist, or a substance that lowers uracil levels. It provides a method of reducing.
  • the cell may be ex vivo , in vivo or in vitro .
  • the cells may be, for example, intestinal cells, and may be intestinal stem cells or intestinal epithelial cells.
  • the present invention provides a method of reducing free radical species levels in a cell as compared to a control not treated with an active oxygen species trapping agent, the method comprising treating the cell with an active oxygen species trapping agent.
  • the cell may be ex vivo , in vivo or in vitro .
  • the cells may be, for example, intestinal cells, and may be intestinal stem cells or intestinal epithelial cells.
  • the active oxygen species trapping agent of the present invention is the same as described above.
  • the present invention provides a method for producing a double oxidase-enhanced cell comprising treating a cell with a uracil, uracil precursor, uracil analogue or non-pathogenic microorganism that produces uracil.
  • the present invention also provides a method for producing a cell that promotes the production of reactive oxygen species, comprising treating a cell with a uracil, a uracil precursor, a uracil analog, or a non-pathogenic microorganism that produces uracil.
  • the cell may be ex vivo , in vivo or in vitro .
  • the cells may be, for example, intestinal cells, and may be intestinal stem cells or intestinal epithelial cells.
  • uracil Through treatment of uracil, uracil precursors, uracil analogues, or non-pathogenic microorganisms producing uracil in cells, PLC ⁇ and / or DUOX are activated by the mechanism described above, and ROS production is promoted by activation of DUOX. This allows the production of cells with activated immune activity.
  • the present invention provides a method for producing a cell having a reduced level of active oxygen species, as compared to a control not treated with the active oxygen species trapping agent, comprising treating the cells with an active oxygen species trapping agent. do.
  • the cell may be ex vivo , in vivo or in vitro .
  • the cells may be, for example, intestinal cells, and may be intestinal stem cells or intestinal epithelial cells.
  • active oxygen species and active oxygen species trapping agent of the present invention are the same as described above.
  • the present invention provides a method for providing information on whether the bacteria intestinal pathogenicity, (a) uracil production-indigenous, uracil production-exogenous, uracil non-indigenous, depending on whether the bacteria uracil production and colonization And classifying into one of the group consisting of uracil non-productive-exogenous; And (b) determining in the step (a) that the bacterium is intestinal pathogenic bacteria if the bacterium corresponds to uracil production-indigenous or uracil non-production-exogenous.
  • the Drosophila strain is w 1118 , UAS-PLC ⁇ - RFP (Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009), MEKK1 Ur3 (Inoue et al., Embo J 20, pp5421-5430, 2001) , Drs-GFP, Dpt-LacZ (Jung et al., Biotechniques 30, pp594-598, 2001), imd 1 (Lemaitre et al., Proc Natl Acad Sci USA 92, pp9465-9469, 1995) , UAS-DUOX- RNAi (Ha et al., Science 310, pp847-850, 2005), norp 7 (Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009) , Gaq 1 (Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009) , esg-GAL4 > UAS-GFP (
  • Drosophila were bred at 25 ° C.
  • the composition of standard corn flour-agar medium was prepared as described in the previous literature (Shin et al., Science 334, pp670-674, 2011). Annexin standard corn flour-agar medium was used when testing with sterile animals or sterile animals monoassociated with symbiotic bacteria. Bokinin and propionic acid were excluded from annexin media.
  • Erwinia carotovora subsp. carotovora-15 was obtained from Bruno Lemaitre (Buchon et al., Cell Host Microbe 5, pp200-211, 2009b).
  • Commensalibacter intestini A911T , Gluconobacter morbifer G707T , Acetobacter pomorum , Lactobacillus plantarum , and Lactobacillus brevis were isolated from our experimental Drosophila (Roh et al., Appl Environ Microbiol 74, pp6171-6177, 2008; Ryu et al., Science 319 , pp777-782, 2008).
  • Bacteria strains identified in humans were obtained from the Korea Institute of Biotechnology Gene Bank.
  • the present inventors have produced two types of mutations URA- bacteria, E. carotovora- pyrE :: Tn5 and G. morbifer- carA :: Tn5 by using a random library Tn5- parameters for E. carotovora and G. morbifer.
  • E. carotovora- pyrE :: Tn5-pyrE strain was prepared by introducing pTac3-pyrE into E. carotovora -pyrE :: Tn5 strain.
  • the pTac3 expression vector containing the apramycin resistance gene modified a version of the pTac1 vector (Koo et al., EMBO J 22, pp2614-2622, 2003). All bacteria were incubated at 30 ° C. Appropriate antibiotics were added at 50 ⁇ g / ml (aphramycin) and 30 ⁇ g / ml (kanamycin), respectively.
  • E. carotovora was cultured in M9 minimal medium. Since all symbiotic bacteria do not grow at all in the M9 minimal growth medium, various vitamin and amino acid essentials were tested in the same manner as previously described (Foda and Vaughn, 1953). Of the amino acid (p -aminobenzoic acid, 0.2 mg / ml), Pantothenate (pantothenic acid, 1 mg / ml ), and niacin (nicotinic acid, 0.2 mg / ml ) - The present inventors C. intestini only p in M9 minimal medium It was confirmed that it could grow by addition.
  • the culture supernatants of each bacteria were obtained through centrifugation and filtration (pore size 0.2 mM). The culture supernatant was lyophilized at Speedvac and the pellet was then dissolved in 20 ml of distilled water. Samples were desalted by adding 50 times greater volume of 100% methanol. Centrifugation followed by lyophilization at Speedvac and the pellet dissolved in 20 ml of distilled water.
  • Samples were washed 5 times with PBS containing 0.1% Triton X-100 for 5 minutes, with the addition of secondary antibody (1: 500 dilution; Alexa Fluor ® 568 goat anti-rabbit IgG; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) Incubate at room temperature for 20 minutes. Samples were washed three times for 5 minutes with PBS containing 0.1% Triton X-100, then mounted with mounting buffer (Vectorshield, Vector Laboratories Inc., Burlingame, Calif., USA) to confocal microscope LSM 700 (Carl Zeiss, Oberkochen). , Germany).
  • mounting buffer Vectorshield, Vector Laboratories Inc., Burlingame, Calif., USA
  • R19S HOCl specific rhodamine-based dye
  • Drosophila were isolated from each bacterium ( C. intestini , A. pomorum , L. plantarum , G. morbifer, G. morbifer-carA :: Tn 5, as described above). , L. brevis or L. brevisDcarA ). These monoassociated Drosophila (13 days old) were orally administered for 90 minutes with a 5% sucrose solution containing R19S (10 ⁇ M).
  • HOCl levels were visualized using an LSM700 confocal microscope (Carl Zeiss).
  • E. carotovora or E. carotovora-pyrE Tn 5 5 x 10 8 cells
  • the mid-length of the collected female Drosophila (day 20) was used for apoptosis analysis.
  • the large intestine was dissected in PBS, and apoptosis assays were carried out by a terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUDP nick end labeling method (Ryu et al. , Science 319, pp 777-782, 2008).
  • Apoptosis index is expressed by dividing the number of apoptotic cells by the total number of cells in another compartment and multiplying by 100.
  • Drosophila bearing esg-GAL4> UAS-GFP were used for analysis of ISC proliferation and differentiation.
  • Drosophila in uracil (16 hours at 20 nM) or different bacteria E. carotovora , E. carotovora-pyrE :: Tn 5 , and E. carotovora-pyrE :: Tn 5-pyrE ⁇ 5 ⁇ 10 8 cells, 5% sucrose solution
  • Drosophila was also co-ingested with uracil (1 nM) with the URA ⁇ strain ( E. carotovora-pyrE :: Tn 5 ).
  • Drosophila bearing Upd3-GAL4> UAS-GFP or 2 x STAT-GFP was compared to esg-GAL4> UAS-GFP except that the ingestion time was 4 hours.
  • Uracil or bacteria are orally administered as described in the intake protocol above.
  • Dipt-LacZ in the presence or absence of imd mutation backgrounds was used to culture supernatants ( ⁇ 2.5) enriched with different stimulants ( ⁇ 50 nl of different bacteria). corresponding to culture supernatants derived from x 10 5 bacterial cells) were allowed to infect sepsis. Dipt-LacZ of the fat was tested 9 hours after the last injection.
  • Transgenic Drosophila bearing PLC ⁇ -RFP ( UAS-PLC ⁇ -RFP ; Da-GAL4 ), as described in a previous study (Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009), is the active form targeted to the membrane.
  • Drosophila (5-6 days old) was fed for 2 hours with a 5% sucrose solution containing 20 nM uracil.
  • Fluorescent real-time PCR was performed to quantify gene expression, using double stranded DNA dye, SYBR Green (Perkin Elmer, Waltham, Mass., USA). Cecropin (sense, 5'-ATG AAC TTC TAC AAC ATC TTC G-3 '(SEQ ID NO: 5); antisense, 5'-GGC AGT TGC GGC GAC ATT GGC G-3' (SEQ ID NO: 6)), Diptericin (sense , 5'-GGC TTA TCC GAT GCC CGA CG-3 '(SEQ ID NO: 7); antisense, 5'-TCT GTA GGT GTA GGT GCT TCC C-3' (SEQ ID NO: 8)), DUOX (sense, 5'- GCT GCA CGC CAA CCA CAA GAG ACT -3 '(SEQ ID NO: 9); antisense, 5'-CAC GCG CAG CAG GAT GTA AGG TTT -3' (SEQ ID NO: 10)
  • E. carotovora E. carotovora-pyrE :: Tn 5
  • carotovora-pyrE Tn 5 (+ uracil) and 1 nM uracil simultaneous ingestion or functional pyrE gene (pyrE +) expressed by the genetically recovery of the E. carotovora-pyrE :: Tn 5 strain of Intake was used.
  • E. carotovora strain E. carotovora, E. carotovora-pyrE :: Tn 5 and E. carotovora-pyrE :: Tn 5- pyrE
  • the female adult flies 5-6 day old
  • a 5% sucrose solution containing carotovora strain to 10 10 cells.
  • the intestines were dissected.
  • the surface sterilized medium, thick, and feed crops were homogenized and diluted appropriately to spread on Luria-Bertani agar plates, and some colony-forming units (CFUs) were obtained from each medium. .
  • CFUs colony-forming units
  • carotovora-pyrE Tn 5 ( + uracil) and 1 nM uracil co-ingestion or expression of the functional pyrE gene ( + pyrE ) by genetically restored E. carotovora-pyrE :: Tn 5 strain Intake was used.
  • Intracellular Ca 2+ was measured using the method described in the previous study (Rosker et al., J Biol Chem 279, pp13696-13704, 2004).
  • Drosophila S2 cells (approximately 10 8 cells) were placed in 2 mM buffer in pH 7.4 containing 10 mM glucose, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl 2 , 5 mM KCl, 1 mM MgCl 2 , and 10 mM HEPES. It was loaded at room temperature for 40 minutes with a solution to which fura-2-acetoxymethyl ester was added.
  • brevis ⁇ carA All bacteria were cultured in mannitol medium except L. plantarum as described in previous studies (Ryu et al., Science 319, pp777-782, 2008), and in MRS medium for L. brevis .
  • PLCb -/- And DUOX-RNAi Drosophila have a short lifespan in a normal breeding environment, but are known to have a general lifespan in a sterile state (Ha et al., Nat Immunol 10, pp 949-957, 2009). Therefore, sterile animals were used in this experiment to measure the effect of uracil on the survival of these Drosophila with different genotypes. Sterile animals were bred in sterile medium containing 1 nM uracil. Sterile animals were transferred to new, sterile bottles with sterile medium containing uracil every 4-5 days. Drosophila remained sterile throughout the experiment. Three or more independent cohorts of approximately 25 fruit flies were monitored to the end.
  • E. carotovora-pyrE Tn 5-pyrE strain was generated by introducing pTac3-pyrE into E. carotovora-pyrE :: Tn 5 .
  • PTac3 expression vectors containing apramycin resistance genes modified versions of the pTac1 vector (Koo et al., 2003).
  • the concentrated bacterial culture supernatant derived from ⁇ 10 8 bacterial cells was prepared through the method of Example 3. Culture supernatants were fractionated for 35 minutes by HPLC at 280 nm with a methanol gradient (0-10%) using a Waters Atlantis TM C18 column (250 ⁇ 4.6 mm and pore size 5 mm).
  • NMR proton signal data were assigned by a combination of 2D 1 H- 1 H experiments including NOESY, COSY and TOCSY to fully determine the structure of the biologically active element obtained from the HPLC fraction.
  • Carbon-carbon signal types were determined by a combination of 1D DEPT and carbon integration experiments using the zgig30 plus program and 2D 1 H- 13 C HSQC and HMBC experiments.
  • Bacterial culture supernatants labeled with 15 N were fractionated by HPLC and nitrogen atoms in the bioactive elements were analyzed by 2D 1 H- 15 N HSQC NMR spectra.
  • Mass spectrometry experiments were performed with an ABI ESI-TOF mass spectrometer (Applied Biosystems) or a GC-2010 mass spectrometer (Shimadzu) equipped with an electron ionization (EI) feeder.
  • Activity fractions fractionated by HPLC were prepared as described in the NMR sample preparation method above except that the residue was dissolved in demineralized water prior to MS analysis.
  • LC was performed using an Agilent 1100 (Agilent Technologies, USA) equipped with a binary pump, vacuum microdegasser, column oven and temperature controlled autosampler. Separation was achieved on a Proshell 120 EC-C18 column (3.0 ⁇ 50 mm; 2.7 ⁇ m particle size; Agilent Technologies, USA).
  • the mobile phase consisted of an aqueous 80% acetonitrile solution with a flow rate of 0.3 mL / min. The temperature of the column was maintained at 35 ° C.
  • LC used API 4000 QTRAP (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). The main parameters of the spectrometer were manually optimized as follows.
  • Mass spectroscopic analysis was performed in multiple reaction monitoring (MRM) mode to detect uracil precursor ions and product ions (precursor ions ⁇ product ions at m / z : 113.0 ⁇ 70.1). All data was processed in Analyst software 1.4.2 (Applied Biosystems, USA).
  • Standard solutions for calibration curves were diluted with M9 medium to a final concentration of 8000 ng / mL, 1600 ng / mL, 320 ng / mL, 65 ng / mL, 13 ng / mL and 0 ng / mL.
  • Culture supernatants (corresponding to culture supernatants obtained from ⁇ 10 8 bacterial cells) of each bacteria incubated in M9 minimal medium were obtained by centrifugation and filtration (pore size 0.2 mM).
  • intestini was cultured by adding p -aminobenzoic acid (0.2 mg / ml), pantothenic acid (1 mg / ml), and nicotinic acid (nicotinic acid, 0.2 mg / ml) to M9 minimal media. It was.
  • the filtered bacterial culture supernatant was mixed with 100 ⁇ L of 5-bromouracil (100 ⁇ g / mL aqueous solution was used as internal standard) and 3 mL of 9: 1 ethyl acetic acid: isopropyl alcohol (v: v) was added and vortex-mixed and centrifuged at 1,100 rpm for 10 minutes to extract.
  • Ce-DUOX1-RNAi was introduced by feeding bacteria bearing the Ce-DUOX1-RNAi vector to L1 nematodes over the L4 stage as in previous studies (Chavez et al., Infect Immun 77, pp4983-4989, 2009). Standard feeding RNAi procedures with Ce-DUOX1-RNAi result in developmental disorders with severe mortality. Ce-DUOX1-RNAi bacteria were mixed in a ratio of 1 to 70 with bacteria carrying control RNAi to give partial knockdown effects as described in the previous study.
  • nematodes In the initial adult stage nematodes were obtained and washed with M9 minimal medium. Nematodes ( ⁇ 200-300 individuals) were allowed to stand for 2 hours at 20 ° C. in 96 wells with M9 medium (50 ml) containing uracil.
  • DUOX-dependent H 2 O 2 is basically 100 mM of Amplex ® UltraRed solution (Invitrogen) and horseradish peroxidase (Sigma) as described in previous studies (Chavez et al., Infect Immun 77, pp4983-4989, 2009). ) 200 ml of reaction buffer containing 0.2 Unit / ml was added and measured at room temperature for 2 hours. Fluorescence of each sample was measured using an fluorescence microplate reader at an excitation wavelength of 530 nm and an emission wavelength of 590 nm. Standard curves were generated using known concentrations of H 2 O 2 .
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • basic epithelial growth medium containing all the additives described in the previous study (Yoon et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 109, pp594-601, 2000). .
  • the cultures were submerged in the first 9 days while submerged in the medium, during which the medium was changed on the first day and the medium was changed daily.
  • An air-liquid interface (ALI) was formed by removing the top medium on Day 9 and feeding only the basal compartment. After ALI was formed, the culture medium was changed daily. All experiments were performed three days after ALI was formed.
  • DMEM was maintained in a standard culture environment of 37 °C. Cells were grown in 12-well plates.
  • NHNE cells or Caco-2 cells After stimulating NHNE cells or Caco-2 cells, the cells were washed with Hanks' balanced salt solution (HBSS) and 5 ⁇ M 2 ', 7'dichlorofluorescin diacetate (2', 7'-dichlorofluorescin diacetate, DCF- DA; Molecular Probes, Eugene OR, USA) containing Krebs-Ringer solution was incubated for 10 minutes in the dark. Cells were washed at least 5 times with 1 ml HBSS to remove extracellular ROS. The culture dish was examined under a Zeiss Axiovert 135 inverted confocal microscope equipped with an x20 Neofluor objective lens and a Zeiss LSM 410 confocal adder.
  • HBSS Hanks' balanced salt solution
  • DCF- DA 7'dichlorofluorescin diacetate
  • Shuttle vectors containing an internal ribosome entry site (IRS) according to the SV40 large T-antigen nuclear localization signal were generated from pBS-KS.
  • a shRNA targeting human DUOX2 mRNA (DUOX2 shRNA, 5′-GCC ATC AGG AGT GGC ATA AAT TAG TGA AGC CAC AGA TGT AAT TTA TGC CAC TCC TGA TGG C-3 ′ (SEQ ID NO: 13)) was constructed.
  • Complementary single-chain DNA oligonucleotides were annealed and inserted into the IRES of shuttle vector 5 '. DNA fragments containing human Duox2 shRNA were isolated from the shuttle vector and inserted into the pLZRS vector.
  • shRNA of pLZRS (5′-CAA CAA GAT GAA GAG CAC CAA CTC GAG TTG GTG CTC TTC ATC TTG TTG-3 ′ (SEQ ID NO: 14) was used as a control.
  • High titers of virus were prepared as described in previous studies (Kim et al., Neuron 38, pp 17-31, 2003). Plasmids were superimposed on a human 293-derived retrovirus packaging cell line (293GPG), capable of propagating a tetracycline-induced plasmid encoding the bullous stomatitis virus G protein, using a Superfect Reagent (Qiagen, Valencia, CA, USA). By transfection.
  • NHNE cells or Caco-2 cells were treated twice with retrovirus (Multiplicity of infection (MOI): 10) for 2 days prior to the experiment.
  • MOI Multiplicity of infection
  • R19S a recently developed HOCl specific rhodamine based dye
  • DUOX-dependent ROS detection was used, which was based on R19S, a recently developed rhodamine-based sensor.
  • R19 is highly specific for DUOX-dependent HOCl (hypochlorite), including hypothiocyanite (hypothiocyanite), and cannot react with various other ROS (FIG. 2A).
  • the following experiment was conducted by measuring the ROS and basal ROS levels caused by bacteria.
  • E. carotovora is considered an opportunistic pathogen because Drosophila does not normally harm the host but can cause serious lethality when host DUOX-dependent intestinal immunity is compromised.
  • E. carotovora was able to induce DUOX-dependent ROS production mainly 1-3.5 hours after anterior bacterial intestinal tract (FIG. 1A, FIG. 2B, and FIG. 2C).
  • bacteria-induced ROS production was at a basic level.
  • Commensalibacter intestini A911 T Acetobacter pomorum
  • Lactobacillus plantarum Lactobacillus plantarum
  • E. carotovora culture supernatants were purified by reverse phase-HPLC (reverse phase-high performance liquid chromatography).
  • HPLC-purified fragments fractions were investigated and showed that fragments found in E. carotovora culture supernatants strongly induced ROS production in intestinal epithelium in vivo. , Peaks with similar retention time in C. intestini culture supernatants did not have any activity (FIG. 3A).
  • HPLC-purified fragments were sequentially analyzed by mass spectrometry and nuclear magnetic resonance (NMR). Chemical analysis revealed that the fragment contained uracil (FIGS. 4A and 4B).
  • FIGS. 4A and 4B nuclear magnetic resonance
  • LC-MS / MS liquid chromatography-parallel mass spectrometry
  • Tandem mass spectrometry was used for quantitative analysis of uracil.
  • Complete media such as Luria-Bertani medium were found to contain high amounts of uracil ( ⁇ 10 g / ml) and minimal growth medium was used to measure uracil levels secreted from bacteria.
  • LC-MS / MS liquid chromatography-parallel mass spectrometry
  • uracil uptake was associated with the DUOX-active pathway (membrane distribution of the active form of PCL and PLC activity as evidenced by Ca 2+ mobilization) (FIGS. 3B and 3C) and the DUOX-expressing pathway (p38 MAPK activation and DUOX gene Induction) showed that both can be activated (FIGS. 3D and 3E).
  • Uracil-induced activity of both DUOX-regulating pathways leads to the generation of large amounts of enteric ROS in a PLC ⁇ -DUOX signal-dependent method (FIG. 3F).
  • uracil treatment can induce ROS production in enterocytes from 0.01 nM and is most effective in the range of 1-20 nM (FIG. 5A).
  • ROS-inducing ability of various uracil-related molecules 8 different pyrimidine analogs, including 5-fluorouracil, as well as other purine and pyrimidine nucleobases
  • DUOX uracil-related molecules
  • uracil was also able to activate DUOX-dependent ROS production in C. elegans and human mucosal epithelial cells (FIGS. 4G-4I).
  • E. carotovora mutant library was first prepared.
  • E. carotovora strains were subjected to the generation of any Tn5-mediated mutation, which is a transfer factor (transposon, transposon, a unit of DNA with a special structure that can transfer DNA molecules within cells, Tn).
  • Tn5-mediated mutation which is a transfer factor (transposon, transposon, a unit of DNA with a special structure that can transfer DNA molecules within cells, Tn).
  • Tn5-mediated mutation which is a transfer factor (transposon, transposon, a unit of DNA with a special structure that can transfer DNA molecules within cells, Tn).
  • Tn5-mediated mutation which is a transfer factor (transposon, transposon, a unit of DNA with a special structure that can transfer DNA molecules within cells, Tn).
  • a come within the hidden behind ⁇ 6000 mutant strains single URA - Strains were isolated (FIG. 6A). Sequence analysis showed that this URA - strain had T
  • E. carotovora-pyrE Tn showed that intestinal infection experiments showed that the uracil auxotrophic pyrE mutant strain (not the other nucleobase auxotrophic mutant mutations such as guanine and adenine) was not. 5 ) Only ROS was significantly reduced as compared to intestinal infection of wild-type (WT) parental E. carotovora strains (FIG. 7A, FIG. 6I, and FIG. 6J). In addition, URA-intake or functional recovery in the URA-strain with co-uracil ingestion of strain when the (i. E., E.
  • carotovora-pyrE Tn 5 strain expressing the pyrE into ectopic
  • infection in a field-induced ROS showed normal levels (FIG. 7A).
  • ISC intestinal stem cell
  • the inventors performed intestinal infection experiments with WT or URA ⁇ strains, and escargot (edible snail) -GAL4> UAS that enabled the identification of ICSs, enteroblasts, positive cells and newly synthesized enterocytes.
  • Escargot positive cells were analyzed using the -GFP system. This result showed that a large number of escargot -positive cells were present in the middle intestinal region of wild-type (WT) bacterial-infected Drosophila in a PLC ⁇ -dependent manner, but the escargot -positive cells were significantly reduced (FIG. 7B).
  • URA - a strain with co-ingestion of uracil, or functional recovery in URA-strain infection was sufficient to chapter Upd3-JAK-STAT recovery of the signal activity and as ISC only proliferation and differentiation induction cells (enteroblast) accumulation ( 7B-7E). Because pathogenic-induced Upd3-JAK-STAT pathway activity was lost in the absence of PLC (FIG. 7E), we found that bacterial-derived uracil alternately upregulated the Upd3-JAK-STAT pathway of epithelial cell regeneration-induced epithelial cell regeneration. It can be concluded that it activates the PLC ⁇ -DUOX-ROS pathway, which acts as an upstream event.
  • Drosophila is more susceptible to URA - pathogen infection, and poor post-infection survival, whereas Drosophila is reversed by trophogenic mutants of wild-type (WT) pathogens or other nucleic acid bases. It was not affected (FIG. 9B).
  • WT wild-type pathogens or other nucleic acid bases. It was not affected (FIG. 9B).
  • the inventors have found that co-intake of URA - strains and uracil or ingestion of a functionally recovered URA - strain is sufficient to regain viability of the host (FIG. 9B), and that URA - pathogen-induced pathology is intestinal. This is due to the absence of uracil in the lumen. Taken together, these results show that host survival for intestinal infections depends on the recognition of pathogen-induced uracil followed by DUOX-dependent intestinal immunity.
  • ROS dysregulation has a significant effect on the pathogenesis of many important diseases in mucosal epithelium.
  • DUOX-activation and ROS-producing ability of the bacterial uracil we hypothesized that exposure of the uracil component may have a deleterious effect on host physiology.
  • PLC ⁇ -/- and DUOX-RNAi fruit flies have a short life cycle under normal rearing conditions and a normal life under sterile conditions
  • sterile animals were used to investigate host physiology after prolonged intake of uracil.
  • Example 12 Effect of Chronic Activity of DUOX-dependent Intestinal Immune Response to Uracil Secretion of Autochthonous Bacteria
  • intestinal bacterial flora also called dysbiosis, or intestinal bacterial imbalance
  • intestinal bacterial flora is a condition that causes overgrowth of one or more normal strains that make up the normal intestinal flora.
  • Other microorganisms in some circumstances, may also lead to host pathogenesis.
  • normal gut flora abnormalities have been associated with many diseases, including inflammatory bowel disease, the molecular mechanisms caused by dysbiosis causing host pathology disorders are not well understood.
  • G. morbifer - since the same inducing chronic active DUOX will be able to cause pathological section above, the present inventors have continued secretion of uracil as a component of a permanent presence of G. morbifer in Section G. morbifer - induced host It is assumed to be a major general component of pathology. Mutations of carbamoyl phosphate synthetase (carA ) are known to induce uracil nutrients. Therefore, the inventors have screened ⁇ 3,000 mutant strains using any transposon-based mutation library to demonstrate the in vivo role of G. morbifer -derived uracil (FIGS. 12D and 12E). a, G.
  • G. morbifer-carA URA - Mutant strains were isolated. Importantly, G. morbifer-carA :: Tn 5 strains and a single separation of sterile fruit flies with this URA - those strains did not cause lasting ROS production as a component in the chapter (Fig. 11c), compared to the parent strain G. morbifer It has been shown that this can lead to significantly reduced intestinal apoptosis (FIG. 11D). When we examined colony forming units (CFUs) of colonized bacteria in the intestine, we found that G. morbifer-carA :: Tn 5 strains were compared with wild type (WT) G.
  • CFUs colony forming units
  • the present inventors have DUOX-RNAi or PLC - / - because they did not observe a difference in the survival rate between G. morbifer single associated with G. morbifer-carA :: Tn 5 relates to the case of a single animal, observed in the control flies G. morbifer -induced host lethality disappeared in the absence of the PLC ⁇ -DUOX pathway (FIG. 11F), suggesting that G. morbifer -induced disease phenotype can be effectively reversed by reducing bacterial uracil production or host DUOX activity. Shows.
  • the single involvement of Gram-positive L. brevis a few other members of the natural intestinal normal flora, is similar to that seen in G.

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Abstract

본 발명은 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 유효성분으로 포함하는, 우라실 영양요구성(URA-) 세균에 대한 항균용 조성물 또는 활성 산소종 포착제(ROS scavenger)를 유효성분으로 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의해 유발되는 세포 손상 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 항균용 또는 세포 손상 예방용 식품 또는 사료, 세포의 이중 산화효소 활성, 활성 산소종 생성 또는 활성 산소종 수준을 조절하는 방법 및 이중 산화효소 활성, 활성 산소종 생성 또는 활성 산소종 수준이 조절된 세포의 제조방법, 및 분리된 세균의 장 내 병원성 여부에 대한 정보제공 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 조성물은 기존에 전혀 알려져 있지 않았던 기작에 따라 세균에 의한 병증을 예방하는 효과를 가진다. 또한, 손쉽게 확인 가능한 기준에 따른 세균의 분류를 통해 손쉽게 치료 전략을 세울 수 있어 추후 세균에 의한 병증의 예방 및 치료 전략 수립에 유용하게 사용될 수 있다.

Description

장 면역활성 조절용 조성물 및 이의 용도
본 발명은 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균을 유효성분으로 포함하는, 우라실 비분비성(URA-) 세균에 대한 항균용 조성물 또는 활성 산소종 포착제(ROS scavenger)를 유효성분으로 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의해 유발되는 세포 손상 예방용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 조성물을 포함하는, 항균용 또는 세포 손상 예방용 식품 또는 사료, 세포의 이중 산화효소 활성, 활성 산소종 생성 또는 활성 산소종 수준을 조절하는 방법 및 이중 산화효소 활성, 활성 산소종 생성 또는 활성 산소종 수준이 조절된 세포의 제조방법, 및 분리된 세균의 장 내 병원성 여부에 대한 정보제공 방법에 관한 것이다.
대부분의 후생동물의 장 상피는 토착성 세균(autochthonous bacteria)에서 외래성 세균(allochthonous bacteria)에 이르기까지 복잡한 미생물 환경을 가지고 있다. 토착성 세균은 숙주 장 환경에 진화적으로 적응하여, 장에 콜로니화(colonization)하여 지속적으로 부착 생활하는 반면, 외래성 세균은 외래로부터 주입되어 소화 경로를 따라 흘러가면서 장 상피에 일시적으로 작용한다. 따라서, 숙주생물들은 상기와 같이 다양하고 끊임없는 외래로부터의 미생물 유입에 대하여, 장 내 미생물 항상성을 유리하기 위한 장 내 면역 시스템을 발전시켜왔다.
즉, 모든 후생동물(metazoan)의 내장은 면역적으로 고유한 환경을 가지고 있다. 구체적으로 외부로부터 유래하는 많은 미생물들 가운데 공생 미생물은 공생할 수 있도록 하는 반면, 병원균은 제거시키는 효율적인 항균 시스템을 가지고 있다. 그러나, 이러한 시스템은 숙주의 면역 세포들이 공생성 세균 또는 병원성 세균에 상관없이 존재하는 공통의 미생물-관련 분자 패턴(microbe-associated molecular patterns, MAMPs)을 인식하여 항균 반응을 일으킨다는 기존에 알려진 이론과 모순된다.
상기 모순을 설명하기 위한 몇 가지의 모델들이 제시된 바 있다. 이에는 패턴 인식 수용체(pattern recognition receptors, PRRs)의 한정적이고 구역화된 발현, NF-kappaB-의존성 선천적 면역 신호전달의 저해 기작 및 점막층에 의한 장 세균의 구역화 등의 모델들이 있다(Hooper et al., Nat Rev Microbiol 7, pp367-374, 2009; Lhocine et al., Cell Host Microbe 4, pp147-158, 2008; Paredes et al., Immunity 35, pp770-779, 2011; Ryu et al., Science 319, pp777-782, 2008). 그러나, 기존 어떠한 모델들도 공생성 세균이 면역반응을 일으키지 않고 공생할 수 있는 분자적 기작에 대하여는 제시하지 못하였다. 이러한 분자적 기작을 이해하게 되면, 유익한 공생 미생물을 공생할 수 있게 하고, 병원균의 제거를 촉진하는 장 내 면역환경을 조절하기 위한 타겟을 확보할 수 있을 것으로 기대되고 있다.
이에, 본 발명자들인 기존 논문에서 초파리(Drosophila)의 장 내 면역에 이중 산화효소(DUOX)의 직접적인 역할에 대하여 발표한 바 있다(Ha et al., Science, Vol. 310, pp847 - 850, 2005). 이는, 유전자 재조합 초파리를 이용하여, 초파리의 점막에서 NADPH 산화효소인 이중 산화효소(dDUOX)가 미생물에 대한 면역활성에 중요한 역할을 한다는 것을 확인하였다. 아울러, 본 발명자는 이러한 이중 산화효소를 조절하는 기작으로 먼저 이중 산화효소의 활성을 조절하는 Gαq-PLCβ-Ca2+ 매개 신호전달이 있으며, 이중 산화효소의 발현을 조절하는 MEKK1-MKK3-p38 MAPK의 순차적 활성을 통한 기작이 있음을 밝힌 바 있다(Ha et al., Dev Cell 16, pp386-397, 2009; Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009b).
병원균 감염은 상기 DUOX-의존적 장 면역 활성 뿐 아니라, IMD(immune deficiency) 신호전달을 활성화시켜, Relish 및 NF-kappaB 단백질의 핵 내 이동을 일으키며, 최종적으로는 AMP 생성을 촉진한다. DUOX-의존적 ROS 및 IMD-의존적 AMP는 장 내에서 시너지 또는 상호 보완적으로 작용한다. 상기 IMD 활성은 세균 표면에 있는 펩티도글리칸에 의하여 촉진되는 것으로 알려져 있다. 그러나, DUOX는 펩티도글리칸에 의하여 활성화되지 않았다. 대신, 단백질 유래 기타 리간드가 G 단백질 공역 수용체(G-protein-coupled receptor, GPCR)를 통하여 DUOX를 활성화한다는 것이 제시된 바 있다(Bae et al., Trends Immunol 31, pp278-287, 2010; Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009b). 외래성 병원균에 대한 매우 효과적인 DUOX-의존적 항균 활성에 불구하고, 토착성 공생 미생물은 여전히 장 내에 콜로니화하여, DUOX 활성없이, 숙주와 공생적 관계를 유지하고 있다. 그러나, 이러한 DUOX-매개 장 면역의 활성에 미생물-유래 어떠한 인자가 작용하는지 아직 알려진 바 없다.
즉, 본 발명자는 상기 이중 산화효소가 미생물 감염시 장 세포의 산화물질 분비를 촉진하여, 장 내 면역활성에 직접적인 역할을 한다는 것을 확인하였다. 다만, 이러한 이중 산화효소에 의한 장 내 면역활성이 공생 미생물에 의해서는 왜 활성화되지 않는지, 면역활성을 일으키는 분자적 기작이 무엇인지는 알려진 바가 없다.
한편, 우라실은 피리미딘 계열의 RNA를 구성하는 핵염기의 하나로, 전사 과정에서 DNA의 아데닌과 상보적으로 결합하여 mRNA를 구성한다. 우라실은 특정 의약적 용도로 사용되고 있지는 않다. 다만, 우라실에 대한 유사체인 플루오로우라실(5'-Fluorouracil, 5'-FU)은 피리미딘계 핵염기에 대한 길항 물질로 작용하여, DNA 합성저해나 RNA 기능장애 등의 핵산 대사 길항작용을 통하여, 대표적인 화학 항암제로 사용되고 있다. 상기 우라실의 유사체 플루오로우라실에 대해서는 일부 소화관 점막의 장애를 일으킬 수 있음이 알려져 있으나, 이는 세포분열 방지 및 세포 변성에 의한 탈락에 의한 것으로 알려져 있을 뿐이다.
본 발명자는 장 내 면역활성을 촉진하는 세균 유래 리간드를 확인하기 위해 예의 노력한 결과, 장 내 이중 산화효소에 의한 활성 산소종 증가 및 면역 활성이 세균에서 분비하는 우라실에 의하여 조절된다는 것을 확인함으로써, 장 내 우라실 수준과 활성 산소종 수준 및 장 내 면역활성과의 관계를 처음으로 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균(opportunistic pathogen)을 유효성분으로 포함하는, 우라실 비분비성(URA-) 세균에 대한 항균용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 활성 산소종 포착제(ROS scavenger)를 유효성분으로 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의해 유발되는 세포 손상 예방용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 항균용 조성물을 포함하는, 항균용 식품 또는 사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 세포 손상 예방용 조성물을 포함하는, 세포 손상 예방용 식품 또는 사료를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균을 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 이중 산화효소 활성 또는 활성 산소종 생성을 촉진하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성 산소종 포착제(ROS scavenger)를 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 활성 산소종 수준을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균을 처리하는 단계를 포함하는, 활성 산소종의 수준이 감소된 세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 활성 산소종 포착제(ROS scavenger)를 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 활성 산소종 수준을 감소시키는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 분리된 세균의 장 내 병원성 여부에 대한 정보제공 방법을 제공하는 것이다.
본 발명에 따른 조성물은 기존에 전혀 알려져 있지 않았던 기작에 따라 세균에 의한 병증을 예방하는 효과를 가진다. 또한, 손쉽게 확인 가능한 기준에 따른 세균의 분류를 통해 손쉽게 치료 전략을 세울 수 있어 추후 세균에 의한 병증의 예방 및 치료 전략 수립에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1은 기회 감염성 병원균이 공생성 미생물과는 달리, DUOX-의존적 장 면역반응을 활성화하는 리간드를 분비한다는 것을 보인 도면이다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다.
구체적으로, 도 1a는 살아있는 박테리아(도 1a), 포르말린-고정 죽은 박테리아(도 1b) 또는 박테리아 배양 상층액(도 1c)을 w1118 (대조군) 또는 UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi) 초파리 종에 처리한 후, R19S 염색을 통하여 ROS 생성을 관찰한 도면이다.
도 1d는 Dipt-lacZ (대조군) 및 Dipt-lacZ; imd1 (IMD-/-) 초파리 종에 전신적 IMD(immune deficiency) 신호전달의 활성화를 확인하였다. 배양 상층액 처리 후 9시간째에 Dipt 발현을 LacZ 염색 및 정량 PCR(± SEM)로 확인하였다.
도 1e는 장에서의 IMD(immune deficiency) 신호전달의 활성화를 Cec 단백질 발현을 통하여 확인하였다. 살아있는 박테리아 또는 포르말린-고정 죽은 박테리아(~1010 이상의 박테리아 세포) 주입 후 9시간째에, Cec 단백질의 발현을 정량 PCR(± SEM)로 확인하였다.
도 2는 다양한 박테리아에 대하여 DUOX-의존적 ROS 생성을 측정한 도면이다.
구체적으로는, 도 2a는 R19S가 포유류 상피세포에서 주요 항균성 ROS인 OSCN-(왼쪽 패널)나 DUOX-의존적 HOCL에서 발생하는 OCl-(오른쪽 패널)에 특이적으로 반응하는지 여부를 확인한 도면이다.
도 2b는 성체 초파리(5~6일령)에 서로 다른 박테리아(E. carotovora 또는 C.intestini ~ 5×108 개 세포)를 경구 투여하고, 투여 후 1, 1.5, 3.5 및 6.5 시간째에 ROS-양성 장의 비율을 시계열적으로 분석한 도면이다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다.
도 2c는 DUOX-의존적 ROS 생성의 공간적 분석으로, 성체 초파리(5~6일령)에 5% 수크로오스 용액 단독 또는 살아있는 박테리아(E. carotovora ~ 5×108 개 세포)를 경구 투여하고 1.5 시간 후에, DUOX-의존적 ROS의 생성을 R19S 염색을 통하여 확인하였다. ROS는 전방 중장(anterior midgut) 부위에서 중점적으로 발생하였다.
도 2d는 다양한 박테리아에 대한 생체 내 ROS 생성을 분석하였다. 성체 초파리(5~6일령)에 다양한 살아있는 박테리아(각 균주별로 5×108개 세포)를 경구 투여하고, 투여 후 1.5 시간째에 ROS-양성 장의 비율을 분석한 도면이다. 사용된 박테리아들은 초파리-유래 공생 균주로 Enterococcus faecalis (F. Leulier laboratory, France) (Storelli et al., Cell Metab 14, pp403-414, 2011); Lactobacillus pentosus (J.-W. Bae laboratory, South Korea); Lactobacillus plantarum CNW10 strain (Douglas laboratory, USA) (Storelli et al., 2011); Acetobacter pasteurianus (J.-W. Bae laboratory, South Korea)를 사용하였으며, 병원균으로는 널리 알려진 E. carotovora 및 Pseudomonas entomophila (Lemaitre laboratory, Swiss)를 사용하였다. 또한, 인간 기회감염성 세균인 E. faecalis-1 (KCTC#3195); E. faecalis-2 (Ferrandon Laboratory, France); Vibrio fluvialis (KCTC#2473); Klebsiella pneumoniae (KCTC#2619); Shigella sonnei (KCTC#2518); Pseudomonas aeruginosa PAO1 (Manoil laboratory, University of Washington); Sarratia marcescens (ATCC#27117)에 대하여도 확인하였다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tukey's post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(**P<0.005, ***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다.
도 2e는 분쇄한 박테리아에 의한 장 내 ROS 생성을 확인한 도면이다. 성체 초파리(5~6일령)에 살아있는 박테리아(E. carotovora ~ 5×108 개 세포) 또는 분쇄한 박테리아(E. carotovora ~ 5×108 개 세포 분쇄)를 경구 투여하고 1.5 시간 후에, ROS-양성 장의 비율을 분석한 도면이다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001).
도 3은 우라실이 DUOX-의존적 장 면역 활성화에 병원균-유래 리간드로 작용하는지를 확인한 도면이다.
구체적으로는, 도 3a는 E. carotovora에 의한 ROS-유도 인자를 분리해내기 위한 HPLC 분석 실험으로, HPLC-정제 fraction을 처리한 후 1.5시간 후에 전방 중장의 ROS 생성을 분석하였다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tukey's post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). 관심 피크(별표)는 포토다이오드 어레이 검출기(파란색)을 이용하여 스펙트럼 분석을 하였다.
도 3b는 우라실이 장의 PLCβ을 활성화시키는 것을 확인한 도면이다. 유전자 재조합 초파리(UAS-PLCβ-RFP; Da-GAL4)에 우라실을 투여하였다(2시간 동안 20nM).
도 3c는 우라실이 Drosophila S2 세포에서 세포 내 Ca2+를 증가시킨다는 것을 확인한 도면이다. 세포에 우라실(20 nM)을 특정 시점(화살표)에 처리하였다.
도 3d는 우라실이 p38의 활성을 촉진한다는 것을 확인한 도면으로, w1118 (대조군) 또는 MEKK1-/- 초파리 종에 우라실을 처리(2시간 동안 20nM)한 후 인산화된 p38을 분석한 도면이다.
도 3e는 우라실이 DUOX의 발현을 촉진한다는 것을 확인한 도면으로, w1118 (대조군) 또는 MEKK1-/- 초파리 종에 우라실을 처리(2시간 동안 20nM)한 후, 한시간 뒤에 DUOX의 발현량을 정량 PCR(± SEM, **P<0.005)로 분석한 도면이다.
도 3f는 우라실이 PLCβ-DUOX-의존적 ROS 생성을 촉진한다는 것을 확인한 도면이다. w1118 (대조군), UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi), 또는 norpA7(PLCβ-/-) 초파리 종에 우라실을 투여한 후(1.5시간 동안 20nM), ROS 생성을 확인하였다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(**P<0.005).
도 4는 병원균-유래 ROS-유도 인자로 우라실을 동정하는 것을 보여준 도면이다.
도 4a는 HPLC에 의해 정제된 E. carotovora의 ROS-유도 프랙션에 대한 2D 1H-13C heteronuclear 다중 연결 상호관련 (HMBC) 스펙트럼 분석 도면이다. 이를 분석하면, HPLC에 의해 정제된 E. carotovora의 ROS-유도 프랙션에는 우라실이 포함되는 것을 확인할 수 있다.
도 4b는 HPLC에 의해 정제된 E. carotovora의 ROS-유도 프랙션에 대한 질량 분석기(Mass spectrometry, MS)를 이용한 분석 결과를 나타낸 도면이다. 분자량과 피크 데이터를 통하여 확인한 결과 분자식이 우라실(C4H4N2O2)과 동일한 것을 확인하였다.
도 4c는 HPLC에 의해 정제된 E. carotovora의 ROS-유도 프랙션과 우라실의 간에 1D 1H-NMR 스펙트럼을 비교한 도면이다.
도 4d는 다양한 박테리아의 우라실 분비량을 정량적으로 분석한 도면이다. 인간으로부터 분리한 Streptococcus pyogenes (KCTC#3096); Lactobacillus gasseri (KCTC#3163); Lactobacillus acidophilus (KCTC#3164); Chryseobacterium indologenes (KCTC#2905); Enterococcus casseliflavus (KCTC#3552); Lactobacillus reuteri (KCTC#3678); Edwardsiella tarda (KCTC#12267); Ewingella americana (KCTC#12690); Vibrio fluvialis (KCTC#2473); Empedobacter brevis (KCTC#2489); Shigella sonnei (KCTC#2518); Klebsiella pneumoniae (KCTC#2619); Streptococcus vestibularis (KCTC#3650); Aneurinibacillus aneurinolyticus (KCTC#3883); Bacillus alcalophilus (KCTC#3884); Acinetobacter junii (KCTC#12406); Acinetobacter schindleri (KCTC#12409); Streptococcus parasanguinis (KCTC#13046) 균주를 사용하였으며, 추가적으로 Pseudomonas entomophila (Bruno Lemaitre, EPFL, Swiss); Listeria monocytogenes (Laboratoire de Microbiologie, INSERM, France); Pseudomonas aeruginosa PAO1 (Manoil laboratory, University of Washington); Enterococcus faecalis; Enterococcus faecalis-2; Staphylococcus aureus; Staphylococcus epidermis (isolated from Drosophila stock in Seoul National University); Lactobacillus casei (Laboratoire de Microbiologie, University of Bourgogne, France); Bacillus thuringiensis (ATCC#10792); Sarratia marcescens (ATCC#27117)균주를 사용하였다. 높은 농도의 우라실을 포함하고 있는 완전 영양 배지에 상기 박테리아 균주 32종을 접종하고, 최소 배지 M9 배지에서 배양하였다. 오직 7개의 박테리아만이 M9 최소 배지에서 증식하였으며, 해당 배양 상층액을 LC-MS/MS으로 분석하였다. 값은 3번의 독립적인 실험에 대한 평균 ± S.D.값을 나타낸다.
도 4e는 장 공생적 박테리아가 우라실에 의한 ROS 생성을 억제하지는 못한다는 것을 보여주는 도면이다. 성체 초파리(5~6일령)에 우라실(20 nM, 1.5 시간) 경구 투여한 후, ROS-양성 장의 비율을 나타낸다. 무균(Germ-free, GF) 초파리 및 각 주요 공생 박테리아를 단일 연관시킨 무세균 초파리(GF + C. intestini, GF + A. pomorum, 및 GF + L. plantarum)를 이용하였다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tukey's post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(*P<0.05, **P<0.005). 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다.
도 4f는 항산화 화합물, N-아세틸 시스테인과 우라실을 같이 투여한 경우, DUOX-의존적 ROS 검출이 사라진다는 것을 확인한 도면이다. 성체 초파리(5~6일령)에 N-아세틸 시스테인(10 mM)과 함께 또는 없이 우라실(20 nM, 1.5 시간)을 경구 투여한 후, HOCL-특이적 R19S 염색을 통하여 중장의 ROS 생성을 시각화하였다. 숫자는 ROS-양성 장의 비율을 의미한다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다. N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다.
도 4g는 우라실이 인간 상피세포에서 DUOX2-의존적 ROS 생성을 촉진한다는 것을 확인한 도면이다. DUOX2 낙다운(knock-down)시키거나 시키지 않은 상태의 장 선암세포 Caco-2(도 4h) 또는 정상 1차 인간 코 상피세포(도 4i)에 우라실(50nM, 15분)을 처리하였다. ROS는 2',7'-dichlorofluorescin diacetate로 측정하였다. DUOX2 낙다운 세포(pLZRS-human DUOX2-shRNA)에서 대조군 세포(pLZRS-control shRNA)에 비하여 내재적 DUOX2 발현 수준은 20% 이하였다. 형광 세기는 Karl Zeiss vision system(KS400, ver. 3.0)에서 측정하였다. 7 개의 값에 대한 평균을 내어 비교하였다. 우라실을 처리하지 않은 상태의 대조군 세포에서의 형광 세기를 1로 하여 값을 나타내었다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tukey's post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌다.
도 5는 우라실이 DUOX-의존적 장 선천적 면역에 특이적인 작용제임을 보여주는 도면이다. 도 5a 내지 5c의 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001).
구체적으로는, 도 5a 및 5b는 다양한 누클레오베이스들(5a) 및 피리미딘 유사체들(5b)을 각각 15분간 20 nM 처리한 다음 ROS 생성을 확인한 도면이다.
도 5c는 w1118(대조군) 또는 Gαq-/- 초파리에 20 nM의 우라실을 1.5시간 처리한 후 ROS 생성량을 비교하여, Gαq가 우라실-유도 ROS 생성에 필요한 인자임을 확인한 도면이다.
도 5d는 우라실이 장 세포의 IMD 신호전달을 활성화시키지 않음을 확인한 도면이다. 우라실(20nM) 또는 살아있는 박테리아(~1010 세포)를 4시간 동안 투여한 후 Cec 발현을 정량 PCR을 통하여 분석하였다(± SEM, ***P<0.001).
도 6은 천연형 E. carotovora와 변이종에 대한 비교 분석이다.
도 6a는 E. carotovora의 Tn5 변이 라이브러리에서 우라실 영양요구성 변이종을 분리하는 스크리닝 전략을 나타낸 모식도이다. 먼저 약 6,000개의 변이종 클론을 우라실 존재 또는 비존재하는 M9 최소 배지에서 배양한 다음, 각 클론의 우라실 영양요구성을 확인한다. 이에 따라, 본 발명의 URA- 변이종을 동정해내었다.
도 6b는 상기 URA-변이종의 Tn5 트랜스포존 삽입 부위를 확인하기 위해서, inverse PCR을 http://labs.fhcrc.org/gottschling/General%20Protocols/ipcr.html에 개시된 방법대로 수행하였다. 이에 사용한 프라이머는 KAN-2 forward primer; 5'-ACC TAC AAC AAA GCT CTC ATC AAC C-3'(서열번호 1) 및 KAN-2 reverse primer; 5'-GCA ATG TAA CAT CAG AGA TTT TGA G-3'(서열번호 2)이다. 서열분석을 통하여 삽입 위치를 추적한 결과, pyrE 유전자 위치인 것을 확인하였다.
도 6c는 상기 제조한 E. carotovora-pyrE::Tn5 균주의 생체 외 증식 속도가 천연형 E. carotovora와 유사함을 확인한 도면이다. 독립적인 3개의 실험 결과에 의한 데이터를 Student's t-test를 통해 분석하고, 값은 평균 ± SEM이다. 분석 결과 URA- 변이 균주와 천연형 균주 사이에 유의미한 차이를 보이지 않았다.
도 6d는 천연형 또는 URA- 변이형 E. carotovora 균주의 주사 전자 현미경(scanning electron microscopic, SEM) 분석을 나타낸 도면이다.
도 6e는 비생물학적 표면(폴리스티렌 플라스틱)에 세균 부착 실험 결과이다. 이를 크리스탈 바이올렛 염색으로 확인했다. 독립적인 3개의 실험 결과에 의한 데이터를 Student's t-test를 통해 분석하고, 값은 평균 ± SEM이다. N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다.
도 6f는 항균 펩타이드 Cecropin의 최소 저해 농도를 확인한 도면이다. Cecropin A1의 최소 저해 농도(minimal inhibitory concentration, MIC)는 균주를 접종한 후, Cecropin A1 농도에 대하여 2배수 표준 희석법을 통해 적응성 실험을 하였다. 18시간 동안 30℃에서 배양한 후, 최소 저해 농도를 확인하였다. 증식은 ELISA reader(Molecular Devices Emax, CA, U.S.A.)를 이용하여 620 nm(OD620)에서 측정하였다.
도 6g는 천연형 균주와 URA- 균주가 전신적 IMD(immune deficiency) 신호전달을 유사한 수준으로 활성화 시키는 것을 확인한 도면이다. Drs-GFP, Dipt-lacZ 유전자를 가지고 있는 성체 초파리(5~6일령)에 살아있는 박테리아(~1010 세포) 농축액 50 nl를 주입한 후, 9시간째에 IMD 신호전달에 의하여 발현 촉진되는 Diptericin 단백질의 발현을 LacZ 염색(왼쪽 패널) 및 실시간 PCR 분석(오른쪽 패널)으로 확인하였다. 투여되지 않은 초파리의 Diptericin 단백질의 발현을 1로 하여 값을 비교하였다. 비교 발현량은 최소 3번의 독립적 실험 결과에 의해 도출된 평균 ± SEM이다. N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다.
도 6h는 천연형 균주와 URA- 균주가 장에서 IMD(immune deficiency) 신호전달을 유사한 수준으로 활성화시키는 것을 확인한 도면이다. 성체 초파리(5~6일령)에 살아있는 살아있는 박테리아(~1010 세포) 농축액 50 nl를 주입한 후, 9시간째에 IMD 신호전달에 의하여 발현 촉진되는 Diptericin 단백질의 발현을 확인하였다. 투여되지 않은 초파리의 Diptericin 단백질의 발현을 1로 하여 값을 비교하였다. 비교 발현량은 최소 3번의 독립적 실험 결과에 의해 도출된 평균 ± SEM이다. N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다.
도 6i는 구아닌 영양요구성 변이균주 및 아데닌 영양요구성 변이균주를 각각 분리하여 삽입위치를 확인한 도면이다. 구아닌 및 아데닌을 포함 또는 비포함한 M9 최소 배지를 이용하는 도 6a의 전략을 사용하여 각 변이체를 분리하고 서열분석을 통하여, 구아닌 영양요구성 변이균주(E. carotovora-guaA::Tn5, 위쪽 패널) 및 아데닌 영양요구성 변이균주(E. carotovora-purC::Tn5, 아래쪽 패널)에서 Tn5가 삽입된 부위를 분석한 결과, 각 변이체에서 Tn5가 각각 guanine monophosphate synthetase(guaA) 및 phosphoribosyl aminoimidazole-succinocarboxamide synthase(purC) 유전자에 삽입된 것을 확인하였다.
도 6j는 구아닌 영양요구성 변이균주 및 아데닌 영양요구성 변이균주의 ROS-생성 능력은 천연형 E. carotovora와 유사하다는 것을 확인한 도면이다. 성체 초파리(5~6일령)에 천연형 또는 상기 영양요구성 변이균주 박테리아(각 균주별로 5 x 108개 세포)를 경구 투여하고, 투여 후 1.5 시간째에 HOCL- 특이적 R19S 염색을 통해 중장의 ROS 생성을 시각화하여, ROS-양성 장의 비율을 측정하였다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다.
도 7는 병원균-유래 우라실이 DUOX-의존적 항균 ROS 생성 및 장 줄기세포 항상성에 필요하다는 것을 확인한 도면이다. URA- E. carotovora 변이균주 처리에 의한 ROS 생성의 감소가 우라실 처리 및 pyrE 유전자 회복에 의하여, 다시 회복되는 것을 확인할 수 있다. 도 7a, 7c 및 7d에서 데이터는 ANOVA에 이은 Tukey's post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001).
도 7a는 천연형 E. carotovora 균주에 의한 ROS 생성에 비하여 URA- E. carotovora 변이균주(E. carotovora-pyrE::Tn5) 처리시 ROS 생성이 현저히 줄어드는 것을 확인하였다. 이러한 ROS 생성의 감소가 우라실 처리 및 pyrE 유전자 회복에 의하여, 다시 회복되는 것을 확인할 수 있다.
도 7b 내지 도 7e는 박테리아 유래 우라실이 상피 세포 재생 프로그램을 조절한다는 것을 보여준다. w1118 (대조군) 및 PLCβ-/- 초파리 종을 이용하여 실험하였다.
도 7b는 escargot-GAL4>UAS-GFP 유전자를 가지고 있는 초파리를 이용하여 천연형 E. carotovora 또는 E. carotovora-pyrE::Tn5(우라실 병용 또는 pyrE 회복) 투여 후 22시간째에, 전방 중장에 escargot-양성 세포를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 7c는 PH3 염색을 통하여 장 줄기세포(intestinal stem cells, ISCs) 증식을 분석한 도면이다.
도 7d는 장벽모세포로의 분화를 분석한 도면이다. Su(H)Gbe-LacZ 초파리를 이용하여 Su(H)Gbe-LacZ 및 Prospero를 분석하였다. 100개의 세포당(DAPI-양성) LacZ-양성 또는 Prospero-양성 세포의 비율을 측정하였다.
도 7e는 Upd3-gal4>UAS-GFP 또는 2XSTAT-GFP 유전자를 가지고 있는 초파리를 이용하여 투여 후 4시간째에, Upd3 프로모터 활성과, STAT 리포터 유전자(GFP)의 활성을 분석하였다.
도 8은 장 감염에 의한 상피 세포의 재생 과정 및 세포 사멸에 대한 시계열적 분석을 보여준다. 초파리에 서로 다른 박테리아(E. carotovora 또는 E. carotovora-pyrE::Tn5 5 x 108 개의 세포)를 포함하는 5% 수크로오스 용액을 경구투여한 후, 16, 24, 48, 및 72 시간째에 수집하였다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tukey's post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001). 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다.
도 8a는 중장에서 PH3-양성 분열기 장 줄기세포를 시계열적으로 비교 정량화한 도면이다. 항-PH3 항체를 이용하여, 감염시키지 않은 초파리(수크로오스만 투여, 투여 후 16시간째)의 분열기의 장 줄기세포를 1로 하여 비교정량하였다.
도 8b는 장벽모세포로의 분화를 시계열적으로 비교한 도면이다. Su(H)Gbe-LacZ 초파리를 이용하여 Su(H)Gbe-LacZ 및 Prospero를 분석하였다. 100개의 세포당(DAPI-양성) LacZ-양성 또는 Prospero-양성 세포의 비율을 측정하였다.
도 8c는 TUNEL 분석을 통하여 세포사멸 비율을 시계열적으로 비교한 도면이다.
도 9는 우라실에 의해서 유도되는 적당한 수준의 면역반응이 숙주의 생존을 위해 필요하다는 것을 확인한 도면이다.
도 9a는 중장에서의 세균 지속을 확인한 도면으로, 투여 후 6시간째에 중장에서의 CFU(colony-forming units)의 수를 측정하였다(각 실험당 n=30). 데이터는 확률을 보정하기 위하여 Kruskal-Wallis 테스트에 이은 Mann-Whitney U 데스트(Bonferroni 보정)를 통해 분석하였다(***P<0.001).
도 9b는 URA- 병원균(E. carotovora-pyrE::Tn5)이 천연형 병원균(E. carotovora)에 비하여 높은 숙주 치사율을 유도하는 것을 개시하고 있다. 그에 반하여, E. carotovora-guaA::Tn5 및 E. carotovora-purC::Tn5는 각각 구아닌 영양요구성 변이체와 아데닌 영양요구성 변이체로 이용하였다. w1118 (Control) 및 UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi) 초파리 종을 이용하였다. 수득된 Kaplan-Meier 데이터를 로그 랭크 분석을 하였다(P<0.001, E. carotovora vs E. carotovora-pyrE::Tn5; E. carotovora-pyrE::Tn5 vs E. carotovora-pyrE::Tn5 +우라실 또는 E. carotovora-pyrE::Tn5 + pyrE).
도 9c는 다양한 유전적 배경을 가진(GF-control, GF-DUOX-RNAi 또는 GF-PLCβ-/-) 무균(Germ-free, GF) 동물을 이용하여 만성적인 우라실 투여에 따른 장 세포 사멸을 확인한 도면이다. 세포 사멸 인덱스(만성적 우라실 투여 20일째)는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(*P<0.05).
도 9d는 다양한 유전적 배경을 가진(GF-control, GF-DUOX-RNAi 또는 GF-PLCβ-/-) 무균(Germ-free, GF) 동물을 이용하여 만성적인 우라실 투여에 따른 숙주의 치사율을 확인한 도면이다. 수득된 Kaplan-Meier 데이터를 로그 랭크 분석한 결과, 우라실 포함 먹이를 준 경우와 보통 먹이를 준 경우에 치사율에 별 차이를 보이지 않는 GF-DUOX-RNAi(P=0.8) 또는 GF-PLCβ-/-(P=0.5)의 경우와는 달리, GF-control의 경우에는 통계학적으로 현저한 차이(P<0.001)를 보였다.
도 10은 우라실이 장 세포에 미치는 생리적 영향을 확인한 도면이다.
도 10a 내지 도 10e는 우라실 섭취가 JAK-STAT 신호전달을 활성화하는 것을 통해서 상피세포의 재생 프로그램을 유도하는 것을 확인한 도면이다. 서로 다른 유전형(w1118 또는 PLCβ-/-)의 성체 초파리(5~6일령)에 우라실(20 nM)이 포함 또는 비포함된 5% 수크로오스 용액을 2 시간 동안 경구투여 하였다. 도 10b 및 도 10c에서 데이터는 student's t-테스트를 통해서 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌다.
도 10a는 escargot-GAL4>UAS-GFP 유전자를 가지고 있는 초파리를 이용하여 천연형 E. carotovora 또는 E. carotovora-pyrE::Tn5(우라실 병용 또는 pyrE 회복) 투여 후 22시간째에, 전방 중장에 escargot-양성 세포를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 10b는 PH3 염색을 통하여 장 줄기세포(intestinal stem cells, ISCs) 증식을 분석한 도면이다.
도 10c는 장벽모세포로의 분화를 분석한 도면이다. Su(H)Gbe-LacZ 초파리를 이용하여 Su(H)Gbe-LacZ 및 Prospero를 분석하였다. 100개의 세포당(DAPI-양성) LacZ-양성 또는 Prospero-양성 세포의 비율을 측정하였다.
도 10d는 Upd3-gal4>UAS-GFP 유전자를 가지고 있는 초파리를 이용하여 투여 후 4시간째에, Upd3 프로모터 활성을 분석하였다.
도 10e는 2XSTAT-GFP 유전자를 가지고 있는 초파리를 이용하여 투여 후 4시간째에, STAT 리포터 유전자(GFP)의 활성을 분석하였다.
도 10f는 상이한 유전적 배경을 가진(w1118 (대조군) 또는 UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi)) 무균(Germ-free, GF) 동물을 이용하여 만성적인 우라실 투여에 따른 장 세포 사멸이 DUOX-의존적으로 일어나는 것을 확인한 도면이다. 상기 성체 초파리(5~6일령)에 7일동안 상이한 농도의 우라실을 포함하는 5% 수크로오스 용액을 경구투여하였다. 세포 사멸 인덱스(만성적 우라실 투여 20일째)는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 행하였다.
도 10g는 상이한 유전적 배경을 가진(w1118 (대조군) 또는 UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi)) 무균(Germ-free, GF) 동물을 이용하여 만성적인 우라실 투여에 따른 숙주의 치사율이 DUOX-의존적으로 일어나는 것을 확인한 도면이다. 상기 성체 초파리(5~6일령)에 7일동안 상이한 농도의 우라실을 포함하는 무균 먹이를 제공하였다. 대략 25 마리의 초파리를 각각 포함하는 3 또는 그 이상의 독립적인 코호트 그룹에서 생존율을 시간을 두고 관찰하였다. 수득된 Kaplan-Meier 데이터를 로그 랭크 분석한 결과, 0.1, 1 또는 10 nM 농도의 우라실 포함 먹이를 준 경우에는 보통 먹이를 준 경우에 치사율에 통계적으로 현저한 차이(P<0.01)를 보이는 반면, 0.001 또는 0.01 nM 농도의 우라실 포함 먹이를 준 경우에는 통계학적으로 유의미성이 확인되지 않았다(0.001nM 우라실 : P=0.147, 0.01nM 우라실 : P=0.107).
도 11은 장 내 서식 G.morbifer이 이의 지속적인 우라실 분비로 인한 만성적인 DUOX 활성에 의하여 대장염을 일으키는 장 내 자연 공생 박테리아로 작용할 수 있음을 확인한 도면이다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트(도 11a, 11c 및 11d) 또는 Tukey's post hoc 테스트(도 11b)로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(*P<0.05, **P<0.005, ***P<0.001).
도 11a는 다양한 유전적 초파리 종(w1118 (대조군), UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi), 또는 norpA7(PLCβ-/-))에 G.morbifer에 의한 ROS 생성을 확인한 도면이다. 기본적 장 내 ROS양은 무균 동물(GF-control, GF-DUOX-RNAi)을 이용하여 측정하였으며, 각각 단일연관시켰다.
도 11b는 다양한 유전적 초파리 종(w1118 (대조군), UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi), 또는 norpA7(PLCβ-/-))에 G.morbifer에 의한 세포사멸 인덱스를 확인한 도면이다.
도 11c는 GF-control 동물을 바탕으로 한 실험에서 G.morbifer의 URA- 변이체(G.morbifer-carA::Tn5)를 이용한 경우에 ROS 생성과 관련된 단일연관성이 없어지는 것을 확인한 도면이다.
도 11d는 GF-control 동물을 바탕으로 한 실험에서 G.morbifer의 URA- 변이체(G.morbifer-carA::Tn5)를 이용한 경우에 세포사멸 인덱스와 관련된 단일연관성이 없어지는 것을 확인한 도면이다.
도 11e는 G.morbifer의 URA- 변이체(G.morbifer-carA::Tn5)가 천연형 G.morbifer만큼이나 장 상피에 콜로니화되는 것을 확인한 도면이다. GF-control 동물을 바탕으로 하여, G.morbifer 또는 G.morbifer-carA::Tn5을 투여하여 13일째되는 날, 중장에서 CFU의 수를 측정하였다. 데이터는 Mann-Whitney U-테스트를 이용하여 분석하였다.
도 11f는 G.morbifer-유래 우라실에 의한 PLCβ-DUOX 신호전달의 만성적인 활성이 숙주의 치사에 직접적인 원인이 된다는 것을 확인한 도면이다. GF-control 바탕으로 한 경우에, G.morbifer 단일연관 또는 G.morbifer-carA::Tn5 단일연관 사이에 현저한 차이(P<0.001)를 보이는 것을 확인할 수 있었다. 그러나, GF-DUOX-RNAi의 경우(P=0.59) 또는 GF-PLCβ-/-의 경우(P=0.47)에는 통계적 유의미성이 확인되지 않았다.
도 12는 G. morbifer 또는 A. pomorum과 ROS의 공존여부와 우라실 영양요구성 G.morbifer 변이체 생성하는 방법을 나타낸 도면이다. 시각화를 위하여, G.morbifer-GFP 및 A.pomorum-GFP를 제조하였다. w1118 (Control), UAS-DUOX-RNAi/+; Da-GAL4 (DUOX-RNAi), and norpA7 (PLCβ-/-) 초파리 종을 이용하였다. G.morbifer-GFP 또는 A.pomorum-GFP와 단일연관한 무균 동물(Control, DUOX-RNAi 및 PLCβ-/-)을 제조하였다.
도 12a는 상기 무균 동물들의 전체 장을 확인한 도면으로, 전장 중장 부위에 G.morbifer와 ROS가 중점적으로 공존하는 것을 확인할 수 있다.
도 12b는 철(iron) 및 구리(copper) 세포 윗부분을 확인한 도면으로, 형태학적으로 커다란 세포가 copper가 축적된 세포로 알려져 있다. control 파리의 전방 중장에서 G.morbifer가 ROS와 공존하는 것을 확인할 수 있다. G.morbifer-단일연관 PLCβ-DUOX 신호전달 변이체 초파리 또는 A.pomorum-단일연관 control 초파리에서 ROS의 생성이 관찰되지 않았다.
도 12c는 A.pomorum 박테리아가 중장 부위의 전방 중장 부위에 특히 중점적으로 콜로니화되어 있는 것을 확인한 도면이다.
도 12d는 우라실 영양요구성 G.morbifer 변이체를 제조하는 것을 개시한 도면이다. 우라실 영양요구성 변이체를 분리하기 위한 스크리닝 전략을 개시하고 있다. 최근에 완성된 G.morbifer 게놈 서열(Kim et al., J Bacteriol 194, 1245, 2012)에 의하면, G.morbifer carA 유전자는 E.coli의 carA 유전자와 51%의 아미노산 서열 상동성을 갖는 것을 알 수 있다. carA 유전자에 변이를 도입하여, 구체적으로는 Rows and Columns PCR 스크리닝 방법을 이용하여 carA 유전자의 open reading frame에 트랜스포존을 포함하고 있는 G.morbifer carA 변이체를 스크리닝하였다. 이를 위하여 사용된 carA 유전자 프라이머는 carA forward primer; 5'-CGG ACT GGA AGC CGT CCG CAA ATG GCG-3'(서열번호 3) 및 carA reverse primer; 5’-CGA AAC GCT CGA AAA GAT AGA AAC TGT C-3'(서열번호 4)이다. 또한, Tn5 트랜스포존이 삽입된 부위를 확인하기 위하여 사용한 프라이머는 KAN-2 forward primer; 5'-ACC TAC AAC AAA GCT CTC ATC AAC C-3'(서열번호 1) 및 KAN-2 reverse primer; 5'-GCA ATG TAA CAT CAG AGA TTT TGA G-3'(서열번호 2)이다. 이를 통해, G.morbifer-carA::Tn5 변이체 후보 클론을 수득하였다.
도 12e는 상기 G.morbifer-carA::Tn5 변이체 후보 클론을 EZ::TN5TM <KAN-2>Tnp TransposomeTM 키트 (Epicentre)를 이용하여 확인하여 트랜스포존이 carA 유전자 사이에 삽입되었는지 확인한 결과를 도식으로 나타낸 도면이다.
도 13은 장 내 서식 L.brevis가 이의 지속적인 우라실 분비로 인한 만성적인 DUOX 활성에 의하여 대장염을 일으키는 장 내 자연 공생 박테리아로 작용할 수 있음을 확인한 도면이다. URA- L.brevis 변이균주를 제조하기 위해서, 2 단계 상동 재조합 방법(two-step homologous recombination method, Barthelmebs et al., Appl Environ Microbiol 66, pp3368-3375, 2000)을 이용하여 carA 유전자 71번째 아미노산으로부터 281번째 아미노산을 제거한 L.brevisΔcarA 균주를 제조하였다.
도 13a는 상이한 유전적 초파리 종(w1118 (대조군) 또는 norpA7(PLCβ-/-))에서 URA- L.brevis 변이체(L.brevisΔcarA)와는 달리 천연형 L.brevis의 콜로니화는 PLCβ-의존적으로 만성적인 ROS 생성을 촉진한다는 것을 확인한 도면이다. 각기 다른 유전적 배경을 갖는 무균 동물(GF-control, GF-PLCβ-/-)을 상이한 공생 박테리아(~106 CFU)와 각각 단일연관시켰다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tamhane's T2 post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 이루어졌으며, 각 실험당 n= 20 이상이다.
도 13b는 상이한 유전적 초파리 종(GF-control 또는 GF-PLCβ-/-)를 천연형 L.brevis 또는 URA- L.brevis 변이체(L.brevisΔcarA)와 단일연관시킨 결과를 나타낸 도면이다. 데이터는 ANOVA에 이은 Tukey's post hoc 테스트로 분석하였고, 값은 평균 ± SEM을 나타낸다(***P<0.001). N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다. 각 실험은 독립적으로 최소한 3번 반복하여 행하였다.
도 13c는 URA- L.brevis 변이체(L.brevisΔcarA)가 천연형 L.brevis만큼이나 장 상피에 콜로니화되는 것을 확인한 도면이다. GF-control 동물과 L.brevis 또는 URA- L.brevis 변이체(L.brevisΔcarA)와 단일연관시킨 다음, 이로부터 중장을 균일화하여 희석하였다. 이를 MRS 아가 플레이트에 배양하여, 각 중장별 CFU를 측정하였다. 데이터는 Mann-Whitney U-테스트로 분석하였다(n=20). 통계학적인 의미있는 차이를 확인하지 못하였다. N.S.는 유의미성이 없음을 의미한다.
도 13d는 L.brevis-유래 우라실에 의한 PLCβ-DUOX 신호전달의 만성적인 활성이 숙주의 치사에 직접적인 원인이 된다는 것을 확인한 도면이다. 상이한 유전적 초파리 종(GF-control 또는 GF-PLCβ-/-)에 대하여 L.brevis 또는 URA- L.brevis 변이체(L.brevisΔcarA)와 단일연관시켰다. 모든 경우에 있어서, 대략 25 마리의 초파리를 각각 포함하는 3 또는 그 이상의 독립적인 코호트 그룹에서 생존율을 시간을 두고 관찰하였다. 수득된 Kaplan-Meier 데이터를 로그 랭크 분석한 결과, GF-control 바탕으로 한 경우에, L.brevis 단일연관 경우와 URA- L.brevis 변이체(L.brevisΔcarA) 단일연관 경우에서 현저한 차이(P<0.01)를 보였다. 그러나, GF-PLCβ-/-의 경우에는 통계적 유의미성이 확인되지 않았다(P=0.694).
도 14는 우라실에 의한 장-미생물 공생성 및 장-미생물 병원성에 대한 모델을 도식화한 도면이다. 박테리아 접촉은 하기 4가지 분류로 나눠질 수 있다. 즉, URA+ 외래성 박테리아 접촉에 의하여 장 면역이 활성화되는 경우(A), URA- 외래성 박테리아 접촉에 의하여 불충분한 장 면역이 일어나는 경우(B), URA+ 토착성 박테리아 접촉에 의하여 장 면역이 만성적으로 활성화되는 경우(C) 및 URA- 토착성 박테리아 접촉에 의하여 면역 적응성 및 장-미생물 공생을 이루는 경우이다.
상기 목적을 달성하기 위한 일 양태로서, 본 발명은 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균을 유효성분으로 포함하는, 우라실 비분비성(URA-) 세균에 대한 항균용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "우라실"은 피리미딘 계열의 RNA를 구성하는 핵염기의 하나를 의미하며, C4H4N2O2 화학식으로 이루어져 있고, 전사 과정에서 DNA의 아데닌과 상보적으로 결합하여 mRNA를 구성한다. 본 발명에서 우라실은 PLCβ-DUOX 신호전달을 통한 ROS 생성 촉진의 기능을 하는 한 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체를 모두 포함할 수 있다.
본 발명에서 우라실은 항균용 조성물로 사용됨에 있어 우라실 전구체, 우라실 유사체, 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물과 함께 사용될 수 있으며, 기존 항균성 조성물, 항균 물질들과 함께 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "우라실 전구체"는 생물적 또는 화학적 특정 반응을 거치면 우라실로 전환되는 물질을 의미하며, 구체적으로 생체 내에 투여시 생체 내 기작에 의하여 우라실로 전환되는 물질일 수 있다. 또한, 우라실보다 조성물 상태에서 화학적 안정성, 보관 용이성을 갖는 물질일 수 있다.
본 발명에서 용어, "우라실 유사체"는 생체 내에서 우라실과 유사한 PLCβ-DUOX 신호전달을 통한 ROS 생성 촉진의 기능을 하는 우라실과 유사한 모든 물질을 포함할 수 있다. 또한, 우라실보다 조성물 상태에서 화학적 안정성, 보관 용이성을 갖는 물질일 수 있다.
본 발명에서 용어, "우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균"은 해당 미생물이 생체에 투여시 무해함을 기본으로 하며, 우라실을 분비하는 능력을 가진 미생물은 제한없이 포함할 수 있다. 이는 해당 미생물로부터 유래한 우라실이 PLCβ-DUOX 신호전달을 통한 ROS 생성 촉진의 기능을 통하여, 접촉된 세포의 면역 활성을 촉진하여 다른 병원성 세균에 대한 면역 활성을 촉진할 수 있다.
곧, 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 및 우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균은 이중 산화효소(dual oxidase, DUOX)를 활성화하는 기능을 하며, 구체적으로는, 선행 기작인 PLCβ의 활성화를 통하여, DUOX가 활성화되고, DUOX의 활성화를 통하여 ROS의 생성을 촉진하는 기능을 한다. 이렇게 생성이 촉진된 ROS는 결론적으로 세포의 면역활성을 높여 각종 항균 기능을 한다. DUOX의 활성화와 ROS의 생성 촉진에 대한 자세한 기작은 Ha et al. (Science 310, pp847-850, 2005)에 나타난 바와 같다.
상기 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 및 우라실을 분비하는 기회 감염성 병원균의 세포의 면역활성을 높이는 기작들은 장 내 세포, 예를 들어, 장 상피 세포에서 이루어지는 것일 수 있다. 상기 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물은 장 내 세포에서 PLCβ 및/또는 이중 산화효소(dual oxidase, DUOX)를 활성화시키는 것일 수 있으며, 상기 이중 산화효소의 활성화는 장 내 세포의 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS) 수준을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 용어, "우라실 비분비성(URA-) 세균"은 해당 세균을 생육하는데 있어, 우라실을 별도로 공급해줘야만 하는 세균 뿐 아니라, 특정 환경에서 우라실을 분비하지 않는 세균을 총체적으로 의미한다.
본 발명에서는 해당 세균을 배양하는데 있어, 우라실을 합성하지 못한다는 점보다는 우라실을 분비하는 능력이 없어 PLCβ-DUOX 신호전달을 활성화시키지 않는 세균을 의미한다. 곧, 우라실을 합성 또는 분비하지 못하는 특성으로 인하여, PLCβ-DUOX 신호전달을 통한 ROS 생성 촉진을 통한 면역활성 또한 활성화하지 못하는 세균을 의미한다. 면역활성을 활성화하지 못함에 따라, ROS에 의한 공격도 받지 않고 생존 가능성이 높아지게 된다.
본 발명에서 우라실 비분비성 세균은 외래성(allochthonous) 세균일 수 있다.
본 발명에서 용어, "외래성 세균"이란 외래에서 투입되어 상피 세포와 접촉하여 병증이나 반응 등을 일으키게 되더라도, 상피 세포에 콜로니화(colonization, 토착화)를 하는 기능이 없는 세균을 의미한다. 곧, 숙주 세포의 특정 부위에 정착하여 세균 종을 이루는 특성이 없는 세균을 의미한다.
본 발명에서 용어, "항균"은 균에 저항하는 능력을 의미하며, 세균이나 곰팡이와 같은 미생물의 작용으로부터 방어하기 위해 이루어지는 모든 기작을 의미한다.
본 발명에서 용어, "세균"은 박테리아에 속하는 생물로서, 생명체들 중에 가장 많이 번성한 종으로 대부분 병원성 균이며 원핵생물의 특징을 그대로 가지고 있으나, 핵막이나 미토콘드리아, 엽록체와 같은 구조는 가지고 있지 않다. 크기는 0.5 μm 부터 0.5 mm 까지 다양하다. 상기 세균에는 예를 들어, 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 에스케리치아 콜리(Escherichia coli), 슈도모나스 아에루기노사(Paeudomonas aeruginosa)이 포함되나, 본 발명의 조성물에 의해 상기 미생물의 작용이 방어되는 미생물을 제한없이 포함된다.
본 발명의 항균용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 본 발명의 유효성분뿐만 아니라, 항균활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 항균용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 임의의 대상 조성물 또는 성분을 하나의 기관, 또는 신체의 부분으로부터 다른 기관, 또는 신체의 부분으로의 운반 또는 수송하는 것에 관여하는 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질과 같은 제약상 허용가능한 물질, 조성물 또는 비히클을 지칭한다. 본 발명의 조성물은 투여를 위해서 상기 기재한 유효성분 이외에 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 스테아린산 마그네슘 및 광물유를 들 수 있다.
또한, 본 발명의 항균용 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다. 상세하게는 제형화할 경우 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이러한 고형제제는 상기 화학식 1 또는 2의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등을 포함하나, 이에 한정되지 않으며, 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 첨가하여 조제될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제를 포함한다. 비수성 용제 및 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 오일, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
뿐만 아니라, 본 발명의 항균용 조성물은 목적하는 방법에 따라 경구 투여하거나 비경구 투여(예를 들어, 정맥 내, 피하, 복강 내 또는 국소에 적용)할 수 있으며, 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 필요에 따라 일일 1회 내지 수회로 나누어 투여할 수 있으며, 세균에 대한 예방 또는 치료를 위하여 단독으로, 또는 수술, 호르몬 치료, 약물 치료 및 생물학적 반응 조절제를 사용하는 방법들과 병용하여 사용할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물은 의약외품 조성물일 수 있다. 즉, 본 발명은 세균에 의한 감염 질환의 예방 또는 개선을 목적으로 의약외품 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 의약외품 조성물은 다른 의약외품 또는 의약외품 성분과 함께 사용할 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 혼합양은 사용 목적(예방, 건강 또는 치료적 처치)에 따라 적합하게 결정될 수 있다. 상기 의약외품 조성물은 소독청결제, 샤워폼, 가그린, 물티슈, 세제비누, 핸드워시, 가습기 충진제, 마스크, 연고제 또는 필터충진제일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
다른 하나의 양태로서, 본 발명은 본 발명의 항균용 조성물을 치료 유효량으로 개체에게 투여하는 단계를 포함하여 우라실 비분비성(URA-) 미생물 또는 우라실 분비가 적은 미생물에 의해 유발되거나 이것이 원인이 되는 감염 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서, "예방"이란, 조성물의 투여에 의해 상기 세균에 의한 감염 질환을 억제시키거나 발병을 지연시키는 모든 행위를 의미하며, "치료"란 조성물의 투여에 의해 세균 감염 질환에 의한 증세가 호전되거나 이롭게 변경하는 모든 행위를 의미하며, 본 발명에서 용어, "개체"란 소, 돼지, 양, 닭, 개, 인간 등을 포함하는 포유동물, 조류 등을 포함하며, 세균 감염 질환이 발병하였거나 발병할 수 있는 인간을 포함한 모든 동물을 의미하고, 본 발명의 조성물을 개체에게 투여함으로써, 상기 질환을 효과적으로 예방 또는 치료할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 우라실에 의해서 유도되는 적당한 수준의 면역반응이 숙주의 생존을 위해 필요하다는 것을 확인하였다(도 9b).
또 다른 양태로서, 본 발명은 우라실 포착제(uracil scavenger), 우라실 길항제(uracil antagonist) 및/또는 생체 내 우라실 수준을 낮출 수 있는 성분을 유효성분으로 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의한 세포 손상 예방용 조성물을 제공한다.
상기 우라실 포착제, 우라실 길항제, 또는 생체 내 우라실 수준을 낮출 수 있는 성분은 우라실 분비성 세균에서 분비된 우라실을 제거하거나, 우라실의 수준을 낮추거나, 우라실의 기능을 억제하는 기능을 하는 것을 제한없이 포함한다. 이를 통하여, 우라실 분비성 세균으로부터 분비된 우라실에 의한 PLCβ의 활성화, DUOX의 활성화 및/또는 ROS의 생성을 억제할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 활성 산소종 포착제(ROS scavenger)를 유효성분으로 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의해 유발되는 세포 손상 예방용 조성물을 제공한다.
본 발명에서 용어, "활성 산소종 포착제(ROS scavenger)"는 활성 산소종(Reactive oxygen species)을 제거하거나 활성을 없애는 물질을 제한없이 포함한다. 이는, 우라실 분비성 세균에서 유래한 우라실에 의하여 활성화된 이중 산화효소에 의해 생성 촉진된 활성 산소종의 수준을 낮추는 것일 수 있다. 또한, 상기 활성 산소종 포착제는 요산, 비리루빈, 비타민C, 비타민E, 카로틴, 라이코펜, 루틴, 카테킨, 플라보노이드, 구리, 아연, 망간, 마그네슘, 철 및 셀레늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 활성 산소종이란 불안정한 상태에 있어 반응성이 높은 산화력을 가진 산소종을 의미한다. 활성 산소종은 강한 반응성을 가지고 있어 생체 내 주요 구성 성분인 지질, 단백질, 핵산 등과 반응하여, 손상을 일으킬 수 있다. 본 발명에서 활성 산소종은 세포가 외래의 미생물을 공격하기 위하여 생산하는 것일 수 있으나, 비록 외래 물질에 대한 공격을 위한 것이라고 하더라도 세포 또한 활성 산소종에 만성적으로 노출됨에 따라 변성, 사멸될 수 있다. 본 발명에서는 PLCβ 및/또는 이중 산화효소(dual oxidase, DUOX)를 활성화에 의하여 생산되는 활성 산소종인 HOCL일 수 있다.
본 발명에서 용어, "우라실 분비성(URA+) 세균"은 스스로 생존에 필요한 우라실을 생산할 뿐 아니라 이를 외부로 분비하는 능력을 가지는 세균을 의미한다.
본 발명에서는 우라실을 생산 및 분비하는 능력을 가짐에 따라, 생체 내에서 세포에 우라실을 분비하고, 우라실에 의하여 활성화되는 PLCβ-DUOX 신호전달을 통한 ROS 생성 촉진을 통한 면역활성을 활성화하는 세균을 의미한다. 면역활성을 활성화함에 따라, 세포의 ROS 생성 촉진을 일으며, 세포의 ROS 수준을 높이게 된다.
본 발명에서 우라실 분비성 세균은 토착성(autochthonous) 세균일 수 있다.
본 발명에서 용어, "토착성(autochthonous) 세균"이란 외래에서 투입되어 상피 세포와 접촉하여 상피 세포에 콜로니화(colonization, 토착화)를 하는 특성이 있는 세균을 의미한다. 곧, 숙주 세포의 특정 부위에 정착하여 세균 종을 이루는 특성을 가지는 세균을 의미한다. 토착성 세균은 일반적으로 생체 내 환경에 진화적으로 적응하여, 생체 내 면역반응으로부터 살아남는 적응을 한 세균을 의미한다. 또한, 이에는 공생적 세균을 포함하며, 공생적 세균의 경우에는 숙주의 생체 내에 정착하여 숙주의 생존에 유익한 기작을 도와주는 기능을 한다. 가령, 소의 경우 식물의 셀룰로오스를 소화하는 각종 미생물을 위에 포함하고 있으며, 이들 미생물이 식물의 셀룰로오스를 흡수 가능한 형태로 바꾸어 주어 숙주인 소의 생존에 필수적인 역할을 하는 공생적 관계를 가지고 있다.
본 발명에서 용어, "세포 손상"은 우라실 분비성 세균에 의하여 발생하는 모든 종류의 세포 손상을 포함하며, 예를 들면 활성 산소종에 의한 산화적 스트레스 일 수 있으나, 이제 제한되는 것은 아니다. 상기 세포는 장 내 세포일 수 있으며, 예를 들어 장 상피 세포일 수 있다. 본 발명에서 세포 손상은, 우라실 분비성 세균에 의해서 PLCβ 및/또는 이중 산화효소(dual oxidase, DUOX)의 활성화에 의해서 증가된 활성 산소종에 의한 것일 수 있다.
본 발명에서, "예방"이란, 조성물의 투여에 의해 상기 세균에 의한 세포 손상을 억제시키거나 병증을 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 세포 손상 예방용 조성물은 약학적 조성물일 수 있다.
본 발명의 세포 손상 예방용 조성물은 본 발명의 활성 산소종 포착제뿐만 아니라, 산화적 스트레스로부터 세포를 보호할 수 있는 각종 항산화 물질 또는 우라실 분비성 세균에 대한 항균활성을 갖는 공지의 유효성분을 1종 이상 더 함유할 수 있다.
또한, 본 발명의 세포 손상 예방용 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가적으로 포함할 수 있다.
본 발명에서의 용어 "약학적으로 허용가능한 담체, 부형제 또는 희석제"는 상기에서 설명한 바와 유사하다. 또한, 약학적 조성물의 제형화, 투여방법 등 역시 상기에서 설명한 바와 유사하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 항균용 조성물을 포함하는, 우라실 비분비성(URA-) 세균에 대한 항균용 식품 또는 사료를 제공한다.
상기 우라실 비분비성 세균은 상기 설명과 유사하다.
본 발명의 상기 항균용 조성물을 포함하는 항균용 식품은 특별히 제한되지 않고, 상기 식품첨가제에 포함되는 조성물의 함량 역시 특별히 제한되지 않으며, 이들은 다양한 세균의 감염 용이성, 감염 정도를 감안하여 당업자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 항균용 조성물을 포함하는 식품의 예로는 육류, 소세지, 빵, 쵸코렛, 캔디류, 스넥류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차, 드링크제, 알코올 음료 및 비타민 복합제 등이 있고, 통상적인 의미에서의 건강기능식품을 모두 포함할 수 있으며, 동물을 위한 사료로 이용되는 식품을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 항균용 조성물이 음료에 첨가되어 사용될 경우에는 통상의 음료와 같이 여러 가지 감미제, 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 포도당, 과당과 같은 모노사카라이드, 말토스, 수크로스와 같은 디사카라이드, 덱스트린, 사이클로덱스트린과 같은 폴리사카라이드, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨과 같은 당알콜일 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 항균용 조성물이 함유된 식품 100 ㎖ 당 예를 들어 약 0.01 내지 0.04g, 구체적으로는 0.02 내지 0.03g일 수 있다. 상기 감미제는 타우마틴, 스테비아 추출물과 같은 천연 감미제 및 사카린, 아스파르탐과 같은 합성 감미제일 수 있다.
상기 외에 본 발명의 항균용 조성물을 함유하는 식품은 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 천연 과일쥬스, 과일쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다.
상기 식품과 마찬가지로, 상기 항균용 조성물이 사용될 수 있는 항균용 사료는 특별히 제한되지 않고, 상기 사료에 포함되는 항균용 조성물의 함량 역시 특별히 제한되지 않으며, 이들은 다양한 세균의 감염 용이성, 감염 정도를 감안하여 당업자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 세포 손상 예방용 조성물을 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의해 유발되는 세포 손상 예방용 식품 또는 사료를 제공한다.
본 발명의 상기 세포 손상 예방용 조성물을 포함하는 세포 손상 예방용 식품은 특별히 제한되지 않고, 상기 식품첨가제에 포함되는 조성물의 함량 역시 특별히 제한되지 않으며, 이들은 다양한 산화적 스트레스의 정도, 세포 손상의 정도를 감안하여 당업자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명의 세포 손상 예방용 조성물을 포함하는 식품은 상기 항균용 조성물을 포함하는 식품에서 설명한 바와 유사하다.
상기 식품과 마찬가지로, 상기 세포 손상 예방용 조성물이 사용될 수 있는 세포 손상 예방용 사료는 특별히 제한되지 않고, 상기 사료에 포함되는 세포 손상 예방용 조성물의 함량 역시 특별히 제한되지 않으며, 이들은 다양한 산화적 스트레스의 정도, 세포 손상의 정도를 감안하여 당업자가 필요에 따라 용이하게 결정할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세포에 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 이중 산화효소 활성을 촉진하는 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포에 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 활성 산소종 생성을 촉진하는 방법을 제공한다.
상기 세포는 생체 외 세포(ex vivo), 생체 내 세포(in vivo) 또는 시험관 내 세포(in vitro)일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 장 세포일 수 있으며, 장 줄기세포 또는 장 상피세포일 수 있다.
세포에 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 처리하는 것을 통하여, 상기 설명한 기작에 의하여 PLCβ 및/또는 DUOX를 활성화시키며, DUOX의 활성화에 의하여 ROS의 생성이 촉진된다. 이를 통해 세포의 면역활성을 활성화시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세포에 우라실 포착제, 우라실 길항제 또는 우라실 수준을 낮추는 물질을 처리하는 단계를 포함하는, 활성 산소종 포착제를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 세포의 활성 산소종 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 세포는 생체 외 세포(ex vivo), 생체 내 세포(in vivo) 또는 시험관 내 세포(in vitro)일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 장 세포일 수 있으며, 장 줄기세포 또는 장 상피세포일 수 있다.
세포에 우라실 포착제, 우라실 길항제 또는 우라실 수준을 낮추는 물질을 처리하는 것을 통하여, 상기 설명한 기작에 의하여 우라실에 의한 PLCβ 및/또는 DUOX를 활성화를 막는 것을 통해 ROS의 생성을 억제한다. 이를 통해 세포의 면역활성을 억제시킬 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세포에 활성 산소종 포착제를 처리하는 단계를 포함하는, 활성 산소종 포착제를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 세포의 활성 산소종 수준을 감소시키는 방법을 제공한다.
상기 세포는 생체 외 세포(ex vivo), 생체 내 세포(in vivo) 또는 시험관 내 세포(in vitro)일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 장 세포일 수 있으며, 장 줄기세포 또는 장 상피세포일 수 있다.
본 발명의 활성 산소종 포착제는 상기 설명한 바와 동일하다.
세포에 활성 산소종 포착제를 처리하는 것을 통하여, 상기 설명한 대로 ROS의 수준을 낮추어 산화적 스트레스를 낮춘다. 이를 통해 세포의 산화적 스트레스에 의한 손상을 막을 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세포에 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 이중 산화효소 활성이 촉진된 세포의 제조방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 세포에 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 처리하는 단계를 포함하는, 활성 산소종 생성이 촉진된 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 세포는 생체 외 세포(ex vivo), 생체 내 세포(in vivo) 또는 시험관 내 세포(in vitro)일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 장 세포일 수 있으며, 장 줄기세포 또는 장 상피세포일 수 있다.
세포에 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 처리하는 것을 통하여, 상기 설명한 기작에 의하여 PLCβ 및/또는 DUOX를 활성화시키며, DUOX의 활성화에 의하여 ROS의 생성이 촉진된다. 이를 통해 면역활성이 활성화된 세포를 제조할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세포에 활성 산소종 포착제를 처리하는 단계를 포함하는, 활성 산소종 포착제를 처리하지 않은 대조군에 비하여, 활성 산소종의 수준이 감소된 세포의 제조방법을 제공한다.
상기 세포는 생체 외 세포(ex vivo), 생체 내 세포(in vivo) 또는 시험관 내 세포(in vitro)일 수 있다. 상기 세포는 예를 들어, 장 세포일 수 있으며, 장 줄기세포 또는 장 상피세포일 수 있다.
본 발명의 활성 산소종, 활성 산소종 포착제는 상기 설명한 바와 동일하다.
세포에 활성 산소종 포착제를 처리하는 것을 통하여, 상기 설명한 대로 ROS의 수준을 낮추어 산화적 스트레스를 낮춘다. 이를 통해, 산화적 스트레스에 의한 손상을 낮춘 세포를 제조할 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 세균의 장 내 병원성 여부에 대한 정보제공 방법으로서, (a) 세균의 우라실 생산 여부 및 콜로니화 여부에 따라 우라실 생산-토착성, 우라실 생산-외래성, 우라실 비생산-토착성 및 우라실 비생산-외래성으로 이루어진 군 중에서 하나로 분류하는 단계; 및 (b) 상기 (a)단계에서 세균이 우라실 생산-토착성 또는 우라실 비생산-외래성에 해당하는 경우에 장 내 병원성 세균으로 판단하는 단계를 포함하는, 방법을 제공한다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에서 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 이들에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: 초파리 종 및 사육
본 발명에서는 초파리 계통으로 w 1118 , UAS-PLCβ-RFP(Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009), MEKK1 Ur3 (Inoue et al., Embo J 20, pp5421-5430, 2001), Drs-GFP,Dpt-LacZ(Jung et al., Biotechniques 30, pp594-598, 2001), imd 1 (Lemaitre et al., Proc Natl Acad Sci U S A 92, pp9465-9469, 1995), UAS-DUOX-RNAi (Ha et al., Science 310, pp847-850, 2005), norp 7 (Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009), Gaq 1 (Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009), esg-GAL4>UAS-GFP(Micchelli and Perrimon, Nature 439, pp475-479, 2006), upd3-GAL4>USA-GFP(Agaisse et al., Dev Cell 5, pp441-450, 2003), Su(H)Gbe-LacZ(Bray and Furriols, Curr Biol 11, pp217-221, 2001) 및 Da-GAL4(Giebel et al., Mech Dev 63, pp75-87, 1997)를 사용하였다. 2XSTAT-GFP를 보유한 형질전환 초파리는 JAK-STAT 경로 활성을 모니터링하는데 사용하였다(Bach et al., Gene Expr Patterns 7, pp323-331, 2007).
초파리는 25 ℃에서 사육하였다. 표준 옥수수 가루-한천 배지의 조성은 이전 문헌에서 설명된 바와 동일하게 제작하였다(Shin et al., Science 334, pp670-674, 2011). 아넥신 표준 옥수수 가루-한천 배지는 무균 동물 또는 공생 박테리아와 단일관련된 무균 동물로 실험할 때 사용하였다. 보키닌(bokinin) 및 프로피오닉산(propionic acid)은 아넥신 배지에서 제외하였다.
실시예 2: 박테리아 균주 및 배양 조건
Erwinia carotovora subsp. carotovora-15는 Bruno Lemaitre에서 입수하였다(Buchon et al., Cell Host Microbe 5, pp200-211, 2009b). Commensalibacter intestini A911T, Gluconobacter morbifer G707T, Acetobacter pomorum, Lactobacillus plantarum, 및 Lactobacillus brevis는 본 발명자들의 실험용 초파리에서 분리하였다(Roh et al., Appl Environ Microbiol 74, pp6171-6177, 2008; Ryu et al., Science 319, pp777-782, 2008). 인간에서 동정된 박테리아 균주는 한국생명공학연구원 유전자은행에서 입수하였다. 본 발명자는 E. carotovora 및 G. morbifer에 대해 Tn5-매개 랜덤 라이브러리를 이용하여 두 종류의 URA- 변이 박테리아, E. carotovora-pyrE::Tn5 및 G. morbifer-carA::Tn5를 제작하였다.
구체적인 Tn5-매개 랜덤 변이생성 방법 및 스크리닝 전략은 하기 실시예 및 도 S3 및 S6에 개시하였다. E. carotovora-pyrE::Tn5-pyrE 균주는 E. carotovora-pyrE::Tn5 균주에 pTac3-pyrE를 도입하여 제작하였다. 아프라마이신 내성 유전자를 포함하는 pTac3 발현 벡터는 pTac1 벡터의 버전을 변형하였다(Koo et al., EMBO J 22, pp2614-2622, 2003). 박테리아는 모두 30℃에서 배양하였다. 적당한 항생제를 각각 50 ㎍/ml(아프라마이신) 및 30 ㎍/ml(카나마이신)로 첨가하였다.
실시예 3 : 농축된 박테리아 배양 상층액의 제조
E. carotovora는 M9 최소 배지에서 배양하였다. 모든 공생하는 박테리아들은 M9 최소 성장 배지에서 전혀 성장하지 않으므로, 다양한 비타민 및 아미노산 필수요소를 기존에 개시된 바(Foda and Vaughn, 1953)와 동일하게 시험하였다. 본 발명자는 C. intestini만이 M9 최소 배지에서 p-아미노벤조산(p-aminobenzoic acid, 0.2 mg/ml), 판토텐산(pantothenic acid, 1 mg/ml), 및 니코틴산(nicotinic acid , 0.2 mg/ml)의 첨가에 의해 성장할 수 있음을 확인하였다.
후기 지수기에서, 각 박테리아의 배양 상층액(~105 개의 박테리아 세포에서 유래한 배양 상층액)을 원심분리 및 여과(공극 크기 0.2 mM) 과정을 통해 수득하였다. 배양 상층액을 Speedvac에서 감압 동결건조하였고, 이어서 펠릿을 20 ml의 증류수에 용해하였다. 샘플은 50배 초과 부피의 100% 메탄올을 첨가함으로써 탈염하였다. 원심분리에 이어 Speedvac에서 감압 동결건조하고 펠릿을 20 ml의 증류수에 용해하였다.
실시예 4 : 면역염색 분석
우라실에 의해 유도된 p38 활성을 연구하기 위해, 서로 다른 유전형의 성체 초파리(5~6일령)에 우라실(20 nM)이 포함된 5% 수크로오스 용액을 2 시간 동안 경구투여 하였다. 중장(midguts)을 PBS에서 해부한 다음에 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정하였다. 샘플을 0.1% Triton X-100을 포함한 PBS로 5분 동안 3회 세척하였고, 상기와 동일한 용액에 5% 소 혈청 알부민을 첨가하여 1시간 동안 배양하였다. 그 다음으로 인산화-특이적 항-p38 항체(phospho-specific anti-p38 antibody, 1:500 희석; Millipore, Milford, MA, USA)로 4℃에서 16시간 동안 샘플을 배양하였다. 샘플은 0.1% Triton X-100을 포함한 PBS로 5분 동안 5회 세척하였고, 2차 항체(1:500 희석; Alexa Fluor® 568 염소 항-토끼 IgG; Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 첨가하여 20분 동안 실온에서 배양하였다. 샘플을 0.1% Triton X-100을 포함한 PBS로 5분 동안 3회 세척한 후에, 마운팅 완충액(Vectorshield, Vector Laboratories Inc., Burlingame, CA, USA)으로 마운팅하여 공초점 현미경 LSM 700(Carl Zeiss, Oberkochen, Germany)으로 분석하였다.
상피 세포의 재생 프로그램을 연구하기 위해, 서로 다른 유전형의 성체 초파리(5~6일령)에 우라실(20 nM로 16시간 동안)이 포함된 5% 수크로오스 용액 또는 서로 다른 박테리아(~5 × 108 개의 세포로 E. carotovora, E. carotovora-pyrE::Tn5 및 E. carotovora-pyrE::Tn5-pyrE를 22시간 동안)를 경구투여 하였다. 회복 실험을 위해, 초파리는 URA- 균주(E. carotovora-pyrE::Tn5)와 우라실(1 nM)을 동시섭취하도록 하였다. 장을 해부한 다음에 1차 항체[항-인산-히스톤 H3(anti-phospho-histone H3, 1:2000 희석; Millipore), 항-LacZ (1:1000 희석; Cappel) 또는 항-프로스페로(anti-Prospero, 1:100 희석; Developmental Studies Hybridoma Bank)]로 처리하였다. 이에, 2차 항체로 Alexa Fluor® 568 염소 항-토끼 IgG 또는 Alexa Fluor® 488 염소 항-마우스 IgG(Invitrogen)를 처리하였다. 핵 염색은 DAPI를 이용하였다.
실시예 5 : 장 상피에서의 생체 내 ROS 검출
최근 개발된 HOCl 특이적인 로다민 기반의 염료, R19S를 본 실험에서 사용하였다(Chen et al., Chem Commun (Camb) 47, pp4373-4375, 2011). R19S는 Futurechem(Seoul, South Korea)에서 구입하였다.
박테리아로 인해 유발된 ROS를 측정하기 위해, 서로 다른 유전형의 암컷 성체 초파리(5~6일령)에 서로 다른 자극제, 즉, 농축된 박테리아 배양 상층액(후기 지수기 상태인 ~5 x 107 개의 박테리아 세포들로부터 수득한 배양 상층액에 상당하는), 전술한 농축 박테리아 배양 상층액의 고속액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC) 프랙션, 우라실(20 nM), 또는 살아있는 박테리아(E. carotovora, E. carotovora-pyrE::Tn5, 및 E. carotovora-pyrE::Tn5-pyrE 5 x 108 개의 세포)가 포함된 5% 수크로오스 용액을 R19S가 부재한 채로 30분 동안 경구투여한 후, 이어서 R19S(10 μM)가 존재하는 채로 60분 동안 경구투여하였다.
또한, 무균 동물에서의 기초 ROS 수준을 측정하기 위해, 초파리들은 상기 설명한 바와 같이 각각의 박테리아들(C. intestini, A. pomorum, L. plantarum, G. morbifer, G. morbifer-carA::Tn5, L. brevis 또는 L. brevisDcarA)과 단일연관되도록 실험하였다. 이들 단일연관된 초파리들(13일령)은 R19S(10 μM)을 포함한 5% 수크로오스 용액으로 90분 동안 경구 투여하였다.
상기 R19S의 섭취에 이어서, 중장을 해부하고 4% 포름알데하이드에서 고정하였다. HOCl 수준(ROS 수준)은 LSM700 공초점 현미경(Carl Zeiss)을 이용하여 시각화하였다.
모든 실험에 있어, 각 집단(n=~20) 동물의 R19S-양성인 장은 각각의 독립적인 실험을 통해 측정하였으며, 데이터는 최소 3회 반복된 독립적인 실험으로 나타내었다. 총 내장 샘플의 개수에 대한 R19S-양성인 내장의 개수를 ROS-양성인 내장의 비율로 나타내었다.
실시예 6 : 세포사멸 분석
장기적인 우라실 노출로 인한 장 세포의 세포사멸을 측정하기 위해, 서로 다른 유전형의 무균 성체(5~6일령)를 우라실(1 nM)을 보충한 표준 옥수수 가루-아가 배지에서 20일 동안 유지하였다.
G. morbifer에 의해 유도된 장 세포의 세포사멸을 측정하기 위해, 서로 다른 G. morbifer 균주로 단일연관된 무균 초파리(야생형 G. morbifer 또는 G. morbifer-carA::Tn5)를 사용하였다.
장 세포의 세포사멸을 시간 경과에 따라 분석하기 위해, 기존의 초파리를 서로 다른 박테리아(E. carotovora 또는 E. carotovora-pyrE::Tn5 5 x 108 개의 세포)로 감염시킨 후, 16, 24, 48, 및 72 시간째에 수집하였다.
상기 수집한 암컷 초파리(20일차)의 중장을 세포사멸 분석에 사용하였다. 중장은 PBS에서 해부하였고, 세포사멸 분석은 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스퍼라제-매개된 dUDP 닉 말단 라벨링 방법(terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT)-mediated dUDP nick end labeling method)으로 기존 연구(Ryu et al., Science 319, pp777-782, 2008)에서 설명한 대로 수행하였다.
세포사멸 지수는 다른 구획에서 전체 세포의 수에 대한 세포사멸 세포의 수를 나누고 이에 100을 곱하여 나타내었다.
실시예 7 : GFP 및 LacZ-리포터 분석
esg-GAL4>UAS-GFP를 보유하고 있는 초파리들을 ISC 증식 및 분화의 분석을 위해 사용하였다. 초파리에 우라실(20 nM으로 16시간 동안) 또는 서로 다른 박테리아(E. carotovora, E. carotovora-pyrE::Tn5, 및 E. carotovora-pyrE::Tn5-pyrE ~5 x 108 개의 세포, 22시간 동안)를 포함한 5% 수크로오스 용액을 구강으로 투여하였다. 회복 실험을 위해, 초파리는 또한 URA - 균주(E. carotovora-pyrE::Tn5)와 함께 우라실(1 nM)의 동시섭취하도록 하였다.
Upd3-JAK-STAT 경로의 분석을 위해, Upd3-GAL4>UAS-GFP 또는 2xSTAT-GFP를 보유하고 있는 초파리들에 섭취 시간이 4시간이라는 점을 제외하고 esg-GAL4>UAS-GFP에 대한 상기의 섭취 프로토콜에 설명한 바와 동일하게 우라실 또는 박테리아를 경구로 투여한다.
항생성 펩티드 발현을 분석하기 위해, Drs-GFP, Dipt-LacZ(imd 변이 백그라운드의 존재 또는 부재에서)를 보유한 초파리를 서로 다른 자극제[서로 다른 박테리아의 ~50 nl로 농축된 배양 상층액(~2.5 x 105 개의 박테리아 세포에서 유래한 배양 상층액에 상당하는)]를 주사함으로써 패혈증이 감염되도록 하였다. 지방체의 Dipt-LacZ는 마지막 주사 후 9시간에 실험하였다.
LacZ 염색의 기존의 연구에서 설명한 대로 수행하였다(Kwon et al., J Biol Chem 275, pp19824-19830, 2000).
실시예 8 : PLCβ의 막 내 위치
PLCβ-RFP(UAS-PLCβ-RFP; Da-GAL4)를 보유한 형질전환 초파리를 기존의 연구(Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009)에서 설명한 바와 같이 막에 표적화된 활성 형태의 PLCβ의 모니터링에 사용하였다. 20 nM 우라실을 포함한 5% 수크로오스 용액으로 2시간 동안 초파리(5~6일령)에게 먹이를 공급하였다.
실시예 9 : 실시간 PCR 분석
형광 실시간 PCR은 유전자 발현을 정량하기 위해 수행하였으며, 이중가닥 DNA 염료, SYBR 그린(Perkin Elmer, Waltham, MA, USA)을 사용하였다. Cecropin(센스, 5'-ATG AAC TTC TAC AAC ATC TTC G-3'(서열번호 5); 안티센스, 5'-GGC AGT TGC GGC GAC ATT GGC G-3'(서열번호 6)), Diptericin(센스, 5'-GGC TTA TCC GAT GCC CGA CG-3'(서열번호 7); 안티센스, 5'-TCT GTA GGT GTA GGT GCT TCC C-3'(서열번호 8)), DUOX(센스, 5'-GCT GCA CGC CAA CCA CAA GAG ACT -3'(서열번호 9); 안티센스, 5'- CAC GCG CAG CAG GAT GTA AGG TTT -3'(서열번호 10)), 및 대조군으로서, Rp49(센스, 5'-AGA TCG TGA AGA AGC GCA CCA AG-3'(서열번호 11); 안티센스, 5'-CAC CAG GAA CTT CTT GAA TCC GG-3'(서열번호 12))에 대한 프라이머 쌍을 표적 유전자 전사체의 검출에 이용하였다. SYBR 그린 분석은 제조사의 지시에 따라 ABI PRISM 7700 시스템(PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)을 이용하여 수행하였다. 모든 샘플은 3회 반복하여 분석하였으며, 검출된 mRNA의 양은 대조군의 mRNA로 정규화하였다. 정규화된 데이터는 주기 임계값 분석(cycling threshold analysis)에 따라 주어진 mRNA의 상대적 양을 정량하는 것에 이용되었다. 표적 유전자 발현은 상대적 발현양으로 표현된다.
실시예 10 : 장내 감염 실험 및 생존 분석
후기 지수기 동안에 서로 다른 박테리아(E. carotovora, E. carotovora-pyrE::Tn5, E. carotovora-pyrE::Tn5-pyrE, E. carotovora-guaA::Tn5 및 E. carotovora-purC::Tn5)들을 원심분리하여 수득하였으며, 펠릿은 PBS로 세척하여 5% 수크로오스 용액에 현탁하였다. 기아상태 없이, 감염되어 있는 동안 지속적으로 박테리아를 먹이로 공급하기 위하여 성체 수컷 초파리(5~6일령)들을 서로 다른 박테리아 세포를 포함한 5% 수크로오스 용액으로 적신 여과지를 넣은 유리병으로 이주시켰다. 여과지는 매일 교체하였다. 회복 실험에서, E. carotovora-pyrE::Tn5(+uracil)과 1 nM 우라실의 동시섭취 또는 기능적 pyrE 유전자(+pyrE)를 발현함으로써 유전적으로 회복된 E. carotovora-pyrE::Tn5 균주의 섭취를 이용하였다.
실시예 11 : 박테리아 지속성 분석
E. carotovora 균주(E. carotovora, E. carotovora-pyrE::Tn5 및 E. carotovora-pyrE::Tn5-pyrE)의 장내 지속성을 측정하기 위하여, 암컷 성체 초파리(5~6일령)에 E. carotovora 균주 ~1010 개의 세포를 포함한 5% 수크로오스 용액을 2시간 동안 구강으로 투여하였다. 마지막 섭취 6시간 후에 중장을 해부하였다. 표면을 살균한 중장, 후장, 및 모이 주머니(crop)를 균질화하고 적절하게 희석하여 Luria-Bertani 한천 평판에 도말하고, 각각의 중장으로부터 얼마간의 콜로니 형성 유닛(colony-forming units, CFUs)을 수득하였다. 회복실험에서, E. carotovora-pyrE::Tn5(+uracil)과 1 nM 우라실의 동시섭취 또는 기능적 pyrE 유전자(+pyrE)를 발현함으로써 유전적으로 회복된 E. carotovora-pyrE::Tn5 균주의 섭취를 이용하였다.
실시예 12 : 세포 내 칼슘량 측정
세포 내 Ca2+를 이전 연구에서 설명한 방법을 이용하여 측정하였다(Rosker et al., J Biol Chem 279, pp13696-13704, 2004). 간단히 말하자면, Drosophila S2 세포(대략 108 개 세포)를 10 mM 글루코오스, 140 mM NaCl, 1 mM CaCl2, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 및 10 mM HEPES를 함유한 pH 7.4인 완충액에 2 mM 푸라-2-아세트옥시메틸 에스터(fura-2-acetoxymethyl ester)를 첨가한 용액과 함께 40분 동안 실온에서 로딩하였다. 세포를 10 mM 글루코오스, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 및 10 mM HEPES를 함유한 pH 7.4인 Ca2+ 착염 완충액(Ca2+ chelating buffer)으로 두 번 세척한 다음에, 동일한 완충액에 재현탁하였다. 그런 다음 우라실(20 nM)을 세포에 첨가하였다. 형광은 형광 분광광도계(Shimadzu, Tokyo, Japan)로 0.5초 간격으로 연속 기록(여기 340 및 380 nm 그리고 방출 510 nm)하여 실온에서 모니터링하였다.
실시예 13 : 무균 동물 제조
무균 동물은 이전 연구(Ryu et al., Science 319, pp777-782, 2008)에서 설명한 대로 생산하였다. 무균 Drosophila를 생산하기 위해, 박테리아 세포(대략 106 세포)를 PBS로 2회 세척하고, 무균 배아가 있는 병에 무균 먹이를 넣어 주었다. 상기의 병은 초파리가 다른 미생물에 오염되는 것을 방지하면서 성체 단계에 이를 때까지 살균 세포 배양 후드에 유지하였다. 상기와 같이 생산된 초파리를 본 실험에 사용하였다. 본 실험에서 사용한 공생 박테리아는 C. intestini, A. pomorum, L. plantarum, G. morbifer, G. morbifer-carA::Tn5, L. brevis 및 L. brevisΔcarA이다. 모든 박테리아는 이전 연구(Ryu et al., Science 319, pp777-782, 2008)에서 설명한 바와 같이 L. plantarum를 제외하고는 만니톨 배지에서 배양하였으며, L. brevis의 경우에는 MRS 배지에서 배양하였다.
실시예 14 : 생존 기간 측정
대조군 초파리와 PLCb-DUOX 경로 변이 초파리(PLCb -/- 및 DUOX-RNAi)를 본 실험에서 사용하였다. PLCb -/- 및 DUOX-RNAi 초파리는 일반적인 사육 환경에서는 짧은 수명을 갖고 있으나, 무균 상태에서는 일반적인 수명을 갖는 것으로 알려져 있다(Ha et al., Nat Immunol 10, pp949-957, 2009). 그러므로, 상이한 유전자형을 갖는 이들 초파리의 생존율에 대한 우라실의 효과를 측정하기 위한 본 실험에서는 무균 동물을 사용하였다. 무균 동물은 1 nM 우라실을 함유한 무균 배지에서 사육하였다. 무균 동물을 4-5일 마다 우라실을 함유한 무균 배지를 넣은 멸균처리한 새로운 병으로 옮겨주었다. 실험 전체 과정에 걸쳐 초파리는 무균 상태로 유지하였다. 약 25 마리의 초파리로 이루어진 3 이상의 독립적인 코호트에서 초파리의 생존을 끝까지 모니터링 하였다.
무균 초파리는 G. morbifer 또는 G. morbifer-carA::Tn5과 단일연관하였다. 숙주에 대한 G. morbifer 및 G. morbifer-carA::Tn5의 효과를 측정하기 위해, 단일연관된 초파리를 4-5일 마다 무균 배지를 넣은 멸균처리한 새로운 병으로 옮겨주었다. 실험 전체 과정에 걸쳐 초파리는 무균 상태로 유지하였다. 약 25 마리의 초파리로 이루어진 3 이상의 독립적인 코호트에서 초파리의 생존을 끝까지 모니터링 하였다.
실시예 15 : Tn5-매개 무작위 변이생성
본 발명자는 장 면역에 대한 우라실의 생체 내 역할을 분자 수준에서 이해하기 위해 두 종류의 URA- 변이 박테리아, E. carotovora-pyrE::Tn5 및 G. morbifer-carA::Tn5를 생산하였다. E. carotovora 및 G. morbifer에 대한 무작위 변이 라이브러리를 제조사의 지시에 따라 EZ::TN5TM <KAN-2>Tnp TransposomeTM kit (Epicentre, Madison, WI, USA)를 이용한 Th5로 매개된 무작위 변이생성을 수행함으로써 생성하였다. 전기수용성 박테리아 세포(electrocompetent bacterial cells) 및 전기천공 과정에 대한 준비는 이전의 연구(Shin et al., Science 334, pp670-674, 2011)에서 설명하였다. G. morbifer 및 E. carotovora 각각에서 약 3,000 및 6,000 개의 독립적인 변이 콜로니가 생성되었다. E. carotovora-pyrE::Tn5-pyrE 균주는 pTac3-pyrE를 E. carotovora-pyrE::Tn5에 도입함으로써 생성하였다. 아프라마이신 저항성 유전자를 포함하는 pTac3 발현 벡터는 pTac1 벡터의 버전을 변형하였다(Koo et al., 2003).
실시예 16 : HPLC 분석 측정
상기 실시예 3의 방법을 통하여 ~108 개의 박테리아 세포로부터 유래한 농축 박테리아 배양 상층액을 제조하였다. 배양 상층액은 Waters AtlantisTM C18 컬럼(250 x 4.6 mm 및 공극 크기 5 mm)을 이용하여 메탄올 구배(0-10%)로 280 nm에서 HPLC로 35분 동안 분획하였다.
실시예 17 : NMR 분광 측정
NMR 실험은 Bruker Avance NMR 900 MHz 장치(Mannheim, Germany) 및 Varian Unity INOVA 400 MHz FT-NMR에서 수행하였다. 화학적 시프트(d)는 내부 표준인 테트라메틸실란(tetramethylsilane)에 비교하여 백만분율(ppm)로 보고하였고, 커플링 상수(J values)는 Hertz로 보고하였다. 각각의 HPLC로 분별된 프랙션을 증발시켰으며, 잔여물을 NMR 실험을 위해 산화중수소(deuterium oxide, D2O), 듀테로화 메탄올(deuterated methanol, CH3OH-d 4) 또는 디메틸설폭시화물(dimethyl sulfoxide, DMSO-d 6)에 용해시켰다. 모든 1-차원(1D) 1H NMR 스펙트럼은 13 ppm의 스펙트럼 폭, 8192 데이터 포인트, 및 온도 298 K 또는 308 K로 기록하였다. 2-차원(2D) COSY, TOCSY(혼합시간 88 ms) 및 NOESY(혼합시간 150 및 300 ms을 유지)의 1H-1H 동핵 실험 그리고 HSQC 그리고 HMBC의 1H-13C 및 1H-15N 이형핵 실험을 t2 범위 및 512 증가에서 4096 데이터 포인트로 기록하였다. 90°상 이동된 사인 벨 함수(sine bell function)를 NOESY 데이터의 푸리에 전이(Fourier transformation) 전에 t2 and t1 차원에서 사용한 반면에, 30°상 편향된 사인 벨 함수를 TOCSY 및 COSY에 사용하였다. 최종 스펙트럼 매트릭스는 1H 빈도(F2 및 F1) 차원의 1,024 x 1,024로 구성되었다. HPLC 프랙션으로부터 얻은 생물 활성 요소의 구조를 온전히 결정하기 위해 NMR 양성자 신호 데이터를 NOESY, COSY 및 TOCSY를 포함하는 2D 1H-1H 실험의 조합에 의해 할당하였다. 탄소-탄소 신호 유형은 zgig30 플러스 프로그램 그리고 2D 1H-13C HSQC 및 HMBC 실험을 이용하여 1D DEPT 및 탄소 통합 실험의 조합에 의해 결정하였다. 15N로 표지된 박테리아 배양 상층액은 HPLC로 분획하였고 생물활성 요소 내의 질소원자는 2D 1H-15N HSQC NMR 스펙트럼으로 분석하였다.
실시예 18 : 질량 분석기 측정
질량 분석 실험은 전자 이온화(electron ionization, EI) 공급 장치가 장착된 ABI ESI-TOF 질량 분광기(Applied Biosystems) 또는 GC-2010 질량 분광기(Shimadzu)로 수행하였다. HPLC에 의해 분별된 활성 프랙션은 MS 분석 전에 탈염수에 잔여물을 용해시키는 것을 제외하고, 상기 NMR 샘플 준비 방법에서 설명한 대로 준비하였다.
실시예 19 : LC-MS/MS를 이용한 우라실의 정량적 분석
LC는 바이너리 펌프, 진공 미세디게서(vacuum microdegasser), 컬럼 오븐 및 온도가 조절되는 자동샘플러가 장착된 Agilent 1100(Agilent Technologies, USA)을 이용하여 수행하였다. 분리는 Proshell 120 EC-C18 컬럼 (3.0 × 50 mm; 2.7 μm 입자 크기; Agilent Technologies, USA)에서 달성하였다. 이동상은 유속 0.3 mL/min인 80% 아세토니트릴 수용액으로 구성되었다. 컬럼의 온도는 35℃로 유지하였다. LC는 API 4000 QTRAP (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하였다. 분광계의 주요한 변수들은 수작업으로 다음과 같이 최적화하였다. 분무기 온도 400℃, 분무기 전압 5500 V, 분무(GS1) 기체 50 psi, 가열(GS2) 기체 50 psi, CAD 기체 4 psi. 질량 분광 분석은 우라실의 전구체 이온 및 생산물 이온(m/z에서 전구체 이온 → 생산물 이온: 113.0 → 70.1)을 검출하기 위해 다중 반응 모니터링(multiple reaction monitoring, MRM) 모드로 수행하였다. 모든 데이터는 Analyst software 1.4.2 (Applied Biosystems, USA)에서 처리하였다. 교정 곡선을 위한 표준 용액 및 샘플 용액은 이전 연구에서 보고되었던 방법에서 국소적인 변형을 가미하여 준비하였다(Buchel et al., Biomed Chromatogr, 2012; Mutlu et al., Chem Res Toxicol 25, pp391-399, 2012; Van Dycke et al., J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 878, pp1493-1498, 2010). 원액을 만들기 위해 우라실을 증류수에 용해하였다(최종 농도 1 mg/mL). 교정 곡선을 위한 표준 용액은 원액을 M9 배지로 희석하여 최종농도 8000 ng/mL, 1600 ng/mL, 320 ng/mL, 65 ng/mL, 13 ng/mL 및 0 ng/mL가 되도록 하였다. M9 최소배지에서 배양된 각 박테리아의 배양 상층액(~108 박테리아 세포로부터 얻은 배양 상층액에 상당)을 원심분리 및 여과(공극 크기 0.2 mM)하여 수득하였다. C. intestini는 M9 최소 배지에 p-아미노벤조산(p-aminobenzoic acid, 0.2 mg/ml), 판토텐산(pantothenic acid, 1 mg/ml), 및 니코틴산 (nicotinic acid, 0.2 mg/ml)을 첨가하여 배양하였다. 여과된 박테리아 배양 상층액을 100 μL의 5-브롬화우라실(5-bromouracil; 100 μg/mL 수용액을 만들어 내부 표준으로 사용)과 혼합하고, 3 mL의 9:1 에틸 아세트산:이소 프로필 알코올(v:v)을 넣어 와류-혼합(vortex-mixing)하고 1,100 rpm에서 10분 동안 원심분리하여 추출하였다. 상부 유기층의 분취물(2.4 mL)을 40℃ 질소기체에서 건조하여 증발시켰다. 잔여물은 1분 동안 초음파처리하고 1분 동안 와류-혼합하여 100 μL 메탄올에 용해하였다. 각 샘플의 상층액과 표준 용액을 미세-용량 인서트(용량 250 μL)에 옮기고 최종 용액 5 μL를 분석하기 위해 LC-MS/MS 시스템에 주입하였다.
실시예 20 : C.elegans에서의 ROS 측정
C. elegans를 이전 연구에서 설명한 대로 사육하고 유지하였다(Chavez et al., Infect Immun 77, pp4983-4989, 2009). 이전 연구에서와 같이 L4 단계에 걸쳐 Ce-DUOX1-RNAi 벡터를 보유한 박테리아를 L1 선충에게 먹이로 줌으로써 Ce-DUOX1-RNAi를 도입하였다(Chavez et al., Infect Immun 77, pp4983-4989, 2009). Ce-DUOX1-RNAi를 이용한 표준 먹이 공급 RNAi 과정은 심각한 정도의 치사율을 나타내는 발달 장애를 야기한다. 이전 연구에서 설명한 바와 같이 부분적인 넉다운 효과를 부여하기 위해 Ce-DUOX1-RNAi 박테리아를 대조군 RNAi를 보유하고 있는 박테리아와 1 대 70의 비율로 혼합하였다. 초기 성체 단계에서, 선충을 수득하여 M9 최소 배지로 세척하였다. 선충(~200-300 개체)를 우라실을 함유한 M9 배지(50 ml)가 있는 96 웰(well)에서 20 °C에서 2시간 동안 정치하였다. DUOX-의존적 H2O2는 기본적으로 이전 연구(Chavez et al., Infect Immun 77, pp4983-4989, 2009)에서 설명한 대로 Amplex® UltraRed 용액(Invitrogen) 100 mM 및 겨자무과산화효소(horseradish peroxidase; Sigma) 0.2 Unit/ml를 포함한 반응 완충액 200 ml을 첨가하여 실온에서 2시간 동안 측정하였다. 각 샘플의 형광은 형광 마이크로플레이트 리더를 이용하여 여기파장 530 nm 그리고 방출파장 590 nm로 측정하였다. 표준 곡선은 알고 있는 H2O2의 농도를 이용하여 생성하였다.
실시예 21 : 인간 상피 세포의 분리 및 배양
인간 중비갑계 검체는 연세대학교 의과대학의 기관 감사 위원회에 의해 연구 계획서를 승인 받은 후에 건강한 자원자로부터 증여받았다. 일반 인간 비강 상피(normal human nasal epithelial, NHNE) 세포에 이용하는 배양 시스템은 이전 연구(Yoon et al., Am J Respir Cell Mol Biol 16, pp724-731, 1997; Yoon et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 109, pp594-601, 2000)에서 설명한 바 있다. 간단히 설명하면, 2-계대의 NHNE 세포(1 x 105 세포/배양)를 0.5 ml의 배양 배지가 들어 있는 24.5-mm, 0.45-㎛-공극 Transwell-투명 배양 인서트(Costar Co., Corning, NY, USA)에 접종하였다. 기존 연구(Yoon et al., Ann Otol Rhinol Laryngol 109, pp594-601, 2000)에서 설명된 모든 첨가물을 함유한 기본 상피 성장 배지 및 Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)의 1:1 혼합물에서 세포를 배양하였다. 배지에 잠긴 상태로 첫 9일 동안 성장 배양시키고, 이 기간 동안에는 1일차에 배지를 교환하기 시작하여 매일 배지를 갈아주었다. 공기-액체 접촉면(air-liquid interface, ALI)은 9일차에 최상부의 배지를 제거하고 기저 구획만을 먹이로 제공함으로써 형성하였다. ALI가 형성된 후에 배양 배지는 매일 갈아 주었다. 모든 실험은 ALI가 형성된 3일 후에 수행하였다. American Type Culture Collection(Manassas, VA, USA)로부터 공급받은 인간 장내 Caco-2 선암 세포(Human intestinal Caco-2 adenocarcinoma cells)는 10%(v/v) 소 태아 혈청 및 항생제(페니실린-스트렙토마이신)을 함유한 DMEM에 37℃의 표준 배양 환경으로 유지하였다. 세포들은 12-웰 플레이트에서 성장시켰다.
실시예 22 : 인간 상피 세포에서의 ROS 측정
NHNE 세포 또는 Caco-2 세포를 자극한 후에, 세포를 Hanks' balanced salt solution(HBSS)로 세척하고, 5μM 2',7'디클로로플루오레신 디아세테이트 (2',7'-dichlorofluorescin diacetate, DCF-DA; Molecular Probes, Eugene OR, USA)를 함유한 Krebs-Ringer 용액에 넣어 어두운 곳에서 10분 동안 배양하였다. 세포 외의 ROS를 제거하기 위해 세포를 1 ml HBSS로 최소 5회 세척하였다. 배양 접시는 x20 Neofluor 대물렌즈 및 Zeiss LSM 410 공초점 부가장치를 장착한 Zeiss Axiovert 135 도립 공초점 현미경으로 검경하였다. 여기파장 488 nm 그리고 방출파장 515-540 nm로 형광을 측정하였다. 상대적인 형광 세기의 편균을 구하기 위해 각 배양 접시에서 일곱 곳의 영역을 무작위로 선택하였고, 이들 평균 값을 비교에 이용하였다. 모든 실험은 최소 3회 반복하였다.
실시예 23 : 위형(pseudo-type) 레트로바이러스 생성 및 형질도입
SV40 거대 T-항원 위치화 신호(SV40 large T-antigen nuclear localization signal)에 따른 내재적 리보솜 도입부(internal ribosome entry site, IRES)를 포함하는 셔틀 벡터는 pBS-KS로부터 생성하였다. 인간 DUOX2 mRNA를 표적으로 하는 shRNA(DUOX2 shRNA, 5'-GCC ATC AGG AGT GGC ATA AAT TAG TGA AGC CAC AGA TGT AAT TTA TGC CAC TCC TGA TGG C-3'(서열번호 13))를 제작하였다. 상보적인 단일-사슬 DNA 올리고뉴클레오티드를 어닐링하였고, 셔틀 벡터 5'의 IRES에 삽입하였다. 인간 Duox2 shRNA를 포함하는 DNA 단편를 셔틀벡터에서 분리하여 pLZRS 벡터로 삽입하였다. pLZRS의 shRNA(5'-CAA CAA GAT GAA GAG CAC CAA CTC GAG TTG GTG CTC TTC ATC TTG TTG-3'(서열번호 14))를 대조군으로 사용하였다. 높은 역가의 바이러스를 이전 연구(Kim et al., Neuron 38, pp17-31, 2003)에서 설명한 대로 준비하였다. 수포성 구내염 바이러스 G 단백질을 코딩하는 테트라사이클린-유발성 플라스미드가 번식할 수 있는, 인간 293-유래의 레트로바이러스 패키징 세포주(293GPG)에 플라스미스를 Superfect Reagent(Qiagen, Valencia, CA, USA)를 이용하여 형질감염시켰다. 바이러스가 유도될 때까지 테트라사이클린을 포함한 배지에서 세포를 배양하였다. 3일 이후에 수집된 레트로바이러스를 포함한 상층액(테트라사이클린은 없음)을 0.45 ㎛의 폴리에테르설폰 멤브레인으로 여과하고 초고속원심분리를 이용하여 농축하였다. NHNE 세포 또는 Caco-2 세포를 실험에 앞서 2일 동안 레트로바이러스(감염다중도(Multiplicity of infection, MOI) : 10)로 두 번 처리하였다.
실시예 24 : 통계적 분석
두 샘플을 비교는 스튜던트 t-검정(Student’s t-test) 또는 만-휘트니 U-검정(Mann-Whitney U-test) 중 하나를 이용하였다. 다중 샘플의 비교는 일원배치 분산분석(one-way analysis of variance, ANOVA)을 이용하였다. 캐플란-메이어 로그 순위 검정(log-rank test of the Kaplan-Meier)은 초파리의 생존 실험의 통계적 분석에 이용하였다. 0.05 미만의 P 값을 통계적으로 유의한 것으로 판단하였으며, 모든 통계 분석은 SPSS 소프트웨어(Chicago, IL, USA)를 이용하였다.
상기 실시예를 통한 실험을 통하여 하기 실험예를 도출하였다.
실험예 1 : 세균의 종류에 따른 숙주의 DUOX-의존성 면역반응 측정
1-1. R19S를 이용한 RUOX-의존적 ROS 측정
최근 개발된 HOCl 특이적 로다민 기반의 염료인, R19S를 본 발명의 실험에서 사용하였다. 생체 내 ROS 이미징(사진 분석)을 위해, DUOX-의존적 ROS 검출을 위한 특이적이고 감각적인 방법을 사용하였으며, 이는 최근에 개발된 로다민(rhodamine)-기반 센서인, R19S에 기반했다. R19는 hypothiocyanite (하이포싸이오사이아나이트)를 포함한 DUOX-의존적 HOCl (하이포아염소산)에 매우 특이적이며 다양한 다른 ROS와 반응할 수 없다 (도 2a). 박테리아로 인해 유발된 ROS 및 기초 ROS 수준을 측정하여 이하 실험을 진행하였다.
1-2. 공생성 세균과 기회 감염성 병원균 투여 후 ROS 수준 측정
성인 초파리(Drosophila)에 Erwinia carotovora (에르위니아 카로토보라) 아종(subspecies)인 carotovora-15(카로토보라-15)를 경구로 섭취시켰다. E. carotovora는 초파리(Drosophila)에서 정상적으로 숙주에 해를 끼치지 않지만 숙주 DUOX-의존성 장 면역이 손상되었을 때 심각한 치사율을 일으킬 수 있기 때문에 기회 감염성 병원균으로 여겨지고 있다.
예상대로, E. carotovora는 세균 섭취 후 주로 앞쪽 중간 장 부위에서 1 - 3.5시간에 DUOX-의존적 ROS 생성을 유도할 수 있었다(도 1a, 도 2b, 및 도 2c). 한편, 초파리가 주요 공생성 장 세균을 먹었을 때 세균-유도된 ROS 생성은 기본적인 수준이었다. 참고로, Commensalibacter intestini (장 내 공생세균) A911T, Acetobacter pomorum (아세토박터 포모럼) 및 Lactobacillus plantarum(락토바실러스 플란타룸), 이들이 해당 초파리(Drosophila)의 98%이상 전체 공생적인 집단을 차지한다(도 1a).
보다 더 많은 분석을 한 결과, 다양한 기회 감염성 병원균에 의하여 특이적으로 장 세포의 ROS 생성이 유도되는 반면, 초파리(Drosophila)에서 공생 세균으로 작용하는 세균 종의 대부분은 장 세포에서 ROS 생성을 유도하지 않았다(도 2d). 이 관찰은 초파리에서 공생세균과 병원성 세균 사이의 구분이 생체 내에서 각 세균의 DUOX-활성 능력에 기반하여 만들어진다는 것을 시사한다.
또한, 살아있는 또는 용해된(또는 파쇄된, lysed) E. carotovora와 대조하여, 포르말린-고정된 죽은 E. carotovora는 ROS 생성을 효율적으로 유도하지 않았다. 이는 살아있는 세균의 대사로 인한 분비 물질이 DUOX 활성의 원인이라는 것을 시사한다(도 1b 및 도 2e).
DUOX 활성에 원인이 되는 살아있는 세균-분비된 리간드의 존재를 확인하기 위하여, 다른 세균 종의 배양 상층액(supernatant)을 준비하였다. 루리아-베르타니 배지(Luria-bertani medium)와 같은 완전 세균 성장 배지를 확인했고, 또한 장 세포에서의 ROS 생성을 유도했기 때문에, 최소 성장 배지에서 성장하지 않는 pomorum과 L. plantarum를 제외하고 이러한 실험에서 사용된 모든 세균은 최소 성장 배지에서 성장시켰다. E. carotovora 배양의 상층액이 DUOX-의존적 방법으로 효과적으로 ROS 생성을 유도한다는 것을 확인했으나, 반면에 Relish(랠리쉬)/NF-кB(NF-카파B)-의존성 항미생물 펩티드(antimicrobial peptide, AMP) 비슷한 유도 수준에 의해 증거가 되기 때문에 C. intestini 배양 상층액은 그렇지 않다는 것을 확인했다(도 1c). 이러한 DUOX-의존적 장 면역의 다른 활성과 대비하여, E. carotovora와 C. intestini 모두의 배양 상층액은 전신적 면역에서 immune deficiency (IMD) 경로 활성의 비교적 수준으로 이어진다(그림 1D). 게다가, 포르말린-고정된 죽은 세균이 아닌, 살아있는 세균과의 장 감염 실험을 통해 그람-음성 병원균과 그람-음성 공생 세균 모두가 장의 면역결핍 경로 활성과 비슷한 것을 나타내는 것을 확인하였다(도 1e). 이러한 결과는 E. carotovora 및 C. intestini 양쪽 모두 알려진 IMD경로 활성 MAMP인, 비슷한 수준의 펩티도글리칸을 분비한다는 것을 나타낸다. 종합해 보면, 이러한 발견은 2개의 명확한 기전인 IMD와 DUOX 활성 경로가 병원체에 대한 면역반응을 만들기 위해 수반하여 작동한다는 것을 시사한다. C. intestini가 아닌 E. carotovoara가 DUOX 활성을 유도할 수 있기 때문에, E. carotovoara가 장의 DUOX 활성을 위해 미지의 리간드를 분비할 수도 있다.
실험예 2 : DUOX-활성 리간드 분석
DUOX-활성 리간드의 분자적 성질을 결정하기 위하여, E. carotovora 배양 상층액을 역상-HPLC(역상 고속 액체 크로마토그래피, reverse phase-high performance liquid chromatography)으로 정제하였다.
HPLC-정제된 조각(분획, fractions)의 DUOX-활성 및 ROS-유도 능력을 조사하였으며, E. carotovora 배양 상층액에서 발견된 조각이 생체 내 장 상피에서 ROS 생성을 강하게 유도한다는 것을 보여 준 반면에, C. intestini 배양 상층액에서 비슷한 보존시간을 가진 피크는 어떠한 활성을 가지지 않았다 (도 3a). HPLC-정제된 조각을 질량스펙트로미터 분석법(mass spectrometry)과 핵자기공명법(NMR)에 의해 순차적으로 구조 분석을 받았다. 화학적 분석으로 이 조각이 우라실을 포함하고 있다는 것을 밝혀냈다(도 4a 및 도 4b). HPLC-정제된 우라실을 스펙트럼 분석(도 3a)과 NMR 분석(도 4c)에 의해 합성된 우라실과 비교했을 때, 프로파일이 동일하였는바, 병원체-유도된 DUOX-활성 리간드는 우라실이라는 것을 확인하였다.
우라실 분비가 인간 병원체를 포함한 넓은 범위의 세균에서 일어나는 지 여부를 더 조사하기 위하여, 본 발명자는 시험관 내 배양된 세균의 상층액에서 LC-MS/MS(액체크로마토그래피-병렬 질량분석기, liquid chromatography-tandem mass spectrometry)에서 우라실의 정량 분석을 수행하였다. 루리아-베르타니 배지와 같은 완전 배지는 높은 양의 우라실을 포함하고 있는 것이 확인되었으며(~10 g/ml), 세균으로부터 분비된 우라실 수준을 측정하기 위하여 최소 성장 배지가 사용되었다. 32개의 시험한 종들 중에서 단지 7개의 세균 종이 최소 배지에서 살 수 있었으며, 이들의 배양 상층액을 LC-MS/MS 분석을 받게 했다. 결과는 비브리오 플루비알리스(Vibrio fluvialis), 폐렴간균(Klebsiella pneumonia), 쉬겔라소네이균(Shigella sonnei), 녹농균(Pseudomonas aeruginosa), 및 세라티아 마르세센스(Serratia marcescens)과 같은 병원체는 상당한 양의 우라실을 분비한다는 것을 보여 주었다(~70-150 ng /108 세포) (도 4d).
위의 결과와 일맥상통하게(도 3a), E. carotovora는 높은 양의 우라실(~200 ng/108 세포)을 분비한 반면에, C. intestini는 그렇지 않았다(도 4d). 결론적으로, 상기 세균들이 DUOX-활성 리간드인 우라실을 분비하는 것을 확인할 수 있었다.
실험예 3 : 우라실의 장의 선천성 면역에 대한 특이적인 효능제 역할
상기 실험 결과, 우라실 섭취가 DUOX-활성 경로(PCL의 활성 형태의 막 분포 및 Ca2+ 동원에 의해 증명된 PLC 활성) (도 3b 및 도 3c)와 DUOX-발현 경로(p38 MAPK 활성화와 DUOX 유전자 유도) 모두를 활성화시킬 수 있다는 것을 보여 주었다(도 3d 및 도 3e). DUOX-조절 경로 모두의 우라실-유도된 활성은 PLCβ-DUOX 신호-의존적 방법에서 많은 양의 장 ROS의 생성으로 이어진다 (도 3f). 장에서 공생 세균의 존재는 우라실의 ROS-생성 능력을 억제할 수 없으며, 이는 공생세균이 우라실-유도된 ROS 생성을 억압할 수 없다는 것을 나타낸다(도 4e). 우라실과 함께 항산화 화학물질인 N-acetyl-cysteine(N-아세틸 시스테인)을 함께 섭취시킨 결과, DUOX-의존적 ROS가 검출되지 않았다(도 3f).
우라실을 농도-의존적으로 처리한 결과, 우라실 처리농도 0.01nM 부터 장세포에서의 ROS 생성을 유도할 수 있고 1-20nM의 범위에서 가장 효과적이라는 것을 보여 주었다(도 5a). 본 발명자가 다양한 우라실-관련 분자의 ROS-유도 능력을 시험했을 때 (다른 푸린과 피리미딘 nucleobase(뉴클레오베이스) 뿐 아니라 5-fluorouracil (플루오르우라실)을 포함한 8개의 다른 피리미딘 유사체), 본 발명자는 단지 우라실만이 DUOX를 활성화할 수 있다는 것을 확인했고(도 5a 및 도 5b), 초파리(Drosophila) 장 상피의 DUOX-의존적 ROS 생성에서 우라실의 높은 특이성을 보여 주었다. 게다가, 우라실은 또한 예쁜꼬마선충(C. elegans)과 인간 점막 상피세포에서 DUOX-의존적 ROS 생성을 활성화할 수 있었다(도 4g 내지 도 4i).
현재, DUOX-의존적 ROS 생성을 위해 어떻게 우라실이 PLCβ-유도된 Ca2+을 활성화하는지는 알지 못한다. 그러나, Gαq 단백질이 우라실 유도 ROS 생성(도 5c)에 필요하고, Gαq-PLCβ-Ca2+ 신호전달이 G 단백질 공역 수용체의 주요 하위 신호전달 이벤트(signal events) 중 하나로 작용한다는 사실은 우라실 인식에 특이적 G 단백질 공역 수용체가 관여할 수 있음을 시사한다(Selbie와 Hill, 1998). DUOX 경로를 활성화하기 위한 능력에 반해서, 우라실은 AMP 생산으로 이어지는 장 IMD 경로를 활성화할 수 없었다(도 3d). 이러한 결과는 우라실이 DUOX-의존적 ROS 생산을 유도할 수 있으나 IMD-의존적 AMP 생산 경로와는 무관한, 장의 선천성 면역에 대한 특이적인 효능제라는 것을 보여주었다.
실험예 4 : 우라실 비생산성 변이체를 이용한 우라실 생산여부와 병원성과의 관계 분석
위의 모든 결과는 병원체-유래된 우라실을 감지함에 의해 장 상피가 병원체에 대한 DUOX-의존적 항미생물 프로그램을 선택적으로 만든다는 것을 시사한다. 우라실 생산이 없는 기회 감염성 병원체가 DUOX 면역을 피할 수 있으며 숙주에 치명적이 되는 것으로 추론하였다. 생체 내에서 DUOX 활성에 대한 병원체-분비된 우라실의 역할을 평가하기 위하여 우라실 생합성 능력이 없는 우라실 영양요구성 돌연변이체(URA - ) 병원체의 감염에 따른 장 ROS 생성을 평가하였다.
우라실 영양요구성 돌연변이체를 제조하기 위하여, 먼저 E. carotovora 돌연변이체 라이브러리를 제조하였다. 이를 위해, E. carotovora 균주에 전이인자(트랜스포존, transposon, 세포 내에서 DNA분자를 스스로 전이할 수 있는 특수한 구조를 가진 DNA의 단위, Tn)인 Tn5-매개된 임의의 돌연변이 생성을 수행하였으며, 그 뒤에 ~6000개의 돌연변이체 균주를 가려내어서 단일한 URA - 균주를 분리하였다(도 6a). 서열 분석으로 이 URA- 균주가 orotate phosphoribosyltransferase 유전자(pyre, 우라실 생합성에 관련된 유전자)내에서 Tn5 삽입을 가짐을 보여 주었다 (도 6b). 세균을 시험관 내에서 배양했을 때, WT와 URA- 균주 사이에 현저한 형태학적 및/또는 생리학적 차이점을 확인하지 못했다(도 6c 내지 도 6f). 게다가, WT 및 URA - 균주 모두 비슷한 수준에서 IMD-의존적 전신적 및 장 AMP 발현을 유도하였다 (도 6g 및 도 6h).
장 감염 실험을 수행한 결과, 구아닌(guanine)과 아데닌(adenine)과 같은 다른 핵산염기(nucleobase) 영양요구성 변이주 돌연변이가 아닌, 상기 우라실 영양요구성 pyrE 돌연변이 균주(E. carotovora-pyrE::Tn5)만이 야생형(WT) 부모 E. carotovora 균주의 장 감염과 비교했을 때 ROS가 현저히 감소하였다(도 7a, 도 6i, 및 도 6j). 게다가, URA - 균주와 우라실을 공동-섭취 또는 기능적으로 회복된 URA- 균주의 섭취(즉, E. carotovora-pyrE:: 이소성으로 pyrE을 발현하는 Tn5 균주)한 경우에, 장에서 감염-유도된 ROS는 정상적인 수준을 보였다(도 7a). 이러한 결과는 숙주가 생체 내에서 세균-유래된 우라실을 감지하여 DUOX-의존적 장 면역을 일으킨다는 것을 시사한다.
실험예 5 : 우라실의 장 줄기세포 및 장 세포 항상성에 미치는 영향
최근에, 장에서 세균 감염과 관련된 상피 손상은 장 줄기세포(ISC) 자극을 통해 장세포(enterocytes)의 재생 프로그램(renewal program)을 가속화시킨다는 것과 이것이 감염에 대한 장 세포의 항상성과 숙주 생존에 필수적이라는 것이 알려진 바 있다. DUOX-의존적 ROS는 최근에 장 감염 동안 ISC 턴오버을 조절하는 데 관여하는 것을 보여 왔으며, 우라실이 상피세포 재생 프로그램을 조절하는 세균-유래된 리간드인지 여부를 확인하였다.
이를 이루기 위하여, 본 발명자는 WT 또는 URA- 균주로 장 감염 실험을 수행하였으며, ICSs, 장 모세포(enteroblasts), 양성세포와 새롭게 합성된 장세포를 확인 가능하게 한 escargot(식용 달팽이)-GAL4>UAS-GFP 시스템을 이용하여 escargot양성 세포를 분석하였다. 이 결과는 많은 수의 escargot-양성 세포가 PLCβ-의존적 방법으로 야생형(WT) 세균-감염된 초파리의 중간 장 부위에 존재하지만, escargot-양성 세포가 상당히 감소되었음을 보여 주었다(도 7b). ICSs가 중간 장 부위에서 분열하는 세포의 유일한 그룹이기 때문에, 유사분열 활동을 정량하기 위하여, 본 발명자는 항-인산화된 히스톤 3 (PH3) 항체를 사용하여 분열하는 세포의 숫자를 더 조사하였다. 이 결과는 야생형(WT) 병원체 감염과 비교했을 때 URA - 병원체 감염 후 PH3-양성 세포의 숫자가 명확히 감소되었음을 보여 주었다 (도 7c 및 도 8a). 본 발명자가 Su(H)Gbe-lacZ(장벽모세포(enteroblasts)에 대해 특이적인 마커)와 Prospero (프로스페로, 장내분비 세포)를 조사했을 때, 본 발명자는 URA - 병원균 감염이 아닌, 야생형(WT) 병원균 감염이 PLCβ-의존적 방법에 의해 장 모세포(enteroblasts)의 숫자를 증가시켰다는 것을 확인하였다(도 7d 및 도 8b). 그러나, 야생형 병원균-감염된 장과 URA - 병원균-감염된 장 사이 관찰된 장 내분비 세포의 숫자는 차이가 없었다(도 7d). URA - 병원균 감염에서 관찰된 이러한 손상된 상피세포 재생 과정과 일치하여, 야생형 병원균-감염된 장에서 보이는 것과 비교하여 URA - 병원균-감염된 장에서 더 현저한 세포사멸을 확인하였다(도 8c). 장세포에서 사이토카인(cytokine) Unpaired-3 (Upd3)의 발현과 ISCs 및 장 모세포(enteroblasts)에서 전사의 janus kinase(야누스 키나아제)-신호 변환기 및 활성물(JAK-STAT) 신호의 이어지는 활성이 장세포 발현에 필수적인 것으로 알려져 있으며, 본 발명자는 세균-유래된 우라실이 Upd3-JAK-STAT 신호 활성에 필수적인지 여부를 조사했다. URA - 병원체 감염 후 야생형(WT) 병원체 감염과 비교했을 때, 리포터 형질전환 초파리의 분석은 URA - 병원체 감염 후 Upd3 발현과 이어지는 STAT 활성을 나타내는 세포의 숫자가 명백히 감소되었다는 것을 보여주었다(도 7e). 중요하게도, URA - 균주와 우라실의 공동 섭취 또는 기능적으로 회복된 URA - 균주는 감염-유도된 Upd3-JAK-STAT 신호 활성의 회복 및 ISC 증식과 분화 뿐만 아니라 장 모세포(enteroblast) 축적에 충분했다(도 7b 내지 도 7e). 병원성-유도된 Upd3-JAK-STAT 경로 활성은 PLC의 부재 하에서 없어졌기 때문에(도 7e), 본 발명자는 세균-유래된 우라실이 교대로 감염-유도된 상피세포 재생의 Upd3-JAK-STAT 경로의 위쪽 이벤트로 작용하는, PLCβ-DUOX-ROS 경로를 활성화시킨다고 결론지을 수 있었다. 게다가, 우라실 단독 섭취는 PLCβ-의존적 방법에서 Upd3-JAK-STAT 경로 활성화와 상피세포 재생 과정을 촉발하는 데 충분했다(도 10a 내지 도 10e). 이러한 모든 결과를 같이 종합해 보면, 세균-유래된 우라실은 장 감염의 동안에 세균-조정된 ISC 턴오버과 장 세포 항상성을 위한 상피세포 재생 프로그램을 맡고 있는 핵심이 되는 주요한 요인이다.
실험예 6 : 세균-유래 우라실의 인식과 숙주의 생존
URA - 병원균으로 감염시킨 경우에는 장 면역반응은 거의 없었는바, 이러한 세균의 장 감염 후 세균의 지속성과 숙주 생존 비율을 조사하였다. 장에서 이러한 세균의 지속됨을 조사한 결과, 중간 장 부위에서 URA - 병원균이 WT 병원균보다 더 길게 지속된다는 것을 확인하였다(도 9a).
세균 지속의 측면에서 소화관의 앞쪽 부분과 뒤쪽 부분에서(즉, 소낭(crop)과 뒤창자(hindgut)) 야생형(WT)과 URA- 병원균 사이에 관찰된 유의미한 차이는 확인되지 않았으며, 이는 장의 중간 부위에서 섭취된 세균이 주로 우라실-조정된 장의 면역에 의해 주로 조절된다는 것을 시사한다. 초파리가 URA-를 우라실과 함께 공동-섭취하게 되거나 기능적으로 회복된 URA- 균주를 섭취하게 되면, 병원체의 오래 계속되는 지속성이 없어졌다(도 9a). 중요하게도, 본 발명자는 초파리가 URA- 병원체 감염에 더 감수성이 있으며, 감염 후 생존율이 좋지 않음을 보였으나, 반면에 초파리는 반대로 야생형(WT) 병원체 또는 다른 핵산염기의 영양요구성 돌연변이체에 의해 영향을 받지 않았다(도 9b). 게다가, 본 발명자는 URA - 균주와 우라실의 공동 섭취 또는 기능적으로 회복된 URA - 균주의 섭취가 숙주의 생존율을 되찾게 하기 충분하다는 것을 확인하였고(도 9b), URA - 병원균-유도된 병리이상은 장 내강에서 우라실이 없음에 기인한다는 것을 보여주고 있다. 종합해 보면, 이러한 결과는 장 감염에 대한 숙주 생존이 병원체-유도된 우라실의 인식과 이어지는 DUOX-의존적 장 면역에 달려있다는 것을 보여준다.
실험예 7 : 장기간 우라실 노출에 의한 DUOX-의존성 장 면역반응의 만성적 활성의 영향
ROS 조절장애는 점막 상피에서 많은 중요한 질병의 발병기전에 중요한 영향을 준다. 세균 우라실의 DUOX-활성화 및 ROS-생성 능력을 고려하면, 본 발명자는 우라실 구성요소의 노출이 숙주 생리학에 해로운 영향을 미칠 수 있다는 것을 가정했다. PLCβ -/- 와 DUOX-RNAi 초파리는 일반적인 양육 조건에서 짧은 수명주기를 가지며 무균 조건에서는 정상적인 수명을 가지는 것으로 알려져 있기 때문에, 우라실의 장기간 섭취 후 숙주 생리학을 조사하기 위하여 무균동물을 사용하였다. 본 발명자는 장 세포에서 광범위한 세포사멸을 확인했으며, 이는 용량-의존적 방법에서 궁극적으로 대조군 초파리의 치사로 이어진다(도 9c, 도 9d, 도 10f, 및 도 10g). 중요하게는 이 우라실-유도된 숙주 병리이상은 전적으로 PLCβ -/- 또는 DUOX-RNAi 초파리에서는 있지 않으며(도 9c, 도 9d, 도 10f, 및 도 10g), 이는 우라실이 PLCβ-DUOX-의존적 방법에서 숙주 세포 손상을 유도한다는 것을 나타낸다. 종합해 보면, 이러한 결과는 과도한 ROS 생성에 기인하여 장기간 우라실 접촉에 의한 PLCβ-DUOX 신호-의존적 장 면역의 만성적 활성이 숙주에 해롭다는 것을 보여준다. 토착해서 상존하는 장 상주미생물총이 중간 장 상피의 위심막(peritrophic membrane)과 관련되어 영구적으로 살고 있기 때문에, 위의 결과는 구성요소로서 지속적으로 존재하여 우라실을 분비하는 장에 상주하는 토착의 자생 세균이 대장염 생성인자로서 작용해 숙주 병리이상으로 이어질 수 있다는 것을 암시한다.
실시예 12 : 토착성 세균(autochthonous bacteria)의 우라실 분비에 따른 DUOX-의존성 장 면역반응의 만성적 활성의 영향
비록 장의 공생하는 정상 장 세균총의 일부가 일반적으로 숙주 생리학에 이롭지만, 정상 장 세균총을 만드는 하나 또는 그 이상의 정상적인 균주의 과다 성장이 일어나는 조건인 장 세균총 이상(dysbiosis, 혹은 장내 세균 불균형이라고도 함)과 같은 다른 미생물들은 어떤 환경에서는 또한 숙주 발병기전으로도 이어질 수 있다. 비록 그러한 정상 장 세균총의 이상은 염증성 장 질환을 포함하여 많은 질병과 관련이 있어 왔지만, 숙주 병리 이상을 일으키는 장 세균총 이상(dysbiosis)에 의한 분자적 기전은 잘 이해되고 있지 않다. 초파리(Drosophila)에서, IMD-의존적 면역의 과다 활성이 장 세균총 이상(dysbiosis)을 유도할 수 있고, 자연적인 장 정상세균총의 소수 일원인 Gluconobacter morbifer G707T의 과다성장으로 이어질 수 있다는 것을 이전에 보여 주었다. G. morbifer의 과다성장은 장 병리이상과 숙주 치사의 직접적인 원인으로 작용한다. G. morbifer 집단이 장에서 주를 이룰 때, 즉, G. morbifer 하고만 관련이 있는 무균 동물의 경우와 같이 다른 공생하는 공동 미생물의 일원이 없을 때, 본 발명자는 G. morbifer가 장의 중간 부위(midgut)에서 대량서식하고 있는(colonize) 것을 관찰하였다(도 12a). G. morbifer하고만 관련이 있는 동물에서 ROS 생산을 조사했을 때, 본 발명자는 PLCβ-DUOX 신호-의존적 방법에서 심각한 장 세포 세포사멸을 수반하는 만성적인 ROS 생성을 발견하였다(도 11a 및 도 11b). 본 발명자는 G. morbifer-유도된 ROS가 PLCβ-DUOX 신호-의존적 방법으로 대량 서식하는 세균과 같이 대부분 앞쪽 장의 중간 부분에서 강하게 공동 분포하는 것을 더 발견하였다(도 12b). 그러나, A. pomorum, C. intestini, 및 L. plantarum과 같은 다른 공생하는 일원은 이러한 대부분 세균의 각각이 무균동물과 단일관련이 있을 때 만성적인 ROS 생성을 유도할 수 없었다(도 11a, 도 12b, 및 도 12c). G. morbifer-유도된 만성적 DUOX 활성이 장 병리이상의 원인이 될 수 있을 것 같기 때문에, 본 발명자는 장에서 G. morbifer의 영구적인 존재로 의한 구성요소로 지속적인 우라실 분비가 G. morbifer-유도된 숙주 병리기전의 주요한 일반적인 요소가 될 것이라고 가정했다. 카르바모 일인산 합성효소(Carbamoyl phosphate synthetase, carA)의 돌연변이는 우라실 영양요구체를 유도하는 것으로 알려져 있다. 그러므로, 본 발명자는 G. morbifer-유래된 우라실의 생체 내 역할을 증명하기 위하여, 트랜스포존(transposon)-기반의 임의의 돌연변이 라이브러리를 사용하여 ~3,000개의 돌연변이 균주를 가려냄으로써(도 12d 및 도 12e), carA 유전자(G. morbifer-carA::Tn5)를 가지는 G. morbifer의 URA - 돌연변이 균주를 분리하였다. 중요하게도, G. morbifer-carA::Tn5 균주와 함께 무균 초파리의 단일 분리는 이 URA- 균주가 장에서 구성요소로 지속적인 ROS 생성을 일으키지 않았다는 것과(도 11c), 부모 G. morbifer 균주와 대비하여, 현저히 감소된 장 세포사멸로 이어질 수 있다는 것을 보여 주었다(도 11d). 본 발명자가 장에서 대량 서식하는(colonized) 세균의 콜로니 형성 유닛(colony forming units, CFUs)을 조사했을 때 본 발명자는 G. morbifer-carA::Tn5 균주가 야생형(WT) G. morbifer 균주와 같이 효율적으로 장 상피에 대량 서식하는 것을 확인하였으며(도 11e), G. morbifer-carA::Tn5와 단일 관련된 동물의 장에서 확인되는 건강한 숙주 표현형은 대량 서식하는(colonized) 세균 숫자의 감소에 기인하지 않는다는 것을 확인시켜 주었다. 본 발명자가 G. morbifer-단일 관련된 초파리의 생존율을 조사했을 때, 본 발명자는 G. morbifer 균주가 초기 숙주 사망으로 이어질 수 있다는 것을 확인하였으며(도 11f), 이것은 그 발병 속성을 보여준다. 그러나, 중요하게도, G. morbifer-carA::Tn5-단일 관련된 초파리는 대조군 동물의 그것과 비교할 만한 생존율을 보였다(도 11f). 본 발명자가 DUOX-RNAi 또는 PLC -/- 동물의 경우에 G. morbifer 단일관련과 G. morbifer-carA::Tn5 단일 관련 사이에 생존율에서 그 차이를 관찰하지 못 했기 때문에, 대조군 초파리에서 관찰된 G. morbifer-유도된 숙주 치사율은 PLCβ-DUOX 경로의 부재 시에 없어졌으며(도 11f), 이는 G. morbifer-유도된 질병 표현형이 세균의 우라실 생산 또는 숙주 DUOX 활성을 감소시킴으로써 효과적으로 뒤바뀔 수 있음을 보여준다. 게다가, 자연적인 장 정상세균총의 다른 소수의 일원인 그람-양성 L. brevis의 단일 관련은, G. morbier-단일 관련 동물에서 보는 것과 비슷하게 무균 동물과 함께 L. brevis가 우라실-유도된 만성적인 DUOX 활성에 기인한 질병 표현형을 또한 일으킬 수 있다는 것을 보여 주었다. 종합해 보면, 2개의 소수 공생 세균으로부터 우라실의 서방성(천천히 지속적인) 방출과 이어지는 PLCβ-DUOX 신호-의존적 장 면역의 만성적 활성이 대장염 생성과 숙주 치사에 직접적인 원인으로 작용한다는 것을 시사한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그 리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (20)

  1. 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 분비하는 기회감염 병원균(opportunistic pathogen)을 유효성분으로 포함하는, 우라실 비분비성(URA-) 세균에 대한 항균용 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 우라실 영양요구성 세균은 외래성(allochthonous) 세균인 것인, 조성물.
  3. 제1항에 있어서, 상기 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 분비하는 기회감염 병원균은 장 내 세포에서 이중 산화효소(dual oxidase, DUOX)를 활성화시키는 것인, 조성물.
  4. 제3항에 있어서, 상기 이중 산화효소의 활성화는 장 내 세포의 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS) 수준을 증가시키는 것인, 조성물.
  5. 제1항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 우라실 영양요구성(URA-) 세균에 대한 항균용 식품 또는 사료.
  7. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 우라실 비분비성(URA-) 세균의 감염성 질환의 예방 또는 치료 방법.
  8. 제1항에 기재된 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 이중 산화효소 활성을 촉진하는 방법.
  9. 제1항에 기재된 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 세포의 활성 산소종 생성을 촉진하는 방법.
  10. 제1항에 기재된 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 이중 산화효소 활성이 촉진된 세포의 제조 방법.
  11. 제1항에 기재된 우라실, 우라실 전구체, 우라실 유사체 또는 우라실을 생산하는 비병원성 미생물을 세포에 처리하는 단계를 포함하는, 활성 산소종 생성이 촉진된 세포의 제조 방법.
  12. 제8항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 장 상피 세포인 것인, 방법.
  13. 활성 산소종 포착제(ROS scavenger)를 유효성분으로 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의해 유발되는 세포 손상 예방용 조성물.
  14. 제13항에 있어서, 상기 우라실 분비성 세균은 토착성(autochthonous) 세균인 것인, 조성물.
  15. 제13항에 있어서, 상기 활성 산소종 포착제는, 상기 우라실 분비성 세균에서 분비된 우라실에 의하여 활성화된, 이중 산화효소에 의해 생성 촉진된 활성 산소종의 수준을 낮추는 것인, 조성물.
  16. 제13항에 있어서, 상기 세포는 장 내 세포인 것인, 조성물.
  17. 제13항에 있어서, 상기 활성 산소종 포착제는 요산, 비리루빈, 비타민C, 비타민E, 카로틴, 라이코펜, 루틴, 카테킨, 플라보노이드, 구리, 아연, 망간, 마그네슘, 철 및 셀레늄으로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 포함하는 것인, 조성물.
  18. 제13항에 있어서, 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함하는 것인, 조성물.
  19. 제13항 내지 제18항 중 어느 한 항에 기재된 조성물을 포함하는, 우라실 분비성(URA+) 세균에 의한 세포 손상 예방용 식품 또는 사료.
  20. 분리된 세균의 장 내 병원성 여부에 대한 정보제공 방법으로서,
    (a) 세균의 우라실 생산 여부 및 콜로니화 여부에 따라 우라실 생산-토착성, 우라실 생산-외래성, 우라실 비생산-토착성 및 우라실 비생산-외래성으로 이루어진 군 중에서 하나로 분류하는 단계; 및
    (b) 상기 (a)단계에서 세균이 우라실 생산-토착성 또는 우라실 비생산-외래성에 해당하는 경우에 장 내 병원성 세균으로 판단하는 단계를 포함하는, 방법.
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