KR101911893B1

KR101911893B1 - 세균유래 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능이상 조절제

Info

Publication number: KR101911893B1
Application number: KR1020170004428A
Authority: KR
Inventors: 김윤근; 박해심; 박한기; 최영우
Original assignee: 주식회사 엠디헬스케어; 아주대학교산학협력단
Priority date: 2017-01-11
Filing date: 2017-01-11
Publication date: 2018-10-29
Also published as: KR20180082925A

Abstract

본 발명은, 세균유래 소포에 의한 호흡기질환의 예방 또는 치료용 면역조절제에 관한 것으로, 구체적으로 호흡기질환을 일으키는 병원성 세균유래 소포에 함유된 표면 항원 단백질을 함유하는, 세균에서 유래한 소포를 유효성분으로 포함하는 면역조절용 약학적 조성물, 및 이의 제조방법 등을 제공하고자 한다.

Description

세균유래 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능이상 조절제 {Immune modulator for the control of airway immune dysfunction to bacteria-derived extracellular vesicles}

본 발명은 세균유래 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능이상 조절제에 관한 것으로, 구체적으로 세균유래 항원 단백질이 로딩된 세균 유래 세포밖 소포를 유효성분을 함유하는, 호흡기질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 이의 제조방법 등에 관한 것이다.

알레르기는 주변 환경에 존재하는 항원에 노출시 우리 몸에 후천적인 면역반응이 발생하고, 항원에 대한 기억으로 항원에 반복노출 시에 면역반응의 양상이 바뀌는 현상으로 정의할 수 있다. 해로운 항원에 노출 시에 발생하는 알레르기현상은 우리 몸에 이로운 효과를 나타내고, 백신을 통한 면역반응을 유도하는 것이 대표적이다. 반면, 항원이 우리 몸에 들어올 때, 항원에 대한 면역반응이 과도하게 유도되어 과민반응이 발생하면, 우리 몸에 염증반응이 발생하여 과민성 염증질환을 일으키게 된다. 만성비염 및 부비동염은 공기 중 혹은 비강 내 원인 항원에 반복적으로 노출되었을 때 비강 및 부비동에 만성염증이 발생하여 재채기, 콧물, 코막힘 등의 증상이 발생하는 질환이다. 천식은 항원에 대한 기도의 과민반응에 의해 유발되는 기도의 만성염증을 특징으로 하는 질환으로서 염증에 의한 구조적인 변화와 이에 따른 기능적인 변화로 천명, 호흡곤란 등의 증상이 발생하는 질환이다. 또한, 만성폐쇄성폐질환 (COPD)은 천식과 달리 비가역적인 기도폐색을 특징으로 하는 질환으로서, 기도의 만성염증 형태이며, 만성폐쇄성기관지염, 만성폐쇄성세기관지염, 폐기종 등의 질환을 포함한다. 최근 역학연구에서 흡연과 상관없이 COPD 환자에서 폐암의 발생이 증가된다는 보고를 통해, COPD는 폐암 발생의 중요한 위험인자로 인식되고 있다.

한편, 실내공기에는 바실러스(Bacillus sp.), 스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus), 스타필로코커스 에피더미디스(Staphylococcus epidermidis), 슈도모나스 스투체리(Pseudomonas stutzeri), 스트렙토마이세테스(Streptomycetes), 코리네박테리아세아에(Corynebacteriaceae) 등 여러 종류의 세균이 서식한다 [J Appl Microbiol. 1999 Apr;86(4):622-34, BMC Microbiol. 2007 Apr 5;7:27]. 상기 실내공기에서 서식하는 세균에서 유래한 내독소 (lipopolysaccharide, LPS)나 펩티도글리칸 (peptidoglycan) 등에 의해 면역세포 및 폐 표피 세포에서 염증성 사이토카인의 생성이 유도됨이 알려져 있다 [Toxicology. 2005 Nov 5;215(1-2):25-36., Indoor Air. 1999 Dec;9(4):219-25].

세균유래 세포밖 소포(extracellular vesicles; EVs)는 구형의 인지질 이중막으로 20-100 nm의 직경을 가지며, 그람음성세균유래 세포밖 소포인 경우, 생화학 및 프로테옴 연구를 통해 외막 단백질, 지질다당류(lipopolysaccharide; LPS), 외막 지질, DNA, RNA, 및 세포질 내 단백질 등을 포함하고 있음이 보고되었다. 그람양성세균도 세포밖 소포를 분비함이 최근 보고되었고, 세포밖 소포에 포함된 단백질이 질병을 일으킴이 보고되었다.

실내 먼지에는 세균유래 세포밖 소포가 다량 존재하고, 먼지 내 세포밖 소포를 마우스에 투여하였을 때 면역기능이상을 동반한 호중구성 기도염증이 발생함이 보고되었다. 또한, 그람양성세균인 황색포도상구균유래 세포밖 소포에 의해 마우스에서 면역기능이상을 동반한 호중구성 염증이 발생함이 최근 알려지게 되었고, 대표적인 그람음성세균인 대장균에서 유래하는 세포밖 소포에 의해 호중구성 기도염증뿐만 아니라 COPD에서 비가역적인 기도폐색의 주요한 원인인 폐기종이 발생함도 보고되었다.

면역요법에는 질병을 일으키는 항원 물질을 체내로 직접 투여하여 체내에 존재하는 면역세포 활성을 유도하는 능동면역요법 (active immunotherapy)과 단클론 항체와 같이 체외에서 생산한 물질을 투여하여 면역반응을 조절하는 수동면역요법 (passive immunotherapy)로 나눌 수 있다. 질병을 예방하기 위한 방법으로 수동면역요법에 비하여 능동면역요법이 비용이나 투여횟수 측면에서 좀더 효율적인 방법으로 인식되고 있다. 능동면역요법은, 후천면역의 특징인 특이적인 장기 방어 기억을 유도하는 능력을 가진 후천면역반응을 유도하는 전략을 사용함으로써, 방어면역이 유도되도록 하는 것이다. 면역기능 이상반응을 조절하기 위한 열쇠는 체액성(또는 항체 매개) 및 세포성(T-세포 매개) 면역과 같은 항원에 대한 면역학적 이상반응을 항원 특이적으로 조절하는 것이 핵심이다.

항원 전달체로서 세균유래 세포밖 소포는 자체의 우수한 면역유도 효과에도 불구하고, 패혈증과 같은 심각한 독성을 유도하는 문제가 있다. 이는 그람음성세균의 세포외막에 내독소로 알려진 lipopolysaccharide (LPS)가 존재하고, 이는 혈관내피세포에 다량으로 존재하는 TLR4 수용체를 통해 전신적인 혈관염증을 유도하여 패혈증을 유도함이 최근 밝혀졌다. 그람음성세균 유래 세포밖 소포에 의한 독성문제를 해결하기 위한 방법으로 세포밖 소포에 존재하는 LPS를 제거하거나, 혹은 LPS 활성을 억제하는 화합물을 처리하여 항원 전달체로 사용할 수 있다. 원형질체(protoplast)는 식물 또는 세균의 살아있는 세포 물질이며, 이들 세포의 세포외막과 세포벽을 기계적/효소적인 방법으로 제거한 형태로서, 세균의 외막에 존재하는 내독소 함량이 제거되어 세포밖 소포 자체의 독성문제를 해결할 수 있다. 또한, 폴리믹신(polymyxin) B와 같은 약물을 처리하여 세포밖 소포 내에 존재하는 내독소의 활성을 제거할 수 있다.

그러나 현재까지 세균에서 유래하는 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능이상을 조절하기 위한 항원 특이적 면역요법은 보고된 바 없다.

이에, 본 발명은 세균유래 세포밖 소포 내 항원 단백질을 발현하는 세균, 및 이로부터 유래하는 세포밖 소포를 포함하는 약학적 조성물, 및 이의 제조방법 등을 제공하고자 한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 이용하여 세균유래 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능 이상반응을 조절하는 방법을 제공하고자 한다.

본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

본 발명은 세균유래 세포밖 소포를 유효성분으로 함유하는 호흡기질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 세균은 세균유래 세포밖 소포 내 항원 단백질 유전자를 과발현 시킨 세균이고, 상기 호흡기 질환은 세균유래 소포에 의한 호흡기 질환인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 세포밖 소포를 생성하는 세균은 대장균(E. coli) 혹은 살모넬라속 세균 (Salmonella spp.)인 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환 (COPD), 폐암, 비염, 및 부비동염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 세균유래 세포밖 소포 내 항원 단백질은 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP) 또는 그람양성세균유래 세포밖 소포 표면단백질인 것을 특징으로 한다. 상기 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질은 외막단백질 A (Outer membrane protein A, OMPA) 일 수 있으며, 그람양성세균유래 세포밖 소포 표면단백질은 코아귤레이즈 (Coagulase, CoA)일 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 세균유래 세포밖 소포 내 항원 단백질 유전자를 세균에 과발현시키는 단계; (b) 상기 과발현된 세균을 배양하는 단계; (c) 상기 세균 배양액에서 세포밖 소포를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 세포밖 소포의 외막 내독소 활성을 제거하는 단계를 포함하는, 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환 예방 또는 치료용 세균유래 세포밖 소포의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 (c) 단계에서 세포밖 소포를 분리하는 방법은 자연적으로 분비된 세포밖 소포를 필터법, 및/혹은 초원심분리법으로 분리하거나, 혹은 인공적인 방법으로 세포밖 소포를 만든 후, 필터법, 및/혹은 초원심분리법 등으로 분리하는 것을 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 (d) 단계에서 내독소 활성을 제거하는 방법은 세포밖 소포 내 독소 (LPS, peptidoglycan 등)를 라이소자임 등으로 제거하거나, 내독소 (LPS)를 폴리믹신 B (polymyxin B)와 같은 약물로 활성을 억제하는 방법을 포함한다.

또한, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 세균유래 세포밖 소포를 유효성분으로 포함하는, 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환 예방 또는 치료용 면역조절제를 제공한다.

상기 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 폐암, 비염, 및 부비동염을 포함하며, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 면역조절제는 세균유래 세포밖 소포의 내강(lumen)에 세균유래 세포밖 소포 항원 단백질이 과발현되어 존재하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 세포밖 소포는 평균 직경이 10-400nm 일 수 있으며, 바람직하게는 10-200nm인 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 세균유래 세포밖 소포를 이용하여 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환을 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 세균유래 세포밖 소포의 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환 예방 또는 치료 용도를 제공한다.

본 발명은 세균유래 세포밖 소포 항원 단백질이 로딩된 세균 유래 세포밖 소포를 유효성분으로 함유하는 조성물을 이용하여, 세균유래 세포밖 소포에 의한 기도 면역기능 이상반응을 조절함으로써, 궁극적으로 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환을 효율적으로 예방 또는 치료할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은, 세균유래 세포밖 소포 항원 단백질을 클로닝하여, 세균에 로딩한 후, 라이소자임으로 처리하여 원형질체를 만든 다음, 압출 (extrusion) 방법으로 소포를 제조하여 면역조절제를 만드는 방법을 도식화한 그림이다.
도 2는, 세균유래 세포밖 소포 항원 단백질 (OMPA)이 로딩된 세포밖 소포를 투과전자현미경 (transmission electron microscope)으로 촬영한 사진 (좌측) 및 동적광산란법 (dynamic light scattering) 방법으로 크기를 측정한 결과 (우측)이다.
도 3은, 세균유래 세포밖 소포 항원 단백질 (OMPA)이 로딩된 세포밖 소포를 골수세포 유래 항원제시세포 (bone marrow-derived dendritic cell)에 처리하여 co-stimulatory molecule (MHC class II 분자)의 발현을 측정한 결과이다.
도 4는, 세균유래 세포밖 소포 항원 단백질 (OMPA)이 로딩된 세포밖 소포를 골수세포 유래 항원제시세포 (bone marrow-derived dendritic cell)에 처리하여 Th1 및 Th17 면역반응을 유도하는 사이토카인인 IL-12 및 IL-6의 분비량을 측정한 결과이다.
도 5는, 우리나라 아파트와 병원 내 침대매트리스에서 먼지를 분리하여, 먼지 내 세균 메타게놈 (유전체) 분석을 수행하여, 먼지에 존재하는 세균의 다양성을 평가한 도이다.
도 6은, 우리나라 아파트와 병원 내 먼지에 존재하는 주요 세균의 분포를 Heat map으로 표현한 도이다.
도 7은, 우리나라 아파트에 존재하는 주요 세균과 세균유래 세포밖 소포(EV)의 분포를 Heat map으로 표현한 도이다.
도 8은, 세균유래 세포밖 소포 항원 단백질이 로딩된 세포밖 소포의 면역원성을 마우스에서 평가하기 위한 실험프로토콜이다.
IM: 근육주사; IN: 비강투여; BAL: 기관지폐포세척액
도 9는, 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포를 도 8의 방법으로 투여한 후, 마우스 혈청 내 항원특이 IgG 항체와 기관지폐포세척액 내 항원특이 IgA 항체 생성능을 측정한 결과이다.
도 10은, 그람음성세균유래 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포를 도 8의 방법으로 투여한 후, 마우스 폐조직에서 T 세포를 분리하여 anti-CD3/CD28로 자극을 준 후, 감마-인터페론, IL-17, IL-4를 측정한 결과이다.
도 11은, 그람양성세균유래 세포밖 소포 표면단백질 (Coagulase, CoA)이 로딩된 세포밖 소포를 도 8의 방법으로 투여한 후, 마우스 혈청 내 항원특이 IgG 항체와 기관지폐포세척액 내 항원특이 IgA 항체 생성능을 측정한 결과이다.
도 12는, 그람양성세균유래 세포밖 소포 표면단백질 (Coagulase, CoA)이 로딩된 세포밖 소포를 도 8의 방법으로 투여한 후, 마우스 폐조직에서 T 세포를 분리하여 anti-CD3/CD28로 자극을 준 후, 감마-인터페론, IL-17, IL-4를 측정한 결과이다.
도 13은, 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 후, 병원성 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의한 염증성 기도질환의 발생을 억제하는 예방효과를 평가하기 위한 프로토콜이다.
IM: 근육주사; IN: 비강투여
도 14는, 병원성 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의한 염증성 기도질환 마우스 질병모델에서, 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포의 항염증 예방효과를 기관지폐포세척액 내 염증세포 수로 평가한 결과이다.
도 15는, 병원성 그람양성세균은 황색포도상구균유래 세포밖 소포에 의한 염증성 기도질환 마우스 질병모델에서, 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (OMP)이 로딩된 세포밖 소포의 항염증 예방효과를 기관지폐포세척액 내 염증세포 수로 평가한 결과이다.
도 16은, 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 후, 병원성 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의한 염증성 기도질환 억제 치료효과를 평가하기 위한 프로토콜이다.
IM: 근육주사; IN: 비강투여; p-BNS: 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포; EV: 세포밖 소포
도 17은, 병원성 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의한 염증성 기도질환 마우스 질병모델에서, 도 16의 방법으로 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 후, 항염증 치료효과를 기관지폐포세척액 내 염증세포 수로 평가한 결과이다.
Mac: 대식세포; Neu: 호중구; Eos: 호산구; Lymph: 림프구
도 18은, 병원성 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의한 염증성 기도질환 마우스 질병모델에서, 도 16의 방법으로 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 후, 항염증 치료효과를 평가하기 위하여 기관지폐포세척액 내 사이토카인을 측정한 결과이다.
NC: 음성대조군; OA: p-BNS 단독 투여군; Ec: E. coli 소포 단독 투여군; OE: E. coli 소포 투여 시 p-BNS 투여군
도 19는, 병원성 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의한 염증성 기도질환 마우스 질병모델에서, 도 16의 방법으로 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 (Outer membrane protein, OMP)이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 후, 항염증 치료효과를 평가하기 위하여 폐 및 비장 T세포에서 감마-인터페론, IL-17, IL-4, IL-10의 분비를 측정한 결과이다.
NC: 음성대조군; OA: p-BNS 단독 투여군; Ec: E. coli 소포 단독 투여군; OE: E. coli 소포 투여 시 p-BNS 투여군

항원특이적 면역조절제를 개발하기 위해서는 항원 선정과 원하는 면역반응을 유도하는 면역보강제 선정이 중요하다. 본 발명에서는, 실내 먼지에 다량으로 존재하는 세균유래 세포밖 소포 표면 항원을 타겟으로 하였다.

항원 전달체로서, 세균 유래 세포밖 소포는 숙주에 다양한 면역반응을 유도할 수 있다는 사실에 근거하여, 세균유래 세포밖 소포를 면역보강제로 이용하고자 하는 시도가 있다. 그러나 세균 유래 세포밖 소포는 LPS와 같은 외독소를 함유하고 있어, 세균 유래 소포에 함유된 LPS에 의한 독성문제를 해결해야 하는 문제가 있다. 이에, 본 발명에서는, 세균 유래 소포가 가지고 있는 독성문제를 제거하기 위하여, 소포의 외막(outer membrane)과 펩티도글리칸층(peptidoglycan)을 포함하는 세포벽(cell wall)을 제거하여 만들어진 원형질체(protoplast)를 제조한 후, 인공적으로 세포밖 소포를 제조하여 사용하였다.

구체적으로, 본 발명에서는, 대표적인 그람음성세균으로 대장균에서 유래하는 세포밖 소포 외막단백질 A (Outer membrane protein A, OMPA)와 대표적인 그람양성세균인 황색포도상구균유래 세포밖 소포 표면항원 (Coagulase, CoA) 각각을 대장균에 과발현시킨 후 배양하였고, 이후 라이소자임을 처리하여 원형질체를 제조한 후, 압출 (extrusion) 방법으로 세포밖 소포를 제조하였다. 이후, 항원이 로딩된 세포밖 소포의 면역원성을 체외 및 체내 실험을 통해 평가하여, 효능 평가를 위한 투여경로와 투여용량을 결정하였다. 이를 통해 상기 항원이 로딩된 세포밖 소포가 유효한 면역조절제임을 알 수 있었다.

또한, 상기의 면역조절제의 효능을 질병모델에서 평가하기 위하여, 병원성 세균유래 세포밖 소포를 직접 기도로 투여하여 호흡기질환 질병모델을 제작하여 사용하였다.

본 발명에서, '호흡기질환'이란, 비염, 부비동염, 천식, COPD, 폐암 등과 같이 호흡기계에 발생하는 질환이면 특별히 제한은 없으나, 천식, COPD, 및 폐암으로 이루어진 군에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에서, '호흡기질환을 일으키는 세균유래 세포밖 소포'란, 먼지 속에 존재하는 세균유래 세포밖 소포이면 특별히 제한은 없으나, 장내 세균과, 슈도모나스속, 아시네토박터속, 또는 포도상구균속 세균에서 유래하는 세포밖 소포에서 선택되는 것이 바람직하다.

본 발명에서 '호흡기질환의 치료 또는 예방'이란, 호흡기질환의 경감, 완화 및 증상의 개선을 포함하며, 또한 호흡기질환이 걸릴 가능성을 낮추는 것을 포함하는 의미이다.

본 발명에서, 유전자를 과발현시킬 수 있는 세균에 특별히 제한은 없으나, 대장균(E. coli) 또는 살모넬라균(Salmonealla spp.)인 것이 바람직하다.

본 발명에서, 세포밖 소포를 분리하는 단계에는 자연적으로 분비된 세포밖 소포를 사용할 수 있고, 세포밖 소포를 분리하는 방법에 특별히 제한은 없으나, 필터로 농축하여 얻을 수 있으며, 이후 초원심분리 등의 공정을 포함할 수 있다.

본 발명에서, 인공적으로 세포밖 소포를 제조할 수 있고, 제조하는 방법에 특별히 제한은 없으나, 필터로 압출하여 얻을 수 있으며, 원심분리, 초원심분리 등의 공정을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 세포밖 소포를 분리하는 방법은 세균 유래 세포밖 소포를 포함한다면 특별히 제한되지 않으며, 예컨대 배양액에서, 원심분리, 초고속 원심분리, 필터에 의한 여과, 겔 여과 크로마토그래피, 프리-플로우 전기영동, 모세관 전기영동 등, 폴리머추가 등의 방법 및 이들의 조합을 이용하여 세포밖 소포를 분리할 수 있다. 또한, 불순물의 제거를 위한 세척, 수득된 세포밖 소포의 농축 등의 과정을 추가로 포함할 수 있다. 상기 세포밖 소포는 자연적으로 분비된 것이거나, 혹은 인공적으로 분비된 세포밖 소포를 포함한다.

본 발명에서, 상기 방법에 의해 제조된 세포밖 소포의 내강(lumen)에 세균유래 세포밖 소포 표면 항원 단백질이 발현되어 있으며, 이때 발현 단백질로는 장내 세균, 슈도모나스속, 아시네토박터속, 또는 포도상구균속 세균에서 유래하는 세포밖 소포 표면 항원이 바람직하다.

본 발명에서, 상기 방법에 의해 제조된 특정 항원이 로딩된 세포밖 소포는 평균 직경이 10-400nm 일 수 있으나, 바람직하게는 10-200nm 이다.

본 발명에서, 상기 호흡기질환의 치료 또는 예방용 면역조절제는 약학적 조성물로 제조될 수 있다. 치료 및 예방에 사용하기 위해 본 발명의 세균 유래 세포밖 소포 자체를 투여하는 것이 가능하나, 약학적 조성물의 활성 성분으로서 상기 소포가 포함되는 것이 바람직하다.

상기 약학적 조성물은 상기 분리된 세포밖 소포를 유효성분으로 함유하며, 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함할 수 있다. 상기 약학적으로 허용 가능한 담체는 제제 시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 사이클로덱스트린, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 등을 포함하지만 이에 한정되지 않으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 다른 통상의 첨가제를 더 포함할 수 있다. 또한 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제, 윤활제 등을 부가적으로 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제화에 관해서는 레밍턴의 문헌 (Remington's Pharmaceutical Science, Mack Publishing Company, Easton PA)에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 제형에 특별한 제한은 없으나 주사제, 흡입제, 피부 외용제 등으로 제제화할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 투여방법은 특별히 제한되는 것은 아니나, 목적하는 방법에 따라 근육주사, 피하, 흡입, 비강, 설하, 피부도포와 같이 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있다.

투여량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설률 및 질환의 중증도 등에 따라 그 범위가 다양하다. 일일 투여량은 치료를 필요로 하는 개체에 투여됨으로써 경감된 질병 상태에 대한 치료에 충분한 본 발명의 치료용 물질의 양을 의미한다. 치료용 물질의 효과적인 양은 특정 화합물, 질병 상태 및 그의 심각도, 치료를 필요로 하는 개체에 따라 달라지며, 이는 당업자에 의해 통상적으로 결정될 수 있다. 비제한적 예로서, 본 발명에 의한 조성물의 인체에 대한 투여량은 환자의 나이, 몸무게, 성별, 투여 형태, 건강 상태 및 질환 정도에 따라 달라질 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시 예를 제시한다. 그러나 하기의 실시 예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시 예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 ]

실시예 1: 세균유래 세포밖 소포 표면 항원이 로딩된 소포 제조 (도 1 참조)

대장균유래 세포밖 소포 외막단백질인 OMPA와 황색포도상구균 표면항원인 CoA 클로닝을 위해 OMPA 및 CoA 유전자를 RT-PCR 방법으로 cDNA로 합성하였다. PCR 산물은 T-blunt PCR 벡터(T-blunt PCR cloning kit, Solgent)에 삽입한 후, 각각의 플라스미드를 EcoRI(OmpA, ABC transporter) 및 BglII(FepA)로 절단하였다. 절편을 전기영동으로 분리한 후 pET-30a 플라스미드에 삽입하고, 대장균 DH5a에 열충격법으로 형질전환(transformation)하여, 최종적으로 상기 유전자를 클로닝하였다.

상기 실시 예에서 얻어진 후보 유전자 클론을 37℃, 200 rpm, 12시간 동안 Luria Bertani broth (Merch)에서 배양한 후, Exprep plasmid mini prep. Kit (GeneAll)를 이용하여 각각의 플라스미드를 분리하여 대장균 BL21(Real Biotech)에 트랜스펙션시켰다.

BL21를 OD값이 0.3이 될 때까지 200 rpm, 37℃, 100 ml LB broth(1 mM IPTG)에서 3시간 배양한 후, 3,000 × g, 4℃에서 10분 동안 원심분리하여 얻어진 박테리아 펠렛을 Tris buffer(0.01M Tris HCl, 0.5M sucrose)로 세척하였고, 4℃, 3,000 × g에서 10분 동안 원심분리한 다음 Tris buffer로 재현탁하였다. 재현탁한 박테리아를 37℃, 100 rpm에서 30분 동안 0.01 M EDTA로 처리하고, 4℃, 3,000 × g에서 10분 동안 펠릿화한 후, Tris buffer로 세척하여 펠릿화하였다.

다음으로, 박테리아 펠릿을 Tris buffer로 재현탁하고, 원형질체를 얻기 위하여 37℃, 100 rpm, 2시간 동안 1 mg/ml 라이소자임(lysozyme)(Sigma)을 처리한 후, 10 μm, 5 μm, 및 1 μm 기공 크기의 막을 통해 순서대로 LiposoFast extruder (Avestin)로 압출하였다. 최종적으로, 10% 및 50% opti-prep 밀도구배 배지(OptiPrep)로 초원심분리하여 OMPA, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 얻었다.

실시예 2: OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포의 물리적 특성 분석

실시예 1에서 얻은 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 PBS로 희석(50μg/ml)시키고, 300-mesh copper grids(EMS)에 10 μl 로딩하였다. 음성염색(negative stain)을 위하여 우라닐아세테이트(2%)를 그리드에 떨어뜨리고, JEM1011 전자 현미경(JEOL)으로 관찰하였다. 그 결과, 상기 세포밖 소포는 구형으로서 지질이중층으로 둘러싸여 있음을 확인하였다 (도 2 참조).

실시예 1에서 얻은 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포의 크기를 측정하기 위하여, 세포밖 소포를 PBS로 희석(500 ng/ml)시키고, Zetasizer Nano ZS (Malvern Instruments)을 이용하여 동적 광산란법으로 지름 크기 분포를 측정하고, Dynamic V6 software를 이용하여 결과를 분석하였다. 그 결과, 세포밖 소포의 직경이 130nm 내외임을 알 수 있었다 (도 2 참조).

실시예 3: OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 선천면역반응

OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 면역조절제로서 이용하기 위해서는 면역반응을 유도할 수 있어야 하기 때문에, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 선천성 면역반응 유도 수준을 평가하기 위해 골수세포에서 유래하는 수지상세포 (bone marrow-derived dendritic cell, BMDC)를 사용하여 in vitro (시험관내) 실험 을 수행하였다.

우선, BMDC (5 × 10⁵cells/well)를 10% FBS와 항생제(100 unit/ml 페니실린 및 100 μg/ml 스트렙토마이신)를 함유한 DMEM으로 37℃에서 24시간 동안 24 well 조직배양플레이트(TPP)에서 배양하였다. 배지 제거 후, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 0.1 및 1 ug/ml의 농도로 첨가한 무혈청 DMEM 배지로 갈아주었다. 15시간 후 BMDC에서 MHC class II 분자의 발현정도와 상기 배양 배지로 ELISA assay를 수행하여 T 세포 분화 사이토카인인 IL-12 및 IL-6의 발현수준을 측정하였다.

그 결과, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의해 항원제시세포에서의 MHC class II 분자의 발현이 크게 증가하였다 (도 3 참조). 또한, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포가 처리된 항원제시세포는 Th1 세포로의 분화에 중요한 IL-12 및 Th17 세포로의 분화에 중요한 IL-6의 분비를 유의하게 증가시켰다 (도 4 참조).

실시예 4: 아파트 및 병원 먼지 내 세균 및 세균유래 세포밖 소포 메타게놈 분석

진공청소기를 사용해 서울에 있는 아파트 내 침대매트리스와 대형병원 내과 및 중환자실 병동 침대매트리스에 존재하는 먼지를 계절별로 수거하였다. 진공청소기의 필터 내 존재하는 먼지를 깨끗한 유리병에 옮겨 담고 질량을 측정하였다. 먼지 5 g을 200 ml PBS가 들어있는 비커에 4℃, 12시간 동안 녹여내었다. 이 후 일차적으로 거즈를 이용하여 큰 이물질들을 걸러내고, 걸러져 나온 용액을 고속원심분리 튜브 (high speed centrifuge tube)에 나눠 담은 후, 4℃, 10,000 × g에서 15분 동안 고속원심분리 (high speed centrifugation)를 연속으로 2번 수행하여 세균이 있는 부분을 수거하였다. 세포밖 소포를 분리하기 위하여 180 ml 가량의 상층액을 구멍 크기가 0.45 μm인 멤브레인 필터 (membrane filter)를 1회 통과 시킨 후, 70 ml 용량의 초원심분리 튜브 (ultracentrifuge tube)에 나눠 담고 4℃, 100,000 × g에서 4시간 동안 초원심분리 (ultracetrifugation)를 하였다. 상층액은 버리고 튜브 아래에 존재하는 침전물을 PBS로 녹여 먼지 내 세포밖 소포를 추출하였다. 세균과 세포밖 소포 100㎕를 heatblock 100℃에서 15분 동안 끓여서 내부의 DNA를 지질 밖으로 나오게 하고 그 후 얼음에 5분 동안 식혔다. 그리고 남은 부유물을 제거하기 위하여 10,000 × g, 4℃에서 30분간 원심분리하고 상등액만을 모았다. 그리고 Nanodrop을 이용하여 DNA 양을 정량하였다. 그리고 세균 유래 DNA가 존재하는지 확인하기 위하여 16s rRNA primer [27F(5') : AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG, 1492R(3') : GGT TAC CTT GTT ACG ACT T]로 PCR을 수행하여 추출한 유전자에 세균유래 유전자가 있음을 확인하였다.

메타게놈 시퀀싱은 상기의 방법으로 분리한 세균 및 세포밖 소포에서 유전자를 추출한 후, 16S rDNA 프라이머를 사용하여 증폭을 한 다음 시퀀싱을 수행하고 (Roche GS FLX sequencer), 결과를 Standard Flowgram Format (SFF) 파일로 출력하고 GS FLX software (v2.9)를 이용하여 SFF 파일을 sequence 파일 (.fasta)과 nucleotide quality score파일로 변환한 다음 리드의 신용도 평가를 확인하고, window (20 bps) 평균base call accuracy 가 99% 미만 (Phred score <20)인 부분을 제거하였다. 질이 낮은 부분을 제거한 후, 리드의 길이가 300 bps 이상인 것만 이용하였다 (Sickle version 1.33). 결과 분석을 위해서 Operational Taxonomy Unit (OUT) 분석을 위해서는 UCLUST와 USEARCH를 이용하여 시퀀스 유사도에 따라 클러스터링을 수행하고, gunus 는 94%, family는 90%, order는 85%, class는 80%, phylum은 75% 시퀀스 유사도를 기준으로 클러스터링을 하고 각 OUT의 phylum, class, order, family, gunus 레벨의 분류를 수행하고, BLASTN와 GreenGenes의 16S RNA 시퀀스 데이터베이스 (108,453 시퀀스)를 이용하여 97% 이상의 시퀀스 유사도를 갖는 세균을 분석하였다 (QIIME).

그 결과, 아파트에 존재하는 먼지인 경우, 여름에 수거한 먼지에 비하여 겨울에 수거한 먼지에 존재하는 세균인 경우 다양성이 감소하였다 (도 5 참조). 또한, 아파트와 병원에서 겨울에 수거한 먼지인 경우, 아파트 먼지에 비하여 병원 내 먼지에 존재하는 세균인 경우 다양성이 감소하였다 (도 5 참조).

아파트와 병원에 존재하는 세균의 분포를 살펴보면, 아파트인 경우 Pseudomonas속, Acinetobacter속, 장내세균과, 포도상구균속 세균이 먼지 내에 존재하는 주요 세균이었고, 아파트인 경우에는 Pseudomonas속 세균이, 병원인 경우에는 Acinetobacter속 세균이 계절에 상관없이 가장 높은 비율로 존재하였다 (도 6 참조).

아파트 먼지에 존재하는 세균유래 세포밖 소포의 분포를 살펴보면, 계절에 상관없이 Pseudomonas속, Acinetobacter속, 장내세균과, 포도상구균속 세균에서 유래하는 세포밖 소포가 주를 이루었고, 특히 Pseudomonas속 세균에서 유래하는 세포밖 소포가 제일 흔하였다 (도 7 참조).

실시예 5: 마우스에서 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 항체 면역반응

생체내(in vivo)에서 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 항체 면역반응 유도능을 확인하고, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포의 유효량을 결정하기 위하여, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 마우스에 투여하여 면역을 유도하였다. 또한, 면역반응을 유도한 후 대조군(PBS) 및 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 마우스에서 혈액을 채취하여 OMPA 특이 IgG 항체를 측정하였고, 기관지폐포세척액을 채취하여 OMPA 특이 sIgA 항체의 농도를 측정하였다 (도 8 참조).

구체적으로, 100 ng의 OMPA가 포함된 100 μl의 PBS를 4℃에서 96-well black plate (Greiner Bio-one)에 24시간 동안 코팅하였다. OMPA로 코팅된 플레이트를 PBS로 세척하고 PBS로 희석한 1% BSA용액을 1시간 동안 처리하여 블로킹 과정을 수행하고 PBS로 다시 세척하였다.

대조군(PBS)과 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 마우스로부터 혈액과 혈청과 세포층을 분리한 후 혈청을 분리하였고, 기관지폐포세척액에서 세포층과 상층액을 분리하여, 혈청과 기관지폐포세책액 상층액을 1% BSA 용액으로 희석하였으며, OMPA 항원으로 코팅된 플레이트에서 2시간 동안 반응시켰다. 배양 후 플레이트를 세척하고 horseradish peroxidase-conjugated goat anti-mouse IgG 및 IgA (Santa Cruz Biotechnology) 200 ng/ml를 첨가하여 2시간 동안 반응시켰다. 다시 플레이트를 세척한 후 ECL substrate(Thermo Scientific)를 첨가하고 Victor Wallac 1420 apparatus (PerkinElmer)를 이용하여 IgG 및 sIgA 항체 역가를 분석하였다.

그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 근육주사로 면역반응을 유도한 마우스 혈청에는 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포 비강투여 유무에 상관없이 OMPA 항원 특이 IgG 항체 생성이 증가되었다. 반면, 기관지폐포세척액 내 OMPA 항원 특이 sIgA 생성은 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 근육주사한 후, 비강으로 투여한 경우에만 증가하였다(도 9 참조).

실시예 6: 마우스에서 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 T 세포 면역반응

생체내(in vivo)에서 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하여 면역반응을 유도한 후, 대조군(PBS) 및 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 마우스에서 T 세포에서 생성되는 사이토카인의 양을 측정하여 T 세포 반응을 평가하였다 (도 8 참조).

즉, 적출한 폐조직을 5ml 시린지 washing buffer (2.5% FBS, 0.01M HEPES 함유 DMEM)로 100 μm cell strainer (BD Biosciences)에 통과시켜 분해시켰다. 분리된 세포에 암모늄 클로라이드 용액을 4℃에서 10분간 처리하여 적혈구 세포가 용해되도록 하였다. 얻어진 세포를 washing buffer로 세척하고 40 μm cell strainer(BD)로 필터링한 후 10% FBS, 50 μM 2-ME, 0.01 M HEPES 및 항생제(100 unit/ml 페니실린, 100 μg/ml 스트렙토마이신)가 포함된 RPMI 1640 배지를 이용해 24-well 플레이트에서 12시간 동안 배양하였다. 이때 24-well 플레이트는 T 세포를 재자극시키기 위하여 1 μg/ml의 항-CD3(eBioscience)과 1 μg/ml의 항-CD28(eBioscience) 항체로 코팅된 것을 이용하였다.

그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, Th1 세포에 의해 생성되는 주요 사이토카인인 IFN-γ의 양은, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포 투여군은 대조군과 비교하여 증가되었고, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포 비강투여 시 용량의존적으로 감소하였다. Th17에서 생성되는 주요 사이토카인인 IL-17의 경우, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포 투여군은 비강투여 시 저농도에선 증가하였으나, 고농도에선 오히려 감소하였다. 그러나 Th2 세포에서 분비되는 IL-4인 경우에는 근육주사 혹은 비강투여에 상관없이 변화가 없었다 (도 10 참조).

실시예 7: 마우스에서 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 항체 면역반응

생체내(in vivo)에서 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 항체 면역반응 유도능을 확인하고, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포의 유효량을 결정하기 위하여, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 마우스에 투여하여 면역을 유도하였다. 또한, 면역반응을 유도한 후 대조군(PBS) 및 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 마우스에서 혈액을 채취하여 CoA 항원 특이 IgG 항체를 측정하였고, 기관지폐포세척액을 채취하여 CoA 항원 특이 sIgA 항체의 농도를 실시예 5의 방법으로 측정하였다.

그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 근육주사로 면역반응을 유도한 마우스 혈청에는 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포 비강투여 유무에 상관없이 CoA 항원 특이 IgG 항체 생성이 증가되었다. 반면, 기관지폐포세척액 내 CoA 항원 특이 sIgA 생성은 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 근육주사한 후, 비강으로 투여한 경우에만 용량의존적으로 증가하였다(도 11 참조).

실시예 8: 마우스에서 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포에 의한 T 세포 면역반응

생체내(in vivo)에서 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하여 면역반응을 유도한 후, 대조군(PBS) 및 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 마우스에서 T 세포에서 생성되는 사이토카인의 양을 측정하여 T 세포 반응을 실시예 6의 방법으로 평가하였다.

그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, Th1 세포에 의해 생성되는 주요 사이토카인인 IFN-γ의 양은, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포 투여군은 대조군과 비교하여 증가되었고, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포 비강투여 시 증가하였다. Th17에서 생성되는 주요 사이토카인인 IL-17의 경우, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포 투여군은 비강투여 시 저농도에선 증가하였으나, 고농도에선 오히려 감소하였다. 그러나 Th2 세포에서 분비되는 IL-4인 경우에는 비강투여 시 증가하였다 (도 12 참조).

실시예 9: 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의한 기도염증반응의 발생에 OMPA 항원이 로딩된 소포의 항염증 예방효과

대표적인 그람음성세균은 대장균에서 유래하는 세포밖 소포를 기도로 투여하여 유도된 기도염증 마우스모델에서 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포의 효능을 평가하기 위하여, 도 13에 표현된 것처럼, 기도염증모델을 제작하기 위하여 대장균유래 세포밖 소포를 일주일에 2회씩 총 3주간 비강으로 투여하여 호흡기질환모델을 제작하였다 (도 13 참조).

OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 면역반응을 유도하기 위해선, 실시예 5의 방법으로 설정된 농도로 도 13에 표현된 것처럼, 호흡기질환모델을 만들기 전에 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 3회 근육주사와 비강투여 하였고, 질환모델을 제작하는 동안에는 비강으로만 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하였다(도 13 참조).

그 결과, 도 14에 표현한 것처럼, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하지 않은 양성 대조군 마우스에선, 기관지폐포세척액 내 염증세포의 수가 대장균유래 세포밖 소포 기도투여에 의하여 현저히 증가되었다. 호흡기질환모델 제작 전에 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 면역반응을 유도한 마우스에선 기관지폐포세척액 내 염증세포의 수가 음성대조군 수준으로 현저히 감소하였고, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 천식모델 제작 전과 제작 후에 지속적으로 투여한 마우스에서도 동일하게 기관지폐포세척액 내 염증세포 수가 현저히 감소하였다 (도 14 참조).

따라서, 그람음성세균 외막단백질이 로딩된 세포밖 소포를 비강으로 투여하였을 때, 그람음성세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환을 효율적으로 억제함을 알 수 있었다.

실시예 10: 그람양성세균인 황색포도상구균유래 세포밖 소포에 의한 기도염증반응의 발생에 CoA 항원이 로딩된 소포의 항염증 예방효과

대표적인 그람양성세균은 황색포도상구균에서 유래하는 세포밖 소포를 기도로 투여하여 유도된 기도염증 마우스모델에서 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포의 효능을 평가하기 위하여, 도 13에 표현된 것처럼, 기도염증모델을 제작하기 위하여 황색포도상구균유래 세포밖 소포를 일주일에 2회씩 총 3주간 비강으로 투여하여 호흡기질환모델을 제작하였다 (도 13 참조).

CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 면역반응을 유도하기 위해선, 실시예 7의 방법으로 설정된 농도로 도 13에 표현된 것처럼, 호흡기질환 모델을 만들기 전에 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 3회 근육주사와 비강투여 하였고, 질환모델을 제작하는 동안에는 비강으로만 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하였다(도 13 참조).

그 결과, 도 15에 표현한 것처럼, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하지 않은 양성 대조군 마우스에선, 기관지폐포세척액 내 염증세포의 수가 황색포도상구군유래 소포 기도투여에 의하여 현저히 증가되었다. 호흡기질환모델 제작 전에 CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 면역반응을 유도한 마우스에선 기관지폐포세척액 내 염증세포의 수가 양성 대조군에 비하여 현저히 감소하였고, CoA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 염증성 기도질환모델 제작 전과 제작 후에 지속적으로 투여한 마우스에서도 동일하게 기관지폐포세척액 내 염증세포 수가 현저히 감소하였다 (도 15 참조).

따라서, 그람양성세균 표면단백질이 로딩된 세포밖 소포를 비강으로 투여하였을 때, 그람양성세균유래 소포에 의한 호흡기질환을 효율적으로 억제함을 알 수 있었다.

실시예 11: 그람음성세균인 대장균유래 세포밖 소포에 의해 유도된 기도염증 마우스모델에 대한, OMPA 항원이 로딩된 소포의 항염증 치료효과

대표적인 그람음성세균인 대장균에서 유래하는 세포밖 소포를 기도로 투여하여 유도된 기도염증 마우스모델에서 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포의 치료효능을 평가하였다. 이를 위하여 기도염증모델을 제작하기 위하여 대장균유래 세포밖 소포를 일주일에 2회씩 총 3주간 비강으로 투여하여 호흡기질환모델을 제작하였다 (도 16 참조).

또한, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 면역반응을 유도하기 위해선, 실시예 5의 방법으로 설정된 농도로, 호흡기질환모델이 만들어진 1주일째에 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 1회 근육주사하였고, 2주 및 3주째엔 근육주사와 동시에 비강투여하였고, 4주째부터는 매일 비강투여만 하였다 (도 16 참조).

그 결과, 도 17에 나타낸 바와 같이, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하지 않은 양성 대조군 마우스에서는, 기관지폐포세척액 내 염증세포의 수가 대장균유래 세포밖 소포 기도투여에 의하여 현저히 증가되었다. 한편, 호흡기질환모델 제작 후에 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포로 면역반응을 유도한 마우스에서는 기관지폐포세척액 내 호중구 수가 현저히 감소하였다 (도 17 참조). 또한, 기관지폐포세척액 내 사이토카인 분비량에서도 감마인터페론, IL-17, IL-4의 분비가 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여하였을 때 효율적으로 억제됨을 확인하였다 (도 18 참조).

OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포 투여 후, 폐조직과 비장에서 T 세포를 분리하여, anti-CD3와 anti-CD28로 자극을 준 후, 사이토카인 분비량으로 T세포 면역반응을 평가하였다. 그 결과, OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포를 투여한 경우에 비장조직 내 T 세포에 의한 IL-4 분비량이 현저히 감소하였고, 면역조절제를 투여하지 않은 경우에 비하여 OMPA 항원이 로딩된 세포밖 소포 면역조절제를 투여한 경우에 폐조직 내 T 세포에서의 감마-인터페론, IL-17, IL-4, IL-10 등의 사이토카인 분비가 감소하였다 (도 19 참조).

따라서, 그람음성세균 외막단백질이 로딩된 세포밖 소포 면역조절제를 비강으로 투여하였을 때, 그람음성세균유래 세포밖 소포에 의한 기도염증을 효율적으로 치료할 수 있음을 알 수 있었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해되어야 한다.

Claims

세균유래 세포밖 소포를 유효성분으로 함유하는 호흡기질환 예방 또는 치료용 약학적 조성물로서, 상기 세균은 세균유래 세포밖 소포 내 항원 단백질 유전자를 과발현시킨 세균이고,
상기 항원 단백질은 외막단백질 A(Outer Membrane Protein A) 또는 코아귤레이즈(Coagulase)이며,
상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서,
상기 세포밖 소포를 생성하는 세균은 대장균(E.coli) 또는 살모넬라균인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
삭제
제 1항에 있어서,
상기 세균유래 세포밖 소포 내 항원 단백질은 그람음성세균유래 세포밖 소포 외막단백질 또는 그람양성세균유래 세포밖 소포 표면단백질인 것을 특징으로 하는, 약학적 조성물.
삭제
삭제
(a) 세균유래 세포밖 소포 내 항원 단백질 유전자를 세균에 과발현시키는 단계;
(b) 상기 과발현된 세균을 배양하는 단계;
(c) 상기 세균을 배양한 배양액에서 세포밖 소포를 분리하는 단계; 및
(d) 상기 소포의 외막 내독소 활성을 제거하는 단계를 포함하는, 세균유래 세포밖 소포에 의한 호흡기질환 예방 또는 치료용 세균유래 세포밖 소포의 제조방법으로,
상기 항원 단백질은 외막단백질 A(Outer Membrane Protein A) 또는 코아귤레이즈(Coagulase)이며,
상기 호흡기 질환은 천식, 만성 폐쇄성 폐질환, 및 폐암으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
제 7 항에 있어서,
상기 세포밖 소포를 생성하는 세균은 대장균(E.coli) 또는 살모넬라균인 것을 특징으로 하는, 제조방법.
삭제