CN112755180B - 一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用，本发明的制备方法是利用超高压强驱动细菌通过裂缝后形成稳定的细菌生物膜囊泡(BBV)，通过该方法，可驱动包括多种革兰氏阴性及革兰氏阳性耐药细菌，以及非耐药细菌产生BBV。BBV是人为驱动细菌制造产生，释放了细菌的胞内蛋白及核酸，相比细菌天然分泌的胞外囊泡(EV)，具有更高的产量及安全性；BBV可被DC细胞高效摄取并刺激其成熟，作为疫苗在体内具有诱导细菌特异性的体液及细胞免疫应答的双重功能。经测试显示，不同细菌来源的BBV疫苗都展示出抵抗各自细菌感染的特点以及良好的生物相容性。这种BBV通用疫苗制备平台的建立突破了EV疫苗的局限性，对细菌疫苗的发展具有重要意义。

Description

一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用
技术领域
本发明属于分子生物学领域，特别涉及一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用。
背景技术
全球耐药菌的感染越来越严重，已成为威胁人类生命健康的极大问题，据报道全世界每年有70万人死于耐药菌感染，如果不加以控制预计到2050年耐药细菌感染致死的人数将达到1000万并超过肿瘤死亡人数。在COVID-19期间，约有50％的死亡病人有继发性细菌感染，主要的感染细菌是肺炎克雷伯菌及鲍曼不动杆菌。耐药细菌由于其对抗生素抵抗，因此一旦感染难以控制，造成高致死率。目前最严重的耐药细菌是碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌，大肠杆菌，鲍曼不动杆菌及铜绿假单胞菌，甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，万古霉素耐药的粪肠球菌，这些细菌被称为“ESKAPE”，严重威胁人类生命健康。
但不幸的是新的抗生素研发周期非常缓慢，已无法赶上耐药细菌的发展速度。细菌的抗生素耐药问题日益严重，已严重威胁人类健康。绕开细菌耐药机制，发展新型耐药菌疫苗具有重要意义。
疫苗是抵抗耐药细菌感染的有效手段，疫苗的使用可以大大降低抗生素的使用量，也将减少细菌耐药性的发展速度。目前耐药细菌疫苗的制备方案主要是灭活疫苗、外膜蛋白疫苗、外膜囊泡疫苗、纳米疫苗、亚单位疫苗。其中胞外囊泡(EV)或叫外膜囊泡(OMV)由于其富含完整的抗原，没有感染性，便于基因工程改造及纳米结构的特点，是目前认为非常适合作为细菌性疫苗的理想组分。
但EV/OMV的一些不利因素严重限制了其进一步发展，主要是：(1)EV在革兰氏阴性菌中的产量很低，EV在革兰氏阳性菌中更少。(2)有效的疫苗成分是表面蛋白，而EV/OMV包含了除表面蛋白外的大量胞内蛋白。(3)EV/OMV包含了细菌的大量核酸，具有传递耐药基因的风险。(4)EV/OMV来源于细菌天然分泌，其质量控制难度较大。(5)EV/OMV制备的工艺在大规模放大时难度较大。综合EV/OMV的优点及缺点，若能改进疫苗制备技术突破EV疫苗的这些限制，将有利于耐药细菌疫苗的发展。
如何提高囊泡产量，提高安全性，增加保护性抗原覆盖度，增强特异性体液免疫及细胞免疫是改善疫苗设计的关键问题。
目前，生物膜的自组装技术已在真核生物中被广泛的应用，这包括在红细胞膜，免疫细胞膜，肿瘤细胞膜等，但基于原核生物膜的生物膜组装目前仍依靠细菌自分泌的EV/OMV而不是人为组装囊泡，这是由于细菌细胞膜具有大量孔蛋白、糖蛋白及肽聚糖等的特殊结构，给人为驱动形成生物膜组装囊泡的技术带来了困难，特别是具有厚的细胞壁的革兰氏阳性菌而言，其生物膜组装难度更大。
如何能够人为驱动细菌细胞膜形成生物膜组装囊泡，形成新型耐药菌疫苗，是一个需要解决的问题。
发明内容
针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种通用的细菌疫苗的制备方法和应用，以细菌生物膜囊泡(BBV)代替EV/OMV，从而提高细菌疫苗的抗原性和安全性。
本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
一种通用的细菌疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，在培养基中培养细菌，当OD600达到1.0时，将培养基离心，去除上清，细菌沉淀经洗涤后重悬，得到细菌悬浮液；
步骤2，高压均质处理：对得到的细菌悬浮液进行高压均质处理，得到的悬浮液经离心，收获上清液，上清液再经超速离心，去除上清收集沉淀，沉淀经重悬得到囊泡悬浮液；
步骤3，对所述囊泡悬浮液进行柱层析纯化或密度梯度离心纯化，获得纯化后的细菌生物膜囊泡(BBV)，即为所述细菌疫苗；
其中密度梯度离心纯化可使用包括碘克沙醇、氯化铯和蔗糖在内的离心介质。
进一步的，所述细菌包括耐药菌和敏感细菌，其中，所述耐药菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌。
进一步的，所述耐药细菌但不限于碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌、碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌、碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌、碳青霉烯耐药的大肠杆菌、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌、万古霉素耐药的粪肠球菌；所述敏感细菌包括但不限于肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、干燥奈瑟菌、溶血性葡萄球菌、脑膜炎球菌、双歧杆菌、卡他奈瑟菌、溶血性链球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、莫拉氏菌、艾肯氏菌、流感嗜血杆菌。
进一步的，步骤2中所述高压均质处理的压力范围在200bar～2000bar。
进一步的，步骤1中在进行离心前，将C10H14N2Na2O8(EDTA·2Na)缓慢加入培养基中，振荡条件下孵育后再进行离心处理。
本发明的另一方面：
一种通用的细菌疫苗，所述疫苗由上述制备方法制备得到。
进一步的，所述疫苗的应用方式包括皮下注射、肌肉注射、吸入及口服。
本发明的另一方面：
所述通用的细菌疫苗作为其他疫苗载体的用途，所述其他疫苗包括肽疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗；
所述通用的细菌疫苗作为药物递送载体的用途，所述药物包括抗肿瘤药物、抗菌药物、示踪药物；
所述通用的细菌疫苗作为免疫刺激剂的用途，所述免疫刺激包括固有免疫激活、肿瘤免疫调控、疫苗佐剂。
本发明相比现有技术的有益效果为：
1、本发明所述的通用的细菌疫苗，包含了所有细菌天然分泌的胞外囊泡(EV)也叫外膜囊泡(OMV)作为疫苗的优势，是一种利用超高压强驱动耐药细菌通过裂缝后形成稳定的细菌生物膜囊泡(BBV)，相比EV/OMV而言，BBV来源于菌体本身而非细菌分泌物，因此产量更高，BBV技术产生的囊泡产量是EV产量的88倍以上，突破了EV技术产量低的限值；
2、本发明所述的通用的细菌疫苗，介导了免疫系统对耐药细菌的直接杀伤。不仅如此，BBV诱导了细菌特异性的细胞免疫应答能力，说明BBV疫苗具有诱导特异性体液免疫和细胞免疫应答的双重功能。
3、本发明所述通用的细菌疫苗制备方法，是一种通用的细菌疫苗制备技术，突破了目前基于EV疫苗形式的很多限制，不仅通用于革兰氏阴性菌，对于具有厚层细胞壁的革兰氏阳性菌，该方法也能驱动细菌产生BBV，且这种革兰氏阳性菌产生的BBV也可以作为疫苗来诱导具有保护性的体液及细胞免疫应答，这对发展耐药细菌疫苗具有重要意义；
4、本发明所述的通用的细菌疫苗，具有更窄的蛋白组成，BBV在自组装前释放了胞内的非抗原蛋白，其蛋白组成大部分是外膜蛋白，因此去除了大量无免疫保护性的蛋白成分，提高了BBV对DC的刺激、抗原性和安全性，同时由于BBV释放了几乎全部的细菌核酸成分，避免了细菌耐药基因传递的风险；
5、本发明所述通用的细菌疫苗的制备方法，是人为可控的过程，提高了囊泡的可质控性，其制备可以以“连续流”的方式完成，有利于规模化放大制备工艺。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明作进一步说明：
图1为BBV的设计原理图；
图2为BBV与EV/OMV制备的对比示意图；
图3为不同压强条件下制备肺炎克雷伯菌的BBV的电镜代表性照片；
图4为kp全菌体、kp菌体裂解物、Kp-EV及Kp-BBV的SDS-PAGE；
图5为不同耐药性的肺炎克雷伯菌全菌体的SDS-PAGE银染，及用2μg Kp-BBV最后一次免疫后7天的抗血清及对照血清进行Western blot分析；
图6为小鼠经不同疫苗免疫的血清，以ELISA检测细菌特异性IgG抗体水平；
图7为经2μg的不同疫苗免疫后3周，分离小鼠脾细胞，用BBV及不同来源的耐药细菌进行重新刺激recall，以MTS分析脾细胞的增殖；
图8为ELISA分析细菌重刺激后小鼠脾细胞分泌细胞因子的水平，其中倍数变化指刺激前后的变化；
图9为疫苗2μg分别免疫小鼠后三周，给小鼠从腹腔(i.p)攻击5×107CFU/鼠剂量的细菌，连续7天观察小鼠的存活率；
图10为疫苗免疫小鼠后的三周，给小鼠从鼻腔(i.n)攻击5×104CFU/鼠剂量的细菌，细菌攻击后24h，分析血液中的中性粒细胞水平；
图11为利用小动物肺功能测定仪分析细菌攻击后24h小鼠的总气道阻力及组织气道阻力；
图12为小鼠肺组织研磨悬液中的细菌载量代表图，稀释10倍后涂布；
图13为小鼠肺组织研磨悬液中的细菌载量统计图；
图14为小鼠脾组织研磨悬液中的细菌载量统计图；
图15为肺组织研磨悬液中的炎症因子水平；
图16肺组织H&E染色的代表图，黑色圈代表alveolar space；
图17为BBV组经肺部感染后24小时的肺组织切片免疫荧光染色的代表图；
图18为碳青霉烯耐药鲍曼不动杆菌(Ab-BBV)，碳青霉烯耐药大肠杆菌(Ec-BBV)，碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌(Pa-BBV)的透射电镜图；
图19为以2μg Ab-BBV免疫小鼠后，以肺部攻击碳青霉烯耐药的5×104CFU鲍曼不动杆菌后24h在肺部的细菌载量，以及在脾脏的细菌载量；
图20为以2μg Ec-BBV免疫小鼠后，被5×104CFU碳青霉烯耐药大肠杆菌从肺部攻击后肺部及在脾脏的细菌载量；
图21为以2μg Pa-BBV免疫小鼠后，被1×106CFU碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌从肺部攻击后肺部及在脾脏的细菌载量；
图22为来源于甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌及万古霉素耐药的粪肠球菌的BBV的透射电镜图；
图23为2μg Sa-BBV免疫小鼠后，鼻腔注射1×106CFU甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌后24h在肺部及脾脏中的细菌载量；
图24为分别以2μg来源于碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌和甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌产生的BBV免疫小鼠三次，期间检测小鼠的体重变化结果图；
图25为分别以2μg来源于碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌和甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌产生的BBV免疫小鼠三次，期间检测小鼠的体温变化结果图。
具体实施方式
实施例1
本实施例提供了一种通用的细菌疫苗的制备方法，包括以下步骤：
步骤1，细菌生物膜的软化：在培养基中培养耐药菌，当OD600达到1.0时，将C10H14N2Na2O8(EDTA·2Na)缓慢加入培养基中直至浓度达到10mM，在37℃下振荡孵育30分钟后将培养基以14,000×g离心20min，去除上清，细菌沉淀用HBSS(不含Ca2+，Mg2+和苯酚红，Servicebio)洗涤，并重悬于300ml HBSS中，得到细菌悬浮液。
所述耐药菌包括碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌、碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌、碳青霉烯耐药的大肠杆菌、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，以及万古霉素耐药的粪肠球菌。以上各菌都是由昆明医科大学第二附属医院提供。
具体来说，在400ml Luria-Bertani培养基中，37℃振荡培养碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌、碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌、碳青霉烯耐药的大肠杆菌、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌，在400ml MRS培养基中，37℃密闭静置培养万古霉素耐药的粪肠球菌。
步骤2，高压处理：对得到的细菌悬浮液在1200bar的压强条件下，通过高压高压均质机(SPX公司，APV-2000)，重复两次。得到的悬浮液在4℃、6,000×g下离心30min，收获上清液，上清液再用超高速离心机(Hitachi CP100 Mx RLM)4℃下以100,000×g离心30min，细菌沉淀重悬在2ml HBSS中，得到细菌悬浮液B；
步骤3，将细菌悬浮液B置于超速离心管最底部，再其上依次将10％、15％、20％、25％、30％、35％、45％的碘克沙醇(Sigma)密度梯度层加入到超速离心管中，4℃、100,000×g超速离心2小时后，分离10％至45％碘克沙醇界面，获得纯化后的细菌生物膜囊泡(BBV)，即为所述通用的细菌疫苗。
如图1所示，被软化后的细菌生物膜在超高压强的驱动下被挤过夹缝形成人工水泡，并组装为完整的细菌生物膜囊泡，这种技术有利于连续流操作并规模化放大。
对比例1
如图2所示，本对比例提供了一种碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌全菌体5306(Kp全菌体)、其细菌裂解产物及细菌EV。
细菌裂解产物：Kp5306细菌经过三个冻融循环后使用细胞超声破碎仪对样品进行超声处理来破碎细菌(30min，10秒超声波和10秒暂停交替进行)，得到Kp裂解产物。
细菌EV制备方法：使用400ml的LB培养基，在37℃条件下培养Kp5306细菌至OD600达到1.0。14,000×g、离心15min后收集细菌培养基上清液并通过0.45μm滤膜(Millipore)过滤。滤液用500kDa的超滤柱(Millipore)进行浓缩。浓缩液在4℃条件下100,000×g超速离心2h。将沉淀悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中得到细菌胞外囊泡Kp-EV，用0.45μm滤膜过滤。
实施例2
为测试不同压力强度对于制备BBV的影响，本实施例采用实施例1所述的方法制备肺炎克雷伯菌的BBV，并分别在200bar,400bar,800bar,1200bar的压强驱动下制备。结果证明在1200bar压强驱动下能驱动细菌大量形成完整的BBV，而在200bar,400bar,800bar条件下虽然也能形成囊泡，但结构并不完整。
如图3，展示了800bar与1200bar压强驱动下产生的BBV电镜代表性照片。左图示出1200bar压强驱动肺炎克雷伯菌后未纯化前，可以看到大量完整的BBV产生。右图的1200bar及800bar压强驱动菌体纯化后的电镜图，说明在1200bar驱动下能形成大量完整的囊泡。
另外实验证实，在碘克沙醇梯度离心的行为中，1200bar压强驱动下产生的BBV比800bar更均一，体现出1200bar的分层更加集中。DLS分析证明1200bar压强下产生的BBV粒径更小且PDI更均一。另外，这种BBV在室温、4℃和-20℃的保存条件下都能维持至少5周的颗粒稳定性。
进一步的，从400ml肺炎克雷伯菌培养物中能制备获得的样品产量分析，用Bradford染色法检测蛋白含量。结果表明，BBV技术产生的囊泡产量是EV产量的88倍以上。
实施例3——BBV产生机制
为明确BBV的产生机制，本实施例进行了以下试验：
分别取实施例1纯化后的Kp-BBV样品，以及对比例1所述Kp全细菌、Kp裂解产物、Kp-EV在10％SDS-PAGE电泳上分析。如图4所示的SDS-PAGE分析，说明Kp-BBV的蛋白组成最少。
将所述Kp-BBV与全菌体蛋白进行ITRAQ蛋白组学分析，结果显示BBV与Kp全菌体相比增加的蛋白有291个，减少的蛋白有117个。聚类分析证明Kp-BBV相比Kp全菌体上调的蛋白大多是生物膜上的蛋白，减少的大多是胞内蛋白；经GO富集分析证明Kp-BBV与Kp全菌体发生上调或下调的蛋白大多是细胞组分及膜成分，且Kp-BBV中减少的大多数是细菌的胞内组分，而增加的是生物膜上的蛋白组分，其中上调和下调最高的15个蛋白，结果也说明了Kp-BBV与Kp全菌体相比，减少了胞内的蛋白而生物膜上的蛋白比例增加。
另外，本实施例用DNA电泳分析了Kp-BBV、Kp菌体裂解物、Kp-EV中的核酸组分，结果证明Kp-BBV中几乎没有可以被检测到的核酸，而Kp菌体裂解物及Kp-EV中都富含大量的核酸。综上所述，我们证明了Kp-BBV的产生原理是细菌在通过夹缝后释放了胞内蛋白及核酸后，由细菌生物膜自组装后形成的囊泡。
实施例4——BBV作为抗细菌感染疫苗的评价
为评价BBV作为抗感染疫苗的可能性，本实施例检测了实施例1纯化后的Kp-BBV在注射部位的驻留时间，实验结果显示2μg Kp-BBV能够在小鼠体内驻留至少120h(5days)。皮下注射1h后，收集小鼠腹股沟淋巴结的细胞进行流式分析，结果证明Kp-BBV显著的激活了DC细胞增殖及成熟。在体外，Kp-BBV也能被BMDC细胞高效摄取，同时在体外Kp-BBV刺激BMDC分泌IL-6，及TNF-α分子来反应DC细胞成熟水平。
综上所述，Kp-BBV能长时间驻留在注射部位，并高效被DC细胞摄取和加工，提示了Kp-BBV作为疫苗的优势。
为了评价BBV引起的体液免疫反应，6-8周龄的ICR小鼠分别在第0、7、14天皮下注射0.2μg或2μg的Kp-BBV、Kp-Lysate、Kp-EV、Sa-BBV、Ab-BBV、Ec-BBV、Pa-BBV、Ef-BBV并混合Alum佐剂。分别在第7天、14天、21天，进行腿部取血。ELISA检测血液中BBV特异性IgG和IgM反应。简单地说，96孔板每个孔包被1μg的BBV，培养板与采集的血清样本(稀释1:1000)和Goat anti-Mouse IgG(H+L)Secondary Antibody(Invitrogen)孵育，然后用碱性磷酸酶底物显色。
如图5所示，最后一次免疫后7天(day 21)的抗血清可以识别具有三种不同来源的耐药肺炎克雷伯菌，说明BBV疫苗可以提供针对不同耐药谱肺炎克雷伯菌的多抗原靶点的广泛交叉保护性。如图6所示，分别以0.2μg及2μg免疫剂量下，BBV都能够产生比EV更强的细菌特异性IgG抗体应答。且BBV及EV作为疫苗进行免疫对机体产生了偏向Th1的免疫应答能力。2μg剂量最后一次免疫后3周，分离小鼠脾细胞以不同的抗原进行再刺激来反应BBV诱导的细胞免疫水平，图7的结果显示BBV疫苗组针对不同抗原的刺激有最显著的淋巴细胞增殖能力，且BBV免疫后的小鼠脾细胞以不同剂量的细菌刺激显示出细胞增殖的剂量依赖性。如图8以ELISA分析脾细胞经灭活细菌刺激后细胞因子IFN-γ,IL-4,IL-17A,IL-10,IL-2的分泌都比对照组高。用流式细胞术检测细菌特异性T细胞的增殖水平，BBV疫苗能够诱导最强的CD3+T细胞的细菌特异性应答，且对不同来源的细菌具有交叉诱导能力。更重要的是，细菌特异性CD3+CD4-CD8+T的细胞免疫反应也是BBV疫苗最明显。
以上结果说明BBV疫苗比EV或细菌裂解产物疫苗而言，不仅能诱导最强的细菌特异性抗体应答，还能诱导显著的细菌特异性CD8+T细胞应答，这对于清除胞内感染细菌具有重要意义。
经BBV免疫后的小鼠进行耐药的肺炎克雷伯菌从腹腔及鼻腔攻击来模拟细菌引起的败血症及肺炎模型，从而评价BBV疫苗的体内保护效率。将细菌攻击剂量提高至5×107CFU/mouse，如图9所示，观察到在更高的攻击剂量下只有BBV疫苗组可以有意义的提高小鼠的生存率，提示BBV疫苗在体内能诱导比裂解物及EV更强的免疫保护能力。如图10所示，在小鼠的肺炎克伯菌引起的肺炎模型中，观察到BBV疫苗组显著的降低了小鼠血液中的中性粒细胞水平；如图11所示，经小动物肺功能检测显示BBV疫苗组显著的降低了小鼠的气道阻力及组织阻力，提示BBV疫苗可以有效的缓解肺炎克雷伯菌引起肺部感染的炎症及肺部临床症状，这可能是因为抗体中和了细菌释放的毒素。如图12所示，我们也观察到BBV疫苗可以显著的减少感染后小鼠肺部的细菌载量，且BBV可以对三种不同抗生素耐药性的肺炎克雷伯菌都具有免疫保护(图13)，这说明BBV疫苗具有广泛的交叉保护性，也证明BBV介导了免疫系统对耐药细菌的直接杀伤。肺部感染的小鼠经BBV疫苗免疫后没有发现脾脏的细菌(图14)，证明BBV可以完全保护细菌局部感染后扩散到全身感染的可能。随着肺部细菌载量的下降，BBV疫苗组也显著的抑制了肺部的炎症(图15)及肺部炎症细胞的浸润(图16)。同时如图17所示，对小鼠肺部切片的免疫荧光实验观察到BBV疫苗组经细菌肺部感染后在支气管周围诱导了大量CD4+T和CD8+T细胞的聚集，说明BBV具有诱导细菌特异性细胞免疫应答的能力。
实施例5——BBV技术通用于耐药革兰氏阴性细菌
为明确BBV技术是否是一种通用的针对革兰氏阴性细菌疫苗的制备技术，我们制备了另外三种碳青霉烯耐药的革兰氏阴性菌(鲍曼不动杆菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌)的BBV，图18所示的电镜结果证明碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌、大肠杆菌及铜绿假单胞菌都能通过BBV疫苗技术产生囊泡。分别用这些细菌的BBV免疫小鼠后测试其免疫保护力，经鲍曼不动杆菌BBV(Ab-BBV)免疫后小鼠产生了抗Ab的特异性IgG抗体，如图19所示，Ab-BBV降低了小鼠肺部的细菌载量，同时也阻止了细菌扩散至除肺以外的其他组织，例如脾脏。大肠杆菌制备的BBV(Ec-BBV)免疫后也产生了显著的大肠杆菌特异性IgG抗体应答，如图20所示，Ec-BBV降低了感染后小鼠在肺部及脾脏的细菌载量。我们还测试了碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌产生的BBV(Pa-BBV)，Pa-BBV能诱导细菌特异性IgG抗体的产生，同时抑制肺炎小鼠肺部及脾脏的细菌载量(图21)。
综上所述，本发明建立的这种纳米疫苗制备方法可以在不同的耐药性革兰氏阴性细菌上产生BBV，这些BBV作为疫苗都能诱导细菌特异性的抗体水平，并有效抵抗耐药细菌的感染。
实施例6——BBV技术通用于耐药革兰氏阳性细菌
实施例5已经证实了BBV技术可以驱动革兰氏阴性菌产生BBV，但该技术驱动革兰氏阳性菌产生BBV的能力并不清楚，且革兰氏阳性细菌自分泌的EV非常有限，因此BBV技术驱动革兰氏阳性菌显得更加有意义。
为明确BBV技术是否是一种通用的针对革兰氏阳性细菌疫苗的制备技术，本实施例利用BBV技术成功的制备严重甲氧西林耐药性金黄色葡萄球菌及万古霉素耐药粪肠球菌的BBV，如图22所示的透射电镜观察到革兰氏阳性菌产生的BBV的表面更厚，本实施例也在细菌感染模型中测试了革兰氏阳性菌产生的BBV作为抗菌疫苗的潜力，实验结果显示金黄色葡萄球菌产生的BBV(Sa-BBV)能诱导细菌特异性的IgG反应。
现在的观点认为只有体液免疫应答不足以很好的抵抗金黄色葡萄球菌的感染，细胞免疫具有重要的作用，因此本实施例也评价了Sa-BBV诱导细胞免疫的能力，我们分离了免疫后小鼠的脾细胞以Sa-BBV及菌体刺激后都能诱导脾细胞增殖，其中以流式细胞术分析发现细菌特异性的CD4+T及CD8+T细胞都显著增加，脾细胞再次接触金黄色葡萄球菌后大量分泌IFN-γ，以上结果提示Sa-BBV诱导产生了显著的细菌特异性细胞免疫应答。如图23所示，经感染后24h的小鼠肺部及脾脏的耐药金黄色葡萄球菌的细菌载量显著下降。不仅如此，万古霉素耐药的粪肠球菌产生的BBV也能诱导抗细菌抗体水平，并能成功保护小鼠的感染，显著增加小鼠存活率。
综上所述，本发明建立的这种纳米疫苗制备技术不仅可以驱动革兰氏阴性菌产生BBV，对于具有厚层细胞壁的革兰氏阳性菌，该技术也能驱动细菌形成BBV，且这种革兰氏阳性菌产生的BBV也可以作为疫苗来诱导具有保护性的体液及细胞免疫应答。因此，BBV制备技术是一种通用的细菌疫苗制备技术，该技术突破了目前基于EV疫苗形式的很多限制，对发展耐药细菌疫苗具有重要意义。
实施例7——BBV的生物相容性
本实施例评价了革兰氏阴性及阳性细菌产生的BBV的生物相容性。结果显示分别经2μg革兰氏阴性及阳性细菌产生BBV免疫后的小鼠的体重与PBS对照组相比未见明显波动(图24)，其体温也未见明显变化(图25)，最后一次免疫后2天我们对小鼠解剖，没有发现革兰氏阴性及阳性细菌BBV引起的明显组织病变。综上所述，本实施例证明在2μg剂量下，革兰氏阴性及阳性细菌产生的BBV具有良好的生物相容性。
最后应说明的是，以上仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳布置方案对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (6)

1.一种细菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
步骤1，在培养基中培养细菌，当OD600达到1.0时，将培养基离心，去除上清，细菌沉淀经洗涤后重悬，得到细菌悬浮液；
步骤2，高压均质处理：对得到的细菌悬浮液进行高压均质处理，得到的悬浮液经离心，收获上清液，上清液再经超速离心，去除上清收集沉淀，沉淀经重悬得到囊泡悬浮液；
所述高压均质处理时，细菌在超高压强的驱动下被挤过夹缝形成人工水泡，并组装为完整的细菌生物膜囊泡；所述高压均质处理的压力范围在1200bar~2000bar；
步骤3，对所述囊泡悬浮液进行柱层析纯化或密度梯度离心纯化，获得纯化后的细菌生物膜囊泡BBV，即为所述细菌疫苗。
2.根据权利要求1所述细菌疫苗的制备方法，其特征在于，所述细菌包括耐药细菌和敏感细菌，所述耐药细菌包括碳青霉烯耐药的肺炎克雷伯菌、碳青霉烯耐药的鲍曼不动杆菌、碳青霉烯耐药的铜绿假单胞菌、碳青霉烯耐药的大肠杆菌、甲氧西林耐药的金黄色葡萄球菌、万古霉素耐药的粪肠球菌；所述敏感细菌包括肺炎克雷伯菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、粪肠球菌、干燥奈瑟菌、溶血性葡萄球菌、脑膜炎球菌、双歧杆菌、卡他奈瑟菌、溶血性链球菌、化脓性链球菌、肺炎链球菌、莫拉氏菌、艾肯氏菌、流感嗜血杆菌。
3.根据权利要求1或2所述细菌疫苗的制备方法，其特征在于，步骤1中在进行离心前，将C10H14N2Na2O8（EDTA·2Na）缓慢加入培养基中，振荡条件下孵育后再进行离心处理。
4.一种细菌疫苗，其特征在于，所述疫苗由权利要求1~3任一项所述制备方法制备得到。
5.权利要求4所述细菌疫苗，其特征在于，所述疫苗的应用方式包括皮下注射、肌肉注射、吸入及口服。
6.如权利要求4所述细菌疫苗作为其他疫苗载体的用途，所述其他疫苗包括肽疫苗、亚单位疫苗、DNA疫苗、RNA疫苗。
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