CN102573904B - 含有源于室内空气的细胞外小泡的组合物及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种含有源于室内空气的细胞外小泡的组合物。另外，本发明提供了一种利用上述细胞外小泡对炎症性呼吸器官疾病及肺癌等进行诊断、预防及/或者治疗的方法。具体地说，本发明将源于室内空气的细胞外小泡向动物注入而构建呼吸器官疾病动物模型，利用上述动物模型对预防或者治疗呼吸器官疾病的备选药物进行筛选及/或者发掘。另外，本发明还提供了对预防及/或者治疗呼吸器官疾病的疫苗、对呼吸器官疾病的致病物质进行诊断的方法，以及为了预防呼吸器官疾病的发生及恶化而抑制室内空气中细胞外小泡的活性或者除去上述细胞外小泡的方法等。

Description

含有源于室内空气的细胞外小泡的组合物及其用途
技术领域
本发明涉及一种含有源于室内空气的细胞外小泡的组合物及利用上述细胞外小泡对炎症性呼吸器官疾病等进行诊断、预防及/或者治疗的方法。
背景技术
室内空气的质量(indoor air quality)是指包含建筑物(buildings)在内的构造物(structures)内部与周边空气的质量(air quality)，特别是，关联着居住者或者是栖息者的健康及舒适的生活。室内空气中污染着对人体有害的气体、细小灰尘、细菌、霉等。有害气体包括：苯、甲醛、五氯苯、乙酸丁酯、甲苯、二甲苯、苯乙烯等挥发性有机化合物 (volatile organic chemicals，VOC)及氡等。生物性污染物(biological contaminants)包括：细菌、霉、病毒、尘螨、蟑螂、动物的皮屑、唾液及花粉等。特别是，当尘螨、霉、宠物(pet)、蟑螂(cockroach)、细菌等分泌的物质其大小等于或小于微米时，吸入后会诱导免疫反应并引发炎症性呼吸器官疾病。
室内空气中含有栖息于包括人、宠物、尘螨、蟑螂等在内的多种生命体的皮肤、胃肠道、呼吸系统等的多种细菌及霉，同时，还含有栖息或流入于包括建筑物在内的构造物内部及周边的多种细菌及霉。
栖息于室内空气中的公知的细菌包括芽孢杆菌(Bacillus sp.)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)、斯氏假单胞菌(Pseudomonas stutzeri)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)、链霉菌(Streptomycetes)、棒状杆菌科(Corynebacteriaceae)、大肠杆菌(Escherichia coli)等。
另外，研究表明，在栖息于上述室内空气中的多种细菌或者源于其中的内毒素(lipopolysaccharide，LPS)或肽聚糖(peptidoglycan)的作用下，诱导免疫细胞及肺表皮细胞生成炎症性细胞因子。
另外，革兰氏阴性细菌经常向外分泌细胞外小泡(outer membrane vesicles)，革兰氏阴性细菌分泌的细胞外小泡由双层磷脂构成，形状成球型，其大小为20-200 nm。上述细胞外小泡不仅含有LPS，而且还含有能够对宿主的炎症反应进行调节的外膜蛋白(outer membrane protein)。最近，本发明人发现，革兰氏阳性细菌向外分泌细胞外小泡，通过蛋白质组分析可知，小泡内含有诱发炎症的蛋白质。
炎症性呼吸器官疾病大致分为在上呼吸道发生的鼻炎及鼻窦炎，在下呼吸道发生的哮喘及支气管炎，在小呼吸道发生的毛细支气管炎，在肺实质发生的肺气肿、肺炎等。在临床上，作为导致呼吸道阻塞的疾病分为以可逆性呼吸道阻塞为特征的哮喘和以非可逆性呼吸道阻塞为特征的慢性阻塞性肺病 (chronic obstructive pulmonary disease，COPD)，作为慢性阻塞性肺病的源发性疾病，包括慢性阻塞性支气管炎、慢性阻塞性毛细支气管炎、肺气肿等。关于哮喘的源发性物质，栖息于室内空气中的蛋白质(过敏原)起重要作用，关于慢性阻塞性肺病的病因，吸烟等刺激性因素起重要作用。
现已知，关于哮喘与慢性阻塞性肺病的发生，炎症具有重要作用，但是，炎症的状态却各不相同。如果是哮喘，嗜酸性粒细胞性炎症起重要作用，如果是慢性阻塞性肺病，非嗜酸性粒细胞性或者中性粒细胞性炎症起重要作用。但是，对于重症哮喘患者来说，反而是中性粒细胞性炎症起重要作用，特别是，对于伴随有非可逆性呼吸道阻塞的哮喘患者来说，中性粒细胞性炎症起重要作用。尤其是，当发生慢性肺炎时，呼吸道及肺实质发生的免疫功能异常起重要作用。本发明人发现，Th2 免疫反应对嗜酸性粒细胞性炎症的发生起重要作用， Th1及Th17免疫反应对中性粒细胞性炎症的发生起重要作用。
另外，炎症诱发癌症的事实很早以前就已经提出，最近研究发现，在针对源自栖息于肠道细菌的毒素的Th17 免疫反应作用下会诱发大肠癌，在共栖于胃内的幽门螺杆菌（Helicobacter pylori）作用下，不仅会诱发慢性胃炎，而且还会诱发胃癌。关于慢性阻塞性肺病与肺癌的病因，有人提出了是由相同致病因子引发疾病群的假设，最近，临床研究表明，与吸烟无关，慢性阻塞性肺病本身是导致肺癌发生的重要危险因素。
发明内容
技术问题
本发明人发现，室内空气中含有由各种细菌等分泌的细胞外小泡，当上述细胞外小泡被哺乳动物吸入时就会诱发炎症性呼吸器官疾病，本发明人基于此而完成了本发明。
本发明的目的在于，提供一种含有源于室内空气的细胞外小泡的组合物及利用上述细胞外小泡对炎症性呼吸器官疾病等进行诊断、预防及/或者治疗的方法。
具体地说，本发明的目的在于，提供一种将源于室内空气的细胞外小泡注入动物构建呼吸器官疾病动物模型并利用上述动物模型对预防或治疗呼吸器官疾病的备选药物进行筛选的方法。另外，本发明的目的在于，提供一种预防或治疗呼吸器官疾病的疫苗及对呼吸器官疾病的致病物质进行诊断的方法，为预防呼吸器官疾病的发生及恶化而抑制室内空气中细胞外小泡的活性或者除去上述细胞外小泡的方法，测定室内空气中细胞外小泡的浓度并对相关于呼吸器官疾病发生的室内空气质量进行评估的方法等。
但是，本发明所要解决的技术课题并不仅限于上面提到的课题，上面未提到的其它相关课题在以下的表述中都有所涉及，相关领域的工作人员可根据以下记载明确理解。
技术方案
本发明的一方面，提供了一种含有源于室内空气的细胞外小泡的组合物。
依据上述本发明的一个实施例，上述细胞外小泡可以源于室内灰尘、尘螨、霉、蟑螂、宠物的分泌物、花粉、人的皮屑、等，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以由栖息于室内空气中的细菌分泌，上述细菌包括栖息于室内灰尘、尘螨、霉、蟑螂、宠物的分泌物、植物、人的皮屑等的细菌，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以是由2种以上细菌分泌的细胞外小泡的混合物。
依据上述本发明的另一实施例，上述细菌包括葡萄球菌(Staphylococcus)、微球菌(Micrococcus)、肠球菌(Enterococcus)、假单胞菌(Pseudomonas)、链霉菌(Streptomycetes)及棒状杆菌(Corinebacterium)。
依据上述本发明的另一实施例，上述细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、人葡萄球菌 (Staphylococcus hominis)、里拉微球菌(Micrococcus lylae)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、斯氏假单胞菌 (Pseudomonas stutzeri)、浅黄假单胞菌(Pseudomonas luteola)及大肠杆菌(Escherichia coli)。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡包括由室内空气中的霉分泌的细胞外小泡，上述霉分泌的细胞外小泡包括由栖息于室内灰尘的霉分泌的细胞外小泡。
依据上述本发明的另一实施例，源于上述细菌或者霉的细胞外小泡可以从细菌或者霉培养液中分离，上述细胞外小泡可以从细菌或者霉培养液中自然分泌或者人工分泌。
本发明的另一方面，提供了一种将源于室内空气的细胞外小泡注入动物而构建的疾病模型。
上述本发明的细胞外小泡如前面所述。
依据上述本发明的一个实施例，上述动物模型可以是老鼠，但并不仅限于此。
上述疾病包括鼻炎、鼻窦炎、鼻咽癌、哮喘、支气管炎、慢性阻塞性肺病、毛细支气管炎、肺炎及肺癌等。
上述本发明的注入包括通过鼻腔、口腔及气管(trachea)注入。
本发明的另一方面，提供了一种利用源于室内空气的细胞外小泡对预防或治疗疾病的备选药物进行筛选的方法。
上述本发明的细胞外小泡如前面所述。
上述本发明的疾病包括由室内空气中的细胞外小泡诱发或者导致恶化的鼻炎、鼻窦炎、鼻咽癌、支气管炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、毛细支气管炎、肺炎及肺癌等。
依据上述本发明的一个实施例，上述筛选方法的特征在于，将备选药物注入上述本发明的动物疾病模型。
依据上述本发明的另一实施例，上述筛选方法的特征在于，将源于室内空气的细胞外小泡从体外处理于细胞时处理备选药物。上述细胞包括炎症细胞、上皮细胞及成纤维细胞等。
依据上述本发明的另一实施例，上述筛选方法包括：将备选物质与源于室内空气的细胞外小泡一起注入后测定炎症相关媒介的标准，但并不仅限于此。
本发明的另一方面，为预防或者治疗疾病而提供了一种含有源于室内空气的细胞外小泡的疫苗。
上述本发明的细胞外小泡如前面所述。
上述本发明的疾病包括由源于室内空气的细胞外小泡引发的鼻炎、鼻窦炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管炎、支气管扩张症、毛细支气管炎、肺炎、肺癌等。
依据上述本发明的一个实施例，上述疾病包括由源于室内空气的细菌或霉引发的鼻窦炎、支气管扩张症、肺炎等。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而使用源于转化的细菌或者霉的细胞外小泡，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而使用源于经化学物质处理的细菌或者霉的细胞外小泡，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而使用经化学物质处理的细胞外小泡，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例， 上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而与药物并用注入，但并不仅限于此。
本发明的另一方面，提供了一种预防或者治疗感染的含有源于室内空气的细胞外小泡的疫苗。
上述本发明的细胞外小泡如前面所述。
上述本发明的感染包括由源于室内空气的细菌或者霉引发的感染，作为一个实例，包括由源于医院室内空气的细菌或者霉引发的感染。
依据上述本发明的一个实施例，上述感染包括由细菌或者霉引发的鼻窦炎、支气管炎、支气管扩张症、肺炎及败血症等。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而使用源于转化的细菌或者霉的细胞外小泡，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例， 上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而使用源于经化学物质处理的细菌或者霉的细胞外小泡，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而使用经化学物质处理的细胞外小泡，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡可以基于增强效果或者减少副作用的目的而与药物并用注入，但并不仅限于此。
本发明的另一方面，提供了一种利用源于室内空气的细胞外小泡诊断上述细胞外小泡导致的疾病发生或者恶化相关的致病因子的方法。
本发明的另一方面，提供了一种利用源于室内空气的细胞外小泡诊断源于室内空气的细菌或者霉导致的感染发生或者恶化相关的致病因子的方法。
上述本发明的细胞外小泡如前面所述。
上述本发明的细胞外小泡引发的疾病包括由存在于室内空气的细胞外小泡引发的鼻炎、鼻窦炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管炎、支气管扩张症、毛细支气管炎、肺炎及肺癌等。
依据上述本发明的一个实施例，上述疾病包括由源于室内空气的细菌或者霉引发的鼻窦炎、支气管扩张症及肺炎等。
上述细菌或者霉引发的感染包括鼻窦炎、哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管扩张症、肺炎及败血症等。
依据上述本发明的另一实施例，上述诊断方法包括对存在于室内空气的细胞外小泡所含遗传物质的碱基序列进行分析，但并不仅限于此。上述遗传物质包括16S rRNA，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述诊断方法包括对存在于室内空气的细胞外小泡所含蛋白质进行测定，但并不仅限于此。
依据上述本发明的另一实施例，上述诊断方法包括对存在于室内空气的细胞外小泡的免疫反应进行测定，但并不仅限于此。上述免疫反应测定包括对存在于室内空气的细胞外小泡的抗体进行测定，但并不仅限于此。
上述本发明的诊断可以利用室内灰尘进行。另外，上述诊断可以利用源于痰的样本、源于胸腔积液的样本、源于鼻涕的样本、源于小便的样本及源于血液的样本等。
本发明的另一方面，为了预防疾病发生及恶化而提供了一种抑制室内空气中细胞外小泡的活性或者除去上述细胞外小泡的方法。
上述本发明的疾病包括由源于室内空气的细胞外小泡引发的鼻炎、鼻窦炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管炎、支气管扩张症、毛细支气管炎、肺炎及肺癌等。
除去上述细胞外小泡的活性可通过将细胞外小泡经热处理或者将细胞外小泡经有特殊作用的化学物质进行处理，但并不仅限于此。上述化学物质包括抑制细胞外小泡内蛋白、LPS (lipopolysaccharide)及肽聚糖活性的物质等，上述LPS活性抑制化学物质包括多粘菌素B (polymyxin B)。
上述本发明的一个实施例，可以利用除去上述细胞外小泡活性的装置。上述装置可以利用将上述细胞外小泡经热处理或者将细胞外小泡经有特殊作用的化学物质进行处理的方法等，但并不仅限于此。
上述本发明的另一实施例，可以利用除去上述细胞外小泡的装置。上述装置包括微滤器，其孔的大小(pore size)为10 nm至200 nm，但并不仅限于此。
本发明的另一方面，作为对于相关呼吸器官疾病发生或者恶化的室内空气质量进行评估的方法，提供了一种以测定室内空气中细胞外小泡的浓度为特征的方法。
上述本发明的一个实施例，上述细胞外小泡的浓度测定可以通过测定细胞外小泡的遗传物质完成，上述遗传物质包括16S rRNA。
上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡的浓度测定可以通过测定细胞外小泡的蛋白质完成。
上述本发明的另一实施例，上述细胞外小泡的浓度测定可以通过利用显微镜测定细胞外小泡的数量完成，上述显微镜可以利用高分辨率光学显微镜或者电子显微镜。
本发明的另一方面，提供了一种包括将源于室内空气的细胞外小泡注入哺乳动物的预防或者治疗疾病的方法。
上述本发明的细胞外小泡如前面所述。
上述本发明的疾病包括由源于室内空气的细胞外小泡引发的鼻炎、鼻窦炎、鼻咽癌、哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管炎、支气管扩张症、毛细支气管炎、肺炎及肺癌等。
依据上述本发明的一个实施例，上述疾病包括由源于室内空气的细菌或者霉引发的鼻窦炎、支气管扩张症、肺炎及败血症等。
上述本发明的注入包括皮下注射及粘膜注入。
技术效果
本发明人发现，室内空气中含有源于细菌等的细胞外小泡，当吸入上述细胞外小泡(特别是，源于革兰氏阴性细菌的细胞外小泡)时，就会诱发肺的Th17及/或者Th1免疫反应，由此诱发中性粒细胞性肺炎，并导致发生重症哮喘和慢性阻塞性肺病等呼吸器官疾病，于是基于此完成了本发明。因此，应用本发明的源于室内空气的细胞外小泡可以获得如下多种效果。
具体地说，本发明将存在于室内空气的细胞外小泡注入动物构建呼吸器官疾病动物模型，利用上述动物模型可以对预防或者治疗呼吸器官疾病的备选药物进行筛选及发掘。即，为了研发预防或者治疗疾病的药物，准确把握致病物质是非常重要的。例如：将致病物质从体外注入细胞的过程中，可以对备选药物进行处理以检验其效果，可以将备选药物注入上述动物模型以检验其效果。因此，本发明为了研发预防或者治疗由源于室内空气的细胞外小泡引发疾病的药物，通过应用存在于室内空气的细胞外小泡的体外筛选系统及/或者动物模型能够有效地发掘预防或者治疗由存在于室内空气的细胞外小泡引发的呼吸器官疾病的药物。
另外，本发明能够准确诊断重症哮喘、慢性阻塞性肺病、肺癌等呼吸器官疾病的致病因子。即，可以应用通过源于室内空气的细胞外小泡的遗传物质碱基序列分析、蛋白质分析或者免疫反应测定而诊断呼吸器官疾病的致病因子的方法。
准确把握疾病的致病因子对于研发能够预防或者治疗疾病的疫苗是必不可少的。就病毒性感染疾病而言，将致病病毒以弱毒化的形态注入体内，诱发针对病毒的免疫反应，从而研发预防疫苗。现在，能够利用预防疫苗有效地预防由病毒引发的疾病。本发明基于存在于室内空气的细胞外小泡是呼吸器官疾病的致病因子的事实，通过应用细胞外小泡调节在体内引发的免疫反应，从而可以研发出有效的疫苗。
另外，本发明基于源于室内空气的细胞外小泡是呼吸器官疾病的致病因子的事实，通过测定源于室内空气的细胞外小泡的浓度，可以对相关于导致呼吸器官疾病的发生或者恶化的室内空气质量进行评估。另外，利用可进行热处理或者化学物质处理的空气净化装置等，抑制室内空气中细胞外小泡的活性或者除去致病性细胞外小泡，从而可以预防或者治疗呼吸器官疾病的发生及恶化。
附图说明
图1是从采集的室内灰尘中分离细胞外小泡的过程的示意图；
图2是通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)对从室内灰尘中分离的细胞外小泡的形状及大小进行分析的示意图；
图3是将室内灰尘通过老鼠的鼻腔注入而诱发炎症性呼吸器官疾病(肺炎)的过程的示意图；
图4是将室内灰尘通过老鼠的鼻腔注入时对支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量进行测定的示意图；
图5是将室内灰尘通过老鼠的鼻腔注入而诱发炎症性呼吸器官疾病(肺炎)时通过细胞内细胞因子染色（intracellular cytokine staining）对肺组织中CD4+ T细胞的细胞因子表达进行测定的示意图；
图6是将老鼠巨噬细胞利用从室内灰尘中分离的细胞外小泡(Dust-EV)与水溶性成份(可溶灰尘Dust-soluble)进行处理后对分泌的细胞因子量通过酶联免疫吸附试验进行测定的示意图；
图7是将老鼠巨噬细胞利用从室内灰尘中分离的细胞外小泡(Dust-EV)进行处理时TNF-α与IL-6的分泌量随着注入细胞外小泡用量的增加而增加的示意图；
图8是将存在于室内空气的细胞外小泡(Dust-EV)经多粘菌素B (PMB) 或者热(heat)处理后注入老鼠巨噬细胞时对TNF-α与IL-6的分泌量进行测定的示意图；
图9是对由存在于室内空气的细胞外小泡(Dust-EV)引发的体内（in vivo）先天免疫反应进行评估的方案；
图10是为了根据图9所示方案对由存在于室内空气的细胞外小泡(Dust-EV)引发的体内（in vivo）先天免疫反应进行评估，从而对肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量进行测定的示意图；
图11是评估细胞外小泡及小泡内LPS对反复注入存在于室内空气的细胞外小泡(Dust-EV)诱发的体内后天免疫反应及由此引发肺炎所起作用的方案；
图12是根据图11所示方案对将存在于室内空气的细胞外小泡(Dust-EV)及小泡经多粘菌素B (PMB)处理引发肺炎进行评估，从而对肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量进行测定的示意图；
图13是为了根据图11所示方案对将源于室内空气的细胞外小泡(Dust-EV)及小泡经多粘菌素B (PMB)处理引发的后天免疫反应进行评估，从局部淋巴结中分离免疫细胞并通过细胞内细胞因子染色对免疫细胞中IFN-γ与IL-17的表达形式进行评估的示意图；
图14是根据图11所示方案将源于室内空气的细胞外小泡(Dust-EV)及小泡经多粘菌素B (PMB)处理时通过ELISA方法测定针对从室内灰尘中分离的小泡的血清内特异抗体的示意图；
图15是显示从室内灰尘中分离的细胞外小泡(Dust-EV)中存在针对大肠杆菌的16s rRNA及源于大肠杆菌的小泡(E.coli-OMV)特异抗体发生反应的蛋白质的示意图；
图16是将源于大肠杆菌的细胞外小泡按1次通过鼻腔注入时在支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中对炎症性细胞因子的分泌进行测定的示意图；
图17是将源于大肠杆菌的小泡(EC-EV)反复注入3周时对引发的肺炎进行评估的方案；
图18是显示将源于大肠杆菌的小泡(EC-EV)反复注入时的肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量的示意图；
图19是将源于大肠杆菌的高用量的细胞外小泡(EC-EV)反复注入4周时对组织学变化进行评估的方案；
图20是根据19所示方案注入源于大肠杆菌的小泡(EC-EV)时诱发肺组织中以肺泡的破坏为特征的肺气肿的示意图；
图21是对尘螨中的细胞外小泡进行分离的方案；
图22是通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)和动态光散射法(dynamic light scattering，DLS)对从尘螨中分离的细胞外小泡的形状及大小进行分析的示意图；
图23是将老鼠巨噬细胞利用源于尘螨的细胞外小泡(HDM-EV)进行处理时测定细胞因子量的示意图；
图24是为了对由源于尘螨的细胞外小泡(HDM-EV)引发的体内先天免疫反应进行评估，对肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量进行测定的示意图；
图25是为了对由源于尘螨的细胞外小泡(HDM-EV)引发的体内先天免疫反应进行评估，在支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中对细胞因子的生成进行测定的示意图；
图26是为了对由源于尘螨的细胞外小泡(HDM-EV)引发的体内后天免疫反应进行评估，对肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量进行测定的示意图；
图27是为了对由源于尘螨的细胞外小泡(HDM-EV)引发的体内后天免疫反应进行评估，在支气管肺泡灌洗液中对由Th17细胞分泌的IL-17的生成进行测定的示意图；
图28是在室内灰尘中培养细菌和霉的示意图；
图29是对栖息于室内灰尘中的细菌进行分离并鉴定的过程示意图；
图30是为了对由源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡(S-EV)及经热处理的小泡引发的体外先天免疫反应进行评估，向老鼠巨噬细胞注入上述细胞外小泡时对TNF-α与IL-6进行测定的示意图；
图31是对由源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应进行评估的方案；
图32是根据图30所示方案将源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡(S-EV)通过鼻腔注入并对支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量进行测定的示意图；
图33是根据图30所示方案对支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡(S-EV)诱发的IL-6分泌进行测定的示意图；
图34是评估小泡内蛋白质或者抗热成份对源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发的免疫反应所起作用的方案；
图35是根据图33所示方案将源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡(S-EV)经热处理后通过鼻腔注入时对支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中炎症细胞数量进行测定的示意图；
图36是根据图33所示方案将源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡(S-EV)经热处理后通过鼻腔注入时，通过酶联免疫吸附试验对支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)中IL-6的量进行测定的示意图；
图37是将源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV) 1 μg间隔1周通过腹腔注入3次的过程中对老鼠血液中小泡特异抗体的量进行测定的函数图；
图38是从体外向注入有源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)疫苗的老鼠脾脏细胞中注入源于大肠杆菌的细胞外小泡处理时对分泌的IFN-g量进行测定的函数图；
图39是从体外向注入有源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)疫苗的老鼠脾脏细胞中注入源于大肠杆菌的细胞外小泡处理时对分泌的IL-17量进行测定的函数图；
图40是显示通过大肠杆菌(EC)感染构建的败血症模型中老鼠致死率的示意图；
图41是显示通过腹腔注入大肠杆菌(EC)构建的败血症模型中源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)疫苗对因败血症导致的致死率所起效果的函数图；
图42是显示通过腹腔注入大肠杆菌(EC)构建的败血症模型中血液内大肠杆菌数量(CFU)随是否接种源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)而变化的函数图；
图43是在接种了源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)的老鼠中通过腹腔反复(3次)注入高用量的源于大肠杆菌的细胞外小泡(5 μg)后在6小时内对老鼠血清中IL-6进行测定的示意图。
具体实施方式
当吸入室内空气中的有害物质时会诱发呼吸器官疾病。过敏性反应的特征为免疫学过敏反应，虽然当单独吸入蛋白质时会诱发免疫耐受，但是，当代替依靠先天免疫反应的针对蛋白质的免疫耐受而同时吸入诱导免疫反应的物质与蛋白质时，就会发生以对蛋白质的记忆为特征的后天免疫反应(致敏)。如果诱导蛋白质致敏作用，即使吸入低浓度的蛋白质，也会通过针对蛋白质的免疫反应诱发炎症。在室内空气中的有害物质中，就气体而言，虽然气体本身的毒性会诱发炎症，但是，不会诱发由后天免疫反应引起的炎症。相反，室内空气中的生物性污染物的特征在于，同时带有诱发先天免疫反应的物质和蛋白质，因此，能够同时诱发先天免疫反应和后天免疫反应。但是，到目前为止，还没有研究表明室内空气含有源于细菌等的细胞外小泡或者室内空气中的细胞外小泡是呼吸器官疾病的致病物质。本发明人首次阐述，室内空气中含有源于细菌等的细胞外小泡，当将其吸入时就会诱发呼吸器官疾病，并基于此完成了本发明。
另外，炎症根据嗜酸性粒细胞的渗透与否区分为嗜酸性粒细胞性及非嗜酸性粒细胞性(或者中性粒细胞性)炎症。慢性炎症大多由以针对蛋白质的过敏反应(后天免疫反应)为特征的免疫机能异常而引发，嗜酸性粒细胞性炎症由针对蛋白质的Th2免疫反应而引发，中性粒细胞性炎症由Th17及/或者Th1免疫反应而引发。
本发明人发现，当吸入室内灰尘时会诱发中性粒细胞性炎症，室内灰尘的成份中细胞外小泡是诱发中性粒细胞性炎症的主要致病因子，当利用抵抗源于革兰氏阴性细菌的内毒素(endotoxin或者脂多糖，LPS)活性的药物(多粘菌素B)进行处理时，细胞外小泡的活性就会被抑制，基于此，最先阐述源于室内空气中革兰氏阴性细菌的细胞外小泡是诱发以中性粒细胞性炎症反应为特征的呼吸器官疾病的致病物质。
中性粒细胞性肺炎对于伴随有非可逆性呼吸道阻塞的重症哮喘和慢性阻塞性肺病的发生来说，是一种重要的病态生理。与吸烟无关，以中性粒细胞性炎症为特征的慢性阻塞性肺病是诱发肺癌发生的重要危险因素，实际上，慢性阻塞性肺病患者的1/3是因肺癌而死亡。另外，研究人员通过动物实验表明，Th17免疫反应及由此引发的中性粒细胞性炎症会诱发大肠癌。这意味着，肺部发生的Th17免疫反应及/或者中性粒细胞性炎症不仅是诱发重症哮喘与慢性阻塞性肺病的重要病因，而且还与肺癌的发生有着密切的关联。
本发明提供了一种含有源于室内空气的细胞外小泡的组合物及利用上述细胞外小泡对炎症性呼吸器官疾病等进行诊断、预防及/或者治疗的方法。
在本发明中，所谓"室内"是指包括建筑物(buildings)在内的构造物(structures)内部及其周边，所谓"室内空气"不仅包括室内灰尘，而且还包括栖息于室内的尘螨、蟑螂、宠物、植物、人等分泌的物质。
在本发明中，所谓"源于室内空气的细胞外小泡"是指存在于包括建筑物在内的构造物内部及其周边空气中的细胞外小泡，例如，源于室内空气的细胞外小泡既包括由栖息于室内空气中的细菌分泌的细胞外小泡，也包括由与栖息于室内的存在于尘螨、蟑螂、宠物、植物、人等的细菌分泌而存在于室内空气中的细胞外小泡，其特征在于，大小比原来的细胞小，但并不仅限于此。
室内空气中不仅栖息有多种细菌和霉，而且含有栖息于包括人、宠物、尘螨、蟑螂等在内的多种生命体的皮肤、消化器官、呼吸器官等的多种细菌和霉，同时还含有栖息于或流入包括建筑物在内的构造物内部及周边的多种细菌和霉。室内特别是床垫和地毯等处存在有大量的灰尘，灰尘中不仅栖息有大量的细菌和霉，而且还含有由尘螨等动物分泌的物质。利用真空吸尘器获得室内灰尘后，再利用纱布将头发等较大的物质除去后进行培养。在这种情况下，室内灰尘中培养有多种霉和细菌。另外，将除去较大物质后的室内灰尘溶于生理盐水(phosphate buffer saline，PBS)后，经过多次离心分离过程，提取出细胞外小泡。通过透射电子显微镜照片观察，可以看到从室内空气中分离的细胞外小泡成大小为50-100 nm的球状。
另外，为了评估室内的灰尘是否诱发炎症性呼吸器官疾病，在3周内通过鼻腔向C57BL/6老鼠注入灰尘。最后一次通过鼻腔注入灰尘后间隔24小时后进行评估时，可以观察到老鼠支气管肺泡灌洗液(bronchoalvelolar lavege fluid，BALF)中炎症细胞数量增加，特别是，中性粒细胞的数量显著增加。上述结果表明，室内的灰尘会诱发以中性粒细胞渗透为特征的炎症性呼吸器官疾病(肺炎)。
为了评估诱发上述呼吸器官疾病的免疫学机制，通过流式细胞术(Flow cytometry)对T细胞表达的细胞因子进行了评估。由T细胞诱发的后天免疫反应大致分为由分泌IFN-γ的Th1细胞、分泌IL-4，IL-5，IL-13等的Th2细胞及分泌IL-17的Th17细胞诱发的免疫反应。由灰尘诱发的中性粒细胞性肺炎主要是以生成IL-17的CD4+T细胞(Th17细胞)和分泌IFN-γ的Th1细胞为媒介的炎症反应。Th1及Th17免疫反应对呼吸道及肺实质发生的以中性粒细胞性炎症为特征的炎症性呼吸器官疾病(哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管扩张症、肺炎等)及肺癌起着重要作用，特别是，Th1炎症对肺气肿的发生起重要作用，Th17炎症对肺癌的发生起重要作用。
为了评估室内灰尘中的细胞外小泡和水溶性成份对室内灰尘诱发炎症反应所起的作用，当向老鼠巨噬细胞(RAW 264.7)注入从灰尘中分离的细胞外小泡和水溶性因子时，虽然TNF-α（alpha）的分泌全都增加，但是，IL-6的分泌主要在注入细胞外小泡时增加。这意味着，存在、于室内空气的细胞外小泡对基于IL-6的免疫反应及炎症的发生起着重要作用。
存在于室内空气的细胞外小泡可以由栖息于室内空气的细菌或者栖息于包括人、宠物、尘螨、蟑螂等在内的多种生命体或者栖息于包括建筑物在内的构造物内部及周边的多种细菌分泌。这种细胞外小泡含有细菌蛋白、LPS、肽聚糖等物质，从而能够诱发炎症反应。
为了对由存在于室内空气的细胞外小泡诱发的体外先天免疫反应进行评估，将老鼠巨噬细胞(RAW 264.7)利用从室内灰尘中分离的细胞外小泡进行处理。巨噬细胞分泌能够诱发炎症的TNF-α及IL-6等，利用上述细胞外小泡进行处理时，TNF-α及IL-6的量与细胞外小泡的用量成比例增加。
IL(interleukin)-6作为发生炎症反应时初期分泌的炎症性细胞因子对初期炎症反应起尺度作用，在通过Th17 细胞免疫反应诱发中性粒细胞性炎症时，它是重要的媒介。另外，IL-6使体内细胞内STAT3 信号（signaling）增加而通过引发肺细胞的增殖、血管生成、免疫反应抑制等而与肺癌的发生相关，而且IL-6在针对抗原的T细胞后天免疫反应发生过程中对原态T（naive T）细胞分化为Th17细胞起重要作用。
因此，存在于室内空气的细胞外小泡使巨噬细胞中IL-6的量增加的事实意味着，上述细胞外小泡诱导炎症反应不仅能够引发哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管扩张症、肺炎等炎症性呼吸器官疾病，而且还会引发肺癌等疾病。
如上所述，存在于室内空气的细胞外小泡含有能够诱导炎症反应的多种蛋白质和LPS等物质，因此，通过存在于室内空气的细胞外小泡诱导的炎症反应可以对上述物质的作用进行评估。
多粘菌素B的作用在于与LPS的功能团即脂质A（lipid A）反应而抑制LPS的功能。据此，当将老鼠巨噬细胞利用从灰尘中分离的细胞外小泡和多粘菌素B一起进行处理时，就会阻碍由细胞外小泡诱发的IL-6及TNF-α的分泌，这意味着，源于革兰氏阴性细菌的细胞外小泡对于上述媒介的分泌起着重要作用。
另外，细胞外小泡中含有多种蛋白质，为了评估小泡中含有的蛋白质的作用，利用在100℃条件下加热20分钟的细胞外小泡对老鼠巨噬细胞进行处理。上述小泡经热处理后，TNF(Tumor necrosis factor) -α（alpha）的分泌就会减少，但是，IL-6的分泌反而会增加。这意味着，对TNF-α（alpha）的分泌来说小泡内蛋白质起着重要作用，但是，对IL-6的分泌来说具有耐热性的小泡成份起着重要作用。
另外，可以将从室内空气中分离的细胞外小泡注入实验动物构建呼吸器官疾病动物模型。与此相关，将从灰尘中分离的细胞外小泡注入老鼠并评估其对肺炎的发生及IL-6的分泌产生的影响。当将多种浓度的细胞外小泡通过呼吸道注入老鼠时，可以确认随着浓度的变化炎症细胞的流入会增加，注入细胞外小泡的老鼠中IL-6的生成量也增加了。上述结果表明，体外实验中在小泡作用下炎症细胞中IL-6分泌增加的现象在体内系统中也会再现。
将从室内灰尘中分离的细胞外小泡反复注入时评估是否发生炎症性呼吸器官疾病。当将小泡通过呼吸道注入3周时，发生了中性粒细胞性炎症。相反，当将多粘菌素B与小泡一起注入时，炎症明显受抑制。这意味着，源于革兰氏阴性细菌的细胞外小泡对炎症的发生起着重要作用。
另外，对干预肺炎发生的免疫学病因进行评估的结果表明，当注入从灰尘中分离的小泡时，表达肺组织内IFN-γ及IL-17的T细胞显著增加，当将多粘菌素B与上述小泡一起注入时，上述细胞的渗透显著减少。上述结果表明，灰尘中的细胞外小泡引发的中性粒细胞性肺炎通过Th1及Th17免疫反应诱导，小泡内LPS 成份对其发生起着重要作用。
另外，对源于室内空气的细胞外小泡特异抗体进行测定的结果表明，当注入小泡时，小泡特异IgG1及IgG2a抗体显著增加，当将多粘菌素B与小泡一起注入时就显著减少。上述结果表明，当室内灰尘中的细胞外小泡通过呼吸道吸入时，血清中生成小泡特异抗体，小泡内LPS成份对其生成起着重要作用。
大肠杆菌作为革兰氏阴性细菌栖息于肠道中，室内灰尘中含有大肠杆菌，研究表明大肠杆菌分泌细胞外小泡。对从室内灰尘中分离的细胞外小泡中是否含有源于大肠杆菌的细胞外小泡的情况进行了评估。当利用针对源于大肠杆菌的细胞外小泡中含有的特异16S rRNA的引物对基因型进行分析时，可观察到阳性评价。另外，制作针对源于大肠杆菌的细胞外小泡的抗体并利用它对从灰尘中分离的细胞外小泡蛋白质实施免疫印迹（Western Blot）时，从灰尘中分离的细胞外小泡内蛋白质与源于大肠杆菌的小泡特异抗体相结合。上述结果表明，室内灰尘中含有源于大肠杆菌的细胞外小泡。大肠杆菌是一种主要栖息于大肠内的细菌，它栖息于尘螨、蟑螂、宠物、人等的肠道内，持续分泌细胞外小泡。这意味着，尘螨等通过大便持续分泌源于大肠杆菌的细胞外小泡。
当将源于大肠杆菌的细胞外小泡通过呼吸道注入1次并对体内的炎症媒介分泌进行评估时，TNF-α（alpha）与IL-6的分泌与细胞外小泡的注入量成比例增加。
当将源于大肠杆菌的细胞外小泡反复注入时，为了评估是否引发炎症性呼吸器官疾病，如果在3周内每周通过鼻腔注入2次时，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量依赖源于大肠杆菌的细胞外小泡注入量的增加而增加。
上述方法中，当将高用量(100 ng)的细胞外小泡反复注入4周并对肺气肿的发生进行评估时，如果注入细胞外小泡的情况下，就会发生肺气肿。这意味着，如果室内灰尘中含有高浓度的如源于大肠杆菌的细胞外小泡的致病性小泡，而将其吸入时，就会诱发导致非可逆性呼吸道阻塞的肺气肿。
源于室内灰尘的细胞外小泡也可以通过灰尘中的多种细菌而生成，栖息于包括室内空气中的尘螨、蟑螂、人、宠物等在内的多种生命体内的细菌可以分泌细胞外小泡。
本发明人从栖息于室内灰尘中的尘螨中分离细胞外小泡。为了对源于尘螨的细胞外小泡引发的体外免疫反应进行评估，利用细胞外小泡对老鼠巨噬细胞进行了处理。在巨噬细胞中TNF-α（alpha）与IL-6的分泌与小泡的浓度成比例增加。另外，由小泡分泌的上述炎症媒介通过抵抗LPS的多粘菌素B处理而被抑制。这意味着，源于尘螨的细胞外小泡可以诱发呼吸器官疾病，其中含有从革兰氏阴性细菌分泌的细胞外小泡。
如上所述，源于尘螨的细胞外小泡在体外实验中可以诱发先天免疫反应。为了对其在体内系统中的再现情况进行评估，将源于尘螨的细胞外小泡通过老鼠的呼吸道注入1次，并评估先天免疫反应情况。肺部的炎症细胞渗入依赖细胞外小泡的浓度的增加而增加，同时，炎症媒介即TNF-γ及IL-6的分泌也增加。
基于上述体内系统的先天免疫反应结果，当源于尘螨的细胞外小泡被反复吸入时，对是否发生肺炎进行评估的结果表明，当将源于尘螨的细胞外小泡注入3周时，会诱发中性粒细胞性肺炎，同时，IL-17的分泌也增加。
上述结果表明，在源于尘螨的细胞外小泡作用下会引发中性粒细胞性肺炎，这主要是由Th17 免疫反应作媒介而引发的现象。
本发明人对栖息于室内灰尘中的细菌进行分离，并鉴定革兰氏阳性细菌的存在。结果鉴定出，革兰氏阳性细菌包括金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ， S.aureus)、人葡萄球菌(Staphylococcus hominis)等。
金黄色葡萄球菌作为革兰氏阳性细菌，本发明人最近曾发表过最早发现其分泌细胞外小泡。为了对源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发的体外免疫反应进行评估，利用源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡对老鼠巨噬细胞进行处理。在源于金黄色葡萄球菌的小泡的作用下，巨噬细胞中TNF-α（alpha）与IL-6的分泌增加。上述结果表明，源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡能够诱发炎症性呼吸器官疾病及肺癌。
如上所述，源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡在体外实验中诱发先天免疫反应。为了通过体内系统对其进行确认，将源于互不相同浓度(1 μg，10 μg)的金黄色葡萄球菌的细胞外小泡通过呼吸道注入老鼠。随着细胞外小泡注入量的增加，流入老鼠肺部的炎症细胞也增加，特别是，中性粒细胞的过量流入。支气管肺泡灌洗液中IL-6的分泌量也随着细胞外小泡浓度的增加而增加。
上述结果表明，源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡诱发肺炎的发生，同时，也可以预测其与IL-6引发Th17后天免疫反应之间的关联性。
另外，为了确认体内系统中源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡内蛋白质的作用，将经热处理的细胞外小泡通过呼吸道注入老鼠。在这种情况下，对引发肺癌及蛋白质特异Th17后天免疫反应起核心作用的IL-6生成量全都减少。上述结果表明，对于吸入灰尘引发Th17免疫反应而导致肺炎的发生而言，源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡内蛋白质的作用就是增加IL-6的生成。
研究疾病的致病因子可以利用致病因子实施免疫调节。本发明人发现，当吸入源于室内空气中大肠杆菌的细胞外小泡时，会诱发炎症性呼吸器官疾病。当将源于大肠杆菌的细胞外小泡按低用量注射时，会生成细胞外小泡特异抗体，通过针对小泡的特异T细胞反应可以诱导分泌IFN-γ和IL-17的Th1及Th17免疫反应。因此，将源于大肠杆菌的细胞外小泡作为疫苗事先注射后，当诱发大肠杆菌感染时，大肠杆菌感染就显著受抑制。另外，当事先注入上述小泡疫苗时，源于大肠杆菌的细胞外小泡通过血管吸收而引发的炎症媒介的分泌就显著受抑制。这意味着，因注射源于细菌的细胞外小泡而诱发免疫反应，通过该免疫反应不仅能够有效地预防由室内空气中细胞外小泡引发的疾病，而且还能够有效地预防由室内空气中细菌引发的感染。
下面，为了有助于对本发明的理解，将提供理想的实施例。但是，以下实施例仅在于使受众能够更加容易地理解本发明，不能依据以下实施例限定本发明的内容。
实施例
实施例 1. 从室内灰尘中提取细胞外小泡及研究特性
本发明人为了确认室内空气中是否存在细胞外小泡，实施了从室内灰尘中分离细胞外小泡并进行鉴定的实验。
具体地说，使用真空吸尘器收集特定居住地寝具上的灰尘。再将真空吸尘器的过滤器内的灰尘移入干净的玻璃瓶中，并测定其质量。将室内灰尘5 g溶于装有200 ml PBS的烧杯中在4℃条件下放置12小时。然后，利用纱布一次性地将较大的异物过滤，将过滤后的溶液分装于高速离心管(fuge tube)内，在4℃，10，000 x g条件下连续2次实施高速离心分离(high speed centrifugation)15分钟。取180 ml左右的上层液按1次通过孔的大小为0.45 μm的薄膜过滤器(membrane filter)，然后，分装于70 ml容量的超速离心管(ultracentrifuge tube)中，在4℃，100，000 x g的条件下超速离心分离(ultracetrifugation)4小时。除去上层液将离心管下部的沉淀物用PBS溶解，并提取细胞外小泡。
为了研究源于室内灰尘的细胞外小泡特性而分离细胞外小泡时，采用蔗糖垫法进行追加提炼。向35 ml容量的超速离心管内依次放入0.5 ml的2.5 M蔗糖和1 ml的0.8 M蔗糖、32 ml除去异物的溶液，在4℃，100，000 x g的条件下超速离心分离4小时。超速离心分离后，细胞外小泡根据其密度位于2.5 M蔗糖层与0.8 M蔗糖层之间。从离心管的上端开始除去溶液，分离出含有细胞外小泡的层。
图1是从室内灰尘中采集细胞外小泡的过程的示意图。图2是通过透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)对源于室内灰尘的细胞外小泡的形状及大小进行拍摄的示意图，可以看出，它由脂双层构成，大小为50-100 nm，大致成球型。
上述结果表明，室内灰尘中含有细胞外小泡，这意味着，室内空气中含有细胞外小泡。
实施例 2. 由室内采集的灰尘诱发的炎症性呼吸器官疾病(肺炎)
本发明人实施了评估从室内采集的灰尘是否诱发哺乳动物发生炎症性呼吸器官疾病的实验。
具体地说，将室内灰尘或者通过40 μm过滤器的室内灰尘100 ng溶于30 μl的PBS中。老鼠采用C57BL/6，6周龄雌性，每群5只，将溶于PBS (phosphate buffered saline)的灰尘在第0，1，7，8， 14，15日时通过呼吸道注入，在第16日测定老鼠的肺炎。在这种情况下，将注入PBS的老鼠作为对照群，将注入上述灰尘的老鼠作为实验群。
将氯胺酮(ketamin)与甲苯噻嗪(xylaxine)混合形成的麻醉液注入老鼠腹腔实施麻醉后，切开胸部，露出气管，将导管插入呼吸道并进行结扎。将无菌生理盐水按每次注入1 ml共注入2次，对呼吸道进行灌洗，提取支气管肺泡灌洗液。将支气管肺泡灌洗液在4℃条件下按800 x g标准离心分离10分钟后，将细胞颗粒(cell pellet)溶于PBS溶液中。将上述细胞颗粒通过细胞离心涂片器(cytospin)涂抹到载玻片上，实施迪芙-奎克 (Diff Quick)染色，在光学显微镜1000倍视野内可以观察到300个以上的炎症细胞，按照巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞分类分别测定各炎症细胞的数量。
图3是将室内灰尘通过老鼠的鼻腔注入而诱发炎症性呼吸器官疾病(肺炎)的过程的示意图，图4是测定支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数量的示意图。
如图4所示，如果将灰尘通过鼻腔注入，就会引发肺炎(BAL细胞增加)，特别是，中性粒细胞(neutrophil)渗透显著增加。另外，当将灰尘通过40 μm过滤器除去较大的物质后通过鼻腔注入时(过滤灰尘filtered dust)，就会诱发以中性粒细胞渗透为特征的中性粒细胞性肺炎。这意味着，诱发中性粒细胞性肺炎的物质是存在于室内灰尘物质中的40 μm以下的成份。
上述结果表明，当将从室内采集的灰尘被哺乳动物吸入时，就会诱发以中性粒细胞性炎症为特征的呼吸器官疾病。
实施例 3. 从室内采集的灰尘引发的中性粒细胞性肺炎的免疫学发生机制
上述实施例2的结果表明，由室内灰尘诱发哺乳动物发生中性粒细胞性肺炎，与此相关，本发明人实施了阐述其免疫学机制的实验。
具体地说，通过上述实施例2的方法从老鼠中摘出诱发肺炎的肺。将摘出的肺组织利用刮脸刀片切碎后，添加IV型胶原酶(collagenase type IV)，在37℃条件下培养10分钟。然后，利用细胞滤网(cell strainer)将从组织中分离细胞，在4℃条件下按800 x g标准离心分离10分钟。
将离心分离的肺细胞放置红细胞溶解溶液中10分钟，将红细胞破坏。然后，再按上述条件进行离心分离。利用血细胞计数器（Hematocytometer）测定细胞数量，按2 x 106/ml的浓度溶于装有RPMI1640和10% FBS (fetal bovine serum)、抗生素(antibiotics)的溶液中。在将细胞放入48孔板的一天前用PBS对48孔板上针对CD3和CD28的抗体进行稀释使其浓度分别达到1 μg/ml，然后，向每个孔中放入250 μl，保持4℃放置10~18小时，将抗体包覆到孔上。
将肺细胞按上述浓度准备好后，将包覆有抗体的48孔板用PBS进行灌洗，除去板底部未进行包覆而以自由形式分散的抗体。然后，放入肺细胞，经过4小时后，放入10 μg/ml的阻碍向细胞外分泌蛋白质等物质的布雷菲德菌素 A再培养2小时，使向细胞外分泌的细胞因子存放到细胞内。完成培养的细胞利用带有荧光的CD4 (FITC)，CD8 (PE-Cy5)，CD3 (APC)抗体对肺细胞表面的各种蛋白质进行染色。30分钟后在4℃条件下按800 x g标准离心分离10分钟，进行灌洗后，利用4% 福尔马林在细胞表面穿孔，使针对细胞因子的抗体能够顺利进入。利用福尔马林处理10分钟后，利用带有荧光的IFN-γ(PE)，IL-4 (PE)，IL-10 (PE)，IL-17 (PE)抗体将细胞因子染色30分钟。利用流式细胞仪（FACS Calibur）测定流入肺内的T细胞中细胞因子的表达。
图5是利用流式细胞术(Flow cytometry)测定按上述方法的CD4+ T细胞的细胞因子表达量的示意图。如上述实施例2所述，图5中的过滤灰尘（filtered dust）使灰尘通过40 μm过滤器。T细胞引发的后天免疫反应大致分为，由分泌IFN-γ的Th1细胞、分泌IL-4的Th2细胞及分泌IL-17的Th17细胞引发的反应。
如图5所示，因灰尘引发肺炎的老鼠与对照群(PBS)相比，其肺组织中表达IFN-γ和IL-17的CD4+ T细胞增加了，如果将灰尘按40 μm大小过滤，则表达IL-17的CD4+ T细胞进一步增加。这意味着，室内灰尘引发的中性粒细胞性肺炎是由生成IFN-γ和IL-17的CD4+T细胞(Th1和Th17细胞)诱发的。Th1和Th17免疫反应不仅是诱发在呼吸道及肺实质发生的炎症性呼吸器官疾病即重症哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管扩张症、肺炎等疾病，而且还诱发肺癌，因此，它作为一种重要的免疫学过敏反应，Th1细胞分泌的IFN-γ对肺气肿的发生起重要作用， Th17细胞分泌的IL-17对肺癌的发生起重要作用。
上述结果表明，室内灰尘能够诱发Th1及Th17免疫反应，并导致以中性粒细胞性肺炎为特征的哮喘、慢性阻塞性肺病、支气管扩张症、肺炎等炎症性呼吸器官疾病和肺癌的发生。
实施例 4. 室内空气中细胞外小泡引发的体外先天免疫反应
在上述实施例1中，确认室内灰尘即室内空气中含有细胞外小泡，并对从室内灰尘中分离的细胞外小泡引发的体外先天免疫反应进行了评估。为此，将对老鼠巨噬细胞(RAW 264.7)利用从室内灰尘中分离的细胞外小泡进行了处理。
首先，将室内灰尘溶于PBS后，将细胞外小泡与水溶性成份分离。为了对上述小泡与水溶性成份引发的先天免疫反应进行评估，利用细胞外小泡和水溶性成份对老鼠巨噬细胞进行处理，收集上层液，测定细胞因子的量，其结果如图6所示。
具体地说，将老鼠巨噬细胞(RAW264.7)在24孔板上培养24小时使其达到1 x 105。利用PBS进行灌洗后，将DMEM培养基分别利用从灰尘中分离的细胞外小泡(Dust-EV，0.1 ㎍/ml)及水溶性成份(Dust-soluble，8 ㎍/ml)进行处理后，培养15小时。收集培养液，在4℃条件下按800 x g标准离心分离10分钟，收集上层液，通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)方法测定细胞因子的量。
如图6所示，与从室内灰尘中分离的小泡和水溶性成份导致TNF-α分泌增加的情况不同，IL-6的分泌主要由小泡诱导。这意味着，存在于室内灰尘中的细胞外小泡对基于IL-6的炎症疾病的发生起着重要作用。
另外，采用与上述相同的方法将细胞外小泡100 ng/ml和1 μg/ml处理后，测定细胞因子的量，结果表明，随着注入小泡的用量增加，TNF-α与IL-6的分泌量也增加(参照图7)。
另外，革兰氏阴性细菌的外膜(outer membrane)中含有LPS，室内灰尘中含有LPS，已知LPS能够诱发先天免疫反应。图8是对从室内灰尘中分离的细胞外小泡引发的免疫反应中LPS作用(LPS作用抑制剂；多粘菌素B，PMB)和蛋白质作用(通过热处理的破坏)进行评估的示意图。可以看出，小泡引发的TNF-α分泌在经PMB或者热处理的情况下全都显著减少。相反，小泡引发的IL-6分泌在经PMB处理的情况下虽然显著减少，但在经热处理的情况下反而增加。
实施例3的结果表明，室内灰尘能够诱导Th17免疫反应并引发中性粒细胞性肺炎。另外，上述实施例4的结果表明，由室内灰尘引发Th17免疫反应诱发的中性粒细胞性肺炎与从室内灰尘中分离的细胞外小泡引发IL-6分泌的增加相关，即室内空气中的细胞外小泡使对T细胞分化为Th17起核心作用的细胞因子即IL-6的分泌增加，结果诱导Th17免疫反应，最终引发中性粒细胞性肺炎。另外，诱发这种炎症性呼吸器官疾病的致病性小泡是含有LPS的小泡。
实施例 5. 室内空气中的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应
本发明人在实施例4中确认的体外先天免疫反应的基础上，还实施了对室内空气中细胞外小泡引发的体内先天免疫反应进行评估的实验，实验方案如图9所示。
具体地说，用C57BL/6，6周龄雌性老鼠(每群4只)做实验，将从室内灰尘中分离的细胞外小泡0.01，0.1，1 mg溶于PBS 30 ㎕中，通过鼻腔注入1次，间隔24小时后进行评估。在这种情况下，将注入PBS的老鼠作为对照群。根据上述方法用麻醉液将老鼠麻醉后，提取支气管肺泡灌洗液。将支气管肺泡灌洗液在4℃条件下按800 x g标准离心分离10分钟后，将细胞颗粒(cell pellet)溶于PBS溶液中，测定流入的炎症细胞数量。
图10是对肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液(BAL)中炎症细胞数量进行测定的示意图。如图10所示，与对照群(PBS)相比，在注入细胞外小泡的情况下(Dust-EV)，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量与小泡用量成比例增加。另外，对于诱发Th17免疫反应的核心细胞因子即IL-6来说，其分泌量与细胞外小泡注入量成比例增加。
上述结果表明，体外系统及体内系统中从室内灰尘中分离的细胞外小泡诱发先天免疫反应，从室内灰尘中分离的细胞外小泡促进IL-6的分泌，从而诱导Th17免疫反应并引发以中性粒细胞性肺炎为特征的呼吸器官疾病。
实施例 6. 室内空气中的细胞外小泡引发的体内后天免疫反应
根据图11所示方案，实施了对从室内灰尘中分离的细胞外小泡引发的体内后天免疫反应进行评估的实验。
具体地说，用C57BL/6，6周龄雌性老鼠(每群4只)做实验，将从室内灰尘中分离的细胞外小泡1㎍溶于PBS 30 ㎕中，通过鼻腔按每周注入2次注射3周，最后一次注入经过24小时后进行评估。另外，为了对含有LPS的细胞外小泡的作用进行评估，将小泡利用PMB处理后，同时实施注入实验。
图12是显示肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数量的示意图，可以看出，与对照群(PBS)相比，细胞外小泡注入群(Dust-EV)中炎症细胞的数量显著增加。另外，当将从室内灰尘中分离的细胞外小泡用PMB处理时 (Dust-EV+PMB)，由小泡导致增加的炎症细胞数量显著减少。这意味着，当反复露出于室内空气中的小泡时，就会引发中性粒细胞性肺炎，含有LPS的小泡对其发生起着重要作用。
另外，本发明人为了对与肺炎发生相关的免疫学发病机制进行评估，从局部淋巴结中分离免疫细胞，对免疫细胞中IFN-γ与IL-17的表达形式进行评估的结果如图13所示。评估结果表明，如果注入从灰尘中分离的小泡，与注入PBS的情况相比，局部淋巴结内T细胞数量显著增加，特别是，表达IFN-γ与IL-17的T细胞显著增加。另外，当将细胞外小泡利用PMB进行处理时，局部淋巴结内T细胞的数量减少，表达IFN-γ和IL-17的T细胞数量也显著减少。
图14是通过ELISA方法对血清中含有的从室内灰尘中分离的小泡特异抗体进行测定的示意图。结果表明，当注入从室内灰尘中分离的小泡时，小泡特异IgG1及IgG2a的量显著增加，这意味着，当将小泡利用PMB处理时，其量的减少程度与注入PBS的群相似。
上述结果表明，室内空气中细胞外小泡引发的肺炎以中性粒细胞性炎症为特征，这意味着，其由Th1及Th17免疫反应引发，对此含有LPS的小泡起着重要作用。另外，当吸入室内空气中的小泡时，血清中小泡特异IgG1及IgG2a抗体增加，因此，通过测定血清中小泡特异抗体就可以对反复暴露的致病性小泡进行诊断。
实施例 7. 室内空气中的细胞外小泡中含有源于大肠杆菌的细胞外小泡
上述实施例5及实施例6的结果表明，含有LPS的小泡对室内空气中细胞外小泡诱导的体内先天免疫反应及后天免疫反应的发生起着重要作用。LPS是一种存在于革兰氏阴性细菌外膜中的物质，显然含有LPS的小泡源于革兰氏阴性细菌。
大肠杆菌作为革兰氏阴性细菌，存在于室内空气中，它分泌含有LPS的细胞外小泡，本发明人发现，该小泡内不仅含有LPS，而且还含有诱导免疫及炎症反应的蛋白质。因此，本发明人对从室内灰尘中分离的细胞外小泡中含有源于大肠杆菌的细胞外小泡的情况进行了评估。
为了评估从室内灰尘中分离的细胞外小泡内含有源于大肠杆菌的小泡，利用大肠杆菌特异性16s rRNA引物评估基因型。具体地说，将从灰尘中分离的细胞外小泡在100 ℃条件下加热20分钟，使其溶出DNA和RNA，将其利用模板(template)合成cDNA。将合成的cDNA通过模板放入大肠杆菌特异性16s rRNA引物，将94 ℃ (40秒)和72 ℃ (40秒)条件以40次周期执行两步法聚合酶链反应(PCR)。
结果表明，与源于大肠杆菌的细胞外小泡(E.coli-EV)相似，从室内灰尘中分离的细胞外小泡(Dust-EV)中也含有大肠杆菌的16s rRNA(参照图15)。
另外，确认从室内灰尘中分离的小泡中含有源于大肠杆菌的小泡所带有的蛋白质。为此，利用由源于大肠杆菌的小泡生成的抗体(anti-E.coli EV Ab)实施免疫印迹(Western Blot)，结果表明，室内灰尘中含有包括细菌等的颗粒成份和从室内灰尘中分离的与源于大肠杆菌的小泡特异抗体反应的蛋白质(参照图15)。
上述结果表明，室内空气中含有源于大肠杆菌的细胞外小泡。
实施例 8. 源于大肠杆菌的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应
从实施例7中可知，室内空气含有源于大肠杆菌的细胞外小泡，基于此，对源于大肠杆菌的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应进行评估。
源于大肠杆菌的细胞外小泡从大肠杆菌培养液中提取。具体地说，将大肠杆菌放入装有3 ml LB溶液的试管内在37 ℃条件下培养4小时后，将其中的10 μl移入装有500 ml LB溶液的8个2L三角烧瓶中，在37 ℃条件下培养4小时。将培养液分装于12个350 ml容量高速离心分离管中，然后在4 ℃，5，000 x g条件下以15分钟连续执行2次。将4 L左右的上层液1次通过带有0.45 μm大小孔的薄膜过滤器(membrane filter)，再利用仅能让100 kDa以下的分子通过的超滤系统(Quixstand system)将其浓缩至300 ml。将浓缩液1次通过带有0.22 μm大小孔的薄膜过滤器后，将其分装于50 ml容量的超速离心管(ultracentrifuge tube)内，在4℃， 150，000 x g条件下超速离心分离(ultracetrifugation)3小时。除去上层液将离心管下部的沉淀物用PBS溶解，并提取源于肠道大肠杆菌的细胞外小泡。
为了测定免疫反应，用C57BL/6，6周龄雌性老鼠(每群4只)做实验，将按上述方法提取的源于大肠杆菌的细胞外小泡1，10，100 ng溶于PBS 30 ㎕中，通过鼻腔注入1次后，间隔2，8，24小时后，对媒介的分泌进行评估。在这种情况下，将注入PBS的老鼠作为对照群。根据上述方法利用麻醉液将老鼠麻醉后，提取支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)。
图16是对支气管肺泡灌洗液中源于大肠杆菌的细胞外小泡引发的炎症性细胞因子的分泌进行测定的示意图。结果可以看出，在注入小泡的情况下，与对照群相比，第8小时的支气管肺泡灌洗液中TNF-α与IL-6的量增加，这意味着，其量与小泡的用量成比例增加。
实施例 9. 反复注入源于大肠杆菌的细胞外小泡引发的肺炎
在实施例8中，基于源于大肠杆菌的小泡按用量依赖性促进诱导Th17免疫反应的IL-6分泌的事实，通过反复注入源于大肠杆菌的小泡对肺炎进行评估。
如图17的方案所示，将源于大肠杆菌的细胞外小泡10，100 ng溶于PBS 30 ㎕中并通过鼻腔向C57BL/6，6周龄雌性老鼠(每群4只)注入，每周注射2次注射3周后，最后一次注入小泡后在第24小时时进行评估。
图18是对肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液中炎症细胞数量进行测定的示意图，与对照群(PBS)相比，源于大肠杆菌的细胞外小泡注入群(EC-EV)中炎症细胞数量增加，这意味着，其数量依赖小泡注入用量的增加而增加。
实施例 10. 源于大肠杆菌的细胞外小泡引发的肺气肿
在实施例9中，当将源于大肠杆菌的细胞外小泡通过呼吸道反复注入3周时，基于按用量依赖性引发肺炎的事实，将高用量的小泡反复注入4周并对其结构性变化进行评估。
如图19的方案所示，将源于大肠杆菌的细胞外小泡100 ng溶于PBS 30 ㎕中并通过鼻腔向C57BL/6，6周龄雌性老鼠(每群4只)注入，每周注射2次注射4周后，在第24小时时对其组织学变化进行评估。
图20是显示肺组织中肺泡破坏情况的示意图，可以看出，在注入源于大肠杆菌的小泡的情况下，与对照群相比，会引发以肺泡破坏为特征的肺气肿，如果将其通过弦长(chord length)进行定量，在注入小泡的情况下，与对照群相比，弦长显著增加。
上述结果表明，当将源于大肠杆菌的细胞外小泡按较高的浓度反复暴露时，就会引发导致非可逆性呼吸道阻塞的肺气肿的发生。
实施例 11. 通过栖息于室内空气中的尘螨构建粗提取物（crude extract）及提取细胞外小泡及研究特性
为了确认栖息于室内的尘螨(house dust mite，HDM)中是否含有细胞外小泡，本发明人实施了从尘螨中提取细胞外小泡并研究其特性的实验。
具体地说，延世大学医用节肢动物素材库中购入尘螨20 g，将其移入干净的烧杯中，放入500 ml PBS后，在 4℃条件下搅拌24小时。然后，将其分装于高速离心分离管(high speed centrifuge tube)内，在4℃，10，000 x g条件下高速离心分离(high speed centrifugation)15分钟，连接执行2次。将450 ml左右的上层液1次通过带有0.22 μm大小孔的薄膜过滤器(membrane filter)，然后，将其分装于70 ml容量的超速离心管(ultracentrifuge tube)内，在4℃，100，000 x g条件下超速离心分离(ultracetrifugation)3小时。除去上层液，将离心管下部的沉淀物用PBS溶解，提取细胞外小泡。
为了研究源于尘螨的细胞外小泡的特性，在将细胞外小泡进行分离时，利用碘克沙醇（opti-prep）溶液进行追加提炼。向10 ml容量的超速离心管内依次放入溶有分离的沉淀物的4.8 ml的50% opti-prep溶液和3 ml的40%及2.5 ml的10% opti-prep溶液，在4℃，100，000 x g条件下超速离心分离2小时。进行超速离心分离后，确认白色层位于40% opti-prep层和10% opti-prep层之间。从离心管的上部开始每次按1 ml的量分装后，为了将opti-prep溶液除去，分别混合9 ml的PBS后，装入10 ml容量的超速离心管内，在4℃，100，000 x g条件下超速离心分离(ultracetrifugation)2小时。除去上层液，将离心管下部的沉淀物再次溶于1 ml的PBS中，提取细胞外小泡。
图21是从尘螨中获得细胞外小泡的过程的示意图。图22是利用透射电子显微镜(transmission electron microscope，TEM)及动态光散射法(dynamic light scattering，DLS)对源于尘螨的细胞外小泡的形状及大小进行测定的示意图，可以看出，它由脂双层构成，大小为100-200 nm，大致成球型。
上述结果表明，尘螨提取物中含有细胞外小泡。
实施例 12. 栖息于室内空气中源于尘螨的细胞外小泡引发的体外先天免疫反应
在实施例11中，确认存在源于尘螨的细胞外小泡，并对源于尘螨的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应进行了评估。为此，将老鼠巨噬细胞 (RAW 264.7)利用源于尘螨的细胞外小泡进行处理。
具体地说，将老鼠巨噬细胞(RAW264.7)在24孔板上培养24小时使其达到1 x 105。用PBS进行灌洗后，将DMEM培养基分别利用从尘螨中分离的细胞外小泡(HDM-EV) 100 ng，1 μg，10 μg进行处理后，培养15小时。收集培养液，在4℃条件下按800 x g标准离心分离10分钟，收集上层液，通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)方法测定细胞因子的量。
如图23所示，从尘螨中分离的小泡可以诱导TNF-α和IL-6的分泌，随着处理用量的增加，TNF-α和IL-6的生成也增加。
实施例 13. 栖息于室内空气中源于尘螨的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应
在实施例11中，确认存在源于尘螨的细胞外小泡，在实施例12中，确认源于尘螨的小泡会引发免疫反应。基于此，对源于尘螨的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应进行了评估。
具体地说，用C57BL/6，6周龄雌性老鼠(每群5只)做实验，将源于尘螨的细胞外小泡0.1，1，10 μg溶于PBS 30 μl中，通过鼻腔注入，间隔12小时后，对炎症细胞渗透和媒介的分泌进行了评估。在这种情况下，将注入PBS的老鼠作为对照群。根据上述方法利用麻醉液将老鼠麻醉后，提取支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)。
图24是对源于尘螨的细胞外小泡引发的炎症进行评估的示意图。它显示了肺炎的指标即支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量。如图24所示，与对照群(PBS)相比，注入源于尘螨的细胞外小泡的群(EV)中炎症细胞数量增加，这意味着，炎症细胞数量与小泡的注入用量成比例增加。
图25是对支气管肺泡灌洗液中细胞因子的分泌进行测定的示意图。如图25所示，在注入小泡的情况下，与对照群相比，支气管肺泡灌洗液（BAL fluid）内TNF-α和IL-6的量增加，这意味着，其量依赖小泡用量的增加而增加。特别是，在注入10 ug小泡的群中，TNF-α和IL-6的量显著增加。
实施例 14. 反复注入栖息于室内空气中源于尘螨的细胞外小泡而引发的肺炎
在实施例13中，确认源于尘螨的细胞外小泡会引发免疫反应，基于此，对源于尘螨的细胞外小泡引发的体内后天免疫反应进行了评估。
具体地说，用C57BL/6，6周龄雌性老鼠(每群5只)做实验，将在实施例13中确认有效的源于尘螨的细胞外小泡10 μg按每天通过鼻腔注射1次注射3天，使其发生致敏，然后，在2周内每周通过鼻腔注射2次。间隔24小时后，评估炎症细胞渗透及炎症媒介的分泌，在这种情况下，将注入PBS的老鼠作为对照群。根据上述方法用麻醉液将老鼠麻醉后，提取支气管肺泡灌洗液(BAL fluid)。
图26是显示炎症细胞渗透的示意图，可以看出，在注入源于尘螨的小泡(HDM EV)的情况下，与对照群(PBS)相比，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量大大增加，特别是，中性粒细胞的数量显著增加。
图27是为了对后天免疫反应的类型进行分析而通过酶联免疫吸附试验对支气管肺泡灌洗液中细胞因子的生成量进行测定的示意图，可以看出，Th17细胞分泌的IL-17在注入源于尘螨的细胞外小泡作用下显著增加。
上述结果表明，当吸入尘螨中的细胞外小泡时，就会诱发以Th17免疫反应为媒介的中性粒细胞性肺炎。
实施例 15. 在室内灰尘中培养细菌和霉及进行细菌鉴定
室内空气中的细胞外小泡可以由室内灰尘中的多种细菌和霉而生成。本发明人利用真空吸尘器收集特定居住地的寝具上的灰尘。然后，将真空吸尘器过滤器中的灰尘移入干净的玻璃瓶中，并对其质量进行测定。将室内灰尘5 g放入装有200 ml PBS的烧杯中，在4℃条件下溶解12小时，再用纱布除去较大的物质。提取1份灰尘液，将其浓度按1/10的比例进行稀释，然后，在带有细菌和霉可以生长的培养液的板上涂抹灰尘液。经过一定的时间以后，确认细菌和霉的生长情况。如图28所示，室内灰尘中栖息有多种细菌和霉。
然后，本发明人实施了对室内灰尘中栖息的细菌进行分离及鉴定的实验。对室内灰尘中栖息的细菌进行分离的方法如图29所示。具体地说，将从床上收集的灰尘按实施例1所述方法溶解后，利用纱布将较大的物质除去。在这种情况下，提取1份灰尘液，将其浓度按1/10的比例进行稀释，然后，在带有细菌可以生长的培养液的板上涂抹灰尘液。经过一定时间以后，确认大小和颜色互不相同的多种菌落，分别接种菌落后，放入装有3ml营养液的试管内，在37℃条件下进行培养。然后，利用生化方法，使用鉴定细菌的微生物自动检测系统 VITEK装备，对栖息于灰尘中的细菌进行鉴定。结果作为革兰氏阳性细菌鉴定出金黄色葡萄球菌，人葡萄球菌。
因此，可以预测灰尘中的细胞外小泡含有革兰氏阳性细菌分泌的小泡。
实施例 16. 源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发的体外免疫反应及小泡内蛋白质的作用
最近，本发明人最先发现，革兰氏阳性细菌即金黄色葡萄球菌能够分泌细胞外小泡。为了源于室内空气中革兰氏阳性细菌的细胞外小泡对诱发呼吸器官疾病的发生所起的作用进行评估，从金黄色葡萄球菌培养液中按实施例1所述方法对金黄色葡萄球菌分泌的细胞外小泡进行分离，并评估其对呼吸器官疾病病因所产生的作用。
具体地说，将金黄色葡萄球菌接种到装有3 ml营养液的试管中，在37oC条件下培养6小时，然后，将其中的5 ml移入装有500 ml营养液的2 L三角烧瓶中，在37oC条件下培养4小时，使其吸光度(600 nm)值达到1.0。将培养液装入500 ml容量的高速离心分离管(high speed centrifuge tube)内，然后在4oC条件下按10，000 x g标准离心分离20分钟。将除去细菌的上层液1次通过带有0.45 μm大小孔的薄膜过滤器(membrane filter)，利用装有能够除去分子量在100 kDa以下蛋白质的薄膜超滤系统(Quixstand system)将其浓缩25倍。将浓缩液1次通过带有0.22 μm大小孔的薄膜过滤器，然后，将其装入70 ml容量的超速离心管(ultracentrifuge tube)内，在4oC条件下按150，000 x g标准超速离心分离(ultracetrifugation)3小时。将沉淀物利用PBS (phosphate buffered saline)进行悬浮(resuspension)后，提取源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡。
为了对源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发的体外免疫反应进行评估，将老鼠巨噬细胞(RAW264.7) 在24孔板上培养24小时使其达到1 x 105，利用PBS进行灌洗，除去FBS(fetal bovine serum)后，将对DMEM培养基利用源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡按1、10 μg/ml进行处理，将其作为对照群。这时，在100℃条件下煮沸20分钟，将利用除去耐热性较弱成份功能的源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡处理的细胞作为实验群。利用各细胞外小泡处理15小时后，收集培养液，在4℃条件下按800 x g标准离心分离10分钟，收集上层液，通过酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbant assay，ELISA)方法测定细胞因子的量。图29是对各具有代表性的炎症性细胞因子即TNF-α和IL-6进行测定的示意图。
如图30所示，对于TNF-α而言，利用经热处理的细胞外小泡(Heat-S-EV) 1 μg/ml处理的群，虽然其生成量减少至1/2以下，但是，利用10 μg/ml处理的群却没有太大的差异。相反，对于IL-6而言，利用源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡经热处理的群(Heat-S-EV)中，IL-6的生成量与小泡的浓度无关而显著少。
上述结果表明，源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡内蛋白质或者耐热性较弱的成份对于由IL-6引发的炎症反应起重要作用。
实施例 17. 源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发的体内先天免疫反应及肺炎
为了对源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发的体内免疫反应进行评估，用C57BL/6，6周龄雌性 (每群3只)做实验，将溶于PBS的源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡1、10 μg通过老鼠呼吸道注入的群作为实验群，将PBS通过呼吸道注入的群作为对照群。将细胞外小泡注入1次后，第二天测定诱发老鼠早期肺炎和细胞因子IL-6的量(参照图31的实验方案)。
图32是通过呼吸道注入源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡后对支气管肺泡灌洗液中炎症进行评估的示意图。可以看出，将细胞外小泡通过呼吸道注入的群(S-EV)中，支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量与小泡浓度成比例增加。特别是，炎症细胞中中性粒细胞的数量显著增加。
另外，通过酶联免疫吸附试验对支气管肺泡灌洗液中诱发Th17免疫反应的核心物质即IL-6的生成量进行测定的结果如图33所示，可以看出，IL-6的分泌量也与源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡(S-EV)的浓度成比例增加。
上述结果表明，当源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡被哺乳动物吸入时，就会诱发中性粒细胞性肺炎，另外，源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡促进在Th17免疫反应中起核心作用的IL-6的生成。
实施例 18. 蛋白质或者耐热性较弱成份对源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡引发先天免疫反应的发生所起的作用
在上述实施例16的体外实验基础上，通过体内实验检验源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡内蛋白质对先天免疫反应的发生所起的作用。
具体地说，用C57BL/6，6周龄雌性(每群3只)老鼠做实验，将细胞外小泡1、10 μg通过老鼠呼吸道注入的群作为对照群。将细胞外小泡在100℃条件下煮沸20分钟的群作为实验群。在老鼠中注入1次细胞外小泡后，第二天测定诱发老鼠早期肺炎和细胞因子IL-6的量(参照图34的实验方案)。
图35是将源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡通过呼吸道注入后评估支气管肺泡灌洗液中炎症反应的示意图。可以看出，将经热处理的细胞外小泡10 μg通过呼吸道注入的群(Heat-S-EV 10μg)与对照群(S-EV 10μg)的肺炎(支气管肺泡灌洗液中炎症细胞的数量)没有太大的差异。
图36是通过酶联免疫吸附试验测定支气管肺泡灌洗液中IL-6量的示意图，与肺炎的情况不同，注入经热处理的源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡(1 μg，10 μg)的群与对照群相比，IL-6的生成量显著减少。
上述结果再次表明，源于金黄色葡萄球菌的细胞外小泡的蛋白质或者耐热性较弱成份对由IL-6引发的免疫反应及炎症性呼吸器官疾病的发生起重要作用。
实施例 19. 源于大肠杆菌的细胞外小泡疫苗的免疫学特性
将根据实施例8所述方法分离的源于大肠杆菌的细胞外小泡1 mg 按间隔1周的频率在3周内通过腹腔向C57BL/6 (雄性，6周，每群10只)注入3次。注入后分别间隔6 小时、24小时、7 天，提取老鼠血液，测定血液中细胞外小泡特异抗体。将包覆有源于大肠杆菌的小泡200 ng的黑色96 孔板上添加用1% BSA/PBS按1:500稀释的老鼠血清，在常温下培养2小时后，观察与过氧化物酶结合的老鼠抗体。
图37是对老鼠血液中源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)特异抗体的量随时间观察的示意图。如图37所示，细胞外小泡特异抗体从注入1次细胞外小泡7天后开始形成，第二次和第三次注入细胞外小泡后，会形成更多的抗体，第三次接种小泡疫苗7天后形成的抗体达到非常高的值。
根据上述方法，三次接种源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)7天后，从老鼠中分离脾脏细胞。向分离的脾脏细胞(2 x 104)中加入源于大肠杆菌的细胞外小泡100 ng，培养72小时后，分别通过ELISA方法测定与分泌脾脏细胞的免疫反应相关的细胞因子即IFN-g，IL-17， IL-4的量。
图38是显示将老鼠脾脏细胞利用源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)处理时分泌的IFN-g量的示意图。如图38所示，与从未接种源于大肠杆菌的细胞外小泡的老鼠群中提取的脾脏细胞相比，从接种了细胞外小泡的老鼠中提取的脾脏细胞分泌的IFN-g增加。
图39是显示将老鼠脾脏细胞利用源于大肠杆菌的细胞外小泡(EC_EV)处理时分泌的IL-17量的示意图。如图39所示，与从未接种源于大肠杆菌的细胞外小泡的老鼠群中提取的脾脏细胞相比，从接种了细胞外小泡的老鼠中提取的脾脏细胞分泌的IL-17增加。
上述结果表明，接种源于大肠杆菌的细胞外小泡时，会诱导针对细菌感染的防御机制即B细胞生成的抗体反应和T细胞免疫反应。特别是，T细胞免疫反应中，对细菌感染的防御起重要作用的分泌IFN-g的Th1免疫反应和分泌IL-17的Th17免疫反应通过接种源于大肠杆菌的细胞外小泡而有效地被诱导。
实施例 20. 源于大肠杆菌细胞外小泡疫苗对大肠杆菌感染引发败血症的效果
为了对源于大肠杆菌的细胞外小泡疫苗的效果进行评估，构建大肠杆菌感染引发的败血症动物模型。将大肠杆菌1 x 106，1 x 108，1 x 1010 CFU通过腹腔向C57BL/6 (雄性，6周，每群10只)注入，在5天内按间隔8小时的频率观察老鼠的存活率。
图40是显示由大肠杆菌(EC)感染导致老鼠致死率的示意图。如图40所示，当注入大肠杆菌1 x 1010 CFU时，老鼠在24小时内死亡，当注入大肠杆菌1 x 106、1 x 108 CFU时，对老鼠的生存没有什么影响。
根据实施例19所述方法，将源于大肠杆菌的细胞外小泡0.5、1 μg按间隔1周的频率在3周内通过腹腔向C57BL/6 (雄性，6周，每群10只)注入3次。完成3次接种源于大肠杆菌的细胞外小泡7天后，将大肠杆菌1 x 1010 CFU通过腹腔注入，在5天内按间隔8小时的频率观察老鼠的存活率。图41是观察源于大肠杆菌的细胞外小泡疫苗对根据上述方法构建的大肠杆菌感染引发败血症的发生所产生效果的示意图。如图41所示，5天后，与未接种源于大肠杆菌的细胞外小泡的老鼠存活率为20%相比，接种了源于大肠杆菌的细胞外小泡的老鼠群的存活率为80-100 %。
根据上述方法将源于大肠杆菌的细胞外小泡1 μg按间隔1周的频率通过腹腔接种3次后，将大肠杆菌1 x 1010 CFU通过老鼠腹腔注入，间隔6小时后，测定血液中大肠杆菌的数量，其结果如图42所示。
如图42所示，当接种源于大肠杆菌的细胞外小泡时，与从未接种源于大肠杆菌的细胞外小泡的老鼠中提取的血液中大肠杆菌的数量相比，接种了小泡的老鼠血液中大肠杆菌的数量显著减少。
上述结果表明，当事先将源于大肠杆菌的细胞外小泡作为疫苗注入时，就能够有效地预防由大肠杆菌引发的感染。
实施例 21. 源于大肠杆菌的细胞外小泡疫苗对源于大肠杆菌的细胞外小泡引发炎症发生的效果
为了评估小泡疫苗对源于大肠杆菌的细胞外小泡引发炎症的发生所起的效果，根据实施例19所述方法，将源于大肠杆菌的细胞外小泡1 μg按间隔1周的频率通过腹腔向C57BL/6 (雄性，6周，每群5只)注射3次进行接种后，将源于大肠杆菌的细胞外小泡通过腹腔注入后，测定血液中炎症媒介的分泌。
图43是按高用量向接种了源于大肠杆菌的细胞外小泡的老鼠注入源于大肠杆菌的细胞外小泡(5 μg，3次)6 小时后，提取老鼠血液对诱导血清内Th17免疫反应的炎症媒介即IL-6的量进行测定的示意图。可以看出，与未接种源于大肠杆菌的细胞外小泡的老鼠群相比，接种了源于大肠杆菌的细胞外小泡的群的血清内IL-6量显著减少。
上述结果表明，当将源于大肠杆菌的细胞外小泡作为疫苗按低用量事先注入时，就能够有效地预防由源于大肠杆菌的细胞外小泡引发的炎症。
如上所述，对本发明的技术思想进行了示例性说明， 通过上述的说明内容，本领域人员完全可以在不偏离本项发明技术思想的范围内，进行多样的修改、变更以及替换。本发明中记载的实施例及附图等仅为了对本发明进行说明，并不限定本发明的技术思想。因此，本领域人员可知，本发明的技术性范围并不局限于上述实施例及附图的内容。
工业实用性
依据本发明，利用源于室内空气的细胞外小泡可以对炎症性呼吸器官疾病等进行诊断、预防及/或者治疗。具体地说，将本发明的源于室内空气的细胞外小泡向动物注入，以构建呼吸器官疾病动物模型，利用上述动物模型能够有效地筛选及/或者发掘预防或者治疗呼吸器官疾病的备选药物。另外，本发明能够准确诊断重症哮喘、慢性阻塞性肺病、肺癌等呼吸器官疾病的致病因子，进而可用于能够预防及/或者治疗上述疾病的疫苗研发。

Claims (1)

1.一种利用源于室内空气中存在的大肠杆菌的细胞外小泡，提供诊断大肠杆菌感染引发的肺炎、肺气肿或败血症的致病因子诊断信息的同时测定室内空气质量的方法，其特征在于：
上述方法包括分析上述细胞外小泡中包含的16S rRNA的碱基序列的步骤。
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