BE1022373B1 - Nouveaux vaccins antipaludeens - Google Patents

Abstract

La présente invention concerne de nouvelles compositions pour l'immunisation contre le paludisme ainsi que des utilisations de telles compositions et des procédés de production de telles compositions. En particulier, l'invention concerne une composition immunogène comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active. Eventuellement, l'adjuvant comprend en outre un agoniste du TLR4.

Description

NOUVEAUX VACCINS ANTIPALUDEENS

Ces travaux ont été réalisés dans le cadre du Cooperative Research and Development Agreement W81XWH-14-0042 du 12 novembre 2013 chez GlaxoSmithKline Biologicals S.A., Walter Reed Army Institute of Research (WRAIR) et United States Army Medicals and Materiel Development Activity (USAMMDA).

Domaine technique

La présente invention concerne de nouvelles compositions pour l’immunisation contre le paludisme ainsi que des utilisations de telles compositions et des procédés de production de telles compositions. En particulier, l’invention concerne une composition immunogène comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active.

Contexte de l’invention

Le paludisme est l’un des problèmes sanitaires majeurs dans le monde. Au cours du 20ème siècle, un développement économique et social, mené conjointement avec des campagnes antipaludéennes, a entraîné l’éradication du paludisme de grandes zones du monde, réduisant la zone touchée de la surface du monde de 50 % à 27 %. Néanmoins, la moitié de la population mondiale vit dans des zones où le paludisme est transmis. Il est estimé que 3,3 milliards de personnes ont un risque de contracter le paludisme. Au cours de l’année 2010, l’Organisation Mondiale de la Santé a rapporté une estimation globale de 219 millions de cas de paludisme. La maladie a tué approximativement 660 000 personnes, dont l'immense majorité était des enfants de moins de cinq ans vivant en Afrique subsaharienne. L’une des formes les plus aiguës de la maladie est provoquée par le parasite protozoaire Plasmodium falciparum qui est responsable de la majeure partie de la mortalité attribuable au paludisme. D’autres espèces de Plasmodium qui peuvent provoquer le paludisme comprennent P. vivax, P. knowlesi, P. ovale et P. malariae. Le cycle de vie du parasite est complexe, nécessitant deux hôtes, l’homme et le moustique pour son accomplissement. L’infection de l’homme est initiée par l’inoculation de sporozoïtes par l’intermédiaire de la salive d’un moustique infecté. Les sporozoïtes migrent vers le foie et là infectent les hépatocytes (stade hépatique) où ils se différencient, par l’intermédiaire de l'étape intracellulaire exoérythrocytaire, au stade des mérozoïtes ils infectent les érythrocytes pour initier la réplication cyclique dans le stade sanguin asexué. Le cycle est complété par la différenciation d’un certain nombre de mérozoïtes dans les érythrocytes en gamétocytes du stade sexué qui sont ingérés par le moustique, où ils se développent par l’intermédiaire de toute une série d'étapes dans l’intestin moyen pour produire des sporozoïtes qui migrent vers la glande salivaire.

Le stade des sporozoïtes a été identifié comme une cible potentielle d’un vaccin antipaludéen. La protéine de surface principale du sporozoïte est connue comme la protéine circumsporozoïte (protéine CS). Le vaccin antipaludéen RTS,S basé sur la protéine CS a été en développement depuis 1987 et il est actuellement le vaccin antipaludéen candidat le plus avancé en étude. Ce vaccin cible spécifiquement le stade préérythrocytaire de P. falciparum. Des données récentes provenant d’un essai clinique en phase III à grande échelle, dans lequel RTS,S a été administré en trois doses, à un mois d’intervalle, ont montré que sur 18 mois de suivi, RTS,S avait presque divisé par deux le nombre de cas de paludisme chez les jeunes enfants (âgés de 5 à 17 mois à la première vaccination) et avait réduit d’environ un quart les cas de paludisme chez les nourrissons (âgés de 6 à 12 semaines à la première vaccination) (Otieno et al. (2013) les résultats ont été présentés à la 6th Multilateral Initiative on Malaria (MIM) Pan-African Conference, Durban). En dépit de ce succès du vaccin RTS,S, des vaccins antipaludéens avec une efficacité plus proche de 100 % sont encore nécessaires.

Dans la recherche de variantes d’antigènes pour une utilisation dans un vaccin antipaludéen, la protéine CelTOS, pour protéine de traversée cellulaire pour les ookinètes et les sporozoïtes a été idnetifiée. Il a été montré que CelTOS de P. berghei médie l’invasion paludéenne des cellules hôtes à la fois des vertébrés et des insectes et est nécessaire à l’établissement de leur infection réussie. Le document WO 2010/062859 est orienté vers l’utilisation de CelTOS en tant qu’antigène cible pour un vaccin antipaludéen préérythrocytaire. Il a été montré que l’immunisation de souris avec CelTOS de P. falciparum (PfCelTOS) combiné avec l’adjuvant de type émulsion eau dans l’huile MONTANIDE IS-720TM a induit une protection contre une épreuve avec P. berghei (voir également Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS One 5(8) e12294). D’autres travaux avec un CelTOS de P. berghei combiné avec l’adjuvant de type émulsion eau dans l’huile MONTANIDE ISA-720TM a indiqué que des réponses immunitaires à la fois humorales et cellulaires étaient nécessaires pour médier une protection stérile complète contre une épreuve par des sporozoïtes (Bergmann-Leitner et al. (2011) Vaccine 29: 5940). En utilisant un système d’imagerie in vivo (IVIS) et une quantification de la bioluminescence absolue sur des sites anatomiques chez des souris infectées, PfCelTOS combiné avec l’adjuvant de type émulsion eau dans l’huile MONTANIDE ISA-720™ a indiqué un rôle pour les mécanismes effecteurs

immunitaires à la fois humoraux et cellulaires (Bergmann-Leitner et al. (2014) Trials in Vaccinology 3: 6-10). En outre, il a été trouvé que des compositions de PfCelTOS adjuvées avec GLA-SE (une émulsion huile dans l’eau stable combinée avec un agoniste du récepteur de type Toll 4 (TLR4)) déclenchent de fortes réponses immunitaires du type Th1 chez les souris (Fox et al. (2012) Clin. Vaccine Immunol 19: 1633). Toutefois, dans une petite étude humaine chez des adultes en bonne santé n'ayant jamais été au contact du paludisme (« naïfs pour le paludisme »), il n’a été observé aucune protection (Cowden et al. (2012), Presentation at the 2012 ASTMH meeting, non publié).

De nombreux adjuvants différents ont été décrits et testés ; voir, par exemple, O'Hagan (2000) Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols. Homana Press,

Totowa, New Jersey. Les documents WO 96/33739 et WO 2007/068907 décrivent des adjuvants comprenant une fraction de saponine immunologiquement active, comme QS21, et éventuellement un agoniste du TLR4, comme le monophosphoryl-lipide A 3-O-désacylé (3D-MPL). Le vaccin RTS,S décrit ci-dessus est adjuvé avec AS01, une formulation liposomale contenant du QS21 et du 3D-MPL. Toutefois, les résultats obtenus avec des adjuvants sont souvent irréguliers en ce que le classement d’un groupe d’adjuvants pour leur efficacité avec un antigène particulier est souvent spécifique de cet antigène et un changement d’antigène entraînera fréquemment un classement différent. Les autorités réglementaires requièrent une analyse rigoureuse de l’efficacité, de la sécurité et de la stabilité des nouvelles combinaisons antigène-adjuvant.

Alors qu’un progrès significatif a été réalisé dans le domaine de la recherche et du développement de vaccins antipaludéens, il existe toujours un besoin de nouveaux vaccins antipaludéens qui sont hautement efficaces, sans risque et induisent un spectre large de réponses immunitaires à réactivité croisée. Résumé de l’invention

Dans un premier aspect de l’invention, il est proposé une composition immunogène comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant, où l’adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active.

Dans un autre aspect, l’invention concerne une composition immunogène comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant comprenant un adjuvant de saponine immunologiquement active et un agoniste du TLR4.

Dans un autre aspect, l’invention concerne une composition immunogène comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant, où l’adjuvant comprend du QS21.

Dans un autre aspect, l’invention concerne l’utilisation de ladite composition en médecine, en particulier dans la prévention du paludisme. L’invention concerne également un procédé pour l’immunisation contre le paludisme comprenant l’administration d’une composition de l’invention à un sujet humain.

Dans un autre aspect, l’invention concerne un kit comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant, où l’adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active. Dans un autre aspect, l’invention concerne un kit comprenant un premier récipient comprenant un antigène CelTOS et un second récipient comprenant un adjuvant, où l’adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active.

Dans encore un autre aspect, il est proposé un procédé de fabrication d’une composition immunogène selon l’invention comprenant l’étape de mélange d’un antigène CelTOS et d’un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active.

Brève description des figures

Figure 1 - Calendrier de l’immunisation et de l’échantillonnage.

Figure 2 - Concentrations des anticorps spécifiques de PfCelTOS en μg/ml déterminées par la technique ELISA.

Figure 3 - Splénocytes produisant de l’IFN-γ après stimulation ex vivo (nombre de cellules formant des spots (SFC) pour 106 splénocytes), GST = glutathion-S-transférase,

Pf30, Pf10 et Pf3 indiquent, respectivement, 30, 10 et 3 μg/ml de PfCelTOS. Pb10 et Pb3 indiquent, respectivement, 10 et 3 μg/ml de PbCelTOS. sc = sous-cutané ; im = intramusculaire

Figure 4 - Splénocytes produisant de l’IL-4 après stimulation ex vivo (nombre de cellules formant des spots (SFC) pour 106 splénocytes), GST = glutathion-S-transférase testée à 10 μg/ml, Pf30, Pf10 et Pf3 indiquent, respectivement, 30, 10 et 3 μg/ml de PfCelTOS. Pb10 et Pb3 indiquent, respectivement, 10 et 3 μg/ml de PbCelTOS ; sc = sous-cutané ; im = intramusculaire

Figure 5 - Capacité des compositions immunogènes à induire une protection stérile chez des souris contre une épreuve hétérologue avec des sporozoïtes de P. berghei. Jours 6, 8 et 14 se rapportent au nombre de jours après l’épreuve avec des sporozoïtes. Ces jours correspondent aux jours 76, 78 et 84 après le début de l’expérience.

Figure 6 - Réactivité (croisée) d’antisérums groupés E. coli exprimant PfCelTOS, PbCelTOS et CelTOS de P. knowlesi (PkCelTOS) recombinants, déterminée par une analyse Western blot.

Figure 7 - Test d’immunofluorescence sur des sporozoïtes fixés de P. falciparum.

Figure 8 - Inhibition de la motilité des sporozoïtes par des antisérums de souris.

Figure 9 - Réponses des anticorps après deux immunisations avec le vaccin PfCelTOS/AS01 chez des sujets individuels.

Description détaillée

Comme il a été expliqué ci-dessus, selon un aspect, l’invention concerne une composition immunogène comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant, où l’adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active.

Antigènes CelTOS

Le terme « antigène CelTOS », lorsqu’il est utilisé ici, indique un polypeptide CelTOS immunogène ou un polynucléotide codant pour un polypeptide CelTOS immunogène. CelTOS est également connu sous le nom de Ag2. Un « polypeptide CelTOS », lorsqu’il est utilisé ici, est un polypeptide comprenant la séquence de SEQ ID NO : 1 ou de SEQ ID NO : 2 ou un polypeptide comprenant un fragment de la séquence de SEQ ID NO : 1 ou de SEQ ID NO : 2 ou un polypeptide comprenant un variant de la séquence de SEQ ID NO : 1 ou de SEQ ID NO : 2.

Dans certains modes de réalisation, l’antigène CelTOS dans la composition immunogène est un polypeptide. Toutefois, dans d’autres modes de réalisation, l’antigène CelTOS est un polynucléotide codant pour CelTOS, par exemple une séquence d’ADN codant pour CelTOS. Le polynucléotide peut être, par exemple, incorporé dans un support adénoviral. Des vaccins à base de vecteurs adénoviraux défectueux pour la réplication ont été décrits dans l'état de l’art, voir, par exemple, Tatsis et al. (2004) Mol Ther. 10: 616 ou Tatsis et al. (2006) Gene Therapy 13: 421 pour des vecteurs adénoviraux provenant de chimpanzé. L'utilisation de vecteurs adénoviraux pour des antigènes paludéens a été décrite, par exemple, dans les documents WO 2004055187 et WO 2009071613.

Des compositions immunogènes dans lesquelles l'antigène CelTOS est un polypeptide CelTOS sont préférées. Dans un mode de réalisation, le polypeptide CelTOS comprend ou est constitué d'une séquence polypeptidique existant à l'état naturel dans la nature, par exemple, une séquence polypeptidique correspondant au CelTOS d'une espèce choisie dans le groupe constitué de : P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale et P. malariae.

Dans un mode de réalisation préféré, le polypeptide CelTOS comprend ou est constitué d'un CelTOS de Plasmodium falciparum, par exemple, un polypeptide de 182 acides aminés tel que défini par SEQ ID NO : 1. SEQ ID NO : 1 (numéro d'accession Q8I5P1 : CelTOS de

Plasmodium falciparum 3D7 ; également GenBank : AAN36249).

MNALRRLPVICSFLVFLVFSNVLCFRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLE

SQSMNKIGDDLAETISNELVSVLQKNSPTFLESSFDIKSEVKKHAKSMLKELIKVGLPSFEN

LVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDFF

D

Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide CelTOS comprend ou est constitué du CelTOS de Plasmodium vivax, par exemple, un polypeptide de 196 acides aminés tel que défini par SEQ ID NO : 2. SEQ ID NO : 2 (numéro d'accession Q53UB7 : CelTOS de

Plasmodium vivax ; également NCBI : XP_001617263)

MHLFNKPPKGKMNKVNRVSIICAFLALFCFVNVLSLRGKSGSTASSSLEGGSEFSER

IGNSLSSFLSESASLEVIGNELADNIANEIVSSLQKDSASFLQSGFDVKTQLKATAKKVLVE

ALKAALEPTEKIVASTIKPPRVSEDAYFLLGPVVKTLFNKVEDVLHKPIPDTIWEYESKGSL

EEEEAEDEFSDELLD

Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide CelTOS comprend ou est constitué du CelTOS de Plasmodium knowlesi, par exemple, un polypeptide de 185 acides aminés tel que défini par SEQ ID NO : 3. SEQ ID NO : 3 (numéro d’accession B3LCG1 ; CelTOS de Plasmodium knowlesi ; également NCBI : XM_002262206)

MNKVNRVSIICAFLALFCFVNVLSLRGKSGLTASSSLEGGSEFSERIGNTLSSFLSE

SASLEVIGNELADNIANEIVGSLQNDSASFLQSEFDVKAQLKATAKKVLTEALKAALEPTEK

IVASTIKPPRIKEDIYFLLSPVVRSLFNKVEDVLHKPVSDDIWNYESRGSSSEEEDEVDSDE

DFLD SEQ ID NO : 1 est approximativement identique à 45 % avec SEQ ID NO : 2 sur 182 résidus, SEQ ID NO : 1 est approximativement identique à 44 % avec SEQ ID NO : 3 sur 178 résidus, et SEQ ID NO : 2 est approximativement identique à 84 % avec SEQ ID NO : 3 sur 185 résidus. En outre, ces séquences apparentées de CelTOS, et les séquences d’acides aminés conservées parmi elles, servent de guide pour produire des polypeptides variants, comprenant une ou plusieurs substitutions d’acides aminés conservatives et/ou une ou plusieurs substitutions d’acides aminés non conservatives, comme il est détaillé ci-dessous.

Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide CelTOS comprend ou est constitué d’un fragment de la séquence de SEQ ID NO : 1, 2 ou 3. Un tel fragment peut être d’une longueur quelconque à condition qu’il conserve les propriétés immunogènes. Par exemple, le fragment peut comprendre 5 acides aminés consécutifs ou plus de la séquence de SEQ ID NO : 1 ou de SEQ ID NO : 2 ou de SEQ ID NO : 3, comme 6 acides aminés consécutifs ou plus, par exemple, 7 acides aminés consécutifs ou plus, comme 8 acides aminés consécutifs ou plus, par exemple, 9 ou plus, 10 ou plus, 20 ou plus, 40 ou plus, 60 ou plus, 80 ou plus, 100 ou plus, 120 ou plus, 140 ou plus, 160 ou plus, ou 180 ou plus, jusqu’à 182 acides aminés consécutifs de la séquence de SEQ ID NO : 1, ou jusqu’à 196 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 2, ou jusqu’à 185 acides aminés consécutifs de SEQ ID NO : 3. Les épitopes de PfCelTOS ont été décrits dans Bergmann-Leitner et al. (2013) PloS 8: e71610.

Les fragments appropriés de PfCelTOS pour une utilisation dans la présente invention comprennent, mais n’y sont pas limités : • Des fragments comprenant les résidus 25 à 83 de PfCelTOS, comme : o NVLCFRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLESQSMNKIGDDLAETISNEL VSVLQKNSPTFLES (SEQ ID NO : 6) o NVLCFRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLESQSMNKIGDDLAETISNEL VSVLQKN (SEQ ID NO : 7) o FRGNNGHNSSSSLYNGSQFIEQLNNSFTSAFLESQSMNKIGDDLAETISNELVSVL QKNSPTFLES (SEQ ID NO : 8) • Des fragments comprenant les résidus 125 à 182 de PfCelTOS, comme : o GLPSFENLVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPD VSESEESLSDDFFD (SEQ ID NO : 9) o LVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEES LSDDFFD (SEQ ID NO : 10) o AENVKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLS DDFFD (SEQ ID NO : 11) • Des fragments comprenant les résidus 125 à 143 de PfCelTOS, comme : LVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNK (SEQ ID NO : 12) LVAENVKPPKVDPATYGIIVPVLT (SEQ ID NO : 13) VKPPKVDPATYGIIVPVLTSLFNK (SEQ ID NO : 14) • Des fragments comprenant les résidus 149 à 182 de PfCelTOS, comme : o VPVLTSLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDFFD (SEQ ID NO : 15) o SLFNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDFFD (SEQ ID NO : 16) o FNKVETAVGAKVSDEIWNYNSPDVSESEESLSDDFFD (SEQ ID NO : 17)

Dans d’autres modes de réalisation, le polypeptide CelTOS comprend ou est constitué de deux fragments ou plus de la séquence de SEQ ID NO : 1 ou de SEQ ID NO : 2 ou de SEQ ID NO : 3, où les deux fragments ou plus ne sont pas consécutifs dans SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2 ou SEQ ID NO : 3, mais, par exemple, forment un épitope conformationnel.

Dans un autre mode de réalisation, le polypeptide CelTOS comprend ou est constitué d’un variant de la séquence de SEQ ID NO : 1 ou de SEQ ID NO : 2.

Un polypeptide variant peut contenir un certain nombre de substitutions, de préférence des substitutions conservatives, (par exemple, 1 à 50, comme 1 à 25, en particulier 1 à 10, et spécialement 1 acide aminé peut être modifié) lorsqu’il est comparé à la séquence de référence. En général, les substitutions conservatives se situeront au sein de l’un des groupements d’acides aminés spécifiés ci-dessous, bien que dans certaines circonstances, d’autres substitutions peuvent être possibles sans affecter substantiellement les propriétés immunogènes de l’antigène comme il est déterminé par des procédés bien connus de l'état de l'art, et comme il est décrit dans les exemples ici. Les huit groupes suivants contiennent chacun des acides aminés qui sont généralement des substitutions conservatives les uns pour les autres : 1) Alanine (A), Glycine (G) ; 2) Acide aspartique (D), Acide glutamique (E) ; 3) Asparagine (N), Glutamine (Q) ; 4) Arginine (R), Lysine (K) ; 5) Isoleucine (I), Leucine (L), Méthionine (M), Valine (V) ; 6) Phénylalanine (F), Tyrosine (Y), Tryptophane (W) ; 7) Sérine (S), Thréonine (T) ; et 8) Cystéine (C), Méthionine (M)

De façon appropriée, de telles substitutions ne surviennent pas dans la région d’un épitope, et par conséquent, n’ont pas un impact significatif sur les propriétés immunogènes de l’antigène.

Les variants de protéines peuvent également comprendre ceux dans lesquels des acides aminés supplémentaires sont insérés comparativement à la séquence de référence, par exemple, de telles insertions peuvent survenir au niveau de 1 à 10 emplacements (comme 1 à 5 emplacements, de manière appropriée 1 à 2 emplacements, en particulier 1 emplacement) et ils peuvent, par exemple, impliquer l’addition de 50 acides aminés ou moins au niveau de chaque emplacement (comme 20 ou moins, en particulier 10 ou moins, spécialement 5 ou moins). De façon appropriée, de telles insertions ne surviennent pas dans la région d’un épitope, et par conséquent, n’ont pas un impact significatif sur les propriétés immunogènes de l’antigène. Un exemple d’insertion comprend une courte séquence de résidus d’histidine (par exemple, 2 à 6 résidus) pour aider l’expression et/ou la purification de l’antigène en question.

Les variants comprennent également ceux dans lesquels des acides aminés ont été délétés comparativement à la séquence de référence, par exemple, de telles délétions peuvent survenir au niveau de 1 à 10 emplacements (comme 1 à 5 emplacements, de manière appropriée 1 ou 2 emplacements, en particulier 1 emplacement) et ils peuvent, par exemple, impliquer la délétion de 50 acides aminés ou moins au niveau de chaque emplacement (comme 20 ou moins, en particulier 10 ou moins, spécialement 5 ou moins). De façon appropriée de telles délétions ne surviennent pas dans la région d’un épitope, et par conséquent, n’ont pas un impact significatif sur les propriétés immunogènes de l’antigène. L’homme du métier comprendra qu’un variant de protéine particulier peut comprendre des substitutions, des délétions et des additions (ou toutes leurs combinaisons).

Les variants présentent de préférence au moins environ 70 % d’identité, de manière davantage préférée au moins environ 80 % d’identité et de manière préférée entre toutes au moins environ 90 % d’identité (comme au moins environ 95 %, au moins environ 98 % ou au moins environ 99 %) avec la séquence de référence associée.

Les termes « identique » ou pourcentage « d’identité », dans le contexte de deux acides nucléiques ou séquences polypeptidiques ou plus, se rapportent à deux séquences ou sous-séquences ou plus qui sont les mêmes ou présentent un pourcentage spécifié de résidus d’acides aminés ou de nucléotides qui sont les mêmes (c’est-à-dire, 70 % d’identité, éventuellement 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 98 % ou 99 % d’identité sur une région spécifiée), lorsqu’ils sont comparés et alignés pour une correspondance maximale sur une fenêtre de comparaison, ou une région désignée, mesuré en utilisant l’un des algorithmes suivants de comparaison de séquences ou par un alignement manuel et un examen visuel. De telles séquences sont alors dites être « substantiellement identiques ». Cette définition se rapporte également au complément d’une séquence à tester. Eventuellement, le pourcentage d’identité existe sur une région qui a une longueur, par exemple, d’au moins 25, comme au moins 50, par exemple au moins 75 acides aminés, comme au moins environ 100, par exemple au moins environ 150 acides aminés. De façon appropriée, la comparaison est réalisée sur une fenêtre correspondant à la longueur entière de la séquence de référence.

Les exemples d’algorithmes qui sont appropriés pour déterminer le pourcentage d’identité de séquence et de similarité de séquence sont les algorithmes BLAST et BLAST 2.0, qui sont décrits dans Altschul et al., Nuc. Acids Res. 25: 3389-3402 (1977) et Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990), respectivement. Le logiciel pour réaliser les analyses BLAST est disponible au public par l’intermédiaire du National Center for Biotechnology Information (site Internet à www.ncbi.nlm.nih.gov). Sauf indication contraire, le pourcentage d’identité d’une séquence par rapport à une séquence de référence sur une longueur de fragment particulière ou sur la longueur entière de la séquence de référence est déterminé en utilisant la fonction Align Sequences Protein de BLAST (disponible à http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).

Les variants d’une séquence polypeptidique posséderont généralement essentiellement la même activité que la séquence de référence. Par essentiellement la même activité, on comprend au moins 50 %, de manière appropriée au moins 75 % et spécialement au moins 90 % d’activité de la séquence de référence dans un test de restimulation in vitro de cellules mononuclées du sang périphérique (PBMC) ou de sang total avec des antigènes spécifiques (par exemple, une restimulation pendant une période située entre plusieurs heures et jusqu’à deux semaines, comme jusqu’à un jour, 1 jour à 1 semaine ou 1 à 2 semaines) qui mesure l’activation des cellules par l’intermédiaire de la lymphoprolifération, de la production de cytokines dans le surnageant de la culture (mesurée par une technique ELISA, CBA, etc.) ou la caractérisation des réponses des lymphocytes T et B par une coloration intra et extracellulaire (par exemple, en utilisant des anticorps spécifiques dirigés contre des marqueurs immunitaires, comme CD3, CD4, CD8, IL2, TNFa, IFN-γ, CD40L, CD69, etc.) suivie d’une analyse avec un cytométre de flux. De façon appropriée, par essentiellement la même activité, on comprend au moins 50 %, de manière appropriée au moins 75 % et spécialement au moins 90 % d’activité de la séquence de référence dans un test de prolifération des lymphocytes T et/ou de production d’IFN gamma.

Les polypeptides CelTOS pour une utilisation dans l’invention peuvent être produits, par exemple, dans E. coli comme il est décrit dans le document WO 2010/062859.

De façon appropriée, la composition immunogène de l’invention comprend entre 2 et 200 μg de polypeptide CelTOS, comme entre 5 et 100 μg, par exemple, entre 10 et 50 μg (microgrammes) de polypeptide CelTOS, comme entre 10 et 30 μg de polypeptide CelTOS.

Dans un autre mode de réalisation, la composition de l’invention comprend un ou plusieurs autres antigènes, de préférence d’autres antigènes de Plasmodium. Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l’invention comprend : 1. un polypeptide comprenant la séquence de SEQ ID NO : 1 ou comprenant un fragment de la séquence de SEQ ID NO : 1 ou comprenant un variant de la séquence de SEQ ID NO : 1, et 2. un polypeptide comprenant la séquence de SEQ ID NO : 2 ou comprenant un fragment de la séquence de SEQ ID NO : 2 ou comprenant un variant de la séquence de SEQ ID NO : 2.

Par exemple, la composition de l’invention peut comprendre • un polypeptide comprenant un fragment de SEQ ID NO : 1, par exemple un fragment de SEQ ID NO : 1 comprenant les résidus 25 à 83 et/ou les résidus 125 à 182, et • un polypeptide comprenant un fragment de SEQ ID NO : 2, par exemple un fragment de SEQ ID NO : 2 comprenant les résidus 36 à 94 et/ou les résidus 136 à 196.

Dans un autre mode de réalisation préféré, l’autre antigène est un antigène dérivé de la protéine circumsporozoïte (CS) de Plasmodium. Un variant approprié de la protéine CS peut être un variant dans lequel des parties de la protéine CS sont sous la forme d’une protéine hybride avec l’antigène de surface S provenant du virus de l’hépatite B (Ag HBs). La protéine hybride peut comprendre, par exemple : 1) une séquence d’au moins 160 acides aminés qui est au moins identique à 70 % avec la partie C-terminale de la protéine CS, à laquelle il manque éventuellement une séquence d’ancrage hydrophobe fonctionnelle, 2) quatre répétitions en tandem ou plus de la région immunodominante de la protéine CS, comme des répétitions NANP, et 3) l’Ag HBs.

La protéine hybride peut être une protéine qui comprend un fragment de la protéine CS de P. falciparum correspondant aux acides aminés 207 à 395 de la protéine CS de P. falciparum clone 3D7 fusionné par l’intermédiaire d’un élément de liaison (linker) linéaire à l’extrémité N-terminale de l’Ag HBs. L'élément de liaison (linker) peut comprendre une partie de preS2 provenant de l’Ag HBs. Des constructions de CS appropriées pour une utilisation dans la présente invention sont présentées dans le document WO 93/10152, lequel a été délivré aux Etats-Unis sous les numéros de brevets US No. 5 928 902 et 6 169 171, les deux étant incorporés par référence dans l’objectif de décrire des protéines appropriées pour une utilisation dans la présente invention.

Une protéine hybride particulière pour une utilisation dans l’invention est la protéine hybride connue sous le nom de RTS (figure 4) (décrite dans le document WO 93/10152 dans lequel elle est indiquée par RTS* et dans le document WO 98/05355) qui est constituée de : - un résidu de méthionine - trois résidus d’acides aminés, Met Ala Pro - une séquence de 189 acides aminés représentant les acides aminés 207 à 395 de la protéine CS de la souche 3D7 de P. falciparum - un résidu de glycine - quatre résidus d’acides aminés, Pro Val Thr Asn, représentant les quatre résidus carboxy-terminaux de la protéine preS2 du virus de l’hépatite B (sérotype adw), et - une séquence de 226 acides aminés, codée par les nucléotides 1653 à 2330, et spécifiant la protéine S du virus de l’hépatite B (sérotype adw).

De façon préférée entre toutes, l’autre antigène est RTS,S. RTS,S est une particule composée d’un mélange de l’antigène de surface natif du virus de l’hépatite B (Ag HBs) et d’une protéine Ag HBs hybride contenant des parties de la protéine CS. RTS,S a été décrit, par exemple, dans Vekemans et al. (2009) Vaccine 275: G67 et Regules et al. (2011) Expert

Rev. Vaccines 10: 589. RTS,S est également décrit dans le document WO 93/10152. D’autres antigènes appropriés dérivés de CS ont été décrits dans le document WO 2014111733 (incorporé ici par référence).

Dans d’autres modes de réalisation, la composition immunogène de l’invention comprend en plus d’un antigène CelTOS, un ou plusieurs autres antigènes de P. falciparum (Pf) et/ou de P. vivax (Pv) choisis dans le groupe constitué de : PfDBP, (protéine de liaison Duffy) PvDBP, PfTRAP (protéine adhésive associée à la thrombospondine), PvTRAP, PfMSP1 (protéine de surface du mérozoïte), PfMSP2, PfMSP3, PfMSP4, PfMSP5, PfMSP6, PfMSP7, PfMSP8, PfMSP9, PvMSP1, PvMSP2,

PvMSP3, PvMSP4, PvMSP5, PvMSP6, PvMSP7, PvMSP8, PvMSP9, PfAMAl (antigène membranaire apical), PvAMAl, PfRBP (protéine de liaison des réticulocytes), PvRBP, PfEMP1 (protéine membranaire érythrocytaire), PvEMP1, Pfs16, Pf332, Pfs25, Pfs28, PfLSA1 (antigène du stade hépatique), PfLSA3, PvLSA1, PvLSA3, PfEBA (antigène de liaison des érythrocytes), PvEBA, PfGLURP (protéine riche en glutamate), PvGLURP, PfRAPl (protéine rhoptry-associée), PvRAPl, PfRAP2, PvRAP2, PfSéquestrine, PvSéquestrine, PfSALSA (antigène du sporozoïte et du stade hépatique), PvSALSA, PfEXPl (protéine d’exportation), PvEXPl, PfSTARP (protéine riche en thréonine-asparagine du sporozoïte), PvSTARP, Pv25, Pv28, Pfs27/25, Pfs48/45, Pfs230 et Pf332, ou un fragment ou un variant de l’un quelconque de ceux-ci.

Adjuvants

Comme il a été expliqué ci-dessus, la composition immunogène de l’invention comprend un adjuvant, lequel comprend une fraction de saponine immunologiquement active. Dans un mode de réalisation, l’adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active et un agoniste du TLR4.

Des adjuvants comprenant des saponines ont été décrits dans l’état de l'art. Des saponines sont décrites dans : Lacaille-Dubois and Wagner (1996) A review of the biological and pharmacological activities of saponins. Phytomedicine vol 2: 363. Les saponines sont connues comme des adjuvants dans les vaccins. Par exemple, Quil A (dérivé de l’écorce de l’arbre d’Amérique du Sud Quillaja Saponaria Molina), a été décrit par Dalsgaard et al. en 1974 ("Saponin adjuvants”, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlin, 243) comme possédant une activité d’adjuvant. Les fractions purifiées de Quil A ont été isolées par CLHP, lesquelles conservent une activité d’adjuvant sans la toxicité associée à Quil A (Kensil et al. (1991) J. Immunol. 146: 431. Des fractions de Quil A ont été également décrites dans le document US 5 057 540 et "Saponins as vaccine adjuvants”, Kensil, C. R., Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 1996, 12 (12): 1-55).

Deux de ces fractions, appropriées pour une utilisation dans la présente invention, sont QS7 and QS21 (également connues comme QA-7 et QA-21). QS21 est une fraction de saponine immunologiquement active préférée pour une utilisation dans la présente invention. QS21 a été décrite par Kensil (2000) dans O'Hagan: Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols. Homana Press, Totowa, New Jersey, chapitre 15. Des systèmes d’adjuvants particuliers comprenant des fractions de QuilA, comme QS21 et QS7, sont décrits, par exemple, dans les documents WO 96/33739, WO 96/11711 et WO 2007/068907.

En plus des autres composants, l’adjuvant comprend de préférence un stérol. La présence d’un stérol peut encore réduire la réactogénicité des compositions comprenant des saponines, voir, par exemple, le document EP0822831. Les stérols appropriés comprennent le bêta-sitostérol, le stigmastérol, l’ergostérol, l’ergocalciférol et le cholestérol. Le cholestérol est particulièrement approprié. De façon appropriée, la fraction de saponine immunologiquement active est QS21 et le rapport QS21/stérol est de 1/100 à 1/1 p/p, comme de 1/10 à 1/1 p/p, par exemple de 1/5 à 1/1 p/p.

Les agonistes du TLR4 appropriés comprennent des lipopolysaccharides, comme le monophosphoryl-lipide A (MPL) et le 3D-MPL. Le brevet US 4 436 727 décrit le MPL et sa fabrication. Le brevet US 4 912 094 et le certificat de réexamen B1 4 912 094 décrit le 3D-MPL et un procédé pour sa fabrication. Un autre agoniste du TLR4 est l’adjuvant glucopyranosyl-lipide (GLA), une molécule synthétique de type lipide A (voir, par exemple, Fox et al. (2012) Clin. Vaccine Immunol 19: 1633). Dans un autre mode de réalisation, l’agoniste du TLR4 peut être un agoniste synthétique du TLR4 comme une molécule synthétique de disaccharide, similaire dans sa structure au MPL et au 3D-MPL ou ce peut être des molécules synthétiques de monosaccharides, comme les composés de phosphate d’aminoalkyl-glucosaminide (AGP) décrits, par exemple, dans les documents WO 9850399, WO 0134617, WO 0212258, WO 3065806, WO 04062599, WO 06016997, WO 0612425, WO 03066065, et WO 0190129. De telles molécules ont été également décrites dans la littérature scientifique et des brevets comme des mimétiques du lipide A. Les mimétiques du lipide A partagent de façon appropriée une certaine activité fonctionnelle et/ou structurale avec le lipide A, et dans un aspect, ils sont reconnus par les récepteurs du TLR4. Les AGP tels que décrits ici sont parfois qualifiés de mimétiques du lipide A dans l’état de l'art. Dans un mode de réalisation préféré, l’agoniste du TLR4 est le 3D-MPL.

Dans un mode de réalisation préféré de la composition de l’invention, la fraction de saponine immunologiquement active est QS21 et l’agoniste du TLR4 est le 3D-MPL.

Dans une forme appropriée de la présente invention, les compositions de l’invention peuvent comprendre du QS21 sous une forme substantiellement pure, c’est-à-dire que le QS21 est pur à au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, par exemple pur à au moins 95 %, ou pur à au moins 98 %. Les compositions de l’invention peuvent comprendre du QS21 dans une quantité située entre environ 1 μg et environ 100 μg par dose humaine, par exemple entre environ 1 μg et environ 60 μg ou entre environ 10 μg et environ 100 μg, par exemple, environ 10 μg, environ 12 μg, environ 15 μg, environ 20 μg, environ 25 μg, environ 30 μg, environ 40 μg ou environ 50 μg. Le QS21 peut être présent, par exemple, dans une quantité entre environ 40 μg et 60 μg ou entre environ 45 et environ 55 μg ou environ 50 μg. En variante, le QS21 peut être présent dans une quantité entre 21 μg et 29 μg ou entre environ 23 μg et environ 27 μg ou environ 25 μg. Dans un autre mode de réalisation, les compositions de l’invention peuvent comprendre du QS21 dans une quantité d’environ 10 μg, par exemple entre environ 6 μg et environ 14 μg, environ 8 μg et environ 12 μg. Dans un autre mode de réalisation, les compositions de l’invention peuvent comprendre du QS21 dans une quantité d’environ 5 μg, par exemple entre environ 3 μg et environ 7 μg ou entre environ 4 μg et environ 6 μg.

Les compositions de l’invention peuvent comprendre du 3D-MPL dans une quantité entre environ 1 μg et environ 100 μg par dose humaine, par exemple entre environ 1 μg et environ 60 μg ou entre environ 10 μg et environ 100 μg, par exemple, environ 10 μg, environ 12 μg, environ 15 μg, environ 20 μg, environ 25 μg, environ 30 μg, environ 40 μg ou environ 50 μg. Le 3D-MPL peut être présent, par exemple, dans une quantité entre environ 40 μg et 60 μg ou entre environ 45 et environ 55 μg ou environ 50 μg. En variante, le 3D-MPL peut être présent dans une quantité entre 21 μg et 29 μg ou entre environ 23 μg et environ 27 μg ou environ 25 μg. Dans un autre mode de réalisation, les compositions de l’invention peuvent comprendre du 3D-MPL dans une quantité d’environ 10 μg, par exemple entre environ 6 μg et environ 14 μg, environ 8 μg et environ 12 μg. Dans un autre mode de réalisation, les compositions de l’invention peuvent comprendre du 3D-MPL dans une quantité autour d’environ 5 μg, par exemple entre environ 3 μg et environ 7 μg ou entre environ 4 μg et environ 6 μg.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l’invention comprend entre environ 10 μg et environ 60 μg de QS21 et entre environ 10 μg et environ 60 μg de 3D-MPL, de manière appropriée environ 50 μg de QS21 et environ 50 μg de 3D-MPL ou environ 25 μg de QS21 et environ 25 μg de 3D-MPL par dose humaine.

Dans certains modes de réalisation, l’adjuvant se présente sous la forme d’une émulsion huile dans l’eau, par exemple, comprenant du squalène, de l’alpha-tocophérol et un tensioactif (voir, par exemple, le document WO 95/17210) ou sous la forme d’un liposome. Une présentation liposomale est préférée. Le terme « liposome », lorsqu’il est utilisé ici, se rapporte à des structures lipidiques uni- ou multilamellaires (particulièrement 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, ou 10-lamellaires selon le nombre de membranes lipidiques formées) renfermant un intérieur aqueux. Les liposomes et les formulations liposomales sont bien connus de l'état de l’art. Des présentations liposomales sont décrites, par exemple, dans les documents WO 96/33739 et WO 2007/068907. Les lipides qui sont capables de former des liposomes comprennent toutes les substances possédant des propriétés graisseuses ou de type graisse. Les lipides qui peuvent constituer les lipides dans les liposomes peuvent être choisis dans le groupe comprenant des glycérides, des glycérophospholipides, des glycérophosphinolipides, des glycérophosphonolipides, des sulfolipides, des sphingolipides, des phospholipides, des isoprénolides, des stéroïdes, des stéarines, des stérols, des archéolipides, des lipides cationiques synthétiques et des lipides contenant des glucides. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, les liposomes comprennent un phospholipide. Les phospholipides appropriés comprennent (mais n’y sont pas limités) : la phosphocholine (PC) qui est un intermédiaire dans la synthèse de la phosphatidylcholine ; des dérivés naturels de phospholipide : la phosphocholine d’œuf, la phosphocholine d’œuf, la phosphocholine de soja, la phosphocholine de soja hydrogénée, la sphingomyéline en tant que phospholipides naturels ; et des dérivés de phospholipides synthétiques : la phosphocholine (didécanoyl-L-a-phosphatidylcholine [DDPC], la dilauroylphosphatidylcholine [DLPC], la dimyristoylphosphatidylcholine [DMPC], la dipalmitoylphosphatidylcholine [DPPC], la distéaroyl-phosphatidylcholine [DSPC], la dioléoylphosphatidylcholine, [DOPC], la 1-palmitoyl, 2-oléoylphosphatidylcholine [POPC], la diélaïdoylphosphatidylcholine [DEPC]), le phosphoglycérol (1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [DMPG], 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [DPPG], 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [DSPG], 1-palmitoyl-2-oléoyl-sn-glycéro-3-phosphoglycérol [POPG]), l’acide phosphatidique (acide 1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphatidique [DMPA], acide dipalmitoyl-phosphatidique [DPPA], acide distéaroyl-phosphatidique [DSPA]), la phosphoéthanolamine (1,2-dimyristoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DMPE], 1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DPPE], 1,2-distéaroyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DSPE], 1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phosphoéthanolamine [DOPE]), la phosphosérine, et le polyéthylène glycol [PEG] phospholipide.

La taille des liposomes peut varier de 30 nm à plusieurs μm selon la composition en phospholipides et le procédé utilisé pour leur préparation. Dans des modes de réalisation particuliers de l’invention, la taille des liposomes se situera dans la plage de 50 nm à 500 nm et dans d’autres modes de réalisation, 50 nm à 200 nm. La diffusion dynamique de lumière laser est un procédé utilisé pour mesurer la taille des liposomes, bien connu de l’homme du métier.

Dans un mode de réalisation particulièrement approprié, les liposomes utilisés dans l’invention comprennent de la DOPC et un stérol, en particulier du cholestérol. Ainsi, dans un mode de réalisation particulier, les compositions de l’invention comprennent du QS21 dans toute quantité décrite ici sous la forme d’un liposome, où ledit liposome comprend de la DOPC et un stérol, en particulier du cholestérol.

Dans un mode de réalisation préféré, la composition de l’invention comprend entre environ 10 μg et environ 100 μg de QS21 et entre environ 10 μg et environ 100 μg de 3D-MPL, de manière appropriée environ 50 μg de QS21 et environ 50 μg de 3D-MPL, dans une formulation liposomale ou environ 25 μg de QS21 et environ 25 μg de 3D-MPL par dose humaine dans une formulation liposomale.

Dans un autre aspect, l’invention concerne un procédé de fabrication d’une composition immunogène telle que définie ici comprenant l’étape de mélange d’un antigène CelTOS et d’un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active. Il est proposé un antigène qui peut être sous forme lyophilisée ou dans une formulation liquide. De manière similaire, dans des modes de réalisation où l'antigène CelTOS est combiné avec un autre antigène, comme RTS,S, les antigènes peuvent être colyophilisés ensemble dans un flacon.

Dans un autre aspect, il est proposé un kit comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active. Dans un autre aspect, il est proposé un kit comprenant un premier récipient comprenant un antigène CelTOS et un second récipient comprenant un adjuvant, où l’adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active.

Il est bien connu que pour une administration parentérale, les solutions devront être physiologiquement isotoniques (c’est-à-dire qu’elles auront une osmolalité pharmaceutiquement acceptable) pour éviter la distorsion ou la lyse des cellules. Un « agent d'isotonicité » est un composé qui est physiologiquement toléré et confère une tonicité appropriée à une formulation (par exemple, les compositions immunogènes de l'invention) pour empêcher le flux net d'eau à travers les membranes cellulaires qui sont en contact avec la formulation. Il est connu des compositions aqueuses d'adjuvant qui contiennent 100 mM de chlorure de sodium ou plus, par exemple le système d'adjuvant A (ASA) dans les documents WO 2005/112991 et WO 2008/142133 ou les adjuvants liposomaux décrits dans le document WO 2007/068907.

Dans certains modes de réalisation, l'agent d'isotonicité utilisé pour la composition est un sel. Toutefois, dans d'autres modes de réalisation, la composition comprend un agent d'isotonicité non ionique et la concentration de chlorure de sodium ou la force ionique dans la composition est inférieure à 100 mM, comme inférieure à 80 mM, par exemple, inférieure à 30 mM, comme inférieure à 10 mM ou inférieure à 5 mM. Dans un mode de réalisation préféré, l'agent d'isotonicité non ionique est un polyol, comme le sorbitol. La concentration de sorbitol peut se situer, par exemple, entre environ 3 % et environ 15 % (p/v), comme entre environ 4 % et environ 10 % (p/v). Des adjuvants comprenant une fraction de saponine immunologiquement active et un agoniste du TLR4, où l'agent d'isotonicité et un sel ou un polyol, ont été décrits dans le document WO 2010142685, voir par exemple les exemples 1 et 2 dans le document WO 2010142685.

Utilisations, doses et régimes d'immunisation

Comme il a été susmentionné, dans un aspect, l'invention concerne l'utilisation des compositions immunogènes, telles que définies ici, en médecine. En particulier, les compositions immunogènes de l'invention peuvent être utilisées en tant que vaccins, c’est-à-dire pour la prévention ou la prophylaxie du paludisme chez des êtres humains, y compris la prévention d’une infection paludéenne et d’une maladie paludéenne et/ou la réduction de la gravité d’une maladie paludéenne.

Ainsi, dans un aspect, l’invention concerne une composition immunogène telle que définie ici pour une utilisation dans la prévention du paludisme. D’une façon similaire, l’invention concerne l’utilisation d’une composition immunogène telle que définie ici pour la fabrication d’un médicament destiné à la prévention du paludisme. En outre, l’invention concerne un procédé d’immunisation contre le paludisme comprenant l’administration d’une composition immunogène telle que définie ici à un sujet humain.

Les compositions immunogènes de l’invention peuvent être utilisées pour la prévention du paludisme provoqué par P. falciparum, P. vivax, P. knowlesi, P. ovale et P. malariae, ou pour soulever une réponse immunitaire chez un sujet contre un ou plusieurs antigènes (par exemple, CelTOS) de l’une quelconque de ces espèces. Les compositions immunogènes de l’invention sont particulièrement appropriées pour une utilisation dans la prévention du paludisme provoqué par P. falciparum ou P. knowlesi.

Les compositions immunogènes de l’invention peuvent être utilisées pour tout groupe de patients, y compris la population pédiatrique ainsi qu’adulte. Un groupe de patients cible particulièrement approprié pour une immunisation avec les compositions telles que définies ici comprend la population pédiatrique, incluant des enfants âgés de 6 à 12 semaines et des enfants âgés de 5 à 17 mois. Une autre population cible particulièrement appropriée comprend les voyageurs vers des régions où le paludisme est endémique.

Dans certains modes de réalisation, la composition immunogène de l’invention est administrée seulement une fois à un sujet. Dans un autre mode de réalisation, la composition immunogène de l’invention est administrée plus d’une fois, comme 2, 3, 4 ou 5 fois. Si la composition est administrée plus d’une fois, de manière générale, il y a un intervalle de temps entre les administrations, comme 1 à 4 semaines ou plus, par exemple de 1 à 3 semaines ou plus, pour permettre à la première immunisation de produire son effet immunogène.

Dans encore d’autres modes de réalisation, la composition immunogène de l’invention est administrée une ou plusieurs fois, ceci suivi d’une ou de plusieurs autres administrations (rappels) avec une composition immunogène différente, par exemple une composition non adjuvée comprenant CelTOS ou une composition comprenant CelTOS avec un adjuvant différent. Dans un autre mode de réalisation, la première immunisation (sensibilisation) est réalisée avec une composition selon l’invention comprenant un polynucléotide codant pour CelTOS et une ou plusieurs autres immunisations (rappels) sont réalisées avec une composition comprenant un polypeptide CelTOS. Un exemple d’une séquence codant pour PfCelTOS est la séquence représentée par la séquence de référence du NCBI XM_001350533.1 (incorporée ici par référence) (SEQ ID NO : 4) : 1 atgaatgcct taagaagatt accagttatt tgctctttct tagtatttct tgtcttttcc 61 aatgttttat gtttcagagg aaacaacgga cacaattctt catcatctct ctataatgga 121 agccaattta ttgaacaatt aaataacagt tttacttcag cttttcttga atcacaatca 181 atgaataaga ttggtgatga tttagcagag accatatcaa atgaacttgt cagtgtttta 241 caaaaaaatt caccaacctt tttagaatca agctttgata tcaaatcaga agtaaaaaaa 301 cacgcaaaat ctatgttaaa ggaattaatc aaagtaggat tgccatcatt cgaaaatctc 361 gtagctgaaa atgttaaacc accaaaagtc gacccagcaa catatggtat aatagtacca 421 gtattaacat ctttatttaa taaggtagaa acagctgtag gtgcgaaagt ttctgatgag 481 atatggaatt acaattcacc agacgtctca gaaagtgaag aaagtttatc agatgatttt 541 ttcgattaa

Un exemple d’une séquence codant pour PvCelTOS est la séquence représentée dans GenBank : AB194053.1 (incorporée ici par référence) (SEQ ID NO : 5) : 1 atgcatttat ttaacaaacc ccccaaaggc aaaatgaaca aagtaaaccg agtctcgatt 61 atttgtgctt tcttggcact tttttgcttc gtaaatgtgt tgtccttgcg gggaaagagc 121 ggctcgactg cctcgtcttc tcttgaagga ggaagcgaat tttccgagcg catagggaac 181 agcttatcgt cattcctttc cgaatcagca tctttggaag ttattggaaa tgaactggcc 241 gacaacatcg ccaacgaaat tgttagctcc ctgcaaaagg attcagcatc ctttttacaa 301 agtgggtttg acgtaaaaac ccagttaaag gctactgcca agaaggtctt agtggaagcg 361 ttaaaagcag cattagagcc aacggaaaaa attgttgcct ccacgattaa gccaccacgt 421 gtcagcgaag atgcctactt cttattggga ccggtcgtca agactctctt taacaaagtt 481 gaggacgttt tacacaagcc aatacctgat accatttggg aatacgaatc caagggttcc 541 ctcgaagagg aagaagctga agatgagttc tctgatgagt tgttagatta g

Dans un mode de réalisation, l’utilisation selon l’invention comprend la combinaison de la composition immunogène de l’invention avec l’antigène RTS,S soit dans la même composition soit dans un régime thérapeutique comprenant une administration séparée de la composition selon l’invention et d’une composition comprenant RTS,S. Par exemple, la composition de l’invention pourra être coadministrée avec une composition comprenant RTS,S au niveau de sites anatomiques distincts (par exemple, bras droit et gauche) ou au niveau du même site anatomique. En variante, les administrations pourront être séquentielles, en alternant une ou plusieurs administrations de la composition de l’invention avec une ou plusieurs administrations de compositions comprenant RTS,S en démarrant avec l’une ou l’autre d’entre elles et, par exemple, en alternant à chaque point de temps d’immunisation. Les immunisations pourront être données au niveau d’un site anatomique donné ou elles pourront également être alternées entre deux sites anatomiques (la composition contenant RTS,S au niveau d’un site et la composition contenant CelTOS au niveau d’un site distant). De préférence, la composition comprenant RTS,S sera également adjuvée avec un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active, par exemple QS21, et éventuellement un agoniste du TLR4, comme le 3D-MPL.

Les compositions immunogènes de l’invention peuvent être administrées de diverses manières, y compris une administration orale, parentérale et mucosale, comme une administration intramusculaire, sous-cutanée, intradermique, intraveineuse ou intranasale. Toutefois, l’administration parentérale est préférée. De manière préférée entre toutes, l’utilisation comprend une administration intramusculaire ou sous-cutanée de la composition.

De façon appropriée, les compositions immunogènes selon la présente invention ont un volume de dose humaine situé entre 0,25 ml et 1 ml, en particulier un volume de dose d’environ 0,5 ml, ou 0,7 ml. Cela peut dépendre de la voie d’administration de doses plus petites qui sont données par voie intranasale ou intradermique. L’enseignement de toutes les références dans la présente demande, y compris les demandes de brevets et les brevets délivrés, est incorporé ici dans son intégralité par référence. Les termes « comprenant », « comprennent » et « comprend » ici sont éventuellement substituables par les termes « étant constitué de », « sont constitués de » et « est constitué de », respectivement. L’invention sera en outre décrite en référence aux exemples non limitatifs suivants.

Exemples

Exemple 1 - Production de l’antigène et de l’adjuvant L’antigène CelTOS de P. falciparum a été produit dans E. coli essentiellement comme il a été décrit dans Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS ONE 5(8) e12294. La protéine a été purifiée jusqu’à devenir homogène, en utilisant un procédé de purification en deux étapes, a) une purification par affinité en utilisant du Ni+2-NTA Sepharose (QIAGEN) et b) un échangeur d’anions Q Sepharose (GE). La protéine purifiée a été échangée contre du tampon par ultrafiltration (UF ; GE Healthcare, Piscataway, NJ) jusqu’à la composition de tampon finale de 10 mM de phosphate de sodium (monobasique), 150 mM de chlorure de sodium, pH 7,2.

Le prémélange de l’adjuvant AS01 a été fabriqué comme il est décrit dans le document WO 96/33739, incorporé ici par référence. En particulier, l’adjuvant AS01 a été préparé essentiellement comme dans l’exemple 1.1 du document WO 96/33739. L’adjuvant AS01 comprend : des liposomes, qui à leur tour comprennent de la dioléoylphosphatidylcholine (DOPC), du cholestérol et du 3D-MPL (dans une quantité de 500 μg de DOPC, 125 μg de cholestérol et 25 μg de 3D-MPL), du QS21 (25 μg), du tampon phosphate NaCl et de l’eau pour un volume de 0,5 ml. L’émulsion de MPL (MPL-E) contenait 50 microgrammes de 3D-MPL par ml de 2,5 % v/v de squalène, 2,5 % v/v d’alpha-tocophérol et 0,91 % v/v de Tween® 80 dans du PBS à pH 7,4.

Le Montanide™ ISA 720 VG (VG = veggie (légumes), aucun produit animal contenu à l’intérieur) (voir également Miles et al. 2005 Vaccine 23: 2530) a été acheté chez Seppic Inc., NJ, USA. Il s’agit d’une émulsion eau dans l’huile avec un rapport 70/30 (volume/volume).

Exemple 2 - Immunisation

Dix groupes de souris BalbC ont été immunisés trois fois (jour 0, jour 21, jour 42) selon le calendrier présenté à la figure 1. Les compositions et les modes d’administration testés ont été les suivants :

Groupe 1 : 10 μg d’antigène PfCelTOS adjuvé avec ISA-720™, sous-cutané

Groupe 2 : 10 μg d’antigène PfCelTOS adjuvé avec MPL-E, sous- cutané

Groupe 3 : 1 μg d’antigène PfCelTOS adjuvé avec AS01, sous- cutané

Groupe 4 : 10 μg d’antigène PfCelTOS adjuvé avec AS01, sous- cutané

Groupe 5 : 1 μg d’antigène PfCelTOS adjuvé avec AS01, intramusculaire

Groupe 6 : 10 μg d’antigène PfCelTOS adjuvé avec AS01, intramusculaire

Groupe 7 : adjuvant ISA-720™ seul, sous-cutané

Groupe 8 : adjuvant MPL-E seul, sous-cutané

Groupe 9 : adjuvant AS01 seul, sous-cutané

Groupe 10 : adjuvant AS01 seul, intramusculaire

Ainsi, les groupes 3 à 6 ont reçu des compositions comprenant l’antigène CelTOS et un adjuvant contenant une saponine (QS21) (AS01).

Les compositions pour l’immunisation ont été préparées comme suit :

Le volume total administré pour tous les groupes de souris a été maintenu à 100 μΐ, sauf que pour les injections intramusculaires, la dose a été divisée entre les grands muscles dans les pattes arrière de chaque souris, par conséquent 2 x 50 μ! pour chaque injection. Les injections sous-cutanées ont été réalisées dans la région inguinale.

Il y avait 15 souris dans chaque groupe. Les sérums des 15 souris par groupe ont été utilisés pour mesurer les concentrations d’anticorps spécifiques de PfCelTOS (exemple 3), pour tester la reconnaissance des sporozoïtes fixés déterminée par IFA (exemple 7) et pour tester l’inhibition de la motilité des sporozoïtes (exemple 8). Dix souris par groupe ont été utilisées pour l’expérience de l’épreuve (exemple 5) et cinq souris par groupe ont été utilisées pour l’expérience ELISpot (exemple 4).

Exemple 3 - Réponses des anticorps

Les concentrations d’anticorps spécifiques de PfCelTOS ont été déterminées dans des échantillons de sérums recueillis aux jours 5, 17, 37 et 58 (seuls les groupes 1 à 8 ont été testés individuellement, alors que les groupes témoins des adjuvants ont été testés sous la forme de sérums groupés). Les sérums obtenus des témoins des adjuvants n’ont pas réagi sur les tests ELISA spécifiques de PfCelTOS (données non présentées). Un test ELISA quantitatif a été réalisé sur les échantillons en utilisant des procédures classiques. Les plaques ont été recouvertes avec 25 ng de protéine PfCelTOS par puits. Résultats

Les résultats ELISA sont présentés sur la figure 2. Comme on peut le voir d’après cette figure, toutes les compositions contenant l’antigène ont induit des anticorps spécifiques de

PfCelTOS. Les réponses des anticorps ont été supérieures dans les groupes qui avaient été immunisés avec 10 μg de PfCelTOS par rapport au groupe qui avait été immunisé avec seulement 1 μg du même antigène. Les taux d’anticorps spécifiques de PfCelTOS induits par une administration intramusculaire de 10 μg de PfCelTOS/AS01 (groupe 6) ont été environ deux fois supérieurs par rapport au moment où l’antigène a été adjuvé avec Montanide ISA-720™ et administré par voie sous-cutanée (groupe 1) (35,52 contre 14,82 μg/ml, respectivement).

Exemple 4 - Réponses cellulaires

Les profils des réponses immunitaires cellulaires ont été étudiés en quantifiant le nombre de splénocytes produisant de l’interféron gamma (IFN-γ) et de l’interleukine 4 (IL-4), en utilisant les procédés et les tests décrits dans Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS ONE 5(8) e12294. Comme témoin négatif, les échantillons ont été stimulés ex vivo avec de la glutathion-S-transférase (GST).

CelTOS de P. berghei (Pb) utilisé pour des stimulations ex vivo a été produit dans E. coli et purifié, essentiellement comme il est décrit dans Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS ONE 5(8) e12294. La protéine comprenait une séquence de liaison N-terminale de 16 acides aminés contenant 6 histidines. Résultats

La figure 3 montre le nombre de splénocytes produisant de l’IFN-γ à la suite d’une stimulation ex vivo (les groupes 1 et 7 n’ont pas été testés dans cette étude). Après stimulation ex vivo avec CelTOS de P. falciparum, de grands nombres de splénocytes spécifiques de PfCelTOS produisant de l’IFN-γ ont pu être détectés dans tous les groupes qui avaient reçu l’antigène PfCelTOS (groupes 2 à 6). Toutefois, les réponses ont été supérieures dans les groupes qui avaient reçu des compositions qui étaient adjuvées avec l’adjuvant AS01 contenant une saponine (QS21) comparativement au groupe dans lequel la composition a été adjuvée avec MPL-E, sans tenir compte de la dose et de la voie d’administration (comparaison des groupes 3 à 6 au groupe 2).

La figure 4 montre le nombre de splénocytes produisant de l’IL-4 à la suite d’une stimulation ex vivo. Après la stimulation ex vivo avec PfCelTOS, des réponses claires ont été obtenues dans tous les groupes qui avaient reçu 10 μg d’antigène PfCelTOS (groupes 2, 4 et 6). La réponse la plus élevée a été obtenue dans les groupes qui avaient reçu une administration sous-cutanée de 10 μg de PfCelTOS adjuvé avec AS01 (groupe 4). Lorsque les résultats (IFN-γ et IL-4) ont été comparés aux données historiques provenant d’immunisations avec PfCelTOS adjuvé dans Montanide ISA-720, l’ampleur des réponses obtenues avec les formulations AS01 a dépassé celles obtenues avec Montanide ISA-720 (données non présentées). L’analyse cellulaire n’a pas révélé de réponse en fonction de la dose en ce qui concerne les nombres de splénocytes spécifiques de PfCelTOS produisant de l’IFN-γ ou de l’IL-4.

Lorsque la stimulation ex vivo a été réalisée avec l’antigène hétérologue CelTOS de P. berghei (PbCelTOS), il a été observé une réponse de réactivité croisée pour l’IL-4 dans les groupes qui avaient reçu une dose élevée de PfCelTOS adjuvé avec AS01 (groupes 4 et 6). Une telle réponse n’a pas été observée dans le groupe dans lequel la composition a été adjuvée avec MPL-E (groupe 2).

Exemple 5 - Epreuve des sporozoïtes

La capacité des compositions immunogènes à induire une protection stérile chez les souris contre une épreuve hétérologue avec des sporozoïtes de P. berghei a été testée. L’épreuve des sporozoïtes a été réalisée comme il est décrit dans Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS ONE 5(8) e12294. Aux jour 76, jour 78 et jour 84 (jour final), des échantillons de sang ont été prélevés, déposés sur une lame de microscope, étalés, fixés avec du méthanol et colorés au colorant Giemsa et séchés à l’air. La parasitémie a été analysée au microscope sur ces échantillons pour déterminer si la cinétique de l’infection différait par groupe de vaccination. Si d’après le frottis sanguin final au jour 84 (jour 14 depuis l’épreuve), les souris sont demeurées aparasitémiques, les souris ont été considérées comme « protégées stérilement ». L’efficacité a été calculée par l’équation présentée ici :

Efficacité = [1-[(nombre d’animaux infectés (I) vaccin/nombre total d’animaux (n) vaccin) v (nombre d’animaux infectés témoins (I)/nombre total d’animaux (n) témoins)]]*100.

Les groupes 7, 8, 9 et 10 ont été utilisés comme groupe témoin pour le groupe 1, le groupe 2, les groupes 3 + 4 et les groupes 5+6, respectivement. Résultats

Les trois combinaisons de 10 μg d’antigène PfCelTOS adjuvé avec l’adjuvant (ISA-720™, MPL-E ou AS01) ont induit une protection contre l’épreuve des sporozoïtes. Une protection a été également observée à la dose plus basse de 1 μg de PfCelTOS/AS01 lorsqu’elle a été donnée par voie intramusculaire (figure 5).

Exemple 6 - Réactivité croisée avec d’autres espèces (Western blot)

Une analyse Western blot a été réalisée pour tester la réactivité croisée des antisérums avec des espèces non falciparum. Les procédures de SDS-PAGE et de Western blot ont été conformes aux procédures opératoires classiques. Pour chaque groupe, le sérum groupé, après le 3ème prélèvement, a été testé à la dilution requise pour obtenir une DO = 1 (déterminée par une technique ELISA en utilisant PfCelTOS, essentiellement comme il est décrit dans l’exemple 3). Des quantités égales de protéines recombinantes (0,5 μg par couloir) ont été chargées dans plusieurs couloirs sur des gels de SDS-PAGE Tris-glycine de 4 à 20 %.

CelTOS de P. knowlesi a été produit dans E. coli comme suit. Le gène a été sous-cloné dans un vecteur pETK modifié et exprimé dans E. coli BL21 DE3. Le procédé de purification utilisé pour isoler cette protéine jusqu’à ce qu'elle devienne homogène est le même procédé que celui utilisé pour le PbCelTOS. Dans tous les cas, une chromatographie d’affinité avec Ni-NTA est utilisée d’abord, suivie d’un passage sur un échangeur d’anions Q Sepharose. Les protéines ont été échangées avec le tampon en une composition de tampon finale de PBS 1X pH 7,4 pour le stockage. Résultats

Le sérum des quatre groupes à la dose de 10 μg de PfCelTOS testés (groupes 1, 2, 4 et 6) a réagi avec CelTOS de P. falciparum et CelTOS de P. berghei (voir les couloirs 2 et 3 sur chacun des panels). Toutefois, seuls les sérums du groupe 6 (souris immunisées par voie intramusculaire avec PfCelTOS/AS01) ont réagi avec CelTOS de P. knowlesi, suggérant que l’immunisation intramusculaire avec PfCelTOS/AS01 a déclenché une réponse immunitaire avec une réactivité croisée plus large (figure 6).

Exemple 7 - Test d’immunofluorescence sur les sporozoïtes

Des tests d’immunofluorescence ont été réalisés comme il est essentiellement décrit dans Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS ONE 5(8) e12294 pour déterminer si les anticorps induits par PfCelTOS/AS01 pouvaient reconnaître l’antigène natif sur ou à l’intérieur des sporozoïtes des glandes salivaires disséquées sur les parasites fixés. Une immunocoloration utilisant les antisérums polyclonaux anti-PfCelTOS provenant de ces souris Balb/c a montré une réactivité sur les sporozoïtes fixés homologues de P. falciparum et hétérologues de P. berghei. En outre, pour la dose de 10 μg de PfCelTOS/AS01 administrée à la fois par voie intramusculaire et par voie sous-cutanée, les anticorps ont réagi sur les sporozoïtes « vivants » de P. falciparum vérifiant la localisation extracellulaire (surface) du PfCelTOS et validant le potentiel des anticorps à agir comme des effecteurs dans la protection (données non présentées). Les données de la figure 7 sont tracées sous la forme du titre médian d'anticorps, ainsi que des premier et troisième quartiles, obtenus à la fin de la réaction. Les valeurs aberrantes et les valeurs aberrantes extrêmes apparaissent en dehors des 1er et 3ème quartiles.

Exemple 8 - Inhibition de la motilité des sporozoïtes par les antisérums L’inhibition du test de motilité des sporozoïtes est un test in vitro pour caractériser et semi-quantifier l’activité antiparasitaire d’anticorps polyclonaux ou monoclonaux ciblant les stades motiles du parasite du paludisme durant le stade pré-érythrocytaire. Les sporozoïtes vivants déposent une traînée de protéine CS sur le verre (Stewart and Vanderberg JP (1988) J Protozool 35: 389). Du fait que la motilité des sporozoïtes est une mesure indirecte de la viabilité et de la qualité des parasites, un test de motilité peut être utilisé pour tester si des anticorps ont un effet sur la viabilité et la santé des parasites. Un tel test de motilité a été réalisé sur les antisérums de souris, en utilisant essentiellement le même procédé que celui décrit dans Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS ONE 5(8) e12294. Des sporozoïtes de P. berghei ainsi que des sporozoïtes de P. falciparum ont été testés. Le pourcentage d'inhibition de la motilité des sporozoïtes est calculé en comptant le nombre de sporozoïtes et le nombre de traînées de CSP par champ (à partir d'au moins 10 champs/lame) et est calculé comme : % d'inhibition = [1-[(n traînées exp/n spz exp)/ (n traînées témoin/n spz témoin)]]*100 ; où exp signifie expérimental et témoin signifie sérum témoin n'ayant jamais été en contact avec le parasite du paludisme (sérum témoin « naïf »). Résultats

Les résultats du test de motilité sont représentés à la figure 8. Le degré le plus élevé d'inhibition de la motilité des sporozoïtes a été induit par les sérums obtenus des souris immunisées par voie intramusculaire avec PfCelTOS/AS01 contre les deux espèces de parasites testées, P. falciparum et P. berghei (groupe 6).

Exemple 9 - Immunogénicité (réponses des anticorps) à la suite de deux immunisations avec le vaccin antipaludéen, FMP012 (PfCelTOS)/AS01, chez des sujets américains n'ayant jamais été en contact avec le paludisme (sujets américains « naïfs »)

Les échantillons de sérum ont été obtenus d'une étude en phase 1 avec une infection de paludisme humain contrôlée (CHMI), une étude ouverte non aléatoire à doses croissantes dans une conception d'essai clinique sur des adultes en bonne santé n'ayant jamais été en contact avec le paludisme (« naïfs » pour le paludisme) âgés de 18 à 50 ans (y compris), pour estimer l’absence de risque, l’immunogénicité, et la protection. A ce jour, les sujets dans 2 groupes ont reçu des vaccinations aux semaines 0, 4, 8 et ont été suivis pour des effets cliniques indésirables et des anomalies de laboratoire. L’antigène PfCelTOS est administré avec l’adjuvant AS01.

Au total, 30 sujets ont été divisés en groupes de dose faible et élevée (15 par groupe), et ont reçu 3 doses du vaccin PfCelTOS/AS01 à ce jour. Le groupe 1 a reçu 10 μg de PfCelTOS formulé avec l’adjuvant AS01, le groupe 2 a reçu 30 μg de PfCelTOS formulé avec l’adjuvant AS01. La composition de l’adjuvant est constante et 500 μ! ont été administrés par la voie intramusculaire aux deux groupes. La conception de l’étude comprenait un départ décalé pour le groupe 1 et le groupe 2 avec des immunisations séparées de 14 jours. Cinq sujets de chaque groupe ont été immunisés dans un groupe pilote, 1 jour avant le reste du groupe, pour la première vaccination uniquement (jour -1 pour le groupe 1, jour 13 pour le groupe 2). Pour ce rapport, seul le titre d’anticorps pour le groupe 1 de PfCelTOS/AS01 (10 μg) sera présenté.

En bref, les réponses des IgG totales à l’antigène PfCelTOS ont été mesurées en utilisant des méthodologies ELISA classiques par le Malaria Serology Lab (MSL) au WRAIR. Les plaques ont été recouvertes avec 100 μl/puits d’antigène CelTOS (Bergmann-Leitner et al. (2010) PLoS ONE 5(8) e12294) à une concentration de 0,25 μg/ml, placées dans une chambre humide et incubées pendant une nuit (16 à 20 h) à 4 °C. Les plaques ont été lavées quatre fois avec du PBS 1X (pH 7,4) contenant 1 % de Tween-20 et bloquées avec 0,5 % de caséine bouillie (Sigma, St. Louis, MO, Etats-Unis). Les plaques ont été lavées quatre fois avec une solution de PBS 1X entre toutes les étapes ultérieures à l’exception de la réaction de développement. Les échantillons de sérum provenant des sujets de l’étude ont été dilués en série à partir de 1/50 sur chaque plaque et incubés à 22 °C pendant 2 h. Un anticorps de chèvre anti-IgG humaine marqué à la peroxydase (KPL, Gaithersburg, MD, Etats-Unis) a été ajouté dans chaque puits à une dilution au 1/4000 et incubé pendant 1 h à 22 °C. Le substrat de peroxydase ABTS (KPL, Gaithersburg, MD, Etats-Unis) a été ajouté pour induire le développement de la réaction. A la fin de l’incubation de 1 h à 22 °C, une solution d’arrêt (dodécylsulfate de sodium à 20 %) a été ajoutée et les plaques ont été lues en utilisant un lecteur de plaque Spectromax34 0PC. L’absorbance à 414 nm a été déterminée pour chaque puits et ces données ont été appliquées à une courbe logistique à quatre paramètres en utilisant le logiciel SoftMax GxP (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, Etats-Unis). Le titre sérique a été défini comme la dilution de sérum atteignant une densité optique (DO) égale à 1,0.

Les résultats sont rapportés graphiquement sur la figure 9 en utilisant Minitab V16 pour les valeurs individuelles pour le groupe 1 sur une échelle linéaire pour le titre moyen en anticorps. L’intervalle de confiance à 95 % est représenté. En outre, la moyenne géométrique des titres et les intervalles de confiance à 95 % et la médiane, avec les premier et troisième quartiles ont été déterminés : • Moyenne géométrique et intervalles de confiance à 95 % = 23 158 (8 276 - 38 981) • Moyenne et intervalle de confiance à 95 % = 36 986 (15 739 - 58 233) • Médiane = 20 100 (premier quartile, 9 505 et troisième quartile, 50 474)

Les titres d’anticorps ont été supérieurs à ceux observés auparavant avec trois doses de PfCelTOS combiné avec un adjuvant ne contenant pas de saponine (Cowden et al. (2012) Présentation au 2012 ASTMH meeting, non publié).

Equivalents

La présente invention propose entre autres choses des compositions immunogènes comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant. Alors que des modes de réalisation spécifiques de l’invention ont été discutés, la description ci-dessus est illustrative et non restrictive. De nombreuses variations de l’invention deviendront évidentes pour l’homme du métier après lecture de cette description. La portée totale de l’invention devra être déterminée en référence aux revendications accompagnées de leur portée totale d’équivalents, et de la description, accompagnée de telles variations.

Incorporation par référence

Toutes les publications et les brevets mentionnés ici sont incorporés ici par référence dans leur intégralité comme si chaque publication ou brevet individuel était spécifiquement et individuellement indiqué comme étant incorporé par référence. En cas de conflit, la présente demande, y compris toutes les définitions ici, prévaudra.

Sont également incorporées par référence dans leur intégralité, toutes les séquences polynucléotidiques et polypeptidiques, qui font référence à un numéro d’accession corrélant une entrée dans une base de données publique comme celles maintenues par The Institute for Genomic Research (TIGR) (www.tigr.org) et/ou the National Center for Biotechnology Information (NCBI) (www.ncbi.nlm.nih.gov).

Claims (27)

1. REVENDICATIONS

   1. Composition immunogène comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant, où l'adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active.
2. 2. Composition selon la revendication 1, dans laquelle l'adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active et un agoniste du TLR4.
3. 3. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la fraction de saponine immunologiquement active est QS21.
4. 4. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'adjuvant comprend en outre un stérol.
5. 5. Composition selon la revendication 4, dans laquelle le stérol est le cholestérol.
6. 6. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la fraction de saponine immunologiquement active est QS21 et dans laquelle le rapport de QS21/stérol est de 1/100 à 1/1 p/p.
7. 7. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'adjuvant comprend un agoniste du TLR4 et dans laquelle l'agoniste du TLR4 est un lipopolysaccharide.
8. 8. Composition selon la revendication 7, dans laquelle le lipopolysaccharide est le 3D-MPL.
9. 9. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle la fraction de saponine immunologiquement active est le QS21 et dans laquelle l'agoniste du TLR4 est le 3D-MPL et dans laquelle à la fois le QS21 et le 3D-MPL sont présents dans une quantité située entre 10 et 100 μg par dose humaine.
10. 10. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'adjuvant est présenté sous la forme d'un liposome.
11. 11. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans laquelle l'antigène CelTOS est un polypeptide CelTOS.
12. 12. Composition selon la revendication 11, dans laquelle le polypeptide est CelTOS de Plasmodium falciparum.
13. 13. Composition selon la revendication 11 ou 12, dans laquelle le polypeptide comprend la séquence représentée par SEQ ID NO : 1 ou SEQ ID NO : 2 ou un fragment immunogène dudit polypeptide, ou un variant dudit polypeptide.
14. 14. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la composition comprend en outre un ou plusieurs autres antigènes de Plasmodium.
15. 15. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, où la composition comprend en outre un antigène de la protéine circumsporozoïte, comme RTS,S.
16. 16. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation en médecine.
17. 17. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation dans la prévention du paludisme.
18. 18. Composition selon l'une quelconque des revendications précédentes, pour une utilisation dans la prévention de la maladie paludéenne provoquée par P. falciparum, P. vivax ou P. knowlesi.
19. 19. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, où l'utilisation comprend l'administration intramusculaire de la composition.
20. 20. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, où l'utilisation comprend l'administration sous-cutanée de la composition.
21. 21. Composition selon l'une quelconque des revendications 16 à 18, où l'utilisation comprend 2 ou 3 administrations de la composition.
22. 22. Utilisation d'une composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 pour la fabrication d'un médicament destiné à la prévention du paludisme.
23. 23. Procédé d'immunisation contre le paludisme comprenant l'administration de la composition selon l'une quelconque des revendications 1 à 15 à un sujet humain.
24. 24. Kit comprenant un antigène CelTOS et un adjuvant, où l’adjuvant comprend une fraction de saponine immunologiquement active.
25. 25. Kit selon la revendication 24, où le kit comprend un ou plusieurs des caractéristiques supplémentaires des revendications 2 à 15.
26. 26. Procédé de fabrication d’une composition immunogène selon l’une quelconque des revendications 1 à 15 comprenant l’étape de mélange d’un antigène CelTOS et d’un adjuvant comprenant une fraction de saponine immunologiquement active.
27. 27. Procédé selon la revendication 26, dans lequel la composition comprend un ou plusieurs des caractéristiques supplémentaires des revendications 2 à 15.