CN106456738B

CN106456738B - 诱导免疫应答的新方法

Info

Publication number: CN106456738B
Application number: CN201580016665.4A
Authority: CN
Inventors: W.R.小巴卢; A.M.迪迪埃洛朗; R.G.范德莫斯特
Original assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Current assignee: GlaxoSmithKline Biologicals SA
Priority date: 2014-04-02
Filing date: 2015-04-02
Publication date: 2021-06-29
Anticipated expiration: 2035-04-02
Also published as: EP3125930B1; CA2943007C; CA2943007A1; BR112016022463A2; JP2017511327A; ZA201605955B; JP2017511324A; IL247493B; GB201405921D0; EP3125930A1; WO2015150568A1; ES2961840T3; KR20230075525A; EP3125929A1; ES2853773T3; MX2016012932A; US11951161B2; CA2943711A1; AU2015239025B2; BR112016022787A2

Abstract

提供了诱导免疫应答的方法和用途，其包括至少两次施用免疫原性组合物，其中给予第二次施用比第一次施用更少的剂量，且其中所述第二次施用可以是未佐剂化的。

Description

诱导免疫应答的新方法

技术领域

本发明涉及诱导免疫应答的方法，特别是包括至少两次施用佐剂化免疫原性组合物的免疫方法，其中在第二次施用中给予比第一次施用低的剂量。

发明背景

疫苗接种是预防传染病的最有效的方法之一。但是，抗原的单次施用通常不足够给予完全免疫和/或长效应答。用于建立对特定病原体的强力且持久的免疫的方法包括向疫苗添加佐剂和/或重复疫苗接种，即，通过施用一次或多次另外的剂量的抗原以强化免疫应答。此类另外的施用可以使用相同疫苗（同源强化）或不同疫苗（异源强化）进行。同源强化最常见的方法不仅施用相同疫苗，并且以如先前施用的相同剂量进行施用。

迄今需要进行多剂量疫苗接种的一种疾病是疟疾。疟疾是世界主要健康问题之一。2010年，世界卫生组织（World Health Organization）报告了估计2.19亿个全球疟疾病例。疟疾是由疟原虫（Plasmodium）属的原生寄生虫引起的。

所述寄生虫的生命周期是复杂的，需要两种宿主，人和蚊来完成。对人的感染由通过受感染的蚊的唾液将子孢子接种开始。子孢子阶段已经被鉴定为疟疾疫苗的一个潜在靶标。子孢子的主要表面蛋白被称为环子孢子蛋白（CS蛋白）。对RTS,S，一种基于疟疾CS蛋白和乙型肝炎病毒的病毒包膜蛋白的抗原，已经进行了超过25年的开发，并且是目前进行研究的最先进的疟疾疫苗候选。其结构和生产描述于在1999年7月27日授权的US5928902中。

在早期工作中，RTS,S和包含与水包油乳液佐剂结合的QS21和3D-MPL的佐剂组合用于在小型临床试验中测试（Stoute等人1997 NEJM 336:86）。对该研究已经计划了三次全剂量施用时间表，但是因为察觉到过度的反应原性，第三次剂量被减少至1/5并且晚于原定计划施用。该研究结果显示7位受试者中的6位受到保护。在后续的工作中，使用了三次全剂量免疫方案，并且在最近的研究中，还使用了用包含QS21和3D-MPL的脂质体制剂将RTS,S佐剂化的三次全剂量免疫方案。该佐剂被称为AS01，并且描述于例如WO 96/33739和WO2007/068907中。来自大规模三期临床试验（其中RTS,S/AS01以三次相同剂量，相隔一个月施用）的最新数据显示，在18个月后的随访中显示，在18个月的随访时期中，显示RTS,S/AS01将儿童（在第一次疫苗接种时年龄为5-17个月）中的疟疾病例数量几乎减半，并且在婴儿（在第一次疫苗接种时年龄为6-12周）中的疟疾病例减少约四分之一。

虽然在疫苗研究和开发领域中取得了显著进展，但是仍需要针对疾病（包括疟疾）进行免疫的新型免疫原性组合物和方法，其是高效率的、安全的、具成本效益的、长效的，且诱导广谱交叉反应性免疫应答。

发明概述

现在令人惊讶地发现，在使用佐剂化疟疾疫苗进行免疫的多剂量方法中，相比使用相同剂量时，当后续剂量（强化剂量）相比先前剂量（激发剂量）减少时免疫更加有效。使用的佐剂包括TLR4激动剂、3D-MPL和免疫活性皂苷级分QS21。

因此，在本发明的第一个方面中，提供了在人类个体中诱导免疫应答的方法，其包括向个体施用包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物的至少一种抗原是相同的，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

• 所述第二佐剂含有比所述第一佐剂更低量的所述相同组分，

并且/或者

• 所述相同抗原是RTS,S，且所述第二组合物含有比所述第一组合物更低量的RTS,S，

条件是所述第一和第二组合物不是均包含RTS,S和与水包油乳液制剂结合的QS21和3D-MPL。

在另外的方面中，提供了用于在人类个体中诱导免疫应答的方法，其包括向所述个体施用包含RTS,S和佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含RTS,S的第二免疫原性组合物，其中所述佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且其中所述第二免疫原性组合物不包含佐剂。

附图简述

图1：接种疫苗的受试者中在受到攻击后28天的随访时间段内未发生寄生虫血症的百分比。Fx指示延时分次剂量组；RRR指示0、1、2个月组；CTL指示对照组。

图2a-c：于1999年7月27日授权的US5928902的RTS,S的序列。

图3a-b：VZV抗原的序列。

图4a：RRr组中4/30的受试者发生寄生虫血症（VE = 87% [95% CI: 67, 95）；RRR组中6/16的受试者发生寄生虫血症（VE = 63% [95% CI 20, 80]）。

图4b：本研究的延时分次剂量部分针对至今完成的5个0、1、2个月RTS,S/AS01试验中研究的95位受试者的集合数据的结果的比较分析。

图5a-b：在最后剂量之后一个月受到子孢子攻击后6个月的分次强化的研究。对在第一次攻击后未受到保护的受试者提供分次强化。对在第一次攻击后受到保护的受试者随机进行或不进行分次强化，随后在一个月后进行子孢子攻击。

图5a：在第12个月没有给予强化剂量的受试者。

图6：来自标准和延时方案中施用M72的小鼠的CD4 T细胞应答。

图7：来自标准和延时方案中施用M72的小鼠的CD8 T细胞应答。

图8：来自标准和延时方案中施用M72的小鼠的CD4 T细胞因子概况。

图9：来自标准和延时方案中施用M72的小鼠的CD8 T细胞因子概况。

图10：来自标准和延时方案中施用M72的小鼠的抗M72的血清学。

序列标识简述

SEQ ID No. 1: RTS,S的氨基酸序列，如本文别处所述。

SEQ ID No. 2: VZV的氨基酸序列，如本文别处所述。

SEQ ID No. 3: M72的氨基酸序列，如本文别处所述。

SEQ ID No. 4: 具有两个N-末端His残基的M72蛋白的氨基酸序列，如本文别处所述。

发明详述

如上文所述，在第一个方面中，本发明涉及在人类个体中诱导免疫应答的方法，其包括向个体施用包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物的至少一种抗原是相同的，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

并且/或者

如本文所用，施用第一组合物“随后”施用第二组合物表明在施用所述第一组合物和施用所述第二组合物之间已经经过了时间间隔。

相似地，提供了用于在人类个体中诱导免疫应答的方法中使用的第一免疫原性组合物，其中所述方法包括向个体施用包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物的至少一种抗原是相同的，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

并且/或者

相似地，提供了用于在人类个体中诱导免疫应答的方法中使用的第二免疫原性组合物，其中所述方法包括向个体施用包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物的至少一种抗原是相同的，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

并且/或者

在另外的方面中，本发明涉及包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于诱导人类个体的免疫应答，其中所述个体先前已接受了包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物的至少一种抗原是相同的，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

并且/或者

在另外的方面中，本发明涉及用于在人类个体中诱导免疫应答的方法，其包括向所述个体施用包含RTS,S和佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含RTS,S的第二免疫原性组合物，其中所述佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且其中所述第二免疫原性组合物不包含佐剂。在该方法的一个实施方案中，所述第二组合物含有比所述第一组合物更低量的RTS,S。在该方法的一个实施方案中，所述第二组合物含有在所述第一和第二组合物中等量的RTS,S。在该方法的一个实施方案中，所述第一和第二组合物均包含25微克RTS,S，或均包含50微克RTS,S。

如上文所述，在另外的方面中，本发明涉及在个体中诱导免疫应答的方法，其包括向个体施用包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物的至少一种抗原是相同的，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

并且/或者

• 所述相同抗原不是RTS,S，且所述第二组合物含有比所述第一组合物更低量的所述相同抗原。

在一个方面中，所述个体是人类个体。

并且/或者

在一个方面中，所述个体是人类个体。

相似地，提供了用于在个体中诱导免疫应答的方法中使用的第二免疫原性组合物，其中所述方法包括向个体施用包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物的至少一种抗原是相同的，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

并且/或者

在一个方面中，所述个体是人类个体。

并且/或者

在一个方面中，所述个体是人类个体。

在另外的方面中，本发明涉及用于在个体中诱导免疫应答的方法，其包括向所述个体施用包含抗原和佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含至少一种与所述第一组合物相同的抗原的第二免疫原性组合物，其中所述佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷，且其中所述第二免疫原性组合物不包含佐剂。

在一个方面中，所述个体是人类个体。

通常，本发明方法的目标是诱导保护性免疫应答，即，针对抗原所衍生的病原体使所述个体免疫或接种疫苗。在一个实施方案中，相比其中第一组合物和第二组合物相同的治疗方案，本发明的方法的免疫效力是提高的。例如，根据本文实施例确定的，所述疫苗效力可以提高至少10%，诸如25%。在一个实施方案中，根据本文实施例测定的，实现了大于80%，如大于90%的免疫效力。因此，所述方法可以用于防止（即预防）传染病。可选地，所述方法可以通过诱导或增强免疫应答而用于免疫治疗，即，治疗疾病（诸如癌症）。

用于本发明的方法的佐剂

如上文所述，在本发明的一个方面中，所述第一佐剂和第二佐剂包含TLR拮抗剂和/或免疫活性皂苷，且这两种组分中的至少一种是相同的。

因此，在一个实施方案中，所述第一佐剂和第二佐剂均包含TLR拮抗剂。在另一个实施方案中，所述第一佐剂和第二佐剂均包含免疫活性皂苷。在还另一个实施方案中，所述第一佐剂和第二佐剂均包含TLR拮抗剂和免疫活性皂苷。

在一个实施方案中，所述第一佐剂和第二佐剂由相同组分组成。因此，在这样的实施方案中，两种佐剂的组分是相同的，但不一定是相同的相对比例。例如，所述第一佐剂和第二佐剂可以均由脂质体制剂中的TLR拮抗剂和皂苷组成，但是TLR拮抗剂与皂苷的比例在第一佐剂中可以是5:1，而在第二佐剂中是1:1。可选地，TLR拮抗剂与皂苷的比例在第一佐剂中可以是4:1，而在第二佐剂中是1:1，在第一佐剂中可以是3:1，而在第二佐剂中是2:1，在第一佐剂中可以是1:1，而在第二佐剂中是1:1。

在另一个实施方案中，所述第一佐剂和第二佐剂由相同组分组成，且这些组分的相对比例相同。然而，在这样的实施方案中，尽管佐剂组分的相对比例相同，这些组分的绝对量在所述第一和第二免疫原性组合物之间可以不同。例如所述第二佐剂的全部组分的绝对量可以是，例如所述第一佐剂的全部组分的绝对量的五分之一。

如上文所述，在一个实施方案中，所述第二佐剂含有比所述第一佐剂更低量的所述相同组分（即更低量的TLR拮抗剂或更低量的皂苷或两者均更低量）。

在一个实施方案中，所述第二佐剂中的所述相同组分的更低量是比所述第一佐剂低至少10%，诸如低至少25%，例如，至少低两倍，诸如至少低三倍，例如至少低四倍，诸如至少低五倍，例如至少低六倍，诸如至少低七倍，例如至少低八倍，诸如至少低九倍，例如至少低十倍，诸如至少低15倍，例如至少低20倍的量。

在另一个实施方案中，在所述第二佐剂中的所述相同组分的更低量是比所述第一佐剂低2至50倍，诸如低2至20倍，例如，如低2至15倍，如低2至10倍，例如，如低3至7倍，如低4至6倍的量。

如上文所述，在一个实施方案中，所述第一佐剂和所述第二佐剂包含TLR（Toll-样受体）拮抗剂。在佐剂中使用TLR拮抗剂是本领域熟知的，且已经由例如Lahiri等人(2008)Vaccine 26:6777综述。可以被刺激以实现佐剂效果的TLR包括TLR2、TLR4、TLR5、TLR7、TLR8和TLR9。TLR2、TLR4、TLR7和TLR8激动剂，特别是TLR4激动剂，是优选的。

合适的TLR4激动剂包括脂多糖类，诸如单磷酰脂A（MPL）和3-O-脱酰基单磷酰脂A（3D-MPL）。美国专利4,436,727公开了MPL及其制备。美国专利4,912,094及其复审证书B14,912,094公开了3D-MPL及其制备方法。另一种TLR4激动剂是吡喃葡萄糖基脂质佐剂（GLA），一种合成的脂质A-样分子（参见，例如Fox 等人(2012) Clin. Vaccine Immunol19:1633）。在另外的实施方案中，所述TLR4拮抗剂可以是合成的TLR4激动剂，诸如合成的二糖分子，与MPL和3D-MPL结构类似，或可以是合成的单糖分子，诸如氨基烷基氨基葡糖苷磷酸酯（AGP）化合物，其公开于例如，WO9850399、WO0134617、WO0212258、W03065806、WO04062599、WO06016997、WO0612425、WO03066065和WO0190129中。这样的分子也已经作为脂质A模拟物描述于科学和专利文献中。脂质A模拟物适合与脂质A共享一些功能和/或结构活性，且在一个方面被TLR4受体识别。本文中描述的AGP在本领域中有时被称为脂质A模拟物。在优选的实施方案中，TLR4拮抗剂是3D-MPL。TLR4拮抗剂，如3-O-脱酰基单磷酰脂A（3D-MPL），及其作为佐剂在疫苗中的用途已经在例如WO 96/33739和WO2007/068907中描述，且在Alving等人(2012) Curr Opin in Immunol 24:310中综述。

在本发明的方法的另外的实施方案中，所述第一佐剂和所述第二佐剂包含免疫活性皂苷，诸如免疫活性皂苷级分，如QS21。

包含皂苷的佐剂已经在本领域中描述。皂苷被描述于：Lacaille-Dubois和Wagner(1996) A review of the biological and pharmacological activities of saponins.Phytomedicine vol 2:363。皂苷作为疫苗中的佐剂是已知的。例如，Quil A (来源于南美树皂皮树的树皮（Quillaja Saponaria Molina）），由Dalsgaard等人于1974 ("Saponinadjuvants", Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag,Berlin, 243)描述具有佐剂活性。Quil A的纯化级分已经由HPLC分离，其保持佐剂活性而没有与Quil A相关的毒性（Kensil 等人(1991) J. Immunol. 146: 431. Quil A级分也被描述于US 5,057,540和"Saponins as vaccine adjuvants", Kensil, C. R. , Crit RevTher Drug Carrier Syst, 1996, 12 (1-2):1-55。

两种适合用于本发明的这样的级分是QS7和QS21 (也被称作QA-7和QA-21)。QS21是用于本发明的优选的免疫活性皂苷级分。QS21已经在Kensil (2000) In O’Hagan:Vaccine Adjuvants: preparation methods and research protocols. Homana Press,Totowa, New Jersey, 第15章中综述。包含Quil A级分（如QS21和QS7）的微粒佐剂系统在例如WO 96/33739、WO 96/11711和WO2007/068907中描述。

除了其它组分，所述佐剂优选地包含固醇。固醇的存在可以进一步降低包含皂苷的组合物的反应原性，参见例如EP0822831。合适的固醇包括β-谷固醇、豆固醇、麦角固醇、钙化醇和胆固醇。胆固醇是特别合适的。合适地，所述免疫活性皂苷级分是QS21且QS21：固醇的比例为1:100至1:1 w/w, 如1:10至1:1 w/w，例如1:5至1:1 w/w。

在本发明的方法的优选实施方案中，所述TLR4拮抗剂是3D-MPL，且所述免疫活性皂苷是QS21。

在一些实施方案中，所述佐剂以水包油乳液（例如，包含鲨烯、α-生育酚和表面活性剂）的形式（参见，例如W095/17210）或以脂质体的形式存在。脂质体呈递是优选的。

当在本文中使用时，术语“脂质体”指的是包覆水性内部的单层或多层（特别是2、3、4、5、6、7、8、9或10层，取决于形成的脂质膜的数量）脂质结构。脂质体和脂质体制剂是本领域熟知的。脂质体呈递在例如WO 96/33739和WO2007/068907中描述。能够形成脂质体的脂质包括所有具有脂肪或脂样性能的物质。甘油酯、甘油膦酸酯、甘油膦酯、甘油膦酰酯、硫脂、鞘脂、磷脂、异戊烯醇、类固醇、硬脂、固醇、古脂质（archeolipid）、合成的阳离子脂质和含碳水化合物脂质。在本发明的特定的实施方案中，所述脂质体包含磷脂。合适的磷脂包括（但不限于） : 磷酸胆碱(PC)其是卵磷脂合成的中间体；天然磷脂衍生物：卵磷酸胆碱、卵磷酸胆碱、大豆磷酸胆碱、氢化大豆磷酸胆碱、作为天然磷脂的鞘磷脂；和合成的磷脂衍生物: 磷酸胆碱 (二癸酰基-L-a-磷脂酰胆碱[DDPC]、二月桂酰磷脂酰胆碱[DLPC]、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱[DMPC]、二棕榈酰磷脂酰胆碱[DPPC]、二硬脂酰磷脂酰胆碱[DSPC]、二油酰磷脂酰胆碱[DOPC]、1-棕榈酰、2-油酰磷脂酰胆碱 [POPC]、二烯醇磷脂酰胆碱[DEPC])、磷酸甘油(1、2- 二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油[DMPG]、1、2-二棕榈酰基-sn-甘油基-3-磷酸甘油[DPPG]、1、2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油[DSPG]、1-棕榈酰-2-油酰-sn-甘油基-3-磷酸甘油[POPG])、磷脂酸(1、2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷脂酸[DMPA]、二棕榈酰磷脂酸[DPPA]、二硬脂酰-磷脂酸[DSPA])、磷酸乙醇胺(1、2-二肉豆蔻酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺[DMPE]、1、2-二棕榈酰-sn-甘油基-3-二硬脂酰[DPPE]、1、2-二硬脂酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺 [DSPE]、1、2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺[DOPE])、磷酸丝氨酸（phoshoserine）、聚乙二醇[PEG]磷脂。

脂质体大小可以在30nm至数um之间变化，取决于磷脂组合物和用于制备它们的方法。在本发明的特定的实施方案中，所述脂质体大小将在50 nm至500 nm的范围内，而在另外的实施方案中在50 nm至200 nm的范围内。动态激光散射是本领域技术人熟知的用于测量脂质体大小的方法。

在特别合适的实施方案中，用于本发明的脂质体包含DOPC和固醇，特别是胆固醇。因此，在特定的实施方案中，本发明的组合物包含以脂质体形式的本文所述的任何量的QS21，其中所述脂质体包含DOPC和固醇，特别是胆固醇。

优选地，所述第一佐剂和第二佐剂包含在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21。

在一个实施方案中，所述第一佐剂包含在脂质体制剂中的25至75（如50）微克3D-MPL和25至75（如50）微克QS21，而所述第二佐剂包含在脂质体制剂中的5至15（如10）微克3D-MPL和5至15（如10）微克QS21。

在另一个实施方案中，所述第一佐剂包含在脂质体制剂中的12.5至37.5（如25）微克3D-MPL和12.5至37.5（如25）微克QS21，而所述第二佐剂包含在脂质体制剂中的2.5至7.5（如5）微克3D-MPL和2.5至7.5（如5）微克QS21。

在另一个实施方案中，所述第一佐剂包含在脂质体制剂中的12.5至37.5，如20至30微克(例如大约或恰好25微克)3D-MPL和12.5至37.5，如20至30微克(例如大约或恰好25微克)QS21，而所述第二佐剂包含在脂质体制剂中的减少量的3D-MPL或QS21，如2.5至20，如2.5至10 微克(例如大约或恰好5 微克)3D-MPL和如2.5至20，如2.5至10微克(例如大约或恰好5微克)QS21。合适地，在第一和第二佐剂中3D-MPL的量与QS21的量相同。

熟知的是用于肠胃外施用溶液的应当是生理等渗的（即，具有药学上可接受的摩尔渗透压浓度）以避免细胞变形或裂解。药学上可接受的摩尔渗透压浓度将通常意为溶液将具有大约等渗或轻微高渗的摩尔渗透压浓度。合适地，本发明的免疫原性组合物将具有250至750 mOsm/kg范围内的摩尔渗透压浓度，例如，所述摩尔渗透压浓度可以在250至550mOsm/kg的范围内，如在280至500 mOsm/kg的范围内。摩尔渗透压浓度可以根据本领域已知的技术测量，诸如通过使用可商购获得的渗压计，例如可从Advanced Instruments Inc.(USA)获得的Advanced® Model 2020。“等渗剂”是生理耐受且给予制剂（例如本发明的免疫原性组合物）合适张度的化合物，以防止水的净流量穿过与所述制剂接触的细胞膜。已知的水性佐剂组合物含有100 mM或更多的氯化钠，例如在WO 2005/112991和WO2008/142133中的佐剂体系A（ASA），或公开于WO2007/068907中的脂质体佐剂。

在一些实施方案中，被用于所述组合物的等渗剂是盐。但是，在另外的实施方案中，所述组合物包含非离子等渗剂，且所述组合物中的氯化钠的浓度或离子强度小于100mM，如小于80 mM，例如小于30 mM，例如小于10 mM或小于5 mM。在优选的实施方案中，所述非离子等渗剂是多元醇，如山梨醇。山梨醇的浓度可以是，例如约3%至约15% (w/v)，如约4%至约10% (w/v)。其中等渗剂是盐或多元醇的包含免疫活性皂苷级分和TLR4拮抗剂的佐剂已经在WO2010142685中描述，参见，例如WO2010142685中的实施例1和2。

在另外的实施方案中，第一佐剂和/或第二佐剂不包含铝。

用于本发明的方法的抗原

在本发明的方法的一个实施方案中，第二组合物含有比第一组合物更少量的相同抗原。

在一个实施方案中，所述第二组合物中的所述相同抗原的更低量是比所述第一组合物低至少10%，如低至少25%，例如，至少低两倍，如至少低三倍，例如至少低四倍，如至少低五倍，例如至少低六倍，如至少低七倍，例如至少低八倍，如至少低九倍，例如至少低十倍，如至少低15倍，例如至少低20倍的抗原量。

在另一个实施方案中，在所述第二组合物中的所述相同抗原的更低量是比所述第一组合物低2至50倍，诸如低2至20倍，例如，如低2至15倍，如低2至10倍，例如，如低3至7倍，如低4至6倍的抗原量。

如上文所述，所述第一免疫原性组合物和所述第二免疫原性组合物具有至少一种相同抗原。在一些实施方案中，所述第一和第二组合物中的全部抗原相同。

在一个实施方案中，所述相同抗原是疟原虫抗原，如恶性疟原虫（P. falciparum）或间日疟原虫（P. vivax）抗原。在一个实施方案中，所述相同抗原是环子孢子（CS）蛋白或其免疫活性片段或变体，如恶性疟原虫的CS蛋白或其免疫活性片段或变体，或间日疟原虫的CS蛋白或其免疫活性片段或变体。

在另一个实施方案中，所述相同抗原是CelTOS(Genbank登录号Q8I5P1: 恶性疟原虫3D7 CelTOS;也是GenBank: AAN36249).)、TRAP (Genbank登录号:CAD52497.1 GI:23615505)或Pfs25 (Genbank登录号: AAN35500.1 GI:23495169)或CelTOS、TRAP和/或Pfs25的免疫活性片段或变体。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是由乙型肝炎的表面抗原S（HBsAg）或其免疫原性片段或包含HBsAg的免疫活性蛋白或其免疫活性片段组成的免疫原性蛋白，例如HBsAg与不同抗原的融合蛋白。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是VZV（水痘带状疱疹病毒）抗原。VZV抗原的实例是VZV糖蛋白gE（也被称为gp1）或其免疫原性衍生物。野生型或全长gE蛋白由623个氨基酸组成，其包含信号肽、所述蛋白的主体、疏水锚定区（残基 546-558）和C-端尾。在一个方面中，使用gE的C-末端截短物（也被称为截短gE或gE截短物），其中该截短将位于羧基末端的总氨基酸残基的4-20%移除。在另外的方面中，截短的gR缺少羧基末端锚定区（大约为野生型序列的氨基酸547-623）。在另外的方面中gR是具有SEQ ID NO. 2的序列的截短的gE。

所述gE抗原，其无锚定衍生物（其也是免疫原性衍生物）和其生产描述于EP0405867中，且在此引用（还参见Vafai (1994) Vaccine 12:1265）。EP192902也公开了gE及其生产。具有SEQ ID No. 2所示的序列的截短的gE也由Haumont等人 Virus Research(1996) 40:199公开，其通过引用全部并入本文。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是巨细胞病毒（CMV）抗原，如gB或其免疫原性片段或变体。合适的衍生自gB的抗原已经在WO 2012/049317中描述，其以US2013216613公开于美国并且为了描述合适用于本发明的的蛋白的目的通过引用并入。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是呼吸道合胞体病毒（RSV）抗原，如RSV的F蛋白或其免疫原性片段或变体。衍生自F蛋白的合适的抗原已经在WO2010149745中描述，例如WO2010149745中 SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:20和SEQ ID NO:22中所示的F蛋白变体。另外合适的RSV抗原已经在WO2011008974和WO2012158613中描述。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是登革热病毒抗原，如灭活或活减毒全登革热病毒。所述组合物可以是多价的且例如含有四种或更多种登革热毒株。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）抗原，如蛋白E和/或菌毛蛋白A或其免疫原性片段或变体，例如，在WO2012139225中描述的那些。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是结核分枝杆菌（M. tuberculosis）抗原，如M72抗原，例如，在WO2006/117240（其以美国专利号8,470,338授权为了描述合适用于本发明的的蛋白的目的通过引用并入）中描述的抗原。

值得关注的结核分枝杆菌抗原包含这样的序列，所述序列包含以下（或由其组成）：

- Rv0125，也被称为Mtb32a，如在WO2010010177的SEQ ID No 20或21中描述的；

- Rv0915, 也被称为MTCC2或Mtb41，如在WO2010010177的SEQ ID No 14中描述的；

- Rv1174，也被称为DPV，如在WO2010010177的SEQ ID No 8中描述的；

- Rv1196，也被称为 Mtb39或TbH9，如在WO2010010177的SEQ ID No 13中描述的；

- Rv1753，如在WO2010010180的SEQ ID No 1和2-7中描述的；

- Rv1793，也被称为MTI或Mtb9.9，如在WO2010010177的SEQ ID No 10中描述的；

- Rv2087，也被称为MSL或Mtb9.8，如在WO2010010177的SEQ ID No 9中描述的；

- Rv2386，如在WO2010010179的SEQ ID No 1和2-7中描述的；

- Rv3616，也被称为HTCC1或Mtb40，如在WO2010010177的SEQ ID No 1和2-7，或在WO2011092253的SEQ ID No 161-169、179或180中描述的；

或包含（或由其组成）上文序列中任一者的至少20个（如至少50个）残基的免疫原性片段，或包含（或由其组成）与上文序列中任一者具有至少90%（如至少95%或98%）同一性的变体。

值得关注的结核分枝杆菌融合抗原包括衍生自Mtb72f，如在WO2010010177的SEQID No 23中描述的；或衍生自M72，如本文SEQ ID No. 3描述的那些。特别值得关注的M72抗原是包含以下（或由其组成）的那些：与本文SEQ ID No. 3具有至少90%（如至少95%或98%）同一性的氨基酸序列，如包含SEQ ID No. 3的残基2至723 的序列（例如本文SEQ ID No.4）。

其它值得关注的结核分枝杆菌抗原包含这样的序列，所述序列包含以下（或由其组成）：

- ESAT-6 (也被称为esxA和Rv3875)，在WO97/09428的SEQ ID No: 103中(SEQ IDNo: 104的cDNA)和在Sorensen 等人Infection and Immunity 1995 63(5):1710-1717中所述的多肽序列。ESAT-6的全长多肽序列在WO10010180的SEQ ID No: 16中显示；

- Ag85复合体抗原(例如Ag85A,也被称为fbpA和Rv3804c;或Ag85B,也被称为fbpB和Rv1886c) ，其在例如Content等人 Infection and Immunity 1991 59:3205-3212 和在Huygen 等人Nature Medicine 1996 2(8):893-898中讨论。Ag85A的全长多肽序列在WO10010180的SEQ ID No: 17中显示（残基43-338的成熟蛋白质，即缺少信号肽的，是特别值得关注的）。Ag85B的全长多肽序列在WO10010180的SEQ ID No: 18中显示（残基41-325的成熟蛋白质，即缺少信号肽的，是特别值得关注的）；

-α-晶状体蛋白（也被称为 hspX和Rv2031c），其在Verbon等人 Journal ofBacteriology 1992 174:1352-1359和 Friscia等人 Clinical and ExperimentalImmunology 1995 102:53-57 (其中特别值得关注的是对应于残基71-91、21-40、91-110和111-130的片段)中讨论。α-晶状体蛋白的全长多肽序列在WO10010180的SEQ ID No: 19中显示。

- Mpt64 (也被称为Rv1980c)，其在Roche等人 Scandinavian Journal of Immunology 1996 43:662-670中描述。MPT64 的全长多肽序列在WO10010180的SEQ ID No:20中显示（残基24-228的成熟蛋白质，即缺少信号肽的，是特别值得关注的）；

TB10.4，TB10.4的全长多肽序列在WO10010180的SEQ ID No: 23中显示；

免疫原性片段可以具有任何长度，前提是其保留了免疫原性特性。例如，所述片段可以包含相关蛋白的5个或更多个连续氨基酸，如10个或更多个连续氨基酸，例如20个或更多个连续氨基酸，如50个或更多个连续氨基酸，例如100个或更多个连续氨基酸。

在另外的实施方案中，所述相同抗原包含相关蛋白的变体或由其组成。

与参考序列相比时，变体多肽可以含有多个置换，优选保守置换（例如，可以改变1-50个，如1-25个，特别是1-10个和尤其1个氨基酸残基）。合适地，此类置换不发生在表位区，因而不会对抗原的免疫原性特性具有显著影响。

与参考序列相比，蛋白变体还可以包括其中插入额外的氨基酸的那些，例如，此类插入可以在1-10个位置出现（如1-5个位置，合适地1或2个位置，特别是1个位置），且可以，例如，在每个位置涉及添加50个或更少的氨基酸（如20个或更少，特别是10个或更少，尤其是5个或更少）。合适地，此类插入不发生在表位区，因而不会对抗原的免疫原性特性具有显著影响。插入的一个实例包括组氨酸残基短段（例如2-6个残基），以帮助表达和/或纯化所关注的抗原。

变体还可以包括与参考序列相比，其中氨基酸已缺失的那些，例如，此类缺失可以在1-10个位置出现（如1-5个位置，合适地1或2个位置，特别是1个位置），且可以，例如，在每个位置涉及缺失50个或更少的氨基酸（如20个或更少，特别是10个或更少，尤其是5个或更少）。合适地，此类缺失不发生在表位区，因而不会对抗原的免疫原性特性具有显著影响。

技术人员将认识到特定的蛋白变体可以包含置换、缺失和插入（或其任意组合）。

变体优选地与相关参考序列具有至少约70%同一性，更优选至少约80%同一性，和最优选至少约90%同一性（如至少约95%、至少约98%或至少约99%）。

适用于确定序列同一性百分比和序列相似度的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，其分别在ltschul等人., Nuc. Acids Res. 25:3389-3402 (1977)和Altschul等人., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)中描述。

CS蛋白的合适变体可以是这样的变体，其中CS蛋白的部分是以与来自乙型肝炎的表面抗原S（HBsAg）的杂合蛋白的形式。CS变体抗原可以是例如，以杂合蛋白的形式，其包含CS蛋白的基本全部C-端部分、CS蛋白免疫显性区的四个或更多串联重复序列和HBsAg。所述杂合蛋白可以包含含有至少160个氨基酸，且其与CS蛋白的C-端基本同源但是缺乏疏水锚定序列的序列。CS蛋白可以缺乏C端的至少12个氨基酸。此外，其可以含有4个或更多个，例如10个或更多个Asn- Ala-Asn-Pro四肽（NANP）重复基序。

用于本发明的杂合蛋白可以是包含恶性疟原虫的CS蛋白的部分的蛋白，其基本上对应于恶性疟原虫克隆3D7的氨基酸 207-395，其衍生自通过线性接头与HBsAg的N-端框架内融合的NF54株。所述接头可以包含来自HBsAg的preS2的部分。适合用于本发明的CS构建体概述于WO 93/10152，其在美国以美国专利号5,928,902和6,169,171授权，两者均出于描述合适用于本发明的蛋白的目的通过引用并入。

用于本发明的特定的杂合蛋白是被称为RTS的杂合蛋白（图2和SEQ ID No. 1）（描述于WO93/10152（其中被指示为RTS*）和WO98/05355），其由以下组成：

-甲硫氨酸残基

-三个氨基酸残基，Met Ala Pro

-代表恶性疟原虫3D7株的CS蛋白的氨基酸207至395的189个氨基酸的小段

-甘氨酸残基

-四个氨基酸残基，Pro VaI Thr Asn，代表乙型肝炎病毒（adw血清型）preS2蛋白的四个羧基末端残基，和

-226个氨基酸的小段，其由核苷酸1653至2330编码，且指定乙型肝炎病毒（adw血清型）的S蛋白。

RTS可以是以RTS,S混合微粒的形式。RTS,S微粒包含两条多肽，RTS和S，其可以是同时合成的并自发形成复合颗粒结构（RTS,S）。

RTS蛋白可以在酵母（例如啤酒酵母（S. cerevisiae））中表达。在此类宿主中，RTS将作为脂蛋白微粒表达。受体酵母菌株可以已经在其基因组中携带了数个乙型肝炎S表达盒的整合拷贝。所得的菌株因此合成两种多肽，S和RTS，其自发地共装配至混合的（RTS,S）脂蛋白微粒中。这些微粒可以在其表面呈现杂合体的CS蛋白序列。这些混合微粒中的RTS和S可以以特定比例存在，例如1:4。

RTS,S已经在例如Vekemans等人. (2009) Vaccine 275:G67和Regules等人.(2011) Expert Rev. Vaccines 10:589中综述。

在一个实施方案中，所述第一免疫原性组合物包含25至75，如50微克RTS,S，而所述第二免疫原性组合物包含5至15，如10微克RTS,S。

在另一个实施方案中，所述第一免疫原性组合物包含12.5至37.5，如25微克RTS,S，而所述第二免疫原性组合物包含2.5至7.5，如5微克RTS,S。

在另外的实施方案中，所述相同抗原衍生自间日疟原虫的CS蛋白。已经描述了合适的间日疟原虫CS蛋白变体。例如，WO2008009652，其在美国以US20100150998公开并出于描述合适用于本发明的蛋白的目的通过引用并入，其描述了包含以下的免疫原性杂合融合蛋白：a.来源于间日疟原虫I型环子孢子的重复区的至少一个重复单元，b.来源于间日疟原虫II型环子孢子的重复区的至少一个重复单元，和c.来源于乙型肝炎病毒的表面抗原S或其片段。WO2008009652的SEQ ID NO:17描述了特定的杂合融合蛋白，被称作CSV-S。当与来源于乙型肝炎病毒的表面抗原S共表达时，形成CSV-S, S微粒（WO2008009652）。此类微粒也可以用于本发明。

在另外的实施方案中，所述相同抗原是包含RTS和CSV-S的混合微粒。此类微粒已经在WO2008009650中描述，其在美国以US20100062028 公开并出于描述合适用于本发明的蛋白的目的通过引用并入。

免疫方案，目标群体和施用模式

如上文描述的，本发明的方法包括施用包含一种或多种抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后施用包含一种或多种抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物。

在一个实施方案中，所述第一组合物的初次施用和所述第二组合物的施用之间的时间间隔为1至24个月，例如，1至18个月、如1至12个月、例如2至24个月，例如2至18个月，如2至14个月，如2至12个月、2至10个月，如3至9个月，例如4至8个月，如7至8个月。

在另一个实施方案中，所述第一组合物的初次施用和所述第二组合物的施用之间的时间间隔被加快，使得第一组合物的初次施用和所述第二组合物的施用之间的时间间隔为1至28天，例如1至21天，例如1至14天，例如1至7天。

本发明的方法可以包括在初次施用所述第一组合物和施用所述第二组合物之外一次或多次另外施用免疫原性组合物。例如，所述个体可以在施用所述第二组合物之前获得多次剂量的所述第一组合物。因此，例如，在一个实施方案中，在施用所述第二组合物之前施用两次所述第一组合物。可选地或另外地，所述个体可以在初次施用所述第二组合物之后接受多次另外剂量的所述第二组合物。因此，在本发明方法的一个实施方案中，所述第二组合物另外施用一次或多次。因此可能的方案包括但不限于以下：

a. 第一组合物，随后第二组合物

b. 第一组合物，随后第一组合物，随后第二组合

c. 第一组合物，随后第二组合物，随后第二组合

d. 第一组合物，随后第一组合物，随后第一组合物，随后第二组合

e. 第一组合物，随后第一组合物，随后第二组合物，随后第二组合

f. 第一组合物，随后第二组合物，随后第二组合物，随后第二组合

方案b.的时间间隔可以是例如0、1、5（即第0月、第1月、第5月）或0、1、6，或0、1、7，或0、1、8，或0、1、12。相似地，方案c.的时间间隔可以是例如0、1、5，或0、1、6，或0、1、7，或0、1、8，或0、1、12。方案b.和c.的加快时间间隔可以是例如第0天、第7天、第14天。

在另外的实施方案中，所述第二组合物可以是例如，以每年重复的强化剂形式给予，例如持续1-5年或更长。在一个实施方案中，在施用所述第二组合物后，以至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月或至少20个月或更多个月的时间间隔，另外施用所述第二组合物一次或多次。在一个实施方案中，在施用所述第二组合物后，以至少1年、至少2年、至少3年、至少4年、至少5年的时间间隔，另外施用所述第二组合物一次或多次。

使用本发明的方法治疗的所述个体可以是任意年龄。在本发明的一个方面中，所述个体是人。本发明的方法可以用作疟疾清除程序的部分，在该情况下可能可用于使基本上全部群体（即全部或大部分年龄组）接受免疫。然而，在一个实施方案中，当施用所述第一组合物时，所述人类个体年龄大于18岁。在另一个实施方案中，当施用所述第一组合物时，所述人类个体年龄小于5岁。在另外的实施方案中，所述个体年龄为6-12周或5-17月。另外的特别合适的目标群体包括前往疟疾流行地区的旅行者。

所述第一和第二组合物可以通过多种合适的途径施用，其包括肠胃外，如肌内或皮下施用。

在一个特定的实施方案中，所述第二组合物是皮内施用。如本文使用的术语皮内地，意指将抗原应用至人皮肤的真皮和/或上皮内。免疫原性组合物的皮内应用可以通过使用技术人员已知的任何皮肤方法进行，包括但不限于，使用短针头装置（包括约0.2至约0.6mm长度的微针）递送或使用皮肤贴片递送。用于本文描述的经皮肤疫苗的合适的装置包括如那些在US 4,886,499,US5,190,521, US 5,328,483、US 5,527,288、US 4,270,537、US5,015,235、US 5,141,496、US 5,417,662 和EP1092444中描述的短针头装置。经皮肤疫苗还可以通过限制针头进入皮肤的有效穿透长度的装置施用（如WO99/34850中描述的那些）。通过液体射流注射器或通过针头将液体疫苗递送至真皮的射流注射装置也是合适的。使用压缩空气将粉末形式的疫苗加速穿过皮肤表层至真皮的弹道粉末/颗粒递送装置也是合适的。皮肤贴片将通常包括垫板，其包括固体支持物。贴片递送本发明使用的抗原和佐剂至真皮或上皮。在特别的实施方案中，可用于本发明的贴片包括多个微突起。所述微突起可以具有适合用于刺穿角质层、上皮和/或真皮的任何形状，并将抗原和佐剂递送至上皮或真皮。在特别的实施方案中，所述微突起是生物可降解的且包含生物可降解的聚合物。

用于本发明的免疫原性组合物可以通过将一种或多种抗原与佐剂掺和而制备。所述一种或多种抗原可以以冻干形式或液体制剂提供。针对每种组合物，可以提供包括含有抗原的第一容器和含有佐剂的第二容器的试剂盒。

合适地，根据本发明的所述免疫原性组合物具有0.05 ml至1 ml的人剂量体积，如0.1至0.5 ml,特别是约0.5 ml,或0.7 ml的剂量体积。可以减少所述第二免疫原性组合物的体积，并例如为0.05 ml至0.5 ml,如0.1至0.2 ml。所使用的组合物的体积可以取决于递送途径，通过皮内途径施用更小剂量。

通常，对于向人施用，所述第一和第二免疫原性组合物将包含1 ug至100 ug的结核分枝杆菌（例如，包含SEQ ID No. 3的多肽），如1 ug至50 ug。合适地，所述第一免疫原性组合物将含有1 ug至50 ug的M72相关抗原（如5 ug至50 ug），尤其是1 ug至20 ug（如5 ug至20 ug）并特别地在大约或恰好10 ug。

在一些实施方案中，所述第二免疫原性组合物将含有与所述第一免疫原性组合物等量的M72相关抗原。例如，所述第二免疫原性组合物将含有1 ug至50 ug的M72相关抗原（如5 ug至50 ug），尤其是1 ug至20 ug（如5 ug至20 ug）并特别地在大约或恰好10 ug。

在其它实施方案中，所述第二免疫原性组合物将含有相对所述第一免疫原性组合物减少量的M72相关抗原。例如，所述第二免疫原性组合物将含有1 ug至40 ug的M72相关抗原（如2 ug至40 ug），尤其是1 ug至16 ug（如2 ug至16 ug）并特别地小于10 ug（如1至8ug）。

本应用的全部参考的教导，包括专利应用和授权的专利，通过引用全部并入本文。以“包含”某些要素定义的组合物或方法或过程被理解为涵盖了（分别地）由那些要素组成的组合物、方法或过程。本发明将进一步通过参考一下非限制性的实例进行描述：

实施例1：使用RTS,S和佐剂AS01的疫苗接种和实验性疟疾攻击

研究中使用的疫苗

基本如WO 93/10152中所述在酵母（酿酒酵母）中生产RTS，S。

“标准”剂量的RTS,S/AS01包含在含有在具有脂质体的制剂中的免疫刺激剂3D-MPL® (GlaxoSmithKline Biologicals, Montana, USA)和QS21(各50 ug)的500 uL AS01佐剂中重构的50 ug冻干的RTS,S抗原。

“分次”剂量的RTS,S/ AS01是100 uL上述溶液，即，其含有10 ug冻干的RTS,S抗原和各10 ug具有脂质体的3D-MPL和QS21。

术语

在本文中，RTS,S/AS01的标准计量被称为“R”，而分次剂量被称为“r”。具有三次标准计量的标准方案被称为“RRR”，而其中第三次剂量为分次剂量的方案被称为“RRr”。具有两次标准计量随后是两次分次剂量的方案是“RRrr”，以此类推。

方法学

进行临床试验以评价含有AS01佐剂化的抗原RTS,S的疟疾疫苗针对子孢子攻击的安全性、反应原性和效力，所述疫苗被肌内施用于年龄为18-50岁的健康的无疟疾志愿者。给予“延时分次剂量”组两次标准剂量（在0月和1个月），并在7个月给予分次剂量（标准计量的五分之一（1/5th））。间隔一个月给予（“0、1、2-月”组）三次标准剂量。

将46位受试者招募至两个组群，并随机分配至上述“延时分次剂量”（30位受试者）和“0、1、2-月”（16位受试者）。另外12位受试者是“传染性”对照的一部分，即不接受任何免疫，但承受子孢子攻击的志愿者。

对每个组群，志愿者被要求接受标准化的初次疟疾攻击（Chulay等人. (1986) AmJ Trop Med Hyg. 35:66)，其也通常被称为“子孢子攻击”，约3周后进行上述组中任意的第三次剂量。初次攻击涉及允许受恶性疟原虫子孢子感染的斯氏按蚊（Anophelesestevensi）在每个受攻击的志愿者上喂食5分钟的时间段。

在受到攻击后受试者随后在至少30天的时间段每天进行评估他们是否已经受到疟疾感染。检测感染的原理方法是Giesma-染色外周血涂片的评估，以通过光学显微镜检测无性生殖期的寄生虫。无性生殖期寄生虫的存在指示受试者已经经历了有效感染，寄生虫已经从肝脏释放并且进行至红细胞内期，并因此没有实现针对攻击的无菌保护。

在出现感染的最初症状时，受试者被宣布为对疟疾呈阳性，并接受治疗剂量的氯喹。最初效力读出为无菌保护，即受试者从未发展出无性繁殖期子孢子。另外，记录了那些未完全受保护的受试者中受到攻击至出现寄生虫血症的时间。通过接受子孢子攻击但保持不被恶性疟原虫感染的接受免疫的参与者的比例以及通过导致感染的展开前（pre-patent）时期的推迟对保护进行评估。

疫苗效力(VE）被定义为100*(1-相对风险)。使用Fisher’s Exact测试比较各个“延时分次剂量”和“0、1、2-月”疫苗组与“传染性”对照之间的疟疾发生率。

结果

表1.疫苗效力

组别	疫苗接种的受试者数量	在受到攻击后发生寄生虫血症的接种疫苗受试者的数量**	疫苗效力%（VE）预估*
				延时分次剂量	30	4	87
0、1、2-月	16	6	63

* Logrank分析（发生寄生虫血症的时间），Fx对RRR p=0.0455。

** 在攻击后第28天已经测量到的寄生虫血症。

研究不足以检测延时分次剂量组相比0、1、2个月组的优越性，且两组之间的差异在统计学上并非特别显著（Fx相比RRR的VE增加= 57.0%, [-7.9-88.3], p=0.0741,Fisher’s exact）。但是，延时分次剂量组相比0、1、2个月组的存活时间差异的分析（其考虑了在延时分次剂量组中感染的推迟时间）具有统计学上的显著性（p=0.0455, logrank）。RRr组中4/30的受试者发生寄生虫血症（VE = 87% [95% CI: 67, 95）；RRR组中6/16的受试者发生寄生虫血症（VE = 63% [95% CI 20, 80]）。图4a。此外，至今完成的比较研究的延时分次剂量组的结果针对5个0、1、2个月RTS,S/AS01试验中所研究的95位受试者的集合数据的分析显示，现在的结果极不可能是偶然发生的（p=0.0045, Fisher’s exact）。图4b。

研究延长

将研究延长，且一些受试者在最后剂量的6个月后接受分次强化，随后在一个月后用子孢子攻击。对在第一次攻击后未受到保护的受试者提供分次强化。在第一次攻击后受到保护的受试者随机接受或不接受分次强化，随后在一个月后用子孢子攻击。结果汇总于表2以及图5a和5b中。NP代表在第一次攻击期间没有受到保护，P代表在第一次攻击期间受到保护。全部强化都是分次的（RTS,S/AS01B剂量的五分之一）。

表2.分次剂量强化。

方案	受保护的
		RRr- NP-经强化	2/2
RRr - P -经强化	9/10
		RRr - P -未经强化	3/7
RRR - NP -经强化	2/3
		RRR - P -经强化	1/5
RRR - P -未经强化	1/4
		传染性对照	0/6

在Fx方案（n=2）或RTS,S的标准计量方案（n=3）后均没有受到保护的大部分受试者可以使用随后的强化剂量（1/5th剂量）获得保护（数据未显示）。

抗-CS抗体效价

通过由GSK Biologicals开发的标准酶联免疫吸附测定（ELISA）确定抗-CS抗体效价。Clement等人. (2012) Malar J 11:384。使用参考标准曲线计算抗体效价并且如所述以ELISA单位（EU）表示。结果汇总于表3中。

表3.抗-CS抗体效价。Fx、RRR、NP、P、Fx NP、Fx P、RRR NP和RRR P在本文别处描述。

分类	N	GMT	LL	UL

Fx	30	40545	32979	49847
					RRR	16	55148	37072	82037

					NP	10	39800	22368	70817
P	36	46725	38432	56808

Fx NP	4	34583	19060	62748
					Fx P	26	41549	33231	51944

					RRR NP	6	43708	17505	109133
RRR P	10	63403	44880	89570

亲和力测定

评估了抗-CS抗体针对CSP的重复区的亲和力指数（AI）。为了测量IgG的亲和力，如Olotu等人(2014) PLoS One 15;9(12):e115126. doi: 10.1371/journal.pone.0115126所述使用两个不同的ELISA板（一个使用离液剂处理，一个未进行处理）对样品进行评估。将硫氰酸铵（NH4SCN）的1M溶液作为离液剂添加至处理板，而将含0.05% Tween-20的PBS添加至未处理板，且两个ELISA板被进一步洗涤并如描述显色。亲和力指数（AI）以在使用NH4SCN处理后保持与包覆抗原结合的抗-CSP IgG的浓度(EU/ml)除以在未处理板中保持与包覆抗原结合的IgG的浓度(EU/ml)的比例计算。结果汇总于表4中。

表4.亲和力指数（AI）。Fx、RRR、NP、P、Fx NP、Fx P、RRR NP和RRR P在本文别处描述。

分类	N	GMT	LL	UL

Fx	30	0.68	0.65	0.72
					RRR	16	0.55	0.51	0.58

					NP	10	0.61	0.55	0.68
P	36	0.64	0.61	0.68

Fx NP	4	0.70	0.63	0.78
					Fx P	26	0.68	0.64	0.72

					RRR NP	6	0.55	0.50	0.60
RRR P	10	0.54	0.49	0.59

AI可以用于比较方案，但是不能解释在个体水平的保护。

实施例2：使用M72和佐剂AS01的疫苗接种

在小鼠模型中研究了肺结核抗原M72 2-his (SEQ ID No. 4)的延时的和减少的剂量的影响。

材料和方法

动物模型

通过肌内途径，向雌性小鼠C57BL/6JOlaHsd（6周龄，12只小鼠/组）在0-14天和28或98天注射50µl，如下表所述。

AS01E佐剂含有在具有脂质体的制剂中的免疫刺激物3D-MPL®(GlaxoSmithKline Biologicals, Montana, USA)和QS21 (各2.5 ug)。使用佐剂缓冲液进行稀释。

读出

全血ICS，在

第21天- II-后7天（G1-7）；

第35天- III-后7天（G1-3）；

第105天- III-后77天（G1-3）和III-后7天（G4-7）

血清学抗-M72 IgTot ，在

第28天- II-后-14天（G1-7）；

第42天- III-后-14天（G1-3）；

第112天- III-后84天（G1-3）和III-后14天（G4-7）

为了得到足够的体积，在第21、35和105天收集3只小鼠组的4个集合的全血。个体血清在第28、42和112天收集。

单独鉴定小鼠以将ICS和血清学的PII和PIII结果关联。

读出描述

细胞免疫应答-胞内细胞因子染色（ICS）

白细胞分离

在每个时间点，从每只小鼠收集血液并随后汇集（3只小鼠的5个集合）。将血液收集在装有含有肝素（1/10）的RPMI/添加剂（RPMI 1640,补充有谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和2-巯基乙醇）的试管中。将10体积裂解缓冲液添加至全血中并将试管在室温（RT）下温育10分钟。在离心（RT下335g, 10分钟）后，在RPMI/添加剂中收集团块并过滤（细胞筛100µm）。将细胞再次沉淀（在RT下335g, 10 分钟），并在完全培养基（RPMI1640,补充有谷氨酰胺、青霉素/链霉素、丙酮酸钠、非必需氨基酸和2-巯基乙醇以及5%热灭活胎牛血清）中重悬。

新鲜白细胞的体外刺激

将白细胞在圆底96-孔板以约每孔1百万细胞铺板。随后使用抗-CD28 (克隆9C10(MFR4.B)和抗-CD49d (克隆37.51)以1µg/ml刺激6小时（37℃, 5% CO₂），其含有或不含有1µg/ml覆盖M72序列的肽。在2小时刺激后，添加在完全培养基中稀释至1/200的BrefeldinA，再持续4小时。随后将平板转移至4℃过夜。

ICS

使用5-色ICS测定进行细胞染色和分析。

将细胞转移至V-底96-孔板，在使用200µl Flow Buffer (PBS 1X, 1% FCS)洗涤后在4℃下以189g离心5分钟，在4℃下在含有稀释至1/50的抗- CD16/32 (克隆2.4G2)的50µl Flow Buffer中重悬细胞10分钟。随后添加含有抗-CD4-V450 (克隆RM4-5,稀释至1/50)和抗-CD8-PerCp-Cy5.5 (克隆53-6.7,稀释至1/50)抗体以及Live&Death PO (稀释至1/500)的50 µl Flow Buffer，在4℃下保持30分钟，将细胞离心（在4℃下189g 5分钟）并用200µl Flow Buffer洗涤。

将白细胞固定并通过在4℃下添加200µl Cytofix/Cytoperm溶液(BectonDickinson commercial buffer)20分钟进行透性化处理。将细胞离心（在4℃下189g 5分钟）并用200µl Perm/Wash缓冲液（在蒸馏水中以1:10稀释的Becton Dickinson商用缓冲液）洗涤。在额外的离心步骤后，在4℃下将细胞在含有抗-IL2-FITC (克隆JES6-5H4, 稀释至1/400)、抗- IFNγ-APC (克隆XMG1.2, 稀释至1/50)和抗-TNFα-PE (克隆MP6-XT22, 稀释至1/700)抗体的50µl Perm/Wash缓冲液中染色1小时。将细胞用 Perm/Wash缓冲液洗涤两次，在220µl BD Stabilizing Fixative溶液中重悬。通过流式细胞术使用LSRII和FlowJo软件分析染色的细胞。

体液应答-通过Elisa的抗-M72 Ig tot血清学

使用含0.25µg/ml重组抗原M72的PBS包覆96-孔Elisa板，并在4℃下温育过夜。将来自Post II和Post III的经免疫的小鼠的血清在PBS (0.2%)-BSA中以1/10000稀释，并随后在孔1至12中进行2倍系列稀释并温育。标准和对照材料的系列稀释被用于计算被测血清的抗-M72抗体标准效价并确保测试的有效性。在每个温育步骤后，使用PBS 0.1% tween20缓冲液洗涤板。随后添加特异于小鼠Ig的生物素酰化山羊抗体，并且通过与链霉亲和素-过氧化物酶复合物和过氧化物酶底物邻-苯二胺盐酸盐/H2O2温育显示抗原-抗体复合物。在490-620 nm记录光密度(O.D.)。使用回归模型，通过ELISA标准曲线确定每个单独小鼠血清的抗-M72抗体效价，并用ELISA单位(EU)/ml表示。随后计算每组小鼠的几何平均效价（GMT）。

结果

T细胞应答

A. M72-特异性CD4 T & CD8 T细胞应答的动力学

为了评估分次和/或延时第三剂量对CD4 T和CD8 T细胞应答的潜在益处，使小鼠接受本研究中0.25ug M72的最大剂量的免疫，以处于CD4 T细胞的动态范围中，同时诱导可检测的CD8 T细胞应答。

如图6所示，在标准计划表（D0-D14-D28）中给予分次第三剂量没有提供改善的CD4T细胞应答，而在接受全剂量、1/5剂量和1/25剂量的组的 7PII至7PIII中观察到了相当的强化。

然而，尽管在集合之间存在 M72特异CD4 T细胞应答的一些可变性，但是相比标准计划表，在延时的0.25ug剂量的M72 7天后观察到更强的强化。此外，接受延时和分次第三剂量或延时和未佐剂化第三剂量的小鼠中的M72 特异CD4 T细胞应答水平与标准计划表中全剂量免疫组中观察到的水平相当。这说明了延时计划表对于CD4 T细胞应答的益处。

在标准计划表中接受0.25ug M72剂量的小鼠中检测到低水平的M72-特异CD8 T细胞应答，且第三免疫剂量没有强化M72-特异CD8 T细胞应答（图8）。

在标准计划表中接受分次第三剂量的小鼠中观察到减少的M72-特异CD8 T细胞应答。这与先前的数据（未显示）一致，其中CD8 T细胞应答主要受到用于免疫小鼠的M72蛋白剂量范围的影响，且其中高剂量的M72（1ug 或8ug）诱导比0.1ug或0.25ug的M72更高水平的应答。

在接受0.25ug M72的延时第三剂量的小鼠中，在所有测试集合中的7PII至7PIII观察到M72特异性CD8 T细胞应答的强化。然而，尽管全部组别均接受了2个剂量的0.25ugM72/AS01E，CD8 T细胞应答的中值在各组的7PII中显示出变化性 (0.231至0.817)。

B. M72-特异性CD4 T & CD8 T细胞应答的细胞因子概况

在标准计划表中接受了全剂量、1/5剂量和1/25剂量的组别中，在7PII和7PIII时均观察到了相似的CD4 T细胞因子表达概况。M72-特异CD4 T细胞应答包括2次免疫后的三倍（IL2/IFNg/TNFa）和双倍（IFNg/TNFa）应答。第三次免疫剂量没有支持多功能CD4 Th1细胞的进展，却相反地增加了产生两倍（IL2/IFNg）和单一（仅IFNg）的CD4 T细胞（图7）。

给予延时第三剂量似乎支持了多功能CD4 Th1细胞的进展，因为M72-特异CD4 T细胞应答几乎由产生IL2/IFNg/TNFa和IFNg/TNFa的CD4 T细胞构成（图7）。AS01进一步增强了多功能T细胞的进展，在接受延时和未佐剂化的第三剂量的小鼠中观察到了产生降低水平的IL2/IFNg/TNFa和IFNg/TNFa和仅增加IFNg水平的CD4 T细胞。

尽管在接受了延时和分次第三剂量的小鼠中的M72特异CD4 T细胞应答的水平与基准所观察到的相似，但是细胞因子概况略有不同，而这些数据一起说明了在延时的免疫计划表中多功能CD4 Th1细胞进展的改善。

已经表明，多功能CD4 T细胞的量级和质量与小鼠中的保护相关（Derrick等人2011 Vaccine 29:2902-2909）。

在所有组别的7PII和7PIII时均观察到相似的M72-特异CD8 T细胞的细胞因子概况（图8）。M72-特异CD8 T细胞应答大部分由产生两倍（IFNg/TNFa）和单一（仅IFNg ）的CD8T细胞构成。还检测到了非常低水平的产生IL2/INFg/TNFa和TNFa的CD8 T细胞。

抗体应答

A. 抗-M72 Ig tot血清学

如图10所示，在标准计划表中接受全剂量、1/5剂量和1/25剂量的组别中在14PII和14 PIII之间观察到抗-M72血清学应答的强化。观察到的剂量范围效应的趋势为最高剂量给予了最高的M72特异性血清学应答。在84PIII时，更低的血清学应答表明应答的持续随时间降低。

在接受延时的第三次免疫的小鼠中，观察到了更高量级的应答。在存在和不存在AS01E的情况下，观察到相似水平的 M72特异性Ig，说明在延时的第三次免疫后，单独的M72足以诱导高血清学应答。

序列表

<110> GlaxoSmithKline Biologicals sa

<120> 诱导免疫应答的新方法

<130> VB65685 PCT

<150> GB1405921.6

<151> 2014-04-02

<160> 4

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 424

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> RTS,S

<400> 1

Met Met Ala Pro Asp Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

1 5 10 15

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

20 25 30

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

35 40 45

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala

50 55 60

Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Ala Asn Pro Asn Lys

65 70 75 80

Asn Asn Gln Gly Asn Gly Gln Gly His Asn Met Pro Asn Asp Pro Asn

85 90 95

Arg Asn Val Asp Glu Asn Ala Asn Ala Asn Ser Ala Val Lys Asn Asn

100 105 110

Asn Asn Glu Glu Pro Ser Asp Lys His Ile Lys Glu Tyr Leu Asn Lys

115 120 125

Ile Gln Asn Ser Leu Ser Thr Glu Trp Ser Pro Cys Ser Val Thr Cys

130 135 140

Gly Asn Gly Ile Gln Val Arg Ile Lys Pro Gly Ser Ala Asn Lys Pro

145 150 155 160

Lys Asp Glu Leu Asp Tyr Ala Asn Asp Ile Glu Lys Lys Ile Cys Lys

165 170 175

Met Glu Lys Cys Ser Ser Val Phe Asn Val Val Asn Ser Ser Ile Gly

180 185 190

Leu Gly Pro Val Thr Asn Met Glu Asn Ile Thr Ser Gly Phe Leu Gly

195 200 205

Pro Leu Leu Val Leu Gln Ala Gly Phe Phe Leu Leu Thr Arg Ile Leu

210 215 220

Thr Ile Pro Gln Ser Leu Asp Ser Trp Trp Thr Ser Leu Asn Phe Leu

225 230 235 240

Gly Gly Ser Pro Val Cys Leu Gly Gln Asn Ser Gln Ser Pro Thr Ser

245 250 255

Asn His Ser Pro Thr Ser Cys Pro Pro Ile Cys Pro Gly Tyr Arg Trp

260 265 270

Met Cys Leu Arg Arg Phe Ile Ile Phe Leu Phe Ile Leu Leu Leu Cys

275 280 285

Leu Ile Phe Leu Leu Val Leu Leu Asp Tyr Gln Gly Met Leu Pro Val

290 295 300

Cys Pro Leu Ile Pro Gly Ser Thr Thr Thr Asn Thr Gly Pro Cys Lys

305 310 315 320

Thr Cys Thr Thr Pro Ala Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro Ser Cys Cys

325 330 335

Cys Thr Lys Pro Thr Asp Gly Asn Cys Thr Cys Ile Pro Ile Pro Ser

340 345 350

Ser Trp Ala Phe Ala Lys Tyr Leu Trp Glu Trp Ala Ser Val Arg Phe

355 360 365

Ser Trp Leu Ser Leu Leu Val Pro Phe Val Gln Trp Phe Val Gly Leu

370 375 380

Ser Pro Thr Val Trp Leu Ser Ala Ile Trp Met Met Trp Tyr Trp Gly

385 390 395 400

Pro Ser Leu Tyr Ser Ile Val Ser Pro Phe Ile Pro Leu Leu Pro Ile

405 410 415

Phe Phe Cys Leu Trp Val Tyr Ile

420

<210> 2

<211> 546

<212> PRT

<213> 水痘带状疱疹

<400> 2

Met Gly Thr Val Asn Lys Pro Val Val Gly Val Leu Met Gly Phe Gly

1 5 10 15

Ile Ile Thr Gly Thr Leu Arg Ile Thr Asn Pro Val Arg Ala Ser Val

20 25 30

Leu Arg Tyr Asp Asp Phe His Ile Asp Glu Asp Lys Leu Asp Thr Asn

35 40 45

Ser Val Tyr Glu Pro Tyr Tyr His Ser Asp His Ala Glu Ser Ser Trp

50 55 60

Val Asn Arg Gly Glu Ser Ser Arg Lys Ala Tyr Asp His Asn Ser Pro

65 70 75 80

Tyr Ile Trp Pro Arg Asn Asp Tyr Asp Gly Phe Leu Glu Asn Ala His

85 90 95

Glu His His Gly Val Tyr Asn Gln Gly Arg Gly Ile Asp Ser Gly Glu

100 105 110

Arg Leu Met Gln Pro Thr Gln Met Ser Ala Gln Glu Asp Leu Gly Asp

115 120 125

Asp Thr Gly Ile His Val Ile Pro Thr Leu Asn Gly Asp Asp Arg His

130 135 140

Lys Ile Val Asn Val Asp Gln Arg Gln Tyr Gly Asp Val Phe Lys Gly

145 150 155 160

Asp Leu Asn Pro Lys Pro Gln Gly Gln Arg Leu Ile Glu Val Ser Val

165 170 175

Glu Glu Asn His Pro Phe Thr Leu Arg Ala Pro Ile Gln Arg Ile Tyr

180 185 190

Gly Val Arg Tyr Thr Glu Thr Trp Ser Phe Leu Pro Ser Leu Thr Cys

195 200 205

Thr Gly Asp Ala Ala Pro Ala Ile Gln His Ile Cys Leu Lys His Thr

210 215 220

Thr Cys Phe Gln Asp Val Val Val Asp Val Asp Cys Ala Glu Asn Thr

225 230 235 240

Lys Glu Asp Gln Leu Ala Glu Ile Ser Tyr Arg Phe Gln Gly Lys Lys

245 250 255

Glu Ala Asp Gln Pro Trp Ile Val Val Asn Thr Ser Thr Leu Phe Asp

260 265 270

Glu Leu Glu Leu Asp Pro Pro Glu Ile Glu Pro Gly Val Leu Lys Val

275 280 285

Leu Arg Thr Glu Lys Gln Tyr Leu Gly Val Tyr Ile Trp Asn Met Arg

290 295 300

Gly Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Ala Thr Phe Leu Val Thr Trp Lys

305 310 315 320

Gly Asp Glu Lys Thr Arg Asn Pro Thr Pro Ala Val Thr Pro Gln Pro

325 330 335

Arg Gly Ala Glu Phe His Met Trp Asn Tyr His Ser His Val Phe Ser

340 345 350

Val Gly Asp Thr Phe Ser Leu Ala Met His Leu Gln Tyr Lys Ile His

355 360 365

Glu Ala Pro Phe Asp Leu Leu Leu Glu Trp Leu Tyr Val Pro Ile Asp

370 375 380

Pro Thr Cys Gln Pro Met Arg Leu Tyr Ser Thr Cys Leu Tyr His Pro

385 390 395 400

Asn Ala Pro Gln Cys Leu Ser His Met Asn Ser Gly Cys Thr Phe Thr

405 410 415

Ser Pro His Leu Ala Gln Arg Val Ala Ser Thr Val Tyr Gln Asn Cys

420 425 430

Glu His Ala Asp Asn Tyr Thr Ala Tyr Cys Leu Gly Ile Ser His Met

435 440 445

Glu Pro Ser Phe Gly Leu Ile Leu His Asp Gly Gly Thr Thr Leu Lys

450 455 460

Phe Val Asp Thr Pro Glu Ser Leu Ser Gly Leu Tyr Val Phe Val Val

465 470 475 480

Tyr Phe Asn Gly His Val Glu Ala Val Ala Tyr Thr Val Val Ser Thr

485 490 495

Val Asp His Phe Val Asn Ala Ile Glu Glu Arg Gly Phe Pro Pro Thr

500 505 510

Ala Gly Gln Pro Pro Ala Thr Thr Lys Pro Lys Glu Ile Thr Pro Val

515 520 525

Asn Pro Gly Thr Ser Pro Leu Ile Arg Tyr Ala Ala Trp Thr Gly Gly

530 535 540

Leu Ala

545

<210> 3

<211> 723

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> M72融合蛋白

<400> 3

Met Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly Gln Gly

1 5 10 15

Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln Ile Arg

20 25 30

Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala Phe Leu

35 40 45

Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val Gln Arg

50 55 60

Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr Gly Asp

65 70 75 80

Val Ile Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr Ala Met

85 90 95

Ala Asp Ala Leu Asn Gly His His Pro Gly Asp Val Ile Ser Val Thr

100 105 110

Trp Gln Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr Leu Ala

115 120 125

Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Val Asp Phe Gly Ala Leu Pro Pro

130 135 140

Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala Ser Leu

145 150 155 160

Val Ala Ala Ala Gln Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu Phe Ser

165 170 175

Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val Gly Ser

180 185 190

Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Val Ala Ala Ala Ser Pro Tyr

195 200 205

Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln Ala Glu Leu Thr Ala Ala

210 215 220

Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly Leu Thr

225 230 235 240

Val Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu

245 250 255

Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Ala Val Asn

260 265 270

Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala Met Phe

275 280 285

Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu Pro Phe

290 295 300

Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu Gln Ala

305 310 315 320

Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln Leu Met

325 330 335

Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Thr Gln Gly

340 345 350

Thr Thr Pro Ser Ser Lys Leu Gly Gly Leu Trp Lys Thr Val Ser Pro

355 360 365

His Arg Ser Pro Ile Ser Asn Met Val Ser Met Ala Asn Asn His Met

370 375 380

Ser Met Thr Asn Ser Gly Val Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser Ser Met

385 390 395 400

Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln Thr Ala

405 410 415

Ala Gln Asn Gly Val Arg Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser Leu Gly

420 425 430

Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg Ala Ala

435 440 445

Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Gln Ala Trp Ala Ala Ala Asn Gln

450 455 460

Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu Thr Ser

465 470 475 480

Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gln Met Leu Gly Gly Leu Pro Val Gly

485 490 495

Gln Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu Arg Val

500 505 510

Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met Pro His Ser Pro Ala Ala Gly Asp Ile

515 520 525

Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro Ala Leu

530 535 540

Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pro Gln Val Val

545 550 555 560

Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala Gly Thr

565 570 575

Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn His Val

580 585 590

Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser Val Gly Ser Gly Gln

595 600 605

Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gln Asp Val Ala

610 615 620

Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala Ile Gly

625 630 635 640

Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala Met Gly Asn Ser Gly

645 650 655

Gly Gln Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val Ala Leu

660 665 670

Gly Gln Thr Val Gln Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu Glu Thr

675 680 685

Leu Asn Gly Leu Ile Gln Phe Asp Ala Ala Ile Gln Pro Gly Asp Ala

690 695 700

Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln Val Val Gly Met Asn Thr

705 710 715 720

Ala Ala Ser

<210> 4

<211> 725

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> M72融合蛋白(2-his)

<400> 4

Met His His Thr Ala Ala Ser Asp Asn Phe Gln Leu Ser Gln Gly Gly

1 5 10 15

Gln Gly Phe Ala Ile Pro Ile Gly Gln Ala Met Ala Ile Ala Gly Gln

20 25 30

Ile Arg Ser Gly Gly Gly Ser Pro Thr Val His Ile Gly Pro Thr Ala

35 40 45

Phe Leu Gly Leu Gly Val Val Asp Asn Asn Gly Asn Gly Ala Arg Val

50 55 60

Gln Arg Val Val Gly Ser Ala Pro Ala Ala Ser Leu Gly Ile Ser Thr

65 70 75 80

Gly Asp Val Ile Thr Ala Val Asp Gly Ala Pro Ile Asn Ser Ala Thr

85 90 95

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100 105 110

Val Thr Trp Gln Thr Lys Ser Gly Gly Thr Arg Thr Gly Asn Val Thr

115 120 125

Leu Ala Glu Gly Pro Pro Ala Glu Phe Met Val Asp Phe Gly Ala Leu

130 135 140

Pro Pro Glu Ile Asn Ser Ala Arg Met Tyr Ala Gly Pro Gly Ser Ala

145 150 155 160

Ser Leu Val Ala Ala Ala Gln Met Trp Asp Ser Val Ala Ser Asp Leu

165 170 175

Phe Ser Ala Ala Ser Ala Phe Gln Ser Val Val Trp Gly Leu Thr Val

180 185 190

Gly Ser Trp Ile Gly Ser Ser Ala Gly Leu Met Val Ala Ala Ala Ser

195 200 205

Pro Tyr Val Ala Trp Met Ser Val Thr Ala Gly Gln Ala Glu Leu Thr

210 215 220

Ala Ala Gln Val Arg Val Ala Ala Ala Ala Tyr Glu Thr Ala Tyr Gly

225 230 235 240

Leu Thr Val Pro Pro Pro Val Ile Ala Glu Asn Arg Ala Glu Leu Met

245 250 255

Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln Asn Thr Pro Ala Ile Ala

260 265 270

Val Asn Glu Ala Glu Tyr Gly Glu Met Trp Ala Gln Asp Ala Ala Ala

275 280 285

Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Ala Thr Leu Leu

290 295 300

Pro Phe Glu Glu Ala Pro Glu Met Thr Ser Ala Gly Gly Leu Leu Glu

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Gln Ala Ala Ala Val Glu Glu Ala Ser Asp Thr Ala Ala Ala Asn Gln

325 330 335

Leu Met Asn Asn Val Pro Gln Ala Leu Gln Gln Leu Ala Gln Pro Thr

340 345 350

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355 360 365

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370 375 380

His Met Ser Met Thr Asn Ser Gly Val Ser Met Thr Asn Thr Leu Ser

385 390 395 400

Ser Met Leu Lys Gly Phe Ala Pro Ala Ala Ala Ala Gln Ala Val Gln

405 410 415

Thr Ala Ala Gln Asn Gly Val Arg Ala Met Ser Ser Leu Gly Ser Ser

420 425 430

Leu Gly Ser Ser Gly Leu Gly Gly Gly Val Ala Ala Asn Leu Gly Arg

435 440 445

Ala Ala Ser Val Gly Ser Leu Ser Val Pro Gln Ala Trp Ala Ala Ala

450 455 460

Asn Gln Ala Val Thr Pro Ala Ala Arg Ala Leu Pro Leu Thr Ser Leu

465 470 475 480

Thr Ser Ala Ala Glu Arg Gly Pro Gly Gln Met Leu Gly Gly Leu Pro

485 490 495

Val Gly Gln Met Gly Ala Arg Ala Gly Gly Gly Leu Ser Gly Val Leu

500 505 510

Arg Val Pro Pro Arg Pro Tyr Val Met Pro His Ser Pro Ala Ala Gly

515 520 525

Asp Ile Ala Pro Pro Ala Leu Ser Gln Asp Arg Phe Ala Asp Phe Pro

530 535 540

Ala Leu Pro Leu Asp Pro Ser Ala Met Val Ala Gln Val Gly Pro Gln

545 550 555 560

Val Val Asn Ile Asn Thr Lys Leu Gly Tyr Asn Asn Ala Val Gly Ala

565 570 575

Gly Thr Gly Ile Val Ile Asp Pro Asn Gly Val Val Leu Thr Asn Asn

580 585 590

His Val Ile Ala Gly Ala Thr Asp Ile Asn Ala Phe Ser Val Gly Ser

595 600 605

Gly Gln Thr Tyr Gly Val Asp Val Val Gly Tyr Asp Arg Thr Gln Asp

610 615 620

Val Ala Val Leu Gln Leu Arg Gly Ala Gly Gly Leu Pro Ser Ala Ala

625 630 635 640

Ile Gly Gly Gly Val Ala Val Gly Glu Pro Val Val Ala Met Gly Asn

645 650 655

Ser Gly Gly Gln Gly Gly Thr Pro Arg Ala Val Pro Gly Arg Val Val

660 665 670

Ala Leu Gly Gln Thr Val Gln Ala Ser Asp Ser Leu Thr Gly Ala Glu

675 680 685

Glu Thr Leu Asn Gly Leu Ile Gln Phe Asp Ala Ala Ile Gln Pro Gly

690 695 700

Asp Ala Gly Gly Pro Val Val Asn Gly Leu Gly Gln Val Val Gly Met

705 710 715 720

Asn Thr Ala Ala Ser

725

Claims

1.包含一种或多种疟原虫抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物和包含一种或多种疟原虫抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在人类个体中诱导针对疟疾的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包含一种或多种疟原虫抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种疟原虫抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物具有至少一种相同疟原虫抗原，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷并且这两种组分中的至少一种是相同的，且其中：

• 所述第二佐剂含有比所述第一佐剂低至少两倍量的至少一种相同组分，

和

• 所述第二组合物含有比所述第一组合物低至少两倍量的RTS,S，

其中所述第一组合物和佐剂的施用与所述第二组合物和佐剂的施用之间的时间间隔为2至12个月，

条件是所述第一和第二组合物不是均包含RTS,S和与水包油乳液制剂缔合的QS21和3D-MPL。

2.权利要求1所述的用途，其中第一佐剂和第二佐剂由相同组分组成。

3.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一和第二佐剂由所述相同组分以相同的相对比例组成。

4.权利要求1或2所述的用途，其中所述第二佐剂含有比所述第一佐剂更低量的至少一种相同组分。

5.权利要求1或2所述的用途，其中所述第二佐剂的更低量是比所述第一佐剂低至少三倍的量。

6.权利要求5所述的用途，其中所述第二佐剂的更低量是比所述第一佐剂低至少五倍的量。

7.权利要求1或2所述的用途，其中所述第二佐剂的更低量是比所述第一佐剂低2至50倍的量。

8.权利要求7所述的用途，其中所述第二佐剂的更低量是比所述第一佐剂低3至7倍的量。

9.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂。

10.权利要求9所述的用途，其中所述TLR激动剂是TLR4激动剂。

11.权利要求10所述的用途，其中TLR4激动剂是3D-MPL。

12.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一和第二佐剂包含免疫活性皂苷。

13.权利要求12所述的用途，其中所述免疫活性皂苷是QS21。

14.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一和第二佐剂还包含固醇。

15.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一和第二佐剂包含在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21。

16.权利要求15所述的用途，其中所述第一佐剂包含25至75微克的3D-MPL和25至75微克的QS21，并且所述第二佐剂包含5至15微克的3D-MPL和5至15微克的QS21。

17.权利要求16所述的用途，其中所述第一佐剂包含50微克的3D-MPL和50微克的QS21，并且所述第二佐剂包含10微克的3D-MPL和10微克的QS21。

18.权利要求15所述的用途，其中所述第一佐剂包含12.5至37.5微克的3D-MPL和12.5至37.5微克的QS21，并且所述第二佐剂包含2.5至7.5的3D-MPL和2.5至7.5微克的QS21。

19.权利要求18所述的用途，其中所述第一佐剂包含25微克的3D-MPL和25微克的QS21，并且所述第二佐剂包含5微克的3D-MPL和5微克的QS21。

20.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一佐剂和/或所述第二佐剂不包含铝。

21.权利要求1或2所述的用途，其中所述第二组合物含有比所述第一组合物更低量的所述相同抗原。

22.权利要求1或2所述的用途，其中所述第二组合物中的相同抗原的更低量是比所述第一组合物至少低三倍的抗原量。

23.权利要求22所述的用途，其中所述第二组合物中的相同抗原的更低量是比所述第一组合物至少低五倍的抗原量。

24.权利要求1或2所述的用途，其中所述第二组合物中的相同抗原的更低量是比所述第一组合物低2至50倍的抗原量。

25.权利要求24所述的用途，其中所述第二组合物中的相同抗原的更低量是比所述第一组合物低3至7倍的抗原量。

26.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一和第二组合物中的所有抗原都是相同的。

27.权利要求1或2所述的用途，其中疟原虫抗原是恶性疟原虫或间日疟原虫抗原。

28.权利要求1或2所述的用途，其中相同抗原是环子孢子蛋白或其变体的免疫原性片段。

29.权利要求1或2所述的用途，其中所述相同抗原选自：RTS、CSV-S、RTS,S和CSV-S,S以及包含RTS和CSV-S的混合微粒。

30.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用之间的时间间隔为2至10个月。

31.权利要求30所述的用途，其中所述第一组合物的施用和所述第二组合物的施用之间的时间间隔为4至8个月。

32.权利要求1或2所述的用途，其中所述第一免疫原性组合物在施用所述第二免疫原性组合物前施用两次。

33.权利要求1或2所述的用途，其中在施用所述第二组合物后，以至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少13个月、至少14个月、至少15个月、至少16个月、至少17个月、至少18个月、至少19个月或至少20个月或更多个月的时间间隔，另外施用所述第二组合物一次或多次。

34.权利要求1或2所述的用途，其中当施用所述第一组合物时，所述人类个体年龄大于18岁。

35.权利要求1或2所述的用途，其中当施用所述第一组合物时，所述人类个体年龄小于5岁。

36.权利要求1或2所述的用途，其中所述第二次施用是皮内施用。

37.免疫原性组合物，其被用于在人类个体中诱导针对疟疾的免疫应答的方法中，其中所述方法包括向所述个体施用包含一种或多种疟原虫抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种疟原虫抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物具有至少一种相同抗原，并且所述第一和第二佐剂包含TLR激动剂和/或免疫活性皂苷且这两种组分中的至少一种相同，且其中：

• 所述第二佐剂含有比所述第一佐剂更低量的至少一种相同组分，和

38.包含一种或多种疟原虫抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物和包含一种或多种疟原虫抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在人类个体中诱导针对疟疾的免疫应答的方法，所述方法包括向所述个体施用包含一种或多种疟原虫抗原和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含一种或多种疟原虫抗原和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二组合物具有至少一种相同抗原，并且其中所述第一和第二佐剂由在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21以相同的相对比例组成，其中所述第二组合物含有比所述第一组合物更低量的抗原和更低量的佐剂。

39.包含RTS,S和第一佐剂的第一免疫原性组合物和包含RTS,S和第二佐剂的第二免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在人类个体中诱导针对疟疾的免疫应答，包括向所述个体施用包含RTS,S和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含RTS,S和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二佐剂以相同的相对比例包含TLR4激动剂和/或免疫活性皂苷，其中所述第二组合物含有比所述第一组合物更低量的抗原和更低量的佐剂，前提是所述第一组合物不是包含RTS,S和与水包油乳液制剂缔合的QS21和3D-MPL的组合物。

40.包含RTS,S和第一佐剂的第一免疫原性组合物和包含RTS,S和第二佐剂的第二免疫原性组合物在制备药物中的用途，所述药物用于在人类个体中诱导针对疟疾的免疫应答，包括向所述个体施用包含RTS,S和第一佐剂的第一免疫原性组合物，随后向所述个体施用包含RTS,S和第二佐剂的第二免疫原性组合物，其中所述第一和第二佐剂由在脂质体制剂中的3D-MPL和QS21以相同的相对比例组成，其中所述第二组合物含有比所述第一组合物更低量的抗原和更低量的佐剂。