JPH04500305A - 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用外来抗原（例えば、病 原体または毒素）に対する免疫性は、受動転線または活性誘発により提供するこ とができる。前者の場合において、外来病原体に対する抗体を個体に注射し、そ の結果短時間の保護が与えられる。後者の場合において、無害（無毒）の形態、 病原体の成分、または毒素の変性した形態（すなわち、トキソイド）は個体の免 疫系を刺激し、長時間の保護を与える。

活性免疫性は、個体の免疫系が競合的であるかぎり、適当な抗原を使用して免疫 系を刺激することによって誘発することができる。例えば、この方法において無 毒のまたは弱毒化した形態の病原体を使用する免疫化（ワクチン接種）は直ちの 免疫応答、ならびに免疫学的「メモリー」を生じ、こうして長期間の保護を同様 によく与える。一般に、ワクチンは不活性化した、非病原性または弱毒化した形 態の病原体または感染性因子を包含し、これは病原体の抗原決定基を包含し、こ うして免疫応答誘発する。同様に、毒素は、微生物、植物および動物により産生 される抗原性物質であり、トキソイドに変換することができる；こうして、それ らは修飾して、それらの毒性を破壊するが、それらの抗原性を保持しそして、結 局、抗毒素抗体の産生を刺激しかつ活性な免疫性を産生ずるそれらの能力を保持 する。このようなトキソイドは毒性に対するワクチンのために使用することがで きる。

両者の場合において、変更した形態の感染性病原体の投与による免疫応答の刺激 を含むこと、およびトキソイドの投与を含むこと一一現在利用可能な手順−一は 、一般に有効であるが、ワクチン接種から生ずる副作用および死亡が起こること が知られている。

安全なワクチンは、病原体の抗原決定基および遺伝子工学７組み換えＤＮＡ技術 のより知識の応用により、現在開発されている。例えば、免疫応答を引き出すこ とが知られているタンパク質抗原の１成分（例えば、抗原決定基）であるポリペ プチドをつくることができる（例えば、化学的合成または問題のポリペプチドを エンコードするＤＮＡの発現により）。

宿主へのポリペプチドの投与すると、抗原決定基に対する宿主による免疫応答が 起こる。このようなポリペプチドの使用は、生ワクチンまたは弱毒化ワクチンの 使用に伴う感染の危険を伴わない。

免疫化（ワクチンの投与）は普通の普及した手順であり、そして使用するワクチ ンは本質的に「活性な免疫学的予防を意図する調製物」であり、ビルレント菌株 の殺した微生物、弱毒化菌株の生きている微生物、および微生物、菌・かび、植 物、原生動物または後生動物の誘導体または産生物の調製物を包含する。ステッ ドマンの図解医学辞典（Ｓｔｅｄｍａｎ’　ｓ　ｌ１ｌｕｓｔｒａｔｅｓ　Ｍｅ ｄｉｃａｌ　Ｄｉｃｔｉ。

ｎａｒｙ）（第２４版）、Ｗｉｌｌｉａｍｓ　＆　Ｗｉｌｋｔｎｓ。

Ｂａ　Ｉ　ｔ　ｉｍｏｒｅ、ｐ、１５２６　（１９８２）、多くの場合において 、ワクチンは１より多い回数で投与して、有効な保護を誘発しなくてはならない ；例えば、抗毒素ワクチンは多数回の投与で与えな（ではならない。

子供のワクチン接種は平凡であり、そして一般に発展した国において成功してお り、ここで健康のサービスを容易に飢えられ、そして多数回の免疫化（例えば、 多数の病原体に対する免疫化および単一の病原体に対する系統的または多数の免 疫化）は可能である。発展途上国において、ワクチン接種は極めて希であり、そ してさらにいっそう問題を生ずる。

例えば、発展途上国において毎年生まれた１００×１０８人の子供の約２０％に のみが、ジフテリア、百日咳、破傷風、はしか、ポリオおよび結核に対してワク チンされる。毎年、発展途上国において５Ｘ１０’人の子供および他の５Ｘ１． Ｏ’人の子供はこれらの病気により生理学的にまたは精神的に不能となり、これ は適切な免疫化が可能である場合、予防することができるであろう。単一の投与 で長期間の免疫性を与えることができる有効なワクチンの入手可能性は、もちろ ん、発展した国および発展途上国の両者において価値があるであろう。

大人のワクチン接種は、また、大人における多数の病気の予防において有効であ りそして、子供の場合におけるように、発展途上国において、とくに多数の免疫 化が必要である場合、実施が困難であることが証明された。病気、なかでも、例 えば、らい、マラリア、結核およびポリオは、大人の間で、アフリカ、アジアお よびラテンアメリカにおいて高い発生率を有し、そして毎年数千式の死亡の原因 である。

多くの努力が主要な病気に対するワクチンの開発において消費されておりそして 、最近、外来遺伝子を発現するために組み換えワクチンのベヒクル（例えば、遺 伝子工学したウィルス）が考慮されてきている。例えば、ウィルスの抗原がワク シニアウィルスの中に挿入された、組み換えワクシニアウィルスが開発された。

例えば、Ｂ型肝炎の遺伝子、インフルエンザウィルスの遺伝子または狂犬病ウィ ルスをエンコードするＤＮＡは、ワクチンをつくる努力において、ワクシニアウ ィルスのＤＮＡにスプライシングされてきている。パニカリ（Ｐａｎ　ｉ　ｃａ 　ｌ　ｉ）　、Ｄ。

ら、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ （Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、３Ｑ、５３６４− ５３６８　（１９８３）：オール（Ｏｒ　ｒ）　、Ｔ、　、遺伝子工学のニュー ス（Ｇｅｎｅｔ　ｉｃ　Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ　Ｎｅｗｓ）、ｐ、１７　（１ ９８５年３月）；バオレッチ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ）、Ｅ。

およびり、バニカリ（Ｐａｎ　ｉｃａ　ｌ　ｉ）　、米国特許第４．　６０３． 　１１２号。

しかしながら、このような組み換えワクシニアウィルスはワクチンとして少なく とも２つの重要欠点有するであろうことが広く認められている。第１に、処置不 可能な、ワクシニアウィルスに関連する、有意な致死率および罹患率（１：　１ ００．０００）が存在する。第２に、ワクシニアウィルスに前に暴露した個体の 組み換えワクシニアを使用するワクチン接種は、しばしば、満足すべき免疫化レ ベルを生成することができなかった。フェンナ−（Ｆｅｎｎｅｒ）　、Ｆ、　、 ワクチンの開発に対する新規なアプローチ（Ｎｅｗ　Ａｐｐｒｏｅｈ　ｔｏ　Ｖ ａｃｃｉｎｅＤｅｖｅ　ｌｏｐｍｅｎｔ）　、Ｒ，ベル（Ｂｅ１１）およびＧ、 ｌ−リギア＝（Ｔｏｒｒｉｇｉａｎｉ）（編）、Ｓｃｈｗａｂｅ　＆　Ｃｏ、、 ｐ、１８７　（１９８４）。

今日まで、所定の病原体に対して免疫性を誘発するとき多くの場合において有効 であるが、１より多い回数で投与しなくてはならなず、そして病原体に対して、 長期間の基準で、保護を提供することができるワクチンが開発された。さらに、 多くの場合（例えば、らい、マラリアなど）において、有効なワクチンはなお開 発しなくてはならない。

マイコバクテリア マイコバクテリアは人間および動物の主要な病原体を表す。例えば、結核は、一 般に、ヒトにおいてヒト結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ（Ｍ、）　ｔｕｂ ｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）によりそして畜生においてウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｅｔ ｅｒｉｕｍ（Ｍ、）　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ（これはヒトおよび結核を引き起こ す他の動物に伝播することがある）により引き起こされる。結核は広く広がった ままであり、そしてとくに発展途上国において、重要な公衆の健康の問題である 。結核の世界中の広がりはほぼｌ０ＸＩＯ’の場合が存在し、毎年の致死は３Ｘ １０＠であると推定される。結核に対するジヨイント・インターナショナル・ユ ニオンおよび世界の健康の機構の研究グループ（Ｊｏｉｎｔ　Ｉｎｔｅｒｎａｔ ｉｏｎａｉ　Ａｇａｉｎｓｔ　Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　ａｎｄ　Ｗｏｒｌｄ 　Ｈｅａｌｔｈ　Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　５ｔｕｄｙ　Ｇｒｏｕｐ）、Ｔｕ ｂｅｒｃｌｅ、６３：１５７−１６９（１９８２）。

らいは、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）により引き起こされ、主として発展途上国 において、１０×１０１人を趙える人々を犯す。ブルーム（Ｂ　］　ｏｏｍ）　 、Ｂ、　Ｒ，およびＴ、ボウダル（Ｇｏｄａｌ）、伝染病の外観（Ｒｅｖｉｅｗ 　ｏｆ　Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　Ｄｏｓｅａｓｅｓ）　、５　：　６５７−６７ ９　（１９８４）　。ヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびアビ ウムーイントラセルラレースクロフラセウム（ａｖｉｕｍ−ｉｎｔｒａｃｅ　Ｉ 　ｌｕｌａｒｅ−ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ）（ＭＡＩＳ）群は、後天性免疫欠 損病（ＡＩＤＳ）をもつ患者の主要な日和見病原体を表す。病気の制御のセンタ ー（Ｃｅｎｔｅｒｓｆｏｒ　Ｄｉｓｅａｓｅ）、罹患率および致死率のウィーク リー・リシュードチューバクロシス（Ｍ、ｐｓｅｕｄｏｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉ Ｓ）は畜生の主要な病原体である。

他方において、バシレ・カルメツチーブニリン（Ｂａｃｉｌ！ｅＣａ１ｍｅｔｔ ｅ−Ｇｕｅｒｉｎ）（ＢＣＧ）、ウシ結核菌（Ｍ、ｂ。

ｖｉｓ）のビルレントは、世界における最も広く使用されているヒトのワクチン であり、そして５０年より多い間生ワクチンとして使用されてきている。過去３ ５年において、それは２．５ＸＩＯ’人を越える人々に投与されてきており、悪 影響は顕著にう少ない（例えば、６０／１０９の推定された致死率）。ＢＣＧは 、多数の研究において、結核に対して保護的効能有することが発見された。しか しながら、最近、南インドにおいて肺結核の予防において有効であることは発見 されなかった。結核の予防の実験（Ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ　Ｐｒｅｖｅｎｔ ｉｏｎＴｒｉａｌ）、７ドラス（Ｍａｄｒａｓ）、インディアン・ジャーナル・ オブ・メディカル・リサーチ（Ｉｎｄｉａｎ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆこうして、 ＢＣＧを包含する、多数の入手可能なワクチンが存在するが、多くは、制限され た応答を誘発するので、価値において制限され、多数回の投与で与えなくてはな らないおよび／または悪い副作用有する。

他の場合（例えば、らい、マラリア）において、ワクチンは簡単に入手可能では ない。悪影響を及ぼさないで問題の１または２以上の病原体に対する保護を提供 するために十分な免疫性を受容体において長期間刺激する、前記病原体に対する ワクチンが入手可能である場合、大きい価値があるであろう。

発明の説明 本発明は、遺伝子操作技術を使用して、マイコバクテリアの中に組み込まれた問 題のＤＮＡ　（ここでそれはマイコバクテリアのゲノムの中に存在する）を発現 する、遺伝子的に組み換え（遺伝子操作された）培養可能なマイコバクテリア： 問題のＤＮＡをマイコバクテリアの中に導入するために有用なベクター；マイコ バクテリアの中にＤＮＡを導入する方法、およびマイコバクテリアのゲノムの中 にＤＮＡを組み込んで遺伝子的組み換えマイコバクテリアを産生ずる方法に関す る。本発明は、さらに、１または２以上のシャトルプラスミドである、遺伝子操 作したシャトルベクターによりマイコバクテリアの異なる属の間で遺伝子物質を 転移する方法に関する。これらのシャトルベクターは、また、本発明の主題であ り、マイコバクテリアの異なる族の間の遺伝子物質の転移およびマイコバクテリ アの中への問題のＤＮＡの導入に有用である。

本発明の組み換えＤＮＡベクターは、２つの型をもつ：テンペレートシャトルプ ラスミドおよびバクテリア−マイコバクテリアのシャトルプラスミド（例えば、 Ｅ、ｃｏｌｉ−マイコバクテリアシャトルプラスミド）。組み換えベクターの各 型は問題のＤＮＡをマイコバクテリアの中に安定に導入することができ、ここで ＤＮＡを次いで発現することがでおいて、マイコバクテリアの染色体またはゲノ ムの中への安定に組み込みは部位特異的組み込みを経て起こる。問題のＤＮＡは 染色体のＤＮＡの一部分として複製される。問題のＤＮＡを含む、バクテリア− マイコバクテリアのシャトルプラスミドの場合において、問題のＤＮＡはプラス ミドとして染色体外に安定に維持される（プラスミドの１成分として）。

問題のＤＮＡの発現はプラスミドとして染色体外で起こる（例えば、エピソーム 的に）、例えば、問題の１または２以」−の遺伝子はバクテリア−マイコバクテ リアのプラスミドの中にクローニングされ、そして培養可能なマイコバクテリア の中に導入され、ここでそれはエビソームの複製（染色体外の複製）を行う。本 発明の方法に従い、組み換えプラスミドを使用して、問題のＤＮＡをマイコバク テリアの細胞の中に導入し、そしてＤＮＡをマイコバクテリアのゲノムの中に組 み込む。使用する組み換えプラスミドは、次のものを包含する二１）相同性の組 み換え（プラスミドを有する配列とマイコバクテリアのゲノム中の配列間）起こ すために必要なマイコバクテリアの配列（プラスミドを有するマイコバクテリア の配列と呼ぶ）＋２）Ｅ、ｃｏｌｉ中の複製および選択に必要なりＮＡ配列；お よび３）問題のＤＮＡ　（例えば、選択可能なマーカーをエンコードするＤＮＡ および問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコードするＤＮＡ）。組み換 えプラスミドは、既知の技術を使用して、マイコバクテリアの細胞の中に導入す る。プラスミド中のマイコバクテリアの配列は、マイコバクテリアのゲノムの中 に存在するものと同一であるが、相同性組み換えを可能とするマイコバクテリア のゲノムの中に存在するものに十分に類似する。プラスミドを有するマイコバク テリアのＤＮＡの中に存在する配列の相同性およびマイコバクテリアのゲノムの 中に存在する十分に類似する配列の同一性の「認識」は、入る（プラスミドを有 する）マイコバクテリアのＤＮＡの相同性領域とゲノムのマイコバクテリアのＤ ＮＡとの間の交差型およびマイコバクテリアのゲ、ツム中への組み換えプラスミ ドの組み込みを生ずる。組み込みは、非必須（すなわち、マイコバクテリアの複 製に必須ではない）マイコバクテリアのゲノム中の選択した部位において起こる 。相同性プラスミドの配列の組み込みは、マイコバクテリアのゲノム中の問題の ＤＮへの相み込みを伴う。

本発明は、さらに、マイコバクテリアのＤＮＡの中に組み込まれたか、あるいは プラスミドとして染色体外に維持される、問題のＤＮＡを発現する組み換えマイ コバクテリアに関する。このような組み換えマイコバクテリアは、適当なマイコ バクテリア、例えば、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓＬウシ結核ｍ　ＣＭ 、ｂｏｖ　１ｓ）−ＢＣＧ、鳥結核菌（Ｍ、ａｖｉｕｍＬチモテ菌（Ｍ、ｐｈｌ ｅｉ）、マイコバクテリウム・フォルライツム（Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マ イコバクテリウム・ルフ（Ｍ、ＩｕｆｕＬバラ結核菌（Ｍ、ｐａｒａｔｕｂｅｒ ｃｕｌ。

５ｉｓ）、ｖイコバクテリウム＋ハバナ（Ｍ、ｈａｂａｎａ）　、マイコバクテ リウム・スクロフラセウム（Ｍ、ｓｃｒｏｆｕｌａｅｅｕｍ）およびマイコバク テリウム・イントラセルラレ（Ｍ、ｉ　ｎ　ｔ　ｒａｃｅ　Ｉ　Ｉｕｌａｒｅ） の中に導入することによって産生ずることができる。問題のＤＮＡがゲノムのＤ ＮＡの中に組み込まれる、組み換えマイコバクテリアにおいて、問題のＤＮＡは 次のような方法で存在する＋１）マイコバクテリアの遺伝子は置換される（すな わち、マイクバクテリアのゲノムの中にもはや存在しない）か、あるいは２）問 題のＤＮＡはマイクバクテリアの遺伝子の中に挿入され、その結果ａ）マイコバ クテリアの遺伝子は完全にかつ機能的に残るか、あるいはｂ）マイコバクテリア の遺伝子は崩壊しかつ非機能的とされる。

生ずる遺伝子的に組み換えのマイコバクテリア（例えば、組み換えＢＣＧ、組み 換えスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）は、問題のＤＮＡをそれに より発現することができる、ベヒクルとしてとくに有用である。これらは遺伝子 的に組み換えのマイコバクテリアまたはマイコバクテリアの発現ベヒクルと呼ぶ 。このようなベヒクルは、例えば、１または２以上の問題の病原体のための、問 題のタンパク質またはポリペプチド（または１より多いポリペプチドまたはタン パク質）、例えば、１または２以上の抗原を発現するワクチンのベヒクルとして 使用することができる。組み換えマイコバクテリアは、また、イムノボテンシェ イター、例えば、酵素、製剤学的剤および抗腫瘍剤の発現のための：抗受精ワク チンのベヒクルの産生において有用なポリペプチドまたはタンパク質の発現のた めの；または免疫応答を誘導するか、あるいは自己免疫病（例えば、慢性関節リ ウマチ）における耐性を誘発するために投与することができる、ストレスタンパ ク質の発現のためのベヒクルとして使用することができる。組み換えマイコバク テリアは、例えば、増殖阻害因子であるか、あるいは腫瘍細胞の殺細胞性である １または２以上のタンパク質またはポリペプチド（例えば、インターフェロンα 、βまたはγ；インターリューキン１〜７、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）αまたはβ ）を発現し、こうして、ある種のヒトの癌（例えば、膀胱癌、黒色症）の処置の ための新しい方法の基準を提供することができる。問題の病原体は、ウィルス、 微生物、または病気を引き起こす他の有機体または物質（例えば、毒素またはト キソイド）を包含する。本発明は、また、宿主を組み換えマイコバクテリアでワ クチン接種して、宿主の中に保護的免疫性を引き出す方法に関する。組み換えワ クチンを使用して、体液抗体の免疫性、細胞の免疫性（ヘルパーおよび細胞毒性 の免疫性を包含する）および／または粘膜または分泌の免疫性を生成することが できる。さらに、本発明は、組み換え培養可能なマイコバクテリウムにより発現 された抗原をワクチンまたは診断試薬として使用することに関する。

本発明のワクチンは、現在入手可能なワクチンを越えた重要な利点を有する。第 １に、マイコバクテリアは最もよく現在知られているなかでアジュバントの性質 を有し、こうして、受容体の免疫系を刺激して、大きい有効性をもって他の抗原 に対して応答させる。これは細胞仲介免疫性を誘発するのでワクチンのと（に個 値ある面であり、こうして、細胞仲介免疫性が抵抗性のために重要であると思わ れる場合において、病原体に対する免疫性を提供するとき、ことに有用である。

第２に、マイコバクテリウムは長期間のメモリーまたは免疫性を刺激する。結局 、単一（１回）の接種を使用して、タンパク質抗原に対する長期間の感作を生成 することができる。本発明のワクチンベヒクルを使用すると、長く持続するＴ細 胞のメモリーをブライミングすることができ、これは感染性因子または毒素を中 和する二次抗体の応答を刺激する。これは、例えば、破傷風およびジフテリアの 毒素、百日咳、マラリア、インフルエンザ、ヘルペスウィルスおよびへびの毒物 に対して有用である。

とくにＢＣＧは、ワクチンのベヒクルとして、次の理由で重要な利点を有する＋ １）それは出産のとき現在与えられる子供のワクチンのみである；２）過去４０ 年間、それは結核に対するワクチンとして与えられたとき、悪影響の発生は非常 に低かった；そして３）それは個体において反復して使用することができる（例 えば、多数の形態で）。

とくにＢＣＧ、ならびに一般にマイコバクテリアのそれ以上の利点は、そのゲノ ムの大きさが大きい、二とである（はぼ３Ｘ１０’ｂｐの長さ）。

ノア゛／ムは火きいので、それは大量のＤ　Ｎ　Ａを他の源（すなわち、問題の Ｄ　Ｎ　Ａ　）を収容することができ、こうして、マルチ−ワクチンベヒクル（ １４なオ）ち、１より多い病原体に対する保護的抗原をエンコードする問題の！ 、’）　Ｎ　Ａをａするもの）を作るために使用することができるう図面の簡単 な説明 第１図は、スメグマ菌（〜１ｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ） スフェロプラス１−とマイコバクテリオファージＤ２９　ＤＮＡのトランスフエ クン３゛／の結果を示す。

第２図は、シャトルプラスミド、ｐｈＡＥｌの構成の概略的表示である。

第３図は、シャトルプラスミドｐｈＡＥ１の評価の結果を示す。

第３Ａ図は、Ｋｐｎｌで消化したマイコバクテリオファージＴＭ４Ｄ　Ｎ　Ａお よびツヤトルプラスミドｐｈＡＥＩ　ＤＮＡのアガロースゲルを示す。レーン１ はＨｉｎｄＩＩＩで消化したラムダＤ　Ｎ　Ａを含有する。

レーン２および３は、Ｋｐｎｌによる消化切断の前に、非結合（レーン２）また は結合した（レーン３）７Ｍ４　ＤＮＡを含有する５レーン４および５は、スメ グマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）上で増殖したファージ粒子から分離 したｐｈＡＥＩ　ＤＮＡ　（レーン４）およびプラスミドとしてＥ、ｃｏｌｉ細 胞から分離しあｐｂＡＥｌ（レーン５）を含有する。矢印は、精査末端において 結合したとき、３．９Ｋｂの断岸を形成する、２．ＩＫｂおよび１．８Ｋｂを指 すことに注意すべきである。

第；）１３図は、プローブとしてｐ　ＨＣ７９を使用する、プラスミドｐｈＡＥ Ｉのサザンプロットの分析の結果を示す（パネルＢ）。第３Ａ図のオートラジオ グラフは、バイ第１・ランス（Ｂｉｏｔｒａｎｓ）ナイロン！（ＩＣＮ）七にプ ロ２ノテイングし、そして３２Ｐ−ｄＣＴＰでニック翻訳したｐＨＣ７９ＤＮＡ でブロービングした後、示された。

第４図はＢＣＧ上のｐｈＡＥｌの複製を示す。それは、ＤＳ６Ａ、これはヒト結 核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）およびＢＣＧ上でプラーク形成するが、 他のマイコバクテリアのプラーク形成については知られていない：ファージ３３ Ｄ、これはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）上でプラーク形成することは 知られているが、ＢＣＧ上のそれ゛については知られていない：およびファージ ＴＭ４、両者上でプラーク形成することが知られている；によりＢＣＧのグラク ツ（Ｇｌａｘｏ）ワクチン菌株の溶菌を比較する。

第４Ａ図は、ファージによるＢＣＧの溶菌を示す。１０−１の希釈で使用したフ ァージ（ｐｆｕ／ｍｌ）の力価は、次の通りであった：　ＤＳ６ａ、ヒト結核菌 （Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、Ｈ３７Ｒａ、上で２ｘｌＯ’；３３Ｄ、ス メグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）　、ｍｅ”６．１二で２Ｘ１０’： ７Ｍ４、ｍｃ２６上で３Ｘ１０”；およびｐｈＡＥｌ、ｍｃ２６上で３Ｘ１０’ Ｏフアージの希釈（５μｌ）を１０’のＢＣＧ細胞を含有する軟寒天上にスポツ ティングした。生ずる溶菌を、３７℃において１０日後、写真撮影した。

第４Ｂ図は、ｐｂＡＥｌ中のコスミドＤＮＡの存在を示す。これらの平板上のプ ラークのリフトは、後述するように実施し、そして３２ｐ標識したｐＨＣ７９Ｄ ＮＡとハイブリダイゼーションした：次いで、オートラジオグラフィーを実施し た。

第４Ｃ図は、シャトルプラスミドｐｈＡＥｌのファージ粒子の電子顕微鏡写真で ある。ＣｓＣｌの勾配で精製したファージ粒子を炭素被覆した、バーロイドンン （Ｐａ　ｒ　］　ｏ　ｉ　ｄｏｎ）被覆したグリッド上に配置し、ブロッティン グし、そして１滴の１％のホスホタングステン酸で洗浄した。電子顕微鏡写真は ＪＥＯＬ　１２００ＥＸ電子顕微鏡を８０ｋＶ、３０，０ＯＯＸで撮った。

第５図は、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）染色体の中にマイコ バクテリアＬ１およびＬｌ−シャトルプラスミドＤＮＡを組み込むことを示す。

ファージＬ１およびＬｌ−シャトルプラスミドからのＤＮＡおよび対応する溶原 化からの染色体のＤＮＡを、ＢａｍＨＩで消化し、そしてアガロース中で電気泳 動にかけた。パネルＡは臭化エチジウムで染色したゲルを示す。パネルＢは、Ｓ ２ｐ標識したファージＬＩ　ＤＮＡでプロービングしたこのゲルのサザン分析の オートラジオグラフを示す。次は示したレーンで示す：親のファージＬ１からの ファージＤＮＡ　（レーン２）、シャトルプラスミドｐｈＡＥ１５から（レーン ４）およびａｐｈ遺伝子を含有するシャトルプラスミドｐｈＡＥ１９から（レー ン６）：親のスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）菌株からのバクテ リアの染色体のＤＮＡ　（レーン１）、Ｌｌで溶原化した菌株（レーン３）、ｐ ｂＡＥｌ５で（レーン５）、およびｐｂＡＥｌ９　（レーン７）。Ｌｌ、ｐｂＡ Ｅｌ５、およびｐｂＡＥｌ９は、各ファージの中に存在する単一の６，７ｋｂの バンドの主な損失（注、Ｌｌ、１ノー・ン２における四角形）および各リソゲン における２つの新しいバンド、９．０ｋｂおよび１゜７ｋｇの出現（円形）によ り明らかなように、それらのそれぞれのリソゲンの染色体内で部位特異的に組み 込まれた（パネルＢ、レーン３．５および７）。

第６図は、テンペレートシャトルプラスミドをクローニングベクターとして使用 して、問題のＤＮＡをマイコバクテリアの染色体の中に導入することの概略的表 示である。問題のＤＮＡ（ＧＥＮＥ　Ｘ）をシャトルプラスミドＤＮＡにおける 独特制限部位の中に挿入し、引き続いてマイコバクテリアの中に導入することが できる。マイコバクテリアにおいて、問題のＤＮＡを有する、シャトルプラスミ ドを溶原化し、そしてファージとして安定に維持することができる。

第７図は、テンペレートシャトルプラスミドｐｈＡＥ１９を使用する溶原性によ るカナマイシン抵抗性の発現を示す。ｐｂＡＥｌ９がｍｃ２６細胞を溶原化する 場合、コロニーは現れ、こうしてカナマイシン抵抗性の発現を実証する。多数の 実験において、カナマイシン抵抗性のコロニーはｍｃ”５細胞またはｐｂＡＥｌ ５で溶原化したｍｃ”６細胞のいずれの自発的突然変異体からも観測されなかっ た。

第８図は、ｐＡＬ５０００ゲノム付近の不規則の部位に挿入された、ネオマイシ ン／カナマイシン（ｎ　ｅ　ｏ）およびクロラムフェニコール（ｃａｔ）に対す る抵抗性をを与えるマーカー遺伝子を含有する、Ｅ。

ｃｏｌｉプラスミド、ｐｌＪ６６６、から成るハイブリッドプラスミド分子のラ イブラリーを発生するために使用した全体の方法の概略的表示である。

第９図は、スメグマ菌（Ｍ、Ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｊ　Ｓ）形質転換体の３つの 独立のプール（レーン１．２．３）から分離したｐｌＪ６６６：　：ｐＡＬ５０ ００組み換えシャトルプラスミドからのＤＮＡのアガロースゲルの電気泳動の分 析の結果を示す。これらのプラスミドのプールの各々をＥ、ｃｏｌｉ菌株、２３ ３８の中に別々に形質転換した後、単一の精製した形質転換体、ｐＹＵＰ１３、 ｐＹＵＰ１４およびｐＹＵＰ１５と表示する、から独特のプラスミドを分離し、 そして、それぞれ、レーン５．６および７に示す。レーン４はマイコバクテリウ ム・フォルライツム（Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）プラスミド、ＤＡＬ５０００、 を含有し、そしてレーンｏＩ　Ｊ６６６　：　：　ｐＡＬ５０００組み換え体の ライブラリーを含有する。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）また はＥ、ｃ。

１１のいずれから分離シャトルプラスミドの大きさは組み換え体のライブラリー の大きさと同一であり、構成体の安定性を示す。

第１０図は、ＢＣＧのシャトルプラスミドＤＮＡによる形質転換を示す。パネル Ａは、シャトルプラスミドＤＮＡを使用するＢＣＧ細胞のエレクトロポレインヨ ン後、生ずるカナマイシン抵抗性ＢＣＧコロニーを示す；パネルＢは、シャトル プラスミドＤＮＡを使用しないＢＣＧ細胞のエレクトロポレイション後、生ずる カナマイシン抵抗性ＢＣＧコロニーを示す。

第１１図は、プラスミドベクターｐＵｃ１９のＰｙｒＦ遺伝子中のＫａｎ挿入が 存在する、組み換えブラスミ、ドの構成の概略的表示である。

第１２図は、ＰｙｒＦ遺伝子がＫａｎ挿入を含有する、ｐＵｃ１９組み換えプラ スミドを使用するマイコバクテリアの細胞の形質転換の概略的表示である。第１ ２Ａ図は、Ｋａｎ遺伝子を含有するＰｙｒＦ遺伝子が存在する、マイコバクテリ アの細胞の、カナマイシンを含有する培地上の増殖を使用する、選択の概略的表 示である。第１２Ｂ図は、ゲノムのＤＮＡの中に組み込まれたＫａｎ遺伝子を含 有するＰｙｒＦ遺伝子を有するマイコバクテリアの細胞の、フルオロ−オロチン 酸を含有する培地上の増殖を使用する、選択の概略的表示である。

第１３図は、Ｋａｎと選択した抗原（Ｆａｎど表示する）をエンコードするＤＮ ＡとのマイコバクテリアのＤ　Ｎ　Ａの中への組み込みの概略的表示である。

第１４図は、カナマイノン抵抗性をエンコードする遺伝子とのマイコバクテリア のＰｙｒＦ遺伝子の置換の概略的表示である。

第１５図は、第１４図に表すように産生じた組み換えマイコバクテリウムの中へ のＰｙｒＦ遺伝子および問題のＤＮＡの組み込みの概略的表示である。

第１６図は、マイコバクテリアのゲノムの中に組み込まれた問題のＤＮＡの発現 を制御するための発現カセットの使用の概略的表示である。

第１７図は、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）およびＢＣＧの中で ストレス誘発した６５ｋＤをエンコードするらい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）遺伝子 の発現を示す、ウェスタン・プロット分析の結果を示す。

発明の詳細な説明 ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ（ＢＣＧまた はウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　１ｓ）−ＢＣＧは、世界中で広く使用されている非 ビルレントウシ結核閑（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）の誘導体であり、そして結核に対する 保護与えるために普通に使用されているが、その有効性は最近問題とされている 。スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）は、ＢＣＧ と抗原性およびアジュバントの性質を共有する非病原性バチルスである。両者は 、また、培養において増殖するのが合理的に容易である。

両者のマイコバクテリアは細胞仲介免疫性の誘発のためのきわめてすぐれたアジ ュバント活性を有し、長期間のメモリー（免疫性）を刺激し、そしてそれらの使 用に関連する致死率が低いが、それらは組み換えワクチンとしてきわめてすぐれ た候補である。すなわち、それらは、問題の遺伝子物質（ＤＮＡ）（それが導入 されているマイコバクテリア以外の源からのＤＮＡ）を挿入し、引き続いて発現 することができる、ベヒクル（ワクチンのベヒクル）として使用のための、きわ めてすぐれた候補である。

問題のＤＮＡは任意の由来であることができそして次の通りである：１）１また は２以上の問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコードする１または２以 上の遺伝子のすべてまたは一部分であるＤＮＡ：　２）選択可能な１または２以 上のマーカーをエンコードするＤＮＡ、または３）両者の選択可能なマーカー（ または複数の選択可能なマーカー）少なくとも１つの問題のタンパク質またはポ リペプチドをエンコードするＤＮＡ０用語問題のポリペプチドは、ここで使用す るとき、発現すべきタンパク質のすべてまたは一部分を包含する。このような問 題のＤＮＡは遺伝子的に組み換えのマイコバクテリアの中で発現され、ここでそ れはマイコバクテリアのゲノムの中に存在する（組み込まれている）か、あるい は染色体外に存在する。組み込まれたＤＮＡは、ここで定義するとき、染色体の 中に存在するか、あるいはマイコバクテリアの中に染色体外に（エピソーム的に ）存在するＤＮＡを包含する。ＤＮＡは１または２以上のシャトルプラスミドに より組み込まれ、マイコバクテリアの染色体またはゲノムのＤＮＡ中への組み込 みまたは問題のＤＮＡのエビソーム的（染色体外）の存在を生ずる。問題のＤＮ Ａの組み込みは相同的または非相同的の組み換え、例えば、ファージエンコーデ ッド合成の部位特異的組み換えまたは転置可能な要素により仲介される組み換え により起こることができる。

現在まで、プラスミドＤＮＡの使用によりマイコバクテリアを形質転換すること ができなかった。さらに、現在まで、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、 免疫応答を望むもの、をエンコードするＤＮＡが、ゲノムのＤＮＡの中の選択し た部位にかつ選択した向きに安定に組み込まれた、組み換えマイコバクテリアの ワクチンのベヒクルを産生ずることができなかった。

発現ベクターまたはワクチンのベヒクルとして使用すべき組み換えマイコバクテ リウムの開発についての研究の主な目的は、１または２以上の病原体に対する保 護にとって重要な、１または２以上の産生物、例えば、タンパク質またはポリペ プチド、をエンコードするＤＮＡの発現を指令するＤＮＡベクターのマイコバク テリウム中への導入である。本発明の方法およびシャトルまたはプラスミドのベ クターを使用して、培養可能なマイコバクテリウムの中に（例えば、マイコバク テリウムの中に、それが染色体外に発現されるように）問題のＤＮＡを組み込む ことが、今回、可能となった。

本発明のシャトルプラスミドのベクターは、バクテリアの中でプラスミドとして およびマイコバクテリアの中でファージとして複製することにおいて独特である 。１つの特定の実施態様において、シャトルプラスミドと呼ぶ、シャトルプラス ミドのベクターは２種の粘着末端（またはＣＯＳ部位）を包含するコラムダファ ージについて１つ、これはＥ、ｃｏｌｉの中で機能する；およびマイコバクテリ アについて１つ、これはマイコバクテリアの中で機能する。すなわち、それは２ 組の粘着末端を含ａする。それはラムダについて１組およびマイコバクテリアに ついて１組を含有するので、それは両者の中に組み込むことができる。ラムダＣ Ｏ８配列の仔在は、また、コスミドのクローニングの効率よい技術の使用を可能 と（４、これはＥ、ｅｏｌｉの中への大きいＤ　Ｎ　Ａ分子の効率よりクローニ ングのためにラムグ生体外バッケーシング系を利用する。

さらに、ンヤ（・ルベクターは独特のＥＣｏＲｌ部位を有し、この中に抗原をＪ −ンコードするＤＮＡを挿入することができる。こうして、シャトルベクターは トランスフェクション合成を発生することができ、これはマイニスバクテリアの 中への組み換えＤＮＡ分子の導入を可能とする。

問題の遺伝子物質をマイコバクテリアの中に組み込んで、本発明の組み換えマイ コバクテリアを産生ずることができる、いくつかの手段が存在する。例えば、問 題のＤＮＡはマイコバクテリアの細胞の中に、シャトルプラスミド、とくにテン ペレートシャトルプラスミド（例えば、細胞を溶原化することができるファージ ）の中にクローニングすることによって安定に導入（例えば、マイコバクテリア の染色体の中に組み込む）ことができる。この方法における問題のＩ）　Ｎ　Ａ の導入は、マイコバクテリアの染色体の中へのＤＮＡの組み込みを生ずる。

例えば、Ｅ、ｅｏｌｉのコスミドをテンペレートのマイコバクテリオファー）Ｉ −１の中に導入し、て、Ｅ、ｃｏｌｉの中でプラスミドとして複製するか、ある いはマイコバクテリアの宿主を溶原化することができるシャトルブラスミドを産 生し、た。これらのテンペレートツヤトルプラスミドはスメグマｍ　（Ｍ、ｓｍ ｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）上で濁ったプラークを形成し、そして、溶原化すると、 重感染に対する抵抗性を与えそしてマイコバクテリアの染色体内に組み込む、［ ：、ｅｏｌｉの中でカナマイシン抵抗性を与えるクローニングした遺伝子を含有 するＬ１シャトルプラスミドをスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ） の中に導入するとき、安定な安定なカナマイシン抵抗性コロニー（すなわち、溶 層）が得られた。

あるいは、プラスミドベクターを使用して問題のＤＮＡをマイコバク色体外で発 現される。例えば、ンヤ（・ルブラスミドマイコバクテリウム・フォルライツム （Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）：　：Ｅ、ｃｏｌ　ｉハイブリッドプラスミドを、 カナマイシン抵抗性およびクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子を含有するマイ コバクテリアおよびＥ、ｃｏｌｉレプリコンから構成した。これらのシャトルプ ラスミドは、エレクトロポレイションによりスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ 　ｉ　ｓ）またはＢＣＧの中に導入すると、形質転換体に安定なカナマイシン抵 抗性およびクロランフェニコール抵抗性を与える。こうして、ベクターは、マイ コバクテリア中への組み換えＤＮＡ分子の導入を許すトランスフェクション系の 開発を可能とする。

また、ファージなしで宿主の染色体の中に問題のＤＮＡを導入し、そしてそれを その中に組み込ませることができる。例えば、これは相同的組み換え、部位特異 的組み換えまたは非相同的組み換えにより（例えば、宿主の染色体物質の中への 不規則的挿入を生ずる、トランスポゾンにより）達成することができる。相同的 組み換えは、後述するように、問題のＤＮＡ　（例えば、カナマイシン抵抗性遺 伝子、６５ＫＤ　らい菌（Ｍ。

１ｅｐｒａｅ）遺伝子）を組み込むために使用されてきている。

マイコバクテリアの中にか、あるいはマイコバクテリアのゲノムの中に問題のＤ ＮＡを、本発明のシャトルベクターまたはプラスミドベクターによるか、あるい は相同的組み換えにより首尾よ（導入するために、次の一般アプローチに従った 。それはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）またはウシ結核菌（λ１．ｂｏ ｖ　ｉ　５）−ＢＣＧにより記載するが、それは問題のｌ）　Ｎ　Ａを他のマイ コバクテリアの中に導入するために使用できること、およびこれらの他の遺伝子 的に組み換えのマイコバクテリアは、また、発現またはワクチンのベヒクルであ ることができることを理解すべきである。このような他のマイコバクテリアは、 次のものを包含する。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）　、ウシ 結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧ、鳥結核ｍ　（Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｒｎ） 　、チモテ菌（Ｍ、ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・フォルライツム（Ｍ、 ｆｏｒｔｕｉｔｕｍＬマイコバクテリウム・ルフ（Ｍ、ＩｕｆｕＬバラ結核菌（ Ｍ、ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ｖイコバクテリウムーハバナ（Ｍ、 ｈａｂａｎａＬマイコバクテリウム・スクロフラセウム（Ｍ、ｓｃｒｏｆｕｌａ ｅｅｕｍ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍ、１ｎｔｒａｅｅ ｌｌｕｌａｒｅ）。ワクチンのベヒクルとしてゆっくり増殖するマイコバクテリ ア（例えば、ウシ結核菌（Ｍ。

ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧおよびヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉＳ） ）を使用すべき場合において、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉＳ）を 通過しくすなわち、その中に１または２以上の抗原をエンコードするＤＮＡを導 入し）引き続いてウソ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　ｓ）　−ＢＣＧの中に入ること はと（に価値がある。

、ろ−メグマ菌■μ￥ユｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中へのマイ社りテリオフ ァージＤＮＡのトランスフェクション マイコバクテリア中のＤＮＡの操作を可能とする系を開発するために、バチルス の中にＤＮＡを転移する効率よい手段を開発することがまず必要であった。使用 した技術は、ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）についてのスフ ェロプラストの調製に関してオカニシ（Ｏｋａｎｔｓｈｉ）およびホブウッド（ Ｈｏｐｗｏｏｄ）により記載されている変更であった。ストレプトミセス属（Ｓ ｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）は、マイコバクテリアに似て、アクチノミセタレス（ Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔａｌｅｓ）である。オカニシ（Ｏｋａｎ　ｉ　５ｈｉ） 　、Ｍ、ら、マイクロバイオロジー（ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＹ）、８旦：３８ ９−４００　（１９７４）；ホブウッド（Ｈｏｐｗｏｏｄ）　、Ｄ、Ａ、および ＨｌＭ、ライト（Ｗｒ　ｉ　ｇｈ　ｔ）　、モレキュラー・ジエニテイック（Ｍ ｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃ）、１６λ：　３０７−３１７（１９７８） 。

変更した技術は、ポリエチレングリコールと組み合わせて使用して、バクテリア のスフェロプラストの中へＤＮＡ分子が入るのを促進した。

マイコバクテリアの形質転換のためのプラスミドの中で有用な抗生物質抵抗性マ ーカーが入手不可能であるために、ＤＮＡをマイコバクテリアの中に転移するた めに最適な条件を評価するために選択した系は、溶菌マイコバクテリオファージ からのＤＮＡのトランスフェクションであった。このような系の２つの利点は、 得られる結果が定量的であり、そして２４時間以内にプラークとして容易に可視 化されたことである。

スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中へのマイコバクテリオファ ージＤＮＡのトランスフェクシヨンは、実施例１に詳細に記載されている。簡潔 的には、ＤＮＡはを最初に除去した細胞壁のすべてまたは一部分（すなわち、原 形質体またはスフェロプラスト）を有するマイコバクテリアの中に、ポリエチレ ングリコールを使用して、導入した。トランスフェクションの実験はマイコバク テリオファージＤ２９からのＤＮＡを使用して開始し、Ｄ２９は広範な種類のマ イコバクテリア上で増殖し、そしてスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　 ｓ）上で大きい透明なプラークを形成する。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　 ｔ　ｉ　ｓ）上で調製したＤ２９ファージの平板培養のリゼイトは、リゼイトの １ｍｌ当たり１０日ｐｆｕ　（プラーク形成単位）より大きい値を絶えず生じた 。収穫したプラークをＣｓＣＩ平衡勾配で２回精製した；それらは１．５１の平 衡浮遊密度でバンドに別れた。ファージＤＮＡはプロテイナーゼに処理およびフ ェノール−クロロホルム抽出により抽出した。結合および非結合のＤ２９　ＤＮ Ａの制限分析は、ファージのゲノムのＤＮＡが二本鎖であり、５０ｋｂの大きさ であり、そして粘着末端を有することを実証した。

マイコバクテリオファージＤ２９　ＤＮＡによりスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ ｔｉｓ）スフェロプラストのトランスフェクションの結果は、第１図に示されて いる。１０”　〜１０’＋）ｆｕ／μｇＤ２９　ＤＮＡの効率が得られ、こうし てマイコバクテリアについての第１の効率的トランスフェクション系を実証する 。これらのプラークはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）スフェロプ ラストのトランスフェクションの結果であるということは、次により実証された ：　（ｉ）　トランスフェクションはＤＮアーゼにより潰滅された；　（ｉ　ｉ ）処理した細胞の浸透圧ショックは保護的トランスフェクションを防止した：そ して（ｉ　ｉ　ｉ）スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）のＤ２９フ ァージ抵抗性突然変異体から誘導されたスフェロプラストは、親菌株に匹敵する 頻度でトランスフェクションされた。これらの技術のそれ以上の洗練は、Ｉ　Ｏ ’ｐ　ｆ　ｕ／μｇのＤ２９　ＤＮＡより大きい頻度を得ることを可能とした。

Ｅ、ｅｏｌｉの中でマイコバクテリアのＤＮＡ構成体の操作および増幅の両者を 可能とし、引き続いてマイコバクテリアの中にトランスフェクションしかつ復製 するベクターを開発した。とくに、速（増殖する非病原性マイコバクテリウム（ 例えば、スメグマＩＩ　（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔｉｓ））の中に、ならびに遅く 増殖するマイコバクテリア（例えば、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣ Ｇおよびヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ　１ｓ））の中に問題のＤＮＡ を導入する能力を有することが高度に望ましかった。プラスミドはＭＡＩＳ複合 体内のあるマイコバクテリアの菌株およびの中におよびマイコバクテリウム・フ ォルライツム（Ｍ、ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）の中に発見されたが、スメグマ菌（Ｍ 。

ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）　、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉ　５）−ＢＣＧまた はヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）内で複製するものはまだ観測さ れてきていない。１つを除外して、これらのプラスミドは選択可能なマーカーを 有する。クララフォード（Ｃｒａｗｆｏｒｄ）　、Ｊ、Ｔ。

およびＪ、Ｈ，ベイツ（Ｂａｔｅｓ）、感染および免疫性（ｒｎｆｅｃｔｉｏｎ 　ａｎｄ　ＩｍｍｕｎｉｔｙＬ２４：９７９−９８１（１９７９）；ミズグチ（ Ｍｉ　ｚｕｇｕｃｈ　ｉ）　、Ｙ、ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロン−（ Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ）、↓４６　：　６５６−６ ５９　（１９８１）：マイスナー（Ｍｅｉｓｓｎｅｒ）、Ｐ、Ｓ、　およびＪ、 ０．ファルキンハム（Ｆａｌｋｉｎｈａｍ）、ジャーナル・オブ・バクテリオロ ン−（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　ＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙＬよ旦ユニ　６６９− ６７２　（１９８４）、対照的に、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ ）　、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧおよびヒト結核菌（Ｍ、ｔｕ ｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の中で複製する種々のファージは記載されそして分離物 の型別のために使用されてきている。

使用する方法は、Ｅ、ｃｏｌｔの中でプラスミドとしてモしてマイコバクテリア の中でファージとして複製するベクターを構成することであった。シャトルプラ スミドのこの開発を達成する１つのアプローチは、マイコバクテリアのＤＮＡが Ｅ、ｃｏｌｉの中でよく発現されないので、プラスミドベクターの中で、Ｅ、ｃ ｏｌｉ宿主を溶菌するであろう機能的マイコバクテリオファージのゲノムをクロ ーニングすることができるであろうという考えに基づいた。こうして、両者の型 の有機体を複製することができるであろう。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　 ｔ　ｉ　ｓ）のトランスフェクションはマイコバクテリオファージの粒子を生ず るであろうから、遅く増殖するマイコバクテリア（例えば、ＢＣＧ）の中に問題 のＤＮＡを導入することは、ファージの感染により達成することができるであろ う。ストレプトミセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）のための２機能的ベクタ ーは、スアレズ（Ｓ　ｕ　ａ　ｒ　ｅ　ｚ）およびチェイタ−（Ｃｈａ　ｔ　ｅ 　ｒ）により記載された。スアレズ（Ｓｕａｒｅｚ）Ｊ、Ｅ。

およびに、　Ｆ、チェイタ−（Ｃｈａ　ｔ　ｅ　ｒ）、ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒ ｅ）、２８６・５２７−５２９　（１９８０）。Ｅ、ｃｏｌｉの中で二重の機能 をもつラムグーＣｏ１Ｅ１ベクターは、ブレンナー（Ｂｒｅｎｎｅｒ）および共 同研究者によりプラスミドと呼ばれた。ブレンナ−（Ｂｒｅｎこの目的で、マイ コバクテリオファージＴＭ４を使用した。ＴＭ４は鳥結核菌（Ｍ、ａｖｊｕｍ） から分離された溶層性ファージであると報告された。チンメ（Ｔｉｍｍｅ）　、 Ｔ、Ｌ、およびＰＬ、ブレンナン（Ｂｒｅｎｎａｎ）、ジャーナル・オブ・ジェ ネティック・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　 Ｍｉｃｒｏｂ＋０１０ｇｙ）、１旦旦：２０５−２０９　（１９８４）。それは スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）を溶原化するファージであると 特性決定された。それはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）　、ＢＣ Ｇ、およびヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の中で複製することが でき、そしてテンペレートであると報告された。このファージは、また、５０ｋ ｂの二本鎖ＤＮＡのゲノムを有し、そして粘着末端を有する。しかしながら、同 様な特性を有する他のマイコバクテリオファージを使用することができる。ＴＭ ４とともに使用して次に記載する手順は、また、ベクターの構成においてこのよ うな他のマイコバクテリオファージとともに使用することができる。

ファージＴＭ４の中にＥ、ｃｏｌｔプラスミドのレプリコンを導入して、Ｅ、ｃ ｏｌｔの中でプラスミドとし２てそしてマイコバクテリアの中でファージ複製す るベクターを発生する方法を第２図に概略的に示す。

平板源リゼイトおよび７Ｍ４フアージのゲノムのＤＮＡを、Ｄ２９ファージにつ いて記載したように調製した（参照、実施例１）。ＴＭ４　ＤＮＡを高い濃度で 結合して、アニリーングした粘着末端の長い鎖状体を形成した。結合したＤＮＡ を５ａｕ３Ａで部分的に消化した。５ａｕ３ＡはＴＭ４ゲノムを頻繁に（例えば 、平均３００ｂｐ毎に１回）切断して、大きさが３０〜５０ｋｂの断片を形成す る。それは長さが全ＴＭ４ケノムまたは小さい欠失をもつＴ　Ｍ　１１ゲノムの 長さである１組のＤＮＡ断片を発生するが、ケノム内のＳａ　ＩＪ　３　Ａ部位 のいずれにおいても切断される。−れらのＤＮＡ断片を１３．５ｋｂのコスミド ｐ　ＨＣ，７９に結合し７、このｐＨＣ７９はアンピシリン抵抗性の遺伝子を含 有し、そし、てＢａ　ｍ　Ｈ］で切断されている。ホーン（Ｈｏｈｎ）、Ｂ　お よびＪ　コリンス（Ｃｏ　Ｉ　ｌ　１ｎｓ）　、遺伝子（Ｇｅｎｅ）−９＋２９ １−２９８　（１９８０）。適当な大きさの組み換え分子について選択するため に、結合混合物を生体外でマイコバクテリオファージラムダのへ・ソドの中にｌ （・ソノ１−ンングし５ｔ１−０これはラムダＣＯ８部位を含有しそして大きさ が３８〜５３ｋｂであるＤＮＡ断片について選択する。生ずるファージ粒子をＥ 、ｃｏｌｉの中に形質導入し２、そしてｐＨＣ７９：　：ＴＭ４　ＤＮＡを含有 するコロニーをアンピシリンを含有する培地トで選択した。円形ＤＮＡを共有的 に閉じたプラスミドを４０．０００のプールしたアンピッリン抵抗性（ａｍｐ’ ）コロニーから分離した。ノく−ボイム（Ｂｉｒｎｂｏ　ｉｍ）　、Ｈ，および Ｄｏｌｙ、ジャーナルーオブ・ヌクレイツクアシッド・リサーチ（Ｊｏｕｒｎａ ｌ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｅ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、７：１５１３−１ ５２５　（１９７９）にのライブラリーは、ｐＨＣ７９コスミドＤＮＡがＴＭ４ ゲノム付近の５ａｕ３Ａ部位の中に不規則的に挿入されている、Ｔｈ１４ゲノム の組み換え分子を含有する。それをスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ ）スフェロプラストの中にトランスフェクションして、非必須領域に挿入された ｐＨＣ７９を有するＴＭ４ファージについて選択した７、こうして、このような ファーらは／ヤトルプラスミドであった。トランスフエクションはプラスミドＤ ＮＡの１μｇ当たり１００プラーク形成単位（ｐ　ｆ　ｕ）を生じｔ：。プラー クのリフトを使用して、３２ｐ＠識したｐ　）（Ｃ７９ＤＮＡに対するハイブリ ダイゼーションについてスクリーニングした：４０００のプラークのうちで１０ にのみが標識したｐＨＣ７９にハイブリダイゼーションした。

プラークの精製およびスメグマＴ９１　（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）細 胞上の増殖後、１つのこのようなファージを詳細に研究し、そしてプラスミド、 ｐｈＡＥｌと表示した。プラスミドｐ　ｈ　Ａ　Ｅ　１は、ブダペスト条約の条 項に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（（１ｈｅ　Ａｍｅ ｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（マリイラン ド州ロックビレ）に受け入れ番号４０３０６号で受託された（１９８６年２月２ ６日）。受託物への公衆のアクセスへのすべての制限は、この出願に基づく米国 特許が登録されると、最終的に除去される。ＤＮＡをスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　 ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）上で増殖したｐｈＡＥ１ファージ粒子から分離し、ＣｓＣ １の勾配で精製し、結合して鎖状体を形成し、そして生体外でバクテリオファー ジラムダのへ。

ドの中にパッケージングした。生ずる粒子はアンピシリン抵抗性をＥ。

ｅｏｌｉ細胞に転移しそして、トランスフェクションすると、スメグマ菌（Ｍ、 ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）上にプラークを産生じた。これはｐｈＡＥｌがシャ トルベクターとして機能する証拠であった。

スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）上で増殖したファージ粒子から ｉｓｌしたｐｈＡＥＩ　ＤＮＡおよびＥ、ｃｏｌｉから分離したプラスミドＤＮ Ａとして分離したｐｈＡＥＩ　ＤＮＡの制限消化は、ファージＤＮＡ調製物にお いて見られる粘着末端により一緒に保持された非アニリーング断片の存在を除外 して、同一のパターンを示した（第３Ａ図）。

サザン分析により、コスミドｐＨＣ７９はＴＭ４ゲノムの２つの１１ｋｂのＫｐ ｎｌ制限断片の１つ内にクローニングされることが実証された（第３Ｂ図）。電 子顕微鏡検査により、ｐｈＡＥ１粒子は、平均直径が５０　ｌ１ｍである６角形 のヘッドをもつバクテリオファージラムダに似る。

しかしながら、これらの粒子は長いテイル（１８０〜２２０μｍの長さ）を有し 、テイルの多（の上にディスク様ベースプレートが存在する（第４Ｃ図）。この 構造は親の７Ｍ４フアージのそれに非常に類似する。チンメ（Ｔｊｍｍｅ）　、 Ｔ、Ｌ、　およびＰ、Ｌ、　ブレンナン（ｂｒｅｎｎａｎ）、ジャーナル・オブ ・ジェネテイック・マイクロバイオロジー（Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎ、Ｍ ｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ）、１３−０　：　２０５−２０９　（１９８４）。

ｐＨＣ７９にハイブリダイゼーションしない、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔ ｉｓ）の中へのｐＨＣ７９：　：ＴＭ４ライブラリーのトランスフェクションか ら生ずる分離されたファージからのＤＮＡの制限分析は、それらが同一であるこ とを示した。ファージは組み換えの事象から生じたと思われ、この事象は２また はそれ以上のｐＨＣ７９：　：７Ｍ４分子を含有するトランスフェクションした 細胞の中で起こり、野生型１Ｍ４ゲノムを生ずる。

スメグマ菌（〜Ｌ　ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）から得られたシャトルプラス ミドｐｈＡＥ１がその親のＴＭ４に類似し、試験した３つの異なるウシ結核菌（ Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧワクチン菌株：グラシン（Ｇｌａｘｏ）、パスツ ール（Ｐａｓｔｅｕｒ）およびダニ・ソシ（Ｄａｎｉｓｈ）のＢＣＧを感染し、 そしてそれらの中で複製するという観察は、とくに興味あることである。これら の結果は第４Ａ図および第４Ｂ図に表されている。

こうして、これは組み換えＤＮＡ分子であるＥ、ｃｏｌｉ−マイコバクテリアの シャトルプラスミドの首尾よい構成を実証し、組み換えＤＮＡ分子はプラスミド としてＥ、ｃｏｌｉの中で複製する能力を有するばかりでなく、かつまたバクテ リオファージのヘッドの中にまたはバクテリオファージの粒子の中にパッケージ ングされる能力を有する。それは、また、組み換えＤＮＡは急速に増殖するマイ コバクテリウム（スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ））および遅く増 殖するマイコバクテリウム（ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧ）の両 者の中に導入されたことを実証する。これはシャトルプラスミドでＢＣＧワクチ ン菌株を感染することを可能とし、こうして、クローニングした遺伝子をマイコ バクテリアの中に導入することを可能とする。こうして、これはＢＣＧのための トランスフェクション系の開発の必要性を排除する。すなわち、Ｅ、ｃｏｌｉ− マイコバクテリアのシャトルプラスミドは、マイコバクテリアの中にトランスフ ェクションすると、マイコバクテリアの粒子の中にパッケージングされるので、 問題のＤＮＡは形質導入により遅く増殖するマイコバクテリア（例えば、ＢＣＧ ）の中に導入することができる。

現在まで、これは実施することができず、そしてこの進歩は、Ｊまたは２以上の 問題の抗原に対して免疫化するために使用できる、組み換えマイクバクテリアの ワクチンのベヒクルの産生を可能とする。

これらのプラスミドを構成するために生体外のパッケージングを使用することは 、パッケージング系の大きさの限界を越えないかぎり、これらのベクターの中に 遺伝子（例えば、それに対する免疫応答を望む、１または２以上の病原体ための １または２以上の抗原をエンコードする、遺伝子、または問題のＤＮＡ）をクロ ーニングする方法として拡張することができる。また、追加のＴＭ４：・ｐＩＩ ｃ７９組み換えプラスミドをスクリーニングすることによって、７Ｍ４フアージ から欠失することができるＤＮＡの最大量を決定すること、およびその中にＤＮ Ａを挿入することができるファージのゲノムの追加の非必須領域を定めることが できる。

シャトルプラスミドによりマイコバクテリアの中に新しい遺伝子（例えば、抗原 をエンコードする問題のＤＮＡ）を導入することは、Ｅ、ｃｏｌｉの中でシャト ルプラスミドの中にＤＮＡ断片をクローニングし、引き続いてスメグマ菌（Ｍ、 ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）スフェロプラストの中にそれらをトランスフェク ションすることを伴う。これはクローニングした遺伝子を含有する組み換えファ ージ粒子を生ずる。生ずる組み換えファージを含有するスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）スフェロプラストを使用して、ＢＣＧを高い効率（１００ ％の効率に近付く）感染し、こうして組み換えファージ中に含まれる問題のＤＮ ＡをＢＣＧの中に導入することができる。マイコバクテリアの細胞の中で外来遺 伝子の安定な発現を可能とする、溶層性または組み換えのための条件を開発する ことは、高度に望ましい。

マイコバクテリアの細胞の中への問題のＤＮＡの導入前述のおよび下の節に記載 するシャトルベクターを使用して、１または２以上の問題の病原体のための１ま たは２以上の抗原をエンコードする問題のＤＮＡを、マイコバクテリア、例えば 、ウシ結核菌（Ｍ、ｂ。

ｖ　ｉ　５）−ＢＣＧまたはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の 中に導入することができる。それは、また、適当な抗原、例えば、ヒトのゴナド トロピンホルモン（ＨＧＨ）断片をマイコバクテリアの中に導入して、抗生値「 ワクチン」を産生ずることができる。これらのベクターを、また、使用して、腫 瘍細胞のための増殖阻害因子または殺細胞因子であるタンパク質またはポリペプ チドをエンコードするＤＮＡを導入することができる。生ずる組み換えマイコバ クテリアを使用して、それぞれ、マイコバクテリアの中で発現された外来抗原に 対する免疫応答を非特異的に増強し、そしであるヒトの癌を処置することができ る。このシャトルベクターは、バクテリア（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉ、ストレプト ミセス属（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）　、バチルス属（Ｂａｃ　ｉ　Ｉ　Ｉ ｕｓ））、または他の有機体（例えば、酵母菌）の中で組み換えＤＮＡ構成体を 操作および増幅し、引き続いてそれらをＤＮＡが発現されるマイコバクテリウム の中に転移する手段を提供する。

結局、例えば、らい、結核、マラリア、ジフテリア、テタヌス、レイシュマニア 、サルモネラ、シストミアシス（ｓｃｈｔｓｔｏｍｉａｓｉＳ）％はしか、おた ふくかぜ、ヘルペスおよびインフルエンザに対して個体を免疫化するために使用 できるマイコバクテリアのワクチンを製造することができる。Ｔ細胞のメモリー またはエフェクターの機能を必要とする、病原体の抗原ををエンコードする遺伝 子を固有する能力は、とくに価値がある。生ずる組み換えマイクバクテリアのワ クチンを宿主に投与すると、宿主の免疫系は刺激されて保護的免疫応答を生成す る。

病原体または毒素に対するワクチンは、本発明のシャトルプラスミドを使用して 、次の手順により生成することができる・それに対する保護を望む病原体または 毒素のための抗原（または複数の抗原）をエンコードするＤＮＡが得られる。Ｄ ＮＡは天然に産出するＤＮＡの分離（例えば、病原性有機体または毒素産生有機 体から）することによって；既知の遺伝子操作技術（例えば、参照、マニアチス （Ｍａｎ　ｉ　ａ　ｔ　ｉ　ｓ）　Ｔ。

ら、モレキュラー・クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｌｏｎｉｎｇ）：実 験室のマニュアル（Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｎｕａｌ）、コールド− スプリングＨハーバ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ）、−ニーヨー ク（１９８２）を使用して、問題のＤＮＡの配列をクローニングおよび増幅する ことによって；あるいは機械的合成により得ることができる。

次の手順により、問題の１または２以上の遺伝子（すなわち、それに対する免疫 性を望む１または２以上の抗原をエンコードする）をシャトルプラスミドの中に クローニングされる。これは第２図を参照して説明することができ、第２図はシ ャトルプラスミドｐｈＡＥ１の概略的表示である。既知の技術を使用して、シャ トルプラスミドの粘着末端を結合する。生ずるシャトルプラスミドを独特制限酵 素（例えば、シャトルプラスミド中の独特部位において切断する制限酵素、例え ば、ＥｃｏＲＩおよびＥｃｏＲＶ）で切断（消化）する。このようにして作られ る切断に対する別のアプローチは、他の制限酵素とともに有用である（それによ り切断することができる）ポリリンカー（オリゴヌクレオチド配列）の付加（結 合による）である。この場合において、リンカ−は選択した制限酵素で切断して 開かれ、問題のＤＮＡを挿入することができる部位を生成する。

第１の場合（独特制限酵素を使用する切断）において、１回切断されそして問題 のＤＮＡを挿入することができる、シャトルプラスミドの分子が生ずる。第２の 場合において、また、ＤＮＡを挿入できる少なくとも１つの部位が存在する。抗 生物質抵抗性をエンコードする遺伝子（例えば、アンピシリン抵抗性をエンコー ドする遺伝子）およびそれに対する免疫性を望む１または２以上の抗原をエンコ ードするＤＮＡを、既知の技術を使用して、制限部位において結合することがで きる。挿入されるＤＮＡおよびシャトルプラスミドのＤＮＡは、一般に、等モル 量で結合される。生ずる結合されたＤＮＡ、この場合においてこれはシャトルプ ラスミドのＤＮＡ、抗生物質抵抗性遺伝子および抗原をエンコードするＤＮＡを 包含する、を、ラムダ生体外パッケージング混合物を使用して、バクテリオファ ージのヘッドの中にパッケージングする。引き続いて、Ｅ、ｃｏｌｉをファージ で形質導入し、その結果抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子および抗原をエ ンコードするＤＮＡを含有するコロニーについてスクリーニングする（抗生物質 を含有する培地を使用して）ことができる 生ずるライブラリーは、例えば、エレクトロボレイションを使用してスメグマ菌 （Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中に導入する。クローニングしたインサ ートのＤＮＡを含有するシャトルプラスミドを含有するプラークを選択する。引 き続いて、組み換えスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）を使用して、培養可 能なマイコバクテリウム、例えば、ＢＣＧを高い効率で感染することができる。

結局、抗原をエンコードするＤＮＡをマイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの中に 導入し、ここでそれは発現されるであろう。

問題のＤＮＡ　（ここでそれらのゲノムのＤＮＡの中に組み込まれた１または２ 以上の抗原をエンコードする）を含有するＢＣＧの選択は、選択可能なマーカー を使用して実施することができる。組み換えファージで感染して導入された、１ または２以上の抗原をエンコードするＤＮＡをＡ何するＢＣＧの選択するために アプローチは、抗生物質抵抗性遺伝子である、選択可能なマーカ・−・の使用に に基づく。この場合において、２・ヤｉ・ルブラスミドは、例えば、カナマイノ ン抵抗性、ビオマイン゛／祇抗性、チオストレプトン抵抗性、ハイグロマイシン 抵抗性またはブレオマインン抵抗性をエンコードする遺伝子を包含する。

選択可能なマーカーを使用して問題のＤＮＡを含有するＢＣＧを選択する、第２ のアプローチは、栄養要求変異種の方法（すなわち、突然変異体を誘導する有機 体が要求しない、ある栄養または物質を要求する突然変異体の有機体の使用に頼 る方法）である。この場合において、突然変異体を有するマ・１′コバクテリウ ムを使用し、そして失なったまたは突然変した機能をエンコードする遺伝子をシ ャトルブラスミド（これは、また、抗原をエンコードするＤＮＡを含有する）の 中に組み込む。こうして、抗原をエンコードするＤＮＡを含有するマイコバクテ リアについての選択は、適当な培地上で増殖したとき、シャトルブラスミドが首 尾よく導入されるマイコバクテリアが生き残る能力に基づく。

例えば、宿主突然変異体（例えば、スメグマ菌（？ｖ１、ｓｍｅｇｍａｔｌｓ） 　、ＢｃＧ）および突然変異体を補足する選択可能なマーカーを包含する系を使 用することができる。このような系は、ｐ　ｙ　ｒ　Ｆ−ＢＣＧ突然変異体であ る宿主突然変異体および選択可能なマーカー、例えば、ｐｙｒＦ”遺伝子（七れ らは（突然変異体）ＢＣＧの中に抗原をエンコードするＤＮＡを導入するために 使用するプラスミドのシャトルベクターの中に存在する）を包含することができ る。例えば、プラスミドは、コスミドのＤＮＡの中に挿入された抗原をエンコー ドするＤＮＡに加えて、ｐｙｒＦ’遺伝子を含むことができる。こうして、別の アプローチは２−デオキシグルコース抵抗性突然変異体を使用することである・ この場合において、マイコバクテリアのグルコキナーゼ遺伝子を、ｐｙｒＦにつ いて前述したように、プラスミドの中にクローニングしそして選択に使用する。

この基準に基づく選択は、ゲノムのＤＮＡの中に安定に組み込まれそしてバチル ス属（Ｂａｃ　ｉ　ｌ　Ｉ　ｕｓ）により発現された、抗原をエンコードするＤ ＮＡを有するＢＣＧ生ずるであろう。このために、遺伝子の発現シグナル（例え ば、プロモーター、リポソーム結合部位）は、外来（抗原をエンコードする）Ｄ ＮＡより玉流に含まれて、抗原をエンコードするＤＮＡを含有するＢＣＧはそれ を十分なレベルで発現して、それを投与した宿主において免疫応答を誘発するこ とができる。

また、１または２以上の抗原をエンコードするＤＮＡを含有するＢＣＧを、モノ クローナル抗体の使用により選択することができる。この場合において、モノク ローナル抗体を利用できる抗原（例えば、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）またはヒ ト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉＳ））の１または２以上のエピトープを エンコードする遺伝子または遺伝子断片は、マイコバクテリアの中に導入される 。このようなモノクローナル抗体を使用して、これらのエピトープの１または２ 以上をエンコードする１または２以上の遺伝子を含有する組み換えＢＣＧについ て選択する。このようにして導入された抗原遺伝子は、プロモーター配列および 他の調節配列を含有する。結局、追加の系列（例えば、他の抗原をエンコードす るＤＮＡ）を、遺伝子操作技術を使用して、インフレームで付加することができ 、こうして１つの抗原に対するモノクローナル抗体により同定される組み換えＢ ＣＧは、また、そのように導入された他の外来抗原をエンコードするＤＮＡを発 現するであろう。

プラスミドを使用して培養可能なマイコバクテリアの中に抗原をエンコードする ＤＮＡを導入する平行な方法を、また、使用してワクチンのベヒクルをつくこと ができる。これはプラスミドとして問題のＤ　Ｎ　Ａを染色体外に安定に維持し 、そしてそれを引き続いて発現するであろう。

このようなシャトルプラスミドの構成は、第８図に概略的に表されている。この 場合において、抗原をエンコードするＤＮＡを含有する細胞の選択を可能とする 、選択可能なマーカーを使用する。選択可能なマーカーは、例えば、抗生物質抵 抗性をエンコードする遺伝子または、シャトルプラスミドを参照して前述したよ うに、栄養要求変異種における損失を補足する遺伝子であることができる。栄養 要求変異種の方法において、栄養要求変異種のマイコバクテリア突然変異体（例 えば、ｐｙｒ−Ｆ突然変異体）を分離し、対応する野生型（非突然変異体）マイ コバクテリウムの中に存在遺伝子をプラスミドの中に組み込む。ｐｙｒ”Ｆ突然 変異体に加えて、グルコキナーゼ遺伝子において欠失を有する、デオキソグルコ ース突然変異体、ならびに他の生合成通路（例えば、アミノ酸生合成、ビタミン 生合成および炭水化物の代謝、例えば、アラビノースおよびガラクトース）にお いて突然変異体を有する他のものを分離することができる。

いずれのアプローチにおいても、マイコバクテリアの突然変異体を選択し、そし て突然変異を補足する遺伝子を、また、抗原をエンコードする問題のＤＮＡを含 有する、プラスミドベクターの中に組み込まれる。

抗原をエンコードするＤＮＡが首尾よく導入されるマイクバクテリアの突然変異 体は、適当に選択した培地（例えば、それに対する抵抗性を与える抗生物質を含 有する培地、使用する突然変異体において影響を受ける生合成の通路に含まれる 栄養を含有するか、あるいは欠く培地）上で培養するか、あるいはｃｌ遺伝子を 使用するとき、形成するプラークの出現を基準にして選択することによって、同 定（または選択）することができるであろう。

組み換えマイコバクテリアのワクチンのベヒクルの中に抗原をエンコードするＤ ＮＡを導入するとき有用なプラスミドの他の成分は、自律的に複製する配列（例 えば、レプリコン）であり、その存在はプラスミドを自律的に複製させる（染色 体外で）ための重要決定因子である。これらの配列は、例えば、プラスミドのレ プリコン、マイクバクテリアのセグメントまたは染色体の複製由来を包含するこ とができる。

シャトルプラスミドｐｈＡＥ１の設計は、これらの因子のいくつかを包含する。

例えば、Ｅ、ｃｏｌｉコスミドｐＨＣ７９をマイクバクテリアＴＭ４の中への導 入は、Ｅ、ｃｏｌｉプラスミドのレプリコン由来および選択可能なアンピシリン 抵抗性遺伝子、ならびにバクテリオファージラムダの粘着（ＣＯＳ）配列および 独特ＥｃｏＲ１部位を提供できるようにする。７Ｍ４フアージ内にＥｃｏＲＩ部 位は存在しない、ｐｈＡＥｌ内の独特ＥｃｏＲ１部位を使用して１または２以上 の外来遺伝子をプラスミドの中に導入することができる。実施例４１ご記載する ように、Ｔｎ９０３からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ（ａ　ｐ 　ｈ）遺伝子をエンコードする１、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、このコスミドの クローニング方法を使用して、ｐｈＡＥｌの中にクローニングした。

ワクチンのベヒクルとして使用すべき、培養可能なマイコバクテリウム、例えば 、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧまたはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　 ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中に抗原をエンコードするＤＮＡを効率よく導入するい くつかのアプローチが存在する。１または２以上の問題の抗原をエンコードする ＤＮＡ、選択可能なマーカーおよび自律的に複製する配列を包含する、プラスミ ドについて、原形質体の融合を使用してマイコバクテリアの中に効率よく導入す ることができる。この場合において、クローニングしたプラスミドを有するＥ、 ｃｏｌｉまたはストレプトミセス属（Ｓｔ　ｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）を、既知の 技術を使用して、マイコバクテリアのスフェロプラストと融合する。このアプロ ーチを使用して、外来（抗原をエンコードする）ＤＮＡをマイコバクテリウムの 中に転移することができる。あるいは、プラスミドのＤＮＡを含有しそして染色 体のＤＮＡを本質的に含有しない、Ｅ、ｃｏｌｉミニ細胞は、ミニ細胞の原形質 体の融合を実施するとき使用することができる。

別法において、問題のＤＮＡをマイコバクテリウムの中に効率的に動かすことが できる場合、自律的に複製する配列が必要でなくそして、その代わり、問題のＤ ＮＡ　（例えば、抗原をエンコードする）をマイコバクテリアの染色体の中に組 み込むことができる。これは、例えば、ミニ細胞の原形質体の融合を使用して達 成することができる。この場合において、マイコバクテリアのための選択可能な マーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子または染色体の突然変異体であることができ 、Ｅ、ｃｏｌｉコスミドの中にクローニングすることができる。マイコバクテリ アの染色体の中に問題のＤＮＡを効率よく組み込むことを可能とするＤＮＡが、 また、Ｅ、ｃｏｌｉコスミドの中に存在するであろう。例えば、らい菌（Ｍ、１ ｅｐｒａｅ）において、組み換えに関連する思われる反復配列が起こる；類似す る配列をＢＣＧおよびスメグマｍｃＭ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）において同定しそ してそれから分離することができ、Ｅ、ｃ。

Ｉｔコスミドの中に組み込むことができ（選択可能なマーカーと一緒に）そして これは高い程度の組み換えを生ずる。

１または２以上の遺伝子（１または２以上の抗原をエンコードする）を記載する 構成体（例えば、Ｅ、ｃｏｌｉのレプリコン、組み換えに関連するマイコバクテ リアの染色体ＤＮＡのセグメント（組み換え発生配列）および２つの選択可能な マーカー−１つはＥ、ｃｏｌｉの中でマーカーとして働きそして第２はマイコバ クテリウムの中でマーカーとして働く−を包含する）の中に組み込むことができ る。次いで、１または２以上の遺伝子をマイコバクテリアの染色体のＤＮＡ、例 えば、ＢＣＧまたはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の染色体のＤ ＮＡの中に組み込むことができる。１または２以上の問題の遺伝子をこのように してスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中に組み込む場合、１ま たは２以上の遺伝子は、また、一般の形質導入ファージによりＢＣＧの中に動く ことができる。この場合において、他の構成成分に加えて、２つの組み換え発生 配列：１つはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）からおよび１つはＢＣＧか ら、を含むことが好ましい。

本発明の組み換えマイコバクテリアを産生じそして使用する方法を、次の節にお いて詳細に記載する。それらの節は次の事項を記載しそして例示する。シャトル プラスミドにより問題のＤＮＡをマイコバクテリアの中に導入して、問題のＤＮ Ａをマイコバクテリアの染色体のＤＮＡの中に組み込むこと：シャトルプラスミ ドにより問題のＤＮＡをマイコバクテリアの中に導入して、その中で問題のＤＮ Ａがエビソーム的に発現されるマイコバクテリアを産生ずること；組み換えプラ スミドベクターにより問題のＤＮＡをマイクバクテリアの中に導入して、相同的 組み換えを通して問題のＤＮＡをマイクバクテリアの染色体の中に導入すること ：組み換えマイコバクテリアの特性決定：およびこのような産生物の使用。

シャトルプラスミドにより問題のＤＮＡの導入本発明の研究は、スメグマ菌（Ｍ 、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）を安定に溶原化するマイコバクテリオファージ の同定を生じた。１つのこのようなファージＬ１はスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇ ｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）上で濁ったプラークを産生ずる従来報告された、そして推定 上の溶原体は重感染に対して抵抗性であり、そして誘発してファージを産生ずる ことができた。トーキ（Ｄｏｋｅ）　、Ｓ、Ｊ、Ｋｕｍａｍｏｔｏ　Ｍｅｄ、Ｓ ｏｃ、Ｓ。

Ｃ１３４，１３６０−１３７３（９６０）。トクナガ（Ｔｏｋｕｎａｇａ）、Ｔ 、およびセラーズ（Ｓｅｌｌｅｒｓ）、Ｍ、１．　、マイコバクテリウム、ノル カルブイア、およびアクチノミセテスにおける宿主−ウィルスの関係（Ｈｏｓｔ −Ｖｉｒｕｓ　Ｒｅ１ａｔｉｏｎｓｈｆｐｓｉｎ　Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 、Ｎｏｒｃａｒｄｊａ、ａｎｄ　Ａｃｔｉｎｏｍｙｃｅｔｅｓ）［ジュハスズ（ ｊｕｈａｚ）　、Ｓ、Ｅ、およびブラ：／：／マー　（Ｐ　１　ｕｍｍｅ　ｒ） 　、Ｇ、　Ｉｉ］　２２７−２４３　［チャールス（Ｃｈａｒｌｅｓ）Ｃ，、ト マス（Ｔｈｏｍａｓ）　、イリノイ州スプリングフィールド、１９７０］。これ らの観察は確証されそして、さらに、サザン分析により、プロファージはスメグ マ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）染色体の中に組み込まれることが実証さ れた（第５図、パネルＢ、レーン２．３）。多数の独立の溶原体の分析はファー ジの組み込みから生ずる独特のバンドの同一パターンを明らかにし、Ｌ１１フア ージみ込みは部位特異的であることを示唆する（第５図、パネルＢ）。

こうして、Ｌｌはスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）を安定に溶原化 することが示された。複製のＣｏ１Ｅｌ由来およびＥ、ｃｏｌｉの中の選択のた めのアンピシリン抵抗性遺伝子を含有する、Ｅ、ｃｏｌｉコスミドｐ　ＨＣ７９ を、Ｌｌ−ゲノムの非必須領域の中に導入することによって、Ｌｌ−シャトルプ ラスミドを構成した（第６図）。Ｌｌ−シャトルプラスミド、ｐｈＡＥ１５と表 示する、をプラスミドとしてＥ、ｃｏｌｉの中でおよびファージとしてマイコバ クテリアの中で複製することが示されそして、親のファージのように、スメグマ 菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）染色体の中に組み込まれることが示された （第５図、パネルＢル−ン４．５）、Ｌ１ファージはＥｃｏＲＩ部位を欠く。ｐ ＨＣ７９の導入はｐｈＡＥ１５のための独特ＥｃｏＲＩ部位を提供し、問題の遺 伝子の導入を可能とする。これらの遺伝子は、シャトルプラスミドのベクターで 溶原化すると、マイクバクテリア内に導入しかつ安定に維持することができるこ とが示された（第６図）。

Ｅ、ｃｏｌｔの中でカナマイシン抵抗性を与える、Ｔｎ９０３からのアミノグリ コシドホスホトランスフェラーゼ（ａｐｈ）を含有する１゜６ｋｇの断片は、コ スミドのクローニング方法により、ｐｈＡＥ１５の中に導入することができる。

才力（Ｏｋａ）　、Ａ、スギサキ（Ｓｕｇｉｓａｋｉ）、Ｈ，およびタカナミ（ Ｔａｋａｎａｍｉ）　、Ｍ、　ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー （Ｊ、Ｍｏｂ　Ｂｉｏ＋、）、１４７．２１７−２２６　（１９８１）、Ｅｃｏ ＲＩ末端をもつａｐｈ遣伝子を、線状ｐｈＡＥ１５　ＤＮＡに結合し、そしてバ クテリオファージラムダ−・＼ラドの中に生体外でベソケージングする。生ずる 組み換え分子をＥ、ｃｏｌｉから分離した。アンピシリンおよびカナマイシンの 両者にン・１して抵抗性であるＥ、ｅｏｌｉのクロー゛ノから、閉じた円形のプ ラスミドＤＮＡを分離し、そしてスーブ−ｔｅｌｌ　（Ｍ、ｓ　ｍ　ｅ　ｇｍ　 ａ　ｔ　ｉＳ）原形質体の中にトランスフェクションＬ、た。これはブーラスミ ドＤＮ、八をバ・・ｔケーシングした７１゛フバクテリアのファージ粒子を生じ た、このプラスニドは、ＨｉｈＡＥ１９と表示し、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍ ａｔｉｓ）細胞を溶原化し、ぞしてカナマ・イレン抵抗性コロニーを発生する能 ノＪを有する（第７図）。マイコバクチリオファ・−ジはこれらの溶原化から誘 発され、Ｌ１感染に対する免疫性および感受性スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ 　ｔ　ｉ　ｓ）細胞に対するカナマイシン抵抗性を同時トランスフェクションし 、カナマ・イノンに対する抵抗性がクローニングしたａｐｈ遺伝子の発現から生 ずることを実証する。ｐ　ｈＡＥ　１９は、また、ウシ結核ａ　（Ｍ、ｂｏｖ　 ｉ　５）−ＢＣＧを溶原化し、そしてウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣ Ｇにカナマイシン抵抗性を与える。こうして、カナ゛？イ゛シ゛／低抗性はマイ コバクテリアについて第１の有用な選択可能なマーカーを表す。さらに、これら の結果は実証するよ・）に、溶層性は問題のＤＮＡをマイコバクテリアの中に導 入しそしてその中で発現することができる。

５．・十トルプラスミドによる問題のＤＮＡの導入シャトルプラスミドによる問 題のＤＮＡの導入は、クローニング容量の増加、ＤＮＡの操作の容易さ、および コピー数の増加によりファージの能力を拡張する。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇ ｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）からのプラスミドは従来記載されてきておらず、ぞしてマイ コバクテリアの中で遺伝子操作は困難である。したがって、Ｅ、ｅｏｌｉおよび マイコバクテリアの両者の中で問題のＤＮＡを復製しかつ発現することができる シャトルプラスミドのベクターを次のようにし２て構成した。マイコバクテリア のための機能的レプリコンを確実にするため、Ｔｎ５からのネオマイシン／カナ マイシンホスホ１−ランスフェラーゼＩＩ（ｎｅｏ）遺伝子、複製のＰ１５Ａ由 来およびｐＡｃＹｃ１８４からのクロランフェニコールアセチルトランスフェラ ーゼ（ｃａｔ）遺伝子を含有する、Ｅ、ｃ。

１１プラスミドｐｌＪ６６６を、マイコバクテリウム・フォルライツム（Ｍ、ｆ ｏｒｔｕｉｔｕｍ）の中で複製するプラスミドｐＡＬ５０００の中に不規則的に 挿入した。ギーザー（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｔ、およびＲｌＥ、メルトン（Ｍｅ　ｌ 　ｔ　ｏｎ）　、遺伝子（Ｇｅｎｅ）　、６５　：　８３−９１　（１９８８） ：ベルブ（Ｂｅｒｇ）　、Ｄ、Ｅ、ら、プロシーディンクス・オブ・ナショナル ・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐ　ｒ　ｏ　ｃ。

Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ、Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、７２　：３６２８−３６３２（１ ９７５）；チャック（Ｃｈａｎｇ）　、Ａ、Ｃ，￥、およびＳ、　Ｎ。

コーヘン（ＣｏｈｅｎＬ　ジャーナル・オブ・バクテリウムジ−（Ｊ。

Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、１３４：１１４１−１１５６　（１９７８）；ラド ディ　（Ｌａｂ　ｉｄ　ｉ）　、Ａ、ら、ＦＥＭＳマイクロバイオロジー・レタ ーズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、３０：２２１−２２５　 （１，９８５）。第８図は、ｐＩ　Ｊ６６６　：　＋　ｐＡＬ５０００ライブラ リーの構成を概略的に示す。

このライブラリーをスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中に形質転 換することは、多分再生する生存しつる細胞の問題のために、困難であった。し たがって、ＤＮＡはエレクトロボレインヨンにより完全なスメグマｍ　（Ｍ、ｓ ｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）細胞の中に直接導入して、スフェロプラストを産生ず るためのプロトコルの使用から生じうるマイコバクデ・リアの細胞への起こり得 る損傷を排除した。５Ｘ１０’ｐｆｕ／μｇより多い値を生じた、溶菌ファージ ＤＮＡのエレクトロボレイションのための条件が開発された。これらの条件下に ｐｌＪ６６６：　：ｐＡＬ５０００をスメグマ菌（Ｍ、５ｒｎｅ　ｇｍａ　ｔ　 ｉ　ｓ）の中に工し・クトロボレイシヨンすると、カナマイシン抵抗性およびク ロランフェニコール抵抗性の形質転換体が生じた。３つの別々の実験においてス メグマ菌（Ｍ。

ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）形質転換体のプールから分離したプラスミドＤＮＡ をＥ、ｃｏｌｉの中に形質転換しもどして、カナマイシン抵抗性について選択し た。ｐｌＪ６６６は分離したＥ、ｃｏｌｉ形質転換体の多くにおけるｐＡＬ５０ ００内の異なる部位に挿入したが、すべてのプラスミドは両者の種において安定 であった（第９図）。これらの方法は、実施例９に記載しそして第１０図に示す ように、あるＢＣＧワクチン菌株をｐ　Ｉ　Ｊ６６６　：　：　ｐＡＬ５０００ 組み換えライブラリーで形質転換することを可能とし、カナマイシン抵抗性を発 現させた。第１０図のパネルＡは、シャトルプラスミドＤＮＡとＢＣＧ細胞をエ レクトロボレイシヨンした後、発生したカナマイシン抵抗性ＢＣＧコロニーを示 す、パネルＢは、シャトルブラスミドＤＮＡの不存在下にエレクトロボレイシヨ ンした後、発生したカナマイシン抵抗性ＢＣＧコロニーを示す。同様なアプロー チを使用して、第１７図に表される結果により示されるように、６５ｋＤのらい 菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）をＢＣＧの中に導入し、ここでそれは発現された。

マイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの中に問題のＤＮＡを組み込むためマイコバ クテリアのゲノムのＤＮＡの中に非マイコバクテリア由来のＤＮＡ　（すなわち 、それを組み込むしｔ：マイコバクテリア以外の源からの）を組み込むために使 用したプラスミドベクターを、第１１図に表すように構成した。ウシ結核菌（Ｍ 、ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧのＰｙｒＦ遺伝子の分離は、次のようにしてそして実施 例１０に記載するようにして実施した。ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ 　ＤＮＡを制限酵素５ａｕ３Ａで部分的に消化し、大きさで選択し、そしてベク ターｐＵＣ１９の中に挿入した。生ずるライブラリーを使用して、Ｅ、ｃｏｌｉ のＰｙｒＦ遺伝子の中に挿入を有するＥ、ｅｏｌｉ細胞を形質転換した。

ウラシルの不存在下に増殖する能力を獲得した、４つの独立のコロニーが同定さ れ、そしてプラスミドＤＮＡをそれらから分離した。このプラスミドＤＮＡを使 用して、組み換えプラスミドベクターを構成した。既知の技術を使用して、スメ グマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）のＰｙｒＦ遺伝子をｐｔＪｃ１９プ ラスミドベクターの中のＢａｍＨＩ部位に組み込み、そしてカナマイシン抵抗性 遺伝子（Ｋａｎ）をＰｙｒＦ遺伝子の中のＢａｍＨＩ部位に挿入した。ＰｙｒＦ ’細胞はウラシルの不存在下に培地の中で増殖することができ、そしてフルオロ −オロチン酸感受性（ＦＯＡ’）である；　ＰｙｒＦ−細胞増殖にウラシルを必 要とし、そしてフルオロ−オロチン酸抵抗性（ＦＯＡつである。カナマイシン抵 抗性遺伝子を含有する細胞はカナマイシン抵抗性（ＫＡＮ’）であり、そしてこ の遺伝子をもたない細胞はカナマイシン感受性（ＫＡＮ’）である。

アウスベル（ＡｕｓｕｂｅＩ　ｚ）　、Ｆ、Ｍ、ら（編）分子生物学における現 在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ　ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌ ａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ）、ｐ、１．５１．１、ＧｒｅｅｎＰｕｂ、（１９８７） 。ｐＵｃ１９、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｒｎ　ｓｍｅｇｍａｔｉ ｓ）およびＴｎ９０３からのＤＮＡを含有するプラスミドＤＮＡ、ｐＲＨｌ、１ ００と表示する、は、ブダペスト条約の条項に従い、アメリカン・タイプ・カル チャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ 　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（マリイランド州ロックビレ）に受け入れ番号４０４ ６８号で受託された（受託日、１９８８年７月６日）。受託物への公衆のアクセ ス・＼の制限は、この出願に基づく米国特許が登録されたとき最終的に除去され るであろう。

下および実施例１０に記載するように、エレクトロボレイションを使用して、生 ずる組み換えプラスミドベクターをマイコバクテリアの中に導入した。第１２Ａ 図に表されるように、組み換えプラスミドで形質転換した細胞において、入るＰ ｙｒＦ配列およびＫａｎ配列の組み込みにおいて、相同的組み換えは、ＰｙｒＦ 遺伝子を含有する入る組み換えプラスミドおよび相同的マイコバクテリアの染色 体（ゲノム）の配列上で配列の開で起こった。Ｋａｎ遺伝子を含有する、組み込 まれた組み換えプラスミドを含有するマイコバクテリアの細胞は、カナマイシン を含有する培地上でエレクトロポレインヨンした細胞を培養することによって選 択した。Ｋａｎ遺伝子の組み込みが起こった細胞のみが生き残った。

問題のＤＮＡ　（ここで、Ｋａｎ遺伝子）が同定されたマイコバクテリアの細胞 は次の通りである。全体の組み込まれた組み換えプラスミドは、それがその中に 組み込むマイコバクテリアのゲノムが互いに密に近接して２つの同一の配列を含 有するので、不安定である。結局、相同的配列の組み換えは再び起こることがで きる。これはルーピングアウト（分割）を生じ、これは組み換えプラスミドを除 去し１、マイコバクテリアのゲノムの正味の変化を生成しないか、あるいはＫａ ｎを含有するＰｙｒＦ遺伝子がマイコバクテリアのゲノムの中に止まるような方 法で組み換えプラスミドを除去する。分割を低い頻度で起こるが、それが起こっ た細胞を同定し、そしてそれらが示す表現型に基づいて分離することができる。

ＰｙｒＦ”細胞（ゲノムの中で正味変化を生じない）は、第１２図に示すように 、カナマイシン感受性およびフルオロ−オロチン酸感受性（ＦＯＡ“）であろう 。Ｋａｎを含有するＰｙｒＦ遺伝子の組み込みを生ずる細胞は、ＰｙｒＦ遺伝子 が崩壊し、こうして非機能的であるので、カナマイシン抵抗性であり、モしてＦ ＯＡ’である。こうして、ＦＯＡを含有する培地上でＫＡＮ’マイコバクテリア の集団を平板培養すると、Ｋａｎ遺伝子がゲノムのＤＮＡの中に安定に組み込ま れた細胞が同定される（第１２Ｂ図、下車：ＫＡＮ’、ＦＯＡ’）。

こうして、Ｋ、ａｎ遺伝子は、隣接するＰｙｒＦ配列の相同的組み換えを使用し て、マイコバクテリアのゲノムの中に安定に組み込まれた。第１２Ｂ図に図解さ れている本発明の方法の重要な利点は、問題のＤＮＡの組み込みが起こると同時 に、プラスミドまたはファージＤＮＡはゲノムの中に組み込まれる。すなわち、 正味の作用はプラスミド配列が組み換えマイコバクテリアの細胞の中に存在しな いことである。Ｋａｎ遺伝子の発現は、また、実証され、そして組み込みおよび 分割の両者が起こりた細胞を細胞の表現型に基づいて選択した（この場合におい て、ＫＡＮ’、ＦＯＡ’）。前述の研究において、非マイコバクテリア由来のＤ ＮＡ　（すなわち、カナマイシン抵抗性遺伝子）はスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍ ａｔｉｓ）のゲノムのＤＮＡの中に首尾よく導入および安定に組み込まれた。同 一技術を使用して、非マイコバクテリア由来のＤＮＡをウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ 　ｉ　ｓ）　−ＢＣＧまたは他のマイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの中に導入 することができる。

同様な方法において、それに対する免疫応答を望む、１または２以上の抗原をエ ンコードするＤＮＡを、マイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの中に組み込むこと ができる。問題のＤＮＡをマイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの中に組み込む、 本発明の方法は、第１３図に概略的に表されている。この方法は、実施した（参 照、実施例１１）スメグマ菌（Ｍ。

ｓｍｅｇｍａｔ　ｉ　ｓ）中の６５ｋＤのらい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）遺伝子で あるＤＮＡの組み込みをとくに参照して記載する。しかし７ながら、同一アプロ ーチを使用して、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）の６５ｋＤの遺伝子を他のマイコ バクテリアの中に導入することができ、ならびに免疫応答をめるｏｒｔポリペプ チドまたはタンパク質をエンコードするＤＮＡをウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　 ５）−ＢＣＧ、スメグマｍ　（Ｍ、ｓｍｅｇｒｎａｔ　ｉ　ｓ）またはマイコバ クテリアの中に組み込むことができる。

選択した抗原（Ｆａｎと表示する、外来抗原について）をエンコードするＤＮＡ の組み込みは、第１３図に表されている。適当なプラスミドベクター（例えば、 Ｅ、ｃｏｌｔの中で複製するが、マイコバクテリアの中で複製しないもの）、例 えば、第１３図に表されている組み換えｐＵＣ１９プラスミドを使用する。組み 換えプラスミドは、マイコバクテリアの遺伝子またはＤＮＡ配列、例えば、第１ ３図に表されているｐｙｒＦ遺伝子を包含する；この遺伝子中の配列は、マイコ バクテリアのゲノム中のものに相同し、プラスミドを有するマイコバクテリアの 配列とゲノムのマイコバクテリアの配列との間で起こるべき相同的組み換えのた めの基準を提供する。組み換えプラスミドは、また、Ｅ、ｃｏｌｉ中の複製およ び選択のために必要なりＮＡ配列およびマイコバクテリア中の選択のために必要 なりＮＡ配列を包含する。選択において使用する配列は細胞に明確な表現型を与 え、こうしてその遺伝子を含有する細胞の同定および分離を可能とする。遺伝子 は、例えば、薬物抵抗性をエンコードすることができる。第１３図において、組 み換えプラスミドはカナマイシン抵抗性を与える遺伝子を包含し、こうしてカナ マイシンを含有する培地上で単に培養することによって、その遺伝子を含有する マイコバクテリアの選択を可能とする。組み換えプラスミドは、また、マイコバ クテリアのゲノムのＤＮＡの中に組み込まれる、それに対する免疫応答を望む１ または２以上のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードするＤＮＡ　（Ｆａ ｎと表示する）を含有する。

本発明の１つの実施態様において、Ｆａｎがらい５ｇ（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）の遺 伝子である、第１３図に表されるような組み換えプラスミドを使用することによ って、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）の６５ｋＤの遺伝子をスメグマ菌（Ｍ、ｓｍ ｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）のゲノムのＤＮＡの中に組み込んだ。

組み換えプラスミド（例えば、６５ｋＤのらい菌（λ４．Ｉｅｐｒａｅ）の遺伝 子およびＫａｎ遺伝子が挿入されたＰ　ｙ　ｒ　Ｆ遺伝子を含有するプラスミド ）を、標準のエレクトロボし・イション技術を使用して、マイコバクテリアの細 胞（スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ））の中に導入した。（参照、 実施例１１）。次いで、工し・りトロポし・イションした細胞をカナマイシンを 含有する培地上に配置した。カナマイシン抵抗性（ＫＡＮ’）の細胞のみがこれ らの条件下に増殖した；このような細胞はゲノムのＤＮＡの中に組み込まれ、Ｋ ＡＮ’遺伝子およびらい菌（〜１゜１ｅｐｒａｅ）の遺伝子は、また、Ｆ（’） Ａ’であった（組み換えプラスミドからおよびマイコバクテリアからのＰｙ　ｒ Ｆ遺伝子が崩壊したために）。

細胞を引き続いてＦＯＡを含有する培地に移して、Ｆａｎ遺伝子（ここで、らい 菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）遺伝子）がゲノムのＤ　Ｎ　Ａの中に安定に組み込まれ た細胞を同定した。第１３図の下のパネル（左側）に示されているように、カナ マイシン抵抗性遺伝子およびＦａｎ遺伝子を含有する崩壊したＰｙｒＦ遺伝子を 、このような細胞のゲノムのＤＮＡ　（Ｋ、八Ｎ′、ＦＯＡ’）の中に組み込む 。下のパネルの右側に示されているように、ルーピングアウトが起こり、その結 果ゲノムの中に完全な外来遺伝子のみが残る、マイコバクテリアの細胞はカナマ イシン感受性でありかつフルオロ−オロチン酸感受性である。

こうして、上にそして実施例１１に記載するように、タンパク質抗原をエンコー ドするをマイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの中に組み込むこと、および安定に 組み込まれた問題のＤＮＡを含有する試料を同定および選択することが可能とな っ１こ。さらに、このような問題のＤＮＡはマイクバクテリアのゲ７！ムの中の 選択した部位（この場合において、ＰｙｒＦ遺伝子の部位）に組み込ま第１た。

この同一のアプローチは、もちろん、問題のＤＮＡをマイコバクテリアのゲノム のＤＮＡ上の他の選択した部位の中に組み込むために使用できる。この場合にお いて、組み込みを望む、ゲノム上の部位を選択することができる。選択し、たゲ ノムの配列に対して相同性であるか、あるいはそれに十分に類似する配列：問題 のＤＮＡ；Ｅ、ｃｏｌｉ中の複製および選択に必要な配列：およびマイコバクテ リア中の選択に必要なりＮＡ配列を含有する組み換えプラスミドは、前述したよ うにして、構成することができる。問題のＤＮＡはマイコバクテリアのゲノムの ＤＮＡの中に安定に組み込むことができ、そして、前述と同一方法で、安定に組 み込まれた問題のＤＮＡを含有する細胞を選択することができる。

マイコバクテリア中の発現をのぞむ、遺伝子のすべてまたは一部分をマイクバク テリアの中に、同一方法を使用して、導入することができる。

すなわち、次の方法を使用して、問題のマイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの中 に安定に組み込むことができる。

Ｅ、ｃｏｌｉの中で複製するが、マイコバクテリアの中で複製することができな い、組み換えプラスミドベクターは、次のものを包含する＝１、　組み換えプラ スミドで形質転換されたマイクバクテリアのゲノムの中の相同配列との組み換え に必要な、マイコバクテリアの遺伝子、またはその一部分。

２、　組み換えプラスミドで形質転換されたマイコバクテリアの中で、その発現 を望む、ポリペプチドまたはタンパク質をエンコードする遺伝子のすべてまたは 一部分； ３、　Ｅ、ｃｏｌｉ中の複製および選択に必要なりＮＡ配列：および ４、　マイコバクテリア中の選択に必要なりＮＡ配列（例えば、薬物抵抗性）。

この組み換えプラスミドを使用して、マイコバクテリアの細胞、例えば、スメグ マ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）またはウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉ　５ ）−ＢＣＧを形質転換する。組み換えプラスミドは、既知の技術を使用して、マ イコバクテリアの細胞の中に導入される。１つの実施態様において、プラスミド をエレクトロボレイションにより、標準のバクテリアのエレクトロボレイション 手順を使用して導入する。（参照、実施例１１）。

エレクトロボレイシヨンした細胞を、組み込むがその中で起こった細胞の選択を 可能とする条件下に平板培養する。前述したように、プラスミドは薬物抵抗性、 例えば、カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子を含有することができる。

その場合において、エレクトロボレイシヨンした細胞をカナマイシンを含有する 培地上で平板培養する。プラスミドＤＮＡが組み込まれた細胞である、カナマイ シン抵抗性（ＫＡＮ’）細胞のみはこれらの条件下に生き残るであろう。

引き続いて、生き残る細胞を、問題のＤＮＡがゲノムのＤＮＡの中に安定に組み 込まれた細胞の同定および選択を可能とする条件下に、平板培養する。ＰｙｒＦ 遺伝子が問題のＤＮＡの挿入により崩壊している場合において、生き残る細胞を ＦＯＡを含有する培地上に平板培養し、これにより、細胞がＦＯＡ’である（こ うし、て、このような培地の中で増殖する）ために分割が起こった細胞を同定す ることができる。

それに対する免疫応答を望み、組み換えプラスミドの中に存在するポリペプチド またはタンパク質をエンコードするＤＮＡは、それが事実存在する源から分離す ることができ、この源は標準の遺伝子操作技術により、適当な宿主の中で産生さ れるか、あるいは化学的または機械的に合成される。同様に、相同的組み換えに 必要なプラスミドを有するＤＮＡ配列は、それが事実存在する源から分離するこ とができ、この源は標準の遺伝子操作技術によるか、あるいは化学的または機械 的に合成される。

組み込まれた問題のＤＮＡを含有するマイコバクテリアの細胞の選択のための基 準として働く特性は、記載したように、薬物抵抗性であることができる。遺伝子 は、例えば、カナマイシン抵抗性、ビオマイシン抵抗性、チオストレプトン抵抗 性、ヒグロマイシン抵抗性またはプレオマイシン抵抗性をエンコードする。ある いは、栄養要求変異種の方法を使用することができ、こうして選択は組み込みが 起こったマイコバクテリアが、適当な培地上で増殖するとき、生き残る能力に基 づく。

マイコバクテリアの遺伝子（例えば、ＰｙｒＦ）を薬物抵抗性および問題のＤＮ Ａにより崩壊する、前述のものに対する別のアプローチは、前に記載した方法の 結果として起こるような、追加の配列を使用せずに（例えば、Ｋａｎ遺伝子を使 用せずに）問題のＤＮＡをマイコバクテリアのゲノムの中に組み込むアプローチ である。この方法は第１４図に表されている。

この方法において、それ以上の操作および問題のＤＮＡの導入の標的である、組 み換えマイコバクテリアの細胞をまず産生ずる。これは、例えば、マイコバクテ リアのＰｙｒＦ遺伝子をカナマイシン抵抗性の遺伝子で正確に置換することによ って、天施することができる。標準のＤＮノ＼技術をこの置換手順において使用 し１、−こでＰ　ｙ　ｒ　Ｆ遺伝子をフランキングする配列を使用（、てＫａｎ 遺伝Ｐを挿入する。組み換えプラスミド（ここでＰｙｒＦ遺伝子がＫａｎと置換 されている）を、標準のエレクトロポ１ノイション方法を使用して、マ・イコバ クテｌ＋７の細胞の中に導入する。生ずるエレクトロポレイシヨンした細胞をカ ナマイシンを含有するがウラシルを含有（、、ない培地上で平板培養する。カナ マイシン抵抗性遺伝子およびゲ５ツムのＰｙｒＦ遺伝子の両者が存在する、マイ コバクテリアの細胞をこの時点において選択する。すべての他の細１１ｆｉ　（ ＫＡＮ’Ｕｒａ−：ＫＡＮ’Ｕｒａ−：ＫＡＮ’Ｕｒａ”）は死亡するであろう 。第１４図に示すように、これはＵＲＡ−およびＦＯＡ’である（それらはＰｙ ｒＦ遺伝子を含有しないために）ならびにＫＡＮ’　（組み込まれたＫａｎ遺伝 子のために）であるマイコバクテリアの細胞の選択を生ずる。

このようにして産生されたマイコバクテリアの細胞は、この方法においてそれ以 上の操作のための標的（標的マイコバクテリアの細胞）として、既知の技術を使 用して使用し、これにより問題のＤＮＡ、および完全なＰｙｒＦ遺伝了をマイコ バクテリアのゲノムのＤＮＡの中に組み込む。第１５図に示すように、前述のも のおよび実施例１０におけるもの類似し、完全なＰｙｒＦ遺伝子および問題のＤ ＮＡ（ＰｙｒＦ遺伝子の１端の次にまたは直後）を包含する、組み換えプラスミ ドを使用する。

組み換えプラスミドを、標準の技術（例えば、エレクトロボレインヨン）を使用 して、「標的」マイコバクテリアの細胞（これはＫａｎ遺伝子を含むが、Ｐｙｒ Ｆ遺伝子を含まない）の中に導入する。相同的組み換えは、配列の間で、標的マ イコバクテリアの細胞の中に存在するＫａｎ遺伝子の１つの側に対して、および 組み換えプラスミドの中に存在するＰｙ　ｒ　Ｆ遺伝子の１つの側で起こり、第 １５図に示すように、標的マイコバクテリ゛ｒの細胞の中にＰｙｒＦ遺伝子のゲ ノム−問題のＤ　Ｎ　Ａの組み合わせを組み込む。

エレクトロポレイシヨンした細胞を、カナマイシンを含有するが、ウラシルを含 有しない培地上で平板培養する。Ｋａｎ遺伝子およびＰｙｒＦ遺伝子（それらと ともに問題のＩ）　Ｎ　Ａが細胞に入った）を含有する細胞のみは、これらの条 件下に生き残るであろう。引き続いて、添加したウラシルを含有しない生き残る 細胞の培養は、第１５図に示すように、それらのゲノムの中にＰｙｒＦ遺伝子− 問題のＤＮＡの組み合わぜを組み込んで有するもののみを増殖させる。

問題のＤＮＡがマイコバクテリアの中で発現するその能力を生ずる源からである 場合において、発現カセットを使用することができる。発現カセットはマイコバ クテリアのプロモーターおよびリポソーム結合部位を含有するすることができ、 これらは問題のＤＮＡの発現を制御する発現シグナルとして働くであろう。第１ ６図に示すように、発現カセットはＰｙｒＦ遺伝子を取り囲む配列の中にポリリ ンカーを含むことができる。結局、問題のＤＮＡは挿入されることができ、モし てマイコバクテリアのシグナルはその発現を制御するであろう。ＰｙｒＦ−発現 カセット−問題のＤＮＡの組み合わせがその中に安定に組み込まれるマイコバク テリアの細胞の選択は、第１５図に関して前述したように実施することができる 。

問題のＤＮＡをマイコバクテリアのゲノムの中に組み込むことができる、わずか に異なるが、関係する方法は、既知の技術を使用して、通常存在するＰｙｒＦ解 読配列を除去したマイコバクテリアを使用する。問題のＤＮＡ　（ＰｙｒＦの１ 端にまたはその付近に位置する）と組み合わせて完全な（非崩壊）ＰｙｒＦ遺伝 子を含む以外、前述の方法に類似する組み換えプラスミドを、ＰｙｒＦを欠失し たマイコバクテリア（例えば、エレクトロポレイションにより）の中に導入する 。完全なＰｙｒＦ遺伝子（および、こうして、問題のＤＮＡ）を含有する細胞は 、ウラシルを含有しないエレクトロボレイシヨンした細胞を培養することによっ て同定する。ＰｙｒＦ遺伝子を含有する細胞にのみが生き残るであろう。

引き続いて、ウラシルを含有しない培地上の増殖は、また、ルーピングアウトが Ｐｙ　ｒＦおよび問題のＤＮＡをマイコバクテリアのゲノムの中に安定に組み込 ませた、細胞を同定するであろう。

ＰｙｒＦがＫａｎ遺伝子と置換されているか、あるいはＰｙｒＦがマイコバクテ リアのゲノムから欠失されている、これらの後者のアプローチの両者の結果は、 生ずる組み換えマイコバクテリアのゲノムが機能的ＰｙｒＦ遺伝子および問題の ＤＮＡを包含するが、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子（例えば、Ｋａｎ）ま たは他の選択可能なマーカーを含有しないことである。

本発明のシャトルベクターおよび方法の使用および利点の外観本発明のプラスミ ドおよびプラスミドベクター、ならびにそれらを使用する本発明の方法について 多数の用途が存在する。これらを後述し、そしてワクチンのベヒクルの構成にお けるそれらの使用を次の節において記載する。マイコバクテリアの中に導入され たＤＮＡを発現した、本発明の方法の結果、病気の病原性の問題を理解すること についての新規な遺伝子手順は現在利用可能である。ファージまたはプラスミド ベクターの系を使用して、相同的組み換えによるか、あるいはトランスポゾン仲 介挿入または欠失により、ビルレンスおよび病原性に要求される、特異的遺伝子 機能を同定することを目的として、病原性マイコバクテリアの遺伝子を挿入的に 突然変異誘発しかつマーキングすることができるべきである。例えば、これらの ベクターおよびマイコバクテリア（例えば、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ 　ｉ　Ｓ）　、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ）を使用して、ヒト結核 菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）またはらい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）のビル レンス遺伝子を同定し、そして診断（診断試験）を開発することができる。それ の遺伝子を特異的に欠失または置換することによって、現在のウシ結核菌（Ｍ、 ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧのワクチンより結核に対してより特異的かつ有効な弱 毒化したワクチンを開発することができる。あるいは、結核およびらいに対して 特異的な保護的抗原を抵抗性個体からのＴ細胞により認識される抗原の研究によ り同定されるので、現在存在するウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧワクチ ンの中にそれらを導入しそして発現することが、今回、可能である。

本発明のベクターは、まず、マイコバクテリアの中でゲノムのライブラリーの構 成を可能とする。これは、病原性マイクバクテリアのための抗原または酵素また は薬物の標的を同定するとき、と（に有用である。

例えば、らい菌（Ｍ、］ｅｐｒａ、ｅ）において、ゲノムのＤＮＡを切りそして クローニングして、全体のゲノムのＤＮＡが含まれることを確実にする。主題の ベクターを使用して、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）の断片のライブラリーをまず バクテリアの宿主、例えば、Ｅ、ｅｏｌｉの中に導入し、ここでそれを発現する 。引き続いて、それはマイコバクテリウム（例えば、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇ ｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）　、ＢＣＧ）の中に動く。結局、ライブラリーはマイクバク テリアの宿主の中に存在し、こうしてマイコバクテリアの抗原、酵素、薬物の標 的および診断プローブの探索をより効率よくする。

ショットガンのアプローチを使用して、ＤＮＡをＢＣＧの中に導入し、そして遅 く増殖するマイコバクテリアである、現在入手可能なりＣＧより速（クローンを 増殖させることができる遺伝子を含有するクローンを同定することができる。引 き続いて、この方法において同定された遺伝子を使用して、現在使用されている ＢＣＧより速く増殖するＢＣＧを産生ずることができる。同様なアプローチを使 用して、らい菌（Ｍ、Ｉｅｐ　ｒ　ａ　ｅ）の遺伝子を培養可能なマイコバクテ リウムの中にクローニングし、そして増殖する組み換え細胞を同定することがで きる。このアプローチを使用して、培養可能なマイコバクテリウムかららい閑（ Ｍ、］ｅｐｒａｅ）をつくり、こうして病原体を産生ずるという現在の困難を軽 減することができる。

本発明のベクターを、また、使用して、結核またはらいの予防または処置のため の新規な薬物を同定することができる。例えば、薬物をそれに対して向けらるべ き標的は、病原性マイコバクテリウムにより産生さ第１る酵素（例えば、ジャイ レース）である。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）中の対応する酵 素をエンコードする遺伝子は、主題のベクターを使用して、ヒト結核菌（Ｍ、ｔ ｕｂｅｒｃｕ！ｏｓｉｓ）またはらい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）の酵素をエンコー ドする遺伝子と置換することができる。これにより、酵素に対して有効な薬物（ ならびに鴎結核菌（Ｍ、ａ　ｖ　ｉ　ｕｍ）およびマイコバクテリウム・イント ラセルラレ（Ｍｙｅｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　１ｎｔｒａｃｅｔｌｕｌａｒｅ）） を同定するための試験のために使用できる、組み換えスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇ ｍａｔｉｓ）が産生ずる。

ここで記載する遺伝子のアプローチは、カナマイシン抵抗性をエンコードするａ ｐｈおよびｎｅｏ遺伝子の両者がウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｊｓ）−ＢＣＧのワク チンの菌株の中で安定に発現されることができる（そして発現された）ことを明 瞭にする。

ここに記載する研究の結果として、選択可能なマーカー（選択の基準することが できる、同定可能な特性をエンコードする遺伝子）は今回マイコバクテリアのた めに入手可能である。３つのこのようなマーカーは、今回マイコバクテリアのた めに入手可能である：クロランフエニコールアセチルトランスフエラーゼまたは ｃａｔ遺伝子、これはクロランフェニコール抵抗性を与える；２）Ｔｎ９０３か らのアミノグリコシドホスホトランスフ２ラーゼまたはａｐｈ遺伝子、これはカ ナマイシン抵抗性を与える；およびｃｌ遺伝子、これはＬ１バクテリオファージ のリプレッサータンパク質をエンコードする。適当な薬物を含有する培地の増殖 は、ｃａｔまたはａｐｈ遺伝子を含有するマイコバクテリアを選択する薬物抵抗 性遺伝子の場合において使用する。培養するとき形成するプラークの外観（曇り または透明）に基づく変動の選択は、ｃＩ遺伝子を選択に使用する場合において 使用する。

また、ここに記載する研究の結果として、清涼性および部位特異的組み換えは、 マイコバクテリアの染色体のＤＮＡ上のおよびマイコバクテリアのファージ上の 、特異的部位、組み込み部位（ａｔｔａｃｈｍｅｎｔ　５ｉｔｅ）として知られ ている、またはａｔｔ部位の間で起こることが示された。ファージラムダで感染 したバクテリアにおいて、ファージＤＮＡの生理学的状態は溶菌および清涼性の 状態において異なる。これらの状態の１つから他の状態への変化は、部位特異的 組み換えを包含する。宿主ＤＮＡの中へのラムダＤＮＡの組み込み（プロファー ジＤＮＡとなる遊離のラムダＤＮＡを生ずる）は、清涼性が起こるために起こら なくてはならない；逆に、宿主の染色体からのプロファージＤＮＡの切り出しは 溶菌が起こるために起こらなくてはならない。組み込みおよび切り出しは部位特 異的組み換えを包含する。この現象はバクテリアのいくつかの属について知られ ているが、これはそれがマイコバクテリアについて実証された最初である。それ は、問題のＤＮＡがマイコバクテリアの中に効率よくかつ安定に組み込むことが できる手段として使用することができる。

例えば、これはｅｏｓ−ａｔｔベクターと呼ぶものを使用して達成することがで きる。このようなベクターは、次のものを包含することができる：１）Ｅ、Ｃｏ １１または複製の他の適当なバクテリアの由来；２）Ｅ、ｃｏｉｉまたは他のバ クテリアの宿主中の選択のための、選択可能なマーカー、例えば、アンピンリン 抵抗性をエンコードする遺伝子；３）テンペレートファージのａｔｔ領域、例え ば、Ｌｌ；　４）ラムダｃｏｓ部位、ラムダ生体外パッケージング系を使用する ことができるために；および５）選択可能なマーカー、例えば、カナマイシン抵 抗性、クロランフェニコール抵抗性をエンコードする遺伝子またはファージＬ１ のＣＩリプレッサーをエンコードする遺伝子。ベクターは、既知の技術およびこ こに記載する技術を使用して構成することができる。ベクターの組み込みを仲介 するために必要な遺伝子は、同一ベクター上に存在することができるか、あるい は途中で設けることができる。

ここに記載する研究は、マイコバクテリア（例えば、スメグマ菌（Ｍ。

ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）、ＢＣＧ）の中で染色体外で複製するプラスミドの レプリコンの同定を生ずる。記載するように、ｐＡＬ５０００レプリコンが同定 された。同一方法を使用して、また、使用することができる他のものを同定する ことができる。

記載する研究は、また、組み換えＤＮＡ分子である、Ｅ、ｃｏｌｉマイコバクテ リアのシャトルプラスミドの首尾よい構成を実証し、そして組み換えＤＮＡ分子 はＥ、ｃｏｌｉの中でプラスミドとして複製しかつマイコバクテリアの中でファ ージとして複製する能力を有するばかりでなく、かつまたバクテリオファージラ ムダのヘッドの中にまたはマイコバクテリオファージ粒子の中にパッケージング される能力を有する。研究において、さらに、組み換えＤＮＡは急速に増殖する マイコバクテリウム（スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）　）およ び遅く増殖するマイコバクテリウム（ＢＣＧ）の両者の中に導入されたことが実 証された。

これにより、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧのワクチンの菌株をシャト ルプラスミドで感染することおよび、こうして、クローニングした遺伝子をマイ コバクテリアの中に導入することができる。こうして、これはＢＣＧのためにト ランスフェクション系を開発する必要性を排除する。すなわち、Ｅ、ｃｏｌｔ− マイコバクテリアのシャトルプラスミドは、マイコバクテリアの中にトランスフ ェクションすると、マイコバクテリアの粒子の中にパッケージングされるので、 問題のＤＮＡをトランスフェクションよりむしろ形質導入により遅く増殖するマ イコバクテリア（例えば、ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−ＢＣＧ）の中に 安定に導入することができる。これにより、問題の１または２以上の抗原に対し 、て免疫化するために使用することができる、組み換えマイコバクテリアのワク チンのベヒクルを産生ずることができる。

これらのプラスミドを構成するために生体外パッケージングの使用は、パッケー ジング系の大きさの限界を越えないかぎり、遺伝子（例えば、それに対する免疫 応答を望む１または２以上の病原体のための１または２以上の抗原をエンコード する遺伝子またはＤＮＡ）をこれらのベクターの中にクローニングする効率よい 方法として拡張することができる。

追加のＬｌ：　：　ｐＨＣ７９組み換えプラスミドをスクリーニングすることに よって、Ｌｌファーンから欠失することができるＤＮＡの最大量を決定すること 、およびその中にＤＮＡを挿入することができる、ファージのゲノムの追加の非 必須領域を定めることが、また、可能であるう本発明の方法は、マイコバクテリ ウムの中に組み込まれた問題のＤＮＡによりエンコードされる１または２以上の タンパク質またはポリペプチドの発現のための、遺伝子的に組み換えのマイコバ クテリアのベヒクルを構成するために有用である。このような遺伝子的に組み換 えのマイクバクテリアは多数の用途を有する。

本発明のベヒクルは、例えば、問題のＤＮＡによりエンコードされる病原性抗原 に対する免疫性を誘発するためのワクチンとして、使用することができる。病原 体は、病気を引き起こす、任意のウィルス、微生物、または他の有機体または物 質（例えば、毒素）である。らいに対する免疫化のために有用なワクチンのベヒ クルをつくることができる。マイコバクテリア、例えば、ＢＣＧの例外的なアジ ュバントの活性のために、このようなワクチンは、とくに長期間のまたは耐久性 の性質の、細胞仲介免疫性の産生において有効である。らいの寄生体らい菌（Ｍ 、］ｅｐｒａｅ）のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子は、ヤング（Ｙｏｕ ｎｇ）により分離され、そして同時係属米国特許出願箱８９２，０９５号、１９ ８６年７月３１日提出、その教示を引用によってここに加える、に詳細に記載さ れている。とくに、５つの免疫原性タンパク質抗原（すなわち、分子量６５ｋＤ 、３６ｋＤ、２８ｋＤ、１８ｋＤおよび１２ｋＤの抗原）をエンコードする遺伝 子が分離された。さらに、６５ｋＤ抗原のための遺伝子によりエンコードされる ６つの異なるエピトープが定められた。これらの少なくとも１つのエピトープは らい菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａ、ｅ）に対して独特であることが示された：他のエピト ープは他のマイコバクテリアの６５ｋＤタンパク質と共有されることが示された 。

本発明のシャトルベクターおよび組み換えプラスミドベクターの使用により、前 述の方法および次の実施例の方法を使用して、ＢＣＧの中にらい菌（Ｍ、Ｉｅｐ ｒａｅ）タンパク質抗原をエンコードする１または２以上の遺伝子を導入するこ とができる。６５ｋＤのらい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）タンパク質をエンコードす る遺伝子は、事実、組み換えの中に導入されそして組み換えＢＣＧにより発現さ れた。ウェスタン・プロット分析の結果（第１７図）は、６５ｋＤのらい菌（Ｍ 、１ｅｐｒａｅ）抗原および選択可能なマーカーの両者の存在を実証した。例え ば、６５ｋＤらい菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）抗原をエンコードする遺伝子はＢＣＧ の中に導入し、そのゲノムのＤＮＡの中に安定に組み込み、そしてそれを投与し た宿主において免疫応答を刺激または導入ために十分なレベルで発現することが できる。実施例１１に詳細に記載されているように、６５ｋＤのらい菌（Ｍ、１ ｅｐｒａｅ）タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を使用して、遺伝 子をその中に導入したスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の抽出物 の中で６５ｋＤのらい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）遺伝子の発現を実証した。さらに 、５ＩＶＩエンヴエローブタンパク質をエンコードする遺伝子を、Ｋａｎおよび らい菌（Ｍ、１ｅ　ｐ　ｒ　ａ　ｅ）の遺伝子について記載した技術を使用して 、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中に導入すべき、同様なプ ラスミドベクターの中にクローニングした。同様な構成体を、ＢＣＧの中に導入 するために、また、つくった。このようにして、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）の １または２以」二の保護的抗原を含有し、寛容性決定因子もたず、そして細胞仲 介免疫性を誘発するためにきわめてすぐれたアジュバントを有することにおいて 、理想的に近いワクチンを構成することができる。

同様な方式で、本発明のシャトルまたはプラスミドのベクターおよび方法を使用 して、ワクチンを構成し、結核に対する特異的保護を提供することができる。こ のようなワクチンは、前述したように、現在使用されているワクチンが無効であ ることが証明されているという最近報告された発見を考慮すると、とくに魅力的 である。結核のバチルス属のヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の免 疫原性タンパク質抗原をエンコードする遺伝子は、次の出願に記載されている二 同時係属米国特許出願第０７１０１０，００７号、発明の名称「ヒト結核菌のタ ンパク質抗原をエンコードする遺伝子およびその使用Ｊ　（Ｒｏｂｅｒｔ　Ｎ。

ＨｕｓｓｏｎおよびＲｉｃｈａｒｄ　Ａ、Ｙｏｕｎｇ）、１９８７年２月２日提 出（現在放棄された）、および一部継続米国特許出願第０７／１５４．３３１号 （１９８８年２月１０日、エキスプレス・メイル・プロセジュア−（Ｅｘｐｒｅ ｓｓ　Ｍａｉ　ｌ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）により提出された）、発明の名称「ヒ ト結核菌のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子およびその使用Ｊ　（Ｒｏｂ ｅｒｔ　Ｎ、ＨｕｓｓｏｎＳＲｉｅｈａｒｄ　Ａ、￥ｏｕｎｇおよびＴｈｏｍａ ｓ　Ｍ、５ｈｉｎｎｔｃｋＬそれらの教示を引用によってここに加える。

この場合において、ヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）の免疫原性タ ンパク質抗原をエンコードする遺伝子を、前述したように、シャトルまたはプラ スミドのベクターによりＢＣＧの中に導入する。また、各々がタンパク質抗原を エンコードする、１より多いヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）遺伝 子をＢＣＧの中に導入することができる。例えば、分子量１２ｋＤ、１４ｋＤ、 １９ｋＤ、６５ｋＤおよび７１ｋＤの免疫原性ヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕ ｌｏｓｉｓ）抗原、またはこれらの遺伝子の２またはそれ以上の組み合わせをＢ ＣＧの中に挿入し、ゲノムのＤＮＡの中に安定に組み込み、そして発現すること ができる。結核に対する免疫化に対して特異的であり、そしてバチルス属に対す る長期間持続する免疫性を誘発するワクチンが得られる。

また、本発明の方法を使用して、多目的的または多機能的ワクチン（すなわち、 各遺伝子が異なる病原体または毒素のためのタンパク質抗原をエンコードする、 １より多い遺伝子を含む問題のＤＮＡをを含有しかつそれを発現する、単一のワ クチンのベヒクル）を構成することができる。

例えば、記載したシャトルベクターのプラスミドまたはプラスミドベクターを使 用して、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子 、ヒト結核菌（λ４．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）のタンパク質抗原をエンコー ドする遺伝子、レイシュマニアの抗原をエンコードする遺伝子、およびマラリア のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子をＢＣＧの中に導入することができる 。この多価ワクチンの投与は、各抗原に対する免疫応答を刺激し、モしてらい、 結核、レイシュマニアおよびマラリアに対する長期間の保護を提供するであろう 。

組み換えマイクバクテリアは、また、抗受精「ワクチン」のベヒクルとして使用 することができる。例えば、ヒトの成長ホルモン（ＨＧ　Ｈ）の断片のような抗 原をエンコードするＤＮＡを含有しマイクバクテリアを、抗受精ワクチンとして 使用し、そして産児制限剤として投与することができる。本発明のワクチンのベ ヒクルはヒトの癌、例えば、膀胱癌または黒色腫を処理する（例えば、増殖阻害 因子または殺細胞産生物の発現により）ために使用することができる。これに関 して、インターフェロンα、βおよび／／またはγ、１または２以上のインター リューキン（インターリューキン１〜７）および／またはＴＮＦαまたはβを含 有しそしてそれらを発現する組み換えマイクバクテリアはとくに有用である。

他の応用において、組み換えマイコバクテリアを使用して、保護的免疫応答（例 えば、引き続くまたは長期間の感染に対する）を引き出す目的で、あるいは自己 免疫病（例えば、慢性関節リウマチ）における耐性を誘発する目的で、ストレス タンパク質を発現するために使用することができる。ストレスタンパク質、例え ば、同時係属米国特許出願第２０７゜２９８号、発明の名称「ストレスタンパク 質およびその使用Ｊ（Ｒｉｃｈａｒｄ　Ａ、ＹｏｕｎｇおよびＤｏｕｇｌａｓ　 Ｙｏｕｎｇ）、１．９８８年６月１５日提出、に記載されているものを、この目 的に使用することができる。それらのゲノムは大きい（例えば、ＢＣＧゲノムは 約３ｘ　１０”ｂ　ｐの長さである）ために、マイコバクテリアは大量の問題の ＤＮＡを収容しそし、て、こうして、多目的ベヒクルとして働くことができる。

本発明の組み換えマイコバクテリアを使用して、問題の１または２以上のポリペ プチド、例えば、ステロイドを産生ずることができる。この場合において、ステ ロイドをエンコードする遺伝子のすべてまたは一部分を適当なマイコバクテリア の宿主の中に導入し、ここでそれを発現する。こうして、組み換えマイコバクテ リアはこのようなタンパク質を産生ずる価値ある手段を提供する。

さらに、本発明のシャトルベクターおよび遺伝子的に組み換えのマイコバクテリ アは診断において使用することができる。例えば、病原性有機体（例えば、ヒト 結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、鳥結核菌（Ｍ、ａｖ　ｉ　ｕｍ）　 ）に対して特異的であり（問題のＤＮＡを導入することができる）そしてリポー タ−分子をエンコードするＤＮＡ　（例えば、ビブリオバクテリアからのまたは ホタルのルシフェラーゼ：β−ガラクトシダーザ；β−グルコシダーゼ：カテコ ールデヒドロゲナーゼ）および強いマイコバクテリアのプロモーター（転写の開 始に必要なりＮＡ配列）を包含し、リポータ−分子をエンコードする遺伝子の発 現を制御（推進）するシャトルプラスミドを構成する。病原性有機体の存在また は不存在について評価すべき個体から試料（例えば、血液または尿）を得る。例 えば、個体を結核について試験する場合、ヒト結核菌（Ｍ。

ｔｕｂｅ　ｒｅｕ　ｌｏｓ　ｉ　ｓ）に対して特異的なシャトルプラスミドを使 用する。試料を培養し、そして適当な量のヒト結核菌（Ｍ、ｔ　ｕ　ｂ　ｅ　ｒ ｃｕｌｏｓｉｓ）特異的プラスミドと組み合わせる。適当な条件下に短時間（例 えば、数時間）後、試料を、既知の技術を使用して、ベクター中のＤＮＡにより エンコードされるリポータ−分子の発生（存在または不存在または必要に応じて 、量）についてアッセイする。試料が、非常に低いレベルでさえ、ヒト結核菌（ Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）を含有する場合、ファージの中に存在するＤＮ Ａは有機体の中に導入されるであろう。いったん試料の中にヒト結核菌（Ｍ、ｔ ｕｂｅｒｃｕｌ。

５ｊｓ）が存在すると、リポータ−分子をエンコードするものを包含する、プラ スミド（ファージ）ＤＮＡは複製されるであろう。リポータ−分子がルシフェラ ーゼである場合、かなりな量のルシフェラーゼは産生され（産生は強いプロモー ターにより推進されるので）そして研究装置、例えば、フォトメーターを使用し て検出することができる。個体におけるヒト結核菌（Ｍ、ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ ｉｓ）の感染の存在または不存在の決定は可能であり、同様に必要に応じて定量 は可能である。本発明の方法が開発されるまで、結核を診断する利用可能な技術 は遅かった（例えば、敗退を要した）。今回マイコバクテリアの中で発現された 、β−グルコシダーゼは、また、リポータ−分子として使用することができる。

タンパク質またはポリペプチドを発現するための使用のいずれにおいても、シグ ナル配列をエンコードするシャトルベクターのＤＮＡを含めることが可能であり 、こうして、発現されたタンパク質またはポリペプチドを細胞雪中につくり、次 いで細胞壁において分泌する手段を提供することができる。例えば、マイコバク テリアの中で分泌するα抗原からシグナル配列を使用することができるであろう 。あるいは、β−がラクトシダーゼ、アガロースまたはα−アミラーゼのための シグナル配列を使用するすることができるであろう。

次の実施例によって、本発明をここで説明する。これらの実施例はいかなる方法 おいても限定的に考慮すべきではない。

実施例１ マイコバクテリオファージＤ２９　ＤＮＡを使用するスメグマ菌（Ｍ。

ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）スフェロプラストのトランスフエクションスメグマ 菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）菌株ｍｃ”５のスフェロプラストを、次 の方法に従い調製した。ｍｃ”ｆ３は単一のコロニーの分離物であり、ＡＴＣＣ ６０７スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）原培養物から分離した主な コロニーの型である。それは再生培地上でオレンジ色の粗いコロニーを形成する 。ホブウッド（Ｈｏ　ｐｗｏ　ｏ　ｄ）　、Ｄ。

Ａ、ら、ストレプトミセス属の遺伝子操作−実験室のマニュアル（Ｇｅｎｅｔｉ ｃ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ−Ａ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎ、ｕａ、Ｉ）、ＴｈｅＪｏｈｎ　Ｉｎｎｅｓ　 Ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ１英国ノーウィッチ（１９８５）。

スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）のスフェロプラストを、スメグ マ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　Ｎ　ｓ）についてウドゥ（Ｕｄｏｕ）らにより 記載されたスフェロプラストの調製のための培地を使用して、ストレプトミセス 属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）について調製した。ウドゥ（Ｕｄｏｕ）Ｔ、ら 、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、ＢａｃｔｒｉｏｌｏｇｙＬ月け： 　１０３５−１０３９　（］９８２）。適度の震盪を有する２５０ｍ１のバッフ ル付きフラスコ内で４０ｍ１の１％のグルコースおよび０．　２％のツイーン８ ０を含有するトリプシン大豆ブロスの中で、ｍｃ２５細胞を３７℃においてＡ６ ゜ｏ＝０．２に増殖させ、この時２０％のゲリンシ溶液を１％の最終ａ盲に添加 した。細胞をさらに］、６時間・インキュベーショ〉′シ、次いで室温において ５０００Ｘｇで１０分間遠心することによって収穫した。沈澱を１０　ｍ　ｌの １０３％のスクロースで２回洗浄し、、次いで２ｍｇ／ｍｌのりゾチーム溶液を 含有する原形質体（ｐ）の緩衝液の中に再懸濁した。３７℃において２時間イン キュベーションした後、５ｍｌの緩衝液を添加し、そしてスフェロプラストを３ ０００Ｘｇにおいて７分間遠心することによって沈澱させた。沈澱を１０ｍ１の ｐ緩衝液の中に再懸濁させ、そして３時間以内に使用した。

ｍｃ２−１１をＡＴＣＣ６０７スメグマ菌（Ｍ、　ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ ）原培養物の自発的Ｄ２９抵抗性分離物として分離し、このとき１０８細胞を３ Ｘ１０’プラ一ク形成単位と混合し、そしてトリプシン大豆寒天平板上で平板培 養した。Ｄ２９抵抗性コロニーは１０−７の頻度で発生しに。

ｍｃ”６スフエロプラストを１μｇのＤ２９　ＤＮＡと混合した。生ずる混合物 の１／１０を、０５モルのスクロースの存在または不存在下に、トリブ７ノン大 豆寒天平板上で平板培養した。次いで、それらを１０’ｍｃ２６細胞を含有する 適当な軟寒天で覆った。ＤＮアーゼ１　（Ｓｌｇｍａ）を５０１１ｇ／ｍｌの最 終濃度でＤ２９　ＤＮＡに添加することによって、ＤＮアーゼ処理を実施した。

等しい量のｍｃ２１１スフエロプラストを同一方法において使用したが、次いで ｍｃ２６細胞で引き続いて覆って、プラーク形成単位（ｐｆＵ）をアッセイした 。

ファージの平板のストック・Ｄ２９の平板リゼイトを２ミリモルのＣａｃｌ、を 含有するトリプシン大豆寒天培地上で調製した。バッフル付きフラスコ内で３７ ℃においてＡ　Ｄ　Ｃエンリッチメント（ｅｎｒｉｃｈｍｅｎｔ）を含有するミ ドルブロック（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）７Ｈ９ブロス中で対数中期に増殖した スメグマｍ　（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）細胞を、ＭＰ緩衝液（１０ミリ モルのトリス−ＨＣＬ　ｐＨ７，６−１０ミ’ＪモルのＭｇＣＩｔ　１００ミリ モルのＮａＣｌ−２ミリモルのＣａＣ１□）中で希釈したファージと混合し、そ して３７℃において３６時間インキ、ベーションして、全面平板培養した。ファ ージをＭＰ緩衝液で収穫し、次いで２つのＣｓＣｌ平衡勾配で精製し、次いでＭ Ｐ緩衝液に対して広範に透析した。ＥＤＴＡを５０ミリモルの最終濃度に添加し 、１００μｇ／ｍｌのプロイテイナーゼで５５℃において２４時間処理し、次い でフェノール−クロロホルムで抽出し、モしてＴＥ緩衝液に対して広範に透析す ることによって、ファージからＤＮＡを抽出した。

トランスフェクション：各トランスフェクションのために、２，５１１のスフェ ロプラスト懸濁液を１５ｍ１のコニカルポリスチレン管内で沈澱させた。上澄み 液を注意してデカンテーションし、そしてスフェロプラストを残る緩衝液の滴中 に再懸濁した。１０μｍより少ない合計の体積で１μｇのＤＮＡを添加した後、 ０．５ｍｌのＰ緩衝液中で調製した２５％のＰＥＧ−１０００（Ｊ、Ｔ、Ｂａｋ ｅｒ　ＣｈｅｍｉｃａｌＣｏ、、ペンシルベニア州フィラデルフィア）溶液を添 加した。３分以内に、５ｍｌのＰ緩衝液を混合物に添加し、そしてスフェロプラ ストを上のように沈澱させた。上澄み液を注意して注ぎ出した後、沈澱を１ｍ１ ０Ｐ緩衝液中に再懸濁し、そして試料を鉤　５モルのスクロースのの存在または 不存在下にトリプシン大豆の寒天に移した。次いで、平板に３．３ｍｌの軟トリ プンン大豆寒で覆い、そして３７℃においてインキュベーションした。２４時間 インキュベーション後、プラークを計数した。

実施例２ シャトルプラスミドｐｈＡＥ１、の構成ＴＭ４　ファージＤＮＡを２５０μｇ／ ｍｌの濃度で結合した。系統的に希釈したＳ　ａ　ｕ　３　、Ａでアリコートを 部分的に消化した：長さが平均３０〜５Ｑｋｂの断片（アガロースゲルの電気泳 動により分析した）がこの方法で得られた。これらの断片を１：４のＴＭ４断片 対ＢａｍＨＩで切断したｐＨＣ７９のモル比で結合した。この結合のアリコート を生体外パッケージング混合物（Ｇｉｇａｐａｃｋ　ｐｌｕｓ、Ｓｔｒａｔａｇ ｅｎｅ、カリフォルニア州すンディエゴ）でパッケージングし、引き続いてＥＲ １３８１（ｈｓｄＲｍｅｒＡ”　ｍｃｒＢ”、Ｅ、Ｒａ１ｅ　ｉ　ｇｈ）の中に 形質導入すると、５０μｇ／ｍｌでアンピシリンを含有するし寒天上で平板培養 するとき、１０’のアンピシリン／μｇの１Ｍ４　ＤＮＡインサートを生じた。

４０．０００アンピシリン抵抗性コロニーのプールを、Ｌブロスをガラススプレ グーで均質化することによって調製した。アルカリＳＤＳ抽出、引き続くフェノ ール−クロロホルム抽出およびエタノールを使用する濃縮により、プラスミドを コロニーのプールから調製した。共有的に閉じたプラスミドのＤＮＡを、実施例 １に記載するようにｍｃ２６スフエロブラストの中にトランスフェクションした 。ベントン（Ｂｅｎｔｏｎ）およびバイオトランス（Ｂｉｏｒａｎｓ）ナイロン 膜（ＩＣＮ）のプロトコルを使用して、プラークのリフトを実施することによっ て、プラークをｐＨＣ７９の存在についてスクリーニングした。ベントン（Ｂｅ ｎｔｏｎ）児　Ｄ、およびＲ，Ｗ、　ディビス（Ｄａｖ　ｉ　ｓ）　、サイエン ス（Ｓｃ　ｉ　ｅｎｃ　ｅ）　、１９６　：１８０−１８２　（１９７７）、” Ｐ−ｄＣＴＰでニック翻訳したｐＨＣ７９と膜をハイブリダイゼーションし、そ してオートラジオグラフィーを実施した。

実施例３ シャトルプラスミドｐｈＡＥ１によるＢＣＧおよびスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｒ ｎａｔ　ｉ　ｓ）の感染 ＢＣＧ−グラクツ（Ｇｌａ、ｘｏ）（Ｗ、Ｊｏｎｅｓ）を、３７℃においてスタ ンディング培養物（ｓｔａｎｄｉｎｇ　ｃｕｌｔｕｒｅｓ）中のＡＤＣエンリッ チメント（Ｄｉｒｃｏ）および０．　５％のツイーン８０　（Ｓ　ｉ　ｇｍａ） を含有するミドルブロック（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）７Ｈ９ブロス（Ｄｉｆｃ ｏ）の中で増殖した。１０’ＢＣＧ細胞を補充した上部の軟寒天と混合し、モし て０ＡＤＳエンリツチメント（ＤｉｆＣＯ）を補充したツイーン８０（Ｄｉｆｃ ｏ）を含まないデュボス（Ｄｕｂｏｓ）寒天上に注ぐことによって、ＢＣＧ−グ ラクツ（Ｇｌａｘｏ）またはｍｃ”６細胞の菌叢を調製した。ジョンズ（Ｊ　ｏ ｎ　ｅ　ｓ）　、Ｗ。

Ｄ、Ｊｒ、、チュバークル（Ｔｕｂｅｒｃｌｅ）、６０：５５−５８　（１９７ ９）。４つのファージ、ＤＳ６Ａ、、１Ｍ４、ｐｈＡＥｌ、および３３Ｄを系統 的に希釈し、そして２つの菌叢上にスポツティングした。平板を１４日および２ 日に、それぞれ、ＢＣＧ−グラクツ（Ｇｌａｘｏ）およびスメグマ菌（Ｍ、ｓｍ ｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）について読んだ。

実施例４ アミノグリコンドホスホトランスフェラーゼ遺伝子のｐ　ｈ　Ａ　Ｅ　ｌ中のク ローニング Ｔｒｉ９０３からのアミノグリコンドホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ａ　ｐ 　ｈ）をエンコードする１、、６ｋｂのＥｃｏＲＩ断片を、コスミトクローニン グ方法を利用してｐｈＡＥｌの中にクローニングした。プラスミドｐｈＡＥ１の ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉから分離し、ＥｃｏＲＩで切断し、モしてｉ、、６ｋｂの 断片をこれらの大きいＤＮＡ分子に結合し、た。

結合産生物をファージラムダの中に生体外でパッケージングし、粒子を産生じ、 これらはカナマイシン抵抗性およびアンピシリン抵抗性をＥ。

ｃｏｌｉ細胞に形質導入した。プラスミドＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉ細胞から分離し 、そしテスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）ｍｃ”６原形質体の中に トランスフェクションするとき、高い頻度のプラーク形成単位を生じた。これは 、少なくとも１．６ｋｂの追加のＤＮＡをｐｈＡＥｌの独特ＥｃｏＲ１部位の中 にクローニングできることを実証する。同様な結果がシャトルプラスミドｐｈＡ Ｅ２を使用して得られ、ｐｈＡＥ２はｐｈＡＥｌの特性に類似する特性を有する が、ｐｈＡＥｌより２ｋｂだけ小さく、少なくとも３．６ｋｂの追加のＤＮＡの クローニングを可能とするであろうシャトルベクターである。両者の場合におい て、ａｐｈ遺伝子の導入は新しいＮｒｕ１部位を導入し、追加のＤＮＡ断片をク ローニングし、そしてシャトルプラスミドの中に安定に維持することができると いう証拠を提供する。こうして、それ以上の修飾をもたないこれらのベクターは 追加の遺伝子をマイコバクテリアの中にクローニングするために有用であること がある。

実施例５ シャトルプラスミドを使用するマイコバクテリア中の選択可能なマーカＴＭ４フ ァージについて構成したものに類似する方法で、シャトルプラスミドをファージ Ｌｌ　（ＡＴＣＣ１７１９９）から構成した。ドウク（Ｄｏｋｅ）　、Ｓ、クマ モト・メディカル・ジャーナル（ｋｕｍａｍｏｔｏ　Ｍｅｄｉｃａｌ　Ｊｏｕｒ ｎａｌ）、３４：１３６０−１３７３　（１９６０）。Ｌｌ−シャトルプラスミ ドのすべてはスメグマ菌（Ｍ。

ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）を溶原化する能力を有する。Ｌｌはスメグマ菌（Ｍ 、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の染色体の物質の中に組み込み、そして安定な 溶原化を形成することが示された。他のファージ、例えば、Ｌ３（ＡＴＣＣ１７ １９９）　、プラスミドとして残る（染色体外）ファージおよびＬ５　（ＡＴＣ Ｃ４ｔ２７２０１）を、また、シャトルプラスミドの構成において使用すること ができる。結果は、これらのシャトルプラスミドがスメグマｍ　（Ｍ、ｓｍｅｇ ｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）を溶原化し、こうして問題のＤＮＡをマイコバクテリアの中 に最初に安定に組み込むすることができることを示した。ａｐｈ遺伝子を、Ｅ、 ｅｏ！ｉ中のＴＭ４−シャトルプラスミドについて前述したように、ｐｈＡＥｌ ５と表示するＬｌ−シャトルプラスミドの独特ＥｃｏＲ１部位の中にクローニン グした。

スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）細胞（ｍｃ”６）を、カナマイ シンを含有するデュボス（Ｄｕｂｏｓ）寒天平板上の寒天の上部にオーバーレイ した。シャトルプラスミドｐｈＡＥ１５およびｐｈＡＥｌ、９（クローンミルｈ 遺伝子をもつｐｈＡＥｌ５）の希釈物を寒天の菌叢上にスポツティングした。平 板を３７℃において５日間インキュベーションした。増殖したコロニーのすべて は、ａｐｈ遺伝子がクローニングされたＬｌ−シャトルプラスミドで溶原化され た。生ずるシャトルプラスミドｐｈＡＥ１９は、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍ ａ　ｔ　ｉ　ｓ）細胞を溶原化することができた。生ずる溶原化は、カナマイシ ン抵抗性であるので、クローニングしたａｐｈを発現した。さらに、これらの溶 原化はマイコバクテリオファージの粒子を生じ、これらの粒子は、また、引き続 いてカナマイシン感受性スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）細胞を 転移および溶原化すると、カナマイシン抵抗性の表現型を発現した。これらのフ ァージの転移は、清涼性状態（すなわち、重感染に対する免疫性）およびカナマ イシン抵抗性の同時形質導入を生じた。スメグマ菌（Ｍ。

ｓｍｅ　ｇｒｎａ　ｔ　ｉ　ｓ）の溶原化に使用したし１フアージはＢＣＧ上で プラーク形成しない。しかしながら、ＢＣＧ上でプラークを形成するＩ、１およ びシャトルプラスミドｐｈＡＥ１９の両者が分離された。これらを、テンペレー トシャトルプラスミドにより、ＢＣＧおよびヒト結核菌（Ｍ。

ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓ　ｉｓ）の中に問題の遺伝子を導入しそして安定に発現す る、それらの能力について試験した。こうして、これらのファージはスメグマ菌 （Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中に問題のＤＮＡを安定に導入する能力 を有する。さらに、ＢＣＧを感染しそして溶原化する宿主の範囲の変異型（例え ば、ｐｈＡＥｌ９）を分離した。これにより、問題のＤＮＡを含有する組み換え マイコバクテリウムを産生ずることができる。このような組み換えマイコバクテ リアはワクチンとして使用することができる。

実施例６ スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）染色体の中へのマイコバクテリ ０．０５％のツイーン８０を含有するトリプシン大豆ブロス中で増殖した、特定 しないマイコバクテリウム、ＡＴＣＣ２７１９９、からの培養上澄み液を、クロ ーニングしたスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）菌株、ｍｃ２５、 上で平板培養することによって、ファージＬ１を得た。

ジャコブス（Ｊ　ａｃｏｂｓ）　、　Ｗ、　Ｒ，Ｊ　ｒ、　、ツクマン（Ｔｕｃ ｍａｎ）、Ｍ、およびブルーム（Ｂｌｏｏｍ）　、Ｂ、Ｒ，ネイチ−？−（Ｎａ ｔｕｒｅ）、３２７：５３２−５３５　（１９８７）。ファージをプラーク精製 し、そして高い力価の平板リゼイトを、２ミリモルのＣａＣＬを含有するデュボ ス寒天培地（ツイーンを含まない）上で３７℃において増殖したｍｃ２６から得 た。ファージ粒子をＣｓＣ１平衡密度の遠心により精製し、そしてファージＤＮ Ａを前述したように分離した。ジャコブス（Ｊ　ａｃｏｂｓ）　、Ｗ、　Ｒ，Ｊ 　ｒ、　、ツクマン（Ｔｕｃｒｎａｎ）、Ｍ２　およびブルーム（Ｂ　ｌ　ｏｏ ｍ）　、Ｂ、　Ｒ，ネイチ＋−（Ｎａｔｕｒｅ）　、３２７　：　５３２−５３ ５　（１９８７）。前述のプロトコルに従い、コスミドとしてｐＨＣ７９および ＴＭ４　ＤＮＡの代わりにＬＸ　ＤＮＡを使用して、Ｌｌ−シャトルプラスミド を構成した。ジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）　、Ｗ、Ｒ，Ｊ　ｒ、　、ツクマン（ Ｔｕｃｍａｎ）　、Ｍ、およｈＡＥ１５　ＤＮＡをＴｎ９０３　ＥｃｏＲＴ　ａ ｐｈカセット（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合することによって、９０３からのａ ｐｈ遺伝子を１つのＬｌ−シャトルプラスミド、ｐｈＡＥｌ５４、の中に導入し た。

生ずる結合体をラムダ−ファージのヘッドの中に生体外パッケージングし、次い でＥ、ｃｏｌｉ菌株２３３８の中に形質導入し、アンピシリン抵抗性およびカナ マイシン抵抗性の両者について選択した。ジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）　、Ｗ、 Ｒ，ら、プロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃａｄ。

Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、８３　：１９２６−１９３０　（１９８６）、プラスミド ＤＮＡをＥ、ｃｏｌｉから分離し、ｍｃ２６原形質原形牛体トランスフェクショ ン腰そして生ずるマイコバクテリオファージをＩ）ＩＩＡＥＩ９と表示した。ｍ ｃ２６細胞を含有する寒天上でプラスミドをスポツティングした後、溶原化を濁 ったプラークから精製した。推定上の溶原化をファージの解放およびＬｌによる 重感染に対する抵抗性について試験した。染色体のＩ）ＮＡをブラウン（Ｂｒａ ｕｎ）ホモジナイザーで分離し、次いでフェノール−クロロホルム抽出した。バ イオトランス（ＩＣＮ）ナイロン膜を使用して製造業者の推奨に従い実施した。

ＬＩ　ＤＮＡをニック翻訳キット（ＢＲＬ）および［２−３２Ｐ］　−ｄｃＴＰ 　（Ａｍｅ　ｒｓｈａｍ）を使用して放射線標識した。

実施例７ ＡＤＣエンリッチメントおよび０．０５％のツイーン８０を補充したミドルブｏ 　ツク（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）７Ｈ９ブロス（Ｍ−ＡＤＣ−ＴＷブロス）の 中で３７℃において培養物を震盪することによって増殖した、スメゲマ菌（Ｍ、 Ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　Ｓ）、ｍｃ”６、　［２×１０７］細胞を、１５μｇ／ ｍｌのカナマイシンを含有するデュボス（Ｄｕｂｏｓ）寒天平板」−にオーバー レイした。Ｌｌ−シャトルプラスミド、ｐ　ｈ　Ａ　Ｅ　ｉ　５およびｐｈＡＥ １９　（＝Ｉ）ｈＡＥ１５：　：ａｐｈ）のりゼイトを、０．４５μｍのフィル ターを通して濾過し、そしてＭＰ緩衝液を使用してほぼ５ｘ１０６ｐｆｕ／ｍｌ に希釈した。ジャコブス（Ｊａｃｏｂｓ）　、Ｗ、　Ｒ，Ｊ　ｒ、　、ツクマン （Ｔｕｃｍａｎ）　、Ｍ、およびを表示し、た区域においてスポツティングし、 そし７て平板を３７℃において５日間インキュベーションした。第７図に示すよ うに、ｐｈＡＥ１９がｒｎ　ｅ　２６を溶原化するコロニーが現れ、こうしてカ ナマイシン抵抗性の発現を実証する。多数の実験において、カナマイシン抵抗性 のコロニーがｍｅ２６の自発的突然変異体またはｐｈＡＥ１５で溶原化したｍｃ ”６細胞から観測されなかった。ｐｈＡＥ１９で溶原化したｍｅ２６であるスメ グマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）菌株、ｍｅ２５９と表示する、は、１ ９８８年７月２２日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈ ｅ　Ａｍｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（ ７リイランド州ロツクビレ）に受託Ｎｏ、６７７４６で受託された。受託物への 公衆のアクセスについてのすべての制限は、この出願に基づく米国特許が登録さ れたとき最終的に除去されるであろう。

実施例８ 前述したように分離したプラスミドｐＡＬ５０００ＤＮＡをＭｂｏｌで部分的に 消化し、５ｋｂの線状断片を電気泳動後にアガロースゲルから分離した。バーン ポイム（Ｂ　ｉ　ｒｎｂｏ　ｉｍ）　、Ｈ，およびドリイ（Ｄｏ］　ｙ）　、核 酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）　、７　：１５１ ３−１５２５　（１９７９）、これらの断片をポジティブ（ｐｏｓ　ｉ　ｔ　１ ｖｅ）選択のベクターｐｌＪ６６６に結合し、このｐ　Ｉ　Ｊ　６６６はＴｎ５ から由来するｎｅｏ遺伝子、およびＢａｍＨＩおよびＥｅｏＲＶで切断しモして Ｅ、ｃｏｌｉの中に形質転換した、ｐＡＣＹＣ１８４からの復製のＰ１５Ａ由来 およびｃａｔ遺伝子を含有した。キーゲル（Ｋｉｅｓｅｒ）、Ｔ、およびＲ，Ｅ 、メルトン（ＭｅｌｔｏｎＬ遺伝子（Ｇｅｎｅ）　、６５　：８３−９１　（１ ９８８）：ベルブ（Ｂｅ　ｒｇ）　、Ｄ、　Ｅ、ら、プロシーディンゲス・オブ ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａｔ　１．Ａｃ ａｄ。

Ｓｃ　ｉ、）ＵＳＡ、ヱ２：３６２８−３６３２　（１９７５）；チヤツプ（Ｃ ｈａｎｇ）　、Ａ、Ｃ，Ｙ、およびＳ、　Ｎ、：＋ウヘン（Ｃｏｈｅｎ）、ジャ ーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂａｃｔｒｉｏｌｏｇｙ）、形質転換体 （２００コロニー、２５ｇ／ｍＩに対して抵抗性）をプールし、そして混合培養 において増殖さ也これからプラスミドを分離した。

バーンボイム（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ）、Ｈ，およびドリイ（Ｄｏｌｙ）、核酸の研 究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ）、ヱ：１５１３−１５２ ５　（１９７９）。ｐＴＪ６６６：　：ｐＡＬ５０００のコノライブラリーを、 ジーン・パルサー（Ｇｅｎｅ　Ｆ’ｕｌｓｅｒ）（Ｂｉｏｒａｄ）エレクトロボ レイターにより、スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の中に形質転換 した。チャシー（Ｃｈａｓｓｙ）　、Ｂ、Ｍ。

およびＪ、Ｌ、フリッキンガ−（Ｆｌ　ｉ　ｃｋｉ　ｎｇｅｒ）、ＦＥＭＳフィ クロバイオロジー・レターズ（Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ　１ｅｔｔｅｒｓ）、 ４４：１７３−１７７　（１９８７）。ｍｃ”６細胞の新鮮な培養物をＭ　−Ａ 　Ｄ　Ｃ−Ｔ　Ｗブロスの中で震盪しながらＡｓｏｏ＝１．　７に増殖させた。

細胞を遠心により収穫し、エレクトロポレイション緩衝液（７ミリモルのホスフ ァージ、ｐＨ７，２−２７２ミリモルのスクロース）中で洗浄し、そしてもとの 体積の１／１０に再懸濁した。プラスミドＤＮＡ　（ｌμｇ）を０．８ｍｌのス メグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉＳ）細胞を含有するエレクトロポレイシ ョンのクベットに添加した。氷上で１０分間インキュベーションした後、細胞を 単一のパルスのエレクトロボレイション（６２５０Ｖ／ｃｍで２５μＦ）に暴露 し、次いで等しい体積のＭ−ＡＤＣ−ＴＷグロスと混合し、そして３７℃におい て２時間インキュベーションしまた。次いで、細胞を１０μｇ／ｍｌのカナマイ シンを含有する７Ｈ１０寒天平板上で平板培養し、そして３７℃において７日間 インキュベーションした。カナマイシン抵抗性の形質転換体を１０μｇ／ｍｌの カナマイシンを含有する７Ｈ９−ＡＤＣ−ＴＷジブロス中継代培養し、そしてフ ァージＤ２９をプラーク形成するそれらの能力を保持し、それらがスメグマ菌（ Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）であることを確証した。７ｏマン（Ｆｒｏｍ ａｎ）、、Ｓ、ら、Ａｍ、Ｊ、Ｐｕｂｌｉｃ　Ｈｅａｌｔｈ、４４：１３２６− １３３４（１９５４）、これらの形質転換体は、また、１００μｇ　／　ｍ　！ のクロランフェニコールに対して抵抗性であった。プラスミドＤＮＡを細胞の１ ｍｌの試料からバーンボイムの手順の修正により分離し、順次にリゾチーム、ア ルカリ性−３ＤＳおよび最終高い塩の中で一夜インキユベーシダンした。スメグ マ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）から分離したＤＮＡを２３３８の中に形質転換 し、そしてＤＮＡの１μｇ当たり１０４のカナマイシン抵抗性Ｅ、ｃｏｌｉ形質 転換体を得た。バーンボイム（Ｂ　ｉ　ｒｎｂｏ　ｉｍ）、Ｈｌおよびドリイ（ Ｄｏ　ｌ　ｙ）　、核酸の研究（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅ５ｅａｒｃ ｈ）、７．：１５１３−１５２５（１９７９）、個々のＥ、ｃｏｌｉ形質転換体 から分離したすべての独特のプラスミドは、形質転換し、そしてカナマイシン抵 抗性およびクロランフェニコール抵抗性をスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔ　ｉ ｓ）にを与えることができた。

実施例９ ＢＣＧ−パスツール（ｐａｓｔｅｕｒ）菌株Ｐ１１７３Ｐ２を、Ｍ＝−ＡＤＣ− ＴＷジブロス中震盪しながら３７℃において５日間増殖した（推定した生存能力 ４．５Ｘ１０’ｃｆｕ／ｍり。これらの細胞を、前述と同一の手順に従い、ｐ　 Ｉ　Ｊ　６６６　：　：　ｐＡＬ５０００組み換えライブラリーでエレクトロポ レイシヨンすることによって形質転換し、そしてＡＤＣエンリッチメントおよび ２０μｇ／ｍｌのカナマイシンを含有する７Ｈ１０寒天上で平板培養した。４５ のカナマイシン抵抗性ＢＣＧ細胞のプールを、２０１１ｇ／ｍｌのカナマイシン を含有する液体培地の中で３７℃において３週間培養した。この培養から、プラ スミドを実施例８に記載するように分離した。それらはずべて１１．２ｋｂの大 きさであり、そし、て形質転換したとき、Ｅ、ｃｏｌｉ細胞にカナマイシン抵抗 性を与えた。このプラスミドＤＮＡを再び使用してＢＣＧ細胞を形質転換した。

上に示した平板を３７℃において１８日間インキュベーションし、次いで写真撮 影した。シャトルプラスミドで形質転換したＢＣＧ−パスツール（ｐａｓｔｅｕ ｒ）下位菌株、ｐＹＵＰｌｌｏｏと表示する（また、ｐＹＵＢ１３と呼ぶが、あ るいは表示する）は、カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子およびクロラ ンフェニコール抵抗性ヲエンコードする遺伝子を包含し１．１９８８年７月２２ 日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃａ ｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ！ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（７リイランド州ロツ クビレ）に受託Ｎｏ、６７７４５で受託された。受託物への公衆のアクセスにつ いてのすべての制限は、この出願に基づく米国特許が登録されたとき最終的に除 去されるであろう。

ストレス誘発した６５ｋＤ抗原をエンコードするらい菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）遺 伝子を、また、導入しそしてスメグマ菌（Ｍ、ｓ　ｍ　ｅ　Ｋ１１ｌ　ａｔｉｓ ）およびＢＣＧの中で発現した。らい菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）遺伝子をＥ、ｃｏ ｌｆ−マイコバクテリアのシャトルプラスミド、ｐｙｕＢ１２と表示する、の中 にクローニングし、このプラスミドは、ｐＲＨｌｌｏｏを含む、前にｐＹＵＰと 表示したシャトルプラスミドの群の１員である。生ずる構成体、ｐＹＵＢ３９、 をスメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）およびＢＣＧ−パスツール（Ｐ ａｓｔｅｕｒ）の両者の中に形質転換し、そして形質転換体からの細胞リゼイト を５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。生ずるｇｍをナイロン 膜上にブロッティングし、次いでこれをらい菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）特異的エピ トープＩＩＥ９を認識するマウスモノクローナル抗体でプロービングした。次い で、プロットをアルカリ性ホスファターゼに結合したマウス特異的ウサギ抗体で ブロービングし、ホスファターゼ活性について展開し、そして写真撮影した。生 ずるゲルは、外来らい菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）の６５ｋＤの抗原をエンコードす るクローニングした遺伝子が、第１７図に表すように、スメグマ閑（Ｍ、Ｓｍｅ 　ｇｍａ　ｔ　ｉ　Ｓ）およびＢＣＧの両者において発現され、ここで第１７図 は組み換えプラスミドｐＹＵＢ１２またはｐＹＵＢ３９を含有する細胞リゼイト のＳＤＳポリアクリルアミドゲルの電気泳動のウェスタン・プロット分析の写真 である。

実施例１０ 次のバクテリア菌株を使用した：ＲＹ１１０３　（ＤＢ６５０７、バッチ（Ｂａ ｅｈ）、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン シズ（Ｐｒｏｃ、Ｎａ　ｔ　１．Ａｅａｄ、Ｓｃ　４．）ＵＳＡ、ヱ６　：　３ ８６−３９０　（１９７９））ＨＢＩＯＩ、ＰｙｒＦ：：Ｔｎ５、ｔｈｒ−１Ｉ ｅｕ−１ｐｒｏ−１Ｂｌ−１ｒ−１ｍ−１ｓｕＩＩおよびＲＹ１１０７　（ＤＢ ６５６６、ロウズ（Ｒｏ　ｓ　ｅ）　、Ｍ、ら、遺伝子（Ｇｅｎｅ）　、２９　 ＋１１３−１２４　（１９８４））Ｂ１５、ＰｙｒＦ　：　：Ｍｕ、ｔ　ｒｐ、 、、、ＩａｃＺ、−、ｈｓｄＲ＼ｍ”、５ｕ−０両者はディピッド・ホトスティ ン（Ｄａｖｉｄ　Ｂｏｓｔｓｔｅｉｎ）博士（マサチ、セッッ工業大学）から入 手した。Ｙｌ、１０９　（ＤＨ５ａｌｐｈａ）Ｆ−％ｅｎｄＡＩ、ｈｓｄＲ１７ （ｒＫＳｍＫつ、５ｕｐＥ４４、ｔｈｉｌ、ｒｅｃＡｌ、ｇｙｒＡ９６、ｒｅ　 Ｉａ、、ｄｅ　ｌ　（ａｒｇＦ−ＩａｃＺＹＡ）（Ｕ１６９、ｌａｍｄａ−１ｐ ｈｉ８０ｄｌａｃＺｄｅＩＭ１５、こわらはベセスダ・リサーチ・ラボラトリー ズ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）から入 手した。

ＭＣツー６、屯−のコロニーの分離物スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）プ ロトドローフ　これはウィリアム・ジャコブス（Ｗｉｌｌｉａｍ　Ｊａｃｏｂｓ ）博士（アルバート・アインシュタイ薬科大学）から入手した。ＦＯＡ＝３はウ ラシル栄養要求変異種へのＭＣ２−５の自発的突然変異体であり、そして５−フ ルオロ−オロチン酸に対して抵抗性である。ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖｉｓ）　− ＢＣＧ　（Ｍｏｒｅａｕ）はＡＴＣＣ３５７３６である。ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏ ｖｉ　５）−ＢＣＣ；　（Ｍｏｎｔｒｅａ＋）はＡＴＣＣ３５７３５゜マイコバ クテリアのゲノムのＤＮＡのライブラリースメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ 　ｊ　ｓ）のゲノムのＤＮＡはグルコースおよび８０を補充したトリプシン大豆 ブロス中で増Ｎ後、ＭＣ”−６から得た。培養物はグリシンを０．　５％に最後 の数時間の間添加して飽和に増殖した。細胞を遠心により収穫し、洗浄し、そし て５０ミリモルのトリスｐＨ８，０，１０ミリモルのＥＤＴＡ、１０％のスクロ ースの中に再懸濁し、次いで０．２μｇ／ｍｌのりゾチームで１時間処理し、次 いで５０ミリモルのＥＤＴＡおよび１％のＳＤＳで１５分間処理した。

多数回のフェノール：クロロホルム抽出を実施し、次いでイソプロパツール沈澱 し、ＲＮアーゼ処理し、フェノール：クロロホルム抽出、クロロホルム抽出およ びエタノール沈澱した。沈澱を７０％のエタノールで洗浄し、そしてＴＥ　ｐＨ ７，５の中に再懸濁した。ウシ結核菌（Ｍ。

ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ　（Ｍｏｒｅａｕ）ゲノムのＤＮＡをグアスキンスキー（ Ｇｒａｓｋｉｎｓｋｙ）博士の寛大な贈り物であった。

マイコバクテリアのゲノムのＤＮＡを５ａｕ３Ａで部分的に消化し、ＤＥ８１紙 」二へのアガロースゲルの電気泳動により大きさで選択し、エタノール沈澱し、 そしてＢａｍＨＩで切断しかつ仔ウシ腸ポスファターゼで処理したｐＵｃ１９の 中に結合した。ハナハン（ｈ　ａ　ｎ　ａ　ｈ　ａ　ｎ）の手順により形質転換 体について競合的とした、ＤＨ５ａｌｐｈａを、この結合体で形質転換し５、そ して５０μｇのアンビンリンを含有す−るルリア・ベルタニ（Ｉ、ｕｒｉａ　Ｂ ｅｒｔａｎｉ）寒天上に平板培養した。

組み換えプラスミドを含有するコロニーの比率は、Ｘ　Ｇ　ａ　ｌおよびＩＰＴ Ｇを含有するインジケーター平板上に平板培養し、そしで白色コロニ一対合計（ 白色＋青色）のコロニーの比を決定することによって決定した。プールしたプラ スミドＤＮＡは、平板からコロニーを引っ掻き取り、５０ミリモルのトリスｐＨ ８，０，１０ミリモルのＥＤＴＡ１５０ミリモルのグルコースの中に再懸濁する ことによって得た。生ずる墾濁液をプラスミドＤＮＡを得るためのアルカリ性溶 菌方法により処理した。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）の組み換 えＤ　Ｎ　Ａライブラリーは３５．０００の独立の初期の形質転換体から成り、 それらの８５％は組み換え体であった。ウシ結核菌（Ｍ、ｂｏｖ　ｉ　５）−Ｂ ＣＧの組み換えＤＮＡライブラリーは６４．０００の独立の初期の形質転換体か ら成り、それらの５５％は組み換え体であった。

’ｌ’　１１０３および”１’１１０７をハナハン（Ｈａｎａｈａｎ）の方法に より競合的とし、プラスミドのライブラリーのＤＮＡで形質転換し、そして最小 寒天平板上で平板培養した。スメグマ菌（Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）のライブラ リーについて最初にスクリーニングした１８０．０００の形質転換体のうちで、 ３１は最小培地上で増殖ことかできた。

グ プラスミドＤＮＡをアルカリ性溶菌法により液体培養により分離した。

組み換えプラスミドＤ　Ｎ　、Ａの制限マツピングを標準の方法に従い多数の酵 素を使用して実施し、た。二。−・イングランド・バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎ ｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌａｂｓ）および米国パイケミカルス（Ｕ。

Ｓ、Ｂｉｏｅｈｅｍｉｅａｌｓ）からの配列決定既知の技術を使用して、Ｍ１３ ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９の中にサブクローニング後、ジデオキシ方法を使 用してＤＮＡの配列決定を実施した。

実施例１１ ｐＰＰ２５、ＰｙｒＦ−Ｅ、ｃｏｌ　ｉと競合することができるスメグマ菌（Ｍ 、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）からのＤＮＡを含有する組み換えプラスミド、 を、ＢａｍＨＩで消化し、そしてｐＵＣ４ｋＳＡＣから分離した、Ｔｎ９０３の アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをエンコードする１、３ｋＢのＢａ ｍＨＩ断片に結合した。らい菌（Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ）の６５ｋＤの抗原をエンコ ードする遺伝子を含有するＹ３１７８のＥｃｏＲＩ断片を、引き続いて、このプ ラスミドにおいてマイコバクテリアのＤＮＡ中の独特ＸｈｏｌおよびＥＣＯＲ’ ｌｌ’の中にクローニングした。各場合において、マイクバクテリアのオープン リーディングフレーム、カナマイシン抵抗性の遺伝子およびらい菌（Ｍ、１ｅｐ ｒａｅ）の６５ｋＤの遺伝子の転写の向きは同−向きであると決定された。

エレクトロボレイションによりマイコバクテリアの形質転換スメグマ菌（Ｍ、ｓ ｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）およびウシ結核菌（Ｍ、ｂ。

ｖ　ｉ　５）−ＢＣＧを、ＡＤＣエンリッチメントおよび０．０５％のツイーン ８０を補充したミドルブロック（Ｍｉｄｄｌｅｂｒｏｏｋ）７Ｈ９培地の中でほ ぼ０．　３〜０．５のＡ６゜。に増殖した。細胞を遠心により収穫−１０ミリモ ルのヘペス（Ｈｅｐｅｓ）ｐＨ７，０中で洗浄し、遠心し、モして１／１０の体 積の１０ミリモルのへベスｐＨ７，０，１０％のグリセロール（スメグマ菌（Ｍ 、ｓｍｅ　ｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ）　）の中に再懸濁するか、あるいは１／１０体 積の７ミリモルのリン酸ナトリウムｐＨ７，２，２７２ミリモルのスクロース（ ＢＣＧ）中で洗浄しそしてその中に再懸濁した。ＤＮＡを添加し、そして細胞を 単一のパルスの６゜２５ｋＶ／ｃｍに２５マイクロフアラドでバイオラド・ジー ン・パルサー（Ｂｉｏｒａｄ　Ｇｅｎｅ　Ｐｕ１ｓｅｒ）を使用して暴露した。

次いで、３〜５体積のＭ−ＡＤＣ−ＴＷを添加し、細胞を３７℃において２〜３ 時間インキュベーションし、遠心し、小さい体積のＭ−ＡＤＣ−１のカナマイシ ンを含有するトリプシン大豆の寒天（スメグマ菌（Ｍ。

ｓｍｅｇｍａ　ｔ　ｉ　ｓ））またはＡＤＣエンリッチメントを補充し、１０μ ｇ／ｍｌのカナマイシンを含をするミドルブロック（Ｍｔｄｄｌｅｂｒｏｏｋ） ７Ｈ９寒天上で平板培養した。

サザンプロット分析 マイクバクテリアの形質転換体のゲノムのＤＮＡを制限酵素で消化し、アガロー スゲルでエレクトロポレイシヨンし、ニトロセルロースに移し、そして３２ｐニ ツク翻訳で標識したＤＮＡでブロービングし、すべて標準の手順を使用した。

ウェスタン・プロット（イムノプロット）分析６５ｋＤのらい菌（Ｍ、１ｅｐｒ ａｅ）タンパク質の発現を、ウェスタン・プロットの技術を使用して実証した。

マイコバクテリアのリゼイトおよびＥ、ｃｏｌｉの形質転換体をＳＤＳポリアク リルアミドゲルの電気泳動にかけ、ニトロセルロースに電気転移させ、そして標 準の技術を使用してほぼ１　：　１０００の希釈でモノクローナル抗体Ｉ　Ｉ　 ｒＥ９でブロービングした。プロトプロット（Ｐｒｏｔｏｂｌｏｔ）キット（Ｐ ｒｏｍｅｇａ　Ｂｉｏｔｅｃ）を使用して抗体の結合を検出し、そして製造業者 の指示に従い使用した。これにより、らい菌（Ｍ、１ｅｐｒａｅ）遺伝子を含有 するプラスミドで形質転換した細胞中で６５ｋＤのタンパク質の発現が検出され た。

同等の実施態様 当業者は日常の実験を越えないものを使用して、ここに記載する発明を逸脱しな いで特定の実施態様に対する多くの同等の態様を、認識するか、あるいは確証す ることができるであろう。このような同等の態様は次の請求の範囲包含される。

：とを意図する。

ＦＩＧ、１ ρＮアーｔ′ズ１理１１：。

ＭｓｍａｇｍａＮａのスフｚｆｆグンヌト＋０２９ＯＮＡ　Ｍ、ｓｍｅｇｍａｔ Ｉｓｎヌ７ｔＤ７ラスＦ寸０２９ＯＮ＾ＦＩＧ、３Ａ　ＦＩＧ、３Ｂ ＦＩＧ、５Ａ　ＦＩＧ、５Ｂ ＦＩＧ、７ Ｆ工ＧＵＲＥ　８ １１．２　ｋｂのｐｌＪ６６６　：：　ｐＡＬ５０００譲新〒（えプラスミドラ ライデラν− ＦＯＡＳ ＫＡＮ　Ｒ ＵＲＡ” ＡＮＲ にＡＮＳ　ＫＡＮＲ Ｂｃ（、ｔｐ、ｙ）Ｍ、Ｉｅｐｒａｅ　６５ｋＤａ　ｅ）ｙ梢源の七硯 ｐＹｔＪＢ３９　ｆ　ｐＹＩＪ巳１２゛：Ｍ　±５ｐｒａｓ　６５　ｋＤａ　ｆ ｌイ云Ｊ−国際調査報告 “°１″″′幻″”””ＰＣＴ／ＬＩＳ　８９１０：９６２ト瞳＋１ｊ−１＠Ｍ ＩΦ＾−釦イｊＩ−・ｈ鳴　ｐ「〒１ｔ＋Ｆ、ＲＱ＃ｌフ９６フ国際調査報告 ＵＳ８９０２９６２ ＳＡ　２９７９Ｄ ■出　願　人　ザ・ボード・オブ・トラステイーズ・オブ・ザ・レランド・ス タッフォード・ジュニア・ユ、二 バーシティ アメリカ合衆国カリフォルニア用９４３０５　スタンフォード　（番地なし）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、組み換えマイコバクテリウムのゲノムＤＮＡの選択した部位の中に安定に組 み込まれた問題のＤＮＡを発現することができる組み換えマイコバクテリウム。 ２、問題のＤＮＡは、抗原、酸素、リンフォカイン、イムノポテンシエイターお よびリポーター分子から成る群より選択される少なくとも１つのタンパク質また はポリペプチドをエンコードする、上記第１項記載の組み換えマイコバクテリウ ム。 ３、問題のＤＮＡは、 ａ、１、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）抗原、２、ヒト 型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗体、３ 、マラリアスポロゾイト、４、マラリアメロゾイト、５、ジフテリアトキソイド 、６、破傷風トキソイド、７、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）抗原、 ８、サルモネラ抗原、９、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）抗原、１０、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）抗 原、１１、鳥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）抗原、１２、 トロポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）抗原、１３、百日咳抗原、１４、ヘルペス ウイルス抗原、１５、はしかウイルス抗原、１６、おたふくかぜウイルス抗原、 １７、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅ１１ａ）抗原、１８、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ ａ）抗原、１９、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原、２０、狂犬病抗原、２１ 、ポリオウイルス抗原、２２、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、２３、へび毒物抗原 、２４、昆虫毒物抗原、および２５、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 ｂ、ステロイド酵素、 ｃ、インターリューキン１〜７、 ｄ、腫瘍壊死因子αおよびβ、 ｅ、インターフェロンα、βおよびγ、およびｆ、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質抗原をエンコードする、 上記第１項記載の組み換えマイコバクテリウム。 ４、ａ、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、ｂ 、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ、ｃ、鳥結 核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、ｄ、チモテ菌（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ）、ｅ、マイコバクテリウム・フォルツイツム（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、ｆ、マイコバクテリウム ・ルフ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｆｕ）、ｇ、パラ結核菌（Ｍｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕ１ｏｓｉｓ）、ｈ、マイコバクテ リウム・ハバナ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｂａｎａ）、ｉ、マイコバ クテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｏｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｃｒｏｆｕＩ ａｃｅｕｍ）、ｊ、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔ ｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、およびｋ、それらのいずれかの 遺伝子変異型から成る群より選択される、上記第３項記載の組み換えマイコバク テリウム。 ５、問題のＤＮＡが、抗原、酵素、リンフォカイン、イムノポテンシエイターお よびリポーター分子から成る群より選択されるヌクレオチド配列から本質的に成 る、組み換えマイコバクテリウムのゲノムのＤＮＡ中の選択した部位に安定に組 み込まれた問題のＤＮＡを発現することができる組み換えマイコバクテリウム。 ６、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ、スメグ マ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、またはその遺伝子 の変異型である、上記第５項記載の組み換えマイコバクテリウム。 ７、組み換えウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ 、組み換えスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、 またはその遺伝子の変異型であり、前記組み換えマイコバクテリウムは選択した 部位においてゲノムのＤＮＡの選択した部位の中に安定に組み込まれた問題のＤ ＮＡを発現することができ、問題のＤＮＡは少なくとも１種の問題のタンパク質 またはポリペプチドをエンコードする、組み換えマイコバクテリウム。 ８、問題のタンパク質またはポリペプチドは、抗原、酵素、リンフォカイン、イ ムノポテンシエイターおよびリポーター分子から成る群より選択される、上記第 ７項記載の組み換えマイコバクテリウム。 ９、抗原は、 ａ、１、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）抗原、２、ヒト 型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗体、３ 、マラリアスポロゾイト、４、マラリアメロゾイト、５、ジフテリアトキソイド 、６、破傷風トキソイド、７、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）抗原、 ８、サルモネラ抗原、９、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）抗原、１０、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）抗 原、１１、鳥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）抗原、１２、 トロポネーマ（Ｔｒｃｐｏｎｅｍａ）抗原、１３、百日咳抗原、１４、ヘルペス ウイルス抗原、１５、はしかウイルス抗原、１６、おたふくかぜウイルス抗原、 １７、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）抗原、１８、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ ａ）抗原、１９、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原、２０、狂犬病抗原、２１ 、ポリオウイルス抗原、２２、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、２３、へび毒物抗原 、２４、昆虫毒物抗原、および２５、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 ｂ、ステロイド酵素、 ｃ、インターリューキン１〜７、 ｄ、腫瘍壊死因子αおよびβ、 ｅ、インターフェロンα、βおよびγ、およびｆ、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される、上記第８項記載の組み換えマイコバクテリウム。 １０、問題のＤＮＡのエピソームの発現をすることができ、前記問題のＤＮＡは 組み換えマイコバクテリウムの染色体外に存在しそして少なくとも１つの問題の タンパク質またはポリペプチドをエンコードすることができる、組み換えマイコ バクテリウム。 １１、問題のタンパク質またはポリペプチドは、抗原、酵素、リンフォカイン、 イムノポテンシエイターおよびリポーター分子から成る群より選択される、上記 第１０項記載の組み換えマイコバクテリウム。 １２、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧまたは スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）である、上記 第１１項記載の和み換えマイコバクテリウム。 １３、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアの中で問題のＤＮＡを複製および発 現することができ、マイコバクテリアのＥ．ｃｏｌｉハイブリッドプラスミドで ある、シャトルプラスミドベクター。 １４、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリアの中で問題のＤＮＡを複製および発 現することができ、 ａ、Ｅ．ｃｏｌｉ中の前記プラスミドの複製および選択に必要なＤＮＡ、 ｂ、マイコバクテリア中の前記プラスミドの選択のための選択可能なマーカーを エンコードするＤＮＡ、 ｃ、マイコバクテリアの中で機能的な複製の由来、およびｅ、マイコバクテリア の中で複製することができるプラスミドの非必須部位の中に挿入された問題のＤ ＮＡ、からなる、シャトルプラスミドベクター。 １５、バクテリアのプラスミドＤＮＡ、マイコバクテリアのプラスミドＤＮＡお よび問題のＤＮＡからなり、Ｅ．ｃｏｌｉの中で問題のＤＮＡを複製および発現 することができ、そしてマイコバクテリウムの中で問題のＤＮＡを複製および発 現することができ、ａ、Ｔｎ５からのｎｅｏ遺伝子、ｐＡＣＹＣ１８４からのＰ １５Ａ由来およびｐＡＣＹＣ１８４からのｃａｔ遺伝子からなる、Ｅ．ｃｏｌｉ プラスミドｐＩＪ６６６のＤＮＡ、 ｂ、プラスミドｐＡＬ５０００のＤＮＡ、およびｃ、問題のＤＮＡ、 からなり、Ｅ．ｃｏｌｉプラスミドのＤＮＡはｐＡＬ５０００のＤＮＡ内に挿入 されている、 ハイブリッドのマイコバクテリアーバクテリアのベクター。 １６、問題のＤＮＡは少なくとも１つのタンパク質またはポリペプチドをエンコ ードする、上記第１５項記載のハイブリッドのマイコバクテリアーバクテリアの ベクター。 １７、問題のＤＮＡは、抗原、酵素、リンフォカイン、イムノポテンシエイター およびリポーター分子から成る群より選択される少なくとも１つのタンパク質ま たはポリペプチドをエンコードする、上記第１６項記載のハイブリッドのマイコ バクテリアーバクテリアのベクター。 １８、プラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉの中で複製しそしてマイコバクテリアを溶 原化することができ、次の成分：ａ、複製のバクテリアの由来、 ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選択のための選択可能なマーカーをエンコー ドするＤＮＡ、 ｃ、独特ＥｃｏＲ１部位、 ｄ、ラムダファージｃｏｓ部位、およびｅ、マイコバクテリア中のプラスミドの 選択のための選択可能なマーカーをエンコードするＤＮＡ、 からなり、前記成分はテンペレートマイコバクテリオファージのゲノムのＤＮＡ の非必須領域の中に挿入されている、シャトルプラスミドベクター。 １９、バクテリアの由来はＣｏ１Ｅ１であり、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの選 択のための選択可能なマーカーをエンコードするＤＮＡはアンピシリン抵抗性を エンコードする遺伝子であり、そしてマイコバクテリア中のプラスミドの選択の ための選択可能なマーカーをエンコードするＤＮＡはカナマイシン抵抗性をエン コードする遺伝子であり、そしてテンペレートマイコバクテリオファージはＬ１ である、上記第１８項記載のシャトルプラスミド。 ２０、プラスミドとしてＥ．ｃｏｌｉの中で複製し、そしてマイコバクテリアを 溶原化することができ、Ｌ１マイコバクテリオファージ：：Ｅ．ｃｏｌｉコスミ ドｐＨＣ７９ハイブリッドである、シャトルプラスミドベクター。 ２１、Ｌ１マイコバクテリオファージのゲノムの非必須領域の中に挿入されたＥ ．ｃｏｌｉコスミドｐＨＣ７９からなる、ｐｈＡＥ１５と表示するＬ１シャトル プラスミド。 ２２、マイコバクテリウムの中で複製しそしてマイコバクテリアのゲノムのＤＮ Ａの中に組み込むことができ、ａ、複製のバクテリアの由来、 ｂ、バクテリア宿主中のベクターの選択のための選択可能なマーカーをエンコー ドするＤＮＡ、 ｃ、マイコバクテリア中のベクターの選択のための選択可能なマーカーをエンコ ードするＤＮＡ、 ｅ、テンペレートマイコバクテリオファージのａｔｔ領域、およびラムダファー ジｃｏｓ部位、 からなる、ｃｏｓ−ａｔｔシャトルベクター。 ２３、マイコバクテリウムの中で染色体外で複製することができる複製のバクテ リアプラスミド由来をエンコードする、分離したＤＮＡ。 ２４、上記第１３項記載のバクテリアーマイコバクテリアのシャトルプラスミド をその中に安定に組み込んで有する組み換えマイコバクテリウム。 ２５、バクテリアーマイコバクテリアのシャトルプラスミドはＥ．ｃｏｌｉ−マ イコバクテリアのシャトルプラスミドである、上記第２４項記載の組み換えマイ コバクテリウム。 ２６、組み換えスメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ ）または組み換えウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）−ＢＣ Ｇである、上記第２５記載の組み換えマイコバクテリウム。 ２７、少なくとも１つの問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコードする 問題のＤＮＡのエピソームの発現をすることができ、前記問題のＤＮＡは上記第 １５項記載のバクテリアーマイコバクテリアのシャトルプラスミド中の組み換え マイコバクテリウムの中に存在する、組み換えマイコバクテリウム。 ２８、前記問題のタンパク質またはポリペプチドは、抗原、酵素、リンフォカイ ン、イムノポテンシエイターおよびリポーター分子から成る群より選択される上 記第２７項記載の組み換えマイコバクテリウム。 ２９、問題のＤＮＡは、 ａ、１、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）抗原、２、ヒト 型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗体、３ 、マラリアスポロゾイト、４、マラリアメロゾイト、５、ジフテリアトキソイド 、６、破傷風トキソイド、７、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）抗原、 ８、サルモネラ抗原、９、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ａｆｒｌｃａｎｕｍ）抗原、１０、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）抗 原、１１、鳥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）抗原、１２、 トロポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）抗原、１３、百日咳抗原、１４、ヘルペス ウイルス抗原、１５、はしかウイルス抗原、１６、おたふくかぜウイルス抗原、 １７、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）抗原、１８、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ ａ）抗原、１９、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原、２０、狂犬病抗原、２１ 、ポリオウイルス抗原、２２、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、２３、へび毒物抗原 、２４、昆虫毒物抗原、および２５、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 ｂ、ステロイド酵素、 ｃ、インターリューキン１〜７、 ｄ、腫瘍壊死因子αおよびβ、 ｅ、インターフェロンα、βおよびγ、およびｆ、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質抗原をエンコードする、 上記第２７項記載の組み換えマイコバクテリウム。 ３０、ａ、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）、 ｂ、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ、ｃ、鳥 結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、ｄ、チモテ菌（Ｍｙｃｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ）、ｅ、マイコバクテリウム・フォルツイツム （Ｍｙｃｏｂａｃｔｃｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、ｆ、マイコバクテリウ ム・ルフ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｆｕ）、ｇ、パラ結核菌（Ｍｙｃ ｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、ｈ、マイコバク テリウム・ハバナ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｂａｎａ）、ｉ、マイコ バクテリウム・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｃｒｏｆｕ ｌａｃｅｕｍ）、ｊ、マイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｏ ｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）、およびｋ、それらのいずれか の遺伝子変異型から成る群より選択される、上記第２９項記載の組み換えマイコ バクテリウム。 ３１、マイコバクチリオファージのＤＮＡ、バクテリアのコスミドＤＮＡおよび 問題のＤＮＡからなる、テンペレートシャトルスプライシングで安定に溶原化さ れた組み換えマイコバクテリウム。 ３２、マイコバクテリオファージのＤＮＡはＬ１のＤＮＡであり、そしてバクテ リアのコスミドＤＮＡはＥ．ｃｏｌｉのＤＮＡである、上記第３１項記載の組み 換えマイコバクテリウム。 ３３、問題のＤＮＡは、 ａ、１、らい菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｅｐｒａｅ）抗原、２、ヒト 型結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒ１ｕｍ　ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）抗体、３ 、マラリアスポロゾイト、４、マラリアメロゾイト、５、ジフテリアトキソイド 、６、破傷風トキソイド、７、リーシュマニア（Ｌｅｉｓｈｍａｎｉａ）抗原、 ８、サルモネラ抗原、９、マイコバクテリウム・アフリカヌム（Ｍｙｃｏｂａｃ ｔｅｒｉｕｍ　ａｆｒｉｃａｎｕｍ）抗原、１０、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）抗 原、１１、鳥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）抗原、１２、 トロポネーマ（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）抗原、１３、百日咳抗原、１４、ヘルペス ウイルス抗原、１５、はしかウイルス抗原、１６、おたふくかぜウイルス抗原、 １７、赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）抗原、１８、ナイセリア（Ｎｅｉｓｓｅｒｉ ａ）抗原、１９、ボレリア（Ｂｏｒｒｅｌｉａ）抗原、２０、狂犬病抗原、２１ 、ポリオウイルス抗原、２２、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、２３、へび毒物抗原 、２４、昆虫毒物抗原、および２５、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 ｂ、ステロイド酵素、 ｃ、インターリューキン１〜７、 ｄ、腫瘍壊死因子αおよびβ、 ｅ、インターフェロンα、βおよびγ、およびｆ、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される少なくとも１種のタンパク質抗原をエンコードする、 上記第３２項記載の組み換えマイコバクテリウム。 ３４、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｏ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託Ｎｏ．６７７ ４６で受託された、シャトルプラスミドｐｈＡＥ１９で溶原化された組み換えス メグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｓｍｅｇｎｌａｔｉｓ）。 ３５、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託Ｎｏ．６７７ ４５で受託された、シャトルプラスミドｐＹＵＰ１１００で形質転換された組み 換えマイコバクテリウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ＢＣＧ−パスツール（ Ｐａｓｔｅｕｒ）下位菌株（ｓｕｂｓｔｒａｉｎ）Ｐ１１７３Ｐ２。 ３６、成分： ａ、マイコバクテリアのゲノムのＤＮＡ中のＤＮＡ配列に対して相同性のＤＮＡ 配列。 ｂ、Ｅ．ｃｏｌｉ中のプラスミドの複製および選択に必要なＤＮＡ配列、 ｃ、マイコバクテリア中のプラスミドの選択に必要なＤＮＡ配列、および ｅ、マイコバクテリアの中で発現すべき少なくとも１つのタンパク質または少な くとも１つのポリペプチドをエンコードするＤＮＡ、からなる、マイコバクテリ アのゲノムのＤＮＡの中に問題のＤＮＡを組み込むのためのプラスミドベクター 。 ３７、Ｅ．ｃｏｌｉの中で複製することができるが、マイロバクテリアの中で複 製することができず、 ａ、ｐＵＣ１９のＢａｍＨＩ部位に挿入されたマイコバクテリアのＰｙｒＦ遺伝 子、 ｂ、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子、およびｃ、少なくとも１つのタンパク 質または少なくとも１つのポリペプチドの抗原をエンコードするＤＮＡ、 からなる和み換えプラスミド。 ３８、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子はカナマイシン抵抗性をエンコードす る遺伝子である、上記第３７項記載の組み換えブラスミド。 ３９、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（ｔｈｅ　Ａｍｅｒｉｃ ａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕｌｔｕｒｅ　Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）に受託Ｎｏ．４０４ ６８で受託された、ｐＲＨ１１００と表示する、ｐＵＣ１９、スメグマ菌（Ｍｙ ｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇｍａｔｉｓ）およびＴｎ９０３からのＤＮＡ を含有するプラスミドＤＮＡ。 ４０、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子および問題の抗原をエンコードするＤ ＮＡをその中に挿入して有するマイコバクテリアのＰｙｒＦ遺伝子を、マイコバ クテリアのゲノムの中に、安定に組み込むことからなる、問題の抗原をエンコー ドするＤＮＡをマイコバクテリウムの中に導入する方法。 ４１、ｐＵＣ１９のＤＮＡ、マイコバクテリアのＤＮＡの一部分と相同性のＤＮ Ａ、問題のＤＮＡ、およびマイコバクテリア中の組み換えプラスミドの選択に必 要なＤＮＡからなる組み換えプラスミド。 ４２、工程： ａ、マイコバクテリアを組み換えプラスミドで形質転換し、前記組み換えプラス ミドは、１）マイコバクテリアのゲノムのＤＮＡの一部分に対して配列が相同性 のＤＮＡ、２）Ｅ．ｃｏｌｉ中の複製および選択に必要なＤＮＡ、３）マイコバ クテリア中の選択に必要なＤＮＡ、および４）発現すべきタンパク質またはポリ ペプチドをエンコードするＤＮＡからなり、前記形質転換はマイコバクテリアの ゲノムのＤＮＡに対して配列が相同性のプラスミドおよび相同性マイコバクテリ アのゲノムのＤＮＡの中でＤＮＡの組み換えが起こるために適当な条件下に実施 し、そして ｂ、相同性の組み換えが起こったマイコバクテリアの細胞を選択する、からなる 、マイコバクテリウムの中で発現すべきタンパク質またはポリペプチドをエンコ ードするＤＮＡをマイコバクテリアのゲノムの中に組み込む方法。 ４３、工程： ａ、１）マイコバクテリアのゲノムの一部分に対して配列が相同性のＤＮＡ、２ ）Ｅ．ｃｏｌｉ中の複製および選択に必要なＤＮＡ、３）マイコバクテリア中の 選択に必要なＤＮＡ、および４）問題のＤＮＡからなる組み換えプラスミドを、 エレクトロポレイションにより、マイコバクテリアの細胞の中に導入し、 ｂ、組み換えプラスミドをそれらのゲノムの中に組み込んで有するマイコバクテ リアの細胞のみが生き残ることができる培地上にエレクトロポレイションした細 胞を平板培養し、そしてｃ、問題のＤＮＡをそれらのゲノムの中に安定に組み込 んで有するマイコバクテリアの細胞のみが生き残ることができる培地上に、生き 残る細胞を平板培養する、 からなる、マイコバクテリアのゲノムを問題のＤＮＡの中に安定に組み込む方法 。 ４４、工程： ａ、ｐＵＣ１９のＤＮＡ、マイコバクテリアのＰｙｒＦ遺伝子、カナマイシン抵 抗性をエンコードする遺伝子および問題のＤＮＡからなる組み換えプラスミドを 、エレクトロポレイションにより、マイコバクテリアの中に導入し、前記Ｐｙｒ Ｆ遺伝子はカナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子および問題のＤＮＡその 中に挿入して有し、そして相同性の組み換えが起こるのために適当な条件下に、 生ずるマイコバクテリアを維持し、 ｂ、エレクトロポレイションしたマイコバクチリアをカナマイシンを含有する培 地上に培養し、 ｃ、工程（ｂ）において培養したマイコバクテリアをフルオロ−オロチン酸を含 有する培地上に移し、そしてｄ、フルオロ−オロチン酸を含有する培地上で増殖 するマイコバクテリアを分離する、 からなる、ゲノムのＤＮＡの中に安定に組み込まれた問題のＤＮＡ有する組み換 えマイコバクテリアを産生する方法。 ４５、ゲノムのＤＮＡの中に安定に組み込まれた問題のＤＮＡ有する組み換えマ イコバクテリウムからなり、前記問題のＤＮＡは免疫応答を望むタンパク質また はポリペプチドをエンコードする、ワクチン。 ４６、組み換えマイコバクテリウムはウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｍｅｇ ｍａｔｉｓ）またはその遺伝子変異型である、上記第４５項記載のワクチン。 ４７、哺乳動物の宿主に組み換えマイコバクテリウムを投与することからなり、 前記組み換えマイコバクテリウムは１または２以上の病原体の各々のための少な くとも１つの抗原をエンコードするＤＮＡをそのゲノムの中に組み込んで有する 、１または２以上の病原体に対して哺乳動物の宿主を免疫化する方法。 ４８、１または２以上の病原体の各々のための少なくとも１つの抗原をエンコー ドするＤＮＡをウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｂｏｖｉｓ）−ＢＣＧ のゲノムの中に安定に組み込むことからなる、１または２以上の病原体に対して 哺乳動物の宿主を免疫化するワクチンを調製する方法。 ４９、適当なエレクトロポレイション緩衝液の中でシャトルプラスミドおよびマ イコバクテリアを組み合わせ、そして前記組み合わせをエレクトロポレイション の単一のパルスに暴露することからなる、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテリア の中で複製しそして外来ＤＮＡを発現することができるシャトルプラスミドを完 全なマイコバクテリウムの中に導入する方法。 ５０、エレクトロポレイションの単一のパルスは６２５０Ｖ／ｃｍにおいて２５ ｕＦである、上記第４９項記載の方法。 ５１、シャトルプラスミドはシャトルプラスミドｐＹＵＰ１１００であり、そし て完全なマイコバクテリウムは、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓ ｍｅｇｍａｔｉｓ）、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ） −ＢＣＧ、鳥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、チモテ菌（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・フォルツイ ツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウ ム・ルフ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｆｕ）、パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム ・ハバナ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｂａｎａ）、マイコバクテリウム ・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から成る群より選択される、上記第４９項記 載の方法。 ５２、工程： ａ）１）組み換えプラスミドのライブラリー、前記ライブラリーはバクテリアの プラスミドのＤＮＡおよびマイコバクテリアの中で複製するプラスミドからのＤ ＮＡから本質的に成る組み換えプラスミドのＤＮＡからなる、および２）完全な マイコバクテリアを、適当なエレクトロポレイションの緩衝液の中で、組み合わ せ、そしてｂ）ａ）において形成した組み合わせを十分な大きさおよび期間のエ レクトロポレイションの単一のパルスに暴露して、組み換えプラスミドのＤＮＡ をマイコバクテリアの中に入れる、からなる、Ｅ．ｃｏｌｉおよびマイコバクテ リアの中で外来ＤＮＡを複製および発現することができるシャトルプラスミドの ＤＮＡを完全なマイコバクテリアの中に導入する方法。 ５３、シャトルプラスミドはシャトルプラスミドｐＹＵＰ１１００であり、そし て完全なマイコバクテリウムは、スメグマ菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓ ｍｅｇｍａｔｉｓ）、ウシ結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｂｏｖｉｓ） −ＢＣＧ、鳥結核菌（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ａｖｉｕｍ）、チモテ菌（ Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐｈｌｅｉ）、マイコバクテリウム・フォルツイ ツム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ）、マイコバクテリウ ム・ルフ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｌｕｆｕ）、パラ結核菌（Ｍｙｃｏｂ ａｃｔｅｒｉｕｍ　ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ）、マイコバクテリウム ・ハバナ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｈａｂａｎａ）、マイコバクテリウム ・スクロフラセウム（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ ）およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅ）から成る群より選択される、上記第５２項記 載の方法。 ５４、組み換えプラスミドのライブラリーはｐＩＪ６６６：ｐＡＬ５０００のラ イブラリーであり、そしてエレクトロポレイションの単一のパルスは６２５０Ｖ ／ｃｍにおいて２５ｕＦである、上記第５３項記載の方法。 ５５、工程： ａ、病原性有機体に対して特異的なシャトルプラスミドを準備し、前記シャトル プラスミドはリポーター分子をエンコードするＤＮＡおよび病原性有機体の中で 機能することができるプロモーターからなり、リポーター分子をエンコードする ＤＮＡの発現は前記プロモーターの制御下にあり、 ｂ、シャトルプラスミドのＤＮＡを病原性有機体の中に導入するために適当な条 件下に、試料を前記シャトルプラスミドと組み合わせ、ｃ、前記リポーター分子 をエンコードするＤＮＡの発現に適当な条件下に、工程（ｂ）の産生物を維持し 、そしてｄ、前記リポーター分子を検出する、 からなる、試料中の選択した病原性有機体の存在を検出する方法。 ５６、病原性有機体はマイコバクテリウムであり、プロモーターはマイコバクテ リアのプロモーターであり、そしてリポーター分子はルシフェラーゼである、上 記第５５項記載の方法。