JPH04500305A - 組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用 - Google Patents
組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
組み換えマイコバクテリアの発現ベヒクルおよびその使用外来抗原(例えば、病
原体または毒素)に対する免疫性は、受動転線または活性誘発により提供するこ
とができる。前者の場合において、外来病原体に対する抗体を個体に注射し、そ
の結果短時間の保護が与えられる。後者の場合において、無害(無毒)の形態、
病原体の成分、または毒素の変性した形態(すなわち、トキソイド)は個体の免
疫系を刺激し、長時間の保護を与える。
活性免疫性は、個体の免疫系が競合的であるかぎり、適当な抗原を使用して免疫
系を刺激することによって誘発することができる。例えば、この方法において無
毒のまたは弱毒化した形態の病原体を使用する免疫化(ワクチン接種)は直ちの
免疫応答、ならびに免疫学的「メモリー」を生じ、こうして長期間の保護を同様
によく与える。一般に、ワクチンは不活性化した、非病原性または弱毒化した形
態の病原体または感染性因子を包含し、これは病原体の抗原決定基を包含し、こ
うして免疫応答誘発する。同様に、毒素は、微生物、植物および動物により産生
される抗原性物質であり、トキソイドに変換することができる;こうして、それ
らは修飾して、それらの毒性を破壊するが、それらの抗原性を保持しそして、結
局、抗毒素抗体の産生を刺激しかつ活性な免疫性を産生ずるそれらの能力を保持
する。このようなトキソイドは毒性に対するワクチンのために使用することがで
きる。
両者の場合において、変更した形態の感染性病原体の投与による免疫応答の刺激
を含むこと、およびトキソイドの投与を含むこと一一現在利用可能な手順−一は
、一般に有効であるが、ワクチン接種から生ずる副作用および死亡が起こること
が知られている。
安全なワクチンは、病原体の抗原決定基および遺伝子工学7組み換えDNA技術
のより知識の応用により、現在開発されている。例えば、免疫応答を引き出すこ
とが知られているタンパク質抗原の1成分(例えば、抗原決定基)であるポリペ
プチドをつくることができる(例えば、化学的合成または問題のポリペプチドを
エンコードするDNAの発現により)。
宿主へのポリペプチドの投与すると、抗原決定基に対する宿主による免疫応答が
起こる。このようなポリペプチドの使用は、生ワクチンまたは弱毒化ワクチンの
使用に伴う感染の危険を伴わない。
免疫化(ワクチンの投与)は普通の普及した手順であり、そして使用するワクチ
ンは本質的に「活性な免疫学的予防を意図する調製物」であり、ビルレント菌株
の殺した微生物、弱毒化菌株の生きている微生物、および微生物、菌・かび、植
物、原生動物または後生動物の誘導体または産生物の調製物を包含する。ステッ
ドマンの図解医学辞典(Stedman’ s l1lustrates Me
dical Dicti。
nary)(第24版)、Williams & Wilktns。
Ba I t imore、p、1526 (1982)、多くの場合において
、ワクチンは1より多い回数で投与して、有効な保護を誘発しなくてはならない
;例えば、抗毒素ワクチンは多数回の投与で与えな(ではならない。
子供のワクチン接種は平凡であり、そして一般に発展した国において成功してお
り、ここで健康のサービスを容易に飢えられ、そして多数回の免疫化(例えば、
多数の病原体に対する免疫化および単一の病原体に対する系統的または多数の免
疫化)は可能である。発展途上国において、ワクチン接種は極めて希であり、そ
してさらにいっそう問題を生ずる。
例えば、発展途上国において毎年生まれた100×108人の子供の約20%に
のみが、ジフテリア、百日咳、破傷風、はしか、ポリオおよび結核に対してワク
チンされる。毎年、発展途上国において5X10’人の子供および他の5X1.
O’人の子供はこれらの病気により生理学的にまたは精神的に不能となり、これ
は適切な免疫化が可能である場合、予防することができるであろう。単一の投与
で長期間の免疫性を与えることができる有効なワクチンの入手可能性は、もちろ
ん、発展した国および発展途上国の両者において価値があるであろう。
大人のワクチン接種は、また、大人における多数の病気の予防において有効であ
りそして、子供の場合におけるように、発展途上国において、とくに多数の免疫
化が必要である場合、実施が困難であることが証明された。病気、なかでも、例
えば、らい、マラリア、結核およびポリオは、大人の間で、アフリカ、アジアお
よびラテンアメリカにおいて高い発生率を有し、そして毎年数千式の死亡の原因
である。
多くの努力が主要な病気に対するワクチンの開発において消費されておりそして
、最近、外来遺伝子を発現するために組み換えワクチンのベヒクル(例えば、遺
伝子工学したウィルス)が考慮されてきている。例えば、ウィルスの抗原がワク
シニアウィルスの中に挿入された、組み換えワクシニアウィルスが開発された。
例えば、B型肝炎の遺伝子、インフルエンザウィルスの遺伝子または狂犬病ウィ
ルスをエンコードするDNAは、ワクチンをつくる努力において、ワクシニアウ
ィルスのDNAにスプライシングされてきている。パニカリ(Pan i ca
l i) 、D。
ら、ブロシーデインダス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ
(Proc、Na t 1.Acad、Sc i、)USA、3Q、5364−
5368 (1983):オール(Or r) 、T、 、遺伝子工学のニュー
ス(Genet ic Engineering News)、p、17 (1
985年3月);バオレッチ(Paoletti)、E。
およびり、バニカリ(Pan ica l i) 、米国特許第4. 603.
112号。
しかしながら、このような組み換えワクシニアウィルスはワクチンとして少なく
とも2つの重要欠点有するであろうことが広く認められている。第1に、処置不
可能な、ワクシニアウィルスに関連する、有意な致死率および罹患率(1: 1
00.000)が存在する。第2に、ワクシニアウィルスに前に暴露した個体の
組み換えワクシニアを使用するワクチン接種は、しばしば、満足すべき免疫化レ
ベルを生成することができなかった。フェンナ−(Fenner) 、F、 、
ワクチンの開発に対する新規なアプローチ(New Approeh to V
accineDeve lopment) 、R,ベル(Be11)およびG、
l−リギア=(Torrigiani)(編)、Schwabe & Co、、
p、187 (1984)。
今日まで、所定の病原体に対して免疫性を誘発するとき多くの場合において有効
であるが、1より多い回数で投与しなくてはならなず、そして病原体に対して、
長期間の基準で、保護を提供することができるワクチンが開発された。さらに、
多くの場合(例えば、らい、マラリアなど)において、有効なワクチンはなお開
発しなくてはならない。
マイコバクテリア
マイコバクテリアは人間および動物の主要な病原体を表す。例えば、結核は、一
般に、ヒトにおいてヒト結核菌(Mycobacterium(M、) tub
erculosis)によりそして畜生においてウシ結核菌(Mycobaet
erium(M、) bovis)−BCG(これはヒトおよび結核を引き起こ
す他の動物に伝播することがある)により引き起こされる。結核は広く広がった
ままであり、そしてとくに発展途上国において、重要な公衆の健康の問題である
。結核の世界中の広がりはほぼl0XIO’の場合が存在し、毎年の致死は3X
10@であると推定される。結核に対するジヨイント・インターナショナル・ユ
ニオンおよび世界の健康の機構の研究グループ(Joint Internat
ionai Against Tuberculosis and World
Health Organization 5tudy Group)、Tu
bercle、63:157−169(1982)。
らいは、らい菌(M、1eprae)により引き起こされ、主として発展途上国
において、10×101人を趙える人々を犯す。ブルーム(B ] oom)
、B、 R,およびT、ボウダル(Godal)、伝染病の外観(Review
of Infectious Doseases) 、5 : 657−67
9 (1984) 。ヒト結核菌(M、tuberculosis)およびアビ
ウムーイントラセルラレースクロフラセウム(avium−intrace I
lulare−scrofulaceum)(MAIS)群は、後天性免疫欠
損病(AIDS)をもつ患者の主要な日和見病原体を表す。病気の制御のセンタ
ー(Centersfor Disease)、罹患率および致死率のウィーク
リー・リシュードチューバクロシス(M、pseudotuberculosi
S)は畜生の主要な病原体である。
他方において、バシレ・カルメツチーブニリン(Bacil!eCa1mett
e−Guerin)(BCG)、ウシ結核菌(M、b。
vis)のビルレントは、世界における最も広く使用されているヒトのワクチン
であり、そして50年より多い間生ワクチンとして使用されてきている。過去3
5年において、それは2.5XIO’人を越える人々に投与されてきており、悪
影響は顕著にう少ない(例えば、60/109の推定された致死率)。BCGは
、多数の研究において、結核に対して保護的効能有することが発見された。しか
しながら、最近、南インドにおいて肺結核の予防において有効であることは発見
されなかった。結核の予防の実験(Tuberculosis Prevent
ionTrial)、7ドラス(Madras)、インディアン・ジャーナル・
オブ・メディカル・リサーチ(Indian Journal ofこうして、
BCGを包含する、多数の入手可能なワクチンが存在するが、多くは、制限され
た応答を誘発するので、価値において制限され、多数回の投与で与えなくてはな
らないおよび/または悪い副作用有する。
他の場合(例えば、らい、マラリア)において、ワクチンは簡単に入手可能では
ない。悪影響を及ぼさないで問題の1または2以上の病原体に対する保護を提供
するために十分な免疫性を受容体において長期間刺激する、前記病原体に対する
ワクチンが入手可能である場合、大きい価値があるであろう。
発明の説明
本発明は、遺伝子操作技術を使用して、マイコバクテリアの中に組み込まれた問
題のDNA (ここでそれはマイコバクテリアのゲノムの中に存在する)を発現
する、遺伝子的に組み換え(遺伝子操作された)培養可能なマイコバクテリア:
問題のDNAをマイコバクテリアの中に導入するために有用なベクター;マイコ
バクテリアの中にDNAを導入する方法、およびマイコバクテリアのゲノムの中
にDNAを組み込んで遺伝子的組み換えマイコバクテリアを産生ずる方法に関す
る。本発明は、さらに、1または2以上のシャトルプラスミドである、遺伝子操
作したシャトルベクターによりマイコバクテリアの異なる属の間で遺伝子物質を
転移する方法に関する。これらのシャトルベクターは、また、本発明の主題であ
り、マイコバクテリアの異なる族の間の遺伝子物質の転移およびマイコバクテリ
アの中への問題のDNAの導入に有用である。
本発明の組み換えDNAベクターは、2つの型をもつ:テンペレートシャトルプ
ラスミドおよびバクテリア−マイコバクテリアのシャトルプラスミド(例えば、
E、coli−マイコバクテリアシャトルプラスミド)。組み換えベクターの各
型は問題のDNAをマイコバクテリアの中に安定に導入することができ、ここで
DNAを次いで発現することがでおいて、マイコバクテリアの染色体またはゲノ
ムの中への安定に組み込みは部位特異的組み込みを経て起こる。問題のDNAは
染色体のDNAの一部分として複製される。問題のDNAを含む、バクテリア−
マイコバクテリアのシャトルプラスミドの場合において、問題のDNAはプラス
ミドとして染色体外に安定に維持される(プラスミドの1成分として)。
問題のDNAの発現はプラスミドとして染色体外で起こる(例えば、エピソーム
的に)、例えば、問題の1または2以」−の遺伝子はバクテリア−マイコバクテ
リアのプラスミドの中にクローニングされ、そして培養可能なマイコバクテリア
の中に導入され、ここでそれはエビソームの複製(染色体外の複製)を行う。本
発明の方法に従い、組み換えプラスミドを使用して、問題のDNAをマイコバク
テリアの細胞の中に導入し、そしてDNAをマイコバクテリアのゲノムの中に組
み込む。使用する組み換えプラスミドは、次のものを包含する二1)相同性の組
み換え(プラスミドを有する配列とマイコバクテリアのゲノム中の配列間)起こ
すために必要なマイコバクテリアの配列(プラスミドを有するマイコバクテリア
の配列と呼ぶ)+2)E、coli中の複製および選択に必要なりNA配列;お
よび3)問題のDNA (例えば、選択可能なマーカーをエンコードするDNA
および問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコードするDNA)。組み換
えプラスミドは、既知の技術を使用して、マイコバクテリアの細胞の中に導入す
る。プラスミド中のマイコバクテリアの配列は、マイコバクテリアのゲノムの中
に存在するものと同一であるが、相同性組み換えを可能とするマイコバクテリア
のゲノムの中に存在するものに十分に類似する。プラスミドを有するマイコバク
テリアのDNAの中に存在する配列の相同性およびマイコバクテリアのゲノムの
中に存在する十分に類似する配列の同一性の「認識」は、入る(プラスミドを有
する)マイコバクテリアのDNAの相同性領域とゲノムのマイコバクテリアのD
NAとの間の交差型およびマイコバクテリアのゲ、ツム中への組み換えプラスミ
ドの組み込みを生ずる。組み込みは、非必須(すなわち、マイコバクテリアの複
製に必須ではない)マイコバクテリアのゲノム中の選択した部位において起こる
。相同性プラスミドの配列の組み込みは、マイコバクテリアのゲノム中の問題の
DNへの相み込みを伴う。
本発明は、さらに、マイコバクテリアのDNAの中に組み込まれたか、あるいは
プラスミドとして染色体外に維持される、問題のDNAを発現する組み換えマイ
コバクテリアに関する。このような組み換えマイコバクテリアは、適当なマイコ
バクテリア、例えば、スメグマ菌(M、smegmatisLウシ結核m CM
、bov 1s)−BCG、鳥結核菌(M、aviumLチモテ菌(M、phl
ei)、マイコバクテリウム・フォルライツム(M、fortuitum)、マ
イコバクテリウム・ルフ(M、IufuLバラ結核菌(M、paratuber
cul。
5is)、vイコバクテリウム+ハバナ(M、habana) 、マイコバクテ
リウム・スクロフラセウム(M、scrofulaeeum)およびマイコバク
テリウム・イントラセルラレ(M、i n t race I Iulare)
の中に導入することによって産生ずることができる。問題のDNAがゲノムのD
NAの中に組み込まれる、組み換えマイコバクテリアにおいて、問題のDNAは
次のような方法で存在する+1)マイコバクテリアの遺伝子は置換される(すな
わち、マイクバクテリアのゲノムの中にもはや存在しない)か、あるいは2)問
題のDNAはマイクバクテリアの遺伝子の中に挿入され、その結果a)マイコバ
クテリアの遺伝子は完全にかつ機能的に残るか、あるいはb)マイコバクテリア
の遺伝子は崩壊しかつ非機能的とされる。
生ずる遺伝子的に組み換えのマイコバクテリア(例えば、組み換えBCG、組み
換えスメグマ菌(M、sme gma t i s)は、問題のDNAをそれに
より発現することができる、ベヒクルとしてとくに有用である。これらは遺伝子
的に組み換えのマイコバクテリアまたはマイコバクテリアの発現ベヒクルと呼ぶ
。このようなベヒクルは、例えば、1または2以上の問題の病原体のための、問
題のタンパク質またはポリペプチド(または1より多いポリペプチドまたはタン
パク質)、例えば、1または2以上の抗原を発現するワクチンのベヒクルとして
使用することができる。組み換えマイコバクテリアは、また、イムノボテンシェ
イター、例えば、酵素、製剤学的剤および抗腫瘍剤の発現のための:抗受精ワク
チンのベヒクルの産生において有用なポリペプチドまたはタンパク質の発現のた
めの;または免疫応答を誘導するか、あるいは自己免疫病(例えば、慢性関節リ
ウマチ)における耐性を誘発するために投与することができる、ストレスタンパ
ク質の発現のためのベヒクルとして使用することができる。組み換えマイコバク
テリアは、例えば、増殖阻害因子であるか、あるいは腫瘍細胞の殺細胞性である
1または2以上のタンパク質またはポリペプチド(例えば、インターフェロンα
、βまたはγ;インターリューキン1〜7、腫瘍壊死因子(TNF)αまたはβ
)を発現し、こうして、ある種のヒトの癌(例えば、膀胱癌、黒色症)の処置の
ための新しい方法の基準を提供することができる。問題の病原体は、ウィルス、
微生物、または病気を引き起こす他の有機体または物質(例えば、毒素またはト
キソイド)を包含する。本発明は、また、宿主を組み換えマイコバクテリアでワ
クチン接種して、宿主の中に保護的免疫性を引き出す方法に関する。組み換えワ
クチンを使用して、体液抗体の免疫性、細胞の免疫性(ヘルパーおよび細胞毒性
の免疫性を包含する)および/または粘膜または分泌の免疫性を生成することが
できる。さらに、本発明は、組み換え培養可能なマイコバクテリウムにより発現
された抗原をワクチンまたは診断試薬として使用することに関する。
本発明のワクチンは、現在入手可能なワクチンを越えた重要な利点を有する。第
1に、マイコバクテリアは最もよく現在知られているなかでアジュバントの性質
を有し、こうして、受容体の免疫系を刺激して、大きい有効性をもって他の抗原
に対して応答させる。これは細胞仲介免疫性を誘発するのでワクチンのと(に個
値ある面であり、こうして、細胞仲介免疫性が抵抗性のために重要であると思わ
れる場合において、病原体に対する免疫性を提供するとき、ことに有用である。
第2に、マイコバクテリウムは長期間のメモリーまたは免疫性を刺激する。結局
、単一(1回)の接種を使用して、タンパク質抗原に対する長期間の感作を生成
することができる。本発明のワクチンベヒクルを使用すると、長く持続するT細
胞のメモリーをブライミングすることができ、これは感染性因子または毒素を中
和する二次抗体の応答を刺激する。これは、例えば、破傷風およびジフテリアの
毒素、百日咳、マラリア、インフルエンザ、ヘルペスウィルスおよびへびの毒物
に対して有用である。
とくにBCGは、ワクチンのベヒクルとして、次の理由で重要な利点を有する+
1)それは出産のとき現在与えられる子供のワクチンのみである;2)過去40
年間、それは結核に対するワクチンとして与えられたとき、悪影響の発生は非常
に低かった;そして3)それは個体において反復して使用することができる(例
えば、多数の形態で)。
とくにBCG、ならびに一般にマイコバクテリアのそれ以上の利点は、そのゲノ
ムの大きさが大きい、二とである(はぼ3X10’bpの長さ)。
ノア゛/ムは火きいので、それは大量のD N Aを他の源(すなわち、問題の
D N A )を収容することができ、こうして、マルチ−ワクチンベヒクル(
14なオ)ち、1より多い病原体に対する保護的抗原をエンコードする問題の!
、’) N Aをaするもの)を作るために使用することができるう図面の簡単
な説明
第1図は、スメグマ菌(〜1ycobacterium smegmatis)
スフェロプラス1−とマイコバクテリオファージD29 DNAのトランスフエ
クン3゛/の結果を示す。
第2図は、シャトルプラスミド、phAElの構成の概略的表示である。
第3図は、シャトルプラスミドphAE1の評価の結果を示す。
第3A図は、Kpnlで消化したマイコバクテリオファージTM4D N Aお
よびツヤトルプラスミドphAEI DNAのアガロースゲルを示す。レーン1
はHindIIIで消化したラムダD N Aを含有する。
レーン2および3は、Kpnlによる消化切断の前に、非結合(レーン2)また
は結合した(レーン3)7M4 DNAを含有する5レーン4および5は、スメ
グマ菌(M、sme gma t i s)上で増殖したファージ粒子から分離
したphAEI DNA (レーン4)およびプラスミドとしてE、coli細
胞から分離しあpbAEl(レーン5)を含有する。矢印は、精査末端において
結合したとき、3.9Kbの断岸を形成する、2.IKbおよび1.8Kbを指
すことに注意すべきである。
第;)13図は、プローブとしてp HC79を使用する、プラスミドphAE
Iのサザンプロットの分析の結果を示す(パネルB)。第3A図のオートラジオ
グラフは、バイ第1・ランス(Biotrans)ナイロン!(ICN)七にプ
ロ2ノテイングし、そして32P−dCTPでニック翻訳したpHC79DNA
でブロービングした後、示された。
第4図はBCG上のphAElの複製を示す。それは、DS6A、これはヒト結
核菌(M、tuberculosis)およびBCG上でプラーク形成するが、
他のマイコバクテリアのプラーク形成については知られていない:ファージ33
D、これはスメグマ菌(M、smegmatis)上でプラーク形成することは
知られているが、BCG上のそれ゛については知られていない:およびファージ
TM4、両者上でプラーク形成することが知られている;によりBCGのグラク
ツ(Glaxo)ワクチン菌株の溶菌を比較する。
第4A図は、ファージによるBCGの溶菌を示す。10−1の希釈で使用したフ
ァージ(pfu/ml)の力価は、次の通りであった: DS6a、ヒト結核菌
(M、tuberculosis)、H37Ra、上で2xlO’;33D、ス
メグマ菌(M、smegma t i s) 、me”6.1二で2X10’:
7M4、mc26上で3X10”;およびphAEl、mc26上で3X10’
Oフアージの希釈(5μl)を10’のBCG細胞を含有する軟寒天上にスポツ
ティングした。生ずる溶菌を、37℃において10日後、写真撮影した。
第4B図は、pbAEl中のコスミドDNAの存在を示す。これらの平板上のプ
ラークのリフトは、後述するように実施し、そして32p標識したpHC79D
NAとハイブリダイゼーションした:次いで、オートラジオグラフィーを実施し
た。
第4C図は、シャトルプラスミドphAElのファージ粒子の電子顕微鏡写真で
ある。CsClの勾配で精製したファージ粒子を炭素被覆した、バーロイドンン
(Pa r ] o i don)被覆したグリッド上に配置し、ブロッティン
グし、そして1滴の1%のホスホタングステン酸で洗浄した。電子顕微鏡写真は
JEOL 1200EX電子顕微鏡を80kV、30,0OOXで撮った。
第5図は、スメグマ菌(M、sme gma t i s)染色体の中にマイコ
バクテリアL1およびLl−シャトルプラスミドDNAを組み込むことを示す。
ファージL1およびLl−シャトルプラスミドからのDNAおよび対応する溶原
化からの染色体のDNAを、BamHIで消化し、そしてアガロース中で電気泳
動にかけた。パネルAは臭化エチジウムで染色したゲルを示す。パネルBは、S
2p標識したファージLI DNAでプロービングしたこのゲルのサザン分析の
オートラジオグラフを示す。次は示したレーンで示す:親のファージL1からの
ファージDNA (レーン2)、シャトルプラスミドphAE15から(レーン
4)およびaph遺伝子を含有するシャトルプラスミドphAE19から(レー
ン6):親のスメグマ菌(M、sme gma t i s)菌株からのバクテ
リアの染色体のDNA (レーン1)、Llで溶原化した菌株(レーン3)、p
bAEl5で(レーン5)、およびpbAEl9 (レーン7)。Ll、pbA
El5、およびpbAEl9は、各ファージの中に存在する単一の6,7kbの
バンドの主な損失(注、Ll、1ノー・ン2における四角形)および各リソゲン
における2つの新しいバンド、9.0kbおよび1゜7kgの出現(円形)によ
り明らかなように、それらのそれぞれのリソゲンの染色体内で部位特異的に組み
込まれた(パネルB、レーン3.5および7)。
第6図は、テンペレートシャトルプラスミドをクローニングベクターとして使用
して、問題のDNAをマイコバクテリアの染色体の中に導入することの概略的表
示である。問題のDNA(GENE X)をシャトルプラスミドDNAにおける
独特制限部位の中に挿入し、引き続いてマイコバクテリアの中に導入することが
できる。マイコバクテリアにおいて、問題のDNAを有する、シャトルプラスミ
ドを溶原化し、そしてファージとして安定に維持することができる。
第7図は、テンペレートシャトルプラスミドphAE19を使用する溶原性によ
るカナマイシン抵抗性の発現を示す。pbAEl9がmc26細胞を溶原化する
場合、コロニーは現れ、こうしてカナマイシン抵抗性の発現を実証する。多数の
実験において、カナマイシン抵抗性のコロニーはmc”5細胞またはpbAEl
5で溶原化したmc”6細胞のいずれの自発的突然変異体からも観測されなかっ
た。
第8図は、pAL5000ゲノム付近の不規則の部位に挿入された、ネオマイシ
ン/カナマイシン(n e o)およびクロラムフェニコール(cat)に対す
る抵抗性をを与えるマーカー遺伝子を含有する、E。
coliプラスミド、plJ666、から成るハイブリッドプラスミド分子のラ
イブラリーを発生するために使用した全体の方法の概略的表示である。
第9図は、スメグマ菌(M、Sme gma t j S)形質転換体の3つの
独立のプール(レーン1.2.3)から分離したplJ666: :pAL50
00組み換えシャトルプラスミドからのDNAのアガロースゲルの電気泳動の分
析の結果を示す。これらのプラスミドのプールの各々をE、coli菌株、23
38の中に別々に形質転換した後、単一の精製した形質転換体、pYUP13、
pYUP14およびpYUP15と表示する、から独特のプラスミドを分離し、
そして、それぞれ、レーン5.6および7に示す。レーン4はマイコバクテリウ
ム・フォルライツム(M、fortuitum)プラスミド、DAL5000、
を含有し、そしてレーンoI J666 : : pAL5000組み換え体の
ライブラリーを含有する。スメグマ菌(M、sme gma t i s)また
はE、c。
11のいずれから分離シャトルプラスミドの大きさは組み換え体のライブラリー
の大きさと同一であり、構成体の安定性を示す。
第10図は、BCGのシャトルプラスミドDNAによる形質転換を示す。パネル
Aは、シャトルプラスミドDNAを使用するBCG細胞のエレクトロポレインヨ
ン後、生ずるカナマイシン抵抗性BCGコロニーを示す;パネルBは、シャトル
プラスミドDNAを使用しないBCG細胞のエレクトロポレイション後、生ずる
カナマイシン抵抗性BCGコロニーを示す。
第11図は、プラスミドベクターpUc19のPyrF遺伝子中のKan挿入が
存在する、組み換えブラスミ、ドの構成の概略的表示である。
第12図は、PyrF遺伝子がKan挿入を含有する、pUc19組み換えプラ
スミドを使用するマイコバクテリアの細胞の形質転換の概略的表示である。第1
2A図は、Kan遺伝子を含有するPyrF遺伝子が存在する、マイコバクテリ
アの細胞の、カナマイシンを含有する培地上の増殖を使用する、選択の概略的表
示である。第12B図は、ゲノムのDNAの中に組み込まれたKan遺伝子を含
有するPyrF遺伝子を有するマイコバクテリアの細胞の、フルオロ−オロチン
酸を含有する培地上の増殖を使用する、選択の概略的表示である。
第13図は、Kanと選択した抗原(Fanど表示する)をエンコードするDN
AとのマイコバクテリアのD N Aの中への組み込みの概略的表示である。
第14図は、カナマイノン抵抗性をエンコードする遺伝子とのマイコバクテリア
のPyrF遺伝子の置換の概略的表示である。
第15図は、第14図に表すように産生じた組み換えマイコバクテリウムの中へ
のPyrF遺伝子および問題のDNAの組み込みの概略的表示である。
第16図は、マイコバクテリアのゲノムの中に組み込まれた問題のDNAの発現
を制御するための発現カセットの使用の概略的表示である。
第17図は、スメグマ菌(M、smegma t i s)およびBCGの中で
ストレス誘発した65kDをエンコードするらい菌(M、1eprae)遺伝子
の発現を示す、ウェスタン・プロット分析の結果を示す。
発明の詳細な説明
ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCG(BCGまた
はウシ結核菌(M、bov 1s)−BCGは、世界中で広く使用されている非
ビルレントウシ結核閑(M、bovis)の誘導体であり、そして結核に対する
保護与えるために普通に使用されているが、その有効性は最近問題とされている
。スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)は、BCG
と抗原性およびアジュバントの性質を共有する非病原性バチルスである。両者は
、また、培養において増殖するのが合理的に容易である。
両者のマイコバクテリアは細胞仲介免疫性の誘発のためのきわめてすぐれたアジ
ュバント活性を有し、長期間のメモリー(免疫性)を刺激し、そしてそれらの使
用に関連する致死率が低いが、それらは組み換えワクチンとしてきわめてすぐれ
た候補である。すなわち、それらは、問題の遺伝子物質(DNA)(それが導入
されているマイコバクテリア以外の源からのDNA)を挿入し、引き続いて発現
することができる、ベヒクル(ワクチンのベヒクル)として使用のための、きわ
めてすぐれた候補である。
問題のDNAは任意の由来であることができそして次の通りである:1)1また
は2以上の問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコードする1または2以
上の遺伝子のすべてまたは一部分であるDNA: 2)選択可能な1または2以
上のマーカーをエンコードするDNA、または3)両者の選択可能なマーカー(
または複数の選択可能なマーカー)少なくとも1つの問題のタンパク質またはポ
リペプチドをエンコードするDNA0用語問題のポリペプチドは、ここで使用す
るとき、発現すべきタンパク質のすべてまたは一部分を包含する。このような問
題のDNAは遺伝子的に組み換えのマイコバクテリアの中で発現され、ここでそ
れはマイコバクテリアのゲノムの中に存在する(組み込まれている)か、あるい
は染色体外に存在する。組み込まれたDNAは、ここで定義するとき、染色体の
中に存在するか、あるいはマイコバクテリアの中に染色体外に(エピソーム的に
)存在するDNAを包含する。DNAは1または2以上のシャトルプラスミドに
より組み込まれ、マイコバクテリアの染色体またはゲノムのDNA中への組み込
みまたは問題のDNAのエビソーム的(染色体外)の存在を生ずる。問題のDN
Aの組み込みは相同的または非相同的の組み換え、例えば、ファージエンコーデ
ッド合成の部位特異的組み換えまたは転置可能な要素により仲介される組み換え
により起こることができる。
現在まで、プラスミドDNAの使用によりマイコバクテリアを形質転換すること
ができなかった。さらに、現在まで、ポリペプチドまたはタンパク質、例えば、
免疫応答を望むもの、をエンコードするDNAが、ゲノムのDNAの中の選択し
た部位にかつ選択した向きに安定に組み込まれた、組み換えマイコバクテリアの
ワクチンのベヒクルを産生ずることができなかった。
発現ベクターまたはワクチンのベヒクルとして使用すべき組み換えマイコバクテ
リウムの開発についての研究の主な目的は、1または2以上の病原体に対する保
護にとって重要な、1または2以上の産生物、例えば、タンパク質またはポリペ
プチド、をエンコードするDNAの発現を指令するDNAベクターのマイコバク
テリウム中への導入である。本発明の方法およびシャトルまたはプラスミドのベ
クターを使用して、培養可能なマイコバクテリウムの中に(例えば、マイコバク
テリウムの中に、それが染色体外に発現されるように)問題のDNAを組み込む
ことが、今回、可能となった。
本発明のシャトルプラスミドのベクターは、バクテリアの中でプラスミドとして
およびマイコバクテリアの中でファージとして複製することにおいて独特である
。1つの特定の実施態様において、シャトルプラスミドと呼ぶ、シャトルプラス
ミドのベクターは2種の粘着末端(またはCOS部位)を包含するコラムダファ
ージについて1つ、これはE、coliの中で機能する;およびマイコバクテリ
アについて1つ、これはマイコバクテリアの中で機能する。すなわち、それは2
組の粘着末端を含aする。それはラムダについて1組およびマイコバクテリアに
ついて1組を含有するので、それは両者の中に組み込むことができる。ラムダC
O8配列の仔在は、また、コスミドのクローニングの効率よい技術の使用を可能
と(4、これはE、eoliの中への大きいD N A分子の効率よりクローニ
ングのためにラムグ生体外バッケーシング系を利用する。
さらに、ンヤ(・ルベクターは独特のECoRl部位を有し、この中に抗原をJ
−ンコードするDNAを挿入することができる。こうして、シャトルベクターは
トランスフェクション合成を発生することができ、これはマイニスバクテリアの
中への組み換えDNA分子の導入を可能とする。
問題の遺伝子物質をマイコバクテリアの中に組み込んで、本発明の組み換えマイ
コバクテリアを産生ずることができる、いくつかの手段が存在する。例えば、問
題のDNAはマイコバクテリアの細胞の中に、シャトルプラスミド、とくにテン
ペレートシャトルプラスミド(例えば、細胞を溶原化することができるファージ
)の中にクローニングすることによって安定に導入(例えば、マイコバクテリア
の染色体の中に組み込む)ことができる。この方法における問題のI) N A
の導入は、マイコバクテリアの染色体の中へのDNAの組み込みを生ずる。
例えば、E、eoliのコスミドをテンペレートのマイコバクテリオファー)I
−1の中に導入し、て、E、coliの中でプラスミドとして複製するか、ある
いはマイコバクテリアの宿主を溶原化することができるシャトルブラスミドを産
生し、た。これらのテンペレートツヤトルプラスミドはスメグマm (M、sm
egma t i s)上で濁ったプラークを形成し、そして、溶原化すると、
重感染に対する抵抗性を与えそしてマイコバクテリアの染色体内に組み込む、[
:、eoliの中でカナマイシン抵抗性を与えるクローニングした遺伝子を含有
するL1シャトルプラスミドをスメグマ菌(M、sme gma t i s)
の中に導入するとき、安定な安定なカナマイシン抵抗性コロニー(すなわち、溶
層)が得られた。
あるいは、プラスミドベクターを使用して問題のDNAをマイコバク色体外で発
現される。例えば、ンヤ(・ルブラスミドマイコバクテリウム・フォルライツム
(M、fortuitum): :E、col iハイブリッドプラスミドを、
カナマイシン抵抗性およびクロラムフェニコール抵抗性の遺伝子を含有するマイ
コバクテリアおよびE、coliレプリコンから構成した。これらのシャトルプ
ラスミドは、エレクトロポレイションによりスメグマ菌(M、smegma t
i s)またはBCGの中に導入すると、形質転換体に安定なカナマイシン抵
抗性およびクロランフェニコール抵抗性を与える。こうして、ベクターは、マイ
コバクテリア中への組み換えDNA分子の導入を許すトランスフェクション系の
開発を可能とする。
また、ファージなしで宿主の染色体の中に問題のDNAを導入し、そしてそれを
その中に組み込ませることができる。例えば、これは相同的組み換え、部位特異
的組み換えまたは非相同的組み換えにより(例えば、宿主の染色体物質の中への
不規則的挿入を生ずる、トランスポゾンにより)達成することができる。相同的
組み換えは、後述するように、問題のDNA (例えば、カナマイシン抵抗性遺
伝子、65KD らい菌(M。
1eprae)遺伝子)を組み込むために使用されてきている。
マイコバクテリアの中にか、あるいはマイコバクテリアのゲノムの中に問題のD
NAを、本発明のシャトルベクターまたはプラスミドベクターによるか、あるい
は相同的組み換えにより首尾よ(導入するために、次の一般アプローチに従った
。それはスメグマ菌(M、smegmatis)またはウシ結核菌(λ1.bo
v i 5)−BCGにより記載するが、それは問題のl) N Aを他のマイ
コバクテリアの中に導入するために使用できること、およびこれらの他の遺伝子
的に組み換えのマイコバクテリアは、また、発現またはワクチンのベヒクルであ
ることができることを理解すべきである。このような他のマイコバクテリアは、
次のものを包含する。スメグマ菌(M、sme gma t i s) 、ウシ
結核菌(M、bov i 5)−BCG、鳥結核m (M、av i urn)
、チモテ菌(M、phlei)、マイコバクテリウム・フォルライツム(M、
fortuitumLマイコバクテリウム・ルフ(M、IufuLバラ結核菌(
M、paratuberculosis)、vイコバクテリウムーハバナ(M、
habanaLマイコバクテリウム・スクロフラセウム(M、scrofula
eeum)およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ(M、1ntraee
llulare)。ワクチンのベヒクルとしてゆっくり増殖するマイコバクテリ
ア(例えば、ウシ結核菌(M。
bov i 5)−BCGおよびヒト結核菌(M、tuberculosiS)
)を使用すべき場合において、スメグマ菌(M、sme gma t iS)を
通過しくすなわち、その中に1または2以上の抗原をエンコードするDNAを導
入し)引き続いてウソ結核菌(M、bov i s) −BCGの中に入ること
はと(に価値がある。
、ろ−メグマ菌■μ¥ユsmegma t i s)の中へのマイ社りテリオフ
ァージDNAのトランスフェクション
マイコバクテリア中のDNAの操作を可能とする系を開発するために、バチルス
の中にDNAを転移する効率よい手段を開発することがまず必要であった。使用
した技術は、ストレプトミセス属(Streptomyces)についてのスフ
ェロプラストの調製に関してオカニシ(Okantshi)およびホブウッド(
Hopwood)により記載されている変更であった。ストレプトミセス属(S
treptomyces)は、マイコバクテリアに似て、アクチノミセタレス(
Actinomycetales)である。オカニシ(Okan i 5hi)
、M、ら、マイクロバイオロジー(MicrobiologY)、8旦:38
9−400 (1974);ホブウッド(Hopwood) 、D、A、および
HlM、ライト(Wr i gh t) 、モレキュラー・ジエニテイック(M
olecular Genetic)、16λ: 307−317(1978)
。
変更した技術は、ポリエチレングリコールと組み合わせて使用して、バクテリア
のスフェロプラストの中へDNA分子が入るのを促進した。
マイコバクテリアの形質転換のためのプラスミドの中で有用な抗生物質抵抗性マ
ーカーが入手不可能であるために、DNAをマイコバクテリアの中に転移するた
めに最適な条件を評価するために選択した系は、溶菌マイコバクテリオファージ
からのDNAのトランスフェクションであった。このような系の2つの利点は、
得られる結果が定量的であり、そして24時間以内にプラークとして容易に可視
化されたことである。
スメグマ菌(M、sme gma t i s)の中へのマイコバクテリオファ
ージDNAのトランスフェクシヨンは、実施例1に詳細に記載されている。簡潔
的には、DNAはを最初に除去した細胞壁のすべてまたは一部分(すなわち、原
形質体またはスフェロプラスト)を有するマイコバクテリアの中に、ポリエチレ
ングリコールを使用して、導入した。トランスフェクションの実験はマイコバク
テリオファージD29からのDNAを使用して開始し、D29は広範な種類のマ
イコバクテリア上で増殖し、そしてスメグマ菌(M、sme gma t i
s)上で大きい透明なプラークを形成する。スメグマ菌(M、sme gma
t i s)上で調製したD29ファージの平板培養のリゼイトは、リゼイトの
1ml当たり10日pfu (プラーク形成単位)より大きい値を絶えず生じた
。収穫したプラークをCsCI平衡勾配で2回精製した;それらは1.51の平
衡浮遊密度でバンドに別れた。ファージDNAはプロテイナーゼに処理およびフ
ェノール−クロロホルム抽出により抽出した。結合および非結合のD29 DN
Aの制限分析は、ファージのゲノムのDNAが二本鎖であり、50kbの大きさ
であり、そして粘着末端を有することを実証した。
マイコバクテリオファージD29 DNAによりスメグマ菌(M、smegma
tis)スフェロプラストのトランスフェクションの結果は、第1図に示されて
いる。10” 〜10’+)fu/μgD29 DNAの効率が得られ、こうし
てマイコバクテリアについての第1の効率的トランスフェクション系を実証する
。これらのプラークはスメグマ菌(M、smegma t i s)スフェロプ
ラストのトランスフェクションの結果であるということは、次により実証された
: (i) トランスフェクションはDNアーゼにより潰滅された; (i i
)処理した細胞の浸透圧ショックは保護的トランスフェクションを防止した:そ
して(i i i)スメグマ菌(M、sme gma t i s)のD29フ
ァージ抵抗性突然変異体から誘導されたスフェロプラストは、親菌株に匹敵する
頻度でトランスフェクションされた。これらの技術のそれ以上の洗練は、I O
’p f u/μgのD29 DNAより大きい頻度を得ることを可能とした。
E、eoliの中でマイコバクテリアのDNA構成体の操作および増幅の両者を
可能とし、引き続いてマイコバクテリアの中にトランスフェクションしかつ復製
するベクターを開発した。とくに、速(増殖する非病原性マイコバクテリウム(
例えば、スメグマII (M、smegma tis))の中に、ならびに遅く
増殖するマイコバクテリア(例えば、ウシ結核菌(M、bov i 5)−BC
Gおよびヒト結核菌(M、tuberculos 1s))の中に問題のDNA
を導入する能力を有することが高度に望ましかった。プラスミドはMAIS複合
体内のあるマイコバクテリアの菌株およびの中におよびマイコバクテリウム・フ
ォルライツム(M、fortuitum)の中に発見されたが、スメグマ菌(M
。
smegma t i s) 、ウシ結核菌(M、bovi 5)−BCGまた
はヒト結核菌(M、tuberculosis)内で複製するものはまだ観測さ
れてきていない。1つを除外して、これらのプラスミドは選択可能なマーカーを
有する。クララフォード(Crawford) 、J、T。
およびJ、H,ベイツ(Bates)、感染および免疫性(rnfection
and ImmunityL24:979−981(1979);ミズグチ(
Mi zuguch i) 、Y、ら、ジャーナル・オブ・バクテリオロン−(
Journal of Bacteriology)、↓46 : 656−6
59 (1981):マイスナー(Meissner)、P、S、 およびJ、
0.ファルキンハム(Falkinham)、ジャーナル・オブ・バクテリオロ
ン−(Journal of BacteriologyLよ旦ユニ 669−
672 (1984)、対照的に、スメグマ菌(M、smegma t i s
) 、ウシ結核菌(M、bov i 5)−BCGおよびヒト結核菌(M、tu
berculosis)の中で複製する種々のファージは記載されそして分離物
の型別のために使用されてきている。
使用する方法は、E、coltの中でプラスミドとしてモしてマイコバクテリア
の中でファージとして複製するベクターを構成することであった。シャトルプラ
スミドのこの開発を達成する1つのアプローチは、マイコバクテリアのDNAが
E、coliの中でよく発現されないので、プラスミドベクターの中で、E、c
oli宿主を溶菌するであろう機能的マイコバクテリオファージのゲノムをクロ
ーニングすることができるであろうという考えに基づいた。こうして、両者の型
の有機体を複製することができるであろう。スメグマ菌(M、sme gma
t i s)のトランスフェクションはマイコバクテリオファージの粒子を生ず
るであろうから、遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、BCG)の中に問題
のDNAを導入することは、ファージの感染により達成することができるであろ
う。ストレプトミセス属(Streptomyces)のための2機能的ベクタ
ーは、スアレズ(S u a r e z)およびチェイタ−(Cha t e
r)により記載された。スアレズ(Suarez)J、E。
およびに、 F、チェイタ−(Cha t e r)、ネイチ+−(Natur
e)、286・527−529 (1980)。E、coliの中で二重の機能
をもつラムグーCo1E1ベクターは、ブレンナー(Brenner)および共
同研究者によりプラスミドと呼ばれた。ブレンナ−(Brenこの目的で、マイ
コバクテリオファージTM4を使用した。TM4は鳥結核菌(M、avjum)
から分離された溶層性ファージであると報告された。チンメ(Timme) 、
T、L、およびPL、ブレンナン(Brennan)、ジャーナル・オブ・ジェ
ネティック・マイクロバイオロジー(Journal of Genetic
Microb+010gy)、1旦旦:205−209 (1984)。それは
スメグマ菌(M、sme gma t i s)を溶原化するファージであると
特性決定された。それはスメグマ菌(M、smegma t i s) 、BC
G、およびヒト結核菌(M、tuberculosis)の中で複製することが
でき、そしてテンペレートであると報告された。このファージは、また、50k
bの二本鎖DNAのゲノムを有し、そして粘着末端を有する。しかしながら、同
様な特性を有する他のマイコバクテリオファージを使用することができる。TM
4とともに使用して次に記載する手順は、また、ベクターの構成においてこのよ
うな他のマイコバクテリオファージとともに使用することができる。
ファージTM4の中にE、coltプラスミドのレプリコンを導入して、E、c
oltの中でプラスミドとし2てそしてマイコバクテリアの中でファージ複製す
るベクターを発生する方法を第2図に概略的に示す。
平板源リゼイトおよび7M4フアージのゲノムのDNAを、D29ファージにつ
いて記載したように調製した(参照、実施例1)。TM4 DNAを高い濃度で
結合して、アニリーングした粘着末端の長い鎖状体を形成した。結合したDNA
を5au3Aで部分的に消化した。5au3AはTM4ゲノムを頻繁に(例えば
、平均300bp毎に1回)切断して、大きさが30〜50kbの断片を形成す
る。それは長さが全TM4ケノムまたは小さい欠失をもつT M 11ゲノムの
長さである1組のDNA断片を発生するが、ケノム内のSa IJ 3 A部位
のいずれにおいても切断される。−れらのDNA断片を13.5kbのコスミド
p HC,79に結合し7、このpHC79はアンピシリン抵抗性の遺伝子を含
有し、そし、てBa m H]で切断されている。ホーン(Hohn)、B お
よびJ コリンス(Co I l 1ns) 、遺伝子(Gene)−9+29
1−298 (1980)。適当な大きさの組み換え分子について選択するため
に、結合混合物を生体外でマイコバクテリオファージラムダのへ・ソドの中にl
(・ソノ1−ンングし5t1−0これはラムダCO8部位を含有しそして大きさ
が38〜53kbであるDNA断片について選択する。生ずるファージ粒子をE
、coliの中に形質導入し2、そしてpHC79: :TM4 DNAを含有
するコロニーをアンピシリンを含有する培地トで選択した。円形DNAを共有的
に閉じたプラスミドを40.000のプールしたアンピッリン抵抗性(amp’
)コロニーから分離した。ノく−ボイム(Birnbo im) 、H,および
Doly、ジャーナルーオブ・ヌクレイツクアシッド・リサーチ(Journa
l of Nucleie Ac1d Re5earch)、7:1513−1
525 (1979)にのライブラリーは、pHC79コスミドDNAがTM4
ゲノム付近の5au3A部位の中に不規則的に挿入されている、Th14ゲノム
の組み換え分子を含有する。それをスメグマ菌(M、smegma t i s
)スフェロプラストの中にトランスフェクションして、非必須領域に挿入された
pHC79を有するTM4ファージについて選択した7、こうして、このような
ファーらは/ヤトルプラスミドであった。トランスフエクションはプラスミドD
NAの1μg当たり100プラーク形成単位(p f u)を生じt:。プラー
クのリフトを使用して、32p@識したp )(C79DNAに対するハイブリ
ダイゼーションについてスクリーニングした:4000のプラークのうちで10
にのみが標識したpHC79にハイブリダイゼーションした。
プラークの精製およびスメグマT91 (M、sme gma t i s)細
胞上の増殖後、1つのこのようなファージを詳細に研究し、そしてプラスミド、
phAElと表示した。プラスミドp h A E 1は、ブダペスト条約の条
項に従い、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション((1he Ame
rican Type Cu1ture Co11ection)(マリイラン
ド州ロックビレ)に受け入れ番号40306号で受託された(1986年2月2
6日)。受託物への公衆のアクセスへのすべての制限は、この出願に基づく米国
特許が登録されると、最終的に除去される。DNAをスメグマ菌(M、sme
gma t i s)上で増殖したphAE1ファージ粒子から分離し、CsC
1の勾配で精製し、結合して鎖状体を形成し、そして生体外でバクテリオファー
ジラムダのへ。
ドの中にパッケージングした。生ずる粒子はアンピシリン抵抗性をE。
eoli細胞に転移しそして、トランスフェクションすると、スメグマ菌(M、
smegma t i s)上にプラークを産生じた。これはphAElがシャ
トルベクターとして機能する証拠であった。
スメグマ菌(M、sme gma t i s)上で増殖したファージ粒子から
islしたphAEI DNAおよびE、coliから分離したプラスミドDN
Aとして分離したphAEI DNAの制限消化は、ファージDNA調製物にお
いて見られる粘着末端により一緒に保持された非アニリーング断片の存在を除外
して、同一のパターンを示した(第3A図)。
サザン分析により、コスミドpHC79はTM4ゲノムの2つの11kbのKp
nl制限断片の1つ内にクローニングされることが実証された(第3B図)。電
子顕微鏡検査により、phAE1粒子は、平均直径が50 l1mである6角形
のヘッドをもつバクテリオファージラムダに似る。
しかしながら、これらの粒子は長いテイル(180〜220μmの長さ)を有し
、テイルの多(の上にディスク様ベースプレートが存在する(第4C図)。この
構造は親の7M4フアージのそれに非常に類似する。チンメ(Tjmme) 、
T、L、 およびP、L、 ブレンナン(brennan)、ジャーナル・オブ
・ジェネテイック・マイクロバイオロジー(Journal of Gen、M
icrobiology)、13−0 : 205−209 (1984)。
pHC79にハイブリダイゼーションしない、スメグマ菌(M、smegmat
is)の中へのpHC79: :TM4ライブラリーのトランスフェクションか
ら生ずる分離されたファージからのDNAの制限分析は、それらが同一であるこ
とを示した。ファージは組み換えの事象から生じたと思われ、この事象は2また
はそれ以上のpHC79: :7M4分子を含有するトランスフェクションした
細胞の中で起こり、野生型1M4ゲノムを生ずる。
スメグマ菌(〜L sme gma t i s)から得られたシャトルプラス
ミドphAE1がその親のTM4に類似し、試験した3つの異なるウシ結核菌(
M、bov i 5)−BCGワクチン菌株:グラシン(Glaxo)、パスツ
ール(Pasteur)およびダニ・ソシ(Danish)のBCGを感染し、
そしてそれらの中で複製するという観察は、とくに興味あることである。これら
の結果は第4A図および第4B図に表されている。
こうして、これは組み換えDNA分子であるE、coli−マイコバクテリアの
シャトルプラスミドの首尾よい構成を実証し、組み換えDNA分子はプラスミド
としてE、coliの中で複製する能力を有するばかりでなく、かつまたバクテ
リオファージのヘッドの中にまたはバクテリオファージの粒子の中にパッケージ
ングされる能力を有する。それは、また、組み換えDNAは急速に増殖するマイ
コバクテリウム(スメグマ菌(M、smegma t i s))および遅く増
殖するマイコバクテリウム(ウシ結核菌(M、bov i 5)−BCG)の両
者の中に導入されたことを実証する。これはシャトルプラスミドでBCGワクチ
ン菌株を感染することを可能とし、こうして、クローニングした遺伝子をマイコ
バクテリアの中に導入することを可能とする。こうして、これはBCGのための
トランスフェクション系の開発の必要性を排除する。すなわち、E、coli−
マイコバクテリアのシャトルプラスミドは、マイコバクテリアの中にトランスフ
ェクションすると、マイコバクテリアの粒子の中にパッケージングされるので、
問題のDNAは形質導入により遅く増殖するマイコバクテリア(例えば、BCG
)の中に導入することができる。
現在まで、これは実施することができず、そしてこの進歩は、Jまたは2以上の
問題の抗原に対して免疫化するために使用できる、組み換えマイクバクテリアの
ワクチンのベヒクルの産生を可能とする。
これらのプラスミドを構成するために生体外のパッケージングを使用することは
、パッケージング系の大きさの限界を越えないかぎり、これらのベクターの中に
遺伝子(例えば、それに対する免疫応答を望む、1または2以上の病原体ための
1または2以上の抗原をエンコードする、遺伝子、または問題のDNA)をクロ
ーニングする方法として拡張することができる。また、追加のTM4:・pII
c79組み換えプラスミドをスクリーニングすることによって、7M4フアージ
から欠失することができるDNAの最大量を決定すること、およびその中にDN
Aを挿入することができるファージのゲノムの追加の非必須領域を定めることが
できる。
シャトルプラスミドによりマイコバクテリアの中に新しい遺伝子(例えば、抗原
をエンコードする問題のDNA)を導入することは、E、coliの中でシャト
ルプラスミドの中にDNA断片をクローニングし、引き続いてスメグマ菌(M、
sme gma t i s)スフェロプラストの中にそれらをトランスフェク
ションすることを伴う。これはクローニングした遺伝子を含有する組み換えファ
ージ粒子を生ずる。生ずる組み換えファージを含有するスメグマ菌(M、sme
gma t i s)スフェロプラストを使用して、BCGを高い効率(100
%の効率に近付く)感染し、こうして組み換えファージ中に含まれる問題のDN
AをBCGの中に導入することができる。マイコバクテリアの細胞の中で外来遺
伝子の安定な発現を可能とする、溶層性または組み換えのための条件を開発する
ことは、高度に望ましい。
マイコバクテリアの細胞の中への問題のDNAの導入前述のおよび下の節に記載
するシャトルベクターを使用して、1または2以上の問題の病原体のための1ま
たは2以上の抗原をエンコードする問題のDNAを、マイコバクテリア、例えば
、ウシ結核菌(M、b。
v i 5)−BCGまたはスメグマ菌(M、sme gma t i s)の
中に導入することができる。それは、また、適当な抗原、例えば、ヒトのゴナド
トロピンホルモン(HGH)断片をマイコバクテリアの中に導入して、抗生値「
ワクチン」を産生ずることができる。これらのベクターを、また、使用して、腫
瘍細胞のための増殖阻害因子または殺細胞因子であるタンパク質またはポリペプ
チドをエンコードするDNAを導入することができる。生ずる組み換えマイコバ
クテリアを使用して、それぞれ、マイコバクテリアの中で発現された外来抗原に
対する免疫応答を非特異的に増強し、そしであるヒトの癌を処置することができ
る。このシャトルベクターは、バクテリア(例えば、E、coli、ストレプト
ミセス属(St reptomyces) 、バチルス属(Bac i I I
us))、または他の有機体(例えば、酵母菌)の中で組み換えDNA構成体を
操作および増幅し、引き続いてそれらをDNAが発現されるマイコバクテリウム
の中に転移する手段を提供する。
結局、例えば、らい、結核、マラリア、ジフテリア、テタヌス、レイシュマニア
、サルモネラ、シストミアシス(schtstomiasiS)%はしか、おた
ふくかぜ、ヘルペスおよびインフルエンザに対して個体を免疫化するために使用
できるマイコバクテリアのワクチンを製造することができる。T細胞のメモリー
またはエフェクターの機能を必要とする、病原体の抗原ををエンコードする遺伝
子を固有する能力は、とくに価値がある。生ずる組み換えマイクバクテリアのワ
クチンを宿主に投与すると、宿主の免疫系は刺激されて保護的免疫応答を生成す
る。
病原体または毒素に対するワクチンは、本発明のシャトルプラスミドを使用して
、次の手順により生成することができる・それに対する保護を望む病原体または
毒素のための抗原(または複数の抗原)をエンコードするDNAが得られる。D
NAは天然に産出するDNAの分離(例えば、病原性有機体または毒素産生有機
体から)することによって;既知の遺伝子操作技術(例えば、参照、マニアチス
(Man i a t i s) T。
ら、モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning):実
験室のマニュアル(A Laboratory Mannual)、コールド−
スプリングHハーバ−(Cold Spring Harbor)、−ニーヨー
ク(1982)を使用して、問題のDNAの配列をクローニングおよび増幅する
ことによって;あるいは機械的合成により得ることができる。
次の手順により、問題の1または2以上の遺伝子(すなわち、それに対する免疫
性を望む1または2以上の抗原をエンコードする)をシャトルプラスミドの中に
クローニングされる。これは第2図を参照して説明することができ、第2図はシ
ャトルプラスミドphAE1の概略的表示である。既知の技術を使用して、シャ
トルプラスミドの粘着末端を結合する。生ずるシャトルプラスミドを独特制限酵
素(例えば、シャトルプラスミド中の独特部位において切断する制限酵素、例え
ば、EcoRIおよびEcoRV)で切断(消化)する。このようにして作られ
る切断に対する別のアプローチは、他の制限酵素とともに有用である(それによ
り切断することができる)ポリリンカー(オリゴヌクレオチド配列)の付加(結
合による)である。この場合において、リンカ−は選択した制限酵素で切断して
開かれ、問題のDNAを挿入することができる部位を生成する。
第1の場合(独特制限酵素を使用する切断)において、1回切断されそして問題
のDNAを挿入することができる、シャトルプラスミドの分子が生ずる。第2の
場合において、また、DNAを挿入できる少なくとも1つの部位が存在する。抗
生物質抵抗性をエンコードする遺伝子(例えば、アンピシリン抵抗性をエンコー
ドする遺伝子)およびそれに対する免疫性を望む1または2以上の抗原をエンコ
ードするDNAを、既知の技術を使用して、制限部位において結合することがで
きる。挿入されるDNAおよびシャトルプラスミドのDNAは、一般に、等モル
量で結合される。生ずる結合されたDNA、この場合においてこれはシャトルプ
ラスミドのDNA、抗生物質抵抗性遺伝子および抗原をエンコードするDNAを
包含する、を、ラムダ生体外パッケージング混合物を使用して、バクテリオファ
ージのヘッドの中にパッケージングする。引き続いて、E、coliをファージ
で形質導入し、その結果抗生物質抵抗性をエンコードする遺伝子および抗原をエ
ンコードするDNAを含有するコロニーについてスクリーニングする(抗生物質
を含有する培地を使用して)ことができる
生ずるライブラリーは、例えば、エレクトロボレイションを使用してスメグマ菌
(M、sme gma t i s)の中に導入する。クローニングしたインサ
ートのDNAを含有するシャトルプラスミドを含有するプラークを選択する。引
き続いて、組み換えスメグマ菌(M、smegmatis)を使用して、培養可
能なマイコバクテリウム、例えば、BCGを高い効率で感染することができる。
結局、抗原をエンコードするDNAをマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に
導入し、ここでそれは発現されるであろう。
問題のDNA (ここでそれらのゲノムのDNAの中に組み込まれた1または2
以上の抗原をエンコードする)を含有するBCGの選択は、選択可能なマーカー
を使用して実施することができる。組み換えファージで感染して導入された、1
または2以上の抗原をエンコードするDNAをA何するBCGの選択するために
アプローチは、抗生物質抵抗性遺伝子である、選択可能なマーカ・−・の使用に
に基づく。この場合において、2・ヤi・ルブラスミドは、例えば、カナマイノ
ン抵抗性、ビオマイン゛/祇抗性、チオストレプトン抵抗性、ハイグロマイシン
抵抗性またはブレオマインン抵抗性をエンコードする遺伝子を包含する。
選択可能なマーカーを使用して問題のDNAを含有するBCGを選択する、第2
のアプローチは、栄養要求変異種の方法(すなわち、突然変異体を誘導する有機
体が要求しない、ある栄養または物質を要求する突然変異体の有機体の使用に頼
る方法)である。この場合において、突然変異体を有するマ・1′コバクテリウ
ムを使用し、そして失なったまたは突然変した機能をエンコードする遺伝子をシ
ャトルブラスミド(これは、また、抗原をエンコードするDNAを含有する)の
中に組み込む。こうして、抗原をエンコードするDNAを含有するマイコバクテ
リアについての選択は、適当な培地上で増殖したとき、シャトルブラスミドが首
尾よく導入されるマイコバクテリアが生き残る能力に基づく。
例えば、宿主突然変異体(例えば、スメグマ菌(?v1、smegmatls)
、BcG)および突然変異体を補足する選択可能なマーカーを包含する系を使
用することができる。このような系は、p y r F−BCG突然変異体であ
る宿主突然変異体および選択可能なマーカー、例えば、pyrF”遺伝子(七れ
らは(突然変異体)BCGの中に抗原をエンコードするDNAを導入するために
使用するプラスミドのシャトルベクターの中に存在する)を包含することができ
る。例えば、プラスミドは、コスミドのDNAの中に挿入された抗原をエンコー
ドするDNAに加えて、pyrF’遺伝子を含むことができる。こうして、別の
アプローチは2−デオキシグルコース抵抗性突然変異体を使用することである・
この場合において、マイコバクテリアのグルコキナーゼ遺伝子を、pyrFにつ
いて前述したように、プラスミドの中にクローニングしそして選択に使用する。
この基準に基づく選択は、ゲノムのDNAの中に安定に組み込まれそしてバチル
ス属(Bac i l I us)により発現された、抗原をエンコードするD
NAを有するBCG生ずるであろう。このために、遺伝子の発現シグナル(例え
ば、プロモーター、リポソーム結合部位)は、外来(抗原をエンコードする)D
NAより玉流に含まれて、抗原をエンコードするDNAを含有するBCGはそれ
を十分なレベルで発現して、それを投与した宿主において免疫応答を誘発するこ
とができる。
また、1または2以上の抗原をエンコードするDNAを含有するBCGを、モノ
クローナル抗体の使用により選択することができる。この場合において、モノク
ローナル抗体を利用できる抗原(例えば、らい菌(M、1eprae)またはヒ
ト結核菌(M、tuberculosiS))の1または2以上のエピトープを
エンコードする遺伝子または遺伝子断片は、マイコバクテリアの中に導入される
。このようなモノクローナル抗体を使用して、これらのエピトープの1または2
以上をエンコードする1または2以上の遺伝子を含有する組み換えBCGについ
て選択する。このようにして導入された抗原遺伝子は、プロモーター配列および
他の調節配列を含有する。結局、追加の系列(例えば、他の抗原をエンコードす
るDNA)を、遺伝子操作技術を使用して、インフレームで付加することができ
、こうして1つの抗原に対するモノクローナル抗体により同定される組み換えB
CGは、また、そのように導入された他の外来抗原をエンコードするDNAを発
現するであろう。
プラスミドを使用して培養可能なマイコバクテリアの中に抗原をエンコードする
DNAを導入する平行な方法を、また、使用してワクチンのベヒクルをつくこと
ができる。これはプラスミドとして問題のD N Aを染色体外に安定に維持し
、そしてそれを引き続いて発現するであろう。
このようなシャトルプラスミドの構成は、第8図に概略的に表されている。この
場合において、抗原をエンコードするDNAを含有する細胞の選択を可能とする
、選択可能なマーカーを使用する。選択可能なマーカーは、例えば、抗生物質抵
抗性をエンコードする遺伝子または、シャトルプラスミドを参照して前述したよ
うに、栄養要求変異種における損失を補足する遺伝子であることができる。栄養
要求変異種の方法において、栄養要求変異種のマイコバクテリア突然変異体(例
えば、pyr−F突然変異体)を分離し、対応する野生型(非突然変異体)マイ
コバクテリウムの中に存在遺伝子をプラスミドの中に組み込む。pyr”F突然
変異体に加えて、グルコキナーゼ遺伝子において欠失を有する、デオキソグルコ
ース突然変異体、ならびに他の生合成通路(例えば、アミノ酸生合成、ビタミン
生合成および炭水化物の代謝、例えば、アラビノースおよびガラクトース)にお
いて突然変異体を有する他のものを分離することができる。
いずれのアプローチにおいても、マイコバクテリアの突然変異体を選択し、そし
て突然変異を補足する遺伝子を、また、抗原をエンコードする問題のDNAを含
有する、プラスミドベクターの中に組み込まれる。
抗原をエンコードするDNAが首尾よく導入されるマイクバクテリアの突然変異
体は、適当に選択した培地(例えば、それに対する抵抗性を与える抗生物質を含
有する培地、使用する突然変異体において影響を受ける生合成の通路に含まれる
栄養を含有するか、あるいは欠く培地)上で培養するか、あるいはcl遺伝子を
使用するとき、形成するプラークの出現を基準にして選択することによって、同
定(または選択)することができるであろう。
組み換えマイコバクテリアのワクチンのベヒクルの中に抗原をエンコードするD
NAを導入するとき有用なプラスミドの他の成分は、自律的に複製する配列(例
えば、レプリコン)であり、その存在はプラスミドを自律的に複製させる(染色
体外で)ための重要決定因子である。これらの配列は、例えば、プラスミドのレ
プリコン、マイクバクテリアのセグメントまたは染色体の複製由来を包含するこ
とができる。
シャトルプラスミドphAE1の設計は、これらの因子のいくつかを包含する。
例えば、E、coliコスミドpHC79をマイクバクテリアTM4の中への導
入は、E、coliプラスミドのレプリコン由来および選択可能なアンピシリン
抵抗性遺伝子、ならびにバクテリオファージラムダの粘着(COS)配列および
独特EcoR1部位を提供できるようにする。7M4フアージ内にEcoRI部
位は存在しない、phAEl内の独特EcoR1部位を使用して1または2以上
の外来遺伝子をプラスミドの中に導入することができる。実施例41ご記載する
ように、Tn903からのアミノグリコシドホスホトランスフェラーゼ(a p
h)遺伝子をエンコードする1、6kbのEcoRI断片を、このコスミドの
クローニング方法を使用して、phAElの中にクローニングした。
ワクチンのベヒクルとして使用すべき、培養可能なマイコバクテリウム、例えば
、ウシ結核菌(M、bov i 5)−BCGまたはスメグマ菌(M、sme
gma t i s)の中に抗原をエンコードするDNAを効率よく導入するい
くつかのアプローチが存在する。1または2以上の問題の抗原をエンコードする
DNA、選択可能なマーカーおよび自律的に複製する配列を包含する、プラスミ
ドについて、原形質体の融合を使用してマイコバクテリアの中に効率よく導入す
ることができる。この場合において、クローニングしたプラスミドを有するE、
coliまたはストレプトミセス属(St reptomyces)を、既知の
技術を使用して、マイコバクテリアのスフェロプラストと融合する。このアプロ
ーチを使用して、外来(抗原をエンコードする)DNAをマイコバクテリウムの
中に転移することができる。あるいは、プラスミドのDNAを含有しそして染色
体のDNAを本質的に含有しない、E、coliミニ細胞は、ミニ細胞の原形質
体の融合を実施するとき使用することができる。
別法において、問題のDNAをマイコバクテリウムの中に効率的に動かすことが
できる場合、自律的に複製する配列が必要でなくそして、その代わり、問題のD
NA (例えば、抗原をエンコードする)をマイコバクテリアの染色体の中に組
み込むことができる。これは、例えば、ミニ細胞の原形質体の融合を使用して達
成することができる。この場合において、マイコバクテリアのための選択可能な
マーカーは、抗生物質抵抗性遺伝子または染色体の突然変異体であることができ
、E、coliコスミドの中にクローニングすることができる。マイコバクテリ
アの染色体の中に問題のDNAを効率よく組み込むことを可能とするDNAが、
また、E、coliコスミドの中に存在するであろう。例えば、らい菌(M、1
eprae)において、組み換えに関連する思われる反復配列が起こる;類似す
る配列をBCGおよびスメグマmcM、smegmatis)において同定しそ
してそれから分離することができ、E、c。
Itコスミドの中に組み込むことができ(選択可能なマーカーと一緒に)そして
これは高い程度の組み換えを生ずる。
1または2以上の遺伝子(1または2以上の抗原をエンコードする)を記載する
構成体(例えば、E、coliのレプリコン、組み換えに関連するマイコバクテ
リアの染色体DNAのセグメント(組み換え発生配列)および2つの選択可能な
マーカー−1つはE、coliの中でマーカーとして働きそして第2はマイコバ
クテリウムの中でマーカーとして働く−を包含する)の中に組み込むことができ
る。次いで、1または2以上の遺伝子をマイコバクテリアの染色体のDNA、例
えば、BCGまたはスメグマ菌(M、smegma t i s)の染色体のD
NAの中に組み込むことができる。1または2以上の問題の遺伝子をこのように
してスメグマ菌(M、sme gma t i s)の中に組み込む場合、1ま
たは2以上の遺伝子は、また、一般の形質導入ファージによりBCGの中に動く
ことができる。この場合において、他の構成成分に加えて、2つの組み換え発生
配列:1つはスメグマ菌(M、smegmatis)からおよび1つはBCGか
ら、を含むことが好ましい。
本発明の組み換えマイコバクテリアを産生じそして使用する方法を、次の節にお
いて詳細に記載する。それらの節は次の事項を記載しそして例示する。シャトル
プラスミドにより問題のDNAをマイコバクテリアの中に導入して、問題のDN
Aをマイコバクテリアの染色体のDNAの中に組み込むこと:シャトルプラスミ
ドにより問題のDNAをマイコバクテリアの中に導入して、その中で問題のDN
Aがエビソーム的に発現されるマイコバクテリアを産生ずること;組み換えプラ
スミドベクターにより問題のDNAをマイクバクテリアの中に導入して、相同的
組み換えを通して問題のDNAをマイクバクテリアの染色体の中に導入すること
:組み換えマイコバクテリアの特性決定:およびこのような産生物の使用。
シャトルプラスミドにより問題のDNAの導入本発明の研究は、スメグマ菌(M
、sme gma t i s)を安定に溶原化するマイコバクテリオファージ
の同定を生じた。1つのこのようなファージL1はスメグマ菌(M、sme g
ma t i s)上で濁ったプラークを産生ずる従来報告された、そして推定
上の溶原体は重感染に対して抵抗性であり、そして誘発してファージを産生ずる
ことができた。トーキ(Doke) 、S、J、Kumamoto Med、S
oc、S。
C134,1360−1373(960)。トクナガ(Tokunaga)、T
、およびセラーズ(Sellers)、M、1. 、マイコバクテリウム、ノル
カルブイア、およびアクチノミセテスにおける宿主−ウィルスの関係(Host
−Virus Re1ationshfpsin Mycobacterium
、Norcardja、and Actinomycetes)[ジュハスズ(
juhaz) 、S、E、およびブラ:/:/マー (P 1 umme r)
、G、 Ii] 227−243 [チャールス(Charles)C,、ト
マス(Thomas) 、イリノイ州スプリングフィールド、1970]。これ
らの観察は確証されそして、さらに、サザン分析により、プロファージはスメグ
マ菌(M、smegma t i s)染色体の中に組み込まれることが実証さ
れた(第5図、パネルB、レーン2.3)。多数の独立の溶原体の分析はファー
ジの組み込みから生ずる独特のバンドの同一パターンを明らかにし、L11フア
ージみ込みは部位特異的であることを示唆する(第5図、パネルB)。
こうして、Llはスメグマ菌(M、smegma t i s)を安定に溶原化
することが示された。複製のCo1El由来およびE、coliの中の選択のた
めのアンピシリン抵抗性遺伝子を含有する、E、coliコスミドp HC79
を、Ll−ゲノムの非必須領域の中に導入することによって、Ll−シャトルプ
ラスミドを構成した(第6図)。Ll−シャトルプラスミド、phAE15と表
示する、をプラスミドとしてE、coliの中でおよびファージとしてマイコバ
クテリアの中で複製することが示されそして、親のファージのように、スメグマ
菌(M、smegma t i s)染色体の中に組み込まれることが示された
(第5図、パネルBル−ン4.5)、L1ファージはEcoRI部位を欠く。p
HC79の導入はphAE15のための独特EcoRI部位を提供し、問題の遺
伝子の導入を可能とする。これらの遺伝子は、シャトルプラスミドのベクターで
溶原化すると、マイクバクテリア内に導入しかつ安定に維持することができるこ
とが示された(第6図)。
E、coltの中でカナマイシン抵抗性を与える、Tn903からのアミノグリ
コシドホスホトランスフェラーゼ(aph)を含有する1゜6kgの断片は、コ
スミドのクローニング方法により、phAE15の中に導入することができる。
才力(Oka) 、A、スギサキ(Sugisaki)、H,およびタカナミ(
Takanami) 、M、 ジャーナル・オブ・モレキュラー・バイオロジー
(J、Mob Bio+、)、147.217−226 (1981)、Eco
RI末端をもつaph遣伝子を、線状phAE15 DNAに結合し、そしてバ
クテリオファージラムダ−・\ラドの中に生体外でベソケージングする。生ずる
組み換え分子をE、coliから分離した。アンピシリンおよびカナマイシンの
両者にン・1して抵抗性であるE、eoliのクロー゛ノから、閉じた円形のプ
ラスミドDNAを分離し、そしてスーブ−tell (M、s m e gm
a t iS)原形質体の中にトランスフェクションL、た。これはブーラスミ
ドDN、八をバ・・tケーシングした71゛フバクテリアのファージ粒子を生じ
た、このプラスニドは、HihAE19と表示し、スメグマ菌(M、smegm
atis)細胞を溶原化し、ぞしてカナマ・イレン抵抗性コロニーを発生する能
ノJを有する(第7図)。マイコバクチリオファ・−ジはこれらの溶原化から誘
発され、L1感染に対する免疫性および感受性スメグマ菌(M、sme gma
t i s)細胞に対するカナマイシン抵抗性を同時トランスフェクションし
、カナマ・イノンに対する抵抗性がクローニングしたaph遺伝子の発現から生
ずることを実証する。p hAE 19は、また、ウシ結核a (M、bov
i 5)−BCGを溶原化し、そしてウシ結核菌(M、bov i 5)−BC
Gにカナマイシン抵抗性を与える。こうして、カナ゛?イ゛シ゛/低抗性はマイ
コバクテリアについて第1の有用な選択可能なマーカーを表す。さらに、これら
の結果は実証するよ・)に、溶層性は問題のDNAをマイコバクテリアの中に導
入しそしてその中で発現することができる。
5.・十トルプラスミドによる問題のDNAの導入シャトルプラスミドによる問
題のDNAの導入は、クローニング容量の増加、DNAの操作の容易さ、および
コピー数の増加によりファージの能力を拡張する。スメグマ菌(M、sme g
ma t i s)からのプラスミドは従来記載されてきておらず、ぞしてマイ
コバクテリアの中で遺伝子操作は困難である。したがって、E、eoliおよび
マイコバクテリアの両者の中で問題のDNAを復製しかつ発現することができる
シャトルプラスミドのベクターを次のようにし2て構成した。マイコバクテリア
のための機能的レプリコンを確実にするため、Tn5からのネオマイシン/カナ
マイシンホスホ1−ランスフェラーゼII(neo)遺伝子、複製のP15A由
来およびpAcYc184からのクロランフェニコールアセチルトランスフェラ
ーゼ(cat)遺伝子を含有する、E、c。
11プラスミドplJ666を、マイコバクテリウム・フォルライツム(M、f
ortuitum)の中で複製するプラスミドpAL5000の中に不規則的に
挿入した。ギーザー(Kieser)、T、およびRlE、メルトン(Me l
t on) 、遺伝子(Gene) 、65 : 83−91 (1988)
:ベルブ(Berg) 、D、E、ら、プロシーディンクス・オブ・ナショナル
・アカデミ−・オブ・サイエンシズ(P r o c。
Nat 1.Acad、Sc i、)USA、72 :3628−3632(1
975);チャック(Chang) 、A、C,¥、およびS、 N。
コーヘン(CohenL ジャーナル・オブ・バクテリウムジ−(J。
Bactriology)、134:1141−1156 (1978);ラド
ディ (Lab id i) 、A、ら、FEMSマイクロバイオロジー・レタ
ーズ(Microbiology Letters)、30:221−225
(1,985)。第8図は、pI J666 : + pAL5000ライブラ
リーの構成を概略的に示す。
このライブラリーをスメグマ菌(M、smegma t i s)の中に形質転
換することは、多分再生する生存しつる細胞の問題のために、困難であった。し
たがって、DNAはエレクトロボレインヨンにより完全なスメグマm (M、s
megma t i s)細胞の中に直接導入して、スフェロプラストを産生ず
るためのプロトコルの使用から生じうるマイコバクデ・リアの細胞への起こり得
る損傷を排除した。5X10’pfu/μgより多い値を生じた、溶菌ファージ
DNAのエレクトロボレイションのための条件が開発された。これらの条件下に
plJ666: :pAL5000をスメグマ菌(M、5rne gma t
i s)の中に工し・クトロボレイシヨンすると、カナマイシン抵抗性およびク
ロランフェニコール抵抗性の形質転換体が生じた。3つの別々の実験においてス
メグマ菌(M。
smegma t i s)形質転換体のプールから分離したプラスミドDNA
をE、coliの中に形質転換しもどして、カナマイシン抵抗性について選択し
た。plJ666は分離したE、coli形質転換体の多くにおけるpAL50
00内の異なる部位に挿入したが、すべてのプラスミドは両者の種において安定
であった(第9図)。これらの方法は、実施例9に記載しそして第10図に示す
ように、あるBCGワクチン菌株をp I J666 : : pAL5000
組み換えライブラリーで形質転換することを可能とし、カナマイシン抵抗性を発
現させた。第10図のパネルAは、シャトルプラスミドDNAとBCG細胞をエ
レクトロボレイシヨンした後、発生したカナマイシン抵抗性BCGコロニーを示
す、パネルBは、シャトルブラスミドDNAの不存在下にエレクトロボレイシヨ
ンした後、発生したカナマイシン抵抗性BCGコロニーを示す。同様なアプロー
チを使用して、第17図に表される結果により示されるように、65kDのらい
菌(M、Ieprae)をBCGの中に導入し、ここでそれは発現された。
マイコバクテリアのゲノムのDNAの中に問題のDNAを組み込むためマイコバ
クテリアのゲノムのDNAの中に非マイコバクテリア由来のDNA (すなわち
、それを組み込むしt:マイコバクテリア以外の源からの)を組み込むために使
用したプラスミドベクターを、第11図に表すように構成した。ウシ結核菌(M
、bovis)−BCGのPyrF遺伝子の分離は、次のようにしてそして実施
例10に記載するようにして実施した。ウシ結核菌(M、bovis)−BCG
DNAを制限酵素5au3Aで部分的に消化し、大きさで選択し、そしてベク
ターpUC19の中に挿入した。生ずるライブラリーを使用して、E、coli
のPyrF遺伝子の中に挿入を有するE、eoli細胞を形質転換した。
ウラシルの不存在下に増殖する能力を獲得した、4つの独立のコロニーが同定さ
れ、そしてプラスミドDNAをそれらから分離した。このプラスミドDNAを使
用して、組み換えプラスミドベクターを構成した。既知の技術を使用して、スメ
グマ菌(M、sme gma t i s)のPyrF遺伝子をptJc19プ
ラスミドベクターの中のBamHI部位に組み込み、そしてカナマイシン抵抗性
遺伝子(Kan)をPyrF遺伝子の中のBamHI部位に挿入した。PyrF
’細胞はウラシルの不存在下に培地の中で増殖することができ、そしてフルオロ
−オロチン酸感受性(FOA’)である; PyrF−細胞増殖にウラシルを必
要とし、そしてフルオロ−オロチン酸抵抗性(FOAつである。カナマイシン抵
抗性遺伝子を含有する細胞はカナマイシン抵抗性(KAN’)であり、そしてこ
の遺伝子をもたない細胞はカナマイシン感受性(KAN’)である。
アウスベル(AusubeI z) 、F、M、ら(編)分子生物学における現
在のプロトコル(Current Protocols in Mo1ecul
ar Biology)、p、1.51.1、GreenPub、(1987)
。pUc19、スメグマ菌(Mycobacteriurn smegmati
s)およびTn903からのDNAを含有するプラスミドDNA、pRHl、1
00と表示する、は、ブダペスト条約の条項に従い、アメリカン・タイプ・カル
チャー・コレクション(the American Type Cu1ture
Co11ection)(マリイランド州ロックビレ)に受け入れ番号404
68号で受託された(受託日、1988年7月6日)。受託物への公衆のアクセ
ス・\の制限は、この出願に基づく米国特許が登録されたとき最終的に除去され
るであろう。
下および実施例10に記載するように、エレクトロボレイションを使用して、生
ずる組み換えプラスミドベクターをマイコバクテリアの中に導入した。第12A
図に表されるように、組み換えプラスミドで形質転換した細胞において、入るP
yrF配列およびKan配列の組み込みにおいて、相同的組み換えは、PyrF
遺伝子を含有する入る組み換えプラスミドおよび相同的マイコバクテリアの染色
体(ゲノム)の配列上で配列の開で起こった。Kan遺伝子を含有する、組み込
まれた組み換えプラスミドを含有するマイコバクテリアの細胞は、カナマイシン
を含有する培地上でエレクトロポレインヨンした細胞を培養することによって選
択した。Kan遺伝子の組み込みが起こった細胞のみが生き残った。
問題のDNA (ここで、Kan遺伝子)が同定されたマイコバクテリアの細胞
は次の通りである。全体の組み込まれた組み換えプラスミドは、それがその中に
組み込むマイコバクテリアのゲノムが互いに密に近接して2つの同一の配列を含
有するので、不安定である。結局、相同的配列の組み換えは再び起こることがで
きる。これはルーピングアウト(分割)を生じ、これは組み換えプラスミドを除
去し1、マイコバクテリアのゲノムの正味の変化を生成しないか、あるいはKa
nを含有するPyrF遺伝子がマイコバクテリアのゲノムの中に止まるような方
法で組み換えプラスミドを除去する。分割を低い頻度で起こるが、それが起こっ
た細胞を同定し、そしてそれらが示す表現型に基づいて分離することができる。
PyrF”細胞(ゲノムの中で正味変化を生じない)は、第12図に示すように
、カナマイシン感受性およびフルオロ−オロチン酸感受性(FOA“)であろう
。Kanを含有するPyrF遺伝子の組み込みを生ずる細胞は、PyrF遺伝子
が崩壊し、こうして非機能的であるので、カナマイシン抵抗性であり、モしてF
OA’である。こうして、FOAを含有する培地上でKAN’マイコバクテリア
の集団を平板培養すると、Kan遺伝子がゲノムのDNAの中に安定に組み込ま
れた細胞が同定される(第12B図、下車:KAN’、FOA’)。
こうして、K、an遺伝子は、隣接するPyrF配列の相同的組み換えを使用し
て、マイコバクテリアのゲノムの中に安定に組み込まれた。第12B図に図解さ
れている本発明の方法の重要な利点は、問題のDNAの組み込みが起こると同時
に、プラスミドまたはファージDNAはゲノムの中に組み込まれる。すなわち、
正味の作用はプラスミド配列が組み換えマイコバクテリアの細胞の中に存在しな
いことである。Kan遺伝子の発現は、また、実証され、そして組み込みおよび
分割の両者が起こりた細胞を細胞の表現型に基づいて選択した(この場合におい
て、KAN’、FOA’)。前述の研究において、非マイコバクテリア由来のD
NA (すなわち、カナマイシン抵抗性遺伝子)はスメグマ菌(M、smegm
atis)のゲノムのDNAの中に首尾よく導入および安定に組み込まれた。同
一技術を使用して、非マイコバクテリア由来のDNAをウシ結核菌(M、bov
i s) −BCGまたは他のマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に導入
することができる。
同様な方法において、それに対する免疫応答を望む、1または2以上の抗原をエ
ンコードするDNAを、マイコバクテリアのゲノムのDNAの中に組み込むこと
ができる。問題のDNAをマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に組み込む、
本発明の方法は、第13図に概略的に表されている。この方法は、実施した(参
照、実施例11)スメグマ菌(M。
smegmat i s)中の65kDのらい菌(M、1eprae)遺伝子で
あるDNAの組み込みをとくに参照して記載する。しかし7ながら、同一アプロ
ーチを使用して、らい菌(M、1eprae)の65kDの遺伝子を他のマイコ
バクテリアの中に導入することができ、ならびに免疫応答をめるortポリペプ
チドまたはタンパク質をエンコードするDNAをウシ結核菌(M、bov i
5)−BCG、スメグマm (M、smegrnat i s)またはマイコバ
クテリアの中に組み込むことができる。
選択した抗原(Fanと表示する、外来抗原について)をエンコードするDNA
の組み込みは、第13図に表されている。適当なプラスミドベクター(例えば、
E、coltの中で複製するが、マイコバクテリアの中で複製しないもの)、例
えば、第13図に表されている組み換えpUC19プラスミドを使用する。組み
換えプラスミドは、マイコバクテリアの遺伝子またはDNA配列、例えば、第1
3図に表されているpyrF遺伝子を包含する;この遺伝子中の配列は、マイコ
バクテリアのゲノム中のものに相同し、プラスミドを有するマイコバクテリアの
配列とゲノムのマイコバクテリアの配列との間で起こるべき相同的組み換えのた
めの基準を提供する。組み換えプラスミドは、また、E、coli中の複製およ
び選択のために必要なりNA配列およびマイコバクテリア中の選択のために必要
なりNA配列を包含する。選択において使用する配列は細胞に明確な表現型を与
え、こうしてその遺伝子を含有する細胞の同定および分離を可能とする。遺伝子
は、例えば、薬物抵抗性をエンコードすることができる。第13図において、組
み換えプラスミドはカナマイシン抵抗性を与える遺伝子を包含し、こうしてカナ
マイシンを含有する培地上で単に培養することによって、その遺伝子を含有する
マイコバクテリアの選択を可能とする。組み換えプラスミドは、また、マイコバ
クテリアのゲノムのDNAの中に組み込まれる、それに対する免疫応答を望む1
または2以上のポリペプチドまたはタンパク質をエンコードするDNA (Fa
nと表示する)を含有する。
本発明の1つの実施態様において、Fanがらい5g(M、1eprae)の遺
伝子である、第13図に表されるような組み換えプラスミドを使用することによ
って、らい菌(M、1eprae)の65kDの遺伝子をスメグマ菌(M、sm
egma t i s)のゲノムのDNAの中に組み込んだ。
組み換えプラスミド(例えば、65kDのらい菌(λ4.Ieprae)の遺伝
子およびKan遺伝子が挿入されたP y r F遺伝子を含有するプラスミド
)を、標準のエレクトロボし・イション技術を使用して、マイコバクテリアの細
胞(スメグマ菌(M、smegma t i s))の中に導入した。(参照、
実施例11)。次いで、工し・りトロポし・イションした細胞をカナマイシンを
含有する培地上に配置した。カナマイシン抵抗性(KAN’)の細胞のみがこれ
らの条件下に増殖した;このような細胞はゲノムのDNAの中に組み込まれ、K
AN’遺伝子およびらい菌(〜1゜1eprae)の遺伝子は、また、F(’)
A’であった(組み換えプラスミドからおよびマイコバクテリアからのPy r
F遺伝子が崩壊したために)。
細胞を引き続いてFOAを含有する培地に移して、Fan遺伝子(ここで、らい
菌(M、Ieprae)遺伝子)がゲノムのD N Aの中に安定に組み込まれ
た細胞を同定した。第13図の下のパネル(左側)に示されているように、カナ
マイシン抵抗性遺伝子およびFan遺伝子を含有する崩壊したPyrF遺伝子を
、このような細胞のゲノムのDNA (K、八N′、FOA’)の中に組み込む
。下のパネルの右側に示されているように、ルーピングアウトが起こり、その結
果ゲノムの中に完全な外来遺伝子のみが残る、マイコバクテリアの細胞はカナマ
イシン感受性でありかつフルオロ−オロチン酸感受性である。
こうして、上にそして実施例11に記載するように、タンパク質抗原をエンコー
ドするをマイコバクテリアのゲノムのDNAの中に組み込むこと、および安定に
組み込まれた問題のDNAを含有する試料を同定および選択することが可能とな
っ1こ。さらに、このような問題のDNAはマイクバクテリアのゲ7!ムの中の
選択した部位(この場合において、PyrF遺伝子の部位)に組み込ま第1た。
この同一のアプローチは、もちろん、問題のDNAをマイコバクテリアのゲノム
のDNA上の他の選択した部位の中に組み込むために使用できる。この場合にお
いて、組み込みを望む、ゲノム上の部位を選択することができる。選択し、たゲ
ノムの配列に対して相同性であるか、あるいはそれに十分に類似する配列:問題
のDNA;E、coli中の複製および選択に必要な配列:およびマイコバクテ
リア中の選択に必要なりNA配列を含有する組み換えプラスミドは、前述したよ
うにして、構成することができる。問題のDNAはマイコバクテリアのゲノムの
DNAの中に安定に組み込むことができ、そして、前述と同一方法で、安定に組
み込まれた問題のDNAを含有する細胞を選択することができる。
マイコバクテリア中の発現をのぞむ、遺伝子のすべてまたは一部分をマイクバク
テリアの中に、同一方法を使用して、導入することができる。
すなわち、次の方法を使用して、問題のマイコバクテリアのゲノムのDNAの中
に安定に組み込むことができる。
E、coliの中で複製するが、マイコバクテリアの中で複製することができな
い、組み換えプラスミドベクターは、次のものを包含する=1、 組み換えプラ
スミドで形質転換されたマイクバクテリアのゲノムの中の相同配列との組み換え
に必要な、マイコバクテリアの遺伝子、またはその一部分。
2、 組み換えプラスミドで形質転換されたマイコバクテリアの中で、その発現
を望む、ポリペプチドまたはタンパク質をエンコードする遺伝子のすべてまたは
一部分;
3、 E、coli中の複製および選択に必要なりNA配列:および
4、 マイコバクテリア中の選択に必要なりNA配列(例えば、薬物抵抗性)。
この組み換えプラスミドを使用して、マイコバクテリアの細胞、例えば、スメグ
マ菌(M、sme gma t i s)またはウシ結核菌(M、bovi 5
)−BCGを形質転換する。組み換えプラスミドは、既知の技術を使用して、マ
イコバクテリアの細胞の中に導入される。1つの実施態様において、プラスミド
をエレクトロボレイションにより、標準のバクテリアのエレクトロボレイション
手順を使用して導入する。(参照、実施例11)。
エレクトロボレイシヨンした細胞を、組み込むがその中で起こった細胞の選択を
可能とする条件下に平板培養する。前述したように、プラスミドは薬物抵抗性、
例えば、カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子を含有することができる。
その場合において、エレクトロボレイシヨンした細胞をカナマイシンを含有する
培地上で平板培養する。プラスミドDNAが組み込まれた細胞である、カナマイ
シン抵抗性(KAN’)細胞のみはこれらの条件下に生き残るであろう。
引き続いて、生き残る細胞を、問題のDNAがゲノムのDNAの中に安定に組み
込まれた細胞の同定および選択を可能とする条件下に、平板培養する。PyrF
遺伝子が問題のDNAの挿入により崩壊している場合において、生き残る細胞を
FOAを含有する培地上に平板培養し、これにより、細胞がFOA’である(こ
うし、て、このような培地の中で増殖する)ために分割が起こった細胞を同定す
ることができる。
それに対する免疫応答を望み、組み換えプラスミドの中に存在するポリペプチド
またはタンパク質をエンコードするDNAは、それが事実存在する源から分離す
ることができ、この源は標準の遺伝子操作技術により、適当な宿主の中で産生さ
れるか、あるいは化学的または機械的に合成される。同様に、相同的組み換えに
必要なプラスミドを有するDNA配列は、それが事実存在する源から分離するこ
とができ、この源は標準の遺伝子操作技術によるか、あるいは化学的または機械
的に合成される。
組み込まれた問題のDNAを含有するマイコバクテリアの細胞の選択のための基
準として働く特性は、記載したように、薬物抵抗性であることができる。遺伝子
は、例えば、カナマイシン抵抗性、ビオマイシン抵抗性、チオストレプトン抵抗
性、ヒグロマイシン抵抗性またはプレオマイシン抵抗性をエンコードする。ある
いは、栄養要求変異種の方法を使用することができ、こうして選択は組み込みが
起こったマイコバクテリアが、適当な培地上で増殖するとき、生き残る能力に基
づく。
マイコバクテリアの遺伝子(例えば、PyrF)を薬物抵抗性および問題のDN
Aにより崩壊する、前述のものに対する別のアプローチは、前に記載した方法の
結果として起こるような、追加の配列を使用せずに(例えば、Kan遺伝子を使
用せずに)問題のDNAをマイコバクテリアのゲノムの中に組み込むアプローチ
である。この方法は第14図に表されている。
この方法において、それ以上の操作および問題のDNAの導入の標的である、組
み換えマイコバクテリアの細胞をまず産生ずる。これは、例えば、マイコバクテ
リアのPyrF遺伝子をカナマイシン抵抗性の遺伝子で正確に置換することによ
って、天施することができる。標準のDNノ\技術をこの置換手順において使用
し1、−こでP y r F遺伝子をフランキングする配列を使用(、てKan
遺伝Pを挿入する。組み換えプラスミド(ここでPyrF遺伝子がKanと置換
されている)を、標準のエレクトロポ1ノイション方法を使用して、マ・イコバ
クテl+7の細胞の中に導入する。生ずるエレクトロポレイシヨンした細胞をカ
ナマイシンを含有するがウラシルを含有(、、ない培地上で平板培養する。カナ
マイシン抵抗性遺伝子およびゲ5ツムのPyrF遺伝子の両者が存在する、マイ
コバクテリアの細胞をこの時点において選択する。すべての他の細11fi (
KAN’Ura−:KAN’Ura−:KAN’Ura”)は死亡するであろう
。第14図に示すように、これはURA−およびFOA’である(それらはPy
rF遺伝子を含有しないために)ならびにKAN’ (組み込まれたKan遺伝
子のために)であるマイコバクテリアの細胞の選択を生ずる。
このようにして産生されたマイコバクテリアの細胞は、この方法においてそれ以
上の操作のための標的(標的マイコバクテリアの細胞)として、既知の技術を使
用して使用し、これにより問題のDNA、および完全なPyrF遺伝了をマイコ
バクテリアのゲノムのDNAの中に組み込む。第15図に示すように、前述のも
のおよび実施例10におけるもの類似し、完全なPyrF遺伝子および問題のD
NA(PyrF遺伝子の1端の次にまたは直後)を包含する、組み換えプラスミ
ドを使用する。
組み換えプラスミドを、標準の技術(例えば、エレクトロボレインヨン)を使用
して、「標的」マイコバクテリアの細胞(これはKan遺伝子を含むが、Pyr
F遺伝子を含まない)の中に導入する。相同的組み換えは、配列の間で、標的マ
イコバクテリアの細胞の中に存在するKan遺伝子の1つの側に対して、および
組み換えプラスミドの中に存在するPy r F遺伝子の1つの側で起こり、第
15図に示すように、標的マイコバクテリ゛rの細胞の中にPyrF遺伝子のゲ
ノム−問題のD N Aの組み合わせを組み込む。
エレクトロポレイシヨンした細胞を、カナマイシンを含有するが、ウラシルを含
有しない培地上で平板培養する。Kan遺伝子およびPyrF遺伝子(それらと
ともに問題のI) N Aが細胞に入った)を含有する細胞のみは、これらの条
件下に生き残るであろう。引き続いて、添加したウラシルを含有しない生き残る
細胞の培養は、第15図に示すように、それらのゲノムの中にPyrF遺伝子−
問題のDNAの組み合わぜを組み込んで有するもののみを増殖させる。
問題のDNAがマイコバクテリアの中で発現するその能力を生ずる源からである
場合において、発現カセットを使用することができる。発現カセットはマイコバ
クテリアのプロモーターおよびリポソーム結合部位を含有するすることができ、
これらは問題のDNAの発現を制御する発現シグナルとして働くであろう。第1
6図に示すように、発現カセットはPyrF遺伝子を取り囲む配列の中にポリリ
ンカーを含むことができる。結局、問題のDNAは挿入されることができ、モし
てマイコバクテリアのシグナルはその発現を制御するであろう。PyrF−発現
カセット−問題のDNAの組み合わせがその中に安定に組み込まれるマイコバク
テリアの細胞の選択は、第15図に関して前述したように実施することができる
。
問題のDNAをマイコバクテリアのゲノムの中に組み込むことができる、わずか
に異なるが、関係する方法は、既知の技術を使用して、通常存在するPyrF解
読配列を除去したマイコバクテリアを使用する。問題のDNA (PyrFの1
端にまたはその付近に位置する)と組み合わせて完全な(非崩壊)PyrF遺伝
子を含む以外、前述の方法に類似する組み換えプラスミドを、PyrFを欠失し
たマイコバクテリア(例えば、エレクトロポレイションにより)の中に導入する
。完全なPyrF遺伝子(および、こうして、問題のDNA)を含有する細胞は
、ウラシルを含有しないエレクトロボレイシヨンした細胞を培養することによっ
て同定する。PyrF遺伝子を含有する細胞にのみが生き残るであろう。
引き続いて、ウラシルを含有しない培地上の増殖は、また、ルーピングアウトが
Py rFおよび問題のDNAをマイコバクテリアのゲノムの中に安定に組み込
ませた、細胞を同定するであろう。
PyrFがKan遺伝子と置換されているか、あるいはPyrFがマイコバクテ
リアのゲノムから欠失されている、これらの後者のアプローチの両者の結果は、
生ずる組み換えマイコバクテリアのゲノムが機能的PyrF遺伝子および問題の
DNAを包含するが、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子(例えば、Kan)ま
たは他の選択可能なマーカーを含有しないことである。
本発明のシャトルベクターおよび方法の使用および利点の外観本発明のプラスミ
ドおよびプラスミドベクター、ならびにそれらを使用する本発明の方法について
多数の用途が存在する。これらを後述し、そしてワクチンのベヒクルの構成にお
けるそれらの使用を次の節において記載する。マイコバクテリアの中に導入され
たDNAを発現した、本発明の方法の結果、病気の病原性の問題を理解すること
についての新規な遺伝子手順は現在利用可能である。ファージまたはプラスミド
ベクターの系を使用して、相同的組み換えによるか、あるいはトランスポゾン仲
介挿入または欠失により、ビルレンスおよび病原性に要求される、特異的遺伝子
機能を同定することを目的として、病原性マイコバクテリアの遺伝子を挿入的に
突然変異誘発しかつマーキングすることができるべきである。例えば、これらの
ベクターおよびマイコバクテリア(例えば、スメグマ菌(M、smegma t
i S) 、ウシ結核菌(M、bovis)−BCG)を使用して、ヒト結核
菌(M、tuberculosis)またはらい菌(M、1eprae)のビル
レンス遺伝子を同定し、そして診断(診断試験)を開発することができる。それ
の遺伝子を特異的に欠失または置換することによって、現在のウシ結核菌(M、
bov i 5)−BCGのワクチンより結核に対してより特異的かつ有効な弱
毒化したワクチンを開発することができる。あるいは、結核およびらいに対して
特異的な保護的抗原を抵抗性個体からのT細胞により認識される抗原の研究によ
り同定されるので、現在存在するウシ結核菌(M、bovis)−BCGワクチ
ンの中にそれらを導入しそして発現することが、今回、可能である。
本発明のベクターは、まず、マイコバクテリアの中でゲノムのライブラリーの構
成を可能とする。これは、病原性マイクバクテリアのための抗原または酵素また
は薬物の標的を同定するとき、と(に有用である。
例えば、らい菌(M、]epra、e)において、ゲノムのDNAを切りそして
クローニングして、全体のゲノムのDNAが含まれることを確実にする。主題の
ベクターを使用して、らい菌(M、1eprae)の断片のライブラリーをまず
バクテリアの宿主、例えば、E、eoliの中に導入し、ここでそれを発現する
。引き続いて、それはマイコバクテリウム(例えば、スメグマ菌(M、smeg
ma t i s) 、BCG)の中に動く。結局、ライブラリーはマイクバク
テリアの宿主の中に存在し、こうしてマイコバクテリアの抗原、酵素、薬物の標
的および診断プローブの探索をより効率よくする。
ショットガンのアプローチを使用して、DNAをBCGの中に導入し、そして遅
く増殖するマイコバクテリアである、現在入手可能なりCGより速(クローンを
増殖させることができる遺伝子を含有するクローンを同定することができる。引
き続いて、この方法において同定された遺伝子を使用して、現在使用されている
BCGより速く増殖するBCGを産生ずることができる。同様なアプローチを使
用して、らい菌(M、Iep r a e)の遺伝子を培養可能なマイコバクテ
リウムの中にクローニングし、そして増殖する組み換え細胞を同定することがで
きる。このアプローチを使用して、培養可能なマイコバクテリウムかららい閑(
M、]eprae)をつくり、こうして病原体を産生ずるという現在の困難を軽
減することができる。
本発明のベクターを、また、使用して、結核またはらいの予防または処置のため
の新規な薬物を同定することができる。例えば、薬物をそれに対して向けらるべ
き標的は、病原性マイコバクテリウムにより産生さ第1る酵素(例えば、ジャイ
レース)である。スメグマ菌(M、smegma t i s)中の対応する酵
素をエンコードする遺伝子は、主題のベクターを使用して、ヒト結核菌(M、t
ubercu!osis)またはらい菌(M、1eprae)の酵素をエンコー
ドする遺伝子と置換することができる。これにより、酵素に対して有効な薬物(
ならびに鴎結核菌(M、a v i um)およびマイコバクテリウム・イント
ラセルラレ(Myeobacterium 1ntracetlulare))
を同定するための試験のために使用できる、組み換えスメグマ菌(M、smeg
matis)が産生ずる。
ここで記載する遺伝子のアプローチは、カナマイシン抵抗性をエンコードするa
phおよびneo遺伝子の両者がウシ結核菌(M、bovjs)−BCGのワク
チンの菌株の中で安定に発現されることができる(そして発現された)ことを明
瞭にする。
ここに記載する研究の結果として、選択可能なマーカー(選択の基準することが
できる、同定可能な特性をエンコードする遺伝子)は今回マイコバクテリアのた
めに入手可能である。3つのこのようなマーカーは、今回マイコバクテリアのた
めに入手可能である:クロランフエニコールアセチルトランスフエラーゼまたは
cat遺伝子、これはクロランフェニコール抵抗性を与える;2)Tn903か
らのアミノグリコシドホスホトランスフ2ラーゼまたはaph遺伝子、これはカ
ナマイシン抵抗性を与える;およびcl遺伝子、これはL1バクテリオファージ
のリプレッサータンパク質をエンコードする。適当な薬物を含有する培地の増殖
は、catまたはaph遺伝子を含有するマイコバクテリアを選択する薬物抵抗
性遺伝子の場合において使用する。培養するとき形成するプラークの外観(曇り
または透明)に基づく変動の選択は、cI遺伝子を選択に使用する場合において
使用する。
また、ここに記載する研究の結果として、清涼性および部位特異的組み換えは、
マイコバクテリアの染色体のDNA上のおよびマイコバクテリアのファージ上の
、特異的部位、組み込み部位(attachment 5ite)として知られ
ている、またはatt部位の間で起こることが示された。ファージラムダで感染
したバクテリアにおいて、ファージDNAの生理学的状態は溶菌および清涼性の
状態において異なる。これらの状態の1つから他の状態への変化は、部位特異的
組み換えを包含する。宿主DNAの中へのラムダDNAの組み込み(プロファー
ジDNAとなる遊離のラムダDNAを生ずる)は、清涼性が起こるために起こら
なくてはならない;逆に、宿主の染色体からのプロファージDNAの切り出しは
溶菌が起こるために起こらなくてはならない。組み込みおよび切り出しは部位特
異的組み換えを包含する。この現象はバクテリアのいくつかの属について知られ
ているが、これはそれがマイコバクテリアについて実証された最初である。それ
は、問題のDNAがマイコバクテリアの中に効率よくかつ安定に組み込むことが
できる手段として使用することができる。
例えば、これはeos−attベクターと呼ぶものを使用して達成することがで
きる。このようなベクターは、次のものを包含することができる:1)E、Co
11または複製の他の適当なバクテリアの由来;2)E、coiiまたは他のバ
クテリアの宿主中の選択のための、選択可能なマーカー、例えば、アンピンリン
抵抗性をエンコードする遺伝子;3)テンペレートファージのatt領域、例え
ば、Ll; 4)ラムダcos部位、ラムダ生体外パッケージング系を使用する
ことができるために;および5)選択可能なマーカー、例えば、カナマイシン抵
抗性、クロランフェニコール抵抗性をエンコードする遺伝子またはファージL1
のCIリプレッサーをエンコードする遺伝子。ベクターは、既知の技術およびこ
こに記載する技術を使用して構成することができる。ベクターの組み込みを仲介
するために必要な遺伝子は、同一ベクター上に存在することができるか、あるい
は途中で設けることができる。
ここに記載する研究は、マイコバクテリア(例えば、スメグマ菌(M。
smegma t i s)、BCG)の中で染色体外で複製するプラスミドの
レプリコンの同定を生ずる。記載するように、pAL5000レプリコンが同定
された。同一方法を使用して、また、使用することができる他のものを同定する
ことができる。
記載する研究は、また、組み換えDNA分子である、E、coliマイコバクテ
リアのシャトルプラスミドの首尾よい構成を実証し、そして組み換えDNA分子
はE、coliの中でプラスミドとして複製しかつマイコバクテリアの中でファ
ージとして複製する能力を有するばかりでなく、かつまたバクテリオファージラ
ムダのヘッドの中にまたはマイコバクテリオファージ粒子の中にパッケージング
される能力を有する。研究において、さらに、組み換えDNAは急速に増殖する
マイコバクテリウム(スメグマ菌(M、sme gma t i s) )およ
び遅く増殖するマイコバクテリウム(BCG)の両者の中に導入されたことが実
証された。
これにより、ウシ結核菌(M、bovis)−BCGのワクチンの菌株をシャト
ルプラスミドで感染することおよび、こうして、クローニングした遺伝子をマイ
コバクテリアの中に導入することができる。こうして、これはBCGのためにト
ランスフェクション系を開発する必要性を排除する。すなわち、E、colt−
マイコバクテリアのシャトルプラスミドは、マイコバクテリアの中にトランスフ
ェクションすると、マイコバクテリアの粒子の中にパッケージングされるので、
問題のDNAをトランスフェクションよりむしろ形質導入により遅く増殖するマ
イコバクテリア(例えば、ウシ結核菌(M、bov i 5)−BCG)の中に
安定に導入することができる。これにより、問題の1または2以上の抗原に対し
、て免疫化するために使用することができる、組み換えマイコバクテリアのワク
チンのベヒクルを産生ずることができる。
これらのプラスミドを構成するために生体外パッケージングの使用は、パッケー
ジング系の大きさの限界を越えないかぎり、遺伝子(例えば、それに対する免疫
応答を望む1または2以上の病原体のための1または2以上の抗原をエンコード
する遺伝子またはDNA)をこれらのベクターの中にクローニングする効率よい
方法として拡張することができる。
追加のLl: : pHC79組み換えプラスミドをスクリーニングすることに
よって、Llファーンから欠失することができるDNAの最大量を決定すること
、およびその中にDNAを挿入することができる、ファージのゲノムの追加の非
必須領域を定めることが、また、可能であるう本発明の方法は、マイコバクテリ
ウムの中に組み込まれた問題のDNAによりエンコードされる1または2以上の
タンパク質またはポリペプチドの発現のための、遺伝子的に組み換えのマイコバ
クテリアのベヒクルを構成するために有用である。このような遺伝子的に組み換
えのマイクバクテリアは多数の用途を有する。
本発明のベヒクルは、例えば、問題のDNAによりエンコードされる病原性抗原
に対する免疫性を誘発するためのワクチンとして、使用することができる。病原
体は、病気を引き起こす、任意のウィルス、微生物、または他の有機体または物
質(例えば、毒素)である。らいに対する免疫化のために有用なワクチンのベヒ
クルをつくることができる。マイコバクテリア、例えば、BCGの例外的なアジ
ュバントの活性のために、このようなワクチンは、とくに長期間のまたは耐久性
の性質の、細胞仲介免疫性の産生において有効である。らいの寄生体らい菌(M
、]eprae)のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子は、ヤング(You
ng)により分離され、そして同時係属米国特許出願箱892,095号、19
86年7月31日提出、その教示を引用によってここに加える、に詳細に記載さ
れている。とくに、5つの免疫原性タンパク質抗原(すなわち、分子量65kD
、36kD、28kD、18kDおよび12kDの抗原)をエンコードする遺伝
子が分離された。さらに、65kD抗原のための遺伝子によりエンコードされる
6つの異なるエピトープが定められた。これらの少なくとも1つのエピトープは
らい菌(M、Iepra、e)に対して独特であることが示された:他のエピト
ープは他のマイコバクテリアの65kDタンパク質と共有されることが示された
。
本発明のシャトルベクターおよび組み換えプラスミドベクターの使用により、前
述の方法および次の実施例の方法を使用して、BCGの中にらい菌(M、Iep
rae)タンパク質抗原をエンコードする1または2以上の遺伝子を導入するこ
とができる。65kDのらい菌(M、1eprae)タンパク質をエンコードす
る遺伝子は、事実、組み換えの中に導入されそして組み換えBCGにより発現さ
れた。ウェスタン・プロット分析の結果(第17図)は、65kDのらい菌(M
、1eprae)抗原および選択可能なマーカーの両者の存在を実証した。例え
ば、65kDらい菌(M、Ieprae)抗原をエンコードする遺伝子はBCG
の中に導入し、そのゲノムのDNAの中に安定に組み込み、そしてそれを投与し
た宿主において免疫応答を刺激または導入ために十分なレベルで発現することが
できる。実施例11に詳細に記載されているように、65kDのらい菌(M、1
eprae)タンパク質に対して特異的なモノクローナル抗体を使用して、遺伝
子をその中に導入したスメグマ菌(M、sme gma t i s)の抽出物
の中で65kDのらい菌(M、1eprae)遺伝子の発現を実証した。さらに
、5IVIエンヴエローブタンパク質をエンコードする遺伝子を、Kanおよび
らい菌(M、1e p r a e)の遺伝子について記載した技術を使用して
、スメグマ菌(M、sme gma t i s)の中に導入すべき、同様なプ
ラスミドベクターの中にクローニングした。同様な構成体を、BCGの中に導入
するために、また、つくった。このようにして、らい菌(M、1eprae)の
1または2以」二の保護的抗原を含有し、寛容性決定因子もたず、そして細胞仲
介免疫性を誘発するためにきわめてすぐれたアジュバントを有することにおいて
、理想的に近いワクチンを構成することができる。
同様な方式で、本発明のシャトルまたはプラスミドのベクターおよび方法を使用
して、ワクチンを構成し、結核に対する特異的保護を提供することができる。こ
のようなワクチンは、前述したように、現在使用されているワクチンが無効であ
ることが証明されているという最近報告された発見を考慮すると、とくに魅力的
である。結核のバチルス属のヒト結核菌(M、tuberculosis)の免
疫原性タンパク質抗原をエンコードする遺伝子は、次の出願に記載されている二
同時係属米国特許出願第071010,007号、発明の名称「ヒト結核菌のタ
ンパク質抗原をエンコードする遺伝子およびその使用J (Robert N。
HussonおよびRichard A、Young)、1987年2月2日提
出(現在放棄された)、および一部継続米国特許出願第07/154.331号
(1988年2月10日、エキスプレス・メイル・プロセジュア−(Expre
ss Mai l procedure)により提出された)、発明の名称「ヒ
ト結核菌のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子およびその使用J (Rob
ert N、HussonSRiehard A、¥oungおよびThoma
s M、5hinntckLそれらの教示を引用によってここに加える。
この場合において、ヒト結核菌(M、tuberculosis)の免疫原性タ
ンパク質抗原をエンコードする遺伝子を、前述したように、シャトルまたはプラ
スミドのベクターによりBCGの中に導入する。また、各々がタンパク質抗原を
エンコードする、1より多いヒト結核菌(M、tuberculosis)遺伝
子をBCGの中に導入することができる。例えば、分子量12kD、14kD、
19kD、65kDおよび71kDの免疫原性ヒト結核菌(M、tubercu
losis)抗原、またはこれらの遺伝子の2またはそれ以上の組み合わせをB
CGの中に挿入し、ゲノムのDNAの中に安定に組み込み、そして発現すること
ができる。結核に対する免疫化に対して特異的であり、そしてバチルス属に対す
る長期間持続する免疫性を誘発するワクチンが得られる。
また、本発明の方法を使用して、多目的的または多機能的ワクチン(すなわち、
各遺伝子が異なる病原体または毒素のためのタンパク質抗原をエンコードする、
1より多い遺伝子を含む問題のDNAをを含有しかつそれを発現する、単一のワ
クチンのベヒクル)を構成することができる。
例えば、記載したシャトルベクターのプラスミドまたはプラスミドベクターを使
用して、らい菌(M、1eprae)のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子
、ヒト結核菌(λ4.tuberculosis)のタンパク質抗原をエンコー
ドする遺伝子、レイシュマニアの抗原をエンコードする遺伝子、およびマラリア
のタンパク質抗原をエンコードする遺伝子をBCGの中に導入することができる
。この多価ワクチンの投与は、各抗原に対する免疫応答を刺激し、モしてらい、
結核、レイシュマニアおよびマラリアに対する長期間の保護を提供するであろう
。
組み換えマイクバクテリアは、また、抗受精「ワクチン」のベヒクルとして使用
することができる。例えば、ヒトの成長ホルモン(HG H)の断片のような抗
原をエンコードするDNAを含有しマイクバクテリアを、抗受精ワクチンとして
使用し、そして産児制限剤として投与することができる。本発明のワクチンのベ
ヒクルはヒトの癌、例えば、膀胱癌または黒色腫を処理する(例えば、増殖阻害
因子または殺細胞産生物の発現により)ために使用することができる。これに関
して、インターフェロンα、βおよび//またはγ、1または2以上のインター
リューキン(インターリューキン1〜7)および/またはTNFαまたはβを含
有しそしてそれらを発現する組み換えマイクバクテリアはとくに有用である。
他の応用において、組み換えマイコバクテリアを使用して、保護的免疫応答(例
えば、引き続くまたは長期間の感染に対する)を引き出す目的で、あるいは自己
免疫病(例えば、慢性関節リウマチ)における耐性を誘発する目的で、ストレス
タンパク質を発現するために使用することができる。ストレスタンパク質、例え
ば、同時係属米国特許出願第207゜298号、発明の名称「ストレスタンパク
質およびその使用J(Richard A、YoungおよびDouglas
Young)、1.988年6月15日提出、に記載されているものを、この目
的に使用することができる。それらのゲノムは大きい(例えば、BCGゲノムは
約3x 10”b pの長さである)ために、マイコバクテリアは大量の問題の
DNAを収容しそし、て、こうして、多目的ベヒクルとして働くことができる。
本発明の組み換えマイコバクテリアを使用して、問題の1または2以上のポリペ
プチド、例えば、ステロイドを産生ずることができる。この場合において、ステ
ロイドをエンコードする遺伝子のすべてまたは一部分を適当なマイコバクテリア
の宿主の中に導入し、ここでそれを発現する。こうして、組み換えマイコバクテ
リアはこのようなタンパク質を産生ずる価値ある手段を提供する。
さらに、本発明のシャトルベクターおよび遺伝子的に組み換えのマイコバクテリ
アは診断において使用することができる。例えば、病原性有機体(例えば、ヒト
結核菌(M、tuberculosis)、鳥結核菌(M、av i um)
)に対して特異的であり(問題のDNAを導入することができる)そしてリポー
タ−分子をエンコードするDNA (例えば、ビブリオバクテリアからのまたは
ホタルのルシフェラーゼ:β−ガラクトシダーザ;β−グルコシダーゼ:カテコ
ールデヒドロゲナーゼ)および強いマイコバクテリアのプロモーター(転写の開
始に必要なりNA配列)を包含し、リポータ−分子をエンコードする遺伝子の発
現を制御(推進)するシャトルプラスミドを構成する。病原性有機体の存在また
は不存在について評価すべき個体から試料(例えば、血液または尿)を得る。例
えば、個体を結核について試験する場合、ヒト結核菌(M。
tube reu los i s)に対して特異的なシャトルプラスミドを使
用する。試料を培養し、そして適当な量のヒト結核菌(M、t u b e r
culosis)特異的プラスミドと組み合わせる。適当な条件下に短時間(例
えば、数時間)後、試料を、既知の技術を使用して、ベクター中のDNAにより
エンコードされるリポータ−分子の発生(存在または不存在または必要に応じて
、量)についてアッセイする。試料が、非常に低いレベルでさえ、ヒト結核菌(
M、tuberculosis)を含有する場合、ファージの中に存在するDN
Aは有機体の中に導入されるであろう。いったん試料の中にヒト結核菌(M、t
ubercul。
5js)が存在すると、リポータ−分子をエンコードするものを包含する、プラ
スミド(ファージ)DNAは複製されるであろう。リポータ−分子がルシフェラ
ーゼである場合、かなりな量のルシフェラーゼは産生され(産生は強いプロモー
ターにより推進されるので)そして研究装置、例えば、フォトメーターを使用し
て検出することができる。個体におけるヒト結核菌(M、tuberculos
is)の感染の存在または不存在の決定は可能であり、同様に必要に応じて定量
は可能である。本発明の方法が開発されるまで、結核を診断する利用可能な技術
は遅かった(例えば、敗退を要した)。今回マイコバクテリアの中で発現された
、β−グルコシダーゼは、また、リポータ−分子として使用することができる。
タンパク質またはポリペプチドを発現するための使用のいずれにおいても、シグ
ナル配列をエンコードするシャトルベクターのDNAを含めることが可能であり
、こうして、発現されたタンパク質またはポリペプチドを細胞雪中につくり、次
いで細胞壁において分泌する手段を提供することができる。例えば、マイコバク
テリアの中で分泌するα抗原からシグナル配列を使用することができるであろう
。あるいは、β−がラクトシダーゼ、アガロースまたはα−アミラーゼのための
シグナル配列を使用するすることができるであろう。
次の実施例によって、本発明をここで説明する。これらの実施例はいかなる方法
おいても限定的に考慮すべきではない。
実施例1
マイコバクテリオファージD29 DNAを使用するスメグマ菌(M。
smegma t i s)スフェロプラストのトランスフエクションスメグマ
菌(M、sme gma t i s)菌株mc”5のスフェロプラストを、次
の方法に従い調製した。mc”f3は単一のコロニーの分離物であり、ATCC
607スメグマ菌(M、smegma t i s)原培養物から分離した主な
コロニーの型である。それは再生培地上でオレンジ色の粗いコロニーを形成する
。ホブウッド(Ho pwo o d) 、D。
A、ら、ストレプトミセス属の遺伝子操作−実験室のマニュアル(Geneti
c Manipulation of the Streptomyces−A
Laboratory Man、ua、I)、TheJohn Innes
Foundation1英国ノーウィッチ(1985)。
スメグマ菌(M、sme gma t i s)のスフェロプラストを、スメグ
マ菌(M、sme gma t N s)についてウドゥ(Udou)らにより
記載されたスフェロプラストの調製のための培地を使用して、ストレプトミセス
属(Streptomyces)について調製した。ウドゥ(Udou)T、ら
、ジャーナル・オブ・バクテリオロジ−(J、BactriologyL月け:
1035−1039 (]982)。適度の震盪を有する250m1のバッフ
ル付きフラスコ内で40m1の1%のグルコースおよび0. 2%のツイーン8
0を含有するトリプシン大豆ブロスの中で、mc25細胞を37℃においてA6
゜o=0.2に増殖させ、この時20%のゲリンシ溶液を1%の最終a盲に添加
した。細胞をさらに]、6時間・インキュベーショ〉′シ、次いで室温において
5000Xgで10分間遠心することによって収穫した。沈澱を10 m lの
103%のスクロースで2回洗浄し、、次いで2mg/mlのりゾチーム溶液を
含有する原形質体(p)の緩衝液の中に再懸濁した。37℃において2時間イン
キュベーションした後、5mlの緩衝液を添加し、そしてスフェロプラストを3
000Xgにおいて7分間遠心することによって沈澱させた。沈澱を10m1の
p緩衝液の中に再懸濁させ、そして3時間以内に使用した。
mc2−11をATCC607スメグマ菌(M、 sme gma t i s
)原培養物の自発的D29抵抗性分離物として分離し、このとき108細胞を3
X10’プラ一ク形成単位と混合し、そしてトリプシン大豆寒天平板上で平板培
養した。D29抵抗性コロニーは10−7の頻度で発生しに。
mc”6スフエロプラストを1μgのD29 DNAと混合した。生ずる混合物
の1/10を、05モルのスクロースの存在または不存在下に、トリブ7ノン大
豆寒天平板上で平板培養した。次いで、それらを10’mc26細胞を含有する
適当な軟寒天で覆った。DNアーゼ1 (Slgma)を5011g/mlの最
終濃度でD29 DNAに添加することによって、DNアーゼ処理を実施した。
等しい量のmc211スフエロプラストを同一方法において使用したが、次いで
mc26細胞で引き続いて覆って、プラーク形成単位(pfU)をアッセイした
。
ファージの平板のストック・D29の平板リゼイトを2ミリモルのCacl、を
含有するトリプシン大豆寒天培地上で調製した。バッフル付きフラスコ内で37
℃においてA D Cエンリッチメント(enrichment)を含有するミ
ドルブロック(Middlebrook)7H9ブロス中で対数中期に増殖した
スメグマm (M、smegma t i s)細胞を、MP緩衝液(10ミリ
モルのトリス−HCL pH7,6−10ミ’JモルのMgCIt 100ミリ
モルのNaCl−2ミリモルのCaC1□)中で希釈したファージと混合し、そ
して37℃において36時間インキ、ベーションして、全面平板培養した。ファ
ージをMP緩衝液で収穫し、次いで2つのCsCl平衡勾配で精製し、次いでM
P緩衝液に対して広範に透析した。EDTAを50ミリモルの最終濃度に添加し
、100μg/mlのプロイテイナーゼで55℃において24時間処理し、次い
でフェノール−クロロホルムで抽出し、モしてTE緩衝液に対して広範に透析す
ることによって、ファージからDNAを抽出した。
トランスフェクション:各トランスフェクションのために、2,511のスフェ
ロプラスト懸濁液を15m1のコニカルポリスチレン管内で沈澱させた。上澄み
液を注意してデカンテーションし、そしてスフェロプラストを残る緩衝液の滴中
に再懸濁した。10μmより少ない合計の体積で1μgのDNAを添加した後、
0.5mlのP緩衝液中で調製した25%のPEG−1000(J、T、Bak
er ChemicalCo、、ペンシルベニア州フィラデルフィア)溶液を添
加した。3分以内に、5mlのP緩衝液を混合物に添加し、そしてスフェロプラ
ストを上のように沈澱させた。上澄み液を注意して注ぎ出した後、沈澱を1m1
0P緩衝液中に再懸濁し、そして試料を鉤 5モルのスクロースのの存在または
不存在下にトリプシン大豆の寒天に移した。次いで、平板に3.3mlの軟トリ
プンン大豆寒で覆い、そして37℃においてインキュベーションした。24時間
インキュベーション後、プラークを計数した。
実施例2
シャトルプラスミドphAE1、の構成TM4 ファージDNAを250μg/
mlの濃度で結合した。系統的に希釈したS a u 3 、Aでアリコートを
部分的に消化した:長さが平均30〜5Qkbの断片(アガロースゲルの電気泳
動により分析した)がこの方法で得られた。これらの断片を1:4のTM4断片
対BamHIで切断したpHC79のモル比で結合した。この結合のアリコート
を生体外パッケージング混合物(Gigapack plus、Stratag
ene、カリフォルニア州すンディエゴ)でパッケージングし、引き続いてER
1381(hsdRmerA” mcrB”、E、Ra1e i gh)の中に
形質導入すると、50μg/mlでアンピシリンを含有するし寒天上で平板培養
するとき、10’のアンピシリン/μgの1M4 DNAインサートを生じた。
40.000アンピシリン抵抗性コロニーのプールを、Lブロスをガラススプレ
グーで均質化することによって調製した。アルカリSDS抽出、引き続くフェノ
ール−クロロホルム抽出およびエタノールを使用する濃縮により、プラスミドを
コロニーのプールから調製した。共有的に閉じたプラスミドのDNAを、実施例
1に記載するようにmc26スフエロブラストの中にトランスフェクションした
。ベントン(Benton)およびバイオトランス(Biorans)ナイロン
膜(ICN)のプロトコルを使用して、プラークのリフトを実施することによっ
て、プラークをpHC79の存在についてスクリーニングした。ベントン(Be
nton)児 D、およびR,W、 ディビス(Dav i s) 、サイエン
ス(Sc i enc e) 、196 :180−182 (1977)、”
P−dCTPでニック翻訳したpHC79と膜をハイブリダイゼーションし、そ
してオートラジオグラフィーを実施した。
実施例3
シャトルプラスミドphAE1によるBCGおよびスメグマ菌(M、smegr
nat i s)の感染
BCG−グラクツ(Gla、xo)(W、Jones)を、37℃においてスタ
ンディング培養物(standing cultures)中のADCエンリッ
チメント(Dirco)および0. 5%のツイーン80 (S i gma)
を含有するミドルブロック(Middlebrook)7H9ブロス(Difc
o)の中で増殖した。10’BCG細胞を補充した上部の軟寒天と混合し、モし
て0ADSエンリツチメント(DifCO)を補充したツイーン80(Difc
o)を含まないデュボス(Dubos)寒天上に注ぐことによって、BCG−グ
ラクツ(Glaxo)またはmc”6細胞の菌叢を調製した。ジョンズ(J o
n e s) 、W。
D、Jr、、チュバークル(Tubercle)、60:55−58 (197
9)。4つのファージ、DS6A、、1M4、phAEl、および33Dを系統
的に希釈し、そして2つの菌叢上にスポツティングした。平板を14日および2
日に、それぞれ、BCG−グラクツ(Glaxo)およびスメグマ菌(M、sm
egma t i s)について読んだ。
実施例4
アミノグリコンドホスホトランスフェラーゼ遺伝子のp h A E l中のク
ローニング
Tri903からのアミノグリコンドホスホトランスフェラーゼ遺伝子(a p
h)をエンコードする1、、6kbのEcoRI断片を、コスミトクローニン
グ方法を利用してphAElの中にクローニングした。プラスミドphAE1の
DNAをE、coliから分離し、EcoRIで切断し、モしてi、、6kbの
断片をこれらの大きいDNA分子に結合し、た。
結合産生物をファージラムダの中に生体外でパッケージングし、粒子を産生じ、
これらはカナマイシン抵抗性およびアンピシリン抵抗性をE。
coli細胞に形質導入した。プラスミドDNAをE、coli細胞から分離し
、そしテスメグマ菌(M、smegma t i s)mc”6原形質体の中に
トランスフェクションするとき、高い頻度のプラーク形成単位を生じた。これは
、少なくとも1.6kbの追加のDNAをphAElの独特EcoR1部位の中
にクローニングできることを実証する。同様な結果がシャトルプラスミドphA
E2を使用して得られ、phAE2はphAElの特性に類似する特性を有する
が、phAElより2kbだけ小さく、少なくとも3.6kbの追加のDNAの
クローニングを可能とするであろうシャトルベクターである。両者の場合におい
て、aph遺伝子の導入は新しいNru1部位を導入し、追加のDNA断片をク
ローニングし、そしてシャトルプラスミドの中に安定に維持することができると
いう証拠を提供する。こうして、それ以上の修飾をもたないこれらのベクターは
追加の遺伝子をマイコバクテリアの中にクローニングするために有用であること
がある。
実施例5
シャトルプラスミドを使用するマイコバクテリア中の選択可能なマーカTM4フ
ァージについて構成したものに類似する方法で、シャトルプラスミドをファージ
Ll (ATCC17199)から構成した。ドウク(Doke) 、S、クマ
モト・メディカル・ジャーナル(kumamoto Medical Jour
nal)、34:1360−1373 (1960)。Ll−シャトルプラスミ
ドのすべてはスメグマ菌(M。
smegma t i s)を溶原化する能力を有する。Llはスメグマ菌(M
、sme gma t i s)の染色体の物質の中に組み込み、そして安定な
溶原化を形成することが示された。他のファージ、例えば、L3(ATCC17
199) 、プラスミドとして残る(染色体外)ファージおよびL5 (ATC
C4t27201)を、また、シャトルプラスミドの構成において使用すること
ができる。結果は、これらのシャトルプラスミドがスメグマm (M、smeg
ma t i s)を溶原化し、こうして問題のDNAをマイコバクテリアの中
に最初に安定に組み込むすることができることを示した。aph遺伝子を、E、
eo!i中のTM4−シャトルプラスミドについて前述したように、phAEl
5と表示するLl−シャトルプラスミドの独特EcoR1部位の中にクローニン
グした。
スメグマ菌(M、sme gma t i s)細胞(mc”6)を、カナマイ
シンを含有するデュボス(Dubos)寒天平板上の寒天の上部にオーバーレイ
した。シャトルプラスミドphAE15およびphAEl、9(クローンミルh
遺伝子をもつphAEl5)の希釈物を寒天の菌叢上にスポツティングした。平
板を37℃において5日間インキュベーションした。増殖したコロニーのすべて
は、aph遺伝子がクローニングされたLl−シャトルプラスミドで溶原化され
た。生ずるシャトルプラスミドphAE19は、スメグマ菌(M、sme gm
a t i s)細胞を溶原化することができた。生ずる溶原化は、カナマイシ
ン抵抗性であるので、クローニングしたaphを発現した。さらに、これらの溶
原化はマイコバクテリオファージの粒子を生じ、これらの粒子は、また、引き続
いてカナマイシン感受性スメグマ菌(M、sme gma t i s)細胞を
転移および溶原化すると、カナマイシン抵抗性の表現型を発現した。これらのフ
ァージの転移は、清涼性状態(すなわち、重感染に対する免疫性)およびカナマ
イシン抵抗性の同時形質導入を生じた。スメグマ菌(M。
sme grna t i s)の溶原化に使用したし1フアージはBCG上で
プラーク形成しない。しかしながら、BCG上でプラークを形成するI、1およ
びシャトルプラスミドphAE19の両者が分離された。これらを、テンペレー
トシャトルプラスミドにより、BCGおよびヒト結核菌(M。
tuberculos is)の中に問題の遺伝子を導入しそして安定に発現す
る、それらの能力について試験した。こうして、これらのファージはスメグマ菌
(M、sme gma t i s)の中に問題のDNAを安定に導入する能力
を有する。さらに、BCGを感染しそして溶原化する宿主の範囲の変異型(例え
ば、phAEl9)を分離した。これにより、問題のDNAを含有する組み換え
マイコバクテリウムを産生ずることができる。このような組み換えマイコバクテ
リアはワクチンとして使用することができる。
実施例6
スメグマ菌(M、sme gma t i s)染色体の中へのマイコバクテリ
0.05%のツイーン80を含有するトリプシン大豆ブロス中で増殖した、特定
しないマイコバクテリウム、ATCC27199、からの培養上澄み液を、クロ
ーニングしたスメグマ菌(M、sme gma t i s)菌株、mc25、
上で平板培養することによって、ファージL1を得た。
ジャコブス(J acobs) 、 W、 R,J r、 、ツクマン(Tuc
man)、M、およびブルーム(Bloom) 、B、R,ネイチ−?−(Na
ture)、327:532−535 (1987)。ファージをプラーク精製
し、そして高い力価の平板リゼイトを、2ミリモルのCaCLを含有するデュボ
ス寒天培地(ツイーンを含まない)上で37℃において増殖したmc26から得
た。ファージ粒子をCsC1平衡密度の遠心により精製し、そしてファージDN
Aを前述したように分離した。ジャコブス(J acobs) 、W、 R,J
r、 、ツクマン(Tucrnan)、M2 およびブルーム(B l oo
m) 、B、 R,ネイチ+−(Nature) 、327 : 532−53
5 (1987)。前述のプロトコルに従い、コスミドとしてpHC79および
TM4 DNAの代わりにLX DNAを使用して、Ll−シャトルプラスミド
を構成した。ジャコブス(Jacobs) 、W、R,J r、 、ツクマン(
Tucman) 、M、およhAE15 DNAをTn903 EcoRT a
phカセット(Pharmacia)に結合することによって、903からのa
ph遺伝子を1つのLl−シャトルプラスミド、phAEl54、の中に導入し
た。
生ずる結合体をラムダ−ファージのヘッドの中に生体外パッケージングし、次い
でE、coli菌株2338の中に形質導入し、アンピシリン抵抗性およびカナ
マイシン抵抗性の両者について選択した。ジャコブス(Jacobs) 、W、
R,ら、プロン−ディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シズ(Proc、Nat 1.Acad。
Sc i、)USA、83 :1926−1930 (1986)、プラスミド
DNAをE、coliから分離し、mc26原形質原形牛体トランスフェクショ
ン腰そして生ずるマイコバクテリオファージをI)IIAEI9と表示した。m
c26細胞を含有する寒天上でプラスミドをスポツティングした後、溶原化を濁
ったプラークから精製した。推定上の溶原化をファージの解放およびLlによる
重感染に対する抵抗性について試験した。染色体のI)NAをブラウン(Bra
un)ホモジナイザーで分離し、次いでフェノール−クロロホルム抽出した。バ
イオトランス(ICN)ナイロン膜を使用して製造業者の推奨に従い実施した。
LI DNAをニック翻訳キット(BRL)および[2−32P] −dcTP
(Ame rsham)を使用して放射線標識した。
実施例7
ADCエンリッチメントおよび0.05%のツイーン80を補充したミドルブo
ツク(Middlebrook)7H9ブロス(M−ADC−TWブロス)の
中で37℃において培養物を震盪することによって増殖した、スメゲマ菌(M、
Smegma t i S)、mc”6、 [2×107]細胞を、15μg/
mlのカナマイシンを含有するデュボス(Dubos)寒天平板」−にオーバー
レイした。Ll−シャトルプラスミド、p h A E i 5およびphAE
19 (=I)hAE15: :aph)のりゼイトを、0.45μmのフィル
ターを通して濾過し、そしてMP緩衝液を使用してほぼ5x106pfu/ml
に希釈した。ジャコブス(Jacobs) 、W、 R,J r、 、ツクマン
(Tucman) 、M、およびを表示し、た区域においてスポツティングし、
そし7て平板を37℃において5日間インキュベーションした。第7図に示すよ
うに、phAE19がrn e 26を溶原化するコロニーが現れ、こうしてカ
ナマイシン抵抗性の発現を実証する。多数の実験において、カナマイシン抵抗性
のコロニーがme26の自発的突然変異体またはphAE15で溶原化したmc
”6細胞から観測されなかった。phAE19で溶原化したme26であるスメ
グマ菌(M、smegma t i s)菌株、me259と表示する、は、1
988年7月22日に、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(th
e American Type Cu1ture Co11ection)(
7リイランド州ロツクビレ)に受託No、67746で受託された。受託物への
公衆のアクセスについてのすべての制限は、この出願に基づく米国特許が登録さ
れたとき最終的に除去されるであろう。
実施例8
前述したように分離したプラスミドpAL5000DNAをMbolで部分的に
消化し、5kbの線状断片を電気泳動後にアガロースゲルから分離した。バーン
ポイム(B i rnbo im) 、H,およびドリイ(Do] y) 、核
酸の研究(Nucleic Ac1ds Re5earch) 、7 :151
3−1525 (1979)、これらの断片をポジティブ(pos i t 1
ve)選択のベクターplJ666に結合し、このp I J 666はTn5
から由来するneo遺伝子、およびBamHIおよびEeoRVで切断しモして
E、coliの中に形質転換した、pACYC184からの復製のP15A由来
およびcat遺伝子を含有した。キーゲル(Kieser)、T、およびR,E
、メルトン(MeltonL遺伝子(Gene) 、65 :83−91 (1
988):ベルブ(Be rg) 、D、 E、ら、プロシーディンゲス・オブ
・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエンシズ(Proc、Nat 1.Ac
ad。
Sc i、)USA、ヱ2:3628−3632 (1975);チヤツプ(C
hang) 、A、C,Y、およびS、 N、:+ウヘン(Cohen)、ジャ
ーナル・オブ・バクテリオロジ−(J、Bactriology)、形質転換体
(200コロニー、25g/mIに対して抵抗性)をプールし、そして混合培養
において増殖さ也これからプラスミドを分離した。
バーンボイム(Birnboim)、H,およびドリイ(Doly)、核酸の研
究(Nucleic Ac1ds Re5earch)、ヱ:1513−152
5 (1979)。pTJ666: :pAL5000のコノライブラリーを、
ジーン・パルサー(Gene F’ulser)(Biorad)エレクトロボ
レイターにより、スメグマ菌(M、smegma t i s)の中に形質転換
した。チャシー(Chassy) 、B、M。
およびJ、L、フリッキンガ−(Fl i cki nger)、FEMSフィ
クロバイオロジー・レターズ(Microbiology 1etters)、
44:173−177 (1987)。mc”6細胞の新鮮な培養物をM −A
D C−T Wブロスの中で震盪しながらAsoo=1. 7に増殖させた。
細胞を遠心により収穫し、エレクトロポレイション緩衝液(7ミリモルのホスフ
ァージ、pH7,2−272ミリモルのスクロース)中で洗浄し、そしてもとの
体積の1/10に再懸濁した。プラスミドDNA (lμg)を0.8mlのス
メグマ菌(M、sme gma t iS)細胞を含有するエレクトロポレイシ
ョンのクベットに添加した。氷上で10分間インキュベーションした後、細胞を
単一のパルスのエレクトロボレイション(6250V/cmで25μF)に暴露
し、次いで等しい体積のM−ADC−TWグロスと混合し、そして37℃におい
て2時間インキュベーションしまた。次いで、細胞を10μg/mlのカナマイ
シンを含有する7H10寒天平板上で平板培養し、そして37℃において7日間
インキュベーションした。カナマイシン抵抗性の形質転換体を10μg/mlの
カナマイシンを含有する7H9−ADC−TWジブロス中継代培養し、そしてフ
ァージD29をプラーク形成するそれらの能力を保持し、それらがスメグマ菌(
M、sme gma t i s)であることを確証した。7oマン(From
an)、、S、ら、Am、J、Public Health、44:1326−
1334(1954)、これらの形質転換体は、また、100μg / m !
のクロランフェニコールに対して抵抗性であった。プラスミドDNAを細胞の1
mlの試料からバーンボイムの手順の修正により分離し、順次にリゾチーム、ア
ルカリ性−3DSおよび最終高い塩の中で一夜インキユベーシダンした。スメグ
マ菌(M、smegmatis)から分離したDNAを2338の中に形質転換
し、そしてDNAの1μg当たり104のカナマイシン抵抗性E、coli形質
転換体を得た。バーンボイム(B i rnbo im)、Hlおよびドリイ(
Do l y) 、核酸の研究(Nucleic Ac1ds Re5earc
h)、7.:1513−1525(1979)、個々のE、coli形質転換体
から分離したすべての独特のプラスミドは、形質転換し、そしてカナマイシン抵
抗性およびクロランフェニコール抵抗性をスメグマ菌(M、smegmat i
s)にを与えることができた。
実施例9
BCG−パスツール(pasteur)菌株P1173P2を、M=−ADC−
TWジブロス中震盪しながら37℃において5日間増殖した(推定した生存能力
4.5X10’cfu/mり。これらの細胞を、前述と同一の手順に従い、p
I J 666 : : pAL5000組み換えライブラリーでエレクトロポ
レイシヨンすることによって形質転換し、そしてADCエンリッチメントおよび
20μg/mlのカナマイシンを含有する7H10寒天上で平板培養した。45
のカナマイシン抵抗性BCG細胞のプールを、2011g/mlのカナマイシン
を含有する液体培地の中で37℃において3週間培養した。この培養から、プラ
スミドを実施例8に記載するように分離した。それらはずべて11.2kbの大
きさであり、そし、て形質転換したとき、E、coli細胞にカナマイシン抵抗
性を与えた。このプラスミドDNAを再び使用してBCG細胞を形質転換した。
上に示した平板を37℃において18日間インキュベーションし、次いで写真撮
影した。シャトルプラスミドで形質転換したBCG−パスツール(pasteu
r)下位菌株、pYUPllooと表示する(また、pYUB13と呼ぶが、あ
るいは表示する)は、カナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子およびクロラ
ンフェニコール抵抗性ヲエンコードする遺伝子を包含し1.1988年7月22
日にアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the America
n Type Cu!ture Co11ection)(7リイランド州ロツ
クビレ)に受託No、67745で受託された。受託物への公衆のアクセスにつ
いてのすべての制限は、この出願に基づく米国特許が登録されたとき最終的に除
去されるであろう。
ストレス誘発した65kD抗原をエンコードするらい菌(M、Ieprae)遺
伝子を、また、導入しそしてスメグマ菌(M、s m e K11l atis
)およびBCGの中で発現した。らい菌(M、Ieprae)遺伝子をE、co
lf−マイコバクテリアのシャトルプラスミド、pyuB12と表示する、の中
にクローニングし、このプラスミドは、pRHllooを含む、前にpYUPと
表示したシャトルプラスミドの群の1員である。生ずる構成体、pYUB39、
をスメグマ菌(M、smegma t i s)およびBCG−パスツール(P
asteur)の両者の中に形質転換し、そして形質転換体からの細胞リゼイト
を5DS−ポリアクリルアミドゲル上で電気泳動させた。生ずるgmをナイロン
膜上にブロッティングし、次いでこれをらい菌(M、Ieprae)特異的エピ
トープIIE9を認識するマウスモノクローナル抗体でプロービングした。次い
で、プロットをアルカリ性ホスファターゼに結合したマウス特異的ウサギ抗体で
ブロービングし、ホスファターゼ活性について展開し、そして写真撮影した。生
ずるゲルは、外来らい菌(M、Ieprae)の65kDの抗原をエンコードす
るクローニングした遺伝子が、第17図に表すように、スメグマ閑(M、Sme
gma t i S)およびBCGの両者において発現され、ここで第17図
は組み換えプラスミドpYUB12またはpYUB39を含有する細胞リゼイト
のSDSポリアクリルアミドゲルの電気泳動のウェスタン・プロット分析の写真
である。
実施例10
次のバクテリア菌株を使用した:RY1103 (DB6507、バッチ(Ba
eh)、プロシーディンゲス・オブ・ナショナル・アカデミ−・オブ・サイエン
シズ(Proc、Na t 1.Aead、Sc 4.)USA、ヱ6 : 3
86−390 (1979))HBIOI、PyrF::Tn5、thr−1I
eu−1pro−1Bl−1r−1m−1suIIおよびRY1107 (DB
6566、ロウズ(Ro s e) 、M、ら、遺伝子(Gene) 、29
+113−124 (1984))B15、PyrF : :Mu、t rp、
、、、IacZ、−、hsdR\m”、5u−0両者はディピッド・ホトスティ
ン(David Boststein)博士(マサチ、セッッ工業大学)から入
手した。Yl、109 (DH5alpha)F−%endAI、hsdR17
(rKSmKつ、5upE44、thil、recAl、gyrA96、re
Ia、、de l (argF−IacZYA)(U169、lamda−1p
hi80dlacZdeIM15、こわらはベセスダ・リサーチ・ラボラトリー
ズ(Bethesda Re5earch Laboratories)から入
手した。
MCツー6、屯−のコロニーの分離物スメグマ菌(M、smegmatis)プ
ロトドローフ これはウィリアム・ジャコブス(William Jacobs
)博士(アルバート・アインシュタイ薬科大学)から入手した。FOA=3はウ
ラシル栄養要求変異種へのMC2−5の自発的突然変異体であり、そして5−フ
ルオロ−オロチン酸に対して抵抗性である。ウシ結核菌(M、bovis) −
BCG (Moreau)はATCC35736である。ウシ結核菌(M、bo
vi 5)−BCC; (Montrea+)はATCC35735゜マイコバ
クテリアのゲノムのDNAのライブラリースメグマ菌(M、sme gma t
j s)のゲノムのDNAはグルコースおよび80を補充したトリプシン大豆
ブロス中で増N後、MC”−6から得た。培養物はグリシンを0. 5%に最後
の数時間の間添加して飽和に増殖した。細胞を遠心により収穫し、洗浄し、そし
て50ミリモルのトリスpH8,0,10ミリモルのEDTA、10%のスクロ
ースの中に再懸濁し、次いで0.2μg/mlのりゾチームで1時間処理し、次
いで50ミリモルのEDTAおよび1%のSDSで15分間処理した。
多数回のフェノール:クロロホルム抽出を実施し、次いでイソプロパツール沈澱
し、RNアーゼ処理し、フェノール:クロロホルム抽出、クロロホルム抽出およ
びエタノール沈澱した。沈澱を70%のエタノールで洗浄し、そしてTE pH
7,5の中に再懸濁した。ウシ結核菌(M。
bovis)−BCG (Moreau)ゲノムのDNAをグアスキンスキー(
Graskinsky)博士の寛大な贈り物であった。
マイコバクテリアのゲノムのDNAを5au3Aで部分的に消化し、DE81紙
」二へのアガロースゲルの電気泳動により大きさで選択し、エタノール沈澱し、
そしてBamHIで切断しかつ仔ウシ腸ポスファターゼで処理したpUc19の
中に結合した。ハナハン(h a n a h a n)の手順により形質転換
体について競合的とした、DH5alphaを、この結合体で形質転換し5、そ
して50μgのアンビンリンを含有す−るルリア・ベルタニ(I、uria B
ertani)寒天上に平板培養した。
組み換えプラスミドを含有するコロニーの比率は、X G a lおよびIPT
Gを含有するインジケーター平板上に平板培養し、そしで白色コロニ一対合計(
白色+青色)のコロニーの比を決定することによって決定した。プールしたプラ
スミドDNAは、平板からコロニーを引っ掻き取り、50ミリモルのトリスpH
8,0,10ミリモルのEDTA150ミリモルのグルコースの中に再懸濁する
ことによって得た。生ずる墾濁液をプラスミドDNAを得るためのアルカリ性溶
菌方法により処理した。スメグマ菌(M、smegma t i s)の組み換
えD N Aライブラリーは35.000の独立の初期の形質転換体から成り、
それらの85%は組み換え体であった。ウシ結核菌(M、bov i 5)−B
CGの組み換えDNAライブラリーは64.000の独立の初期の形質転換体か
ら成り、それらの55%は組み換え体であった。
’l’ 1103および”1’1107をハナハン(Hanahan)の方法に
より競合的とし、プラスミドのライブラリーのDNAで形質転換し、そして最小
寒天平板上で平板培養した。スメグマ菌(M、smegmatis)のライブラ
リーについて最初にスクリーニングした180.000の形質転換体のうちで、
31は最小培地上で増殖ことかできた。
グ
プラスミドDNAをアルカリ性溶菌法により液体培養により分離した。
組み換えプラスミドD N 、Aの制限マツピングを標準の方法に従い多数の酵
素を使用して実施し、た。二。−・イングランド・バイオラプス(New En
gland Biolabs)および米国パイケミカルス(U。
S、Bioehemieals)からの配列決定既知の技術を使用して、M13
mp18およびM13mp19の中にサブクローニング後、ジデオキシ方法を使
用してDNAの配列決定を実施した。
実施例11
pPP25、PyrF−E、col iと競合することができるスメグマ菌(M
、sme gma t i s)からのDNAを含有する組み換えプラスミド、
を、BamHIで消化し、そしてpUC4kSACから分離した、Tn903の
アミノグリコシドホスホトランスフェラーゼをエンコードする1、3kBのBa
mHI断片に結合した。らい菌(M、Ieprae)の65kDの抗原をエンコ
ードする遺伝子を含有するY3178のEcoRI断片を、引き続いて、このプ
ラスミドにおいてマイコバクテリアのDNA中の独特XholおよびECOR’
ll’の中にクローニングした。各場合において、マイクバクテリアのオープン
リーディングフレーム、カナマイシン抵抗性の遺伝子およびらい菌(M、1ep
rae)の65kDの遺伝子の転写の向きは同−向きであると決定された。
エレクトロボレイションによりマイコバクテリアの形質転換スメグマ菌(M、s
me gma t i s)およびウシ結核菌(M、b。
v i 5)−BCGを、ADCエンリッチメントおよび0.05%のツイーン
80を補充したミドルブロック(Middlebrook)7H9培地の中でほ
ぼ0. 3〜0.5のA6゜。に増殖した。細胞を遠心により収穫−10ミリモ
ルのヘペス(Hepes)pH7,0中で洗浄し、遠心し、モして1/10の体
積の10ミリモルのへベスpH7,0,10%のグリセロール(スメグマ菌(M
、sme gma t i s) )の中に再懸濁するか、あるいは1/10体
積の7ミリモルのリン酸ナトリウムpH7,2,272ミリモルのスクロース(
BCG)中で洗浄しそしてその中に再懸濁した。DNAを添加し、そして細胞を
単一のパルスの6゜25kV/cmに25マイクロフアラドでバイオラド・ジー
ン・パルサー(Biorad Gene Pu1ser)を使用して暴露した。
次いで、3〜5体積のM−ADC−TWを添加し、細胞を37℃において2〜3
時間インキュベーションし、遠心し、小さい体積のM−ADC−1のカナマイシ
ンを含有するトリプシン大豆の寒天(スメグマ菌(M。
smegma t i s))またはADCエンリッチメントを補充し、10μ
g/mlのカナマイシンを含をするミドルブロック(Mtddlebrook)
7H9寒天上で平板培養した。
サザンプロット分析
マイクバクテリアの形質転換体のゲノムのDNAを制限酵素で消化し、アガロー
スゲルでエレクトロポレイシヨンし、ニトロセルロースに移し、そして32pニ
ツク翻訳で標識したDNAでブロービングし、すべて標準の手順を使用した。
ウェスタン・プロット(イムノプロット)分析65kDのらい菌(M、1epr
ae)タンパク質の発現を、ウェスタン・プロットの技術を使用して実証した。
マイコバクテリアのリゼイトおよびE、coliの形質転換体をSDSポリアク
リルアミドゲルの電気泳動にかけ、ニトロセルロースに電気転移させ、そして標
準の技術を使用してほぼ1 : 1000の希釈でモノクローナル抗体I I
rE9でブロービングした。プロトプロット(Protoblot)キット(P
romega Biotec)を使用して抗体の結合を検出し、そして製造業者
の指示に従い使用した。これにより、らい菌(M、1eprae)遺伝子を含有
するプラスミドで形質転換した細胞中で65kDのタンパク質の発現が検出され
た。
同等の実施態様
当業者は日常の実験を越えないものを使用して、ここに記載する発明を逸脱しな
いで特定の実施態様に対する多くの同等の態様を、認識するか、あるいは確証す
ることができるであろう。このような同等の態様は次の請求の範囲包含される。
:とを意図する。
FIG、1
ρNアーt′ズ1理11:。
MsmagmaNaのスフzffグンヌト+029ONA M、smegmat
Isnヌ7tD7ラスF寸029ON^FIG、3A FIG、3B
FIG、5A FIG、5B
FIG、7
F工GURE 8
11.2 kbのplJ666 :: pAL5000譲新〒(えプラスミドラ
ライデラν−
FOAS
KAN R
URA”
ANR
にANS KANR
Bc(、tp、y)M、Ieprae 65kDa e)y梢源の七硯
pYtJB39 f pYIJ巳12゛:M ±5pras 65 kDa f
lイ云J−国際調査報告
“°1″″′幻″”””PCT/LIS 8910:962ト瞳+1j−1@M
IΦ^−釦イjI−・h鳴 p「〒1t+F、RQ#lフ96フ国際調査報告
US8902962
SA 2979D
■出 願 人 ザ・ボード・オブ・トラステイーズ・オブ・ザ・レランド・ス
タッフォード・ジュニア・ユ、二
バーシティ
アメリカ合衆国カリフォルニア用94305 スタンフォード (番地なし)
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、組み換えマイコバクテリウムのゲノムDNAの選択した部位の中に安定に組 み込まれた問題のDNAを発現することができる組み換えマイコバクテリウム。 2、問題のDNAは、抗原、酸素、リンフォカイン、イムノポテンシエイターお よびリポーター分子から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質また はポリペプチドをエンコードする、上記第1項記載の組み換えマイコバクテリウ ム。 3、問題のDNAは、 a、1、らい菌(Mycobacterium leprae)抗原、2、ヒト 型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗体、3 、マラリアスポロゾイト、4、マラリアメロゾイト、5、ジフテリアトキソイド 、6、破傷風トキソイド、7、リーシュマニア(Leishmania)抗原、 8、サルモネラ抗原、9、マイコバクテリウム・アフリカヌム(Mycobac terium africanum)抗原、10、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ(Mycobacterium intracellulare)抗 原、11、鳥結核菌(Mycobacterium avium)抗原、12、 トロポネーマ(Treponema)抗原、13、百日咳抗原、14、ヘルペス ウイルス抗原、15、はしかウイルス抗原、16、おたふくかぜウイルス抗原、 17、赤痢菌(Shige11a)抗原、18、ナイセリア(Neisseri a)抗原、19、ボレリア(Borrelia)抗原、20、狂犬病抗原、21 、ポリオウイルス抗原、22、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、23、へび毒物抗原 、24、昆虫毒物抗原、および25、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 b、ステロイド酵素、 c、インターリューキン1〜7、 d、腫瘍壊死因子αおよびβ、 e、インターフェロンα、βおよびγ、およびf、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される少なくとも1種のタンパク質抗原をエンコードする、 上記第1項記載の組み換えマイコバクテリウム。 4、a、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)、b 、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCG、c、鳥結 核菌(Mycobacterium avium)、d、チモテ菌(Mycob acterium phlei)、e、マイコバクテリウム・フォルツイツム( Mycobacterium fortuitum)、f、マイコバクテリウム ・ルフ(Mycobacterium lufu)、g、パラ結核菌(Myco bacterium paratubercu1osis)、h、マイコバクテ リウム・ハバナ(Mycobacterium habana)、i、マイコバ クテリウム・スクロフラセウム(Myoobacterium scrofuI aceum)、j、マイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobact erium intracellulare)、およびk、それらのいずれかの 遺伝子変異型から成る群より選択される、上記第3項記載の組み換えマイコバク テリウム。 5、問題のDNAが、抗原、酵素、リンフォカイン、イムノポテンシエイターお よびリポーター分子から成る群より選択されるヌクレオチド配列から本質的に成 る、組み換えマイコバクテリウムのゲノムのDNA中の選択した部位に安定に組 み込まれた問題のDNAを発現することができる組み換えマイコバクテリウム。 6、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCG、スメグ マ菌(Mycobacterium smegmatis)、またはその遺伝子 の変異型である、上記第5項記載の組み換えマイコバクテリウム。 7、組み換えウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCG 、組み換えスメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)、 またはその遺伝子の変異型であり、前記組み換えマイコバクテリウムは選択した 部位においてゲノムのDNAの選択した部位の中に安定に組み込まれた問題のD NAを発現することができ、問題のDNAは少なくとも1種の問題のタンパク質 またはポリペプチドをエンコードする、組み換えマイコバクテリウム。 8、問題のタンパク質またはポリペプチドは、抗原、酵素、リンフォカイン、イ ムノポテンシエイターおよびリポーター分子から成る群より選択される、上記第 7項記載の組み換えマイコバクテリウム。 9、抗原は、 a、1、らい菌(Mycobacterium leprae)抗原、2、ヒト 型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗体、3 、マラリアスポロゾイト、4、マラリアメロゾイト、5、ジフテリアトキソイド 、6、破傷風トキソイド、7、リーシュマニア(Leishmania)抗原、 8、サルモネラ抗原、9、マイコバクテリウム・アフリカヌム(Mycobac terium africanum)抗原、10、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ(Mycobacterium intracellulare)抗 原、11、鳥結核菌(Mycobacterium avium)抗原、12、 トロポネーマ(Trcponema)抗原、13、百日咳抗原、14、ヘルペス ウイルス抗原、15、はしかウイルス抗原、16、おたふくかぜウイルス抗原、 17、赤痢菌(Shigella)抗原、18、ナイセリア(Neisseri a)抗原、19、ボレリア(Borrelia)抗原、20、狂犬病抗原、21 、ポリオウイルス抗原、22、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、23、へび毒物抗原 、24、昆虫毒物抗原、および25、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 b、ステロイド酵素、 c、インターリューキン1〜7、 d、腫瘍壊死因子αおよびβ、 e、インターフェロンα、βおよびγ、およびf、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される、上記第8項記載の組み換えマイコバクテリウム。 10、問題のDNAのエピソームの発現をすることができ、前記問題のDNAは 組み換えマイコバクテリウムの染色体外に存在しそして少なくとも1つの問題の タンパク質またはポリペプチドをエンコードすることができる、組み換えマイコ バクテリウム。 11、問題のタンパク質またはポリペプチドは、抗原、酵素、リンフォカイン、 イムノポテンシエイターおよびリポーター分子から成る群より選択される、上記 第10項記載の組み換えマイコバクテリウム。 12、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCGまたは スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)である、上記 第11項記載の和み換えマイコバクテリウム。 13、E.coliおよびマイコバクテリアの中で問題のDNAを複製および発 現することができ、マイコバクテリアのE.coliハイブリッドプラスミドで ある、シャトルプラスミドベクター。 14、E.coliおよびマイコバクテリアの中で問題のDNAを複製および発 現することができ、 a、E.coli中の前記プラスミドの複製および選択に必要なDNA、 b、マイコバクテリア中の前記プラスミドの選択のための選択可能なマーカーを エンコードするDNA、 c、マイコバクテリアの中で機能的な複製の由来、およびe、マイコバクテリア の中で複製することができるプラスミドの非必須部位の中に挿入された問題のD NA、からなる、シャトルプラスミドベクター。 15、バクテリアのプラスミドDNA、マイコバクテリアのプラスミドDNAお よび問題のDNAからなり、E.coliの中で問題のDNAを複製および発現 することができ、そしてマイコバクテリウムの中で問題のDNAを複製および発 現することができ、a、Tn5からのneo遺伝子、pACYC184からのP 15A由来およびpACYC184からのcat遺伝子からなる、E.coli プラスミドpIJ666のDNA、 b、プラスミドpAL5000のDNA、およびc、問題のDNA、 からなり、E.coliプラスミドのDNAはpAL5000のDNA内に挿入 されている、 ハイブリッドのマイコバクテリアーバクテリアのベクター。 16、問題のDNAは少なくとも1つのタンパク質またはポリペプチドをエンコ ードする、上記第15項記載のハイブリッドのマイコバクテリアーバクテリアの ベクター。 17、問題のDNAは、抗原、酵素、リンフォカイン、イムノポテンシエイター およびリポーター分子から成る群より選択される少なくとも1つのタンパク質ま たはポリペプチドをエンコードする、上記第16項記載のハイブリッドのマイコ バクテリアーバクテリアのベクター。 18、プラスミドとしてE.coliの中で複製しそしてマイコバクテリアを溶 原化することができ、次の成分:a、複製のバクテリアの由来、 b、E.coli中のプラスミドの選択のための選択可能なマーカーをエンコー ドするDNA、 c、独特EcoR1部位、 d、ラムダファージcos部位、およびe、マイコバクテリア中のプラスミドの 選択のための選択可能なマーカーをエンコードするDNA、 からなり、前記成分はテンペレートマイコバクテリオファージのゲノムのDNA の非必須領域の中に挿入されている、シャトルプラスミドベクター。 19、バクテリアの由来はCo1E1であり、E.coli中のプラスミドの選 択のための選択可能なマーカーをエンコードするDNAはアンピシリン抵抗性を エンコードする遺伝子であり、そしてマイコバクテリア中のプラスミドの選択の ための選択可能なマーカーをエンコードするDNAはカナマイシン抵抗性をエン コードする遺伝子であり、そしてテンペレートマイコバクテリオファージはL1 である、上記第18項記載のシャトルプラスミド。 20、プラスミドとしてE.coliの中で複製し、そしてマイコバクテリアを 溶原化することができ、L1マイコバクテリオファージ::E.coliコスミ ドpHC79ハイブリッドである、シャトルプラスミドベクター。 21、L1マイコバクテリオファージのゲノムの非必須領域の中に挿入されたE .coliコスミドpHC79からなる、phAE15と表示するL1シャトル プラスミド。 22、マイコバクテリウムの中で複製しそしてマイコバクテリアのゲノムのDN Aの中に組み込むことができ、a、複製のバクテリアの由来、 b、バクテリア宿主中のベクターの選択のための選択可能なマーカーをエンコー ドするDNA、 c、マイコバクテリア中のベクターの選択のための選択可能なマーカーをエンコ ードするDNA、 e、テンペレートマイコバクテリオファージのatt領域、およびラムダファー ジcos部位、 からなる、cos−attシャトルベクター。 23、マイコバクテリウムの中で染色体外で複製することができる複製のバクテ リアプラスミド由来をエンコードする、分離したDNA。 24、上記第13項記載のバクテリアーマイコバクテリアのシャトルプラスミド をその中に安定に組み込んで有する組み換えマイコバクテリウム。 25、バクテリアーマイコバクテリアのシャトルプラスミドはE.coli−マ イコバクテリアのシャトルプラスミドである、上記第24項記載の組み換えマイ コバクテリウム。 26、組み換えスメグマ菌(Mycobacterium smegmatis )または組み換えウシ結核菌(Mycobacteriumbovis)−BC Gである、上記第25記載の組み換えマイコバクテリウム。 27、少なくとも1つの問題のタンパク質またはポリペプチドをエンコードする 問題のDNAのエピソームの発現をすることができ、前記問題のDNAは上記第 15項記載のバクテリアーマイコバクテリアのシャトルプラスミド中の組み換え マイコバクテリウムの中に存在する、組み換えマイコバクテリウム。 28、前記問題のタンパク質またはポリペプチドは、抗原、酵素、リンフォカイ ン、イムノポテンシエイターおよびリポーター分子から成る群より選択される上 記第27項記載の組み換えマイコバクテリウム。 29、問題のDNAは、 a、1、らい菌(Mycobacterium leprae)抗原、2、ヒト 型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)抗体、3 、マラリアスポロゾイト、4、マラリアメロゾイト、5、ジフテリアトキソイド 、6、破傷風トキソイド、7、リーシュマニア(Leishmania)抗原、 8、サルモネラ抗原、9、マイコバクテリウム・アフリカヌム(Mycobac terium afrlcanum)抗原、10、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ(Mycobacterium intracellulare)抗 原、11、鳥結核菌(Mycobacterium avium)抗原、12、 トロポネーマ(Treponema)抗原、13、百日咳抗原、14、ヘルペス ウイルス抗原、15、はしかウイルス抗原、16、おたふくかぜウイルス抗原、 17、赤痢菌(Shigella)抗原、18、ナイセリア(Neisseri a)抗原、19、ボレリア(Borrelia)抗原、20、狂犬病抗原、21 、ポリオウイルス抗原、22、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、23、へび毒物抗原 、24、昆虫毒物抗原、および25、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 b、ステロイド酵素、 c、インターリューキン1〜7、 d、腫瘍壊死因子αおよびβ、 e、インターフェロンα、βおよびγ、およびf、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される少なくとも1種のタンパク質抗原をエンコードする、 上記第27項記載の組み換えマイコバクテリウム。 30、a、スメグマ菌(Mycobacterium smegmatis)、 b、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCG、c、鳥 結核菌(Mycobacterium avium)、d、チモテ菌(Myco bacterium phlei)、e、マイコバクテリウム・フォルツイツム (Mycobactcrium fortuitum)、f、マイコバクテリウ ム・ルフ(Mycobacterium lufu)、g、パラ結核菌(Myc obacterium paratuberculosis)、h、マイコバク テリウム・ハバナ(Mycobacterium habana)、i、マイコ バクテリウム・スクロフラセウム(Mycobacterium scrofu laceum)、j、マイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobao terium intracellulare)、およびk、それらのいずれか の遺伝子変異型から成る群より選択される、上記第29項記載の組み換えマイコ バクテリウム。 31、マイコバクチリオファージのDNA、バクテリアのコスミドDNAおよび 問題のDNAからなる、テンペレートシャトルスプライシングで安定に溶原化さ れた組み換えマイコバクテリウム。 32、マイコバクテリオファージのDNAはL1のDNAであり、そしてバクテ リアのコスミドDNAはE.coliのDNAである、上記第31項記載の組み 換えマイコバクテリウム。 33、問題のDNAは、 a、1、らい菌(Mycobacterium leprae)抗原、2、ヒト 型結核菌(Mycobacter1um tuberculosis)抗体、3 、マラリアスポロゾイト、4、マラリアメロゾイト、5、ジフテリアトキソイド 、6、破傷風トキソイド、7、リーシュマニア(Leishmania)抗原、 8、サルモネラ抗原、9、マイコバクテリウム・アフリカヌム(Mycobac terium africanum)抗原、10、マイコバクテリウム・イント ラセルラレ(Mycobacterium intracellulare)抗 原、11、鳥結核菌(Mycobacterium avium)抗原、12、 トロポネーマ(Treponema)抗原、13、百日咳抗原、14、ヘルペス ウイルス抗原、15、はしかウイルス抗原、16、おたふくかぜウイルス抗原、 17、赤痢菌(Shigella)抗原、18、ナイセリア(Neisseri a)抗原、19、ボレリア(Borrelia)抗原、20、狂犬病抗原、21 、ポリオウイルス抗原、22、ヒト免疫欠損ウイルス抗原、23、へび毒物抗原 、24、昆虫毒物抗原、および25、コレラ菌から成る群より選択される抗原、 b、ステロイド酵素、 c、インターリューキン1〜7、 d、腫瘍壊死因子αおよびβ、 e、インターフェロンα、βおよびγ、およびf、ルシフェラーゼ、β−ガラク トシダーゼ、β−グルクロニダーゼおよびカテコールデヒドロゲナーゼから成る 群より選択されるリポーター分子、 から成る群より選択される少なくとも1種のタンパク質抗原をエンコードする、 上記第32項記載の組み換えマイコバクテリウム。 34、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the Amerio an Type Culture Collection)に受託No.677 46で受託された、シャトルプラスミドphAE19で溶原化された組み換えス メグマ菌(Mycobacteriumsmegnlatis)。 35、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the Americ an Type Culture Collection)に受託No.677 45で受託された、シャトルプラスミドpYUP1100で形質転換された組み 換えマイコバクテリウム(Mycobacterium)BCG−パスツール( Pasteur)下位菌株(substrain)P1173P2。 36、成分: a、マイコバクテリアのゲノムのDNA中のDNA配列に対して相同性のDNA 配列。 b、E.coli中のプラスミドの複製および選択に必要なDNA配列、 c、マイコバクテリア中のプラスミドの選択に必要なDNA配列、および e、マイコバクテリアの中で発現すべき少なくとも1つのタンパク質または少な くとも1つのポリペプチドをエンコードするDNA、からなる、マイコバクテリ アのゲノムのDNAの中に問題のDNAを組み込むのためのプラスミドベクター 。 37、E.coliの中で複製することができるが、マイロバクテリアの中で複 製することができず、 a、pUC19のBamHI部位に挿入されたマイコバクテリアのPyrF遺伝 子、 b、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子、およびc、少なくとも1つのタンパク 質または少なくとも1つのポリペプチドの抗原をエンコードするDNA、 からなる和み換えプラスミド。 38、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子はカナマイシン抵抗性をエンコードす る遺伝子である、上記第37項記載の組み換えブラスミド。 39、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション(the Americ an Type Culture Collection)に受託No.404 68で受託された、pRH1100と表示する、pUC19、スメグマ菌(My cobacterium smegmatis)およびTn903からのDNA を含有するプラスミドDNA。 40、薬物抵抗性をエンコードする遺伝子および問題の抗原をエンコードするD NAをその中に挿入して有するマイコバクテリアのPyrF遺伝子を、マイコバ クテリアのゲノムの中に、安定に組み込むことからなる、問題の抗原をエンコー ドするDNAをマイコバクテリウムの中に導入する方法。 41、pUC19のDNA、マイコバクテリアのDNAの一部分と相同性のDN A、問題のDNA、およびマイコバクテリア中の組み換えプラスミドの選択に必 要なDNAからなる組み換えプラスミド。 42、工程: a、マイコバクテリアを組み換えプラスミドで形質転換し、前記組み換えプラス ミドは、1)マイコバクテリアのゲノムのDNAの一部分に対して配列が相同性 のDNA、2)E.coli中の複製および選択に必要なDNA、3)マイコバ クテリア中の選択に必要なDNA、および4)発現すべきタンパク質またはポリ ペプチドをエンコードするDNAからなり、前記形質転換はマイコバクテリアの ゲノムのDNAに対して配列が相同性のプラスミドおよび相同性マイコバクテリ アのゲノムのDNAの中でDNAの組み換えが起こるために適当な条件下に実施 し、そして b、相同性の組み換えが起こったマイコバクテリアの細胞を選択する、からなる 、マイコバクテリウムの中で発現すべきタンパク質またはポリペプチドをエンコ ードするDNAをマイコバクテリアのゲノムの中に組み込む方法。 43、工程: a、1)マイコバクテリアのゲノムの一部分に対して配列が相同性のDNA、2 )E.coli中の複製および選択に必要なDNA、3)マイコバクテリア中の 選択に必要なDNA、および4)問題のDNAからなる組み換えプラスミドを、 エレクトロポレイションにより、マイコバクテリアの細胞の中に導入し、 b、組み換えプラスミドをそれらのゲノムの中に組み込んで有するマイコバクテ リアの細胞のみが生き残ることができる培地上にエレクトロポレイションした細 胞を平板培養し、そしてc、問題のDNAをそれらのゲノムの中に安定に組み込 んで有するマイコバクテリアの細胞のみが生き残ることができる培地上に、生き 残る細胞を平板培養する、 からなる、マイコバクテリアのゲノムを問題のDNAの中に安定に組み込む方法 。 44、工程: a、pUC19のDNA、マイコバクテリアのPyrF遺伝子、カナマイシン抵 抗性をエンコードする遺伝子および問題のDNAからなる組み換えプラスミドを 、エレクトロポレイションにより、マイコバクテリアの中に導入し、前記Pyr F遺伝子はカナマイシン抵抗性をエンコードする遺伝子および問題のDNAその 中に挿入して有し、そして相同性の組み換えが起こるのために適当な条件下に、 生ずるマイコバクテリアを維持し、 b、エレクトロポレイションしたマイコバクチリアをカナマイシンを含有する培 地上に培養し、 c、工程(b)において培養したマイコバクテリアをフルオロ−オロチン酸を含 有する培地上に移し、そしてd、フルオロ−オロチン酸を含有する培地上で増殖 するマイコバクテリアを分離する、 からなる、ゲノムのDNAの中に安定に組み込まれた問題のDNA有する組み換 えマイコバクテリアを産生する方法。 45、ゲノムのDNAの中に安定に組み込まれた問題のDNA有する組み換えマ イコバクテリウムからなり、前記問題のDNAは免疫応答を望むタンパク質また はポリペプチドをエンコードする、ワクチン。 46、組み換えマイコバクテリウムはウシ結核菌(Mycobacterium bovis)−BCG、スメグマ菌(Mycobacterium smeg matis)またはその遺伝子変異型である、上記第45項記載のワクチン。 47、哺乳動物の宿主に組み換えマイコバクテリウムを投与することからなり、 前記組み換えマイコバクテリウムは1または2以上の病原体の各々のための少な くとも1つの抗原をエンコードするDNAをそのゲノムの中に組み込んで有する 、1または2以上の病原体に対して哺乳動物の宿主を免疫化する方法。 48、1または2以上の病原体の各々のための少なくとも1つの抗原をエンコー ドするDNAをウシ結核菌(Mycobacteriumbovis)−BCG のゲノムの中に安定に組み込むことからなる、1または2以上の病原体に対して 哺乳動物の宿主を免疫化するワクチンを調製する方法。 49、適当なエレクトロポレイション緩衝液の中でシャトルプラスミドおよびマ イコバクテリアを組み合わせ、そして前記組み合わせをエレクトロポレイション の単一のパルスに暴露することからなる、E.coliおよびマイコバクテリア の中で複製しそして外来DNAを発現することができるシャトルプラスミドを完 全なマイコバクテリウムの中に導入する方法。 50、エレクトロポレイションの単一のパルスは6250V/cmにおいて25 uFである、上記第49項記載の方法。 51、シャトルプラスミドはシャトルプラスミドpYUP1100であり、そし て完全なマイコバクテリウムは、スメグマ菌(Mycobacterium s megmatis)、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis) −BCG、鳥結核菌(Mycobacterium avium)、チモテ菌( Mycobacterium phlei)、マイコバクテリウム・フォルツイ ツム(Mycobacterium fortuitum)、マイコバクテリウ ム・ルフ(Mycobacterium lufu)、パラ結核菌(Mycob acterium paratuberculosis)、マイコバクテリウム ・ハバナ(Mycobacterium habana)、マイコバクテリウム ・スクロフラセウム(Mycobacterium scrofulaceum )およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobacterium intracellulare)から成る群より選択される、上記第49項記 載の方法。 52、工程: a)1)組み換えプラスミドのライブラリー、前記ライブラリーはバクテリアの プラスミドのDNAおよびマイコバクテリアの中で複製するプラスミドからのD NAから本質的に成る組み換えプラスミドのDNAからなる、および2)完全な マイコバクテリアを、適当なエレクトロポレイションの緩衝液の中で、組み合わ せ、そしてb)a)において形成した組み合わせを十分な大きさおよび期間のエ レクトロポレイションの単一のパルスに暴露して、組み換えプラスミドのDNA をマイコバクテリアの中に入れる、からなる、E.coliおよびマイコバクテ リアの中で外来DNAを複製および発現することができるシャトルプラスミドの DNAを完全なマイコバクテリアの中に導入する方法。 53、シャトルプラスミドはシャトルプラスミドpYUP1100であり、そし て完全なマイコバクテリウムは、スメグマ菌(Mycobacterium s megmatis)、ウシ結核菌(Mycobacterium bovis) −BCG、鳥結核菌(Mycobacterium avium)、チモテ菌( Mycobacterium phlei)、マイコバクテリウム・フォルツイ ツム(Mycobacterium fortuitum)、マイコバクテリウ ム・ルフ(Mycobacterium lufu)、パラ結核菌(Mycob acterium paratuberculosis)、マイコバクテリウム ・ハバナ(Mycobacterium habana)、マイコバクテリウム ・スクロフラセウム(Mycobacterium scrofulaceum )およびマイコバクテリウム・イントラセルラレ(Mycobacterium intracellulare)から成る群より選択される、上記第52項記 載の方法。 54、組み換えプラスミドのライブラリーはpIJ666:pAL5000のラ イブラリーであり、そしてエレクトロポレイションの単一のパルスは6250V /cmにおいて25uFである、上記第53項記載の方法。 55、工程: a、病原性有機体に対して特異的なシャトルプラスミドを準備し、前記シャトル プラスミドはリポーター分子をエンコードするDNAおよび病原性有機体の中で 機能することができるプロモーターからなり、リポーター分子をエンコードする DNAの発現は前記プロモーターの制御下にあり、 b、シャトルプラスミドのDNAを病原性有機体の中に導入するために適当な条 件下に、試料を前記シャトルプラスミドと組み合わせ、c、前記リポーター分子 をエンコードするDNAの発現に適当な条件下に、工程(b)の産生物を維持し 、そしてd、前記リポーター分子を検出する、 からなる、試料中の選択した病原性有機体の存在を検出する方法。 56、病原性有機体はマイコバクテリウムであり、プロモーターはマイコバクテ リアのプロモーターであり、そしてリポーター分子はルシフェラーゼである、上 記第55項記載の方法。
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