JPH06501607A - ミコバクテリアへの部位特異的組み込みの可能なｄｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ミコバクテリアへの部位特異的組込みの可能なりＮＡこの発明はミコバクテリア 染色体への組込みの可能なりＮＡ（デオキシリボ核酸）に関する。とりわけこの 発明は、ミコバクテリア染色体への部位特異的組込みが可能であり、一方ＤＮＡ が組込まれるミコバクテリアに対し異型の蛋白質をコード化するＤＮＡ配列を含 むＤＮＡに関する。

ある種のミコバクテリアは人間および動物の主要な病原体を代表する。例えば、 結核症は一般に結核菌により人体に生じ、またミコバクテリア・ボーヴイス（ウ シ型結核菌）により畜生に生じ、後者は人間および他の動物にも伝達される。病 菌はパンセン病の作因である。結核菌およびアヴイウム細胞内腺病グループ（Ｍ Ａ　Ｉ　Ｓグループ）のミコバクテリアは、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ） の患者の主要な日和見病原体を代表する。偽結核病菌は畜生の主要な病原体であ る。

一方、バチルス、カルメットーゲランワクチン、つまりＢＣＧは生型ミコバクテ リアの弱毒性菌株でヒト用ワクチンとして広く利用され、また特に生ワクチンと して使用され、結核の予防に用いられる。ＢＣＧは唯一の小児用ワクチンで、生 誕時に与えられ、悪影響を与える発生率が極めて低く、個人に対しく例久ば多様 な形態で）繰返して使用することができる。加久てＢ　ＣＧおよびその他のミコ バクテリア（例えば恥垢菌）がワクチンにｆｌｌ用される際には、それは現在知 られている最良のものの中でアジュバント（免疫助成剤）性能を有し、従って受 容体の免疫システムを刺戟して、抗原に対し非常に有効に反応させるものとなる 。

ＢＣＧが組換え体ワクチンの構築のために宿主として使用できることが、ジエイ コブ他によりネイチャー誌Ｖｏ１．３２７．Ｎｏ、６１２２、ＰＰ５３２−５３ ５　（１９８７年６月１１日号）で提案されている。

換言すれば、現存するワクチン（この場合は結核に対するワクチン）を取り、他 の病原体からの一つもしくはそれ以上の遺伝子導入によりその予防的レパートリ −を拡大することが提案された。ＢＣＧワクチンが生バクテリアとして投与され るため、バクテリアで発現される外部抗原、ポリペプチドあるいは蛋白質は、予 防接種に引き続くバクテリアから失われないことが基本となる。

形質変換、すなわち裸のＤＮＡが細菌細胞に導入されるプロセスは、ミコバクテ リア内で成功裡に実施された。前記引用の通りジエイコブ他は、化学的方法によ りミコバクテリアの形質転換について述べており、またスナツパ−他は、ＰＮＡ Ｓ。

Ｖｏｌ、８５．ＰＰ６９８７−６９９１　（１９８８年９月）において、電気穿 孔法によるミコバクテリアの形質転換を記述している。電気穿孔法はプラスミド ＤＮＡのｕｇ当り１０’〜１０８個の形質転換細胞を生じることができ、この種 のプラスミドＤＮＡはカナマイシンなどの抗生物質マーカーへの耐性のために遺 伝子を保持し、非形質転換細胞から形質転換細胞を選別することが可能となる。

ジエイコブ他（１９８７）およびスナツパ−他（１９８８）は対象となる遺伝子 をミコバクテリアに運び込むプラスミドやバクテリオファージなどのクローニン グビークルの使用についても述べている。

分子クローニング（例λば制限酵素等の利用ンの標準器具と共に、上記手法の組 み合せは、対象となる遺伝子のベクターへのクローニングおよびその遺伝子のミ コバクテリアへの導入を可能にする。これらの遺伝子を発現するために、遺伝子 発現のためのシグナル、とりわけ転写プロモーターエレメントを利用できること が重要となる。この種のプロモーターエレメントは、ミコバクテリアの熱シヨツ ク遺伝子から分離され、ミコバクテリアにある外部抗原を発現するために利用さ れている。

しかしながら、現在ミコバクテリアで使用できるプラスミドは、安定して維持さ れることはなく、非選択的成長の間に容易に失われる。対象となる遺伝子を発現 する組換え体ミコバクテリアが、特定の抗原に対するワクチンとして、あるいは ミコバクテリアで発現される宿主に対して治療薬を提供する手段として使用され る場合には、その遺伝子が投与に従って組換え体ミコバクテリアから失われない でいることがきわめて重要である。

ミコバクテリアに導入し、最終的に多種多様の異型遺伝子を発現することがこの 発明の目的であり、遺伝子は、必ずしも以下のものに限定されないが、多種多様 の病原体に対する予防抗原のための遺伝子およびもしくはその他治療薬のための 遺伝子などを含み、それによってそういう病原体に対する有効なワクチンを作り 出しあるいは有効な治療薬を提供する遺伝子であり、そこでこれらの遺伝子は、 予防接種あるいは治療薬の投与に続いて失われることはない。

この発明の一局面に従って、バクテリオファージのミコバクテリア染色体への組 込みをコード化するファージＤＮＡ部分である第１次ＤＮＡ配列、およびＤＮＡ が組込まれるミコバクテリアに対し異型である少くとも一つの蛋白質あるいはポ リペプチドをコード化する第２次ＤＮＡ配列よりなるＤＮＡが提供される。

ここで使用される「ファージＤＮＡ部分」という用語は、ＤＮＡ配列がファージ から誘導され、ファージ複製に必要なりＮＡを欠いていることを意味する。

ファージＤＮＡ部分が誘導されるバクテリオファージは、必ずしもそれに限定さ れないが、ミコバクテリオファージ、つまり必ずしも限定されないが、Ｌ５．Ｌ ｌ、ＢｘｂｌおよびＴＭ４ミコバクテリオファージ、大腸菌のラムダファージ、 コリネバクテリアの毒素ファージ、放線菌およびノルカシアのファージ、ストレ プトミセスのファイＣ３１フアージ、およびサルモネラのＰ２２ファージである 。望ましくは、ファージＤＮＡ部分はミコバクテリオファージのミコバクテリア 染色体への組込みをコード化する。

好ましい実施例において、第１次ＤＮＡ配列は、ＤＮＡコード化インテグラーゼ を含み、これはＤＮＡのミコバクテリア染色体への組込みを提供する蛋白質であ る。より好ましくは、第１次ＤＮＡ配列はさらにＡｔｔＰ部位をコード化するＤ ＮＡを含んでいる。

ＡｔｔＰ部位およびインテグラーゼをコード化するＤＮＡ配列は、部位特異的組 込みとして参照される組込み事象を提供する。ＡｔｔＰ部位およびインテグラー ゼ遺伝子を含むＤＮＡは対応するミコバクテリア染色体のＡｔｔＰ部位への組込 みを可能にする。

ａｔｔＰ部位をコード化する的確なりＮＡ配列が、異ったファージの間で変化で きるし、ａｔｔＢ部位をコード化する的確なりＮＡ配列が異ったミコバクテリア の間で変化できることも理解されることである。

組込み事象はＡ　ｔ　ｔ　ＬおよびＡｔｔＲと呼ばれる２個の新しい接合部位の 形成に帰着し、その夫々がＡｔｔＰおよびＡｔｔＢのそれぞれの部分を含んでい る。第１次および第２次ＤＮＡ配列を含む挿入され組込まれた非ファージＤＮＡ は、ＡｔｔＬおよびＡｔｔＲ部位と側面を隣接している。ファージＤＮＡ部分の 挿入および組込みは、形質転換ミコバクテリアの形成に帰着する。

出願人が発見したのは、この発明のファージＤＮＡ部分がミコバクテリア染色体 への組込みに使用される場合に、ミコバクテリア染色体に組み込まれる対象とな る遺伝子は、ミコバクテリアの非選択的成長に続いて失われることはない、とい うことであった。かくして、対象となる遺伝子は、非選択的成長に続いてミコバ クテリアにより発現され、また形質転換されたミコバクテリアの優れたビークル をワクチンや薬剤に利用し、それにより組換えミコバクテリアを宿主に投与する ことに続き、対象となる抗原およびもしくは治療薬を発現することとなる。

ファージＤＮＡ部分が組み込まれるミコバクテリアは、必ずしもそれに限定され ないが、ウシ型結核菌ＢＣＧ、恥垢菌、鳥型結核菌、チモテ菌、フォルチュイト ウム菌（Ｍ、　ｆｏｒｔｕｉｔｕｍｌ　＋ルフ菌（Ｍ、　１ｕｆｕｌ　、パラ結 核性腸炎菌、ハバナ菌（Ｍ、　ｈａｂａｎａｌ、スクロファロセウム菌（Ｍ、Ｓ ｃｒｏｆａｌａｃｅｕｍｌ　、　＠菌、およびイントラセルラーり菌（トリ菌群 Ｍ、　１ｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｅｌである。好ましい実施例において、ＤＮ Ａはウシ型結核菌ＢＣＧに組み込まれる。

ミコバクテリアに異型蛋白質をコード化する第２次ＤＮＡ配列は対象となる蛋白 質あるいはポリペプチドをコード化する遺伝子のすべてもしくは一部であるＤＮ Ａである。ここでＤＮＡは１個もしくは２個以上の選択的マーカーをコード化し 、あるいはＤＮＡは１個もしくは２個以上の選択的マーカーおよび対象となる少 くとも１個の蛋白質もしくはポリペプチドの両方をコード化する。

第２次ＤＮＡ配列でコード化される対象となる蛋白質あるいはポリペプチドは、 必ずしも以下のものに限定されないが、抗原、抗腫瘍剤、酵素、リンホカイン、 薬理剤、免疫相乗剤および診断の情況下において対象となるリポータ−分子であ る。

第２次ＤＮＡ配列がコード化できる抗原は必ずしも以下のものに限定されないが 、癩薗抗原、結核菌抗原、リケッチア抗原、マラリア分裂体および分裂小体、ジ フテリア・トキソイド、破傷風トキソイド、クロストリジウム属抗原、レーシュ マニア抗原、サルモネラ抗原、ボレリア属抗原、アフリカ結核菌抗原、イントラ セルラーレ・トリ菌群抗原、鳥型結核菌抗原、トレポネーマ抗原、百日咳抗原、 住血吸虫属抗原、フィラリア糸状虫属抗原、ヘルペス・ウィルス抗原、インフル エンザおよびバラインフルエンザ・ウィルス抗原、麻疹ウィルス抗原、おたふく かぜウィルス抗原、肝炎ウィルス抗原、シゲラ抗原、淋菌抗原、狂犬病抗原、ポ リオウィルス抗原、リフトバレー熱つィルス抗原、デング熱ウィルス抗原、麻疹 ウィルス抗原、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）抗原、呼吸シンシチアルウイル ス（ＲＳＶ）抗原、蛇毒抗原、およびビブリオ・コレラ抗原である。コード化さ れる酵素は、必ずしもそれに限定されないが、ステロイド酵素を含む。

第２次ＤＮＡ配列でコード化される抗腫瘍剤は必ずしもそれに限定されないが、 インターフェロン−α、インターフェロンーβ、あるいはインターフェロン−γ 、および腫瘍壊死因子つまりＴＮＦである。コード化されるリンホカインは必ず しもそれに限定されないが、インターロイキン１からインターロイキン８までで ある。

コード化されるリポータ−分子は必ずしもそれに限定されないが、ルシフェラー ゼ、β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、およびカテコール脱水素酵 素である。

第２次ＤＮＡ配列でコード化される他のペプチドあるいは蛋白質は、必ずしもそ れに限定されないが、ストレス蛋白質のためにコード化するものであり、自己免 疫疾患（例えば慢性関節リウマチ）において免疫反応を呼び出し、あるいは耐性 を誘発するために投与することができる。

コード化される選択的マーカーは、必ずしもそれに限定されないが、カナマイシ ン耐性マーカー、ネオマイシン耐性マーカー、クロラムフェニコール耐性マーカ ー、およびハイグロマイシン耐性マーカーである。

ミコバクテリア染色体へのミコバクテリアファージの組込みをコード化する第１ 次ＤＮＡ配列、およびミコバクテリアに異型の少くとも１個の蛋白質あるいはポ リペプチドをコード化する第２次ＤＮＡ配列を含むこの発明のファージＤＮＡ部 分は、当業者に知られた遺伝子工学技術を通じて構築される。望ましい実施例に おいて、組込みをコード化するＤＮＡおよび異型の蛋白質をコード化するＤＮＡ に加えて、ファージＤＮＡ部分は、多種多様の生体のいずれかを複製する原点を 含むプラスミドであり、これは必ずしもそれに限定されないが、大腸菌、ストレ プトミセス種、桿菌種、ブドウ球菌種、シゲラ種、サルモネラ種および肺炎双球 菌の各種である。もっとも好適なものとしては、プラスミドは大腸菌のための複 製の原点を含んでいる。

ファージＤＮＡ部分は、更に適切なプロモーターを含んでいる。適切なプロモー ターは必ずしもそれに限定されないが、ＢＣＧ　Ｈ３Ｐ６０およびＨ３Ｐ７０プ ロモーターなどのミコバクテリア・プロモーター、スーパーオキサイドジスムタ ーゼ・プロモーター、結核菌およびＢＣＧのα抗原プロモーター。

ＭＢＰ−７０プロモーター、結核菌およびＢＣＧの４５Ｋｄａ（キロダルトン） 抗原プロモーター、およびミコバクテリアａｓｄプロモーター、ミコバクテリア １４Ｋｄａおよび１２Ｋｄａプロモーター、Ｂｘｂｌプロモーターなどのミコバ クテリアファージ・プロモーター、ＬｌおよびＬ５プロモーター、およびＴＭ４ プロモーター、あるいはその他適切なプロモーターである。適切なプロモーター の選択はここに含まれる教訓から通常の当業者の範囲内にあるものと見做される 。

一つの実施例において、プロモーター配列は、通常プロモーターの支配下にある 遺伝子の一部をも含む発現カセットを構成することができる。例えば、ミコバク テリアＨＳＰ６０もしくはＨＳ　Ｐ　７０プロモーターが採用された場合、発現 カセットはプロモーターに加えてＨ３Ｐ６０あるいはＨ３Ｐ７０蛋白質の遺伝子 の一部を含むことができる。発現カセットおよび異型の蛋白質もしくはポリペプ チドをコード化するＤＮＡが発現される場合、カセットおよび異型の蛋白質もし くはポリペプチドをコード化するＤＮＡにより発現された蛋白質は、ミコバクテ リアの断片の融合蛋白質（例えばＨ３Ｐ６０あるいはＨ３Ｐ７０蛋白ｆｆ）およ び異型蛋白質である。

好ましい実施例において、ｍＲＮＡの翻訳の開始を提供する転写開始部位、リボ ゾーム結合部位および出発コドンは、それぞれミコバクテリア原点であるｏ　ｍ 　ＲＮ　Ａの翻訳を停止し、従って異型蛋白質の合成を終結させる停止コドン、 および転写終結部位は、ミコバクテリア原点、あるいはその他バクテリア原点で あり、もしくはその種の停止コドンおよび転写終結部位は異型蛋白質あるいはポ リペプチドをコード化するＤＮＡのそれである。

ここで指摘されているように、ファージＤＮＡ部分はミコバクテリア染色体への 組込みに使用することができ、それによってミコバクテリアを形質転換し、そこ でミコバクテリアはミコバクテリアに異型の蛋白質あるいはポリペプチドを発現 することができる。このようなミコバクテリアは形質転換されるミコバクテリア で発現される蛋白質あるいはポリペプチドに依存して、ワクチンあるいは治療薬 の生産に利用することができる。

そのようなワクチンあるいは治療薬を形成するために、形質転換ミコバクテリア は適切な薬品キャリアを併用して投与される。適切なキャリアの代表例として言 及されるものは、鉱油。

アラム９合成ポリマーなどがある。ワクチンおよび治療薬用のビークルは、普通 の技術として周知であり、適切なビークルの選択はここに含まれる教訓から当業 者の範囲内にあるものと見做される。適切なビークルの選択は、更にワクチンあ るいは治療薬が投与されるべき方法にも依存する。ワクチンあるいは治療薬は注 射処方の形であり得るし、また筋肉内に、静脈内に、口腔に、皮膚内に、あるい は皮下投与によって投与される。

ワクチンあるいは治療薬を投与するその他の手段は、当然のことながらここに提 示される教訓から当業者にとっては明白なことである。従って、この発明の範囲 は特定の受渡し形態に限定されるものではない。

形質変換ミコバクテリアがワクチンとして利用される場合には、そのようなワク チンは現在利用可能なその他のワクチンに勝る重要な利点を有する。ここで指摘 されたミコバクテリアは、現在知られている最良のものの中でもアジュバント性 能を有し、従って有効性の大きい対応ができるように受容体の免疫システムを刺 戟する。ワクチンのこの局面は細胞仲介免疫を誘導し、かくして細胞仲介免疫が 耐性に対し重要であると見られる場合に病原体に対する免疫を提供するのに特に 有用である。

更にミコバクテリアは長期の免疫記憶あるいは免疫を刺戟する。かくして感染剤 あるいは毒素を不活性化する二次抗体反応を刺戟する長期継続Ｔ細胞記憶を準備 することが可能となる。

このようなＴ細胞記憶の準備は以下のものにとって有効である。例えば破傷風お よびジフテリア毒素、百日咳、マラリア。

インフルエンザウィルス、ヘルペスウィルス、狂犬病、リフトバレー熱ウィルス 。デング熱ウィルス、麻疹ウィルス、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶＩ、呼吸シ ンシチアルウイルス、ヒト臘瘍、および蛇毒に対して有効である。ワクチンある いは治療薬としてこの発明によるファージＤＮＡ部分で形質転換されたミコバク テリアを利用するも一つの利点は、一般にミコバクテリアが巨大ゲノム（すなわ ち長さで約３Ｘ１０’塩基対）を持つことである。ゲノムが大きいため、他の発 生源から大量のＤＮＡを供給することが可能となり、また一つ以上の抗原および もしくは治療薬をコード化するＤＮＡ配列を含むワクチンおよびもしくは治療薬 を作るのに利用できる。

更に対象となる組込み遺伝子力（Ｆｆ９質転換ミコバクテリアの非選択的成長に 続いて失われないために、対象となる遺伝子はミコバクテリアの宿主への投与に 引き続き形質転換ミコバクテリアにより発現され続けることになる。従ってその ようなミコバクテリアは、免疫反応を刺戟する抗原を発現するのに有効なビーク ルであり、あるいは抗腫瘍剤およびもしくは抗癌剤などのような治療薬の発現の ために有効なビークルとなる。

この発明は、これから下記の実施例に関連して記述される。

しかしこの発明の範囲はそれだけに限定されることはない。

実施例　Ｉ Ａ、恥垢菌のａｔｔＢ、ａｔｔＬおよびａｔｔＲ付着部位のＤＮＡ配列の同定 通常の技術を利用して、ラムダＥＭＢＬ３ライブラリーがＢａｍＨＩ消化ｍｃ” ６１染色体ＤＮＡ　（ｍｃ”　６１は恥垢菌の菌株であり、その中にミコバクテ リオファージＬ５のゲノムが組込まれた恥垢菌染色体を含んでいる）から準備さ れ、Ｂａｍ　ＨＩで消化された。ファージＬ５が４２℃で複製でき、ファージＬ Ｌがそのような成長が不可能であることを除き、ファージＬ５はファージＬ１の それと同定できる制限部位を有するＤＮＡを含んでいる（スナツパ−他、１９８ ８）。このライブラリーはその後、ａｔｔＰ配列を保持するものとして以前に同 定されていたし５ゲノムから分離される６、７Ｋｂ　（キロベース）ＤＮＡ断片 でプローブされた。（スナツパ−他、１９８８）。正のクローンの一つがプラー ク精製され、ＤＮＡが用意され（Ａ　ｔ　ｔ　Ｌ配列を含む）、ｔ、ＩＫｂ　５ ａｌＩ断片が配列ベクターｐＵｃ１１９内にサブクローンされた。この断片のＤ ＮＡ配列はサンガー配列決定で共役されたショットガンアプローチを用いて決定 された。ａｔｔＬ結合部位を分離。

配列決定し、これと利用できるＬ５のＤＮＡ配列を比較し、二つの配列が整列す るが特異的な不連続性が存在する領域が決定された。不連続性はａｔｔＰ、ａｔ ｔＢおよびａｔｔＬに共通するコア配列の一側面を表す。組換え交差点を含む領 域は、ＦＩＧ、１で示される。

ａｔｔＬ　ＤＮＡ　（１，ＩＫｂ　ＳａＬ　ｆ断片）は、ＢａｍＨＩ消化ｍｃ” 　６ＤＮＡのサザンブロツティングにハイブリッド形成させるプローブとして使 用された。Ｂａｍ　ＨＩ消化ｍｃ”　６ＤＮＡは恥垢菌の菌株であり、ファージ 組込みのない恥垢菌染色体を含んでいる（ジェイコブ他、１９８７．前記引用） 。約６４Ｋｂの単−帯が、恥垢菌のａｔｔＢ配列に対応して検出された。これと 同じａｔｔＬプローブが（イエシーバ大字アルバート・アインシュタイン・カレ ッジのピル　ジェイコブ博士により提供された）ｍｃ”　６のコスミドライブラ リーをスクリーニングするために使用され、数多くの正のコスミドクローンが同 定された。ＤＮＡはこれらのクローンから用意され、ａｔｔＬプローブをハイブ リッド形成する（ａｔｔＢ部位を包含する）１．９Ｋｂ　５ａｌｌ断片が配列決 定および詳細分析のために、ｐＵｃ１１９へサブクローンされた。コア配列を包 含するＤＮＡ配列が決定され、Ｆ４Ｇ、１で示されるａｔｔＰ、ａｔｔＢおよび ａｔｔＬに共通するコア配列は４３塩基対の長さを有する。

ｍｃ”６１ラムダＥＭＢＬ３　ライブラリーは、その後ａｔｔＢ部位を含む１． ９Ｋｂ　５ａｌＩ断片でプローブされた。

正のプラークが同定され、ＤＮＡが用意され、制限分析およびサザンブロツティ ングで分析された。ラムダクローンは、推定上のａｔｔＲ部位を含む３．２Ｋｂ 　Ｂａｍ　Ｈｌ断片を含むことが同定された。３．２Ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ１断片は 精製され、配列決定および詳細分析のためにｐＵｃ１１９にクローンされた。

Ｂ、Ｌ５ゲノムのａｔｔＰインテグラーゼ領域の決定上記手順と同時にＬ５ＤＮ Ａ配列の有意部分が決定され、い（つかの「コンティーグＪ　（ｃｏｎｔｉｇｓ ｌっまりＤＮＡ配列のアイランドで表わされた。前記記載の６．７Ｋｂ　Ｂａｍ 　ＨＩ断片の配列は（ａ）Ｌ５　ＤＮＡのコンティーグにあるＢａｍＨＩの位置 分析、および（ｂ）プラスミドｐＪＲ−１のＢａｍＨＩ部位周辺からのＤＮＡ配 列の短い伸張を決めることで決定された（ＦＩＧ、６）、後者はＬ５の６．７Ｋ ｂ　ＢａｍＨＩを保持する。

ＤＮＡ配列の環部は、ファージＬ５の６．７Ｋｂ　ＢａｍＨＩ断片を表わして位 置付けられた。他のファージについての研究では、インテグラーゼ遺伝子はしば しばａｔｔＰ部位の近（に位置していることが示された。かくしてＬ５インテグ ラーゼ（１ｎｔｌ遺伝子は、６．７Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片内か、もしくはその どちらかの側面にあるＤＮＡ配列内のいずれかにあるべきことが決定された。こ の領域にあるＤＮＡ配列は、全部で６種の可能な読み枠に翻訳され、これらアミ ノ酸配列を蛋白質と関連するインテグラーゼの系統群に対する類似性で資料調査 し、ＤＮＡ配列のコンピューター支援解析を通じて分析された。ＦＩＧ、２で示 されているようにＬ５インテグラーゼと他のインテグラーゼの間で適度に良い保 存の２個のドメイン、およびドメイン２で完全に保存される３個のアミノ酸残基 のあることが示されている（ヤギール他、　Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、、Ｖｏｌ、 ２Ｄ７゜ｐｐ、６９５−７１７．１９８９　、およびボヤートサルメロン他、Ｊ 、ＥＭＢＯ，Ｖｏｌ、８．ｐｐ、２４２５−２４３３．１９８９１゜領域は同定 され、対応するＤＮＡ配列の分析は、約３３３アミノ酸の蛋白質をコード化する ことのできる読み枠を示した。これらの観察は推定上のｊｎｔ遺伝子を同定した 。

ｉｎｔ遺伝子の位置は６．７Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片内には存在しなかった。し かしそれは、遺伝子の出発の１００塩基対上流以下の（６，７Ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ ｒ断片を規定する）Ｂａｍ　Ｈ１部位の一つに極めて近接していた。Ｂａｍ　Ｈ Ｉ部位の分析は、６．７Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片に隣接して位置を占める１、９ Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片内にｉｎｔ遺伝子が位置していることを示した。この１ ．９Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片は、Ｌ５　ＤＮＡのＢａｍ　ＨＩ消化からの断片の 精製によってクローンされ、ｐＵＣ１１９にクローンされｐＭＨ１を発生した（ ＦＩＧ、７）。

前記のアプローチの組み合せから、Ｌ５のａｔｔＰ−ｉｎｔ領域の体制の構成図 が構築され（ＦＩＧ、３）、ａｔｔＰ−ｉｎｔ領域の遺伝子配列がＦＩＧ、４で 与えられる。

Ｃ，ｐＭＨ５の構築 ミコバクテリオファージＬ５の６．７Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片は前記記載の通り ａｔｔＰ部位を含んでいるが、ｐＵｃ１１９のＢａｍ　Ｈ１部位にクローンされ た（ＦＩＧ、５）、これはアガロースゲル電気泳動により分離されたＬ５ＤＮＡ のＢａｍ　ＨＩ消化から、６．７Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片を精製し、Ｂａｍ　Ｈ ｉ　ｃｕｔ　ｐＵｃ１１９と連結することで達成された。ＤＮＡは候補的組換え 体から用意され、制限酵素分析およびゲル電気泳動によって特徴付けられた。組 換え体は、ｐＵｃ１１９にクローンされたＬ５　６．７Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片 を含むことで同定された。このプラスミドはＦＩＧ、６で示されるようにｐＪＲ −１と名付けられた。

Ｌ５を配列決定するためのプロジェクトから得られたＤＮＡ配列データの分析は 、前記記載の６．７Ｋｂ　Ｂａｎ　ＨＩ断片に隣接する１、９Ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ Ｉ断片がインテグラーゼ遺伝子を含むことを示した。

ｐＵｃ１１９のＢａｍ　ＨＩ部位にクローンされるインテグラーゼをコード化す るＤＮＡを含む１．９Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片を含むプラスミドが構築された。

１．９Ｋｂ断片はＬ５ＤＮＡのＢａｍ　ＨＩ消化から精製され、ｐＵｃ１１９の ＢａｍＨＩ部位にクローンされた０組換え体の構築は、制限分析およびゲル電気 泳動により決定された。このプラスミドはｐＭＨｌと呼ばれ、その構築はＦＩＧ 、７で図式的に示される。

ｐＪＲｌはその後、その間がＢａｍＨＩ部位であるＥｃ。

ＲＩおよび５ｎａＢＩ　（いずれもユニーク・クローニング部位）で消化により 変更された。ＢａｍＨＩ部位を含むＥｃ。

ＲＩ−ＳｎａＢＩ断片が除去され、ｐＪＲ−１に含まれる２個のＢａｍ　Ｈ１部 位に対比される１＠のＢａｍＨＩ部位を含むｐＭＨ２のプラスミドを形成するた めこのプラスミドが再連結された。ｐＭＨ２構築のための構成図がＦＩＧ、８に て示される。

インテグラーゼ遺伝子を含む１．９Ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＥ断片は、ｐＭＨｌのＢａ ｍＨＩ消化から精製され、Ｂａｍ　ＨＩ消化のｐＭＨ２に連結された０組換え体 は上記のとおり同定され、１．９Ｋｂ断片の配向が決定された。ｐＭＨ４と呼ば れるプラスミドがかくして構築され（ＦＩＧ、９）、ここではＳｎａ　ＢＩ部位 （ａｔｔＰの上流）からＢａｍ　ＨＩ部位（インテグラーゼ遺伝子の下流）に到 るまでの領域がＬ　５のそれと同定であった。

ｐＭＨ４はＨｉｎｄＩＩＩ（ユニーク部位）で消化され、カナマイシン耐性を決 定する遺伝子を含む（ナイジエル・ギントレー・ラボラトリ−のキース・ダービ ーシャーより提供された）ｐＫＤ４３から精製されたＩＫｂ　ＨｉｎｄＴＩＩに 連結された６組換え体が同定され、上記の通り特徴付けられた。このプラスミド はｐＭＨ５と呼ばれる。ｐＭＨ５の構築の構成図はＦＩＧ、１０で示される。

Ｄ、ｐＭＨ５の恥垢菌ａｔｔＢへの組込みプラスミドｐＹＵＢ１２（ビル・ジエ イコブ博士よりの贈与されたもので、その構成図はＦＩＧ、２０で示される）、 ｐＭＤｏｔ　（ＦＩＧ、１１）およびｐＭＨ５が１０００倍レンジ以上のプラス ミドＤＮＡの４種の異った濃度で、プラスミド複製を支援できる菌株である恥垢 菌菌株ｍｃ”１５５に電気穿孔された。実施例１および２で、恥垢菌あるいはＢ ＣＧのすべての電気穿孔手順が下記の通り実施された。：生体の培養はスナツパ −他（１９８８）により記述されているようにミドルプルツク７Ｈ９培地で成長 し、遠心分離で収穫され、冷却１０％のグリセロールで３回洗浄され、細胞の約 １００Ｘ濃度で再懸濁された。

１μ２のＤＮＡが氷で冷却されたクヴエット内の１ｏｏＬＬＲの細胞に加えられ 、パイオーラッド遺伝子露出器で露出され、２５μＦ、１．２５Ｋｖで単一露出 が与えられた。抗生物質耐性マーカーの発現のために３７℃で１時間定温保持さ れた細胞に１ｍＪ２の肉汁が加えられた。細胞はその後濃縮されカナマイシン１ ５μｇ　／　ｍ　ｔ２を含むミドルプルツクあるいはトリプシン大豆培地でプレ ート培養された。３７℃で３−５日定温保温の後に集落が観察された。

ｐＹＵＢ１２．ｐＭＤＯｌ、およびｐＭＨ５のそれぞれがカナマイシン耐性を保 持している。プラスミドｐＹＵＢ　ｌ　２はＤＮＡ複製の原点を保持し、一方ｐ ＭＤＯ１は複製のミコバクテリア原点を欠いている。プラスミドｐＭＨ５は複製 のミコバクテリア原点を保持しないが、ａｔｔＰ部位とインテグラーゼ遺伝子を 含むファージＬ５の２ｋｂ領域を保持している。数多くの形質転換細胞がＤＮＡ 濃度に従って線型であった。プラスミドｐＹＵＢ　１２はｍｃ”　１５５内で巨 大な数の形質転換細胞（ＤＮＡ　ｕｇ当り２Ｘ１０’）を生じ、一方ｐＭＨ５は ＤＮＡμｇ当り６ＸＩＯ’の形質転換細胞を生じるが、ｐＭＤｏ　１には形質転 換細胞を生まない。

前記の実験はプラスミドｐＹＵＢ　１２．ｐＭＤｏ　ｌおよびｐＭＨ５を、プラ スミド複製を支援しない恥垢菌菌株ｍｃ”　６に電気穿孔させ、繰返して行われ た。ｐＹＵＢ１２に、あるいはｐＭＤｏ　ｌからはｍｃ”　６内の形質転換細胞 は得られなかったが、一方ｐＭＨ５はＤＮＡのｕｇ当りｍｃ”　６に約１０４カ ナマイシン耐性形質転換細胞を生じ、か（してｐＭＨ５がｍｃ”６染色体へ組込 まれたことが示された。

６個の独′ｒＬｐＭＨ５形質転換細胞（ｍｃ”１５５に４個、ｍｃ”６に２個） からのＤＮＡが用意されたｍ　（ｍｃ”　１５５自身およびプラスミドｐＹＵＢ 　ｌ　２を保持するｍｃ”１５５の双方からのＤＮＡと一緒に）これらＤＮＡは 制限酵素で消化され、前記記数の恥垢菌１．９Ｋｂ　ａｔｔＢプローブでサザン ブロツティングおよびハイブリッド形成で分析された。

ＦＩＧ、１２で示されるように、６個の形質転換細胞すべてがａｔｔＢ部位に組 込まれ、異った電気泳動移動度を有する２個の新しいＤＮＡ断片を生産すること となった。もしｐＭＨ５がａｔｔＢ部位に組込まれなかったなら、ｍｃ”１５５ 対照内にあるａｔｔＢ部位に対応して単−帯が得られることが期待されたであろ う。

Ｅ、ｐＭＨ９，２およびｐＭＨ９，４の構築ｐｕｃ　１１９はＨｉｎｄＩＩＩで 消化され、またカナマイシン耐性遺伝子を含みｐＫＤ４３で精製されたｌｋｂ　 Ｈｉｎｄ　ｆＩＩは２ＭＨ８を形成するためにＨｉｎｄＩＩＩ消化ｐＵｃ１１９ に連結された（ＦＩＧ、１３）、Ｓａｌ　Ｉ消化ｐＭＨ５からのａｔｔＰおよび インテグラーゼ遺伝子を保持するｐＭＨ５の２ｋｂ　５ａＩＩ断片（塩基対３２ ２６−５３１０）はプラスミドｐＭＨ９，２およびｐＭＨ９，４を形成するため に精製され５ａｌＩ消化ｐＭＨ８のベクトル・バックボーンに比例して双配向に 挿入された（ＦＩＧ、１４およびＦＩＧ、１５）。

Ｆ、恥垢菌内のプラスミドの安定性 電気穿孔法の結果としてプラスミドｐＹＵＢ１２．ｐＭＨ９，２あるいはｐＭＨ ９，４を保持する恥垢菌菌株ｍｃ”１５５細胞、あるいは前記記載の電気穿孔法 の結果としてプラスミドｐＭＨ５を保持する菌株ｍｃ”　６は、カナマイシン入 り肉汁内で成長し飽和した。培養はその後カナマイシンのない肉汁で１：１００ で希釈され成長し飽和した。細菌成長の約２０世代の対応する更に２回のサイク ルの希釈と成長が行われた。培養は非選択平板上で単一集落に向けて平板化され 、約１００個のこれら集落が非選択平板および選択平板上にパッチ平板化された 。カナマイシンに感受性があり従ってプラスミドを失った細胞の割合に対応する 集落の％が以下の表Ｉに示される。

表　Ｉ 損耗％ ｐＹＵＢ１２　（ｍｃ”　１５５）　３５ｐＭＨ５（ｍｃ”　６）１７ ｐＭＨ９，２（ｍｃ”　１５５）　３ ｐＭＨ９，４（ｍｃ”　１５５）　０ 実施例　２ 前記記載の恥垢菌ａｔｔＢ部位を含む１．９Ｋｂ　５ａｌＩ断片はｐＵｃ１１９ にクローンされ、生じたプラスミドはｐＭＨ−１２と名付けられた（ＦＩＧ、１ ６）。

（ｐＭＨ−１２から分離された）ａｔｔＢを含む５ａ１１１．９Ｋｂ恥垢菌断片 を精製したゲルが、ＢＣＧサブ菌株パスツールを含むＢａｍ　Ｈ１消化ミコバク テリアＤＮＡのサザン転移をプローブするために使用されたが、これはＦＩＧ、 １７で示される。これは、恥垢菌ａｔｔＢプローブに対し強力にハイブリッド形 成するＢＣＧのＢａｍ　Ｈ１断片１個と微弱にハイブリッド形成する３個がある ことを示していた。最強のハイブリッド形成帯は最速移動帯（約１．９Ｋｂ３で ある。

前記の同一クローンがＢ　ＣＧコスミド・ライブラリー（ビル・ジェイコブ博士 の提供による）をプローブするために使用され、正のクローンが同定された。Ｄ ＮＡはい（つかの正のクローンから用意され、制限分析およびサザンブロツテイ ングで分析された。（サザンプロットにおける最強のハイブリット形成帯に対応 する）１．９ｋｂ　Ｂａｍ　Ｈ１断片が同定され、ゲルがコスミドＤＮＡから精 製されｐＵｃ１１９にクローンされた。生じたプラスミドはｐＭＨ−１５と名付 けられた（ＦＩＧ、１８）。

プラスミドｐＭＨ−５およびｐＭＨ９，４はＢＣＧパスツールに電気穿孔された 。ｐＭＨ９，４は高収率（ＤＮＡ、μｇ当り約１０’個の形質転換細胞）でＢＣ Ｇを形質転換し、一方ｐＭＨ−５は低収率（ＤＮＡ、μｇ当り１〜１０個の形質 転換細胞）でＢＣＧを形質転換することが観察された。ＤＮＡはＢＣＧ形質転換 細胞から用意され、Ｂａｍ　ＨＩ制限分析およびサザン・プロット分析で分析さ れ、ｐＭＨ−１５からの１．９ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ　ＢＣＧ　ａｔｔＢを精製し たゲルでプローブされた。これらのデータはＦＩＧ、１９に示されており、ｐＭ Ｈ５およびｐＭＨ９，４双方の組込みがＢＣＧ　ａｔｔＢ部位に特異的（すなわ ちＢＣＧ内での強力交差ハイブリッド形成断片）であることを示している。これ は形質転換細胞か６１．９ｋｂ　Ｂａｍ　ＨＩ断片の損耗およびａｔｔＬおよび ａｔｔＲ細胞間結合断片を表す２個の新しい帯の出現により説明される。ＦＩＧ 、１９はただ一つだけではあるが、ｐＭＨ５／ＢＣＧ形質転換細胞を示している 。もっとも分析された４個のすべては、帯の一つ（最大のもの）が期待されたよ りも小さく　（また形質転換細胞のそれぞれで異なっており）、ｐＭＨ５の形質 転換効率はＢＣＧでは低いものとなる。対照的に４個のｐＭＨ９，４形質転換細 胞は相互に同一であり（ＦＩＧ、１９）、また予想されたサイズのａｔｔＲおよ びａｔｔＬ細胞間結合断片を生じる。

実施例　３ Ａ、ミコバクテリア・プロモーター発現カセットを含むプラスミドの構築 １、ｐＹＬＩＢ１２５の構築 プラスミドｐＡＬ５０００はフォルチュイトウム菌の複製の原点を含むプラスミ ドであり、ラビディ他によりＦ　ＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｌｅｔｔ、、Ｖｏ ｌ　３０．ＰＰ　２２１−２２５（１９８５１で、またＧｅｎｅ、Ｖｏ１７１、 ＰＰ、　３１５−３２１　（１９８８１で記述されているが、このプラスミドは 部分Ｓａｕ　３Ａ消化を受け、また５ｋｂ断片はゲル精製される。５ｋｂ断片は 、その後プラスミドｐＹＵＢ　１２を形成するために、Ｂａｍ　ＨＩ消化ｐＩＪ ６６６　（キーザー他によりＧｅｎｅ、　Ｖｏｌ、　６５．　ＰＰ、　８３−９ １．１９８８．に記載されているように、複製の大腸菌原点を含み、ネオマイシ ン・カナマイシン耐性を保持する大腸菌ベクター）に連結される。プラスミドｐ ＹＵＢ　ｌ　２の構成図がＦＩＧ、２０で示される。ｐｙｔｒＢｌ　２ｉ５よび ｐｒＪ６６６はそれから恥垢菌およびＢＣＧ内に形質転換された。ｐＹＵＢ　Ｌ 　２形質転換により、ただ一つ得られたネオマイシン耐性形質転換細胞は、ｐＡ Ｌ５０００が恥垢菌およびＢＣＧ内に自律複製をｐｌＪ６６６に授けることを確 証した。

スナツパ−他（１９８８，前記引用）によるショットガン突然変異誘発は、ｐＡ Ｌ５０００プラスミドの半分だけがＢＣＧ内でのプラスミド複製を支援するのに 必要であることを示した。このセグメントは推定上読み取り枠０ＲＦＩおよび０ ＲＦ２を保持シタが、これはロージエ他によりＧｅｎｅ、Ｖｏｌ、７１．ＰＰ、 ３１５−３２１．１９８８で同定され、また更に推定上複製のミコバクテリア原 点を保持した。ｐＹＵＢ１２はそれからＨｐａＩおよびＥｃｏＲＶで消化され、 ｐＡＬ５０００のこの領域あるいはセグメントを保持する２５８６塩基対は除去 されまたＰｖｕＩＩ消化ｐＹ［ＪＢ８に連結される。プラスミドｐＹＵＢ８Ｂ　 （ｐＢＲ３２２誘導体）は大腸菌レプリコンおよびＫａｎ”　（ａｐｈ）遺伝子 を含む。２５８６塩基対ｐＹＵ１２断片をＰｖｕＩＩ消化ｐＹＵＢ８に連結させ ると、ＦＩＧ、２１に描かれているようにｐＹＵＢ５３が形成されることになる 。ｐＹＵＢ５３の形質転換は、ミコバクテリアｒｅｐ指定のＥｃｏＲＶ−Ｈｐａ Ｉ断片がＢＣＧで自律複製を支援できることを確証した。

プラスミドｐＹＵ８５３はそれから下記の制限部位を除去するためにＡａｔＩ、 ＥｃｏＲＶ、およびＰｓｔＩで消化された。

Ａａｔｌ　５７０７ ＥｃｏＲＩ　５７８３ Ｂａｍ　ＨＩ　５７９１ Ｓａｌ　Ｉ　５７９７ ＰｓｔＩ　５８０３ ＰｓｔＩ　７２５２ Ｓａｌ　Ｉ　７２５８ Ｂａｍ　ＨＩ　７２６４ ＥｃｏＲＩ　７２７３ Ｃ１ａＩ　７２９８ Ｈｉｎｄ　ＩＩＩ　７３０４、および ＥｃｏＲＶ　７４６０ 断片末端は、その後Ｔ４　ＤＮＡ重合酵素で平坦化され、プラスミドｐＹＵＢ１ ２５を形成するために再連結され、その構築はＦＩＧ、２２に示される。

２、　ｐＹＵＢ１２５から余分のベクターＤＮＡの除去前もって操作して不活性 化されたｔｅｔ遺伝子の７９２塩基が、完全なＮａｒ　Ｉ消化、６４０７塩基対 断片のゲル精製、および大腸菌菌株ＨＢ１０１の連結／再循環、形質転換、およ びＫａｎ”形質転換細胞の選択によって除去された。結果として生じるプラスミ ドｐＭＶ　１０１の構築は、ＦＩＧ、２３で図式的に示されており、この後記載 の除去される領域および突然変異のマーキングを含むｐＭＶ　１０１のＤＮＡ配 列はＦＩＧ、２４で示される。

３、ａｐｈ　（Ｋａｎ”　）遺伝子にある望ましくない制限部位の除去 将来の操作を容易にするために、ａｐｈ遺伝子にあるＨｉｎｄ　ＩＩＩおよびＣ １ａｌ制限部位は、Ｇｅｎｅ、　Ｖｏｌ、　７７、　ＰＰ、　５７−５９．１９ ８９に記述された手順に従って、重合酵素連鎖反応ＰＣＲ突然変異誘発により同 時に突然変異を誘発された。ａｐｈ遺伝子内で変化した塩基は、それぞれの制限 部位内部でコドンの第３番位置（ゆらぎ塩基）にあり、作られた塩基の置換は、 コード化された蛋白質のアミノ酸配列を変更しないように設計された。

ＣｌａＭｕｔ−Ｋａｎ＋ＨｉｎｄＲＭｕｔ−ＫａｎおよびＨｉｎｄＦＭｕｔ−Ｋ ａｎ＋Ｂａｍ−Ｋａｎのプライマーを用いたプラスミドｐＭＶ　１０１の別のＰ ＣＲ反応が２５サイクルで、９４℃（１分）、５０℃（１分）および７２℃（１ 分）で行われた。ＰＣＲプライマーは下記の塩基配列を有していた。

Ｃ１ａＭｕｔ−Ｋａｎ ＣＴＴ　ＧＴＡ　ＴＧＧ　ＧＡＡ　ＧＣＣＣＣＨｉ　ｎｄＲＭｕｔ−Ｋａｎ ＧＴＧ　ＡＧＡ　ＡＴＧ　ＧＣＡ　ＡＡＡ　ＧＡＴ　ＴＡＴ　ＧＣＡ　ＴＴＴ　 ＣＴＴ　ＴＣＣＡＧＨｉ　ｎｄＦＭａｔ−Ｋａｎ ＧＴＣＴＧＧ　ＡＡＡ　ＧＡＡ　ＡＴＧ　ＧＡＴ　ＡＡＴ　ＣＴＴ　ＴＴＧ　（ ：ＣＡ　ＴＴＣＴＣＡ　（：ＣＧ　ＧＢａｍ−Ｋａｎ ＣＧＴ　ＡＧＡ　ＧＧＡ　Ｔ（：（１：　ＡＣＡ　ＧＧＡ　ＣＧその結果生じる ＰＣＲ生成物はゲル精製され、また混合され、プライマー無しの単−ＰＣＲ反応 はｌＯサイクルで９４℃（１分）、７２℃Ｃ１分）で行われた。Ｃ１ａＭｕｔ− ＫａｎおよびＢａｍ−Ｋａｎプライマーが添加され、ＰＣＲは２０サイクルで９ ４℃（１分）、５０℃（１分）、および７２℃（２分）で回収された。生じたＰ ＣＲ生成物（）（ａｎ、ｍｕｔ）はＢａｍ　ＨＩで消化されゲル生成された。プ ラスミドｐＭ■１０１はＣ１ａＩで消化され、付着末端はフレノウ断片＋ｄＣＴ Ｐ＋ｄＧＴＰにより充填された。フレノウ断片は熱不活性化され、その消化は更 にＢａｍ　ＨＩで消化された。５２３２塩基対断片はゲル精製され、断片Ｋａｎ 、ｍｕｔと混合され、連結された。連結は大腸菌菌株ＨＢＩＯＩに形質転換され 、Ｋａｎ”集落はＣ１ａｌおよびＨｉｎｄＩＩＩ消化に耐性のあるプラスミドの ためスクリーニングされた。そのようなプラスミドはｐＭＶｌｌｏとして指定さ れ、ＦＩＧ、２３で描かれている。

４、ミコバクテリアのプラスミド複製に不必要な配列の除去 プラスミドｐＭＶ１１０はプラスミドｐＭＶ１１１およびｐＭＶ１１２を産出す るためプラスミドｐＭＶ１１０が異った構築で切除された。一つの構築において 、ｐＭＶｌｌｏはＮａｒＩおよびＢａ１Ｉで消化され、末端は満たされ、５２９ ６塩基対断片がｐＭＶｉｌｌを形成するために連結され再循環された。も一つの ｌｌＩ築において、ｐＭＶ　１１０はＮｄｅ　Ｉおよび５ｐｌＩで消化され、末 端は充填され、また５７６３塩基対断片はｐＭＶ　１１２を形成するため連結さ れ再循環された。

ｐＭＶｌｌｌおよびｐＭＶ１１２の構築の構成図はＦＩＧ。

２５で示される。これらの構築は、ミコバクテリア複製に不必要なｐＡＬ５００ ０から得られた余分の大腸菌ベクター配列を重に除去した。クローニングが大腸 菌で行われた。プラスミドｐＭＶ　ｌ　１１およびｐＭＶ　ｌ　ｌ　２は、恥垢 菌に複製できるための能力を検定された。双方のプラスミドが恥垢菌に複製した ため、プラスミドそれぞれの削除はｐＭＶ１１３を構築するために組合わされた 。

ｐＭＶＩ　１３　（ＦＩＧ、２５）を構築するために、ｐＭＶ　１１１はＢａｍ 　ＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化され、また１０７１塩基対断片が分離された。ｐ ＭＶ　１１２はＢａｍ　ＨＩおよびＥｃｏＲｒで消化され、また３５７０塩基対 断片は分離され、その後ｐＭＶ１１３を形成するためにｐＭＶ　１１１から得ら れた１０７１塩基対断片に連結された。これらの構築ばかくして１９１０塩基対 以上にはならないようにミコバクテリアの自律複製に必要なｐＡＬ５０００の領 域を定義した。

５６ミコバクテリア・レプリコンにおける制限部位の突然変異誘発 ミコバクテリア・レプリコンの操作を更に容易にするために、上記のようにｐＡ Ｌ５０００のＯＲＦ　ｌとして知られる読み取り枠に位１する５ａｉ１．Ｅｃｏ Ｒｌ、およびＢｇｌＩＩ部位を除去することが実施された。ＰＣＲ突然変異誘発 がそれぞれの制限部位内のゆらぎ塩基で行われ、塩基置換は推定上のコード化Ｏ ＲＦ　ｌ蛋白質のアミノ酸配列を変更しないように設計された。制限部位はミコ バクテリアの検定のために、一時に１個除去された。ｋ・垢菌の複製を変更する ことなく、５ａｌＩおよびＥｃｏＲＩを除去することが可能であった。一つの構 築において、ＥｃｏＲＩ　１０７１部位を欠＜ｐＭＶ１１７を形成するためにＥ ｃｏＭｕｔ−Ｍ、ｒｅｐおよびＢａｍ−Ｍ、ｒｅｐプライマーと共にｐＭＶ　ｌ 　１３のＥｃｏＲＩ　１０７１でＰＣＲ突然変異誘発が実施された。ＥｃｏＭｕ ｔ−Ｍ、ｒｅｐプライマーは下記の配列を有する。

ＴＣＣＧＴＧ　ＣＡＡ　ＣＧＡ　ＣＧＴ　ＧＴＧ　ＴＣＣＣＧＧ　Ａ。

またＢａｍ−Ｍ、ｒｅｐは下記の配列を有する。

ＣＡＣ（：ＣＧ　ＴＣＣＴＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＣＴ　ＡＣも一つの構築にお いて、５ａｌＩ　１３８９部位を欠＜ｐＭＶ１１９を形成するために、ＳａｌＭ ｕｔ−Ｍ、ｒｅｐおよびＢａｍ−Ｍ、ｒｅｐプライマーと共に５ａｌＩ　１３８ ９部位でＰＣＲ突然変異誘発が実施された。ＳａｌＭｕｔ−Ｍ、ｒｅｐプライマ ーは下記の配列を有する。

ＴＧＧ　ＣＧＡ　ＣＣＧ　ＧＡＧ　ＴＴＡ　ＣＴＣＡＧＧ　ＣＣＴｐＭＶ１１７ はそれからＡｐａＬ　ＩおよびＢｇｌｌｌで消化され、３３６０塩基対断片が分 離された。ｐＭＶ１１９はＡｐａＬＩおよびＢｇｌ　Ｉ　Ｉで消化され、また１ ２８１塩基対断片が分離され、ｐＭＶ　ｌ　２３を形成するためにｐＭＶ　１１ ７から分離された３３６０塩基対断片に結合された。プラスミドｐＭＶ１１７． ｐＭＶ１１９．およびｐＭＶ　１２３を構築する構成図はＦＩＧ、２６で示され る。しかしＰＣＲ突然変異誘発あるいはフレノウ充填のいずれかによるＢｇｌ　 Ｉ　Ｉ部位の除去は、ミコバクテリアのプラスミド複製を除去し、かくしてＢｇ ｌ　Ｉ■部位はミコバクテリア複製に必要な配列に近接しているかその配列内に あることを示唆することとなった。

６、ｐ、ＭＶ２００シリーズ・ベクターの構築大１［１１１およびミコバクテリ ア（Ｅ、ｒｅｐおよびＭ、ｒｅｐ）のプラスミド複製に必要なすべての成分の操 作、および組換え体（Ｋａｎ”　）の選択を容易にするために、各成分のそれぞ れのカセットは、将来のベクターに単純化された自己集合を構築し、ユニーク制 限部位および転写および翻訳ターミネータ−を含む多重クローニング部位（ＭＣ Ｓ）を含むものとなった。カセットは方向性クローニングおよび自己集合をすべ ての転写が一方向性であるプラスミドに与えるよう構築された。

Ｋａｎ”カセット ａｐｈ　（Ｋａｎ”　）遺伝子を含むＤＮＡカセットがＫａｎ５　およびＫａｎ ３　′プライマーと共にＰＣＨにより構築された。５ＰｅＩ部位がＰＣＲプライ マーＫａｎ３　’の５′末端に添加され、結果として下記の配列を有するＰＣＲ プライマーの形成が行われた。

ＣＴＣＧＡＣＴＡＧ　ＴＧＡ　ＧＧＴ　ＣＴＧ　ＣＣＴ　ＣＧＴ　ＧＡＡ　Ｇ。

Ｒａｍ　ＨＩ＋Ｎｈｅ１部位がＰＣＲプライマーＫａｎ５　’の５゛宋端に加え られ、結果として下記の配列を有するＰＣＲプライマーの形成が行われた。

ＣＡＧ　ＡＧＧ　ＡＴＣＣＴＴ　ＡＧＣＴＡＧ　ＣＣＡ　ＣＣＴ　ＧＡＣＧＴＣ ＧＧＧ　Ｇ。

ＰＣＲはｐＭＶ　ｌ　２３の塩基３３７５および４５８５で実施され、Ｂａｍ　 ＨＩおよびＮｈｅ　Ｉ部位は塩基３１５９に加えられ、また５ｐｅＩ部位は塩基 ４５８５に加えられた。ＢａｍＨｌおよび５ｐｅＩによる消化、および続いて精 製が行われ、Ｂａｍ　ＨＩから５ｐｅＩまでのａｐｈ遺伝子処理のための転写方 向でＢａｍ　ＨＩおよび５ｐｅＩ付着末端で境界付けられた１　２２８／２４４ ３Ｋａｎ”カセットを生成した。

Ｅ、ｒｅｐ、カセット ｐＵＣ１９のＣ０ＩＥＩレプリコンを含むＤＮＡカセットがＥ、ｒｅｐ／Ｓｐｅ およびＥ、ｒｅｐ／Ｍｌｕプライマーを伴うＰＣＲで構築された。５ｐｅＩ部位 がＰＣＲプライマーＥ。

ｒｅｐ／Ｓｐｅの５′末端に加えられ、またＭｌｕＩ部位がＰＣＲプライマーＥ 、ｒ　ｅ　ｐ／Ｍ　１　ｕの５′末端に加えられた。

生成したプライマーは下記の配列を有した。

Ｅ、ｒｅｐ、／５ｐｅ ＣＣＡ　ＣＴＡ　ＧＴＴ　ＣＣＡ　（：ＴＧ　ＡＧＣＧＴＣＡＧＡ　ＣＣＣＥ、 ｒｅｐ、／Ｍｌｕ ＧＡＣＡＡ（：　ＧＣＧ　ＴＴＧ　ＣＧＣＴＣＧ　ＧＴＣＧＴＴ　ＣＧＧ　ＣＴ Ｇ。

ＰＣＲはｐＵｃ　１９の塩基７１３および１５００で実施され、また、Ｍ　ｌ　 ｕ　ｒ部位は塩基７１３に加えられ、Ｓｐｅ　Ｉ部位は塩基１５００に加えられ た。ＭｌｕＩおよびＳｐｅ　Ｉでの消化およびそれに続（精製によって、５ｐｅ ＩからＭ　１　ｕ　ＩまでのＲＮＡＩおよびＲＡＮＵ複製プライマー処理のため の転写方向に伴って５ｐｅｌおよびＭ　ｌ　ｕ　Ｉ付着末端で境界付けられたＥ 、ｒｅｐ、カセットが生成した。

Ｍ、ｒｅｐ、カセット ミコバクテリアのプラスミド複製に必要な配列を含むＤＮＡカセットが、Ｍ、　 ｒ　ｅ　ｐ／Ｍ　ｌ　ｕおよびＭ、ｒｅｐ／Ｂａｎプライマーを伴うｐＭＶ１２ ３のＰＣＲにより構築された。Ｍ１ｕＩ部位がＰＣＲプライマーＭ、　ｒ　ｅ　 ｐ／Ｍ　１　ｕの５′末端に加λられた。Ｂａｍ　ＨＩ部位はＰＣＲプライマー Ｍ、ｒｅｐ／　Ｂ　ａ　ｍの５′末端に加えられた。生成するＰＣＲプライマー は下記の塩基配列を有する。

Ｍ、　ｒ　ｅ　ｐ、　７Ｍ　ｌ　ｕ Ｃｌｌ：Ａ　ＴＡＣＧ（：Ｇ　ＴＧＡ　ＧＣＣＣＡ（：　ＣＡＧ　ＣＴＣＣＧＭ 、ｒｅｐ、／Ｂａｍ ＣＡＣＣＣＧ　ＴＣＣＴＧＴ　ＧＧＡ　ＴＣＣＴＣＴ　ＡＣＰＣＲはｐＭＶ　１ ２３（７）塩基１３４および２０８２で実施された。Ｍ　１　ｕ　Ｉ部位が塩基 ２０８２に加えられた。Ｂａｍ　ＨＩおよびＭ　１　ｕ　ｒによる消化、および それに続くゲル精製によって、ＭｌｕＩからＢａｍ　ＨＩまでのｐＡＬ５０００ 　０ＲＦＩおよび０ＲＦ２遺伝子のための転写方向に伴ってＭ　ｌ　ｕ　Ｉおよ びＢａｍ　Ｈ工付着末端により境界付けられた１９３５塩基対ＤＮＡカセツトが 精製した。

Ｋａｎ”　、Ｅ、ｒｅｐ、およびＭ、ｒｅｐの各ＰＣＲカセットがそれから当モ ル濃度で混合され連結され、Ｋａｎ”形質転換細胞の選択のための大腸菌菌株Ｈ ＢＩＯＩに形質転換された。Ｂａｍ　Ｈｒ＋Ｍ１ｕＩ＋５ｐｅＩおよび指定され たｐＭＶ２００で消化された後、３個のカセットすべてを保持するプラスミドの 存在を確認するため、集落がスクリーニングされた。追加の制限部位であるＮｃ ｏ　Ｉは、ＮｃｏＩと共にｐ　Ｍ　Ｖ２Ｏ０の消化でＭ、ｒｅｐカセットから除 去され、フレノウで充填され、連結および再循環された後、ｐＭＶ２０１が形成 された。ｐＭＶ　１２３およびｐＵＣ１９からのｐＭＶ２００、およびｐＭＶ　 ２００からｐＭＶ２０１の形成の構成図がＦＩＧ。

２７で示される。プラスミドｐＭＶ２００およびｐＭＶ２０１は恥垢菌およびＢ ＣＧに形質転換された。二つのプラスミドはいずれもＫａｎ”形質転換をもたら し、かくしてミコバクテリアに複製する能力のあることを示した。

合成多重クローニング配列（ＭＣ３）（ＦＩＧ、２８）がその後設計され、ミコ バクテリアでの外部遺伝子発現のため、またミコバクテリア染色体へ組込むため の分子クローニングおよび操作を容易にするためにこのＭＣ３が合成された。Ｆ ＩＧ。

２８で示される合成ＭＣ３は、ｐＭＶ２０１に対しユニークである１６個の制限 部位を含み、３個の読み枠それぞれに翻訳停止コドンを保持する領域、および大 腸１１５ＳリボゾームＲＮＡ（Ｔ１）から得られる転写ターミネータ−を含む。

ＭＣＳカセットを挿入するため、ｐＭＶ２０１はＮａｒ　ＩおよびＮｈｅ　Ｉで 消化され、生成する断片はゲル精製された。

ＭＣ３はＨｉｎＰＩおよびＮｈｅＩで消化され、生成断片はゲル精製された。２ 個の断片はその後、ｐＭｖ　２０４を産出するため連結された。ｐＭＶ２０４の 構築図ばＦｒＧ、２９で示される。

プラスミドｐＭＶ　２０４はその後追加の構築においてＭ、ｒｅｐカセットの除 去を容易にするよう更に操作された。ｐＭＶ２０４はＭ　ｌ　ｕ　ｒで消化され 、またＭｌｕＩ−Ｎｏｔｌリンカ−がｐＭＶ２０６を生成するためにＭ、ｒｅｐ およびＥ。

ｒ６ｐの間のＭ　ｌ　ｕ　Ｉ部位に挿入された。ｐＭＶ２０４からｐＭＶ２０６ を作ル１１１１築図はＦＩＧ、３０で示され、ｐＭｖ２０６のＤＮＡ配列はＦＩ Ｇ、３１で示される。

７、ＢＣＧ　ＨＳＰ６０に基づく発現カセットの構築ミコバクテリアの中でもっ とも豊富な蛋白質はＨ３Ｐ６０熱シヨツク蛋白質（６５キロダルトン抗原として も知られる）である。ミコバクテリア内のＨＳＰ６０蛋白質が豊富であることが 強力なＨＳＰ遺伝子発現を示すために、Ｈ３Ｐ６０発現を支配する配列は、ＢＣ Ｇの抗原あるいはその他の蛋白質をコード化する異型遺伝子の発現を支配するよ う選択された。

ＢＣＧ　Ｈ３Ｐ６０遺伝子の公開された配列（トール他、Ｉｎｆｅｃｔ　ａｎｄ 　Ｉｍｍｕｎ、、Ｖｏｌ、５５．ＰＰ１４６６−１４７５．Ｊｕｎｅ、１９８７ １　および周辺の配列は、ＰＣＨによる発現制御配列（すなわちプロモーターお よび翻訳開始配列）を保持するカセットの構築を可能にした。ＢＣＧ　Ｈ３Ｐ６ １カセツト（ＦＩＧ、３２）はＢＣＧＨ３Ｐ出発コドンに対し３７５塩基５′を 、また出発コドンに対し１５塩基（５コドン）３′を含む。ＰＣＲオリゴヌクレ オチド　プライマーがその後合成された。下記の配列を有するＢａｍ−Ｈ３Ｐ６ 　Ｌプライマー： ＣＡＧ　ＡＴＣＴＡＧ　ＡＣＧ　ＧＴＧ　ＡＣＣＡＣＡ　ＡＣＧ　ＣＧＣＣはカ セットの５′末端のため合成され、また下記の配列のプライマーＢａｍ−Ｈ５Ｐ ６１： ＣＴＡ　ＧＧＧ　ＡＴＣＣＧＣＡＡＴ　ＴＧＴ　ＣＴＴ　ＧＧＣＣＡＴ　ＴＧは カセットの３′末端のために合成された。ＢＣＧサブ菌株パスツール染色体ＤＮ ＡからＰＣＨによりカセットを増幅するためにこれらのプライマーが使用された 。カセットの３′末端でのＢａｍ　ＨＴ部位の追加は、）ＩＳＰ６０遺伝子の最 初の６個のコドンに１個のコドン（ＡＳＰ）を追加する。

ｐＭＶ　２０６およびＰＣＲカセットＨ３Ｐ６１のそれぞれは、Ｘｂａｒおよび Ｉ３ａｍ　ＨＩで消化された。ＰＣＲカセットはその後ｐＭＶ２０６のＸｂａＩ およびＢａｎ　ＨＩ部位の間に挿入され、それからｐＭＶ２６１を形成するため に連結されたが、これはＦＩＧ、３３で示される。

大腸菌１ａｃ　Ｚ遺伝子は、ＢＣＧの異型遺伝子を発現するＨ３Ｐ６１カセツト の性能を検定するリポータ−あるいはマーカー遺伝子として使用された。ｌ’ａ ｃ　Ｚ遺伝子を保持するＢａｍ　ＨＩ制限断片はＢａｍＨＩ消化ｐＭＶ２６１の Ｂａｍ　ＨＩ部位にクローンされ、ｐＭＶ２６１／ＬＺを結果的に形成する。ｐ ＭＶ２６１／ＬＺの構築図はＦＩＧ、３４で示される。ｐＭＶ２６１／ＬＺの形 成は、Ｈ３Ｐ６０遺伝子の第６番コドンとｌａｃ　Ｚ遺伝子の第６番コドンにあ るＨＳＰ６０遺伝子とｌａｃ　Ｚ遺伝子の間で融合する。ｐＭＶ２６１／ＬＺは それから大腸菌に形質転換された。青色大腸菌集落はｐＭＶ２６１／ＬＺの存在 に対しＸ−ｇａｌ平板上で選別され、かくしてＨ３Ｐ６０プロモーターおよび翻 訳開始配列がいずれも大腸菌内で活性であることを示した。

その後ｐＭＶ２６１／ＬＺはＢＣＧに形質転換され、Ｘ−ｇａｌを含むダポスオ レイック寒天培地にプレートされた。この形質転移から生じるすべてのＢＣＧＩ Ｋ落は青色を呈し、かくしてｌ　ａｃＺ遺伝子生成物（β−ガラクトシダーゼ） がＢＣＧで発現されたことを示した。ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動が、ｐ ＭＶ２６１／ＬＺ　ＢＣＧＩＩ換え体の溶菌液で実施され、β−ガラクトシダー ゼ蛋白質が（クーマツシー　ブリリアントプル〜の染色で定義されるように）全 ＢＣＧ蛋白質のＩＯ％を越える水準にあることを発現しん。これらのデータは、 ＢＣＧ　Ｈ３Ｐ６１発現力ｔ’ットが発現ベクターｐ　Ｍ　Ｖ　２６１　ニ官能 的であり、また異型遺伝子の実体の発現が、ＢＣＧ内のＨＳＰ６０−制御発現を 使用して達成できることを示した。

プラスミドｐＭＶ２６１／ＬＺは次いで自律的に複製し、恥垢菌およびＢＣＧ内 でＢＣＧプロモーターＨ３Ｐ６０により駆動されて大腸菌β−ガラクトシダーゼ 、あるいは１　ａｃＺ遺伝子を発現することが示された。

Ｂ、ミコバクテリアファージし５組込み配列のＢＣＧ発現ベクターへの転移 ミコバクテリアファージＬ５　ａｔｔＰ部位およびＬ５インテグラーゼ遺伝子を 含むプラスミドｐＭ８９．４は、ＫｐｎＩ＋ＰｖｕＩＩもしくはＸｂａＩ＋Ｐｖ ｕＩ　Ｉのいずれかで完成のため消化され、またそれぞれがａｔｔＰ部位および インテグラーゼ遺伝子を含む１８６２もしくは１８４７塩基対の制限部位は、そ れぞれアガロースゲル電気泳動で精製された。プラスミドｐＭＶ２６１／ＬＺは ７５６９塩基対あるいは７５７４塩基対ベクタ一断片のいずれかを生成するため にＸｂａＩ＋Ｄｒａｌで消化された。７５６９塩基対断片はｐＭＶ４６０Ｆ／Ｌ Ｚを形成するために、ｐＭＨ９，４から引き出された１８６２塩基対に連結され た。７５７４塩基対断片はｐＭＶ４６０Ｒ／ＬＺを形成するために、ｐＭ８９． ４から引き出された１８４７塩基対断片と連結された。プラスミドｐＭＶ４６０ Ｆ／ＬＺおよびｐＭＶ４６０Ｒ／ＬＺのそれぞれは、ミコバクテリア・レプリコ ン、ＬａｔｔＰ部位、およびＬ５インテグラーゼ遺伝子を含む。プラスミドｐＭ Ｖ４６０Ｆ／ＬＺおよびミコバクテリア・プラスミド・レプリコンのない誘導体 を生成す６　ｒ、＝　ａｌ’）　１ｍ、プラスミドｐＭＶ４６０Ｆ／ＬＺおよび ｐＭＶ４６０Ｒ／ＬＺはＮｏｔＩで消化され、ｐＭＶ３６０Ｆ／ＬＺおよびｐＭ Ｖ３６０Ｒ／ＬＺを生成するために、連結し再循環された。ｐＭＶ３６０Ｆ／Ｌ Ｚｊ５．Ｊ：びｐＭＶ／３６０　Ｒ／Ｌ　Ｚの構成図はＦＩＧ、３６で示される 。

プラスミドｐＭＶ９．４．ｐＭＶ２６１／ＬＺ、ｐＭＶ４６０Ｆ／ＬＺ、ｐＭＶ ４６０Ｒ／ＬＺ、りＭＶ３６０Ｆ／’ＬＺ、およびｐＭＶ３６０Ｒ／ＬＺは、自 律的に複製するか、あるいは恥垢菌もしくはＢＣＧ染色体に組込むプラスミドの 能力を検定するために、恥垢菌およびＢＣＧにその後形質転換された。ｐＭＶ９ ．４．ｐＭＶ２６１／ＬＺ、ｐＭＶ３６０Ｆ／ＬＺ、およびｐＭＶ３６０Ｒ／Ｌ Ｚは、恥垢菌およびＢＣＧ（７）カナマイシン耐性形質転換細胞を生成した。ｐ ＭＶ２６１／ＬＺ、ｐＭＶ３６０Ｆ／ＬＺ、ＳよびＰＭＶ３６０Ｒ／ＬＺＬｆ、 ｐＭＶ２６１／ＬＺで前記記載の通り、ＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動 およびｘ−ｇａｌ検定により大腸菌β−ガラクトシダーゼを発現することが示さ れた。プラスミドｐＭＶ４６１　Ｆ／ＬＺおよびｐＭｖ４６１Ｒ／ＬＺはカナマ イシン耐性形質転換細胞の生成ができなかったので自律複製を仲介する配列を保 持するプラスミドの染色体組込みが、ミコバクテリアに対しては致死的であるこ とが示された。

実施例　４ Ａ、ＢＣＧ　ＨＳＰ７０に基礎を置く発現カセットの構築リック・ヤング博士（ Ｍ　Ｉ　Ｔ）により得られた（７０キロダルトンの抗原としても知られるＢＣＧ 　Ｈ３Ｐ７０熱シヨツク蛋白質に対しコード化する）ＢＣＧ　Ｈ３Ｐ７０遺伝子 の５′領域の部分配列は、航記引用の手順に従って、ＰＣＨによって発現対照配 列（すなわちプロモーターおよび翻訳開始配列）を保持するカセットの構築を可 能にした。ＢＣＧ−Ｈ３Ｐ７１カセツト（ＦＩＧ、３２）は、ＢＣＧ−Ｈ３Ｐ出 発コドンに対し１５０塩基５′を、また出発コドンに対し１５塩基（５コドン） ３′を含む。プライマーＸｂａ−Ｈ３Ｐ７０はカセットの５′末端で合成され、 またプライマーＢａｍ−Ｈ３Ｐ７１はカセットの３′末端で合成された。プライ マーは下記の塩基配列を有する。

Ｘｂａ−Ｈ３Ｐ７０ ＧＧＣＣＴＣＴＡＧ　ＡＣＣＣＧＣＡＣＧ　ＡＣＣＡＧＣＧＴＴ　ＡＧＣＢａｍ −ＨＳＰ７１ ＧＣＴ　ＡＧＧ　ＡＴＣＣＣＣＧＡＣＣＧＣＡＣＧ　ＡＧＣＣＡＴ　ＧＧＴプラ イマーはＢＣＧサブ菌株パスツール染色体ＤＮＡからのカセットを増幅するため に使用された。カセットの３′末端でのＢａｍ　Ｈｌの付加は、Ｈ３Ｐ７１発現 カセットの３′末端に１コドン（Ａｓｐ）を加える。

ｐＭＶ２０６ｇよびＰＣＲカセットＨ３Ｐ７１のそれツレはＸｂａＩおよびＢａ ｍ　ＨＩで消化された。ＰＣＲカセットはそれからｐＭＶ　２０６のＸｂａＩお よびＢａｍ　Ｈ１部位の間に挿入され、次いでｐＭＶ２７１を形成するために連 結されたが、それはＦＩＧ、３３で示される。

Ｂ、ＨＩＶ−１ｇａｇのクローニング ＨＩＶ−１ｇａｇのＢａｍ　Ｈｌ−Ｃ１ａＩ　Ｐ　ＣＲカセットは、ｐＭＶ２６ １／ｇａｇおよびｐ　Ｍ　Ｖ　２７１　／　ｇ　ａ　ｇを得るためにｐＭＶ２６ １およびｐＭＶ２７１のＢａｍ　ＨｌおよびＣｌａＴ部位の間でクローンされた 。ＢＣＧのｇａｇ抗原の発現は、ＢＣＧ　ｐＭＶ２７１／ｇａｇ組換え体温菌液 のウェスタンブロッティング分析で免疫反応性蛋白質帯の外観によって実証され た。しかしＢＣＧ形質転換細胞はｐＭＶ２６１／ｇａｇでは決して得られず、か くしてｐ　Ｍ　Ｖ　２６１　／　ｇ　ａ　ｇから発現されたｇａｇは致死的であ ったことが判明した。

Ｃ，Ｈ３Ｐ６０−ｇａｇ発現カセットのＢＣＧへの組込みＨ３ＰＨ３Ｐ−６Ｏ− 発現カセットのＢＣＧへの組込みがＢＣＧのｇａｇの非致死的発現になるかどう かを検証するために、Ｈ３Ｐ６０−ｇａｇ発現カセットはプラスミド（ｐ　Ｍ　 Ｖ２Ｏ３）にクローンされた。これはミコバクテリオファージＬ５　ａｔｔＰお よびインテグラーゼ配列を含んでおり、その構築は下記に説明される。

１、ｐＭＶ３０７（＋）構築 プラスミドｐＭＶ２０６はミコバクテリア・レプリコンを除去するためにＮｏｔ Ｉで消化された。生成した２２０９塩基対断片はａｐｈ　（Ｋａｍ”　）遺伝子 、大腸菌レプリコンおよび多重クローニング部位を含んでいるが、ｐＭＶ　２０ ６を形成するために連結され再循環された。その構築はＦＩＧ、３０で図式％式 ％ プライマーＸｂａＩ　Ａｔｔ／ＩｎｔおよびＮｈｅＩ−Ａｔｔ／Ｉｎｔと共にＰ ＣＲが、次いでａｔｔＰ部位およびＬ５インテグラーゼ遺伝子を含むｐＭＨ９， ４からの５ａｌＩ断片上で実施された。生成したカセットはその後Ｘｂａ　Ｉお よびＮｈｅ　Ｉで消化され、１７８９塩基対断片はゲル精製された。それからｐ ＭＶ２０５がＮｈｅ　Ｉで消化され、生成した断片は、ｐＭＶ３０７を形成する ためｐＭＨ９，４から得られた１９８９塩基対断片に連結された。ｐＭＶ３０７ の構成図はＦＩＧ、３７で示される。

２、ｐＭＶ３６１／ｇａｇの構築および形質転換ＸｂａＩ−Ｃ１ａＩ　Ｈ３Ｐ抗 原カセットは、ＨＳＰ６０プロモーターおよびＨＩＶ−１ｇａｇ配列を含むが、 このカセットはプラスミドｐＭＶ３６１／ｇａｇを形成するためにｐＭＶ３０７ のＮｏｔＩおよびＣｌａｌ部位の間でクローンされた。

ｐＭｖ３６１／ｇａｇはその後Ｂ　ＣＧ　ｉ：形質転換され、ＨｒＶ−１感染ヒ ト血清を便ってウェスタンブロッティング分析によりＨＩＶ−１ｇａｇ蛋白質を 発現することが示された。

実施例　５ 表２で示されるように、ヒト腫瘍抗原Ｐ９７の遺伝子を含む遺伝子断片を除いて 、一連の抗原遺伝子断片あるいはカセットがＰＣＲにより構築され、ｐＭＶ２６ １およびｐＭＶ２７１シリーズの新しい構築物を形成するためにｐＭＶ２６１お よびｐＭＶ２７１シリーズの新しい構築物を形成するためにｐＭＶ２６１および ｐｌｉ’１Ｖ２７１の各種の制限部位にクローンされた。抗原遺伝子、抗原遺伝 子断片、ｐＭＶ２６１およびｐ、ＭＶ２７１、および生成された構築物の各種は 、下記の表２で提示される。

下記の構成物： ｐＭＶ２６１／Ｐ９７ ｐＭＶ２７１／Ｐ９７ ｐＭＶ２６１／ＣＳ ｐＭＶ２７１／ＣＳ ｐＭＶ２６１／ＳＭ９７ ｐＭＶ２７１／ＳＭ９７ ｐＭＶ２７１／ＨＩＶ−１−ｇａｇ ｐＭＶ２６１／ＨｆＶ−１ｇｐ１２０ ｐＭＶ２７１／ＨＩＶ−１ｇｐ１２０ ｐＭＶ２６１／ＨＩＶ−１−ｇｐ４１ ｐＭＶ２７１／ＨＩ　Ｖ　−１−ｇｐ４１ｐＭＶ２６１／ＨＥＶ２ｇａｇ ｐ　Ｍ　Ｖ　２７１　／　ＨＩ　Ｖ　２　ｇ　ａ　ｇｐＭＶ２６１／ＨＩＶ２− ｇｐ１２０ ｐＭＶ２７１／ＨＩＶ２−ｇｐ１２０ ｐＭＶ２６１／ＨＩＶ２−ｇｐ４Ｌ　；ｊ；よびｐＭＶ２７１／ＨＩＶ２−ｇｐ ４Ｌ はＢＣＧに形質転換され、またＢＣＧに対応する抗原の存在がＢＣＧ組換え体ラ イゼートのウェスタンブロッティング分析で免疫反応性蛋白質帯の出現によって 確証された。

実施例　６ 抗原遺伝子発現カセットはプロモーター配列および異型遺伝子配列を含むが、こ のカセットはＮｏｔＩおよび第２制限酵素部位（ｐｖｕＩ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ、Ｓ ａｔ　Ｉ、Ｃ１ａＩあるいはＨｉｎｄ　ＩＩＩ）と共にｐＭＶ２６１およびｐＭ Ｖ２７１誘導体から切除され、プラスミドのｐＭＶ３６１／ＸＸＸおよびｐＭＶ ３７１／ＸＸＸシ’Ｊ−ズ（例えばｐＭＶ３６１／ＨＩＶ−Ｉｇｐ１２０）を形 成するためにＮｏｔＩ部位および第２制限酵素部位（Ｐｖｕｌ　Ｉ、ＥｃｏＲＩ 、Ｓａｔ　Ｉ、Ｃ１ａＩあるいはＨｉｎｄ　ＩＩＩ）の間の組込みプラスミドｐ ＭＶ３０７にクローンされた。これらシリーズのプラスミド（ｐＭＶ３６１およ びｐＭＶ３７１）のバックボーンはＦＩＧ、３８に示される。

下記のプラスミド： ｐＭＶ３６１／Ｐ９７ ｐＭＶ３７１／Ｐ９７ ｐＭＶ３６１／Ｃ３ ｐＭＶ３７１／Ｃ３ ｐ　Ｍ　Ｖ　３６１　／　Ｓ　Ｍ　９７ｐＭＶ３７１／ＳＭ９７ ｐＭＶ３６１／ＨｒＶ−１−ｇａｇ ｐ　Ｍ　Ｖ　３７１　／　ＨＩ　Ｖ　−１−ｇ　ａ　ｇｐＭＶ３６１／ＨＩＶ− １ｇｐ１２０ ｐＭＶ３７１／ＨＩＶ−１ｇｐ１２０ ｐＭＶ３６１／ＨＩＶ−１ｇｐ４１ ｐＭＶ３７１／ＨＩＶ−１ｇｐ４１ ｐＭＶ３６］／ＨＩＶ２ｇａｇ ｐＭＶ３７１／ＨＩＶ２ｇａｇ ｐＭＶ３６１／ＨＩＶ２−ｇｐ１２０；およびｐＭＶ３６１／ＨＩＶ２−ｇｐ４ １ はＢＣＧに形質転換され、適切な抗原特異的ヒト血清を使ってウェスタンブロッ ティング分析により対応する抗原を発現することが示された。

しかしこの発明の範囲は前記記載の実施例に限定されるものではない、この発明 は特に記述された以外にも実施することができ、しかもなお添付の請求の範囲内 にある。

４０４　Ｄｒａｌ！ 隙影艶＝　Ｌ５　ＤＮＡ 除影部＝　Ｌ５　ＤＮＡ ｍｅ！５　＝　ＫａｎＲ刀亡・・／ト 瞳Ｐ／郡すａｎ　力仁Ｖヒ ＦＩＧ、１８ １工Ｏのでシ＾αχロχυ冗π　属≧απ３τπにα論−５にαＸαに一輪　賀 πａシα−ｂ」コ℃献ゴ ＾ｔａシーコ℃＾ Ｔひ４１ｍログにテＣ−コ℃ Ａ−１論　π−Ｃ ＭχＣαｔロズゴ ηズｉαズ℃んＣ口χη 献χ論ａ工ηｎムα工く ＴＡｉズχす０りχ工丁＾−ズＩ℃Ｃ買ズＸ論ｔシ講Ａ賀χ２αχ０ズエＴｘＣ αＸ−αズ「＾手糸売ネ甫正書（方式） 平成５年１１月　２日

Claims (11)

【特許請求の範囲】
1. １．ＤＮＡをミコバクテリア染色体に組込むＤＮＡであり、バクテリオファージ のミコバクテリア染色体への組込みをコード化するファージＤＮＡ部分である第 １次ＤＮＡ配列、および ＤＮＡが組込まれるミコバクテリアに異型である蛋白質もしくはポリペプチドを コード化する第２次ＤＮＡ配列よりなるＤＮＡ。
2. ２．前記ファージＤＮＡ部分がミコバクテリオファージのミコバクテリア染色体 への組込みをコード化することを特徴とする請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
3. ３．前記第１次ＤＮＡ配列がＤＮＡコード化インテグラーゼを含むことを特徴と する請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
4. ４．前記第１次ＤＮＡ配列がＡｔｔＰ部位をコード化するＤＮＡを含む請求の範 囲第３項記載のＤＮＡ。
5. ５．前記第１次ＤＮＡ配列がＢＣＧへの祖込みをコード化することを特徴とする 請求の範囲第４項記載のＤＮＡ。
6. ６．ＤＮＡが大腸菌の複製の原点を含むプラスミドであることを特徴とする請求 の範囲第５項記載のＤＮＡ。
7. ７．第１次ＤＮＡ配列がＦＩＧ．４よりなるクループ、およびミコバクテリアヘ の組込みをコード化するその同族体および誘導体から選択されることを特徴とす る請求の範囲第１項記載のＤＮＡ。
8. ８．請求の範囲第１項記載のＤＮＡで形質転換されたミコバクテリア。
9. ９．染色体に組込きれた外部ＤＮＡを持つＢＣＧ。
10. １０．請求の範囲第８項記載の形質転換されたミコバクテリア，および許容でき る薬品キャリアよりなるワクチン。
11. １１．請求の範囲第８項記載のミコバクテリアに蛋白質を発現することを含む蛋 白質を提供する方法。