ES2323131T3 - Oligonucleotidos para la deteccion de leishmaniasis y metodos correspondientes. - Google Patents
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Abstract
Un cebador oligonucleotídico que tiene una secuencia seleccionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para la amplificación del gen relacionado con la quinesina de las especies Leishmania.
Description
Oligonucleótidos para la detección de
Leishmaniasis y métodos correspondientes.
El presente invento proporciona un método para
detectar Leishmaniasis mediante la amplificación de la región
repetida en tándem del gen relacionado con la quinesina a partir de
varias cepas de L. donovani. Este invento también
proporciona cebadores nuevos y un método de amplificación usando
estos cebadores para detectar y diferenciar las cepas de L.
donovani que causan leishmaniasis visceral (VL) y leishmaniasis
post kala-azar-dérmica (PKDL).
La Leishmaniasis, una enfermedad parásita
transportada por un vector, está causada por protozoos
intramacrofágicos obligatorios. Está caracterizadas por la
diversidad y complejidad. Se presenta con un amplio intervalo de
formas clínicas. Sin embargo, hay principalmente 4 formas clínicas.
La Leishmaniasis Visceral (VL), también conocida como kala azar, es
la forma más grave de la enfermedad, que si no se trata, tiene una
tasa de mortalidad de casi un 100%. La Leishmaniasis Cutánea (CL)
produce úlceras de piel en las partes expuestas del cuerpo, tales
como la cara, brazos y piernas. El número de úlceras puede variar
desde 1 hasta tantos como 200 en algunos casos, causando graves
minusvalías y dejando al paciente permanentemente marcado con
cicatrices. La tercera forma es la Leishmaniasis Mucocutánea (MCL),
o espundia. Puede llevar a una destrucción extensa y desfigurante
de las membranas mucosas de las cavidades nasales, bucales y la
garganta y puede afectar incluso al cartílago. La forma cutánea
puede llevar a la forma diseminada, conocida como Leishmaniasis
Cutánea Difusa (DCL). La Leishmaniasis es causada por un total de
alrededor de 21 especies, que son trasmitidas por alrededor de 30
especies de moscas de las arenas Phlebotomine [Herwaldt BL.,
1999].
La Leishmaniasis está presente de forma endémica
en 88 países en cinco continentes: África, Asia, Europa,
Norteamérica y Sudamérica y un total de 350 millones de personas
están en riesgo de infección. Se estima que 12 millones de personas
en todo el mundo están afectadas por leishmaniasis; esta cifra
incluye casos con enfermedad declarada y aquellos sin síntomas
aparentes. De los 1,5-2 millones de casos nuevos
estimados que tiene lugar anualmente, sólo 600.000 se declaran
oficialmente. De los 500.000 nuevos casos de VL, que tienen lugar
anualmente, 90%, están en cinco países en vías de desarrollo:
Bangladesh, Brasil, India, Nepal y Sudán. Alrededor de 90% de todos
los casos de MCL tienen lugar en Bolivia, Brasil y Perú, y 90% de
todos los casos de CL tienen lugar en Afganistán, Brasil, Irán,
Perú, Arabia Saudí y Siria, con 1-1,5 millones de
nuevos casos reportados cada año en todo el mundo. La distribución
geográfica de la leishmaniasis está limitada por la distribución de
la mosca de la arena, su susceptibilidad a climas fríos, su
tendencia a tomar sangre a partir de humanos o animales y su
capacidad para soportar el desarrollo interno de especies
específicas de Leishmania [Desjeux P 2001].
En la India, VL es un problema grave en Bihar,
Bengala oeste y Uttar Pradesh oriental donde hay una infravaloración
de Leishmaniasis dérmica Kala-azar (KA) y post
kala-azar en mujeres y niños entre 0 y 9 años de
edad. La reciente epidemia en 1992 de VL mató a más de 100.000
personas en la India y Sudán. Fumigaciones con DTT ayudó a
controlar el KA en la India, sin embargo, hay informes de desarrollo
de resistencias del vector Phlebotomus argentipes. También
linfoadenopatías, una característica principal presente en India
abre la posibilidad de un nuevo vector o una variante de la
enfermedad [Bora D., 1999].
La Leishmaniasis dérmica post
kala-azar (PKDL) es una secuela de KA en India y
Sudán; la enfermedad desarrolla desde meses a años tras la
recuperación del paciente de KA. Las lesiones cutáneas caracterizan
la enfermedad y demuestran una gran variabilidad, que oscila desde
las máculas hipopigmentadas hasta pápulas eritematosas y desde
nódulos a placas. Como en la lepra, el amplio espectro clínico de
PKDL se refleja en una respuesta inmune del individuo hacia el
organismo del leishmania. Las lesiones pueden ser numerosas y
persisten durante décadas. Parásitos aislados a partir de las
lesiones son idénticos a los que causan la enfermedad visceral
original.
Los hallazgos clínicos y epidemiológicos en
leishmaniasis no son patognomónicos y pueden imitar varios estados
endémicos tales como la malaria, tuberculosis, sífilis e infecciones
fúngicas. A partir de aquí, el diagnóstico de laboratorio es
requerido para confirmar las sospechas clínicas. Las herramientas de
diagnósticos usadas para cada síndrome de leishmania viz. forma
visceral, cutánea, y mucocutánea varía, pero el estándar ideal en
cada caso sigue siendo la demostración y aislamiento del parásito a
partir del tejido apropiado [Singh S y otros, 2003].
Los signos clínicos y síntomas no son
suficientes para diferenciar VL de otros estados similares tales
como la malaria, la esquistosomiasis del síndrome de esplenomegalia
tropical o cirrosis con hipertensión portal, la tripanosomiasis
africana, tuberculosis miliar, brucelosis, fiebre tifoidea,
endocarditis bacteriana, histoplasmosis, malnutrición, linfoma, y
leucemia. Por consiguiente, otros métodos de diagnóstico son
requeridos [Herwaldt BL, 1999; Davidson RN, 1998]. Entre estos la
técnica más específica y estándar es la demostración parasitológica
o aislamiento de un agente causante. La médula ósea obtenida a
partir de punciones del esternón o de la cresta ilíaca es mucho más
segura pero es un método doloroso. Los aspirados son distribuidos
sobre un portaobjetos de cristal y teñidos con la tinción de
Romanowsky para demostrar las formas amastigotas del parásito. Sin
embargo, en cultivo pueden dar resultado positivo en hasta un 80% de
los casos. La glándula linfática da lugar a resultados positivos en
un 60% de los casos. El líquido es extraído a partir de cualquier
glándula linfática inflamada y sometido tanto a un examen directo
como a un cultivo para dar la mejor oportunidad de un diagnóstico
[Williams, J. E, 1995; Manson-Bahr PEC, 1987]. El
aislamiento primario de L. donovani es hecho sobre un medio
Novy-MacNeal-Nicolle (NNN) sólido
que tiene un 20-30% de sangre de conejo o medio
líquido de insecto de Shneider suplementado con 10% de suero de
ternera fetal (FCS). Otro medio de crecimiento adecuado puede
también ser usado particularmente para mantener los subcultivos de
promastigotos usando FCS u otros suplementos incluyendo orina
humana [Singh S y otros, 2000]. La demostración de los parásitos en
el bazo y el hígado es uno de los métodos más precisos disponibles
para determinar las infecciones por leishmania. El noventa por
ciento de los casos activos muestran parásitos en aspirados de bazo
e hígado [Williams, J. E, 1995]. Parte del aspirado de bazo puede
ser usado para hacer frotis para examen microscópico directo y el
resto debería ser cultivado. Hay varios método para la detección de
esta enfermedad en pacientes. Los métodos microscópicos
convencionales son invasivos y dolorosos y llevan el riesgo de
infecciones iatrogénicas y hemorragias fatales.
El ensayo de gel de formol es el examen
serológico más viejo y tiene la ventaja de ser barato y simple de
realizar. Este examen es inespecífico ya que se basa en detectar
niveles elevados de inmunoglobulinas IgG e IgM [documento del
comité de expertos de la OMS, 1991]. Varios otros ensayos basado en
este principio han estado en uso en el pasado pero muy raramente
usados estos días. [Singh S, 1999].
Hay un número de ensayos serológicos específicos
y todos tienen una sensibilidad y especificidad variables para el
diagnóstico de la enfermedad. Algunos de estos ensayos incluyen
hamaglutininación indirecta (IHA), inmuno electroforesis a
contracorriente (CCIEP), inmunodifusión (ID) etc. Pero todos estos
ensayos son engorrosos y carentes de sensibilidad y especificidad y
por tanto no son comúnmente usados. Algunos más comúnmente usados
son dados a continuación:
- 1.
- Ensayo de Leishmania en piel (LST) [Singh S, 1999, Sassi A, y otros, 1999]
- 2.
- Ensayo de fluorescencia indirecta de anticuerpo (IFAT) [Williams, J. E. 1995, Gari-Toussaint M, y otros, 1994]
- 3.
- Ensayo de aglutinación directa [Schallig HD y otros, 2001]
- 4.
- Inmunotransferencia [Herwaldt BL., 1999; Singh S, 1999; Schallig HD y otros, 2001]
- 5.
- Detección antigénica [Senaldi G y otros, 2001; Attar ZJ y otros, 2001]
- 6.
- Ensayo de inmunoadsorbencia ligada a enzimas (ELISA) [Martin SK y otros, 1998, Rajasekariah GH y otros, 2001, Schoone GJ y otros 2001].
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Raj y otros (1999) han desarrollado un proteína
recombinante r-ORFF de origen de L. infantum
para el diagnóstico de VL en la India. la proteína ORFF está
codificada en el locus LD1 del cromosoma 35 de L. infantum,
un ELISA con este antígeno ha demostrado ser sensible con una
cantidad tan pequeña como 5 ng de r-ORFF cuando se
realiza con diferentes grupos de pacientes como aquellos con VL
confirmada, VL sospechada, normales endémicos tratados de modo
intermitente y normales no endémicos. Además, el ensayo está en un
estadio temprano y necesita ser evaluado por otros y su utilidad
para el diagnóstico de campo está aun por ser estudiado [Raj VS y
otros, 1999].
Otro antígeno recombinante, que pertenece a la
familia génica relacionada a la quinesina de motoproteínas, K39
recombinantes (rK39) se ha demostrado que es específica para
anticuerpos que surgen durante VL causada por miembros del complejo
de L. donovani, que incluye Leishmania chagasi y L.
infantum. Este antígeno, que es un miembro de la familia génica
relacionada a la quinesina, codifica una proteína con un epítopo
repetitivo, que consiste en 39 residuos aminoacídicos (K39) es
altamente sensible y predictiva del inicio de la enfermedad aguda y
valores de anticuerpo elevados han sido demostrados en pacientes con
VL [Burns JM Jr y otros, 1993; Singh S y otros., 1995; Badaro R y
otros., 1996; Singh S y otros., 2002; Maalej IA y otros, 2003,
PATENTE DE EE.UU. Nº 5.411.865; PATENTE DE EE.UU. Nº 5.719.263].
\vskip1.000000\baselineskip
La biología molecular es cada vez más relevante
para el diagnóstico y el control de enfermedades infecciosas. La
información sobre las secuencias de ADN ha sido extensivamente
explotada para el desarrollo de ensayos basados en la reacción de
polimerasa en cadena para el diagnóstico de leishmaniasis e
identificación de especies parásitas. Las técnicas tales como
microarrays y amplificación de ácidos nucleicos basada en secuencias
permitirán eventualmente un cribado rápido para los genotipos de
parásitos específicos y asistir en el diagnóstico y estudios
epide-
miológicos.
miológicos.
Un diagnóstico temprano de leishmaniasis es
importante para evitar daños grave o la muerte del paciente. El
diagnóstico rutinario de leishmaniasis se basa bien en la
demostración microscópica de los amastigotos de Leishmania en los
aspirados a partir del tejido linfoide, aspirados de hígado o de
médula ósea, en frotis de incisión en la piel o sangre periférica o
cultivo. Sin embargo, la retirada de la muestra es incómoda para el
paciente y el aislamiento del parásito en cultivo lleva tiempo, es
difícil y caro. Los métodos inmunológicos fallan a la hora de
distinguir entre infecciones pasadas y presentes y no son fiables en
el caso de pacientes inmunocomprometidos. Además, ninguno de los
métodos serológicos abordan el problema de la identificación de
especies, que es importante para determinar medidas de control de
enfermedades apropiadas. Los pacientes con leishmaniasis cutánea
(CL) o mucocutánea (MCL) con frecuencia tienen niveles bajos o
ausentes de anticuerpos, debido al carácter localizado de la
enfermedad, y así los ensayos serológicos son en la mayoría
negativos. La aproximación molecular para detectar ácidos nucleicos
únicos de los parásitos en el tejido abordarían estas limitaciones.
Por lo tanto la PCR es una herramienta importante para el
diagnóstico de CL y MCL. La PCR se ha documentado que es muy útil
para el diagnóstico de PKDL. Una variedad de métodos de detección
basados en ADN que están dirigidos a ADN y ARN génicos han sido
desarrollados. La PCR ha causado una revolución en el diagnóstico de
Leishmaniasis [Singh S y otros, 2003].
Entre los métodos moleculares usados para el
diagnóstico clínico, la PCR ha demostrado ser una técnica altamente
sensible y específica. Un estudio reciente ha mostrado un ensayo por
PCR que podría detectar parasitemia unas semanas antes de que
aparezca cualquier signo clínico o síntoma. Diferentes secuencias de
ADN en el genoma de leishmania como la región ITS, el locus gp63,
las secuencias teloméricas secuencias diana en rARN génico tal como
18s rARN y SSU-rARN y ambos conservados y regiones
variables en los minicírculos de kADN han sido usados por varios
investigadores [El Tai NO y otros, 2001; Pizzuto M y otros, 2001;
Wortman G y otros 2001, Monroy Ostria y
Sanchez-Tezeda G, 2002, Chiurillo MA y otros, 2001].
Usando una metodología de PCR, ya no es esencial llevar a cabo
métodos invasivos tales como extracción de médula ósea, punciones de
bazo, biopsia de nódulos linfáticos, biopsias de hígado etc. o
recoger grandes volúmenes de muestras de sangre. Aún unas cuantas
gotas de sangre sobre papel de filtro pueden ser suficientes [Da
Silva y otros, 2004].
En un estudio reciente comparando tres técnicas
diferentes tales como huellas dactilares genéticas mediante PCR,
PCR-RFLP y PCR SSCP para revelar los polimorfismos
intraespecíficos, la técnica de PCR-SSCP se ha
encontrado que es más ventajosa que las otras dos para la detección
de variaciones de secuencias en rARN génicos con la especie de
L. donovani. Además, se puede realizar fácil y rápidamente
sin el cultivo previo del parásito facilitando la detección e
identificación del parásito de modo simultáneo [El Tai NO y otros,
2001]. Otro ensayo de PCR evaluado por Pizzuto y otros (2001), para
un seguimiento posterapéutico y la detección de recaídas, se mostró
un 97% sensible en muestras de sangre periférica y 100% sensibilidad
en muestras de médula ósea para detectar especies de leishmania en
pacientes infectados con VIH usando una diana génica SSU rARN
[Pizzuto M y otros 2001]. Sin embargo hay 2 principales
inconvenientes del SSCP. Primero, las cantidades de diferencias en
movilidad tienen poca correlación, si es que la hay, con la cantidad
de diferencias de secuencia. Así, la única información que puede
ganarse a partir de SSCP es si los amplicones de PCR son
"idénticos" o diferentes. Segundo, el tamaño del amplicón
óptimo para la detección de la mayoría de mutaciones puntuales es
bastante pequeña, alrededor de 200 pb. Las estrategias para evitar
esta limitación (por ejemplo huellas dactilares genéticas por
didesoxi o corte de amplicones con enzimas de restricción) son con
frecuencia tediosas y no dan necesariamente los resultados
deseados.
PCR Multiplex en el diagnóstico e
identificación de especies de leishmaniasis: PCR puede ofrecer
una alternativa rápida, sensible, específica, y de bajo coste. Un
número de ensayos de PCR para la identificación de Leishmania al
nivel de género o para la caracterización de complejos individuales
de L. braziliensis, L. mexicana o L. donovani han
sido descritas. Sin embargo, ninguno de estos protocolos de PCR
identifican los tres complejos en un ensayo.
Recientemente desarrollos en el campo de la
biología molecular en los últimos años han llevado al desarrollo de
un ensayo basado en PCR de una etapa simple sensible y específica
para diferenciar los tres complejos de Leishmania del Nuevo Mundo.
Este método emplea diferentes grupos de cebadores en una reacción de
PCR única y conocidos como multiplex de PCR. Hay un documento de
uso de este método, usando la secuencia de ARN líder de corte y
empalme multicopia (mini exón génico) como diana. Este ensayo genera
productos específicos de especie de diferente tamaño para L.
braziliensis, L. mexicana, y L. donovani y es
adecuado para el uso en laboratorios no sofisticados en países
donde la leishmaniasis es endémica. En otro estudio las cepas de
Leishmania fueron caracterizadas usando un único cebador 5' y dos
cebadores 3' combinados en una única reacción multiplex. [Harris y
otros, 1998, Belli y otros, 1998]. Aunque este método es útil pero
las oportunidades de resultados de amplificación no específica o
falsos positivos son altos debido al uso de múltiples grupos de
cebadores. Así, para evitar tales resultados, uno debe seleccionar
los cebadores amplificando regiones altamente conservadas en la
especie para evitar la amplificación no específica.
Varias cepas pueden circular en un área endémica
a un tiempo dado. Por consiguiente, cebadores específicos de
especies y cepas han sido desarrollados para detectar la
heterogeneidad genética. Recientemente, cebadores desarrollados por
el grupo de los autores podría diferenciar las cepas de la India que
causan las formas VL y PKDL. Una amplificación del tipo
Alu-PCR multiplex fue realizada con los aislados de
L. donovani cultivada de pacientes con VL y PKDL. El patrón
de bandas de los amplicones de PCR podrían agrupar claramente todas
las cepas de PKDL en un grupo mientras que las cepas VL tuvieron una
heterogeneidad intra-especies.
Los solicitantes hicieron una búsqueda extensa
de las bases de datos de patentes con diferentes palabras clave
para estudiar el trabajo hecho previamente en el diagnóstico basado
en Alu PCR/PCR de leishmaniasis y amplificación de PCR del gen
relacionado con la quinesina para diagnosticar y diferenciar las
cepas que causan VL y PKDL. A continuación se tratan las pocas
patentes de EE.UU. sobre el sujeto que concierne y la singularidad
del invento del solicitante.
La Patente de Estados Unidos nº 5.411.865 de
Reed del 2 de Mayo de 1995 enseña sobre el método para detectar
anticuerpos antiparásito de leishmania. El compuesto descrito es
para un método para detectar anticuerpos antiparásito de Leishmania
frente a un antígeno de 230 kDa presente en Leishmania
chagasi y Leishmania donovani.
La Patente de Estados Unidos nº 5.719,263 de
Reed del 17 de Febrero de 1998 enseña acerca del antígeno de 230
kDa presente en la especie de Leishmania. El compuesto descrito es
un antígeno de 230 kDa aislado que está presente en Leishmania
chagasi y Leishmani donovani, y polipéptidos aislados que
comprenden uno o una pluralidad de antígenos repetidos K39. También
descritos están los ADN que codifican el antígeno de 230 KDa y el
antígeno K39 de repetición, y las composiciones de vacuna que
comprenden los antígenos.
El antígeno descrito antes de 230 kDa y el
polipéptido aislado que comprende las repeticiones k39 son sólo un
método serológico y que además se ha descrito que no son muy
sensibles en ciertas áreas geográficas en las que VL es altamente
endémico y causada por L. donovani. Por el contrario, el
invento del solicitante proporciona métodos y compuestos, que
tratan del diagnóstico molecular o de ensayos basados en
amplificación de ácidos nucleicos.
La Patente de Estados Unidos nº 5.834.592 de
Reed y otros, del 10 de Noviembre de 1998 da información acerca de
un polipéptido aislado que comprende una porción inmunogénica de un
antígeno de Leishmania que tiene la secuencia aminoacídica mostrada
en la SEQ ID NO: 4, o una variante de dicho antígeno que difiere
sólo en sustituciones, modificaciones o combinaciones conservadoras
de las mismas. El antígeno es considerado que es importante en el
diagnóstico y la terapia de leishmaniasis. Sin embargo el invento
del solicitante difiere del compuesto paten-
tado.
tado.
La Patente de Estados Unidos nº 5.846.748 de
Mandal y otros del 8 de Diciembre de 1998 da información acerca del
método para diagnosticar leishmaniasis visceral en un paciente
mediante la identificación de un nuevo marcador clave, a saber,
9-O-sialoglicoconjugado acetilado.
Este invento se refiere a la identificación de un nuevo marcador
clave, a saber
9-O-sialoglicoconjugado acetilado
con la ayuda de una lectina de unión al ácido 9-O
acetilsiálico, Achatina-H útil para el diagnóstico
de leishmaniasis visceral, mediante un ensayo de hemaglutinación
preciso. Por el contrario, el invento del solicitante proporciona
método y compuestos, que tratan del diagnóstico molecular o ensayos
basados en la amplificación de ácidos nucleicos.
La Patente de Estados Unidos nº 5.912.166 de
Reed, y otros, del 15 de Junio de 1999 enseña acerca de compuestos
y método para diagnosticar la infección por leishmania. Los
compuestos proporcionados incluyen polipéptidos que contienen al
menos un epítopo del antígeno LcPO ribosoma ácido de Leishmania
chagasi, o una variante del mismo. Tales compuestos son útiles
en una variedad de inmunoensayos para detectar la infección de
Leishmania y para identificar individuos con infecciones
asintomáticas que son probables que progresen a leishmaniasis
visceral aguda. Los compuestos polipeptídicos son usados
adicionalmente en vacunas y composiciones farmacéuticas para
prevenir leishmaniasis. Sin embargo, el presente invento del
solicitante no trata del antígeno LcPO ribosomal
ácido.
ácido.
La Patente de Estados Unidos nº 6.525.186 de
Bebate y otros, en Febrero del 2003, es un polinucleótido aislado,
que comprende un cADN recombinante que codifica un polipéptido
quimera que tiene 4 proteínas LiP2a, LiP2b, LiH2a y LiPO de
Leishmania infantum útil en el diagnóstico serológico de
leishmaniasis canina y una proteína obtenida que contiene al menos
un determinante antigénico, reconocido por el suero de perros con
Leishmaniasis Visceral. Por el contrario, el invento del
solicitante proporciona métodos y compuestos que tienen que ver con
el diagnóstico molecular o ensayos basados en la amplificación de
ácidos nucleicos.
La Patente de Estados Unidos nº 6.613.337 de
Reed y otros, del 2 de Septiembre del 2003, tiene que ver con una
proteína de fusión y un vehículo fisiológicamente aceptable, en el
que la proteína de fusión comprende la secuencia aminoacídica de la
SEQ ID NO: 24, para su uso en terapia y diagnóstico de
leishmaniasis. La combinación contiene polipéptidos que comprenden
porciones inmunogénicas de M15, Ldp23, Lbhsp83, Lt-1
y LbelF4A. Sin embargo, el presente invento del solicitante no
tiene que ver con la solicitud de la proteína de fusión.
La Patente de Estados Unidos nº 6.638.517 de
Reed y otros, del 28 de Octubre del 2003, antígenos de Leishmania
para su uso en terapia y diagnóstico de leishmaniasis enseña
composiciones y métodos para prevenir, tratar y detectar
leishmaniasis y estimular la respuesta inmune en pacientes. Los
compuesto proporcionados incluyen polipéptidos que contiene una
porción inmunogénica de uno o más antígenos de Leishmania, o una
variante de los mismos. La patente también describe vacunas y
composiciones farmacéuticas que comprenden tales polipéptidos, o
polinucleótidos que codifican tales polipéptidos, son también
proporcionados y pueden ser usados, por ejemplo, para la prevención
y terapia de leishmaniasis, así como para la detección de la
infección por Leishmania.
La Solicitud de Patente de Estados Unidos
20030162182, Salotra Poonam y otros, del 28 de Agosto del 2003, un
ensayo de PCR específico de especie para la detección de
Leishmania donovani en muestras clínicas de leishmania
dérmica de kala-azar y post
kala-azar enseña métodos y compuestos para ensayos
por reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para el diagnóstico
de leishmaniasis usando cebadores oligonucleotídicos noveles
específicos para la identificación de parásitos de Leishmania
donovani en muestras clínicas.
El invento del solicitante usa una diana en el
ADN genómico de leishmani que es enteramente diferente del trabajo
de Salotra y otros (Solicitud de EE.UU. Nº 20030162182), en el que
los autores amplifican los minicírculos en el ADN del cinetoplasto
que es un tipo de ADN mitocondrial y muy menor en cantidad,
proporcionando de ese modo menos dianas para los cebadores
resultando en una sensibilidad baja. El presente invento usa ADN
genómico como diana para la amplificación por PCR que está en
abundancia en el parásito y así una mejor sensibilidad. Las
secuencias de ADN amplificadas son del ADN genómico en el que el
método del Dr. Salotra amplifica una región del ADN mitocondrial,
que es difícil de aislar comparado con el ADN genómico y requiere
una mayor experiencia y equipamiento. También la cantidad de ADN
mitocondrial (K-ADN) aislado es mucho menor que la
cantidad de ADN genómico aislado. El método desarrollado por
Salotra no puede diferenciar entre las formas VL y PKDL de
leishmania. Así el presente invento es más conveniente de realizar
ya que tiene la capacidad de diferenciar las especies de modo
más
específico.
específico.
El presente invento proporciona un método
directo de detectar Leishmania mediante la amplificación de la
región repetida conservada del gen relacionado con la quinesina,
mientras que todos los demás métodos descritos se basan en el
polipéptido derivado del gen relacionado con la quinesina (ensayos
de antígeno-anticuerpo). Otra característica de
este invento es que, el método de PCR puede diferenciar entre
Leishmaniasis visceral (VL) y leishmaniasis dérmica post
kala-azar (PKDL).
\vskip1.000000\baselineskip
El principal objetivo del presente invento es
desarrollar nuevos cebadores oligonucleotídicos para la
amplificación del gen relacionado con la quinesina de la especie
Leishmania. Además el objetivo es diseñar cebadores basados en la
región repetitiva del gen relacionado con la quinesina para
amplificación por PCR.
Otro objetivo del invento es desarrollar un
método para la amplificación por PCR para detectar Leishmaniasis en
pacientes infectados con cepas de Leishmania donovani basadas
en la región repetitiva conservada del gen relacionado con la
quinesina de la especie Leishmania usando cebadores
oligonucleotídicos nuevos.
Otro objetivo del presente invento es
desarrollar un método para la detección y diferenciación de cepas de
Leishmania que causan VL y PKDL usando los cebadores
oligonucleotídicos nuevos.
Otro objetivo más del presente invento es de un
métodos de detección para leishmaniasis a partir de una muestra que
es seleccionada de bien muestras clínicas o bien muestras de
cultivo.
Un objetivo adicional del presente invento es
desarrollar un kit diagnóstico para detectar y diferenciar las
cepas/formas de leishmaniasis VL/PKDL, que comprenden cebadores
oligonucleotídicos noveles, un tampón de reacción, ADN polimerasa,
Taq polimerasa.
\vskip1.000000\baselineskip
Figura 1: Amplificación por PCR del ADN de
varias cepas de Leismania donovani que causan VL y PKDL. Los
carriles describen lo siguiente: Carril A representa los marcadores
de peso molecular, PKDL (carril b, cepa RMP-240;
carril C, cepa RMP-142; Carril D, cepa
RMP-155, Carril E, cepa RMP-19); y
cepas de Leishmania donovani que causan enfermedades
viscerales (Carril F, DD-8 (cepa de referencia de la
OMS); Carril G, cepa RMR-1, Carril H, cepa
KE-16, Carril I, UR-6]; Carril J es
una muestra clínica (sangre) de un paciente positivo para
Leishmaniasis visceral, Carril K, una muestra de ADN de un humano
sano y carril L, es una muestra de sangre a partir de un paciente
con infección CMV (Testigo de la enfermedad).
\vskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, el presente invento
proporciona cebadores oligonucleotídicos nuevos para la
amplificación del gen relacionado con la quinesina de la especie de
Leishmania seleccionado a partir de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2,
SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4, en el que los cebadores
oligonucleotídicos nuevos son diseñados basados en la región
repetida en tándem del gen relacionado con la quinesina de la
especie de Leishmania.
El presente invento también proporciona un
método basado en la amplificación de la región repetida en tándem
del gen relacionado con la quinesian a partir de diversas cepas de
L. Donaban usando los cebadores (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3 y SEQ ID NO: 4) para detectar y diferenciar las cepas de
leishmania que causan leishmaniasis visceral (VL) y leishmaniasis
dérmica post kala-azar (PKDL). El invento
proporciona un método usando PCR multiplex para detectar y
diferenciar las cepas de Leishmania donovani que causan
leishmaniasis visceral (VL) y leishmaniasis dérmica post
kala-azar (PKDL) en una muestra, que comprende
aislar ADN a partir de una muestra; amplificar la región diana a
partir del ADN usando cebadores oligonucleotídicos nuevos y ADN
polimerasa estable al calor para obtener fragmentos amplificados;
separar los fragmentos amplificados y analizar los fragmentos para
detectar y diferenciar las cepas de Leishmania donovani que
causan VL y PKDL basadas en el patrón de bandas de los fragmentos
amplificados. Además, el presente invento proporciona un kit
diagnóstico para la detección y diferenciación de las cepas de
Leishmania donovani que causan VL y PKDL.
\vskip1.000000\baselineskip
En concordancia, el presente invento proporciona
cebadores oligonucleotídicos nuevos para la amplificación del gen
relacionado con la quinesina de la especie Leishmania seleccionados
a partir de la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO.3 y SEQ ID NO:
4.
Una realización del presente invento proporciona
un método para detectar y diferenciar las cepas de Leishmania
donovani que causan leishmaniasis visceral (VL) y leishmaniasis
dérmica post kala-azar (PKDL), dicho método
comprende las etapas de:
- a)
- aislar ADN de la muestra
- b)
- amplificar la región diana a partir del ADN de la etapa (a) usando cebadores oligonucleotídicos nuevos que tiene la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y ADN polimerasa estable al calor para obtener fragmentos amplificados;
- c)
- separar los fragmentos amplificados de la etapa (b); y
- d)
- analizar los fragmentos de la etapa (c) para detectar y diferenciar las cepas de Leishmania donovani que causan VL y PKDL basadas en el patrón de bandas de los productos amplificados.
\vskip1.000000\baselineskip
Otra realización del presente invento
proporciona un método en el que la muestra para la detección es
seleccionada a partir de muestras clínicas o bien muestras de
cultivo.
Otra realización más del presente invento
proporciona un método en el que la muestra para detección es
seleccionada de un grupo que consiste en sangre, aspirado de médula
ósea, biopsia de médula ósea, aspirado de bazo, biopsia de bazo,
aspirado de hígado, biopsia de hígado, aspirado de nódulo linfático,
biopsia de nódulo linfático, raspado de piel, biopsia de fisura y
otros materiales tisulares.
Aún otra realización del presente invento
proporciona un método en el que el uso de ADN polimerasa estable al
calor preferiblemente Taq polimerasa y la amplificación son llevados
a cabo por una reacción en cadena de la polimerasa.
Otra realización del presente invento
proporciona un método en el que la separación de productos
amplificados es mediante electroforesis en gel y la detección de los
productos amplificados es por bromuro de etidio u otras tinciones de
ADN.
Una realización adicional del presente invento
proporciona un kit para la detección y diferenciación de cepas de
Leishmania donovani que causan VL y PKDL, que comprenden
cebadores oligonucleotídicos que tienen la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, tampón de reacción, polimerasa Taq,
marcador de ADN, una muestra de testigo positivo, una muestra de
testigo negativo y un manual de instrucciones.
El presente invento se refiere a un método para
la detección de Leishmaniasis en el que lo parásitos protozoicos del
género Leishmania son los agentes causantes de la leismaniasis
visceral (VL), también llamada kala-azar (KA). KA es
una infección sintomática del hígado, bazo y médula ósea causada por
organismos del complejo Leishmania donovani. PKDL
(leishmaniasis post kala-azar dérmica) es una
dermatosis inusual que se desarrolla como una secuela de KA,
produciendo lesiones cutáneas extensas en la forma de máculas
hipopigmentadas, eritema y nódulos. la enfermedad es relativamente
común en el subcontinente indio y menos frecuente en África
Oriental, pero excepcional en los continentes Americanos y Europeos.
La detección y caracterización de Leishmania a partir de pacientes
tanto de KA como de PDKL es importante para decidir los regímenes de
tratamiento así como para comprender la epidemiología de la
enfermedad. En muchos pacientes las manifestaciones dérmicas son
vistas incluso cuando los pacientes nunca tienen la forma visceral
por tanto el término leishmaniasis dérmica post
kala-azar es un término equivocado. Se ha visto
también que ningún paciente kala-azar ha
desarrollado nunca PKDL una vez que ha migrado a un área endémica no
PKDL tras el tratamiento para kala-azar. Por lo
tanto, el solicitante propone una hipótesis que las cepas de
Leishmania donovani que causan VL y PKDL son diferentes. para
elucidar la hipótesis propuesta, el solicitante diseñó y estandarizó
con éxito una Alu-PCR y sus cebadores para
diferenciar entre estas dos cepas.
El presente invento proporciona un método de
amplificación por PCR único para amplificar el gen relacionado con
la quinesina de diferentes aislados indios de Leishmania
donovani. Este ha sido desarrollado por el solicitante para
analizar diferencias genéticas de las cepas que causan VL y PKDL en
base al número y tamaño de las bandas como resultado del ensayo de
PCR. El ensayo de PCR para la detección y diferenciación entre las
cepas de Leishmania donovani que causan leishmaniasis
visceral y cepas que causan leishmaniasis dérmica post
kala-azar fue desarrollado usando los siguientes
grupos de cebadores de PCR:
\vskip1.000000\baselineskip
El invento proporciona además un método para
diferenciar las cepas VL y PKDL usando los grupos de cebadores
anteriores que tiene la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y
SEQ ID NO: 4, que son diseñados en base al consenso, las secuencias
de 117pb repetitivas en el gen relacionado con la quinesina de la
cepa MHOM/IN/DD8 de Leishmania donovani. El presente invento
enseña métodos mejorados para la diferenciación de cepas de
Leishmania donovani que causan VL y PKDL basado en la
amplificación por PCR del gen relacionado con la quinesina.
El presente invento está descrito a
continuación. Aunque métodos similares o equivalente a los descritos
aquí pueden ser usados en la práctica o ensayo del presente invento,
los métodos preferidos y materiales son descritos a continuación.
Los materiales, métodos, y ejemplos son solamente ilustrativos y no
pretenden ser limitantes. Otras características y ventajas del
invento serán aparentes a partir de la descripción detallada, y a
partir de las reivindicaciones.
\vskip1.000000\baselineskip
los parásitos fueron inicialmente aislados como
Promastigotos en un medio Novy-Mac Neal Nicolle
(NNN) [Sundar, y otros, 2002] a partir de las muestras
clínicas de los pacientes con leshmaniasis dérmica
Kala-azar y post Kala-azar y
posteriormente adaptado para crecer a 25ºC en un medio 199 que
contiene 10% FCS inactivado por calor. Para el mantenimiento
rutinario, las muestras del inóculo que contienen los parásitos
fueron introducidos asépticamente en los tubos de cultivo con 4 ml
del medio 199 [Sundar y otros, 2002] complementado con 10%
de FCS. Los tubos fueron colocados en una incubadora enfriada a 25ºC
y el crecimiento fue monitorizado a intervalos regulares mediante
microscopía. Para el cultivo en masa del parásito, las muestras del
inóculo que contenían parásitos fueron introducidas asépticamente
en 200 ml del M199 que contiene 10% de FCS en un frasco de cultivo
de tejido de 500 ml e incubado en una incubadora enfriada a 25ºC
hasta la mitad de la fase log (7-10 días). Los
parásitos fueron luego recogidos y usados para el aislamiento de ADN
nuclear.
\vskip1.000000\baselineskip
Las cepas VL y PKDL, como se describen aquí
fueron aisladas de diversas partes de la India (Tabla 1) y
mantenidas en un medio 199 complementado con 10% de suero de ternera
fetal y la propagación del cultivo en masa para el aislamiento del
ADN para PCR fue hecha en un medio 199 con 5% de FCS +5% de orina
humana (hembra post menopáusica) y los frascos de cultivo incubados
con agitación entre 17-20ºC en una incubadora
BOD.
Los parásitos en su fase log media fueron
recogidos mediante centrifugación a 5000 rpm en una centrifugadora
refrigerada. El ADN nuclear parásito fue aislado siguiendo el
protocolo estándar [Lu H.G y otros, 1994] con modificaciones
menores. Aproximadamente 1-5 x 10^{9}
promastigotos fueron lisados en 10 volúmenes de tampón de lisis
(NaCl 100 mM, Tris-HCl 10 mM (pH 8,0), EDTA 10 mM,
100 \mug de Proteinasa K/ml, Sarcosyl 1,5%) a 60ºC durante 3
horas. Las redes de ADN cinetoplasto fueron sedimentadas por
centrifugación a 27.000 X g durante 1 hora y resuspendidas en un
tampón TE 10 mM (Tris-HCl (pH 8.0), 1 mM EDTA (pH
8.0)). El ADN nuclear fue aislado de los sobrenadantes sobrantes
después de la sedimentación del ADN cinetoplasto. Estos
sobrenadantes fueron incubados durante toda la noche para una
digestión adicional de las proteínas a 65ºC. El ADN nuclear fue
sujeto a varios ciclos de extracciones de fenol/cloroformo por
adición de un volumen igual a la mezcla de fenol/cloroformo,
mezclado completamente seguido por la sedimentación por
centrifugación a 5000 rpm durante 15 minutos. El ADN nuclear fue
precipitado por adición de 1/10 del volumen de acetato de sodio 3 M
y 2 volúmenes de 100% de etanol bien mezclado e incubado a -20ºC
durante 1 hora. La mezcla fue sedimentada por centrifugación a 5000
rpm durante 30 minutos a 4ºC. La precipitación fue lavada con 70% de
etanol, secada y resuspendida en un tampón TE. La concentración y
pureza del ADN fueros medidas tomando la DO a 260/280 nm. El ADN fue
también comprobado usando electroforesis de gel de agarosa usando
el ADN estándar como marcador para la cuantificación. El ADN fue
almacenado a -70ºC hasta su uso.
El ADN de las muestras clínicas es extraído por
adición de 300 \mul de la sangre entera de un paciente al RBC o a
una disolución de tejido de lisis en un tubo de Microfuga de 1,5 ml
seguido por la mezcla e incubación a temperatura ambiente durante
30 minutos y el tratamiento dado con una disolución de lisis de ADN
genómico, y centrifugado a 12.000 rpm durante 5 minutos, eliminado
todo cuidadosamente excepto 30-50 \mul del
sobrenadante y al sobrenadante se le añaden 200 \mul de Matrix
Instagene (Bio-Rad, USA) al tubo, después de la
incubación a 56ºC durante 30 minutos, los contenidos fueron
agitados con vórtex a alta velocidad durante 10 segundos,
calentados a 100ºC en un bloque de calor durante 5 minutos, agitados
con vórtex de nuevo y finalmente recentrifugados a 12.000 rpm
durante 5 minutos, 20 \mul del ADN aislado del sobrenadante fueron
cogidos para PCR.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de PCR fue estandarizado usando el ADN
aislado de los cultivos VL y PKDL causando cepas de Leishmania
donovani. El ensayo de PCR fue adicionalmente llevado a cabo
usando la muestra de sangre entera de los pacientes de
Leishmania donovani para la estandarización. La amplificación
por PCR fue llevada a cabo usando los cuatro cebadores
oligonucleótidos nuevos a saber SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Los detalles de los cebadores son dados a
continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo puede ser llamado ensayo de PCR
multiplex. Los cebadores nuevos fueron diseñados basados en la
región repetitiva consenso de 117 pb del gen relacionado con la
quinesina de Leishmania donovani. El método de amplificación
por PCR del presente invento fue basado en los datos de la
estructura concerniente y la organización de los elementos
repetitivos en el genoma humano y tiene similitudes con las
secuencias en las especies Leishmania y de ahí que sea
llamado PCR Alu [Piarrous R y otros, 1993]. Se ha observado
que los cebadores originados de las secuencias repetitivas
reconocen y diferencian el locus de una manera específica en base al
tamaño del elemento repetitivo presente en las especies, que varía
en sus tamaños debido a las secuencias intrónicas (regiones no
codificantes).
Los cebadores oligonucleótidicos nuevos que
tienen la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4
fueron diseñados basados en la secuencia repetitiva consenso de 117
pb del gen relacionado con la quinesina de la cepa Leishmania
donovani MHOM/IN/DD8. Todos los cuatro cebadores (SEQ ID NO: 1,
SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4) fueron empleados en el
ensayo de PCR para la detección del Leishmaniasis usando la
estrategia de PCR multiplex.
La amplificación por PCR del gen relacionado con
la quinesina de diferente aislado de la India de L. donovani
y las muestras clínicas positivas para Leishmaniasis
(serológicamente positivo) fueron llevadas a cabo siguiendo el
método desarrollado exclusivamente por el solicitante usando los
cebadores nuevos que tienen la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Estos cebadores fueron diseñados únicamente
basados en el fragmento 117 pb del gen relacionado con la quinesina
para amplificar la región repetida del gen relacionado con la
quinesina. Los productos amplificados PCR fueron sometidos a
electroforesis en un gel de agarosa de 2,0% al 2,5% y teñidos con
bromuro de etidio. Los productos fueron visualizados bajo un
transiluminador de UV (UVP) para la identificación del patrón de
bandas.
El presente invento enseña un método para la
detección de cepas de Leishmania donovani que causan VL y
PKDL basado en los cebadores oligonucleótidos nuevos diseñados para
la amplificación del gen relacionado con la quinesina. Este método
está basado en la amplificación por PCR multiplex y emplea cuatro
cebadores (SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4)
en una mezcla de reacción simple. Los productos amplificados por
PCR fueron resueltos mediante electroforesis en gel y detectados por
métodos estándar. Los patrones de bandas de las diversas muestras
fueron analizados para la detección de cepas de Leishmania
Donovan que causan VL y PKDL.
\newpage
El procedimiento detallado del ensayo PCR se
da a continuación:
El ensayo por PCR fue llevado a cabo en una
mezcla de reacción de 50 \mul para las diversas muestras para la
detección de las cepas de Leishmania donovani que causan VL y
PKDL.
Cada 50 \mul de la mezcla de reacción contiene
100 \mug del ADN nuclear (aislado de las muestras), 200 \muM de
cada desoxirribonucleótido trifosfato (dNTPs), 1,5 unidades de ADN
polimerasa Taq, 5 \mul de 10 X tampón de PCR (100 mM TAPS (pH
8,8), 15 mM MgCl_{2}, 500 mM KCl y 0,1% de gelatina). La mezcla de
la reacción fue incubada a 94ºC de temperatura durante 5 min antes
de comenzar los ciclos de amplificación por PCR. Las temperaturas
usadas para los ciclos de amplificación fueron de 94ºC durante 60s,
52ºC durante 60s, 72ºC durante 60s. Esto fue llevado a cabo para
los ciclos 25-36 seguidos por extensión a 72ºC
durante 10 min. Los productos amplificados por PCR fueron sometidos
a electroforesis en gel de agarosa de 2,0% a 2,5%, teñidos con
bromuro de etidio y visualizados en un transiluminador de UV para
detectar el patrón de bandas de los productos de las diversas
muestras ensayadas.
El patrón de bandas de los productos de ADN
amplificados fue diferente para el VL y PKDL que causa cepas como
se observa en la Figura 1. Un patrón de bandas a escala fue obtenido
para ambas cepas VL y PKDL, sin embargo el patrón de bandas fue
diferente para ambas cepas. El número de productos amplificados
varió de 8-10 para las cepas que causan VL mientras
que las bandas eran 6-8 para las cepas que causa
PKDL, como se muestra en la Figura 1.
Todos los cuatro cebadores fueron usados para la
amplificación de la concentración equimolar en una mezcla de
reacción por PCR simple. Se ha observado que los cebadores
originados de las secuencias repetitivas reconocen un locus en una
manera específica, asimismo los cebadores SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO:
2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 se unen en una manera específica de
cepa. Los productos amplificados muestran un patrón de bandas
distinto para las cepas que causan VL y PKDL, en el que el número
de bandas para las cepas VL fue de 8-10 mientras
que para las cepas PKDL fueron detectadas 6-8
bandas. La mayoría de los productos amplificados de PCR estuvieron
en el intervalo de tamaño de 0,2-2,0 kb después de
la amplificación por PCR de las cepas VL mientras que en el caso de
las cepas PKDL los productos amplificados estuvieron en el intervalo
de 0,2 a 1,2 kb en longitud.
La bandas de los productos amplificados mostró
un patrón de bandas distinto para las cepas VL y las cepas PKDL, en
el que el número de bandas para las cepas VL fue de
8-10 y para las cepas PKDL de 6-8.
Un patrón de bandas representativo de los productos amplificados
PCR está descrito en la Figura 1. La Figura 1 muestra claramente
diferencias en el patrón de bandas entre las cepas que causan PKDL y
el VL. Basado en el patrón de bandas de los productos amplificados
de las cepas de Leishmania de los pacientes
kala-azar (Leishmaniasis visceral, VL) se mostraron
más bandas como se comparó con las bandas amplificadas de las cepas
que causan PKDL. Las bandas fueron amplificadas en el intervalo de
0,2 a 2,0 kb en las cepas VL que son, a saber, del tamaño de 2,0
kb, 1,4 kb, 1,0 kb, 0,7 kb, 0,6 kb, 0,45 kb y 0,4 kb. Bandas débiles
fueron también detectadas alrededor de 0,2 kb. Una señal intensa
fue observada en todos estos carriles (VL) alrededor de
0,45-0,4 kb. Esto puede ser debido a la presencia
de bandas dobles. Esta banda prominente del tamaño de 0,45 kb estuvo
ausente de las cepas PKDL (Fig 1).
En el caso de las cepas que causan PKDL
(Leishmaniasis dérmica de Bihar), el número de bandas PCR fue
significativamente menor. El número estaba entre las
6-8 bandas. Todos los productos amplificados por PCR
(vistos como bandas en la Fig. 1) fueron observados en el rango de
0,20-1,2 kb. Entre estos los más prominentes fueron
las bandas de tamaños 1,2 Kb, 0,85 Kb, 0,8 Kb, 0,6 Kb, 0,4 Kb y
0,36 kb. Una banda débil alrededor de 0,2 Kb fue observada en las
cepas PKDL (Fig 1). La banda en 0,85 mostró una señal intensa y
puedo ser un doblete de dos bandas de tamaño 0,85 y 0,8 Kb.
Significativamente esta banda prominente estuvo ausente en las cepas
VL. Además, los testigos negativos fueron incluidos en el ensayo
por PCR usando los mismos cebadores y las condiciones de PCR. Estos
están representados en la Figura 1 (véase los carriles K y L). Los
testigos son muestras de ADN de humanos sanos (vía K) y muestras de
ADN humano infectado con CMV (vía L). Un frotis Av ya que se tomó un
exceso en cantidad de ADN (plantilla) para el análisis.
Después de describir los cebadores para
diferenciar las dos cepas causantes del Leishmania, el
solicitante encontró que las manifestaciones dérmicas de
Leishmaniasis en Bihar y las áreas cercanas son debidas a la
hibridación in vivo y el desarrollo de cuasi especies. Este
invento quiere ayudar a la identificación del organismo y sus
enfermedades asociadas, si causa alguna forma de VL y PKDL cuando la
fuente de aislamiento no es conocida. Este invento también ayudará
en la identificación de la cepa específica y localizará la fuente
de infección (reservorio) problema que ha permanecido sin resolver
en la India hasta la fecha.
Estos resultados, también sugieren que los
agentes que causan el VL y el PKDL son genéticamente diferentes. Los
siguientes factores necesitan consideración, a saber:
1.) PKDL que se considera que es la secuela de
la infección con Leishmania donovani.
2.) La presencia del gen relacionado con la
quinesina conservado solo en las especies visceralizantes pero
pequeñas diferencias genotípicas entre el VL y el PKDL aislado
suponen que, el PKDL puede ser debido a la recombinación entre las
dos especies de Leishmania que
co-infectan el mismo hospedante y luego evolucionan
a una nueva cepa que causa el PKDL.
\vskip1.000000\baselineskip
El uso de PCR multiplex usando los cebadores de
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 es para la
detección de la infección por Leishmania donovani y para
diferenciar las cepas si estas causaran forma visceral de
Leishmaniasis (kala-azar) o una forma dérmica de
Leishmaniasis en Bihar conocida comúnmente como PKDL.
El invento está ilustrado además con los
Ejemplos siguientes y estos Ejemplos no pretenden limitar el alcance
del invento.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parásitos fueron aislados inicialmente como
promastigotos en un medio NNN a partir de las muestras clínicas de
Kala-azar y de los pacientes de Leishmaniasis
dérmica post Kala-azar y adaptados posteriormente
para crecer a 25ºC en un medio 199 que contiene 10% de FCS
inactivado por calor. Para el mantenimiento rutinario, las muestras
de los parásitos que contienen inóculo fueron introducidas
asépticamente en tubos de cultivo con 4 ml del medio 199
complementado con 10% FCS. Los tubos fueron colocados en una
incubadora enfriada a 25ºC y el crecimiento fue monitorizado a
intervalos regulares por microscopia. Para el cultivo en masa del
parásito, las muestras de los parásitos que contienen inóculo fueron
introducidas asépticamente en 200 ml de M199 que contienen 10% de
FCS en un frasco de cultivo de 500 ml de cultivo e incubadas en una
incubadora enfriada a 25ºC hasta una fase log media
(7-10 días). Los parásitos fueron luego recogidos y
usados para aislamiento de ADN nuclear.
\vskip1.000000\baselineskip
Los parásitos en su fase log media fueron
recogidos por centrifugación a 5000 rpm en una centrifugadora
refrigerada. El ADN nuclear parásito fue aislado siguiendo el
protocolo estándar [Lu H.G, y otros, 1994] con
modificaciones menores. Aproximadamente 1-5 X
10^{9} promastigotos fueron lisados en 10 volúmenes de tampón de
lisis (NaCl, 100 mM, Tris-HCl, 10 mM (pH 8,0), 10 mM
EDTA, Proteinasa K/ml 100 \mug, Sarcosyl 1,5%) a 60ºC durante 3
horas. Las redes de ADN cinetoplasto fueron sedimentadas por
centrifugación a 27.000 X g durante 1 hora y resuspendidas en un
tampón TE (Tris-HCl (pH 8,0) 10 mM, EDTA (pH 8,0) 1
mM). El ADN nuclear fue aislado de los sobrenadantes restantes
después de la sedimentación del ADN cinetoplasto. Estos
sobrenadantes fueron incubados durante toda la noche para una
digestión adicional de las proteínas a 65ºC. El ADN nuclear fue
sujeto a diversos ciclos de extracciones de fenol/cloroformo por
adición de un volumen igual de mezcla fenol/cloroformo, mezclando
rigurosamente seguido por sedimentación por centrifugación a 5000
rpm durante 15 minutos. El ADN nuclear fue precipitado por adición
de 1/10 de volumen de 3 M de acetato de sodio y 2 volúmenes de 100%
de etanol bien mezclado e incubado a -20ºC durante 1 h. La mezcla
fue sedimentada por centrifugación a 5000 rpm durante 30 minutos a
4ºC. El precipitado fue lavado con 70% de etanol, secado y
resuspendido en un tampón TE. La concentración y pureza del ADN fue
medida tomando la DO a 260/280 nm. El ADN fue almacenado a -70ºC
hasta su uso.
\vskip1.000000\baselineskip
El ensayo de PCR fue llevado a cabo usando el
ADN aislado (el Ejemplo 2 da detalles para el aislamiento del ADN)
de las diversas cepas como se dan en la Tabla 1. La amplificación
por PCR fue llevada a cabo usando los cuatro cebadores
oligonucleótidos nuevos, a saber SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID
NO: 3 y SEQ ID NO: 4. Los cebadores nuevos fueron diseñados basados
en la región repetitiva consenso de 117 pb del gen relacionado con
la quinesina de Leishmania donovani. El ensayo de PCR también
puede ser llamado PCR multiplex. Los detalles de los cebadores se
dan a continuación.
\vskip1.000000\baselineskip
Cada 50 \mul de mezcla de la reacción contiene
100 ng de ADN nuclear (aislado de las muestras), 200 \muM de cada
desoxirribonucleótido trifosfato (dNTPs), 1,5 unidades de polimerasa
de ADN Taq, 5 \mul de 10 X tampón PCR (100 mM TAPS (pH 8,8), 15
mM MgCl_{2}, 500 mM KCl y 0,1% de gelatina). La mezcla de la
reacción fue incubada a 94ºC de temperatura durante 5 min antes de
comenzar los ciclos de amplificación por PCR. Las temperaturas
usadas para los ciclos de amplificación fueron de 94ºC durante 60s,
52ºC durante 60s y 72ºC durante 60s. Esto fue llevado a cabo para
los ciclos 35-36 seguidos por extensión a 72ºC
durante 10 min. Los productos amplificados por PCR fueron sometidos
a electroforesis en geles de agarosa de 2% a 2,5%, teñidos con
bromuro de etidio y visualizados en un transiluminador de UV para
detectar el patrón de bandas de los productos de las diversas
muestras ensayadas.
Todos los cuatro cebadores fueron usados para la
amplificación a una concentración equimolar en una mezcla de
reacción de PCR multiplex simple. Se ha observado que en ciertas
condiciones, los cebadores originados de las secuencias repetitivas
reconocen un locus en una manera específica, asimismo los cebadores
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 se unen en
una manera específica de cepa. Las bandas de los productos
amplificados mostraron un patrón de bandas distinto para las cepas
VL y las cepas PKDL, en el que el número de bandas par las cepas VL
fueron 8-10 y para las cepas PKDL
6-8 bandas fueron detectadas. La mayoría de los
productos amplificados estaban en el intervalo de tamaño de
0,2-2,0 kb en las cepas VL mientras que en las
cepas PKDL las bandas estaban en el intervalo de bandas entre
0,20-1,2 kb. Esto se muestra en la Figura 1 y los
detalles se dan en la descripción a continuación. Basado en el
patrón de bandas después de la amplificación, queda claro que las
cepas de Leishmania donovani que causan VL y PKDL pueden ser
diferenciadas. De la Fig. 1, queda claro que 2 bandas de peso
molecular 1,4 Kb y 2,0 kb son amplificadas en las muestras que son
de las cepas que causan VL, pero están ausentes en las cepas de
Leishmania donovani que causan PKDL. Otra diferencia
importante observada en la Fig.1 es la presencia de una banda
prominente con una señal fuerte en las cepas de VL de alrededor de
0,45 kb, que está ausente en las cepas PKDL. Asimismo, una banda
prominente con una señal fuerte alrededor de 0,8 kb está presente
en las cepas PKDL que está ausente en las cepas VL. Estas
diferencias en el patrón de bandas pueden ser usadas para
diferenciar entre las cepas de Leishmania donovani que causan
VL y el PKDL.
El ADN de las muestras clínicas es extraído
añadiendo 25 \mul de sangre entera de un paciente a 1 ml de agua
destilada esterilizada en un tubo de Microfuga de 1,5 ml seguido por
la mezcla e incubación a temperatura ambiente durante 30 minutos,
centrifugado a 12.000 rpm durante 5 minutos, eliminado todo
cuidadosamente excepto 30-50 \mul del
sobrenadante y al tubo se le añaden 200 \mul de Matrix Instagene
(Bio-Rad, USA), después de la incubación a 56ºC
durante 30 minutos, los contenidos son agitados con vórtex a alta
velocidad durante 10 segundos, calentados a 100ºC en un bloque de
calor durante 5 minutos, agitados con vórtex de nuevo y finalmente
recentrifugados a 12.000 rpm durante 5 minutos, 20 \mul del ADN
aislado del sobrenadante fueron tomados para PCR. Además, en el
experimento 100-150 ng del ADN nuclear de los
diferentes aislados fueron amplificados durante 36 ciclos en 50
\mul de mezclas de la reacción, conteniendo cada uno, 200 \muM
de cada desoxirribonucleótido trifosfato (dNTPs), 1,5 unidades de
ADN polimerasa Taq (Perkin Elmer) y 5 \mul de 10 X tampón de PCR
(100 mM TAPS (pH 8,8), 15 mM MgCl_{2}, 500 mM KCl y 0,1% de
gelatina). La concentración de trabajo de cada cebador fue de 0,5
\muM. Los ciclos de temperatura usados fueron de 94ºC durante 10
min, 94ºC durante 60s, 52ºC durante 60s, 72ºC durante 60s seguidos
por 72ºC durante 10 min. Los productos de PCR fueron sometidos a
electroforesis en geles de agarosa de 1,5% a 2,5%, teñidos con
bromuro de etidio y visualizados en un transiluminador de UV. Los
datos obtenidos de este ensayo fueron similares a los datos
obtenidos como se muestra en el Ejemplo 3. Los productos
amplificados mostraron un patrón de bandas distinto de las bandas de
las cepas que causan VL y PKDL, en los que el número de bandas de
VL fueron de 8-10 mientras que para las cepas PKDL
se detectaron de 6-8. La mayoría de los productos
amplificados por PCR estaban en el intervalo de tamaño de
0,2-2,0 kb después de la amplificación por PCR de
las cepas VL mientras que en el caso de las cepas PKDL los productos
amplificados estaban en el intervalo de longitud de 0,20 a 1,2
kb.
1. Attar ZJ, Chance ML.
el-Safi S, Carney J, Azazy A,
El-Hadi M, Dourado C, Hommel M.
2001. Latex agglutination test for the detection of urinary
antigens in visceral leishmaniasis. Acta Trop 78 (I)
11-6.
2. Badaro. R.,D. Benson. M.C.
Eulalio, M. Freire, S. Cunha, E. M.
Netto, D. Pedral-Sampaio, C.
Madureira, J. M. Burns, R. L. Houghton, J. R.
David, and S. G. Reed, 1996 r K39: a cloned
antigen for Leishmania Chagasi that predicts active visceral
leishmaniasis. J. Infect. Dis.
173:758-761.
3. Belli A, Rodríguez B,
Aviles H and Harris E. Simplified Polymerase Chain
Reaction detection of new world Leishmania in clinical
specimen of cutaneous leishmaniasis. Am. J. Trop. Med. Hyg.
58 (1), 102-109 (1998).
4. Bora D. 1999. Epidemiology of
visceral leishmaniasis in India. Natl Med J India. 12
(2):62-8.
5. Burns JM Jr, Shreffler WG,
Benson DR, Ghalib HW, Badaro R, Reed SG.
1993. Molecular characterization of a
kinesin-related gene antigen of Leishmania chagasi
that detects specific antibody in African and American visceral
leishmaniasis. Proc Natl Acad Sci, USA.
90(2):775-9.
6. Chiurillo MA, Sachdeva M,
Dole VS, Yepes Y, Miliani E, Vazquez L.
2001. Detection of Leishmania causing visceral leishmaniasis
in the old and new worlds by a polymerase Chain reaction assay based
on telomeric sequences. Am. J. Trop. Med. Hyg. 65 (5),
573-82.
7. Davidson RN. 1998. Practical
guide for the treatment of leishmaniasis. Drugs.
56(6):1009-18.
8. Desjeux P. 2001. The increase
in risk factors for leishmaniasis worldwide. Trans R Soc Trop Med
Hyg. 95(3):239-43.
9. Da Silva ES, Gontijo CM,
Pacheco Rda S, Brazil RP Diagnosis of human visceral
leishmaniasis by PCR using blood samples spotted on filter paper.
Genet. Mol. Res. 3 (2), 251-257
(2004).
10. El Tai NO, El Fari M,
Mauricio I, Miles MA, Oskam L, El Safi
SH, Presber WH, Schonian G. 2001. Leishmania
donovani: intraspecific polymorphisms of Sudanese isolates revealed
by PCR-based analyses and DNA sequencing. Exp
Parasitol. 97(1), 35-44.
11. Gari-Toussaint, M.,
Lelievre, A., Marty, P.,
Le-Fichoux, Y. 1994. Contribution of
serological tests to the diagnosis of visceral leishmaniasis in
patients infected with the human immunodeficiency virus. Trans.
R. Soc. Trop. Med. Hyg. 88(3):301-2.
12. Harris F. Kropp G,
Belli A, Rodríguez B and Agabian N.
Single-Step Multiplex PCR Assay for Characterization
of New World Leishmania Complexes. J. Clinical.
Microbiol. 36(7), 1989-1995
(1998).
13. Herwaldi BL. 1999,
Leishmaniasis. Lancet.
354(9185):1191-9.
14. LU HG, Zhong L, Guan
LR, Qu JQ, Hu XS, Chai JJ, Xu ZB,
Wang CT, Chang KP. Separation of Chinese Leishmania
isolates into five genotypes by kinetoplast and chromosomal DNA
heterogeneity. Am J Trop Med Hyg. 1994 Jun;
50(6):763-70.
15. Maalej lA, Chenik M,
Louzir H, Ben Salah A, Bahloul C, Amri
F, Dellagi K. 2003. Comparative evaluation of ELISAs
based on ten recombinant or purified Leishmania antigens for the
serodiagnosis of mediterrean visceral lesihmaniasis. Am J Trop
Med Hyg; 68(3): 312-20.
16. Manson-Bahr PEC.
Diagnosis. 1987. In the Leishmaniases in Biology and
Medicine, vol. 2, Clinical Aspects and Control. W Peters & R
Killick-Kendrick (eds). New York, Academic Press
Inc.: p.709-729.
17. Martin SK,
Thuita-Harm L,
Adoyo-Adoyo M, Wasunna KM.
1998. A diagnostic ELISA for visceral leishmaniasis, based on
antigen from media conditioned by Leishmania donovani
promastigotes. Ann Trop Med Parasitol.
92(5):571-7.
18. Monroy Ostria &
Sanchez-Tezeda G. 2002. Molecular
probes and the polymerase chain reaction for detection and typing of
Leishmania species in México. Trans R Soc Trop Med Hyg. 96
(Suppl 1), S101-4.
19. Piarroux R, Azaiez R,
Lossi A. M, Reynier P, Muscatelli,
Gambarelli F, Fontes M, Dumon H and
Quilici M. 1993. Isolation and characterization of a
repetitive DNA sequence from Leishmania infantum: development of a
visceral leishmaniasis polymerase chain reaction. Am J Trop Med
Hyg. 49(3): 364-9.
20. Pizzuto M, Piazza M,
Senese D. 2001. Role of PCR in diagnosis and prognosis
of visceral leishmaniasis in patients co-infected
with human immunodeficiency virus type-1. J Clin
Microbiol; 39(1), 357-361.
21. Raj VS, Ghosh A, Dole
VS, Madhubala R, Myler PJ, Stuart KD.
1999. Serodiagnosis of leishmaniasis with recombinant ORFF
antigen. Am J Trop Med Hyg. 61(3):
482-7.
22. Rajasekariah GH, Ryan JR,
Hillier SR, Yi LP, Stiteler JM, Cui L,
Smithyman AM, Martin SK. 2001. Optimization of
an ELISA for the serodiagnosis of visceral leishmaniasis using in
vitro derived promastigote antigens. J Immunol Methods.
252(1-2):105-19.
\newpage
23. Sassi A, Louzir H, Ben
Salah A, Mokni M, Ben Osman A, Dellagi K.
1999. Leishmanin skin test lymphoproliferative responses and
cytokine production after symptomatic or asymptomatic Leishmania
major infection in Tunisia. Clin Exp Immunol.
116(1): 127-32.
24. Schalling HD, Schoone GJ,
Kroon CC, Hailu A, Chappuis F, Veeken H.
2001. Development and application of "simple" diagnostic
tools for visceral leishmaniasis. Med Microbiol Immunol
(Berl). 190(1-2):69-71.
25. Schoone GJ, Hailu A,
Kroon CC, Nieuwenhuys JL, Schallig HD,
Oskam L 2001. A fast
agglutination-screening test (FAST) for the
detection of anti-Leishmania antibodies. Trans R
Soc Trop Med HYg. 95(4), 400-1.
26. Senaldi G,
Xiao-su H, Hoessli D.C, Bordier
C. 2001. Serological diagnosis of visceral leishmaniasis by a
dot-enzyme immunoassay for the detection of a
Leishmania donovani-related circulating antigen.
J Immunol Methods. 193:9-15.
27. Singh S and Sivakumar R.
2003. Recent advances in the diagnosis of leishmaniasis.
J. Postgrad. Med. 49(1):55-60.
28. Singh S,
Gilman-Sachs A, Chang KP. Reed
SG. 1995. Diagnostic and prognostic value of K39 recombinant
antigen in Indian leishmaniasis. J. Parasitol. 81
(6):1000-3.
29. Singh S, Kumari V,
Singh N. 2002. Predicting kala-azar
disease manifestations in asymptomatic patients with latent
Leishmania donovani infection by detection of antibody
against recombinant K39 antigen. Clin Diagn Lab Immunol.
9(3):568-72.
30. Singh S, Mohapatra DP,
Sivakumar R. 2000. Successful replacement of foetal
calf serum with human urine for in vitro culture of
Leishmania donovani. J. Commun Dis.
32(4):289-94.
31. Singh S. 1999. Diagnostic and
Prognostic markers of anti-Kala-azar
therapy and vaccination. IN:Proceeding of V Round Table Conference
Series. No.5 Gupta S & Sood OP (Ed). Ranbaxy Science Foundation,
New Delhi. Pp 95-114.
32. Sundar S, Rai M. 2002.
Laboratory diagnosis of visceral leishmaniasis. Clin Diagn Lab
Immunol. 9(5):951-8.
33. WHO expert committee report. Control of the
Leishmaniasis. 1991. Technical Report Series 793.
34. Williams, J. E. 1995,
Leishmania and Trypanosoma. In medical parasitology. A practical
approach. Gillespie, S. H., Hawkey, P.M., Eds, London, Oxford
University Press.
35. Wortman G, Sweeney C.
Houng H-S, Aronson N, Stiteler
J, Jachson J, Ockenhouse C. 2001. Rapid
diagnosis of Leishmaniasis by fluorogenic polymerase chain reaction.
Am J Trop Med Hyg; 65:583-87.
<110> All India Institute of medical
Science
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Oligonucleótidos para la detección
de Leishmaniasis y métodos de la misma
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> PCT002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> 1598/DEL/03
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2003-12-23
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> El cebador fue sintetizado en el
laboratorio
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipctagagcagc agcttcg
\hfill17
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<210> 2
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<211> 17
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<212> ADN
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<220>
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<223> El cebador fue sintetizado en el
laboratorio
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<400> 2
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\hskip-.1em\dddseqskipcttgagcagc agcttcg
\hfill17
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 3
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<211> 17
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<212> ADN
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<220>
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<223> El cebador fue sintetizado en el
laboratorio
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<400> 3
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\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgtggccctc gtgttct
\hfill17
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<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 17
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<212> ADN
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<213> Secuencia artificial
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<220>
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<223> El cebador fue sintetizado en el
laboratorio para su uso
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipcgcggccctc gtgtcct
\hfill17
Claims (9)
1. Un cebador oligonucleotídico que tiene una
secuencia seleccionada a partir de SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ
ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 para la amplificación del gen relacionado
con la quinesina de las especies Leishmania.
2. Un método para detectar y diferenciar las
cepas de Leishmania donovani que causan la Leishmaniasis
visceral (VL) y Leishmaniasis post kala-azar dérmica
(PKDL) en una muestra, dicho método comprende las etapas de:
- a)
- aislamiento de ADN de una muestra;
- b)
- amplificación de la región diana del ADN de la etapa (a) usando cebadores oligonucleotídicos que tienen la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4 y calientan la polimerasa de ADN estable para obtener fragmentos amplificados;
- c)
- separación de fragmentos amplificados de la etapa (b); y
- d)
- análisis de los fragmentos de la etapa (c) para detectar y diferenciar las cepas de Leishmania donovani que causan VL y PKDL basadas en el patrón de bandas de los fragmentos amplificados.
3. El método de la reivindicación 2, en el que
en la muestra de la etapa (a) es o bien una muestra clínica o una
muestra de cultivo.
4. El método de la reivindicación 3, en el que
la muestra clínica es seleccionada de un grupo que consiste en
sangre, aspirado de médula ósea, biopsia de médula ósea, aspirado
esplénico, biopsia esplénica, aspirado de hígado, biopsia de hígado,
aspirado de nódulo linfático, biopsia de nódulo linfático, trozos de
piel, biopsia de corte y otros materiales tisulares.
5. El método de la reivindicación 2, en el que
la ADN polimerasa estable al calor en la etapa (b) es una
polimerasa Taq.
6. El método de la reivindicación 2, en el que
la amplificación en la etapa (b) está hecha mediante la reacción de
la polimerasa en cadena.
7. El método de la reivindicación 2, en el que
la separación en la etapa (c) está hecha preferentemente mediante
electroforesis en gel.
8. El método de la reivindicación 2, en el que
la detección en la etapa (d) es por bromuro de etidio u otras
tinciones de ADN.
9. Un kit de diagnóstico para la detección y
diferenciación de las cepas de Leishmania donovani que causan
VL y PKDL, que comprende cebadores oligonucleotídicos identificados
por la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3 y SEQ ID NO: 4,
polimerasa Taq, marcador de ADN, una muestra testigo
positivo, una muestra testigo negativo y un manual de
instrucciones.
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