CN103290030A - 一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用。本发明在筛选一种结核分枝杆菌HtdY蛋白的基础上，建立了一种基因工程制备技术，可应用于结核病临床检测，是一个活性较强的B细胞目标抗原，用于结核病检测试剂盒的制备，具有操作简便，敏感性高而且安全可靠。

Description

一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用

技术领域

本发明属于临床免疫学诊断领域，特别涉及一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用。

背景技术

建立简便、快速和准确的结核病诊断技术对于结核病的防控十分重要。目前临床最为常用的结核病诊断方法仍然依靠传统的痰涂片细菌学检查，但检出率低；结核分枝杆菌（MTB）培养可做为结核病确诊的“金标准”，但其培养时间太长，一般4-6周，难以满足临床需要；X线和CT检查仅提供影像学可能性诊断；聚合酶链反应（PCR）技术及其它基因诊断方法作为临床诊断尚存在操作复杂，对技术和人员专业素质要求较高，且仍不能用于菌阴结核病的快速诊断。而MTB感染的血清免疫学诊断以其固有的操作简便、快速、可用肉眼判断结果、稳定性好、便于推广、无需特殊精密仪器等优势，是最可能满足经济不发达地区和结核病高发区所亟需的结核病诊断技术。

发明内容

为克服现有技术中的上述问题，本发明的一个目的是提供一种结核分枝杆菌重组HtdY蛋白，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

它来自结核分枝杆菌H37Rv。

本发明的另一目的在于提供所述重组HtdY蛋白在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。

HtdY蛋白是结核分枝杆菌生长过程中分泌的一种低分子量蛋白。本发明所使用的HtdY蛋白可以是来自采用本领域公知方法对结核分枝杆菌短期培养滤液进行分离纯化得到的全长序列蛋白，也可以从使用方便考虑，使用其中的一段，例如从全长蛋白中切割或者采用重组方法合成，例如在下文中的制备方法以及实施例中描述的重组方法制备得到的HtdY蛋白（得到的蛋白分子量在47.3kDa±0.3%范围内，等电点在5.1-5.2范围内（参见序列表中的SEQ ID NO: 2）

在一实施方式中，所述HtdY蛋白是具有全长度氨基酸序列的蛋白。

在另一实施方式中，所述HtdY蛋白是用基因重组法以结核分枝杆菌DNA为模板扩增出HtdY基因后克隆、表达得到，其氨基酸序列为SEQ ID No: 2, 通过使用pET32a质粒，在HtdY天然蛋白序列前面加了一段Trx·Taq和S·Taq融合标签及 His·Tag纯化标签。

本发明的另一目的在于提供所述结核分枝杆菌重组HtdY蛋白的制备方法，包括以下步骤：

  （1）结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；

  （2）HtdY基因的扩增；

  （3）HtdY基因插入表达质粒；

  （4）将构建的表达质粒转化入宿主细胞；

（5）诱导表达蛋白HtdY；

（6）分离纯化诱导表达产物，得到HtdY重组蛋白，

其中，在制备结核分枝杆菌HtdY基因中采用的引物为HtdY-F和HtdY-R，所述引物HtdY-F的核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示，所述引物HtdY-R的核苷酸序列如SEQ ID No: 4所示。

本发明的重组结核分枝杆菌HtdY蛋白的制备方法中，提供了一种新的重组质粒，即将HtdY基因序列插入商用表达质粒序列中。HtdY基因NCBI登录号为CP002992.1；蛋白号为： NP_217906.1。

本发明的“HtdY基因序列”也包括对CP002992.1中一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性，所以与CP002992.1核苷酸序列同源性低至约70%的简并序列也能编码相同的氨基酸序列。该术语还包括在中度严密条件下，更佳地在高度严密条件下与CP002992.1的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。该术语还包括与CP002992.1的核苷酸序列同源性至少70%，更佳地至少90%的核苷酸序列。

本发明的重组质粒，通常将HtdY基因插入表达质粒的多克隆位点处得到。

本发明的重组质粒在制备过程中，可选用本领域已知的各种载体，然后将编码本发明的核苷酸序列可操作性地连接于表达调控序列，从而形成蛋白表达载体。

本发明中可采用的载体包括且不仅限于pET32a。本发明的一个实施例中，所用的质粒为pET32a。

用作检测试剂的HtdY重组蛋白与NCBI上的NP_217906.1蛋白序列相比，加入了载体相关序列和纯化标签。例如，使用pET32a质粒时，蛋白序列后面加了pET32a上的相关序列和一段His Tag纯化标签。

所用的宿主细胞应当与表达质粒相匹配。可使用原核细胞或者真核细胞等，例如常用的大肠杆菌（E. coli）。用于转化的宿主细胞可以是BL21（DE3）或BL21 plysS（DE3）菌株等。本发明的一个实施例中所用的就是BL21 plysS（DE3）菌株。

上述制备方法中，各种实验参数均按常规操作选择，可视具体实验条件而定。

本发明的HtdY基因序列可以用PCR扩增法获得。可根据本发明所公开的相关核苷酸序列，尤其是开放阅读框序列来设计引物，并用本领域技术人员已知的常规方法所制备的基因组DNA为模板，扩增而得到相关序列。

本发明中，重组蛋白所用的表达质粒可以是pET28b、pET30a或者pET32a等。

本发明的一个实施例中，重组蛋白HtdY按如下方法得到：设计引物（HtdY-F：5’- TTATCCATGGCGATTGATCCGAACTCC-3’； HtdY-R：5’- TATTAAGCTTCTAACCCGCCACGTACTCCAC -3’）。以结核分枝杆菌H37Rv株基因组DNA为模板，PCR扩增HtdY基因，该基因的PCR产物经纯化后双酶切，克隆构建质粒。测序表明所插入的序列与GeneBank 中H37Rv结核全基因组对应基因序列（HtdY基因NCBI登录号为CP002992.1；蛋白号为：NP_217906.1）完全一致。将验证好的重组质粒转化到宿主细胞进行蛋白表达。

本发明中，表达HtdY蛋白所用的宿主细胞为大肠杆菌的BL21（DE3）菌株或BL21 plysS（DE3）菌株。

本发明中，诱导表达HtdY蛋白可采用多种方法，如使用异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。

本发明中，分离纯化重组HtdY蛋白也可采用多种方法，如亲和层析、离子交换层析等。

本发明的一个实施例中，重组HtdY蛋白可以按如下方法获得：将鉴定好的重组质粒加入到大肠杆菌感受态细胞中，冰上放置45min，42℃水浴锅中热击90秒，冰浴3min，加入500ul的不含抗生素的的LB培养基。37℃摇床，220rmp，培养45-60min。取100ul左右在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，室温干燥后倒置于37℃温箱中培养10－12小时。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液体培养基中，220rmp，37℃培养OD至0.6左右，加入IPTG，37℃ 3h，收集IPTG诱导后的菌体，重悬后超声破碎。目的蛋白含于上清中，10000g 离心30min，收集上清。用IMAC亲和色谱柱进行亲和纯化，收集过柱纯化的目的蛋白，用20mM Tris-HCl，pH 8.0的溶液透析，10 kDa超滤管对透析后的目的蛋白液进行浓缩，用 BCA法测定纯化后目的蛋白的浓度。

天然HtdY蛋白的提取方法繁琐，实际操作中难以取得足够的量进行研究和生产之用。

本发明的另一目的在于提供结核分枝杆菌HtdY蛋白或其特异性抗体在制备结核病检测试剂盒中的应用。

在一实施方式中，所述HtdY蛋白是具有全长度氨基酸序列的蛋白。

在一实施方式中，所述HtdY蛋白是用基因重组法以结核分枝杆菌DNA为模板扩增出HtdY基因后克隆、表达得到，其氨基酸序列为SEQ ID No: 2。

本发明的另一目的在于提供一种结核病检测试剂盒，其组分中的检测抗原是结核分枝杆菌HtdY蛋白。

在一实施方式中，所述HtdY蛋白是具有全长度氨基酸序列的蛋白。在另一实施方式中，所述HtdY蛋白是用基因重组法以结核分枝杆菌DNA为模板扩增出HtdY基因后克隆、表达得到，其氨基酸序列为SEQ ID No: 2。

本发明的含有重组蛋白HtdY的试剂盒，主要基于抗原抗体反应原理，包括且不仅限于采用凝集反应，沉淀反应，免疫荧光技术，E花环反应，ELISA反应等。如反应结果呈阳性，则认为该检测者患有结核病。

本发明提供的另一种结核病检测试剂盒，它含有上述重组蛋白HtdY的特异性抗体（来源于患者血清和健康对照者）。将待检测者标本，包括且不仅限于组织、体液中的蛋白进行分离，如有与重组蛋白HtdY的特异性抗体完全相同的蛋白，即认为该检测者患有结核。

本发明的试剂盒中，除了有重组蛋白HtdY或其特异性抗体外，还有用于检测的各种常用的试剂和器皿，包括各种缓冲液、稀释液、终止液等。在本发明的一个实施例中，结核检测试剂盒包括如下试剂和物品：

（1）包被稀释液：0.05M的碳酸盐包被缓冲液（pH9.6）；

（2）洗涤缓冲液：PBST；

（3）样本稀释液：含1%BSA的PBST；

（4）经标记的二抗：标记的羊抗人IgG或IgM。

（5）阳性对照品和阴性对照品；

（6）底物溶液：底物缓冲液A：乙酸钠2.4g，柠檬酸0.28g溶于88ml超纯水，磁力搅拌器充分搅拌溶解，最后加入53μl 30%H₂O₂，磁力搅拌器充分搅拌溶解而得；底物缓冲液B：80ml超纯水中加入0.03g TMB和0.32g EDTA-Na2，然后再加入8ml甘油，磁力搅拌使其充分搅拌溶解而得。

（7）终止液：2M硫酸；

（8）96孔酶标反应板；

其实施方法参考以下实施例。

本发明的重组HtdY蛋白抗原与现有技术中的ESAT-6抗原相比，在诊断结核病方面具有同样特异性，但更高的敏感性，其在结核病人血清中IgG的阳性率为33.3%，高于ESAT-6抗原的22.2%，与PPD-和PPD+健康对照相比，其检测特异性均为87.5%。本发明的重组HtdY蛋白可以单独作为诊断试剂，也可以与现有已知的诊断抗原联合，从而提高检测结核病人的敏感性。

附图说明

图1 是重组蛋白HtdY的表达纯化图，其中，1是蛋白分子量标准，2-9是诱导后的蛋白破碎沉淀和洗脱样品。

图2 是重组蛋白HtdY经进一步纯化及浓缩后的SDS-PAGE图，其中，1是蛋白分子量标准，2是纯化浓缩后的目的蛋白（5μg）。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的，下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用，但不能限制本方面的内容。

实施例1 基因重组法获得HtdY蛋白

1.1 重组质粒pET32a-HtdY的构建

（1）靶基因引物设计

HtdY-F：5’- TTATCCATGGCGATTGATCCGAACTCC-3’;

HtdY-R：5’- TATTAAGCTTCTAACCCGCCACGTACTCCAC -3’;

酶切位点分别为Nco I、Hind III-R。

（2）靶基因的PCR扩增、克隆及序列测定

以结核分枝杆菌H37Rv基因组DNA为摸板，HtdY-F和HtdY-R为引物，应用Taq酶，通过PCR直接扩增HtdY蛋白基因。PCR反应条件：94℃预变性5min；( 94℃，30s；58℃，30s；72℃，40s) 35个循环；72℃延伸5min；4℃保存。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳分离目的片段，后用DNA回收试剂盒（购自Invitrogen）回收。用Nco I和Xho I酶切，克隆构建入pET32a质粒Nco I和Xho I酶切位点中。测序表明所插入的序列和GeneBank中H37Rv结核全基因组相应基因序列完全一致。

1.2 重组蛋白HtdY的诱导表达及纯化

将装有100ul BL21（DE3）physS感受态细胞（购自TIANGEN）的eppdorf 管从-80℃冰箱立即放入冰上。3-5分钟后等管内液体融化后，将0.5ul测序正确的重组pET32a-HtdY质粒放入感受态细胞中，冰上放置45min，42℃水浴锅中，热击90s，冰上静置3min，加入500ul的不含抗生素的的LB培养基，37℃摇床，220rmp，培养45-60min。然后取100ul左右在含卡那霉素的固体LB培养基平皿上涂布，室温干燥后倒置于37℃温箱中培养10－12小时。挑取克隆，放入含50ug/ml卡那霉素的抗性的LB液体培养基中，220rmp，37℃培养OD至0.6左右，加入终浓度为10mM IPTG，37℃ 3h，收集IPTG诱导后的菌体，按10ml Washing Buffer I每克湿菌的比例重悬后超声破碎。结果目的蛋白含于上清中。10000g 离心30min，收集上清。用IMAC亲和色谱柱（购自Bio-Rad）进行亲和纯化（2CV 去离子水冲洗，5CV 含5mM 咪唑的washing Buffer I平衡，6CV含目的蛋白上清上样，6CV 含5mM 咪唑的washing Buffer I冲洗，6CV 含10mM 咪唑的washing Buffer 2冲洗，10CV 含500mM 咪唑的Elution Buffer洗脱），收集过柱纯化的目的蛋白（图1），用20mM Tris-HCl，pH 8.0的溶液透析，10 kDa超滤管对透析后的目的蛋白液进行浓缩，用 BCA法测定纯化后目的蛋白的浓度为5mg/ml，SDS-PAGE电泳分析目的重组蛋白HtdY纯度为95%以上（图2），收率为9.2%。

实施例2  

以商品化的ESAT-6抗原（购自ImmunoDiagnostics, Inc., USA）作为对照，评估重组HtdY抗原作为检测试剂对PPD-健康对照、PPD+健康对照血清和结核病人血清学反应效果。

利用间接酶联免疫吸附试验检测不同血清标本中抗HtdY的IgG反应。具体步骤是：96孔板用抗原HtdY（2μg/ml）或ESAT-6抗原（3ug/ml）包被过夜，弃去包被液，PBST洗涤5次，甩干。每孔加入300μl含1%BSA的PBST，37℃温育2h。甩干，每孔加入100μl用含1%BSA的PBST稀释的待检血清（1:50），37℃温育0.5h。）弃去血清，PBST洗涤5次，甩干。每孔加入100μl用含1%BSA的PBST稀释的辣根过氧化物酶标记的羊抗人IgG抗体（购自Jackson，USA），37℃温育0.5h。弃去液体，PBST洗涤5次，甩干。每孔加入100μl新鲜配置的底物液（A：B=1:1），37℃避光温育10min。每孔加入50μl 2M硫酸终止反应，450nm检测OD值。以健康对照者血清标本的平均OD值加3倍标准方差作为Cutoff的判断标准。若血清标本的OD值大于或等于此标准，即判断为阳性，反之为阴性。重组蛋白HtdY和ESAT-6抗原分别对PPD-健康对照、PPD+健康对照血清和结核患者血清学反应结果如表1所示。

表1

从表1的结果表明，重组HtdY蛋白抗原与ESAT-6抗原相比，在诊断结核病方面具有同样特异性，但更高的敏感性。其在结核病人血清中IgG的阳性率为33.3%，高于ESAT-6抗原的22.2%，与PPD-和PPD+健康对照相比，其检测特异性均为87.5%。

本发明的重组HtdY蛋白可以单独作为诊断试剂，也可以与现有已知的诊断抗原联合，从而提高检测结核病人的敏感性。

除上述实施例外，本发明还可以有其它实施方式。凡采用修饰、更换、等同替换或等效变换形成的技术方案，均落入本发明的保护范围内。

                

<110>  上海交通大学

 

<120>  一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用

 

<130>  20121020SJ

 

<160>  4    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  873

<212>  DNA

<213>  结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)

 

<400>  1

atggcgattg atccgaactc cataggtgca gtgaccgagc cgatgttgtt cgagtggacc       60

 

gaccgggaca cgctgcttta cgcgatcggg gtgggcgccg ggaccggaga tctggcgttc      120

 

accacggaga acagccacgg catcgaccag caagtgttgc cgacgtatgc ggtgatttgc      180

 

tgtccggcgt ttggtgcggc cgcaaaggtg ggaacattca acccggcggc gctgctacac      240

 

ggctcccagg gcatccggct gcatgcgccg ctgccggcgg cgggaaaact gtcggtggtc      300

 

accgaggtcg ccgacatcca ggacaagggg gagggcaaga acgccatcgt tgtgctgcgc      360

 

ggccgcggtt gcgacccgga atcgggttcg ttggttgccg aaacgcttac cacgttggtg      420

 

cttcggggtc aggggggttt cggaggagcg cggggtgagc ggccggccgc gccggaattt      480

 

ccggaccgcc accccgacgc ccgaatcgat atgccgaccc gtgaggacca ggcgctgatc      540

 

taccggctct ccggtgaccg caacccgctg cacagcgacc cctggttcgc cacgcagctg      600

 

gccgggtttc ccaagccgat cctgcacggg ttgtgcacct acggggtggc gggccgggcg      660

 

ctggtggccg agcttggcgg cggtgtggcg gccaacatca cctcgatcgc cgcgcggttc      720

 

accaagccgg tgtttcccgg cgagacgctg tcgacggtga tctggcgcac cgagccgggc      780

 

cgggcggtgt tccgcaccga ggtggccggc tccgacggcg ccgaggcccg ggtggtgctc      840

 

gacgacggcg cggtggagta cgtggcgggt tag                                   873

 

 

<210>  2

<211>  449

<212>  PRT

<213>  结核分枝杆菌(mycobacterium tuberculosis)

 

<400>  2

 

Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp

1               5                   10                  15     

 

 

Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp

            20                  25                  30         

 

 

Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp

        35                  40                  45             

 

 

Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn

    50                  55                  60                 

 

 

Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu

65                  70                  75                  80 

 

 

Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser

                85                  90                  95     

 

 

Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly

            100                 105                 110        

 

 

Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro

        115                 120                 125            

 

 

Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln

    130                 135                 140                

 

 

His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met

145                 150                 155                 160

 

 

Ala Ile Asp Pro Asn Ser Ile Gly Ala Val Thr Glu Pro Met Leu Phe

                165                 170                 175    

 

 

Glu Trp Thr Asp Arg Asp Thr Leu Leu Tyr Ala Ile Gly Val Gly Ala

            180                 185                 190        

 

 

Gly Thr Gly Asp Leu Ala Phe Thr Thr Glu Asn Ser His Gly Ile Asp

        195                 200                 205            

 

 

Gln Gln Val Leu Pro Thr Tyr Ala Val Ile Cys Cys Pro Ala Phe Gly

    210                 215                 220                

 

 

Ala Ala Ala Lys Val Gly Thr Phe Asn Pro Ala Ala Leu Leu His Gly

225                 230                 235                 240

 

 

Ser Gln Gly Ile Arg Leu His Ala Pro Leu Pro Ala Ala Gly Lys Leu

                245                 250                 255    

 

 

Ser Val Val Thr Glu Val Ala Asp Ile Gln Asp Lys Gly Glu Gly Lys

            260                 265                 270        

 

 

Asn Ala Ile Val Val Leu Arg Gly Arg Gly Cys Asp Pro Glu Ser Gly

        275                 280                 285            

 

 

Ser Leu Val Ala Glu Thr Leu Thr Thr Leu Val Leu Arg Gly Gln Gly

    290                 295                 300                

 

 

Gly Phe Gly Gly Ala Arg Gly Glu Arg Pro Ala Ala Pro Glu Phe Pro

305                 310                 315                 320

 

 

Asp Arg His Pro Asp Ala Arg Ile Asp Met Pro Thr Arg Glu Asp Gln

                325                 330                 335    

 

 

Ala Leu Ile Tyr Arg Leu Ser Gly Asp Arg Asn Pro Leu His Ser Asp

            340                 345                 350        

 

 

Pro Trp Phe Ala Thr Gln Leu Ala Gly Phe Pro Lys Pro Ile Leu His

        355                 360                 365            

 

 

Gly Leu Cys Thr Tyr Gly Val Ala Gly Arg Ala Leu Val Ala Glu Leu

    370                 375                 380                 

 

 

Gly Gly Gly Val Ala Ala Asn Ile Thr Ser Ile Ala Ala Arg Phe Thr

385                 390                 395                 400

 

 

Lys Pro Val Phe Pro Gly Glu Thr Leu Ser Thr Val Ile Trp Arg Thr

                405                 410                 415    

 

 

Glu Pro Gly Arg Ala Val Phe Arg Thr Glu Val Ala Gly Ser Asp Gly

            420                 425                 430        

 

 

Ala Glu Ala Arg Val Val Leu Asp Asp Gly Ala Val Glu Tyr Val Ala

        435                 440                 445            

 

 

Gly

   

 

 

<210>  3

<211>  27

<212>  DNA

<213>  HtdY-F

 

<400>  3

ttatccatgg cgattgatcc gaactcc                                           27

 

 

<210>  4

<211>  31

<212>  DNA

<213>  HtdY-R

 

<400>  4

tattaagctt ctaacccgcc acgtactcca c                                      31

 

 

Claims (13)

1.一种结核分枝杆菌重组HtdY蛋白的基因，其特征在于，它的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种结核分枝杆菌重组HtdY蛋白，其特征在于，它的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根据权利要求2所述的一种结核分枝杆菌重组HtdY蛋白，其特征在于，它来自结核分枝杆菌H37Rv。

4.根据权利要求2所述的结核分枝杆菌重组HtdY蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

  （1）结核分枝杆菌菌株基因组DNA的制备；

  （2）HtdY基因的扩增；

  （3）HtdY基因插入表达质粒；

  （4）将构建的表达质粒转化入宿主细胞；

（5）诱导表达蛋白HtdY；

（6）分离纯化诱导表达产物，得到HtdY重组蛋白；

其中，在制备结核分枝杆菌HtdY基因中采用的引物为HtdY-F和HtdY-R，所述引物HtdY-F的核苷酸序列如SEQ ID No: 3所示，所述引物HtdY-R的核苷酸序列如SEQ ID No: 4所示。

5.结核分枝杆菌HtdY蛋白在制备检测或诊断结核病的试剂中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述HtdY蛋白是具有全长度氨基酸序列的蛋白。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述HtdY蛋白是用基因重组法以结核分枝杆菌DNA为模板扩增出HtdY基因后克隆、表达得到，其氨基酸序列为SEQ ID No: 2。

8.结核分枝杆菌HtdY蛋白或其特异性抗体在制备结核病检测试剂盒中的应用。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述HtdY蛋白是具有全长度氨基酸序列的蛋白。

10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述HtdY蛋白是用基因重组法以结核分枝杆菌DNA为模板扩增出HtdY基因后克隆、表达得到，其氨基酸序列为SEQ ID No: 2。

11.一种结核病检测试剂盒，其特征在于，其组分中的检测抗原是结核分枝杆菌HtdY蛋白。

12.如权利要求11所述的结核病检测试剂盒，其特征在于，所述HtdY蛋白是具有全长度氨基酸序列的蛋白。

13.如权利要求11所述的结核病检测试剂盒，其特征在于，所述HtdY蛋白是用基因重组法以结核分枝杆菌DNA为模板扩增出HtdY基因后克隆、表达得到，其氨基酸序列为SEQ ID No: 2。

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