ES2326257T3 - Proteinas expresadas por mycobacterium tuberculosis y no por bcg y su utilizacion como reactivos diagnosticos y vacunas. - Google Patents
Proteinas expresadas por mycobacterium tuberculosis y no por bcg y su utilizacion como reactivos diagnosticos y vacunas. Download PDFInfo
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Abstract
Procedimiento in vitro de diagnóstico, que discrimina entre la exposición de un sujeto a Mycobacterium tuberculosis (M. tuberculosis) y la exposición de un sujeto a la cepa Bacille Calmette Guerin de Mycobacterium bovis (BCG), comprendiendo el procedimiento someter a ensayo una población de células procedente de un sujeto para la presencia de linfocitos T CD4 que responden a MTBN4, tal como se ilustra en la figura 1, en el que la presencia de linfocitos T CD4 que responden a MTBN4 indica que el sujeto ha sido expuesto a M. tuberculosis y no a BCG sin exposición a M. tuberculosis.
Description
Proteínas expresadas por Mycobacterium
tuberculosis y no por BCG y su utilización como reactivos
diagnósticos y vacunas.
La invención se refiere al campo de la
tuberculosis y, específicamente, a reactivos útiles para generar
respuestas inmunológicas frente a Mycobacterium tuberculosis
y para diagnosticar infección y enfermedad en un sujeto que ha sido
expuesto a M. tuberculosis.
La infección por tuberculosis continúa siendo un
problema sanitario mundial. Recientemente, esta situación ha
resultado fuertemente exacerbada por la emergencia de cepas de M.
tuberculosis resistentes a múltiples fármacos y la epidemia
internacional del SIDA. De esta manera, ha crecido la importancia de
producir vacunas efectivas contra M. tuberculosis y reactivos
diagnósticos fiables del mismo.
La invención se basa en el descubrimiento del
inventor de que un polipéptido codificado por un marco de lectura
abierta (ORF) en el genoma de M. tuberculosis que se
encuentra ausente del genoma de la cepa Bacille Calmette Guerin
(BCG) de M. bovis induce una respuesta de hipersensibilidad
de tipo retardado en animales infectados por M.
tuberculosis, pero no en animales sensibilizados frente a BCG.
De esta manera, las proteínas codificadas por ORF presentes en el
genoma de M. tuberculosis, aunque ausentes del genoma de BCG,
representan reactivos que resultan útiles para discriminar entre
M. tuberculosis y BCG, y en particular, para procedimientos
diagnósticos (por ejemplo ensayos en la piel y ensayos in
vitro para anticuerpos específicos de M. tuberculosis y
de capacidad de respuesta linfocitaria) que discriminan entre la
exposición de un sujeto a M. tuberculosis y la vacunación
con BCG. De esta manera, la presente invención se refiere a
procedimientos de diagnóstico in vitro que discriminan entre
la exposición de un sujeto a M. tuberculosis y la exposición
de un sujeto a BCG. En una forma de realización, el procedimiento
comprende someter a ensayo una población de células procedentes de
un sujeto, para la presencia de linfocitos T CD4 que responden a
MTBN4, tal como se ilustra en la figura 1, en la que la presencia
de linfocitos T CD4 que responden a MTBN4 indica que el sujeto ha
sido expuesto a M. tuberculosis y no a BCG sin exposición
a
M. tuberculosis.
M. tuberculosis.
En otra forma de realización, el procedimiento
comprende someter a ensayo un sujeto para la presencia de linfocitos
B que producen anticuerpos que se unen a MTBN4, llevando a cabo el
ensayo en un líquido corporal procedente del sujeto, en el que la
presencia en el sujeto de linfocitos B que producen anticuerpos que
se unen a MTBN4 indica que el sujeto ha sido infectado por
exposición a M. tuberculosis y no a BCG sin exposición a
M. tuberculosis.
Asimismo, la invención proporciona vectores que
comprenden las moléculas de ADN codificantes de polipéptidos MTBN4 y
composiciones que comprenden estos polipéptidos. También se
proporciona una diversidad de metodologías diagnósticas que utilizan
lo expuesto anteriormente.
En una forma de realización, la invención
proporciona un vector que comprende: (a) la molécula de ADN
codificante del polipéptido MTBN4, tal como se ilustra en la figura
1, y (b) secuencias reguladoras de transcripción y de traducción
ligadas funcionalmente a dicha secuencia de ADN, permitiendo dichas
secuencias reguladoras la expresión del polipéptido codificado por
dicha secuencia de ADN en una célula para la utilización como
diagnóstico. El polipéptido codificado presenta propiedades
antigénicas e inmunogénicas específicas de Mycobacterium
tuberculosis. También se define en la presente memoria una parte
aislada de la molécula de ADN expuesta anteriormente. Dicha parte
de la molécula de ADN codifica un segmento del polipéptido, que es
más corto que el polipéptido de longitud completa, y el segmento
presenta propiedades antigénicas e inmunogénicas específicas de
Mycobacterium tuberculosis. Las células que pueden utilizarse
para expresar el polipéptido codificado dentro del vector incluyen
células tanto eucarióticas como procarióticas.
Los vectores expuestos anteriormente pueden
incorporarse en composiciones que comprenden un diluyente o relleno
farmacéuticamente aceptable. Otras composiciones que pueden
utilizarse contienen por lo menos dos (por ejemplo tres, cuatro,
cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, doce, quince o veinte)
secuencias de ADN, codificando cada una un polipéptido del complejo
Mycobacterium tuberculosis o un segmento funcional del mismo,
encontrándose las secuencias de ADN ligadas funcionalmente a
secuencias reguladoras de transcripción y de traducción que
permiten la expresión de cada uno de los polipéptidos en una célula
de un vertebrado. En estas composiciones, por lo menos una de las
secuencias de ADN (por ejemplo dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete
u ocho) es una molécula de ADN codificante del polipéptido MTBN4,
tal como se ilustra en la figura 1. Los polipéptidos codificados
preferentemente serán los no codificados por el genoma de las
células de la cepa BCG de M. bovis.
En la presente memoria se describe un
polipéptido que comprende la secuencia de MTBN4 tal como se ilustra
en la fig. 1. Asimismo, la invención proporciona una composición que
comprende dicho polipéptido y por lo menos un polipéptido adicional
del complejo Mycobacterium tuberculosis, no encontrándose
codificado por el genoma de las células de la cepa BCG de
Mycobacterium bovis, para la utilización como diagnóstico.
El polipéptido o polipéptidos pueden seleccionarse de entre el grupo
constituido por MTBN1, MTBN2, MTBN3, MTBN4, MTBN5, MTBN6, MTBN7 y
MTBN8, tal como se ilustra en la figura 1, o polipéptidos con
secuencias de aminoácidos idénticas a los mismos con sustituciones
conservadoras. El polipéptido presenta propiedades antigénicas e
inmunogénicas específicas de Mycobacterium tuberculosis.
También se define en la presente memoria un segmento aislado de los
polipéptidos expuestos anteriormente, siendo el segmento más corto
que el polipéptido de longitud completa y presentando propiedades
antigénicas e inmunogénicas específicas de Mycobacterium
tuberculosis. Los polipéptidos y composición de la invención
pueden utilizarse con un diluyente o relleno farmacéuticamente
aceptable. Las composiciones de la invención también pueden contener
por lo menos dos (por ejemplo tres, cuatro, cinco, seis, siete,
ocho, nueve, diez, doce, quince o veinte) polipéptidos del complejo
Mycobacterium tuberculosis, o segmentos funcionales de los
mismos, con por lo menos uno de los dos o más (por ejemplo dos,
tres, cuatro, cinco, seis, siete u ocho) polipéptidos que comprende
la secuencia de MTBN4, tal como se ilustra en la figura 1. Los
polipéptidos preferentemente son los no codificados por el genoma de
las células de la cepa BCG de M. bovis.
Asimismo, la invención proporciona polipéptidos,
composiciones y vectores tal como se ha indicado anteriormente,
para la utilización como diagnósticos. Aunque no forman parte de la
invención, pueden utilizarse procedimientos que implican: (a) la
administración de una de las composiciones de polipéptidos en un
sujeto que se sospecha que presenta infección por Mycobacterium
tuberculosis o que es susceptible de la misma, y (b) detectar
una respuesta inmunológica en el sujeto frente a la composición,
como indicación de que el sujeto presenta una infección por
Mycobacterium tuberculosis o es susceptible de la misma. Un
ejemplo de este tipo de procedimiento es un ensayo en la piel en el
que la sustancia de ensayo (por ejemplo composiciones que contienen
uno o más de entre MTBN1-MTBN8) se inyecta
intradérmicamente en el sujeto y en el que se detecta una respuesta
de hipersensibilidad de tipo retardado en la piel.
En otro aspecto, la invención se refiere a un
procedimiento in vitro de diagnóstico, que comprende: (a)
poner en contacto linfocitos T CD4 con células presentadoras de
antígeno (APC) en presencia de un polipéptido que comprende la
secuencia de MTBN4, tal como se ilustra en la figura 1, en el que
dichos linfocitos T CD4 proceden de una población de células de un
sujeto, y en el que dichas APC expresan por lo menos una molécula
del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase II
expresada por dicho sujeto, y (b) determinar la capacidad de dichos
linfocitos T CD4 de responder a dicho polipéptido, como indicación
de que dicho sujeto presenta una infección por Mycobacterium
tuberculosis o es susceptible de la misma. Otro procedimiento
diagnóstico in vitro de la invención implica: (a) poner en
contacto un polipéptido que comprende la secuencia de MTBN4, tal
como se ilustra en la figura 1, con un líquido corporal de un
sujeto, (b) detectar la presencia de unión de anticuerpo a dicho
polipéptido, como indicación de que dicho sujeto presenta una
infección por Mycobacterium tuberculosis o es susceptible de
la misma.
En los procedimientos diagnósticos in
vitro de la invención mencionados anteriormente, el polipéptido
que comprende MTBN4 puede encontrarse presente dentro de una
composición que comprende por lo menos un polipéptido adicional tal
como se ha definido anteriormente.
También se encuentra comprendida dentro de la
invención la utilización de una composición de polipéptidos o vector
tal como se define en la presente memoria, para la preparación de un
medicamento para diagnosticar la exposición de un sujeto a
Mycobacterium tuberculosis.
Tal como se utiliza en la presente memoria, una
"molécula de ADN aislada" es un ADN que es uno o ambos de
entre: no inmediatamente contiguo a una o ambas secuencias
codificantes respecto a las que es inmediatamente contiguo (es
decir, una en el extremo 5' y una en el extremo 3') en el genoma
natural del organismo del que se derivó el ADN, o que se encuentra
sustancialmente libre de las secuencias de ADN junto con las que se
encuentra en el organismo a partir del que se derivó el ADN. La
expresión incluye, por ejemplo, un ADN recombinante que,
incorporado en un vector, por ejemplo en un plásmido o virus de
replicación autónoma, o en el ADN genómico de un procariota o
eucariota, o que existe en forma de molécula separada (por ejemplo
un ADNc o un fragmento genómico producido mediante PCR o
tratamiento con endonucleasa de restricción) independiente de otras
secuencias de ADN. El ADN aislado también incluye un ADN
recombinante que es parte de un ADN híbrido codificante de
secuencias polipeptídicas adicionales de M. tuberculosis.
Entre las "moléculas de ADN" se incluyen
ADNc, ADN genómico y ADN sintético (por ejemplo de síntesis
química). En el caso de que sea de cadena única, la molécula de ADN
puede ser una cadena sentido o una cadena antisentido.
Un "polipéptido aislado" de la invención es
un polipéptido que no presenta contrapartida natural, o que ha sido
separado o purificado a partir de componentes que lo acompañan
naturalmente, por ejemplo en bacterias de M. tuberculosis.
Típicamente el polipéptido se considera "aislado" en el caso de
que se encuentre libre por lo menos al 70%, en peso seco, de las
proteínas y moléculas orgánicas naturales con las que se encuentra
naturalmente asociado. Preferentemente una preparación de un
polipéptido de la invención es por lo menos 80%, más
preferentemente por lo menos 90%, y todavía más preferentemente por
lo menos 99%, en peso seco, el péptido de la invención. Debido a
que un polipéptido de síntesis química, por su naturaleza, se
encuentra separado de los componentes que lo acompañan
naturalmente, el polipéptido sintético se encuentra
"aislado".
Un polipéptido aislado de la invención puede
obtenerse, por ejemplo, mediante extracción a partir de una fuente
natural (por ejemplo bacterias de M. tuberculosis), mediante
expresión de un ácido nucleico recombinante codificante del
polipéptido, o mediante síntesis química. Un polipéptido producido
en un sistema celular diferente de la fuente de la que se origina
naturalmente se encuentra "aislado", debido a que se encontrará
separado de los componentes que lo acompañan naturalmente. El grado
de aislamiento o pureza puede medirse mediante cualquier
procedimiento apropiado, por ejemplo cromatografía de columna,
electroforesis en gel de poliacrilamida o análisis de HPLC.
Los polipéptidos pueden contener una secuencia
primaria de aminoácidos que ha sido modificada respecto a aquéllas
dadas a conocer en la presente memoria. Preferentemente estas
modificaciones consisten en sustituciones conservadoras de
aminoácidos. Entre las sustituciones conservadoras típicamente se
incluyen sustituciones en los grupos siguientes: glicina y alanina,
valina, isoleucina, y leucina; ácido aspártico y ácido glutámico;
asparagina y glutamina; serina y treonina; lisina y arginina; y
fenilalanina y tirosina.
Los términos "proteína" y
"polipéptido" se utilizan en la presente memoria para hacer
referencia a cualquier cadena de aminoácidos, con independencia de
la longitud o la modificación postraduccional (por ejemplo la
glucosilación o la fosforilación). De esta manera, la expresión
"polipéptido de Mycobacterium tuberculosis" incluye
proteína natural de longitud completa de Mycobacterium
tuberculosis, así como un polipéptido producido
recombinantemente o sintéticamente que corresponde a una proteína
natural de longitud completa de Mycobacterium tuberculosis o
a dominios o partes particulares de una proteína natural. La
expresión también comprende un polipéptido maduro de
Mycobacterium tuberculosis que presenta una metionina
aminoterminal añadida (útil para la expresión en células
procarióticas) o cualquier secuencia corta de aminoácidos útil para
la purificación de proteínas mediante cromatografía de afinidad,
por ejemplo polihistidina para la purificación mediante
cromatografía de quelatos metálicos.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"inmunogénico" hace referencia a la posibilidad de activar una
respuesta inmunológica primaria o de memoria. Entre las respuestas
inmunológicas se incluyen respuestas de linfocitos T CD4+ y CD8+ y
de linfocitos B. En el caso de los linfocitos T, dichas respuestas
pueden ser proliferativas y/o citoquinas (por ejemplo
interleuquina(IL)-2, IL-3,
IL-4, IL-5, IL-6,
IL-12, IL-13, IL-15,
o productoras de factor \alpha de necrosis tumoral
(TNF-\alpha) o de
interferón-\gamma (IFN-\gamma),
o pueden resultar en la generación de linfocitos T citotóxicos
(CTL). Las respuestas de linfocitos B pueden ser las que resultan en
la producción de anticuerpos por parte de los linfocitos B
respondedores.
Tal como se utiliza en la presente memoria,
"antigénico" hace referencia a la posibilidad de ser reconocido
por moléculas de anticuerpo o por receptores de células T (TCR)
específicas de antígeno situadas sobre células T efectoras activadas
(por ejemplo células T productoras de citoquinas, o CTL).
De esta manera, los polipéptidos que presentan
"propiedades antigénicas específicas de Mycobacterium
tuberculosis" son polipéptidos que: (a) pueden ser
reconocidas por anticuerpos y unirse a ellos, inducidos en respuesta
a organismos de Mycobacterium tuberculosis o moléculas de
Mycobacterium tuberculosis de tipo salvaje (por ejemplo
polipéptidos), o (b) contienen subsecuencias que, posteriormente al
procesamiento del polipéptido por parte de las células
presentadoras de antígenos (APC) apropiadas y tras unirse a
moléculas apropiadas del complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC), resultan reconocidas y se unen a TCR situados sobre células
T efectoras inducidas en respuesta a organismos de Mycobacterium
tuberculosis o a moléculas de Mycobacterium tuberculosis
de tipo salvaje (por ejemplo polipéptidos).
Tal como se utiliza en la presente memoria, los
polipéptidos que presentan "propiedades inmunogénicas específicas
de Mycobacterium tuberculosis" son polipéptidos que: (a)
pueden inducir la producción de anticuerpos que reconocen y se unen
a organismos de Mycobacterium tuberculosis o a moléculas de
Mycobacterium tuberculosis de tipo salvaje (por ejemplo
polipéptidos), o (b) contienen subsecuencias que, posteriormente al
procesamiento del polipéptido por parte de células presentadoras de
antígeno (APC) apropiadas y tras unirse a moléculas apropiadas del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) sobre la superficie de
las APC, activan células T con TCR que reconocen y se unen a
fragmentos peptídicos derivados mediante procesamiento por parte de
las APC de organismos de Mycobacterium tuberculosis o de
moléculas de Mycobacterium tuberculosis de tipo salvaje (por
ejemplo polipéptidos) y unidas a moléculas del MHC sobre la
superficie de las APC. Las respuestas inmunológicas inducidas en
respuesta a los polipéptidos inmunogénicos preferentemente son
protectoras. Tal como se utiliza en la presente memoria,
"protector" se refiere a la prevención del establecimiento de
una infección o de la aparición de una enfermedad o a la reducción
de la severidad de una enfermedad existente en un sujeto. El
término "prevenir" puede incluir retrasar la aparición, así
como bloquear parcial o completamente el progreso de la
enfermedad.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
"segmento funcional de un polipéptido de Mycobacterium
tuberculosis" es un segmento del polipéptido que presenta
propiedades antigénicas e inmunogénicas específicas de
Mycobacterium tuberculosis.
En el caso de que se administre un polipéptido,
un segmento funcional de un polipéptido o una mezcla de polipéptidos
y/o segmentos funcionales (por ejemplo mediante inyección
intradérmica) en un sujeto con el fin de someter a ensayo la
infección por M. tuberculosis o la susceptibilidad a dicha
infección, "detectar una respuesta inmunológica" significa
examinar el sujeto para indicios de una reacción inmunológica contra
el material administrado, por ejemplo enrojecimiento o hinchazón de
la piel en el sitio de inyección intradérmica. En el caso de que el
sujeto presente anticuerpos contra el material administrado, la
respuesta generalmente será rápida, por ejemplo entre 1 minuto y 24
horas. Por otra parte, una reacción de células T activadas o de
memoria de linfocitos T preinmunizados en el sujeto generalmente es
más lenta, apareciendo únicamente tras 24 horas y alcanzando un
máximo transcurridas entre 24 y 96 horas.
Tal como se utiliza en la presente memoria, un
"sujeto" puede ser un sujeto humano o un mamífero no humano,
tal como un primate no humano, un caballo, un animal bovino, un
cerdo, una oveja, una cabra, un perro, un gato, un conejo, un
cobaya, un hámster, una rata o un ratón.
A menos que se indique lo contrario, todos los
términos técnicos y científicos utilizados en la presente memoria
presentan el mismo significado conocido por el experto ordinario en
la materia a la que se refiere la presente invención. En caso de
conflicto, la presente memoria, incluyendo las definiciones, resulta
prioritario. Se describen posteriormente los procedimientos y
materiales preferidos, aunque pueden utilizarse procedimientos y
materiales similares o equivalentes a los descritos en la presente
memoria en la práctica o en el ensayo de la presente invención. A
menos que se indique lo contrario, estos materiales y procedimientos
son meramente ilustrativos y no pretenden ser limitativos. La
totalidad de las publicaciones, solicitudes de patente, patentes y
otras referencias indicadas en la presente memoria se proporcionan
únicamente a título ilustrativo y no limitativo.
Otras características y ventajas de la
invención, por ejemplo procedimientos de diagnóstico de la infección
por M. tuberculosis, resultarán evidentes a partir de la
descripción siguiente, a partir de los dibujos y de las
reivindicaciones.
La figura 1 es una ilustración de las secuencias
de aminoácidos de los polipéptidos
MTBN1-MTBN-8 de M.
tuberculosis.
La figura 2 es una ilustración de las secuencias
de nucleótidos de las regiones codificantes
(mtbn1-mtbn8) que codifican
MTBN1-MTBN8.
La figura 3 es un gráfico de columnas que
muestra las respuestas de hipersensibilidad de tipo retardado
inducidas por la inyección intradérmica de 3 reactivos de ensayo
diferentes en cobayas hembra que habían sido infectadas con células
de M. tuberculosis o sensibilizadas con BCG o con células de
M. avium.
El genoma de M. tuberculosis [Cole et
al., Nature 393:537-544, (1998)] contiene marcos
de lectura abierta (ORF) que han sido delecionados de la cepa BCG
no virulenta. Los polipéptidos codificados por dichos ORF se
denominan en la presente memoria polipéptidos "de M.
tuberculosis negativos para BCG" ("MTBN") y los ORF se
denominan "mtbn". La invención se basa en el descubrimiento de
que un polipéptido MTBN (MTBN4) indujo una respuesta en la piel en
animales infectados por M. tuberculosis, aunque no en
animales sensibilizados frente a BCG o M. avium, una cepa de
micobacterias que no pertenece al complejo M. tuberculosis
(ver el Ejemplo 1, posteriormente). Estos resultados indican que
MTBN (por ejemplo MTBN1-MTBN8) puede utilizarse en
ensayos diagnósticos que discriminan la infección de un sujeto por
M. tuberculosis de la exposición a micobacterias que no
pertenecen al complejo M. tuberculosis y de BCG. El complejo
M. tuberculosis incluye M. tuberculosis, M.
bovis, M. microti y M. africanum. De esta manera,
pueden utilizarse para discriminar sujetos expuestos a M.
tuberculosis, y que de esta manera potencialmente presentan, o
se encuentran bajo riesgo de presentar, tuberculosis, de sujetos que
han sido vacunados con BCG, la vacuna de la tuberculosis más
ampliamente utilizada. Los ensayos diagnósticos que son capaces de
esta discriminación representan un avance importante que reducirá
mucho los esfuerzos estériles y los costes que son consecuencia de
ensayos diagnósticos adicionales y/o procedimientos terapéuticos en
sujetos que han presentado resultados positivos en ensayos
diagnósticos menos discriminatorios. Además, los resultados en el
Ejemplo 1 muestran que MTBN4, tal como se expresa en organismos de
M. tuberculosis viables completos, es capaz de inducir una
fuerte respuesta inmunológica en sujetos infectados por los
organismos y de esta manera presenta el potencial de ser una
vacuna.
Entre los polipéptidos MTBN definidos en la
presente memoria se incluyen, por ejemplo, los polipéptidos
codificados dentro de las regiones RD1, RD2 y RD3 del genoma de
M. tuberculosis [Mahairas et al., J. Bacteriol.
178:1274-1282, (1996)]. Resultan de particular
interés los polipéptidos codificados por ORF dentro de las regiones
RD1 del genoma de M. tuberculosis. Las secuencias de
aminoácidos de MTBN1-MTBN8 se muestran en la fig. 1
y las secuencias de nucleótidos de mtbn1-mtbn8 se
muestran en la fig. 2.
En la presente memoria se describen: (a)
moléculas de ADN aisladas que contienen secuencias mtbn (por ejemplo
mtbn1-mtbn8) codificantes de polipéptidos MTBN (por
ejemplo MTBN1-MTBN8) y partes aisladas de dichas
moléculas de ADN que codifican segmentos polipeptídicos que
presentan propiedades antigénicas e inmunogénicas (es decir,
segmentos funcionales), (b) los polipéptidos MTBN mismos (por
ejemplo MTBN1-MTBN8) y segmentos funcionales de los
mismos, (c) anticuerpos (incluyendo fragmentos de unión a antígenos,
por ejemplo F(ab')_{2}, Fab, Fv y fragmentos Fv de una
cadena de dichos anticuerpos) que se unen a los polipéptidos MTBN
(por ejemplo MTBN1-MTBN8) y segmentos funcionales,
(d) moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo vectores) que
contienen y son capaces de expresar una o más de las secuencias
mtbn (por ejemplo mtbn1-mtbn8) y partes de moléculas
de ADN, (e) células (por ejemplo células bacterianas, de levadura,
de insecto o de mamífero) transformadas por dichos vectores, (f)
composiciones que contienen vectores codificantes de uno o más
polipéptidos de M. tuberculosis (o segmentos funcionales),
incluyendo tanto los polipéptidos MTBN (por ejemplo
MTBN1-MTBN8) (o segmentos funcionales de los
mismos) y polipéptidos de M. tuberculosis anteriormente
descritos, tales como ESAT-6, antígeno de 14 kDa,
MPT63, antígeno de 19 kDa, MPT64, MPT51, MTC28, antígeno de 38 kDa,
antígeno de 45/47 kDa, MPB70, complejo Ag85, MPT53 y
KatG (ver también la solicitud de patente US nº 08/796.792), (g)
composiciones que contienen uno o más polipéptidos de M.
tuberculosis (o segmentos funcionales), incluyendo tanto los
polipéptidos de la invención y los polipéptidos de M.
tuberculosis previamente indicados, tales como aquellos
indicados anteriormente, (h) composiciones que contienen uno o más
de los anticuerpos indicados en (c), (i) procedimientos de
diagnóstico que implican: (1) la administración (por ejemplo la
inyección intradérmica) de cualquiera de las composiciones de
polipéptidos anteriores en un sujeto que se sospecha que presenta
una infección por M. tuberculosis o que es susceptible de la
misma, (2) ensayo in vitro de linfocitos (linfocitos B,
linfocitos T CD4 y linfocitos T CD8) procedentes de dicho sujeto
para la capacidad de respuesta (por ejemplo mediante la medición de
la proliferación celular, la producción de anticuerpos, la
producción de citoquinas o la actividad de las CTL) frente a
cualquiera de las composiciones de polipéptidos anteriormente
indicadas, (3) someter a ensayo un líquido corporal (por ejemplo
sangre, saliva, plasma, suero, orina o semen o un lavado, tal como
un lavado broncoalveolar, un lavado vaginal o un lavado
gastrointestinal inferior) para anticuerpos contra los polipéptidos
MTBN (por ejemplo MTBN1-MTBN8) o segmentos
funcionales de los mismos, o las composiciones de polipéptidos
anteriormente indicadas, (4) someter a ensayo un líquido corporal
(por ejemplo tal como anteriormente) para la presencia de M.
tuberculosis, polipéptidos MTBN (por ejemplo
MTBN1-MTBN8) o segmentos funcionales de los mismos,
o las composiciones de polipéptidos anteriormente indicadas en
ensayos utilizando los anticuerpos indicados en (c), y (5) someter
a ensayo un tejido (por ejemplo tejido pulmonar o bronquial) o un
líquido corporal (por ejemplo tal como anteriormente) para la
presencia de moléculas de ácidos nucleicos (por ejemplo ADN o ARN)
codificantes de polipéptidos MTBN (por ejemplo
MTBN1-MTBN8) (o partes de dichas moléculas de
ácidos nucleicos) utilizando sondas de ácidos nucleicos o cebadores
que presenten secuencias de nucleótidos de las moléculas de ácidos
nucleicos, partes de las moléculas de ácidos nucleicos, o los
complementos de dichas moléculas, y (j) procedimientos de
vacunación que implican la administración en un sujeto de las
composiciones de (f), (g) o (h), o de una combinación de dos
cualesquiera o incluso de las 3 composiciones.
Con respecto al diagnóstico, las proteínas MTBN
purificadas, los segmentos funcionales de estas proteínas, o las
mezclas de proteínas y/o los fragmentos funcionales, presentan las
ventajas anteriormente indicadas de discriminar la infección por
M. tuberculosis de la infección por otras bacterias y, en
particular, por micobacterias no patogénicas, o de la exposición
(por ejemplo por vacunación) a BCG. Además, las composiciones que
contienen las proteínas, los segmentos funcionales de las proteínas,
o las mezclas de las proteínas y/o los segmentos funcionales,
permiten un mejor control de calidad, debido a que la variabilidad
entre lotes se reduce mucho comparado con mezclas complejas, tales
como el derivado purificado de proteína tuberculina (PPD).
La utilización de los reactivos polipeptídicos y
de los ácidos nucleicos anteriormente indicados para la vacunación
también permite la inmunización altamente específica y efectiva.
Debido a que los polipéptidos de M. tuberculosis virulentos
codificados por genes ausentes de BCG no virulento probablemente son
mediadores de virulencia, la inmunidad dirigida contra ellos puede
resultar especialmente potente en términos de capacidad protectora.
En el caso de que la vacunación se lleve a cabo con ácidos
nucleicos, pueden utilizarse procedimientos tanto in vivo
como ex vivo. Los procedimientos in vivo implican la
administración de los ácidos nucleicos mismos en el sujeto, y los
procedimientos ex vivo implican obtener células (por ejemplo
células de médula ósea o fibroblastos) a partir del sujeto,
transducir las células con los ácidos nucleicos, preferentemente
seleccionando o enriqueciendo en células transducidas con éxito, y
administrar las células transducidas en el sujeto.
Alternativamente, las células que se han transducido y administrado
en el sujeto pueden derivarse de otro sujeto. Los procedimientos de
vacunación y diagnóstico se describen con mayor detalle en la
solicitud de patente US nº 08/796.792.
El ejemplo siguiente se proporciona a título
ilustrativo y no limitativo de la invención.
\vskip1.000000\baselineskip
Se utilizaron cuatro grupos de cobayas hembra
cruzadas con otras líneas genéticas (18 por grupo) para someter a
ensayo la utilidad del polipéptido MTBN4 como reactivo diagnóstico
específico de M. tuberculosis. Los cuatro grupos se trataron
de la manera siguiente:
Los animales del grupo 1 se infectaron mediante
aerosol con aproximadamente 100 células de M. tuberculosis
cepa H37Rv.
Los animales del grupo 2 se sensibilizaron
intradérmicamente con 10^{6} células vivas de M. bovis BCG
japonés.
Los animales del grupo 3 se sensibilizaron
intradérmicamente con 10^{6} células vivas de M. avium.
Los animales del grupo 4 se sensibilizaron
simuladamente mediante la inyección intradérmica de solución
salina.
Siete semanas después de la infección o
sensibilización, los animales recibieron inyecciones intradérmicas
de 1 \mug de PPD (6 animales de cada grupo), 2 \mug de MPT64
recombinante purificado (6 animales de cada grupo) o 2 \mug de
MTBN4 (6 animales de cada grupo). Se midió el diámetro del eritema
resultante 24 horas después. Los datos se expresan como diámetros
medios de eritema (en mm) y se indican las desviaciones estándares
(fig. 3).
\newpage
No se detectó eritema en los animales del grupo
4 con ninguna sustancia de ensayo y, por lo tanto, no se muestran
datos para este grupo. Por otra parte, los animales del grupo 1
(columnas sólidas) mostraron una respuesta significativa con las
tres sustancias de ensayo. Los animales del grupo 2 (columnas
blancas) mostraron una respuesta significativa frente a PPD y MPT64,
pero no frente a MTBN4. Los animales del grupo 3 mostraron una
respuesta significativa frente a PPD únicamente (columnas
rayadas).
De esta manera, PPD que contiene moléculas
antigénicas/inmunogénicas comunes al complejo M.
tuberculosis, así como a otras cepas micobacterianas,
proporcionó los resultados menos discriminatorios en el aspecto de
que indujo respuestas en animales infectados por micobacterias o
sensibilizados frente a ellas del complejo M. tuberculosis
(M. tuberculosis y BCG), así como en otra micobacteria no
patogénica (M. avium). Aunque MPT64, que se encuentra
codificado y se expresa tanto en M. tuberculosis como en BCG,
no indujo una respuesta en animales infectados por M. avium,
sí indujo respuestas en animales tanto infectados por M.
tuberculosis como sensibilizados frente a BCG. Finalmente, MTBN4
indujo una respuesta únicamente en los animales con M.
tuberculosis. De esta manera, indujo la respuesta más específica
y, más importante, permitió discriminar entre animales infectados
por M. tuberculosis y aquellos sensibilizados frente a
BCG.
Aunque la invención ha sido descrita haciendo
referencia a la forma de realización preferida en este momento,
debe apreciarse que pueden introducirse diversas modificaciones. De
acuerdo con lo expuesto anteriormente, la invención se encuentra
limitada únicamente por las reivindicaciones siguientes.
Claims (13)
1. Procedimiento in vitro de diagnóstico,
que discrimina entre la exposición de un sujeto a Mycobacterium
tuberculosis (M. tuberculosis) y la exposición de un
sujeto a la cepa Bacille Calmette Guerin de Mycobacterium
bovis (BCG), comprendiendo el procedimiento someter a ensayo una
población de células procedente de un sujeto para la presencia de
linfocitos T CD4 que responden a MTBN4, tal como se ilustra en la
figura 1, en el que la presencia de linfocitos T CD4 que responden a
MTBN4 indica que el sujeto ha sido expuesto a M. tuberculosis
y no a BCG sin exposición a M. tuberculosis.
2. Procedimiento in vitro de diagnóstico,
que discrimina entre la exposición de un sujeto a M.
tuberculosis y la exposición de un sujeto a BCG, comprendiendo
el procedimiento: someter a ensayo un sujeto para la presencia de
linfocitos B que producen anticuerpos que se unen a MTBN4, llevando
a cabo el ensayo en un líquido corporal del sujeto, en el que la
presencia en el sujeto de linfocitos B que producen anticuerpos que
se unen a MTBN4 indica que el sujeto ha sido infectado mediante
exposición a M. tuberculosis y no a BCG sin exposición a
M. tuberculosis.
3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2,
en el que dicho polipéptido se encuentra presente dentro de una
composición que comprende por lo menos otro polipéptido del complejo
M. tuberculosis, no encontrándose codificado dicho por lo
menos otro polipéptido por el genoma de las células de la cepa BCG
de Mycobacterium bovis.
4. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ensayo de la población de células procedente de un sujeto
para la presencia en el sujeto de linfocitos T CD4 que responden a
MTBN4 comprende poner en contacto los linfocitos T CD4 del sujeto
con células presentadoras de antígeno (APC) y MTBN4 o uno o más
fragmentos antigénicos del mismo.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ensayo de la población de células procedente del sujeto
para la presencia en el sujeto de linfocitos T CD4 que responden a
MTBN4 comprende realizar un ensayo para determinar la producción de
citoquinas.
6. Procedimiento según la reivindicación 5, en
el que la citoquina medida es el IFN\gamma.
7. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el ensayo de una población de células procedente de un sujeto
para la presencia de linfocitos T CD4 que responden a MTBN4
comprende:
- (a)
- poner en contacto los linfocitos T CD4 con células presentadoras de antígeno (APC) en presencia de MTBN4 o de uno o más fragmentos antigénicos del mismo, en el que dichos linfocitos T CD4 proceden de una población de células de un sujeto, y en el que dichas APC expresan por lo menos una molécula de clase II del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) expresada por dicho sujeto, y
- (b)
- determinar la capacidad de dichos linfocitos T CD4 de responder a MTBN4 o a uno o más fragmentos antigénicos del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
8. Procedimiento según la reivindicación 2, en
el que el ensayo para la presencia en el sujeto de linfocitos B que
producen anticuerpos que se unen a MTBN4, comprende:
- (a)
- poner en contacto el líquido corporal procedente del sujeto con MTBN4 o con uno o más fragmentos antigénicos del mismo, y
- (b)
- someter a ensayo la unión de anticuerpo en el líquido corporal a MTBN4, o a uno o más fragmentos antigénicos del mismo.
\vskip1.000000\baselineskip
9. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el líquido corporal es sangre.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en
el que el líquido corporal es plasma o suero.
11. Composición que comprende por lo menos dos
polipéptidos del complejo M. tuberculosis, estando dichos por
lo menos dos polipéptidos constituidos por la secuencia de MTBN4,
tal como se ilustra en la figura 1, y
por lo menos otro polipéptido del complejo M.
tuberculosis, que no se encuentra codificado por el genoma de
las células de la cepa BCG de M. bovis.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Vector, que comprende:
- (a)
- la molécula de ADN codificante del polipéptido MTBN4, tal como se ilustra en la figura 1; y
- (b)
- las secuencias reguladoras transcripcionales y traduccionales ligadas a dicha secuencia de ADN, permitiendo dichas secuencias reguladoras la expresión del polipéptido codificado por dicha secuencia de ADN en una célula,
- para su utilización como diagnóstico.
\vskip1.000000\baselineskip
13. Utilización de un polipéptido que comprende
la secuencia MTBN4, tal como se ilustra en la figura 1, una
composición según la reivindicación 11, o un vector según la
reivindicación 12, para la preparación de un medicamento para
diagnosticar la exposición de un sujeto a M.
tuberculosis.
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