PL186774B1 - Związki i sposoby do immunoterapii i diagnostyki gruźlicy - Google Patents
Związki i sposoby do immunoterapii i diagnostyki gruźlicyInfo
- Publication number
- PL186774B1 PL186774B1 PL96325373A PL32537396A PL186774B1 PL 186774 B1 PL186774 B1 PL 186774B1 PL 96325373 A PL96325373 A PL 96325373A PL 32537396 A PL32537396 A PL 32537396A PL 186774 B1 PL186774 B1 PL 186774B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- seq
- polypeptide
- tuberculosis
- ala
- amino acid
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 51
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 title 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 162
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 146
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims abstract description 143
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 66
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims abstract description 37
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 35
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 19
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims abstract description 15
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims abstract description 15
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 15
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 101710166488 6 kDa early secretory antigenic target Proteins 0.000 claims abstract description 11
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims abstract description 7
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 claims abstract description 6
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 5
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims abstract description 4
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims abstract 2
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 103
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 10
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims description 8
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 7
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 5
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 208000034189 Sclerosis Diseases 0.000 claims 1
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 137
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 137
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 135
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 103
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 38
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 32
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 31
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 30
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 26
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 26
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 25
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 19
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 19
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 17
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 14
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 13
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 13
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 13
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 11
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 10
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 9
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 9
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 9
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 9
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 9
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 9
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 9
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 8
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 8
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 8
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 6
- UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N N,N'-diphenyl-1,4-phenylenediamine Chemical compound C=1C=C(NC=2C=CC=CC=2)C=CC=1NC1=CC=CC=C1 UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100224410 Solanum tuberosum DPEP gene Proteins 0.000 description 6
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 6
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 6
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 101100117387 Catharanthus roseus DPAS gene Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 3
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 1,25-Dihydroxy-vitamin D3' Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CC(O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 241001049988 Mycobacterium tuberculosis H37Ra Species 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 2
- 102100023870 YLP motif-containing protein 1 Human genes 0.000 description 2
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 2
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012228 culture supernatant Substances 0.000 description 2
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical compound BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 2
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 238000000682 scanning probe acoustic microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 2-amino-4,6-dichloropyrimidine-5-carbaldehyde Chemical group NC1=NC(Cl)=C(C=O)C(Cl)=N1 GOJUJUVQIVIZAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710129902 34 kDa antigenic protein Proteins 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102100037373 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N Gly-Cys-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC([O-])=O CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 101710085938 Matrix protein Proteins 0.000 description 1
- 101710127721 Membrane protein Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- 101100494726 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) pep-4 gene Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006335 Phosphate-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058514 Phosphate-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710189650 Probable AP endonuclease Proteins 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 206010040914 Skin reaction Diseases 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N Tritium Chemical compound [3H] YZCKVEUIGOORGS-NJFSPNSNSA-N 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 102000019199 alpha-Mannosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010012864 alpha-Mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 230000002365 anti-tubercular Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000006065 biodegradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000001516 cell proliferation assay Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 1
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 1
- 238000005227 gel permeation chromatography Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 208000021760 high fever Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 239000003547 immunosorbent Substances 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 1
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 1
- 230000001323 posttranslational effect Effects 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 229940070741 purified protein derivative of tuberculin Drugs 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 230000036647 reaction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 230000035483 skin reaction Effects 0.000 description 1
- 231100000430 skin reaction Toxicity 0.000 description 1
- -1 spacer amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 229910052722 tritium Inorganic materials 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
1. Polipeptyd, znamienny tym, ze obejmuje sekwencje aminokwasowa przedstawiona w Identy- fikatorze Sekw. nr: 66, Identyfikatorze Sekw. nr: 79 albo Identyfikatorze Sekw. nr: 91. 2. Czasteczka DNA, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydowa kodujaca poli- peptyd okreslony w zastrz. 1. 3. Czasteczka DNA wedlug zastrz. 2, znamienna tym, ze obejmuje sekwencje nukleotydowa przedstawiona w Identyfikatorze Sekw. nr: 4, Identyfikatorze Sekw. nr: 17 albo Identyfikatorze Sekw. nr: 33 4. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, ze obejmuje czasteczke DNA okreslona w zastrz. 2. 6. Komórka gospodarza wedlug zastrz. 5, znamienna tym, ze jest wybrana z grupy skladajacej sie z komórek E. coli, drozdzy oraz ssaków. 7. Bialko fuzyjne, znamienne tym, ze obejmuje: polipeptyd okreslony w zastrz. 1 oraz TbH9; albo polipeptyd okreslony w zastrz. 1 oraz TbRa12; albo polipeptyd okreslony w zastrz. 1 oraz TbRa35; albo polipeptyd okreslony w zastrz. 1 oraz ESAT-6. 8. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, ze obejmuje: polipeptyd okreslony w zastrz. 1; albo czasteczke DNA okreslona w zastrz. 2; albo bialko fuzyjne okreslone w zastrz. 6; oraz fizjo- logicznie dopuszczalny nosnik. 10. Szczepionka, znamienna tym, ze obejmuje polipeptyd okreslony w zastrz. 1; albo cza- steczke DNA okreslona w zastrz. 2; albo bialko fuzyjne okreslone w zastrz. 6; oraz nieswoisty wzmacniacz odpowiedzi odpornosciowej. PL PL PL
Description
Wynalazek dotyczy ogólnie wykrywania, leczenia i zapobiegania zakażeniom Mycobacterium tuberculosis. Bardziej szczegółowo, wynalazek dotyczy polipeptydów stanowiących antygen Mycobacterium tuberculosis, albo jego część albo inną odmianę, oraz zastoso186 774 wania takich polipeptydów do diagnozowania i szczepienia przeciwko zakażeniom Mycobacterium tuberculosis.
Gruźlica jest przewlekłą chorobą zakaźną, która jest wywoływana przez zakażenie Mycobacterium tuberculosis. Jest ona głównie chorobą krajów rozwijających się, ale stanowi rosnący problem w regionach rozwiniętych świata, z 8 milionami nowych przypadków i 3 milionami zejść w ciągu roku. Jakkolwiek, zakażenie może przez czas dłuższy przebiegać bezobjawowo, choroba zwykle manifestuje się ostrym zapaleniem płuc, z wysoką gorączką i nieproduktywnym kaszlem. Pozostawiona bez leczenia powoduje poważne powikłania i zwykle kończy się śmiercią.
Jakkolwiek gruźlicę można ogólnie kontrolować stosując przewlekłą terapię antybiotykami, leczenie takie jest niewystarczające do zapobiegania szerzeniu się choroby. Zakażeni osobnicy mogą być bezobjawowi, ale czasem zakaźni. Oprócz tego, jakkolwiek postępowanie zgodnie ze schematem leczenia jest kluczowe, zachowanie pacjenta jest trudne do śledzenia. Niektórzy pacjenci nie odbywają pełnego kursu leczenia, co może prowadzić do braku jego skuteczności i rozwoju oporności na leki.
Zahamowanie rozsiewu gruźlicy wymaga skutecznego szczepienia i dokładnej, wczesnej diagnostyki choroby. Obecnie, szczepienie żywymi bakteriami jest najskuteczniejszą metodą wywoływania ochronnej odporności. Najpowszechniej stosowanym w tym celu Mycobacterium jest Bacillus Calmette-Guerin (BCG), niezjadliwy szczep Mycobacterium bovis. Jednakże, bezpieczeństwo i skuteczność BCG stanowi przedmiot kontrowersji i niektóre kraje, takie jak Stany Zjednoczone, nie szczepią populacji ogólnej. Diagnostyka jest zwykle przeprowadzana przy użyciu testów skórnych, które obejmują śródskórną ekspozycję na gruźliczą PPD (frakcja oczyszczonych białek). Reakcja swoistych antygenowo limfocytów T powoduje w miejscu wstrzyknięcia możliwy do zmierzenia odczyn w 48-72 godziny po wstrzyknięciu, co świadczy o ekspozycji na antygeny mykobakterii. Wrażliwość i swoistość stanowią jednakże problem w przypadku tego testu, zaś osobników szczepionych BCG nie można odróżnić od osobników zarażonych.
Jakkolwiek wykazano, że makrofagi działają jako główny efektor odporności na M. tuberculosis, głównymi induktorami tej odporności są limfocyty T. Zasadnicza rola limfocytów T w odporności przeciwko Mycobacterium tuberculosis demonstrowana jest częstym występowaniem Mycobacterium tuberculosis u pacjentów cierpiących na AIDS, co jest spowodowane zubożeniem w limfocyty T CD4, spowodowane zakażeniem ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV). Wykazano, że limfocyty T CD4 reagujące na mykobakterie wytwarzają znaczne ilości interferonu gamma (IFN-y), który, jak wykazano, wyzwala u makrofagów efekt niszczący mykobakterie u myszy. Jakkolwiek rola IFN-y u ludzi jest mniej poznana, badania wykazały, że 1,25-dihydroksy-witamina D3, sama albo w kombinacji z IFN-y albo czynnikiem martwicy nowotworu-alfa, aktywuje ludzkie makrofagi do hamowania zakażenia M. tuberculosis. Ponadto, wiadomo, że iFN-y pobudza ludzkie makrofagi do wytwarzania 1,25-dihydroksy-witaminy D3. Podobnie wykazano, że IL-12 odgrywa rolę w pobudzaniu odporności na zakażenie Mycobacterium tuberculosis. Przegląd immunologii zakażenia Mycobacterium tuberculosis opisano w Chan i Kaufmann, Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, (wyd) Bloom, ASM Press, Waszyngton, DC, 1994.
Istnieje więc w stanie techniki zapotrzebowanie na ulepszone szczepionki i sposoby zapobiegania, leczenia i wykrywania gruźlicy. Wynalazek spełnia te potrzeby i dostarcza innych, dalszych korzyści.
Pokrótce, wynalazek dostarcza substancji i sposobów do zapobiegania i diagnozowania gruźlicy. W jednym z aspektów, dostarczono polipeptydów obejmujących immunogenną część rozpuszczalnego antygenu Mycobacterium tuberculosis albo odmiany takiego antygenu, który różni się wyłącznie konserwatywnymi zastąpieniami i/lub modyfikacjami. W jednym wykonaniu tego aspektu, antygen rozpuszczalny ma jedną z poniższych sekwencji końca N:
(a) Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-ne-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-AlaLeu; (Identyfikator Sekw. nr 120) (b) Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser; (Identyfikator Sekw. nr 121)
186 774 (c) Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg; (Identyfikator Sekw. nr 122) (d) T yr-T yr-T rp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-T rp-Gly-Pro ; (Identyfikator Sekw. nr 123) (e) Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val; (Identyfikator Sekw. nr 124) (f) Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro; (Identyfikator Sekw. nr 125) (g) Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser; (Identyfikator Sekw. nr 126) (h) Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly; (Identyfikator Sekw. nr 127) (i) Asp-Pro-A]a-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-AsnSer-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn; (Identyfikator Sekw. nr 128) (j) Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser; (Identyfikator Sekw. nr 134) (k) Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-fle-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp; (Identyfikator Sekw. nr 135)Iub (l) Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (Identyfikator Sekw. nr 136) gdzie Xaa może być dowolnym aminokwasem.
W pokrewnym aspekcie dostarczone są polipeptydy obejmujące immunogenną część antygenu Mycobacterium tuberculosis, albo jego odmiany która różni się wyłącznie konserwatywnymi zastąpieniami i/lub modyfikacjami, a antygen ma jedną z poniższych sekwencji końcaN:
(m) Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-HisLeu-Val; (Identyfikator Sekw. nr 137) Iub (n) Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-GlyArg-Arg-Xaa-Phe; (Identyfikator Sekw. nr 129) gdzie Xaa może być dowolnym aminokwasem.
W innym wykonaniu, antygen obejmuje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej sekwencje wymienione jako Identyfikatory Sekw. nr: 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 99 i 101, ich sekwencje komplementarne i sekwencje, które hybrydyzująz sekwencjami wymienionymi jako Identyfikatory Sekw. nr: 1, 2, 4-10, 13-25, 52, 99 i 101 oraz ich sekwencjami komplementarnymi, w umiarkowanie surowych warunkach hybrydyzacji.
W pokrewnym aspekcie, polipeptydy obejmują immunogenną część antygenu Mycobacterium tuberculosis, albo odmianę takiego antygenu, która różni się wyłącznie konserwatywnymi zastąpieniami i/lub modyfikacjami, a antygen obejmuje sekwencję aminokwasową kodowaną przez sekwencję DNA wybraną z grupy obejmującej sekwencje wymienione jako Identyfikatory Sekw. nr: 26-51 ich sekwencje komplementarne i sekwencje, które hybrydyzują z sekwencjami wymienionymi jako Identyfikatory Sekw. nr: 26-51 oraz ich sekwencjami komplementarnymi, w umiarkowanie surowych warunkach hybrydyzacji.
W pokrewnym aspekcie, dostarczono również sekwencji DNA kodujących powyższe polipeptydy, wektorów ekspresyjnych obejmujących te sekwencje DNA i komórek gospodarza transformowanych albo transfekowanych takimi wektorami ekspresyjnymi.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza białek fuzyjnych obejmujących pierwszy i drugi polipeptyd według wynalazku, albo alternatywnie, polipeptyd według wynalazku i znany antygen Mycobacterium tuberculosis.
W innych aspektach, wynalazek dostarcza kompozycji farmaceutycznych obejmujących jeden albo wiele powyższych polipeptydów, albo cząsteczkę DNA kodującą takie polipeptydy i nośnik dopuszczalny fizjologicznie. Wynalazek dostarcza również szczepionek obejmujących jeden albo wiele polipeptydów, jak opisane wyżej i nieswoisty wzmacniacz odpowiedzi odpornościowej, wraz ze szczepionkami obejmującymi jedną albo wiele sekwencji DNA kodujących takie polipeptydy i nieswoisty wzmacniacz odpowiedzi odpornościowej.
186 774
W jeszcze innym aspekcie, dostarczono sposobów wywoływania ochronnej odporności u pacjenta, obejmujących podawanie pacjentowi skutecznej ilości jednego lub wielu powyższych polipeptydów.
W dalszych aspektach wynalazku, dostarczono sposobów i zastawów diagnostycznych do wykrywania gruźlicy u pacjenta. Sposoby obejmują kontaktowanie komórek skóry pacjenta z jednym albo wieloma powyższymi polipeptydami i wykrywanie odpowiedzi odpornościowej na skórze pacjenta. Zestawy diagnostyczne obejmująjeden albo wiele powyższych polipeptydów w kombinacji z aparatem odpowiednim do kontaktowania polipeptydów z komórkami skóry pacjenta.
Te i inne aspekty wynalazku staną się widoczne w odniesieniu do poniższego szczegółowego opisu i dołączonych rysunków. Wszystkie odnośniki ujawnione tu są włączone jako odnośniki w całości, ponieważ włączono je indywidualnie.
Figura 1A i B pokazuje pobudzenie proliferacji i wytwarzania interferonu-γ w limfocytach T pochodzących od, odpowiednio, pierwszego i drugiego dawcy odpornego na Mycobacterium tuberculosis, przez antygeny 14 kDa, 20 kDa i 26 kDa opisane w Przykładzie 1.
Figura 2 pokazuje pobudzenie proliferacji i wytwarzania interferonu-y w limfocytach T pochodzących od dawcy odpornego na Mycobacterium tuberculosis, przez dwa reprezentatywne polipeptydy, TbRa3 i TbRa9.
Identyfikator Sekw. nr 1 jest sekwencją DNA TbRal
Identyfikator Sekw. nr 2 jest sekwencją DNA TbRal 0
Identyfikator Sekw. nr 3 jest sekwencją DNA TbRal 1
Identyfikator Sekw. nr 4 jest sekwencją DNA TbRal 2
Identyfikator Sekw. nr 5 jest sekwencją DNA TbRal 3
Identyfikator Sekw. nr 6 jest sekwencją DNA TbRal 6
Identyfikator Sekw. nr 7 jest sekwencją DNA TbRal 7
Identyfikator Sekw. nr 8 jest sekwencją DNA TbRal 8
Identyfikator Sekw. nr 9 jest sekwencją DNA TbRal 9
Identyfikator Sekw. nr 10 jest sekwencją DNA TbRa24
Identyfikator Sekw. nr 11 jest sekwencją DNA TbRa26
Identyfikator Sekw. nr 12 jest sekwencją DNA TbRa28
Identyfikator Sekw. nr 13 jest sekwencją DNA TbRa29
Identyfikator Sekw. nr 14 jest sekwencją DNA TbRa2A
Identyfikator Sekw. nr 15 jest sekwencją DNA TbRa3
Identyfikator Sekw. nr 16 jest sekwencją DNA TbRa32
Identyfikator Sekw. nr 17 jest sekwencją DNA TbRa35
Identyfikator Sekw. nr 18 jest sekwencją DNA TbRa36
Identyfikator Sekw. nr 19 jest sekwencją DNA TbRa4
Identyfikator Sekw. nr 20 jest sekwencją DNA TbRa9
Identyfikator Sekw. nr 21 jest sekwencją DNA TbRaB
Identyfikator Sekw. nr 22 jest sekwencją DNA TbRaC
Identyfikator Sekw. nr 23 jest sekwencją DNA TbRaD
Identyfikator Sekw. nr 24 jest sekwencją DNA YYWCPG
Identyfikator Sekw. nr 25 jest sekwencją DNA AAMK
Identyfikator Sekw. nr 26 jest sekwencją DNA TbL-23
Identyfikator Sekw. nr 27 jest sekwencją DNA TbL-24
Identyfikator Sekw. nr 28 jest sekwencją DNA TbL-25
Identyfikator Sekw. nr 29 jest sekwencją DNA TbL-28
Identyfikator Sekw. nr 30 jest sekwencją DNA TbL-29
Identyfikator Sekw. nr 31 jest sekwencją DNA TbH-5
Identyfikator Sekw. nr 32 jest sekwencją DNA TbH-8
Identyfikator Sekw. nr 33 jest sekwencją DNA TbH-9
Identyfikator Sekw. nr 34 jest sekwencją DNA TbM-1
Identyfikator Sekw. nr 35 jest sekwencją DNA TbM-3
Identyfikator Sekw. nr 36 jest sekwencją DNA TbM-6
186 774
Identyfikator Sekw. nr 37 jest sekwencją DNA TbM-7 Identyfikator Sekw. nr 38 jest sekwencją DNA TbM-9 Identyfikator Sekw. nr 39 jest sekwencją DNA TbM-12 identyfikator Sekw. nr 40 jest sekwencją DNA TbM-13 Identyfikator Sekw. nr 41 jest sekwencją DNA TbM-14 Identyfikator Sekw. nr 42 jest sekwencją DNA TbM-15 Identyfikator Sekw. nr 43 jest sekwencją DNA TbH-4 Identyfikator Sekw. nr 44 jest sekwencją DNA TbH-4-FWD Identyfikator Sekw. nr 45 jest sekwencją DNA TbH-12 Identyfikator Sekw. nr 46 jest sekwencją DNA Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 47 jest sekwencją DNA Tb38-4 Identyfikator Sekw. nr 48 jest sekwencją DNA TbL-17 Identyfikator Sekw. nr 49 jest sekwencją DNA TbL-20 Identyfikator Sekw. nr 50 jest sekwencją DNA TbL-21 Identyfikator Sekw. nr 51 jest sekwencją DNA TbH-16 Identyfikator Sekw. nr 52 jest sekwencją DNA DPEP Identyfikator Sekw. nr 53 jest domniemaną sekwencją aminokwasową DPEP Identyfikator Sekw. nr 54 jest sekwencją białkową końca N antygenu DPV Identyfikator Sekw. nr 55 jest sekwencją białkową końca N antygenu AVGS Identyfikator Sekw. nr 56 jest sekwencją białkową końca N antygenu AAMK Identyfikator Sekw. nr 57 jest sekwencją białkową końca N antygenu YYWC Identyfikator Sekw. nr 58 jest sekwencją białkową końca N antygenu DIGS Identyfikator Sekw. nr 59 jest sekwencją białkową końca N antygenu AEES Identyfikator Sekw. nr 60 jest sekwencją białkową końca N antygenu DPEP Identyfikator Sekw. nr 61 jest sekwencją białkową końca N antygenu APKT Identyfikator Sekw. nr 62 jest sekwencją białkową końca N antygenu DPAS Identyfikator Sekw. nr 63 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal Identyfikator Sekw. nr 64 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 0 Identyfikator Sekw. nr 65 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 1 Identyfikator Sekw. nr 66 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 2 Identyfikator Sekw. nr 67 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 3 Identyfikator Sekw. nr 68 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 6 Identyfikator Sekw. nr 69 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 7 Identyfikator Sekw. nr 70 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 8 Identyfikator Sekw. nr 71 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRal 9 Identyfikator Sekw. nr 72 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa24 Identyfikator Sekw. nr 73 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa26 Identyfikator Sekw. nr 74 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa28 Identyfikator Sekw. nr 75 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa29 Identyfikator Sekw. nr 76 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa2A Identyfikator Sekw. nr 77 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa3 Identyfikator Sekw. nr 78 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa32 Identyfikator Sekw. nr 79 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa35 Identyfikator Sekw. nr 80 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa36 Identyfikator Sekw. nr 81 jest domniemaną sekwencją aminokwasowąTbRa4 Identyfikator Sekw. nr 82 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRa9 Identyfikator Sekw. nr 83 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRaB Identyfikator Sekw. nr 84 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRaC Identyfikator Sekw. nr 85 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbRaD Identyfikator Sekw. nr 86 jest domniemaną sekwencją aminokwasową YYWCPG Identyfikator Sekw. nr 87 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbAAMK Identyfikator Sekw. nr 88 jest domniemaną sekwencją aminokwasową Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 89 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbH-4 Identyfikator Sekw. nr 90 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbH-8
186 774
Identyfikator Sekw. nr 91 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbH-9 Identyfikator Sekw. nr 92 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbH-12 Identyfikator Sekw. nr 93 jest sekwencją, aminokwasową TbRa peptydu 1 Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 94 jest sekwencją aminokwasową TbRa peptydu 2 Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 95 jest sekwencją aminokwasową TbRa peptydu 3 Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 96 jest sekwencją aminokwasową TbRa peptydu 4 Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 97 jest sekwencją aminokwasową TbRa peptydu 5 Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 98 jest sekwencją aminokwasową TbRa peptydu 6 Tb38-1 Identyfikator Sekw. nr 99 jest sekwencją DNA DPAS
Identyfikator Sekw. nr 100 jest domniemaną, sekwencją aminokwasową DPAS
Identyfikator Sekw. nr 101 jest sekwencją DNA DPV
Identyfikator Sekw. nr 102 jest domniemaną sekwencją aminokwasową DPV
Identyfikator Sekw. nr 103 jest sekwencją DNA ESAT-6
Identyfikator Sekw. nr 104 jest domniemaną sekwencją aminokwasową ESAT-6
Identyfikator Sekw. nr 105 jest sekwencją DNA TbH-8-2
Identyfikator Sekw. nr 106 jest sekwencją DNA TbH-9FL
Identyfikator Sekw. nr 107 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbH-9FL
Identyfikator Sekw. nr 108 jest sekwencją DNA TbH-9-1
Identyfikator Sekw. nr 109 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbH-9-1
Identyfikator Sekw. nr 110 jest sekwencją DNA TbH-9-4
Identyfikator Sekw. nr 111 jest domniemaną sekwencją aminokwasową TbH-9-4
Identyfikator Sekw. nr 112 jest sekwencją DNA Tb38-1F2 IN
Identyfikator Sekw. nr 113 jest sekwencją DNA Tb38-2F2 RP
Identyfikator Sekw. nr 114 jest domniemaną sekwencją aminokwasową. Tb37-FL
Identyfikator Sekw. nr 115 jest domniemaną sekwencją aminokwasową Tb38-IN
Identyfikator Sekw. nr 116 jest sekwencją DNA Tb38-1F3
Identyfikator Sekw. nr 117 jest domniemanąsekwencjąaminokw&5owąTb38-lF3
Identyfikator Sekw. nr 118 jest sekwencją DNA Tb38-1F5
Identyfikator Sekw. nr 119 jest sekwencją DNA Tb38-1F6
Identyfikator Sekw. nr 120 jest domniemaną sekwencją aminokwasową końca N DPV Identyfikator Sekw. nr 121 jest domniemaną sekwencją aminokwasową końca N AVGS Identyfikator Sekw. nr 122 jest domniemaną sekwencją aminokwasową końca N AAMK
Identyfikator Sekw. nr 123 jest domniemaną sekwencją aminokwasową końca N YYWC
Identyfikator Sekw. nr 124 jest domniemaną sekwencją aminokwasową końca N DIGS Identyfikator Sekw. nr 125 jest domniemaną, sekwencją aminokwasową końca N AEES Identyfikator Sekw. nr 126 jest domniemaną, sekwencją aminokwasową końca N DPEP Identyfikator Sekw. nr 127 jest domniemaną, sekwencją aminokwasową końca N APKT Identyfikator Sekw. nr 128 jest domniemaną sekwencją aminokwasową DPAS Identyfikator Sekw. nr 129 jest sekwencją białkową antygenu końca N DPPD Identyfikatory Sekw. nr 130 - 133 są sekwencjami białkowymi czterech fragmentów DPPD z trawienia bromkiem cyanogenu
Identyfikator Sekw. nr 134 jest N końcową sekwencją białkową antygenu XDS Identyfikator Sekw. nr 135 jest N końcową sekwencją białkową antygenu AGD Identyfikator Sekw. nr 136 jest N końcową sekwencją białkową antygenu APE Identyfikator Sekw. nr 137 jest N końcową sekwencją białkową antygenu XYI Jak zaznaczono powyżej wynalazek dotyczy ogólnie kompozycji i sposobów do zapobiegania, leczenia i diagnozowania gruźlicy. Kompozycje według wynalazku obejmują polipeptydy obejmujące przynajmniej jedną część immunogenną antygenu Mycobacterium tuberculosis albo odmiany takiego antygenu, która różni się jedynie konserwatywnymi zastąpieniami i/lub modyfikacjami. Polipeptydy w zakresie wynalazku obejmują, choć nie są ograniczone do rozpuszczalnych, immunogennych antygenów M. tuberculosis. „Rozpuszczalnym antygenem M. tuberculosis jest białko pochodzące z M. tuberculosis, które występuje
186 774 w filtracie hodowli M. tuberculosis. W znaczeniu tu użytym, termin „polipeptyd” obejmuje łańcuchy aminokwasowe o dowolnej długości, w tym białka pełnej długości (tj. antygeny), w których reszty aminokwasowe połączone są kowalencyjnymi wiązaniami peptydowymi. Tak więc, polipeptyd obejmujący immunogenną część jednego z powyższych antygenów może składać się całkowicie z części immunogennej, albo może zawierać dodatkowe sekwencje. Dodatkowe sekwencje mogą pochodzić z natywnego antygenu M. tuberculosis albo mogą być heterologiczne, i mogą (ale nie muszą) być immunogenne.
„Immunogenne” w znaczeniu tu użytym dotyczy zdolności do wywoływania odpowiedzi odpornościowej (np. komórkowej) u pacjenta, takiego jak człowiek, i/lub w próbce biologicznej. W szczególności, antygeny które są immunogenne (i immunogenne części albo inne odmiany takich antygenów) są zdolne do pobudzania proliferacji komórek, wytwarzania interleukiny-12 i/lub wytwarzania interferonu-y w próbkach biologicznych zawierających jedną albo wiele komórek wybranych z grupy obejmującej limfocyty T, NK, B i makrofagi, które to komórki pochodzą od osobnika odpornego na M. tuberculosis. Polipeptydy obejmujące przynajmniej immunogenną część jednego albo wielu antygenów M. tuberculosis mogą być zastosowane ogólnie do wykrywania gruźlicy albo do wywoływania ochronnej odporności przeciwgruźliczej u pacjenta.
Kompozycje i sposoby według wynalazku obejmują również odmiany powyższych polipeptydów. „Odmiana” w znaczeniu tu użytym, oznacza polipeptyd, który różni się od natywnego antygenu wyłącznie konserwatywnymi zastąpieniami i/lub modyfikacjami w taki sposób, że zachowana jest zdolność polipeptydu do wywoływania odpowiedzi odpornościowej. Odmiany takie mogą być ogólnie określone przez modyfikowanie jednej z powyższych sekwencji polipeptydowych i badanie właściwości immunogennych zmodyfikowanych polipeptydów przy użyciu, przykładowo, opisanych tu reprezentatywnych procedur.
„Zastąpienie konserwatywne” jest to takie zastąpienie, w którym aminokwas zastępowany jest innym aminokwasem o podobnych właściwościach, w taki sposób, że specjalista w dziedzinie chemii peptydów może oczekiwać, że struktura drugorzędową i hydropatyczna natura polipeptydu pozostanie zasadniczo niezmieniona. Ogólnie, poniższe grupy aminokwasów stanowią zmiany konserwatywne: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, thr, tyr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his; i (5) phe, tyr, trp, his.
Odmiany mogą być również (albo alternatywnie) modyfikowane przez, przykładowo, delecję albo addycję aminokwasów, które mają znikomy wpływ na właściwości immunogenne, strukturę drugorzędową i hydropatyczną naturę polipeptydu. Przykładowo, polipeptyd może być sprzęgnięty z sekwencją sygnałową (albo liderową) na końcu N białka, które współtranslacyjnie albo potranslacyjnie kieruje przeniesieniem białka. Polipeptyd może być również sprzęgnięty z łącznikiem albo inną sekwencją w celu ułatwienia syntezy, oczyszczania albo identyfikacji polipeptydu (np. poli-His), albo w celu zwiększenia wiązania się polipeptydu z podłożem stałym. Przykładowo, polipeptyd może być sprzęgnięty z regionem Fc immunoglobuliny.
W pokrewnym aspekcie, ujawniono kombinowane polipeptydy. „Polipeptyd kombinowany” oznacza polipeptyd obejmujący przynajmniej jedną z powyższych części immunogennych i jedną albo wiele dodatkowych sekwencji immunogennych M. tuberculosis, które są połączone przez wiązanie peptydowe w jeden łańcuch aminokwasowy. Sekwencje mogą być przyłączone bezpośrednio (tj. bez rozdzielających aminokwasów) albo mogą być połączone sekwencją łącznikową (np. Gly-Cys-Gly), które nie zmniejsza istotnie właściwości immunogennych polipeptydów składowych.
Ogólnie, antygeny M. tuberculosis i sekwencje DNA kodujące takie antygeny, mogą być wytwarzane przy użyciu różnych procedur. Przykładowo, antygeny rozpuszczalne mogą być izolowane z filtratów hodowli M. tuberculosis procedurami znanymi specjalistom w dziedzinie, w tym chromatografią anionowymienną albo chromatografią w odwróconych fazach. Oczyszczone antygeny są następnie badane pod względem ich zdolności do wywoływania odpowiedniej odpowiedzi odpornościowej (np. komórkowej) przez zastosowanie, przykładowo, opisanych tu reprezentatywnych metod. Antygeny immunogenne mogą być następnie
186 774 częściowo sekwencjonowane przy użyciu technik takich jak tradycyjna metoda Edmana, patrz, Edman i Berg, Eur. J. Biochem. 80: 116-132,1967.
Antygeny immunogenne mogą być również wytwarzane rekombinacyjnie, przy użyciu sekwencji DNA kodujących antygen, które zostały wprowadzone do wektora ekspresyjnego i wyrażone w odpowiednim organizmie gospodarza. Cząsteczki DNA kodujące rozpuszczalne antygeny można izolować przez przesiewanie odpowiedniej biblioteki ekspresyjnej M. tuberculosis przy użyciu surowic odpornościowych (np. króliczych) wywołanych swoiście przeciwko rozpuszczalnym antygenom M. tuberculosis. Sekwencje DnA kodujące antygeny, które mogą ale nie muszą być rozpuszczalne można zidentyfikować przez przesiewanie odpowiedniej ekspresyjnej biblioteki genomowej albo cDNA M. tuberculosis przy użyciu surowic uzyskanych od pacjentów zarażonych M. tuberculosis. Przesiewanie takie można ogólnie wykonać stosując techniki dobrze znane specjalistom w dziedzinie, takie jak opisane w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
Sekwencje DNA kodujące antygeny rozpuszczalne można również otrzymać przez przesiewanie odpowiedniej biblioteki cDNA albo genomowego DNA M. tuberculosis w poszukiwaniu sekwencji DNA, które hybrydyzują ze zdegenerowanymi oligonukleotydami pochodzącymi z częściowych sekwencji aminokwasowych izolowanych antygenów rozpuszczalnych. Zdegenerowane sekwencje oligonukleotydowe do zastosowania w takim przesiewaniu można zaprojektować i zsyntetyzować, po czym wykonać przesiewanie jak to opisano w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manuał, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989 (i odnośnikach tam cytowanych). Można również wykorzystać reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), stosując powyższe oligonukleotydy w sposobach dobrze znanych w dziedzinie wiedzy, w celu izolowania sondy kwasu nukleinowego z biblioteki cDNA albo biblioteki genomowej. Przesiewanie biblioteki można wykonać stosując wyizolowaną sondę.
Alterantywnie, biblioteki genomowe i cDNA pochodzące z M. tuberculosis można przesiewać bezpośrednio stosując jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) albo linie limfocytów T pochodzące od jednego albo wielu osobników odpornych M. tuberculosis. Ogólnie, PBMC i/lub limfocyty T do stosowania w takim przesiewaniu można wytworzyć jak to opisano niżej. Bezpośrednie przeszukiwanie biblioteki można wykonać przez badanie pul wyrażanych białek rekombinowanych pod względem ich zdolności do wywoływania proliferacji i/lub wytwarzania interferonu-y w limfocytach T pochodzących od osobnika odpornego na M. tuberculosis. Alternatywnie, potencjalne antygeny limfocytów T mogą być początkowo selekcjonowane w oparciu o reaktywność z przeciwciałami, jak to opisano wyżej.
Niezależnie od sposobu wytwarzania, antygeny (i ich immunogenne części) opisane tu (które mogą ale nie muszą być rozpuszczalne) mają zdolność do wywoływania reakcji odpornościowej. Konkretniej, antygeny mają zdolność do wywoływania proliferacji i/lub wytwarzania cytokin (tj. interferonu-y i/lub interleukiny-12) w limfocytach T, NK, B i/lub makrofagach pochodzących od osobników odpornych na M. tuberculosis. Wybór rodzaju komórki do zastosowania w badaniu odpowiedzi odpornościowej na antygen powinien zależeć od pożądanej odpowiedzi. Przykładowo, wytwarzanie interleukiny-12 bada się przy użyciu preparatów zawierających limfocyty B i/lub makrofagi. Osobnikiem odpornym na M. tuberculosis jest taki, który uważany jest za oporny na rozwój gruźlicy dzięki skutecznej reakcji limfocytów T wobec M. tuberculosis (tj . zasadniczo wolny od objawów choroby). Osobników takich można zidentyfikować w oparciu o silnie dodatnią (tj. odczyn większy niż około 10 mm średnicy) reakcję skórną na białka tuberkulinowe (PPD) i brak jakichkolwiek objawów gruźlicy. Limfocyty T, NK, B i makrofagi pochodzące od osobników odpornych na M. tuberculosis można wypreparować stosując metody znane specjalistom w dziedzinie. Przykładowo, preparatyka PBMC (komórek jednojądrzastych krwi obwodowej) może być wykorzystana bez dalszego rozdziału składowych komórek. PBMC można ogólnie wypreparować, przykładowo, przez wirowanie na gradiencie gęstości przez Ficoll™ (Winthrop Laboratories, NY). Limfocyty T do zastosowania w opisanych tu testach można również oczyścić z PBMC. Alternatywnie, można zastosować wzbogacone linie limfocytów T reaktywnych wobec białek myko10
186 774 bakterii albo klony limfocytów T reaktywne wobec poszczególnych białek mykobakterii. Takie klony limfocytów T można wywołać przez, przykładowo, hodowanie PBMC od osobników odpornych na M. tuberculosis z białkami mykobakterii przez okres 2-4 tygodni. Umożliwia to propagację wyłącznie limfocytów T swoistych wobec białek mykobakterii, dając linie składające się wyłącznie z takich komórek. Komórki takie można następnie klonować i badać z poszczególnymi białkami, stosując sposoby znane specjalistom w dziedzinie, w celu szczegółowego określenia swoistości poszczególnych limfocytów T. Ogólnie, antygeny, które okazały się pozytywne w testach proliferacji i/lub wytwarzania cytokin (tj. wytwarzaniu interferonu-γ i interleukiny-12) wykonanych przy użyciu limfocytów T, NK, B i/lub makrofagów pochodzących od osobnika odpornego naM. tuberculosis uważane są za immunogenne. Testy takie można wykonać stosując, przykładowo, procedury opisane poniżej. Części immunogenne takich antygenów można zidentyfikować stosując podobne testy, i mogą one występować w opisanych tu polipeptydach.
Zdolność polipeptydu (np. immunogennego antygenu albo jego części albo innej odmiany) do wywołania proliferacji komórek bada się przez kontaktowanie komórek (np. limfocytów T i/lub NK) z polipeptydem i mierzenie proliferacji komórek. Ogólnie, ilość polipeptydu, który wystarcza do badania około I05 komórek zawiera się od około 10 ng/ml do około 100 pg/ml i korzyytnie wyyosi około 10 pg/ml. Inkubację polipeptyyd z komórkami przzprowadza się zwykle w 37°C przez około sześć dni. Po inkubacji z oolioeptγdpm, komórki bada się pod względem odpowiedzi proliferacγjkej, którą można badać sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie, takimi jak eksookowanip komórek na puls tymidyny ykaUowckęj radioaktywnie i mierzenie wbudowywania znacznika do DNA komórki. Ogólnie, polipeotγd, który powoduje przynajmniej trzykrotny wzrost proliferacji powyżej tła (tj. proliferacji obserwowanej dla komórek hodowanych bez ooiioαptγdu) uważany jest za zdolny do wywoływania proliferacji.
Zdolność ooliopptγdu do pobudzania wytwarzania interferonu-y i/lub ikterlebUikγ-12 w komórkach może być badana przez kontaktowanie komórek z pklippptydem i mierzenie poalomu interferonu-y albo iktprlpuainy--k wyłwkrzokγcłi w komórce. Ogólnie, ilość polipkyioóu, który wystarcza do badania około 10y yomórpk zαwiesa się od kkoło 1 0 ng/ml do oUoło W0 gg/ml iUorzγstkie wynosi okofo 10 gg/ml. pkliopptγdu yUomóókaml przeprowadza się zwykle w 37°C przez około sześć dni. Polioeptyd może, ale nie musi, być unieruchomiony na podłożu stałym, takim jak perełki albo mikrosfery ulegające degradacji biologicznej, takie jak opisane w patencie USA nr 4,897,268 i 5,075,109. Inkubację polipeptydu z komórkami przeprowadza się zwykle w 37°C przez około sześć dni. Po inkubacji z ooliprotydem, komórki bada się pod kątem interferonu-y i/lub ikterleuUikγ-12 (albo jednej albo wielu ich podjednostek), które można badać sposobami znanymi specjalistom w dziedzinie, tyaimi jak enzymkSγcpoγ test immunosorpcyjny (ELISA) albo, w przypadku pocljednostki P70 IL-12 testem biologicznym takim jak test mierzący proliferację limfocytów T. Ogólnie, Ooiiprρtyd powodujący wytworzenie oryγkąjmkjpę 50 pg interferonu-y na ml nadsączu hodow^ego (zawierającego 104-105 limfocytów T na ml) uważany jent za poaódzającγ wytwarzanie interferonu-y. Poiippptyd powodujący wytworzenie Jrryγnαęwkięj 10 pg Okdęaekostki P70 IL-12 i/lub u00 pg/ml podj ednostfo P40 IL-12 na 105mγkΌórnów albo limfocytów B (albo na 3xi0u PBMC) uważany jest: za pobudzający wγrtwarzαrαe IL-12.
Ogólnie, antygenami iwwukogenkymi są takiα antygeny, które ooaueyają proliferację i/lub wytwarzanie cγtoUin (tj. wγiwarkkme interferonmy i/lub mterleuOliay-]2) przez Emfocyuy T, NK, B i/lub tkaarofęgi ooyhodzkce od prtrsnajmnięi 25% oskbmUów odporkycó na M tuberculosis. W(śród tych immukogakkyfh aktygaków', oolioeotydγ wγkrrwjkfa naj silniejsze właściwości terapeutyczne mogą być odróżmokα w oparciu o wielkość reakcji w oowγższyclr testayłl oraz w ooαγcju o procent osobników dfo których obsyrwuęa się reakcją Oprócz tego, antygcny wykazujące kαęsiin-ęjszα właściw^ci terapeyeyfzne niw będą oopuezać proliferacji i/lub wytwarzania fytoUjk in vitro w Uowórkach pofhoezecych od ponad 25% osobników, którzy nie są odporni na M. tuberculosis, eliminując w ten sposób reakcje, które nie są swoiste dla kowórrU reagujących na M. tuberculosis. Antygeny, które wywołują odpowiedź u znacznego odsetka preparatów limfocytów T, B, NK i/lub wαkrofagów oofhodyącγch od
186 774 osobników odpornych na M. tuberculosis (z rzadkim występowaniem reakcji w preparatach komórkowych pochodzących od innych osobników) mają najsilniejsze właściwości terapeutyczne.
Antygeny o najwyższych właściwościach można również zidentyfikować w oparciu o ich zdolność do zmniejszania ciężkości zakażenia M. tuberculosis u zwierząt doświadczalnych, gdy podane są jako szczepionka. Odpowiednie preparaty szczepionek do zastosowania na zwierzętach doświadczalnych opisane są szczegółowo poniżej. Skuteczność ich można określić w oparciu o zdolność antygenu do powodowania co najmniej około 50% zmniejszenia liczby bakterii i/lub co najmniej około 40% zmniejszenia śmiertelności po zakażeniu doświadczalnym. Odpowiednie zwierzęta doświadczalne obejmują myszy, świnki morskie i naczelne.
Antygeny wykazujące najsilniejsze właściwości diagnostyczne można ogólnie identyfikować w oparciu o zdolność do wywoływania odpowiedzi w teście skórnym wykonanym na osobnikach z czynną gruźlicą, ale nie w teście wykonanym na osobnikach nie zakażonych M. tuberculosis. Testy skórne można ogólnie wykonywać jak to opisano niżej, przy odczynie przynajmniej średnicy 5 mm uważanym z pozytywny.
Immunogenne części opisanych tu antygenów można wytworzyć i zidentyfikować stosując dobrze znane techniki, takie jak opisane przez Paul, Fundamental Immunology, wyd. 3, Raven Press, 1993, str. 243-247 i cytowane tam odnośniki. Techniki takie obejmują przesiewanie części polipeptydu natywnego antygenu pod kątem ich właściwości immunogennych. Reprezentatywne testy proliferacji i wytwarzania cytokin opisane tu można generalnie zastosować do przesiewania. Częścią immunogenną polipeptydu jest część, która w reprezentatywnych testach powoduje reakcję odpornościową (np. proliferację, wytwarzanie interferonu-γ i/lub interleukiny-12) która jest zasadniczo podobna do wywołanej przez antygen pełnej długości. Innymi słowy, część immunogenną antygenu może wywoływać przynajmniej około 20%, zaś korzystnie około 100% proliferacji wywołanej przez antygen pełnej długości w opisanym tu modelu proliferacji komórek. Część immunogenną może również, albo alterantywnie, pobudzać wytwarzanie przynajmniej około 20%, zaś korzystnie około 100% interferonu-γ i/Iub interleukiny-12 wywołanej przez antygen pełnej długości w opisanym tu teście.
Części i inne odmiany antygenów M. tuberculosis można wytworzyć syntetycznie albo rekombinacyjnie. Polipeptydy syntetyczne posiadające mniej niż 100 aminokwasów, i ogólnie mniej niż 50 aminokwasów mogą być wytworzone przy użyciu technik dobrze znanych specjalistom w dziedzinie wiedzy. Przykładowo, polipeptydy takie można zsyntetyzować stosując dostępne w handlu techniki na podłożu stałym, takie jak metoda syntezy na podłożu stałym Merrifielda, gdzie aminokwasy dodawane są kolejno do rosnącego łańcucha aminokwasowego. Patrz, Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85: 2149-2146, 1963. Przyrządy do automatycznej syntezy polipeptydów dostępne są w handlu od dostawców takich jak Applied Biosystems, Inc., Foster City, CA, i mogą być obsługiwane zgodnie z instrukcją producenta. Odmiany antygenów natywnych można ogólnie wytworzyć stosując standardowe techniki mutagenezy, takie jak ukierunkowana mutageneza kierowana oligonukleotydem. Części sekwencji DNA można również usuwać stosując standardowe techniki umożliwiające wytwarzanie polipeptydów okrojonych.
Rekombinowane polipeptydy zawierające części i/lub odmiany natywnego antygenu można łatwo wytworzyć z sekwencji DNA kodujących polipeptyd przy użyciu różnych technik dobrze znanych specjalistom w dziedzinie. Przykładowo, nadsącze z odpowiednich układów gospodarz/wektor, które wydzielają białko rekombinowane do pożywki hodowlanej mogą być najpierw zatężane przy użyciu dostępnego w handlu filtra. Po zatężaniu, koncentrat można wprowadzić do odpowiedniej matrycy do oczyszczania takiej jak matryca powinowactwa albo żywica anionowymienna. Na koniec, można zastosować jeden albo wiele etapów HPLC o odwróconych fazach w celu dalszego oczyszczenia rekombinowanego białka.
Do wyrażania rekombinowanych polipeptydów według wynalazku można zastosować dowolny spośród różnych wektorów ekspresyjnych znanych specjalistom w dziedzinie. Ekspresję można uzyskać w dowolnej odpowiedniej komórce gospodarza, którą transformowano albo transfekowano wektorem ekspresyjnym zawierającym cząsteczkę DNA, kodującą poli12
186 774 peptyd rekombinowany. Odpowiednie komórki gospodarza obejmują komórki prokariotyczne, drożdży i wyższe eukariotyczne. Korzystnie, zastosowaną komórką gospodarza jest E. coli, drożdże albo linia komórek ssaczych taka jak COS albo CHO. Sekwencje DNA wyrażane w ten sposób mogą kodować antygeny występujące naturalnie, części naturalne i występujących antygenów albo ich inne odmiany.
Ogólnie, niezależnie od sposobu wytwarzania, ujawnione tu polipeptydy są wytwarzane w postaci zasadniczo czystej. Korzystnie, polipeptydy są przynajmniej w około 80% czyste, jeszcze korzystniej przynajmniej w około 90% czyste, zaś najkorzystniej przynajmniej w około 99% czyste. W pewnych korzystnych wykonaniach, opisanych szczegółowo poniżej, zasadniczo czyste polipeptydy są włączane do kompozycji farmaceutycznych albo szczepionek do zastosowania w jednej lub wielu ujawnionych tu metodach.
W pewnych szczególnych wykonaniach, wynalazek ujawnia polipeptydy obejmujące przynajmniej immunogenną część rozpuszczalnego antygenu M. tuberculosis, obejmującego przynajmniej immunogenną część rozpuszczalnego antygenu M. tuberculosis, posiadającego jedną z poniższych sekwencji końca N, albo jej odmianę, która różni się jedynie konserwatywnym zastąpieniami i/lub modyfikacjami:
(a) Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-lle-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-AlaLeu; (Identyfikator Sekw. nr 120) (b) Ala-Val-GlUjSerrGly-Met-LeUjAla-LeUjGly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ssr; ((denttyikator
Sekw. nr 121) (c) Ala-Ala-Llet-Pyr-Pro-Arg-'Γhγ-Glp-Gsy-Prly-Pro-Leu-Gla-Ala-Ala-Lyj-Glγ-GlyArg; (Identyfikator Sekw. nr 122) (d) Tyγ-Tyr-Tηr-Cys-Pro-Gly-GlntPro-PPe-Asp-Pro-Ala-Trp-Giy-Pro- ((denttγfkator
Sekw. nr 123) (e) Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val; (Identyfikator Sekw. nr 124) (f) Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro; (Identyfikator Sekw. nr 125) (g) Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser; (Identyfikator Sekw. nr 126) (h) Ala-Pro-Lys-ThrrTyyrXaa-G!u-Glu-Leu-Lys-Gly-ThrrAsp-ThrrG]y; (Identtγika-or Sekw. nr 127) (i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-AsnSer-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn; (Identyfikator Sekw. nr 128) (j) Xaa-Asp-Ser'Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-I'le-Lγs-Val-Thr-Asp-Ala-Ser; (Identyfikator Sekw. nr 134) (k) Ala-Glγ-Asp-Thr-Xaa-Πe-Tγr-Πe-Val-Glγ-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp; (Identyfikator Sekw. nr 13:5) Iub (l) Ala-Pro-Glu-Ser-Glγ-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly; (Identyfikator Sekw. nr 136) gdzie Xaa może być dowolnym aminokwasem, korzystnie resztą cysteinową. Sekwencja DNA kodująca antygen określony jako (g) dostarczona jest jako Identyfikator Sekw. nr 52, zaś polipeptyd kodowany przez Identyfikator Sekw. nr 52 dostarczony jest jako Identyfikator Sekw. nr 53. Sekwencja DNA kodująca antygen określony jako (a) dostarczona jest jako Identyfikator Sekw. nr 101, jego wywnioskowana sekwencja aminokwasowa dostarczona jest jako Identyfikator Sekw. nr 102. Sekwencja DNA odpowiadająca antygenowi (d) dostarczona jest jako Identyfikator Sekw. nr 24. Sekwencja DNA odpowiadająca antygenowi (c) dostarczona jest jako Identyfikator Sekw. nr 25. Sekwencja DNA odpowiadająca antygenowi (i) dostarczona jest jako Identyfikator Sekw. nr 99, jego wywnioskowana sekwencja aminokwasową dostarczona jest jako Identyfikator Sekw. nr 100.
W dalszym konkretnym wykonaniu, wynalazek ujawnia polipeptydy obejmujące immunogenną część antygenu Mycobacterium tuberculosis, albo jego odmianę, która różni się wyłącznie konserwatywnymi zastąpieniami i/lub modyfikacjami, a antygen ma jedną z poniższych sekwencji końca N:
186 774 (m) Xaa-Tyr-He-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Vał-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-HisLeu-Val; (Identyfikator Sekw. nr 137) lub (n) Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-GlyArg-Arg-Xaa-Phe; (Identyfikator Sekw. nr 129) gdzie Xaa może być dowolnym aminokwasem, korzystnie resztą cysteinową.
W innym konkretnym wykonaniu, wynalazek ujawnia polipeptyd obejmujący przynajmniej immunogenną część rozpuszczalnego antygenu M. tuberculosis (albo odmianę takiego antygenu) która obejmuje jedną lub wiele sekwencji aminokwasowych kodowanych przez (a) sekwencje kodowane przez Identyfikatory Sekw. nr: 1, 2, 4-10, 13-25, i 52; (b) ich sekwencje komplementarne albo (c) sekwencje DNA zasadniczo homologiczne z sekwencjami DNA (a) albo (b).
W innym konkretnym wykonaniu, wynalazek ujawnia polipeptyd obejmujący przynajmniej immunogenną część rozpuszczalnego antygenu M. tuberculosis (albo odmianę takiego antygenu), który może, ale nie musi być rozpuszczalny, który obejmuje jedną lub wiele sekwencji aminokwasowych kodowanych przez (a) sekwencje kodowane przez Identyfikatory Sekw. nr: 26-52; (b) ich sekwencje komplementarne albo (c) sekwencje DNA zasadniczo homologiczne z sekwencjami DNA (a) albo (b).
W konkretnych dyskutowanych tu wykonaniach, antygeny M. tuberculosis obejmują odmiany, które są kodowane przez sekwencje DNA, które są zasadniczo homologiczne do jednej albo wielu wymienionych tu sekwencji DNA. „Zasadnicza homologia” w znaczeniu tu użytym dotyczy sekwencji DNA, które są zdolne do hybrydyzacji w umiarkowanie surowych warunkach. Odpowiednie umiarkowanie surowe warunki obejmują wstępne płukanie w roztworze 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybrydyzację przy 55-65°C, w 5X SSC, przez noc albo, w przypadku homologii międzygatunkowej, przy 45°C, 0,5X SSC; a następnie dwukrotne płukanie przy 65°C przez 20 minut w, kolejno, 2X, 0,5X i 0,2X SSC zawierającym 0,5% SDS). Takie hybrydyzujące sekwencje DNA leżą w zakresie wynalazku, podobnie jak sekwencje nukleotydowe które, z powodu degeneracji kodu kodują polipeptyd immunogenny, któryjest kodowany przez hybrydyzującą sekwencję DNA.
W pokrewnym aspekcie, wynalazek dostarcza białek fuzyjnych obejmujących pierwszy i drugi polipeptyd według wynalazku albo, alternatywnie, polipeptyd według wynalazku i znany antygen M. tuberculosis, taki jak antygen 38 kDa opisany wyżej albo ESAT-6 (Identyfikator Sekw. nr 103 i 104), wraz z odmianami takich białek fuzyjnych. Białka fuzyjne według wynalazku mogą również obejmować łącznik peptydowy pomiędzy pierwszym i drugim polipeptydem.
Sekwencja DNA kodująca białko fuzyjne według wynalazku konstruowana jest przy użyciu znanych technik rekombinacji DNA, w celu połączenia osobnych sekwencji DNA kodujących pierwszy i drugi polipeptyd w odpowiednim wektorze ekspresyjnym. Koniec 3' sekwencji DNA kodującej pierwszy polipeptyd poddaje się ligacji z, wraz z łącznikiem peptydowym albo bez niego, z końcem 5' sekwencji DNA kodującej drugi polipeptyd w taki sposób, że ramki odczytu są w tej samej fazie, umożliwiając translację mRNA dwóch sekwencji DNA jako jedno białko fuzyjne, zachowujące aktywność biologiczną zarówno pierwszego jak i drugiego polipeptydu.
Sekwencję łącznika peptydowego można zastosować w celu oddzielenia pierwszego i drugiego polipeptydu o odległość zapewniającą możliwość pofałdowania się każdego z polipeptydów w jego strukturę drugo- i trzeciorzędową. Taką sekwencję łącznika peptydowego wprowadza się do białka fuzyjnego metodami znanymi w stanie techniki. Odpowiednie sekwencje łącznika peptydowego mogą być wybrane w oparciu o poniższe czynniki: (1) ich zdolność do przyjęcia wydłużonej, giętkiej konformacji; (2) niemożność przyjęcia struktury drugorzędowej, która mogłaby oddziaływać z funkcjonalnymi epitopami pierwszego i drugiego polipeptydu; oraz (3) brak reszt hydrofobowych albo obdarzonych ładunkiem, które mogłyby reagować z funkcjonalnymi epitopami polipeptydu. Korzystne sekwencje łącznika peptydowego zawierają reszty Gly, Asn i Ser. Do sekwencji łącznika peptydowego można także zastosować inne prawie obojętne aminokwasy takie jak Thr i Ala. Sekwencje aminokwasowe, które mogą być korzystnie zastosowane jako łączniki ujawnione zostały przez
186 774
Maratea i in., Gene 40: 39-46, 1985; Murphy i in., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83: 8258-8262, 1986; patent USA nr 4,935,233 i 4,751,180. Sekwencja łącznikowa może mieć długość od 1 do 50 aminokwasów. Sekwencje peptydowe nie są konieczne gdy pierwszy i drugi polipeptyd ma nieistotne regiony aminokwasowe na końcu N, które mogą być zastosowane do oddzielenia domen funkcjonalnych i zapobiegania oddziaływaniu sferycznemu.
Poddane ligacji sekwencje dNa są funkcjonalnie połączone z odpowiednimi elementami regulującymi transkrypcję albo translację. Elementy regulacyjne odpowiedzialne za ekspresję DNA są położone wyłącznie w kierunku 5' od sekwencji DNA kodującej pierwszy polipeptyd. Podobnie, kodony stop wymagane do zakończenia translacji i sygnały przerwania transkrypcji obecne sąjedynie na końcu 3' sekwencji DNA kodującej drugi polipeptyd.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobów do stosowania jednego albo wielu powyższych polipeptydów albo białek fuzyjnych (albo cząsteczek DNA kodujących takie polipeptydy) do wywoływania u pacjenta ochronnej odporności przed gruźlicą. W znaczeniu tu użytym, „pacjent” dotyczy dowolnego zwierzęcia stałocieplnego, korzystnie człowieka. Pacjent może być dotknięty chorobą, albo może być wolny od wykrywalnej choroby i/lub zakażenia. Innymi słowy, ochronna odporność może być wywołana do zapobiegania albo leczenia gruźlicy.
W tym aspekcie, polipeptyd, białko fuzyjne albo cząsteczka DNA występuje ogólnie w kompozycji farmaceutycznej i/lub szczepionce. Kompozycje farmaceutyczne mogą obejmować jeden albo wiele polipeptydów, z których każdy może zawierać jedną albo wiele powyższych sekwencji (albo ich odmian), oraz nośnik dopuszczalny fizjologicznie. Szczepionki mogą obejmować jeden albo wiele powyższych polipeptydów i nieswoisty wzmacniacz odpowiedzi odpornościowej, taki jak adiuwant albo liposom (do którego wbudowany jest polipeptyd). Takie kompozycje farmaceutyczme i szczepionki mogą również zawierać inne antygeny M. tuberculosis, wbudowane do polipeptydów kombinowanych albo obecne w osobnych polipeptydach.
Alternatywnie, szczepionka może zawierać DNA kodujący jeden albo wiele polipeptydów jak to opisano wyżej, w taki sposób, że polipeptydy wytwarzane są in situ. W szczepionkach takich, DNA może występować w dowolnym spośród układów dostarczania znanych specjalistom w dziedzinie, w tym w układach ekspresji kwasu nukleinowego, układach ekspresyjnych wirusowych i bakteryjnych. Odpowiednie układy ekspresji kwasu nukleinowego obejmują sekwencje DNA niezbędne do ekspresji w organizmie pacjenta (takie jak odpowiednie sygnały promotorowe i terminacji). Bakteryjne układy dostarczania obejmują podawanie bakterii (takich jak Bacillus Calmette-Guerin), które wyrażają na swej powierzchni immunogenną część polipeptydu. W najkorzystniejszym wykonaniu, DNA może być wprowadzony przy użyciu wirusowych układów ekspresji (np. wirus krowianki albo inny wirus ospy, retrowirus albo adenowirus), które mogą obejmować zastosowanie niepatogennych (defektywnych) wirusów zdolnych do replikacji. Techniki włączania DNA do takich układów ekspresyjnych są dobrze znane specjalistom w dziedzinie. DNA może być również „nagie”, jak to opisano przykładowo, w Ulmer i in., Science 259: 1745-1749, 1993 oraz Cohen, Science 259: 1691 -1692, 1993. Wychwyt nagiego DNA może być wzmożony przez pokrycie DNA perełek ulegających degradacji biologicznej, które są wydajnie transportowane do wnętrza komórek.
W pokrewnym aspekcie, szczepionka DNA jak opisana wyżej, może być podawana równocześnie z, albo kolejno, z polipeptydem według wynalazku albo znanym antygenem M. tuberculosis, takim jak antygen 38 kDa opisanym wyżej. Przykładowo, podawanie DNA kodującego polipeptyd według wynalazku, nagiego albo w układzie dostarczania jak opisano wyżej, może poprzedzać podawanie antygenu w celu wzmocnienia efektu odporności ochronnej szczepionki.
Drogi i częstość podawania, jak również dawki, różnią się w zależności od osobnika i mogą być podobne do stosowanych obecnie w immunizacji przy użyciu BCG. Ogólnie, kompozycje farmaceutyczne i szczepionki mogą być podawane przez wstrzyknięcie (np. śródskómie, domięśniowo, dożylnie albo podskórnie), donosowo (np. przez aspirację) albo doustnie. W okresie 1 -36 tygodni można podać od 1 do 3 dawek. Korzystnie podaje się 3 dawki,
186 774 w odstępach 3-4 miesięcy po czym można podawać okresowe dawki przypominające. Dla konkretnych pacjentów można stosować odmienny protokół. Odpowiednią dawką jest taka ilość polipeptydu albo DNA, która po podaniu w opisany wyżej sposób jest zdolna do wywołania u nieimmunizowanego pacjenta odpowiedzi odpornościowej wystarczającej do ochrony pacjenta przed zakażeniem M. tuberculosis w ciągu co najmniej 1-2 lat. Ogólnie, ilość polipeptydu obecnego w dawce (albo wytworzonego in situ przez DNA w dawce) zawiera się od około 1 pg do około 100 mg na kg pacjenta, zwykle od około 10 pg do około 1 mg, zaś korzystnie od około 100 pg do około 1 pg. Odpowiednie wielkości dawek mogą się zmieniać w zależności od wielkości pacjenta, ale zwykle zawierają się w zakresie od około 0,1 ml do około 5 ml.
O ile można zastosować odpowiedoie nośniki znane snacjalistom w dzicdzinie w kompozycjach farmaceutycznych według wynalazku, rodzaj nośnika zależy od sposobu podawania. Do podawania pozajelitowego, takiego jak podawanie podskórne, nośnik korzystnie zawiera wodę, roztwór soli, alkohol, tłuszcz, wosk albo bufor. Do podawania doustnego można zastosować dowolny z powyższych nośników albo nośnik stały taki jak manrntol, laktoza, skrobia, stearynian magnezu, sól sodową sacharyny, talk, celulozę, glukozę, sacharozę i węglan magnezu. Jako nośnik do kompozycji farmaceutycznej według wynalazku można również zastosować mikrosfery ulegające degradacji biologicznej (np. dolilaktogalaktyd). Odpowiednie mikrosfery ulegające degradacji biologicznej ujawniono, przykładowo, w patencie USA nr 4,897,268 i 5,075,109.
W szczepionkach według wynalazku można zastosować dowolny spośród licznych aOiuwantów, w celu zwiększenia nieswoistej odpowiedzi odpornościowej. Większość aOiuwantów zawiera substancje przeznaczone do zapobiegania raptownemu katabolizmowi antygenu, takie jak wodorotlenek glinu oraz nieswoiste wzmacniacze reakcji odpornościowych, takie jak lipiO A, Bordetella pertussis albo Mycobacterium tuberculosis. Odpowiednie aOiuwanty dostępne są w handlu, przykładowo, niekompletny aOiuwant Freund'a i kompletny aOiuwant Freunda (Difco Laboratories) i Merck Adjuwant 65 (Merck & Co. Inc., Rahway, NJ). Inne odpowiednie aOiuwanty obejmują alum, mikrosfery ulegające degradacji biologicznej, monofosforylo-lipid A oraz Quil A.
W innym aspekcie, wynalazek dostarcza sposobów zastosowania jednego albo wielu polipndtydów opisanych wyżej do diagnozowania gruźlicy przy użyciu testów skórnych. W znaczeniu tu użytym, „test skórny” jest badaniem wykonywanym bezpośrednio na pacjencie, w którym mierzy się reakcję nadwrażliwości typu późnego (DTH) (taką jak obrzęk, zaczerwienienie albo zapalenie skóry), po wstrzyknięciu jednego albo wielu wyżej opisanych polipnpty0ów. Wstrzyknięcie takie można wykonać stosując dowolny przyrząd o0dowindni do kontaktowania polipeptyOu albo polidepty0ów z komórkami skóry pacjenta, taki jak np. strzykawka tuberkulinowa albo strzykawka 1 ml. Korzystnie, reakcję mierzy się przynajmniej po 48 godzinach od wstrzyknięcia, korzystniej 48-72 godziny.
Reakcja DTH jest komórkową oddćwie0oią odpornościową, która jest silniejsza u pacjentów ^ι^Οη^ eksponowanych na badany antygen (tj. immunogenną część stosowanego polidndtydu albo jego odmiany). Reakcję można mierzyć optycznie stosując linijkę. Ogólcie reakcja większa niż około 0,5 cm średnicy, korzystnie większa niż około 1 cm średnicy jest reakcją pozytywną, wskazującą na zakażenie gruźlicą, które może albo nie, manifestować się aktywną chorobą.
Polipedtydy według wynalazku są korzystnie upostaciowane do zastosowania w teście skórnym, jako kompozycje farmaceutyczne zawierające polipeptyd i nośnik dopuszczalny fizjologicznie, jak to opisano wyżej. Kompozycje takie zwykle zawierają jeden albo wiele z powyższych dolidedtyOów w ilości zawierającej się od około 1 pg Oo około 100 pg, korzystnie od około 10 pg Oo około 50 pg w objętości 0,1 ml. Korzystnie, nośnikiem zastosowanym w takich kompozycjach farmaceutycznych jest roztwór soli z odpowiednim konserwantem, takim jak fenol i/lub Tween 80™.
W korzystnym wykonaniu, polidedtyO zastosowany w teście skórnym jest wystarczającej wielkości aby pozostać w miejscu wstrzyknięcia w celu trwania okresu reakcji. Ogólnie, dolidndtyd długości przynajmniej 9 aminokwasów jest wystarczający. PćlidnptyO jest również
186 774 korzystnie rozkładany przez makrofagi, w ciągu godzin od wstrzyknięcia, w celu umożliwienia prezentacji limfocytom T. Polipeptydy takie mogą zawierać powtórzenia jednego albo wielu powyższych sekwencji i/lub sekwencji immunogennych albo nieimmunogennych.
Poniższe przykłady podano w celu zilustrowania, nie zaś w celu ograniczenia.
Przykład 1
Oczyszczanie i charakterystyka polipeptydów z filtratu hodowli M. tuberculosis
Przykład ten ilustruje preparowanie rozpuszczalnych polipeptydów M. tuberculosis z filtratu hodowli. O ile nie zaznaczono inaczej, w poniższym przykładzie wszystkie procenty podano jako wagowe na objętość.
M. tuberculosis (H37Ra, ATCC nr 25177 albo H37Rv, ATCC nr 25618) hodowano w sterylnych pożywkach GAS przy 37°C przez 14 dni. Następnie, pożywki filtrowano pod próżnią (oddzielając większość komórek) przez filtr 0,45 μ do sterylnej butelki 2,5 1. Następnie pożywkę filtrowano przez filtr 0,2 μ do sterylnej butelki 4 1 i dodawano NaN3 w stężeniu 0,04%. Butelki umieszczano w chłodni 4°C.
Filtrat hodowli zatężano przez umieszczenie go w 12-litrowym wysterylizowanym zbiorniku i wprowadzanie go do 400 ml komory Amicon z mieszadłem, którą przepłukano etanolem, wyposażonej w membranę 10000 kDa MWCO. Ciśnienie utrzymywano na poziomie 60 psi przy użyciu azotu. Procedura spowodowała zmniejszenie objętości 12 1 do około 50 ml.
Filtrat hodowli dializowano wobec 0,1% dwuwęglanu amonu stosując membranę z estru celulozy o MWCO równym 8000 kDa, z dwiema zmianami roztworu dwuwęglanu amonu. Stężenie białka oznaczono stosując dostępny w handlu test BCA (Pierce, Rockford, IL).
Dializowany filtrat hodowli liofilizowano i zawieszono polipeptydy w wodzie destylowanej. Polipeptydy dializowano wobec 0,01 mM 1,3 bis[tris(hydroksymetylo)-metyloamino]propanu, pH 7,5 (bufor Bis-Tris propanu), początkowych warunkach chromatografii anionowymiennej. Frakcjonowanie wykonywano stosując profuzyjną chromatografię żelową na kolumnie anionowymiennej POROS 146 II Q/M 4,6 mm X 100 mm (Perseptive BioSystems, Framingham, MA) zrównoważonej 0,01 mM buforem Bis-Tris propanu pH 7,5. Polipeptydy eluowano liniowym gradientem 0-0,5 M NaCl w powyższym buforze. Eluent monitorowano przy długości fali równej 220 nm.
Pule polipeptydów eluowanych z kolumny anionowymiennej dializowano wobec wody destylowanej i liofilizowano. Powstały materiał rozpuszczano w 0,1% kwasie trifluorooctowym (TFA) pH 1,9 w wodzie, po czym polipeptydy oczyszczono na kolumnie Delta-Pack C18 (Waters, Milford, MA), wielkość porów 300 L, wielkość cząstek 5 μ (3,9 X 150 mm). Polipeptydy eluowano z kolumny liniowym gradientem 0-60% buforu do rozcieńczania (0,1% TFA w acetonitrylu). Prędkość przepływu wynosiła 0,75 ml/minutę, zaś eluent HPLC monitorowano przy długości fali 214 nm. Frakcje zawierające eluowane polipeptydy zbierano w celu maksymalizacji czystości poszczególnych próbek. Uzyskano około 200 oczyszczonych polipeptydów.
Oczyszczone polipeptydy badano przesiewowo pod kątem zdolności do wywoływania proliferacji limfocytów T w preparatach PBMC. PBMC od dawców, o których wiadomo, że są pozytywni w skórnym teście z PPD i których limfocyty T proliferują, jak wykazano, w odpowiedzi na PPD i surowe białka rozpuszczalne z MTB hodowano w pożywce zawierającej RPMI 1640 z dodatkiem 10% pulowanej surowicy ludzkiej i 50 μg/ml gentamycyny. Oczyszczone polipeptydy dodawano w powtórzeniach w stężeniu od 0,5 do 10 μg/ml. Po sześciu dniach hodowli w 96-studzienkowych płytkach okrąglodennych w objętości 200 μ' pobierano 50 μl pożywki z każdej ze studzienek w celu oznaczenia poziomu IFN-γ, jak to opisano niżej. Następnie płytki pulsowano 1 μCi/studzienkę irytowanej tymidyny przez dalsze 18 godzin, zbierano i oznaczano wychwyt trytu stosując licznik scyntylacyjny. Frakcje dające proliferację w obu powtórzeniach wyższą niż trzykrotna proliferacja obserwowana na komórkach hodowanych w samej pożywce uważane byty za pozytywne.
IFN-γ mierzono stosując enzymatyczny test immunosorpcyjny (ELISA). Płytki ELISA pokryto mysimi przeciwciałami monoklonalnymi skierowanymi przeciwko ludzkiemu IFN-γ (PharMingen, San Diego, GA) w PBS przez 4 godziny w temperapurze pokojowej. Następnie,
186 774 studzienki blokowano PBS zawierającym 5% (wag./obj.) odtłuszczonego mleka w proszku przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie, płytki płukano sześciokrotnie w PBS/0,2% Tween-20 i próbki rozcieńczone 1:2 pożywką hodowlaną inkubowano w płytkach ELISA przez noc w temperaturze pokojowej. Płytki ponownie płukano i dodano poliklonalną króliczą surowicę przeciwko ludzkiemu IFN-γ, rozcieńczona 1:3000 w PBS/10% surowicy koziej. Następnie, płytki inkubowano przez dwie godziny w temperaturze pokojowej, płukano i dodawano peroksydazę chrzanową sprzęgniętą z przeciwciałem przeciwko króliczym IgG (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) w rozcieńczeniu 1:2000 w PBS/5% odtłuszczonym mleku w proszku. Po dalszych dwóch godzinach inkubacji w temperaturze pokojowej, płytki płukano i dodano substratu TMB. Reakcję zatrzymano po około 20 minutach 1 N kwasem siarkowym. Gęstość optyczną oznaczano przy długości fali 450 nm stosując 570 nm jako długość fali odniesienia. Frakcje dające w obu powtórzeniach OD dwukrotnie większą niż średnia OD z komórek hodowanych w samej pożywce plus trzy odchylenia standardowe uważane były za pozytywne.
Do sekwencjonowania polipeptydy osobno suszono na filtrach z włókna szklanego traktowanych Biobrene™ (Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA). Filtry z polipeptydem wprowadzano do sekwenatora białkowego Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division Procise 492. Polipeptydy sekwencjonowano od końca aminowego stosując reakcję Edmana. Sekwencję aminokwasową dla każdego polipeptydy oznaczano przez porównanie czasu retencji pochodnej PTH aminokwasu do odpowiedniego standardu pochodnej PTH.
Stosując opisano powyżej procedurę, wyizolowano antygeny o następujących sekwencjach końcaN:
(a) Asp-Pro-V al-Asp-Ala-V al-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-T yr-Gly-Gln-V al-V al-Ala-AlaLeu; (Identyfikator Sekw. nr 54) (b) Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser; (Identyfikator Sekw. nr 55) (c) Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-GlyArg; (Identyfikator Sekw. nr 56) (d) Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro; (Identyfikator Sekw. nr 57) (e) Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val; (Identyfikator Sekw.
nr 58) (f) Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro; (Identyfikator Sekw. nr 59) (g) Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser; (Identyfikator Sekw. nr 60) (h) Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly; (Identyfikator Sekw. nr 61) gdzie Xaa może być dowolnym aminokwasem.
Stosując etap oczyszczania HPLC o małej średnicy oprócz opisanych wyżej procedur wyizolowano dodatkowy antygen. Konkretnie, 20 pl frakcji zawierającej mieszaninę antygenów z wyżej opisanego etapu oczyszczania chromatograficznego oczyszczono na kolumnie Aquapore C18 (Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) o wielkości porów równej 7 μ, kolumna wielkości 1 mm X 100 mm w HPLC Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division Model 172. Frakcje eluowano z kolumny liniowym gradientem 1%/minutę acetonitrylu (zawierającego 0,05% TFA) w wodzie (0,05% TFA) przy przepływie równym 80 pl/minutę. Eluent monitorowano przy długości fali 250 nm. Początkową frakcję rozdzielono na 4 główne szczyty plus inne małe składniki, zaś uzyskany polipeptyd miał ciężar cząsteczkowy równy 12,054 kDa (oznaczone spektrometrią masową) i następującą sekwencję końca N:
(i) Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-AsnSer-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn; (Identyfikator Sekw. nr 62)
Polipeptyd ten wywoływał proliferację i wytwarzanie IFN-γ przez PBMC w warunkach testu opisanych powyżej.
186 774
Dodatkowe rozpuszczalne antygeny wyizolowano z filtratu M. tuberculosis w następujący sposób. Filtrat hodowli M. tuberculosis wytworzono w opisany wyżej sposób. Po dializie wobec buforu Bis-Tris propanu, pH 5,5, wykonano frakcjonowanie stosując chromatografię anionowymienną na kolumnie POROS QE 4,6 mm X 100 mm (Perseptive BioSystems) zrównoważonej buforem Bis-Tris propanu pH 5,5. Polipeptydy eluowano liniowym gradientem 0-1,5 M NaCl w powyższym buforze przy przepływie równym 10 ml/min. Eluent opuszczający kolumnę monitorowano przy długości fali równej 214 nm.
Frakcje eluowane z kolumny jonowymiennej pulowano i poddawano chromatografii w odwróconych fazach stosując kolumnę Poros R2 4,6 x 100 mm (Perseptive BioSystems). Polipeptydy eluowano z kolumny stosując liniowy gradient 0-100% acetonitrylu (0,1% TFA przy przepływie równym 5 ml/min. Eluent monitorowano przy długości fali 214 nm.
Frakcje zawierające eluowane polipeptydy liofilizowano i zawieszano w 80 μΐ wodnego roztworu 0,1% TFA i poddawano dalszej chromatografii w odwróconych fazach na kolumnie Vydac C4 4,6 X 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) z liniowym gradientem 0-100% acetonitrylu (0,1% TFA) przy przepływie równym 2 ml/min. Eluent monitorowano przy długości fali 214 nm.
Frakcje o aktywności biologicznej rozdzielono na jeden główny szczyt i kilka mniejszych składnikó w. Analiza metodą Western biot na membranie PVDF wykazała trzy główne prążki o cięhirach cząsteczkowych równych 14 kDa, 20 kDa i 2 6 kDa. Polipeptydy miały następujące sekwencje końca N:
(j) Xar-Asp-SertGlu-Nys-Ser-Ala-Thr-Iln-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Snr; (Identyfikator Sekw. nr 134) (k) Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tąr-Ile-Val-Gly-Asa-Lnu-Thr-Ala-Asp; (Identyfikator Sekw. nr 135)lub (l) Ala-Pro-Glu-Snr-Gly-Ala-Gly-Lnu-Gly-Glą-Thr-Val-Gln-Ala-Glą: (Identyfikator Sekw. nr 136)
Stosując opisane wyżej testy wykazano, że polipeptydy te wywołują proliferację i wytwarzanie IFN-γ przez preparaty PBMC. Figury 1A i B pokazuje wyniki takich testów wykonanych przy użyciu preparatów PBMC, odpowiednio, od pierwszego i drugiego dawcy.
iSekrncencjz DNA kodeijąrc óntygeny oznaczone nako (a), er), ze) o ig) ugyskado przez przgenomowdj jąił^liąntąi /W. tubeacutneis kosując cdegenerowane olinonpkleprye^, zna0.oaven) no Ooó^u i2P, odpowiadające sekwencjom kobza N i nawiaaająoe preterowmną kodony Μ. tuberkuloti3. Prkasz.u0iwasie wykowenc omy ożcaiN soa^cW ojipowiodejnrkj źa) pouwolilo zidentyfikować ϋοπ w ąrkwencjj pąSazmnej jako IstkaPnnkatos Sej
Cw. ge o 01. Polipeptyd Ι^οΟο)/.!^.' pnwz Ideoiyfikato) nakw, ot łon iSsCkkand j^o kdenOyfikWor S ekw. nr Praerodkiwani e π/Οοη!/^ przą orycik wondy odpowiaOąiącęj antydenowi kj) iro^wWó In ziNentyfϊnowrρ klon w .^νεΏρίί onko ^^pi^^i^i^tj^r S eCw. nn 5W.
Pol iOkpWΌ kodoweny ρ^ζ Idrntnfikator Snkw . nr 52 pcka/ano lkantyfika1or nrkw.
ot 5Ó. Orąasktdiwonią wyOonane pmy użyriS srndy odpowtaraIaakj sn1ngydnwi (d) pozwohło aident^y0nwwr Hen e )ekwaaaji ookawżąęj u ako Iąon)pfiOaior ScŃ. nm ge, zwa przokzu0twao1) wyfonaoa ono użyeiu eondy orąowiadająkeI' natyoenow'i Sek ponwolilo zldeoicfiWować nien o rckwancji omkazanuj jako Idkd00okatoc ąckw. nm )ϊ.
Powożeac so0wencjn ^mmokev;tąoi^^'c oocównano zc znanymi sekwencjami aminokwasowymń w banku emów stosuj ąn DNA STna^^. Przeszukiwane danych ορ^ϊι^^Ια
17W000 i wost Cembmk))ą0aD NAnych SWPrS, 0Ik wanc z ο.ΐο.ηηο'ίοο^ϊ bńałek twkrtj a 77). 'Nic kwierdzono iotc^-to^j ^ιπιοΚ'.π sekwóncji omino0wasownr0 dic aotygeaów (w)-(hji (1).
Sekwencja aminokwasowa antygenu (i) okazała się homologiczna z sekwencją M. leprae. Sekwencją CO /nom ^^^ej atągnaw amkiifikowcno z oekomowaąo DNW i^tc^ując sekwOncje {^c^^n^^do^^e z GENBANK. ^Rwecc^ ta /(^^ι o)etosowon) dD NmeszueSwania kWe^r^t^ki M. tubeuoulosib opusAnej niCnj w arsąktadzkc C i u:ccokcko w to spoańb ^kiwokią bP. tubdrρulosis ąelnej dlugoóci CtnsntlżnSaton Sekw. ot 99) .
Sekwencja emisokwatowa antyąoru O Syfa hnmologiczna ze znanym białkiem M. tuberculod1słe^aosjocooii}kr z skOweąaoi DNA. Wzdle ncjtepszęI wiedz, Wmocluzców, niM wu186 774 kazano uprzednio aktywności stymulującej limfocyty T dla tego białka. Sekwencja aminokwasowa antygenu (k) była pokrewna z sekwencjąM. leprae.
W testach proliferacji i IFN-γ opisanych wyżej, z użyciem trzech dawców PPDpozytywnych, otrzymano wyniki pokazane na tabeli 1:
Tabela 1
Wyniki testów proliferacji PBMC i IFN-γ
| Sekwencja | Proliferacja | IFN-γ |
| (a) | + | - |
| (c) | +++ | +++ |
| (d) | ++ | ++ |
| (g) | +++ | +++ |
| (h) | +++ | +-H- |
W tabeli 1, reakcje dające wskaźnik pobudzenia (SI) pomiędzy 2 i 4 (w porównaniu z komórkami hodowanymi z samą pożywką) oceniono jako +, SI równy 4-8 albo 2-4 przy stężeniu 1 pg albo mniej oceniono jako ++, zaś SI większy niż 8 oceniono jako +++. Stwierdzono, że sekwencja (i) wykazuje wysoki SI (+++) wobec pierwszego dawcy i niski SI (++ i +) wobec dwóch innych dawców w testach proliferacji i IFN-γ. Wyniki te wskazują, że antygeny te są zdolne do wywoływania proliferacji i/lub wywarzania IFN-γ.
Przykład 2
Zastosowanie surowic pacjentów do izolowania antygenów M. tuberculosis
Przykład ten pokazuje izolowanie antygenów z lizatu M. tuberculosis przez przeszukiwanie przy użyciu surowic od osobników zarażonych M. tuberculosis.
Wysuszone M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories) dodano do 2% roztworu NP40 i na przemian homogenizowano i sonikowano trzykrotnie. Powstałą zawiesinę odwirowano przy 13000 obrotów na minutę w probówkach, zaś nadsącz przepuszczono przez filtr strzykawkowy 0,2 μ. Filtrat związano z perełkami Macro Prep DEAE (BioRad, Hercules, CA). Perełki przemywano intensywnie 20 mM Tris pH 7,5 i eluowano związane białka 1 M NaCl. Eluat dializowano przez noc wobec 10 mM Tris, pH 7,5. Dializowany roztwór traktowano DNazą i RNazą w stężeniu 0,05 mg/ml przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie a-D-mannozydazą, 0,5 U/mg w pH 4,5 przez 3-4 godziny w temperaturze pokojowej. Po doprowadzeniu do pH 7,5 materiał frakcjonowano przez FPLC na kolumnie Bio Scale-Q-20 (BioRad). Frakcje połączono w 9 pul, zatężono wCentriprep 10 (Amicon, Beverley, MA), a następnie przesiewano w badaniu metodą Western biot w kierunku aktywności serologicznej stosując pule surowic od pacjentów zakażonych M. tuberculosis, którzy nie byli immunoreaktywni z innymi antygenami według wynalazku.
Najbardziej reaktywną frakcję poddano SDS-PAGE i przeniesiono na membranę PVDF. Wycięto prążek wielkości około 85 kDa, uzyskując sekwencję:
(m) Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-HisLeu-Val; (Identyfikator Sekw, nr 137) gdzie Xaa oznacza dowolny aminokwas.
Porównanie tej sekwencji z bankiem genów jak to opisano wyżej, nie wykazało istotnej homologii ze znanymi sekwencjami.
Przykład 3
Wytwarzanie sekwencji DNA kodujących antygeny M. tuberculosis
Przykład ten pokazuje wytwarzanie sekwencji DNA kodujących antygeny M. tuberculosis przez przesiewanie biblioteki ekspresyjnej M. tuberculosis przy użyciu surowic uzyskanychod pacjentów zakażonych M. tuberculosis, albo surowic odpornościowych wywołanych przeciwko rozpuszczalnym antygenom M. tuberculosis.
A. Wytwarzanie rozpuszczalnych antygenów M. tuberculosis przy użyciu króliczych surowic odpornościowych
186 774
Genomowy DNA wyizolowano z M. tuberculosis szczepu H37Ra. DNA pocięto losowo zastosowano do konstruowania biblioteki ekspresyjnej przy użyciu układu ekspresyjnego Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Królicze surowice odpornościowe wywołano przeciwko białkom wydzielniczym M. tuberculosis szczepu H37Ra, H37Rv i Erdman, przez immunizowanie królików zatężonymi nadsączami hodowli M. tuberculosis. Konkretnie, królika immunizowano podskórnie przy użyciu 200 pg antygenu białkowego w objętości całkowitej ml zawierającej 10 pg dipeptydu muramylowego (Calbiochem, La Jolla, CA) i 1 ml niekompletnego adiuwantu Freund'a. Cztery tygodnie później królikowi podano dawkę przypominającą podskórnie w postaci 100 pg antygenu w niekompletnym adiuwancie Freund'a. Na koniec, królika immunizowano dożylnie cztery tygodnie później 50 pg antygenu białkowego. Surowice odpornościowe zastosowano do przeszukiwania biblioteki ekspresyjnej jak to opisano w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Oczyszczono łysinki bakteriofagów wyrażających antygeny immunoreaktywne. Uratowano fagemid z łysinek wywnioskowano sekwencję nukleotydrwą klonów M. tuberculosis.
Oczyszczono 32 klony. Wśród nich, 25 stanowiło sekwencje, których uprzednio nie zidentyfikowano w ludzkiej M. tuberculosis. Rekombinowane antygeny poddano ekspresji i oczyszczone antygeny zastosowano do analizy immunologicznej opisanej w Przykładzie 1. białka indukowano IPTG i oczyszczono przez elucję z żelu, jak to opisano w Seiky i in., J. Exp. Med. 181: 1527-1537, 1995. Reprezentatywne sekwencje cząsteczek DNA zidentyfikowanych w tym przesiewaniu pokazano jako Identyfikatory Sekw. nr 1-25. Odpowiednie przewidywane sekwencje aminokwasowe pokazano jako Identyfikatory Sekw. nr 63-87.
Przy porównaniu tych sekwencji ze znanymi sekwencjami w banku genów przy użyciu baz danych opisanych wyżej stwierdzono, że klony określone dalej jako TbRA2A, TbRAl 6, TbRA18 i TbRA29 (Identyfikator Sekw. nr 76, 68, 70 i 75) wykazują niejaką homologię z sekwencjami opisanymi uprzednio w M. leprae, ale nie w M. tuberculosis. TbRAll, TbRA26, TbRA28 i TbDPEP (Identyfikator Sekw. nr 65, 73, 74, 53) zidentyfikowano uprzednio w M. tuberculosis. Nie stwierdzono istotnej homologii z TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRA19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 i nakładających się klonów TbRA35 TbRA12 (Identyfikator Sekw. nr 63, 77, 81, 82, 64, 67, 71, 75, 78, 80, 79, 66). Klon TbRA24 nakładał się z klonem TbRA29.
Wyniki testów proliferacji PBMC i IFN-γ wykonanych z reprezentatywnymi rekombinowanymi antygenami i z użyciem preparatów limfocytów T od kilku różnych pacjentów odpornych naM. tuberculosis przedstawiono na tabeli, odpowiednio, 2 i 3.
186 774
Wyniki proliferacji PBMC w odpowiedzi na rozpuszczalne antygeny
| Pacjent | 1 | t | W c | 1 | G | t | G | G | *—> G | G | G | G | G | S | +-» G | G | |||
| ΓΊ | +1 | 1 | c | -H | +1 | ł | G | w G | G | G | i | G | G | *—> G | -H | + | -H | 1 | |
| + | 1 | g | -H | + + | + | G | *—> G | G | O | i | G | G | O | G | O | -H | 1 | ||
| o | 1 | w G | + + | + | • | G | G | 4—» G | G | t | -*-> G | G | G | • | 1 | + | 1 | ||
| o | 1 | -H | G | 1 | + + | -H | G | O | G | G | i | G | G | G | 1 | 1 | -H | 1 | |
| oo | -H | + + | +-» G | -H | 1 | -H | O | G | G | G | ł | *—> G | G | G | 1 | 1 | ί | 1 | |
| r- | -H | 1 | 4—» G | G | G | + | G | +-» G | G | 4—» G | G | G | s | G | g | G | *—> G | 1 | |
| 1 | 1 | + + | + | + | + + | + | 1 | 1 | 1 | i | » | 1 | • | 1 | |||||
| 1 | -H | + + | -H | + + | -H | 1 | 1 | 1 | f | t | 1 | 1 | 1 | 1 | ł | 1 | 1 | ||
| i | 1 | 4—» G | +1 | ++ | + | G | G | G | G | i | G | G | G | 1 | 1 | i | 1 | ||
| -H | ++ | G | -H | + | + | G | G | G | O | + + | G | G | -H | • | t | t | |||
| 1 | -H | 1 | -H | G | G | + | •w G | G | s | G | G | 1 | 1 | + | 1 | ||||
| - | 1 | « | -H | 1 | G | G | 1 | G | + + | G | G | G | 1 | 1 | 1 | 1 | |||
| Antygen | TbRal | f2 | TbRa9 | TbRalO | TbRal 1 | TbRal2 | TbRaló | s | TbRa26 | TbRa29 | TbRa35 | TbRaB | TbRaC | TbRaD | AAMK | YY | DPEP | kontrola |
nt = nie badano
186 774
Wyniki wytwarzania interferonu-γ przez PBMC w odpowiedzi na rozpuszczalne antygeny
| Pacjent | ł | 1 | 2 | t | 4—» G | ł | 2 | ·*-> G | 4—» G | 2 | 2 | ·*-» G | 2 | 2 | *-» G | 2 | 2 | 1 | |
| CN | -H | 1 | 2 | -H | -H | 1 | G | 2 | 2 | ·*-» G | i | ·*-» G | ·*-» G | G | -H | + | -H | i | |
| + | c | -H | ί | + | ·*-» O | ·«-» O | 2 | 2 | i | 2 | s | 2 | 2 | 2 | -H | 1 | |||
| 2 | 1 | 1 | 2 | + | ί | 1 | 2 | 2 | 2 | 2 | i | 2 | ·*-» G | w G | 1 | I | + | 1 | |
| o | 1 | -H | -M c | ί | -H | 2 | 2 | 2 | ·*-» G | ί | 2 | 2 | 2 | 1 | 1 | -H | 1 | ||
| 00 | -H | t | 2 | -H | 1 | -H | 2 | 2 | 2 | w G | t | 4—» G | 2 | ·*-» 0 | 1 | 1 | -H-+ | 1 | |
| 1 | c | 2 | 2 | + | 2 | 2 | ·*-» G | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | ·*-> G | w α | > | |||
| t | 1 | • | + | + | i | + | 1 | + | 1 | i | + | + | + | 1 | - | 1 | 1 | ||
| + | -H | t | -H | i | +1 | + | + | + | + | ΐ | t | + | + | 1 | 1 | + | |||
| i | I | 2 | -H | i | + | z | -ł-» z | z | z | i | Nt | z | 1 | ΐ | ( | ||||
| cn | i | G | -H | + | + | 2 | 2 | 2 | 2 | i | 2 | 2 | 2 | -H | I | + | |||
| CN | i | -H | + | + | -H | 1 | 2 | o | i | 4—» G | 2 | 2 | 2 | 2 | ł | + | 1 | ||
| - | + | 1 | t | + | 1 | s | 2 | i | 2 | i | 2 | 2 | G | 1 | 1 | + | 1 | ||
| Antygen | TbRal | o4 JO H | o £ H | TbRalO | TbRal 1 | CN s | TbRal 6 1 1 | TbRa24 | (=4 λ H | TbRa29 | IT) cd |2 | TbRaB | TbRaC | AAMK | YY | DPEP | kontrola |
186 774
W tabelach 2 i 3 odpowiedzi, które Oawały wskaźnik pobudzenia (SI) między 1,2 i 2 (w porównaniu z komórkami hodowanymi w samej pożywce) oceniono jako ±, SI 2-4 oceniono jako +, SI 4-8 albo 2-4 przy stężeniu 1 pg albo mniej oceniono jako ++ i SI większe niż 8 oceniono jako + + +. Oprócz tego, wpływ stężenia na proliferację i wytwarzanie intnrfnronu-y pokazano na załączonej Figurze dla dwóch z powyższych antygenów. Dla proliferacji i wytwarzania interferonu-y TbRa3 oceniono na ++, zaś TbRa9 na +.
Wyniki te pokazują, że rozpuszczalne antygeny potrafią indukować proliferację i/lub wytwarzanie IFN-y droeo limfocyty T pochodzące oO osobników odpornych na M. tuberculosis.
B. Zastosowaolć euśowlc ραο^ι^^' do wee^tyi^i^^icji DNA kodujących geny M. tuberculosis
Bibliotekę gecomowngo DNA i dodatkową bibliotekę H37Rv przesiewano stosując pulowaną surowicę od pacjentów z czynną gruźlicą. W celu wytworzenia biblioteki H37Rv, wyizolowano genomowy DNA M. tuberculosis szczepu H37Rv, poddano częściowemu trawieniu Sau3A i zastosowano do konstruowania biblioteki ekspresyjnej stosując układ ekspresyjny Lambda ZAP (Stratagene, La Jolla, CA). Trzy różne pule surowic, z których każda zawierała surowice uzyskane oO trzech osobników z czynną gruźlicą płucną albo ćdłucnową, zastosowano do dronsinwania ekspresyjnego. Pule oznaczono TbL, TbM i TbH, w zależności od reaktywności z lizatnm H37Ra (tj. TbL = słaba reaktywność, TbM = pośrednia reaktywność i TbH = wysoka reaktywność) w formacie ELISA i immunoblotu. Zastosowano również czwartą pulę surowic oO siedmiu pacjentów z aktywną gruźlicą płucną. Wszystkie surowice pozbawione były zwiększonej reaktywności z rekombinowanym białkiem wiążącym fosforan 38 kDaM. tuberculosis.
Wszystkie pule preadsorbowano na lizacie E. coli, i zastosowano do przesiewania bibliotek ekspresyjnych H37Ra i H37Rv, Jak to opisano w Sambrook i in., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Oczyszczono łysinki bakteriofagów ekspresj^^^ych antygeny immunoreaktywnn. Uratowano fagemid z łysinek i określono sekwencje cukleotydown klonów M. tuberculosis.
Oczyszczono 32 klony. WśróO nich, 31 stanowiło snkwnccjn, których do tej pory nie zidentyfikowano u ludzkiej M. tuberculosis. Reprezentatywne sekwencje cząsteczek DNA są podane na Identyfikatorze Sekw. nr 26-51 i 105. Wśród nich, TbH-8 i TbH-8-2 (Identyfikator Sekw. nr 105) są nieciągłymi sekwencjami tego samego klonu, zaś TbH-4 (Identyfikator Snkw. nr 43) i TbH-4-FWD (Identyfikator Sekw. nr 44) są nieciągłymi sekwencjami tngo samego klonu. Sekwencje aminokwasowi dla antygenów określonych Oalej jako Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9 i TbH-12 pokazano jako Identyfikator Snkw. nr 88-92. Porównanie tych sekwencji ze ocacymi sekwencjami w banku danych przy użyciu wyżej opisanych baz danych mn wykazało istotnej homologii z TbH-4, TbH-8, TbH-9 i TbM-3, jakkolwiek stwinrOoono słabe homologin z TbH-9. Stwierdzono, że TbH-12 jest homologiczny z białkiem antygenowym 34 kDa uprzednio zidentyfikowanym w M. tuberculosis (nr S28515). Stwierdzono, żn Tb38-1 położony jest 34 pary zasad powyżej ramki odczytu dla antygenu ESAT-6 opisanego uprzednio u M. bovis (nr U34848) i M. tuberculosis (Sorenstn i in., Infect. Immun. 63: 17101717(1995).
SonOy dochoOoąje z Tb38-1 i TbH-9 wyizolowane z biblioteki H37Ra, zastosowano Oo identyfikacji klonów w bibliotece H37Rv. Tb38-1 hybryOyzował zTb38-1F2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 i Tb38-1F6 (Identyfikator Sekw. nr 112, 113, 116, 118 i 119). (Identyfikator Snkw. nr 112 i 113 są nieciągłymi sekwencjami klonu Tb38-1F2). W klonie Tb38-1F2 wywnioskowano dwie ramki odczytu; jedna odpowiada Tb37FL (Identyfikator Sekw. nr 114), Oruga, sekwencja częściowa, możn być homologiem Tb38-1 i nazwana jnst Tb38-IN (Identyfikator Sekw. nr 115). Wywnioskowana sekwencja aminokwasową Tb38-1F3 przedstawiona została na IOectyfikatoroe Snkw. nr 117. Sonda TbH-9 zidentyfikowała trzy klony w bibliotncn H37Rv; TbH-9-FL (Identyfikator Sekw. nr 106), który może być hćmologenm TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1 (Identyfikator Sekw. nr 108) i TbH-9-4 (Identyfikator Sekw. nr 110), z których wszystkie są blisko spokrewnione z TbH-9. Wywnioskowane sekwencje aminokwasowi Ola tych trzech klonów przedstawiono w Identyfikator Snkw. nr 107, 109 i 111.
186 774
Wyniki testów z limfocytami T wykonanych na Tb38-1, ESAT-6 i innych reprezentatywnych antygenach rekombinowanych przedstawiono, odpowiednio, na tabelach 4A, B i 5 poniżej:
Tabela 4A
Wyniki proliferacji PBMC w odpowiedzi na reprezentatywne antygeny
| Antygen | Dawca | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Tb38 1 | +++ | + | - | - | - | ++ | - | + | - | ++ | +++ |
| ESAT-6 | +++ | + | + | + | - | + | - | + | + | ++ | +++ |
| TbH-9 | ++ | ++ | - | ++ | ± | ± | + | ++ | ++ | ++ | ++ |
Tabela 4B
Wyniki wytwarzania IFN-γ przez PBMC w odpowiedzi na reprezentatywne antygeny
| Antygen | Dawca | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Tb38.1 | +++ | + | - | + | + | +++ | - | ++ | - | +++ | +++ |
| ESAT-6 | +++ | + | + | + | + | + | - | + | + | +-H- | +++ |
| TbH-9 | ++ | ++ | - | +-H- | ± | ± | +++ | +++ | ++ | +++ | ++ |
Tabela 5
Podsumowanie reakcji limfocytów T na reprezentatywne antygeny
| Antygen | Proliferacja | Interferon-γ | suma | ||||
| pacjent 4 | pacjent 5 | pacjent 6 | Pacjent 4 | pacjent 5 | pacjent 6 | ||
| TbH9 | ++ | ++ | +—+ | +++ | ++ | ++ | 13 |
| TbM7 | - | + | - | -H- | + | - | 4 |
| TbH5 | - | + | + | ++ | ++ | ++ | 8 |
| TbL23 | - | + | ± | ++ | ++ | + | 7,5 |
| TbH4 | - | ++ | ± | ++ | ++ | ± | 7 |
| kontrola | - | - | - | - | - | - | 0 |
Wyniki te wskazują, że zarówno antygeny M. tuberculosis według wynalazku jak i ESAT-6 potrafią wywołać proliferację i/lub wytwarzanie interferonu-γ przez limfocyty T pochodzące od osobników odpornych na M. tuberculosis. Według najlepszej wiedzy Wynalazców, nie wykazano do tej pory aby ESAT-6 pobudzał ludzką reakcję odpornościową.
Skonstruowano zestaw sześciu nakładających się peptydów, pokrywających sekwencję aminokwasową antygenu Tb38-1, stosując metodę opisaną w Przykładzie 4. Sekwencje tych peptydów, określane dalej jako pepl-6, pokazano, odpowiednio, w Identyfikator Sekw. nr 9398. Wyniki testów z limfocytami T przy użyciu tych peptydów pokazano na tabeli 6 i 7. Wyniki te potwierdzają występowanie i pomagają w lokalizacji epitopów limfocytów T w obrębie Tb38-1, zdolnych do wywołania proliferacji i wytwarzania interferonu-γ przez limfocyty T pochodzące od osobników odpornych na M. tuberculosis.
186 774 c3 <υ χ
C0
Η
| 1 Pacjent | ΓΊ | + | + | -Η | + | + | + | |
| CN | 1 | • | - | 1 | I | |||
| I | 1 | 1 | 1 | « | 1 | 1 | ||
| Ο | -Η | -Η | t | -Η | 1 | + | t | |
| ο | 1 | -Η | -Η | -Η | -Η | -Η | 1 | |
| 00 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | > | 1 | |
| ο | - | 1 | 1 | + | + | -Η | 1 | |
| 1 | 1 | - | • | |||||
| 1/Ί | +1 | -Η | t | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Tf | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| ΓΊ | 1 | 1 | • | - | 1 | 1 | ||
| ΓΝ | 1 | 1 | 1 | 1 | -Η | ί | 1 | |
| - | 1 | -Η | 1 | -Η- | -Η- | • | 1 | |
| Peptyd | <υ CL | ΓΜ CX ϋ CŁ | ΓΊ Cu (ϋ Λ | <Χ | νΊ Cu ϋ α | Cu <υ <Χ | kontrola |
186 774
Γ03 <υ
X>
Λ
Η >>
% &
D§ ’Ξ £
| Pacjent | Γ*Ί | + | + | -Η | + | + | + | 1 |
| CS | 1 | 1 | 1 | • | 1 | 1 | 1 | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| ο | + | •Ή | » | + | 1 | + | 1 | |
| σ> | 1 | -Η | + | -Η | Ή | -Η | 1 | |
| 00 | 1 | t | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| Γ- | 1 | 1 | 1 | + | + | + | 1 | |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | ||
| •τι | +( | -Η | 1 | 1 | i | 1 | ||
| τΤ | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | • | ||
| m | • | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | |
| CS | 1 | 1 | I | » | -Η | -Η- | t | |
| - | + | 1 | φ | Φ | + | 1 | ||
| Peptyd | <υ α | CS (X <υ α- | ΠΊ CU 8, | pep4 | ΙΤ) α. (U ο< | & Cm | kontrola |
186 774
Przykład 4
Oczyszczanie i charakterystyka polipeptydu z oczyszczonej pochodnej białkowej tuberkuliny
Polipeptyd M. tuberculosis wyizolowano z oczyszczonej pochodnej białkowej tuberkuliny (PPD) w następujący sposób.
PPD wytworzono w sposób opisany w Seibert i in., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of large quantity for standard. The American Review for Tuberculosis 44: 9-25, 1941, z niewielkimi modyfikacjami.
Szczep Rv M. tuberculosis hodowano przez 6 tygodni na syntetycznym podłożu w butelkach typu roller w 37°C. Butelki zawierające bakterie podgrzano do 100°C w parze wodnej przez 3 godziny. Hodowle filtrowano sterylnie stosując filtr 0,22 μ i zatężono fazę płynną 20-krotnie stosując membranę o ciężarze odcięcia 3 kDa. Białka precypitowano raz 50% roztworem siarczanu amonu i ośmiokrotnie 25% roztworem siarczanu amonu. Powstałe białka (PPD) frakcjonowano przez chromatografię w odwróconej fazie (RP-HPLC) stosując kolumnę C18 (7,8 x 300 mm; Waters, Milford, Ma) w układzie Biocad HPLC (Perseptive BioSystems, Framingham, MA). Frakcje eluowano z kolumny liniowym gradientem 0-100% buforu (0,1% TFA w acetonitrylu). Przepływ wynosił 10 ml/minutę, zaś eluent monitorowano przy długości fali 214 nm i 280 nm.
Zebrano sześć frakcji, wysuszono, zawieszono w PBS i badano indywidualnie na świnkach morskich zakażonych M. tuberculosis w kierunku wywoływania reakcji nadwrażliwości typu późnego (DTH). Stwierdzono, że jedna z frakcji wywołuje silną reakcję DTH, i frakcjonowano ją dalej przez RP-HPLC na kolumnie o małej średnicy Vydac Cl8 (nr kat. 218TP5115) w HPLC model 172 Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA. Frakcje eluowano liniowym gradientem 5-100% buforu (0,05% TFA w acetonitrylu) przy przepływie równym 80 μ /min. Eluent monitorowano przy długości fali 215 nm. Zebrano osiem frakcji, które badano indywidualnie pod kątem wywoływania DTH u świnek morskich zakażonych M. tuberculosis. Stwierdzono, że jedna z frakcji wywołuje silną DTH o odczynie równym około 16 mm. Inne frakcje nie wywoływały wykrywalnej DTH. Pozytywną frakcję poddano SDS-PAGE i stwierdzono, że zawiera pojedynczy prążek białka o ciężarze cząsteczkowym około 12 kDa.
Polipeptyd ten, określany dalej jako DPPD, sekwencjonowano od końca aminowego stosując sekwenator białkowy Procise 492 Perkin-Elmer/Applied Biosystems Division, jak to opisano wyżej, i stwierdzono sekwencję końca N pokazaną na Identyfikatorze Sekw. nr 129. Porównanie tej sekwencji ze znanymi sekwencjami w banku danych jak to opisano wyżej nie wykazało istotnej homologii. Wyizolowano cztery fragmenty DPPD pochodzące z trawienia bromkiem cyanogenu i stwierdzono że mają sekwencje pokazane na Identyfikatorach Sekw. nr 130-133.
Zdolność antygenu DPPD do pobudzania ludzkich PBMC do proliferacji i wytwarzania IFN-γ badano jak to opisano w Przykładzie 1. Jak to pokazano na tabeli 8, stwierdzono, że DPPD pobudzi proliferację i wywołuje wytwarzanie znacznych ilości IFN-γ; silniej niż dostępny w handlu preparat PPD.
Claims (15)
1. Polipeptyd, znamienny tym, że obejmuje sekwencję aminokwasową przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr: 66, Identyfikatorze Sekw. nr: 79 albo Identyfikatorze Sekw. nr: 91.
2. Cząsteczka DNA, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową kodującą polipeptyd określony w zastrz. 1.
3. Cząsteczka DNA według zastrz. 2, znamienna tym, że obejmuje sekwencję nukleotydową przedstawioną w Identyfikatorze Sekw. nr: 4, Identyfikatorze Sekw. nr: 17 albo Identyfikatorze Sekw. nr: 33
4. Wektor ekspresyjny, znamienny tym, że obejmuje cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 2.
5. Komórka gospodarza transformowana wektorem ekspresyjnym określonym w zastrz. 4.
6. Komórka gospodarza według zastrz. 5, znamienna tym, że jest wybrana z grupy składającej się z komórek E. coli, drożdży oraz ssaków.
7. Białko fuzyjne, znamienne tym, że obejmuje: polipeptyd określony w zastrz. 1 oraz TbH9; albo polipeptyd określony w zastrz. 1 oraz TbRal2; albo polipeptyd określony w zastrz. 1 oraz TbRa35; albo polipeptyd określony w zastrz. 1 oraz ESAT-6.
8. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że obejmuje: polipeptyd określony w zastrz. 1; albo cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 2; albo białko fuzyjne określone w zastrz. 6; oraz fizjologicznie dopuszczalny nośnik.
9. Kompozycja farmaceutyczna według zastrz. 8, znamienna tym, że służy do zastosowania w sposobie wywoływania ochronnej odporności immunologicznej u pacjenta, przy czym sposób obejmuje podanie pacjentowi kompozycji farmaceutycznej.
10. Szczepionka, znamienna tym, że obejmuje polipeptyd określony w zastrz. 1; albo cząsteczkę DNA określoną w zastrz. 2; albo białko fuzyjne określone w zastrz. 6; oraz nieswoisty wzmacniacz odpowiedzi odpornościowej.
11. Szczepionka według zastrz. 10, znamienna tym, że nieswoistym wzmacniaczem odpowiedzi odpornościowej jest adiuwant.
12. Szczepionka według zastrz. 10 albo 11, znamienna tym, że służy do zastosowania w sposobie wywoływania ochronnej odporności immunologicznej u pacjenta, przy czym sposób obejmuje podanie pacjentowi szczepionki.
13. Kompozycja, znamienna tym, że obejmuje polipeptyd określony w zastrz. 1, do zastosowania w sposobie wykrywania gruźlicy u pacjenta, przy czym sposób ten obejmuje:
(a) kontaktowanie komórek skóry pacjenta z jednym albo wieloma polipeptydami określonymi w zastrz. 1 i (b) wykrywanie odpowiedzi odpornościowej na skórze pacjenta, a tym samym wykrywanie gruźlicy u pacjenta.
14. Kompozycja według zastrz. 13, znamienna tym, że odpowiedzią odpornościową jest stwardnienie.
15. Zestaw diagnostyczny, znamienny tym, że obejmuje:
(a) polipeptyd określony w zastrz. 1; oraz (b) aparat odpowiedni do kontaktowania polipeptydu z komórkami skóry pacjenta.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52343695A | 1995-09-01 | 1995-09-01 | |
| US53363495A | 1995-09-22 | 1995-09-22 | |
| US62087496A | 1996-03-22 | 1996-03-22 | |
| US65968396A | 1996-06-05 | 1996-06-05 | |
| US68057496A | 1996-07-12 | 1996-07-12 | |
| PCT/US1996/014674 WO1997009428A2 (en) | 1995-09-01 | 1996-08-30 | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL325373A1 PL325373A1 (en) | 1998-07-20 |
| PL186774B1 true PL186774B1 (pl) | 2004-02-27 |
Family
ID=27541835
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL96325373A PL186774B1 (pl) | 1995-09-01 | 1996-08-30 | Związki i sposoby do immunoterapii i diagnostyki gruźlicy |
Country Status (23)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (5) | EP1712628B1 (pl) |
| JP (5) | JP4382160B2 (pl) |
| KR (1) | KR100433750B1 (pl) |
| CN (1) | CN1117149C (pl) |
| AT (5) | ATE426025T1 (pl) |
| AU (1) | AU727602B2 (pl) |
| BR (2) | BR9612997B1 (pl) |
| CA (3) | CA2684425A1 (pl) |
| CY (2) | CY2570B1 (pl) |
| CZ (3) | CZ300688B6 (pl) |
| DE (4) | DE69636487T2 (pl) |
| DK (4) | DK1347055T3 (pl) |
| ES (4) | ES2271449T3 (pl) |
| HU (2) | HU227778B1 (pl) |
| IL (1) | IL123506A (pl) |
| MX (1) | MX9801638A (pl) |
| NO (4) | NO324372B1 (pl) |
| NZ (1) | NZ319377A (pl) |
| PL (1) | PL186774B1 (pl) |
| PT (4) | PT1398379E (pl) |
| SI (1) | SI0851927T1 (pl) |
| TR (5) | TR199800411T1 (pl) |
| WO (1) | WO1997009428A2 (pl) |
Families Citing this family (45)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2501135Y2 (ja) | 1989-06-10 | 1996-06-12 | エヌティエヌ株式会社 | 摩擦式無段変速機 |
| JP2501911B2 (ja) | 1989-08-15 | 1996-05-29 | 日産自動車株式会社 | トロイダル型無段変速機 |
| US6991797B2 (en) | 1993-07-02 | 2006-01-31 | Statens Serum Institut | M. tuberculosis antigens |
| US6641814B1 (en) | 1997-04-02 | 2003-11-04 | Statens Serum Institut | Nucleic acids fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis |
| US6290969B1 (en) | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6458366B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| US6592877B1 (en) | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| AU4750597A (en) * | 1996-10-11 | 1998-05-11 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| US6627198B2 (en) | 1997-03-13 | 2003-09-30 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6544522B1 (en) * | 1998-12-30 | 2003-04-08 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6350456B1 (en) | 1997-03-13 | 2002-02-26 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection |
| US6982085B2 (en) | 1997-04-02 | 2006-01-03 | Statens Serum Institut | TB diagnostic based on antigens from M. tuberculosis |
| DK1449922T3 (da) * | 1997-04-02 | 2007-12-03 | Statens Seruminstitut | Nukleinsyrefragmenter og polypeptidfragmenter afledt af M. tuberculosis |
| US7037510B2 (en) | 1997-04-18 | 2006-05-02 | Statens Serum Institut | Hybrids of M. tuberculosis antigens |
| US6613881B1 (en) * | 1997-05-20 | 2003-09-02 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use |
| US6555653B2 (en) | 1997-05-20 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use |
| AU8123898A (en) * | 1997-07-16 | 1999-02-10 | Institut Pasteur | A polynucleotide functionally coding for the lhp protein from mycobacterium tuberculosis, its biologically active derivative fragments, as well as metho ds usingthe same |
| EP1484405A1 (en) * | 1997-11-10 | 2004-12-08 | Statens Serum Institut | Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. Tuberculosis |
| AU750173B2 (en) * | 1997-11-10 | 2002-07-11 | Statens Serum Institut | Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis |
| BR9909472A (pt) * | 1998-04-07 | 2001-09-11 | Corixa Corp | Polipeptìdeo purificado, processo para prevenir tuberculose, e, composição farmacêutica |
| GB9808720D0 (en) * | 1998-04-23 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| ES2333073T3 (es) * | 1998-11-04 | 2010-02-16 | Isis Innovation Limited | Prueba diagnostica de tuberculosis. |
| AU2594500A (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-31 | Corixa Corporation | Methods for using mycobacterium tuberculosis molecules as immunological adjuvants |
| US6465633B1 (en) | 1998-12-24 | 2002-10-15 | Corixa Corporation | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis |
| CA2372583C (en) * | 1999-05-04 | 2012-07-10 | University Of Medicine And Dentistry Of New Jersey | Proteins expressed by mycobacterium tuberculosis and not by bcg and their use as diagnostic reagents and vaccines |
| US7009042B1 (en) * | 1999-10-07 | 2006-03-07 | Corixa Corporation | Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins |
| US6316205B1 (en) | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
| AU2001241738A1 (en) | 2000-02-25 | 2001-09-03 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
| DE60139963D1 (de) | 2000-06-20 | 2009-10-29 | Corixa Corp | Fusionsproteine aus mycobakterium tuberculosis |
| US7026465B2 (en) | 2002-02-15 | 2006-04-11 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis |
| ITRM20040091A1 (it) | 2004-02-19 | 2004-05-19 | Istituto Naz Per Le Malattie | Test immunologico rapido per la diagnosi ed il monitoraggio dell'infezione tubercolare. |
| FI119445B (fi) * | 2004-10-29 | 2008-11-14 | Waertsilae Finland Oy | Polttomoottorin polttoaineen syöttöjärjestelmän paineen värähtelyn vaimennin |
| EA012037B1 (ru) | 2004-11-16 | 2009-06-30 | Круселл Холланд Б.В. | Поливалентные вакцины, содержащие рекомбинантные вирусные векторы |
| KR20130110233A (ko) | 2005-04-29 | 2013-10-08 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 결핵균 감염을 예방 또는 치료하기 위한 신규한 방법 |
| FR2952058B1 (fr) * | 2009-10-29 | 2013-10-04 | Centre Nat Rech Scient | Procede de ligation native de polypeptides |
| HRP20161608T1 (hr) | 2010-01-27 | 2017-01-13 | Glaxosmithkline Biologicals Sa | Modificirani tuberkulozni antigeni |
| CA2819297A1 (en) | 2010-12-14 | 2012-06-21 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Mycobacterium antigenic composition |
| FR2971509B1 (fr) * | 2011-02-16 | 2013-02-22 | Centre Nat Rech Scient | Procede de preparation de peptides par assemblage de multiples fragments peptidiques |
| CN103290030A (zh) * | 2012-02-23 | 2013-09-11 | 上海交通大学 | 一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用 |
| CA2871711A1 (en) * | 2012-05-04 | 2013-11-07 | Pfizer Inc. | Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens |
| KR102444555B1 (ko) * | 2014-04-04 | 2022-09-21 | 베스타론 코포레이션 | 인위적으로 활성화된 펩타이드 |
| GB201513176D0 (en) | 2015-07-27 | 2015-09-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel methods for inducing an immune response |
| FR3048286B1 (fr) * | 2016-02-26 | 2021-01-22 | Omunis | Peptides immunogenes et leur utilisation |
| CN107304231B (zh) * | 2016-04-18 | 2021-01-01 | 华中农业大学 | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用 |
| GB201614485D0 (en) * | 2016-08-25 | 2016-10-12 | Univ Oxford Innovation Ltd | Immunogenic composition |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2244539A1 (en) * | 1973-07-13 | 1975-04-18 | Mitsui Pharmaceuticals | Tuberculin active proteins and peptides prepn - from tubercle bacillus |
| FR2265402A1 (en) * | 1974-03-29 | 1975-10-24 | Mitsui Pharmaceuticals | Tuberculin active proteins and peptides prepn - from tubercle bacillus |
| US4876089A (en) * | 1984-09-06 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines |
| US4751180A (en) | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
| US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
| US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
| US4897268A (en) | 1987-08-03 | 1990-01-30 | Southern Research Institute | Drug delivery system and method of making the same |
| FR2677365B1 (fr) * | 1991-06-07 | 1995-08-04 | Pasteur Institut | Proteines de mycobacterium et applications. |
| US5330754A (en) * | 1992-06-29 | 1994-07-19 | Archana Kapoor | Membrane-associated immunogens of mycobacteria |
| DK79793D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | Diagnostic test |
| DK79893D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | New vaccine |
-
1996
- 1996-08-30 ES ES03021501T patent/ES2271449T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 JP JP51146497A patent/JP4382160B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 ES ES96933009T patent/ES2210392T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DK DK03005931T patent/DK1347055T3/da active
- 1996-08-30 TR TR1998/00411T patent/TR199800411T1/xx unknown
- 1996-08-30 MX MX9801638A patent/MX9801638A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 AT AT03005931T patent/ATE426025T1/de active
- 1996-08-30 PT PT03021501T patent/PT1398379E/pt unknown
- 1996-08-30 TR TR2008/06258T patent/TR200806258T2/xx unknown
- 1996-08-30 BR BRPI9612997-2A patent/BR9612997B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 AU AU71586/96A patent/AU727602B2/en not_active Expired
- 1996-08-30 IL IL12350696A patent/IL123506A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 EP EP06112509A patent/EP1712628B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PT PT96933009T patent/PT851927E/pt unknown
- 1996-08-30 EP EP96933009A patent/EP0851927B1/en not_active Revoked
- 1996-08-30 TR TR2004/03064T patent/TR200403064T2/xx unknown
- 1996-08-30 CA CA002684425A patent/CA2684425A1/en not_active Abandoned
- 1996-08-30 EP EP03005931A patent/EP1347055B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 CA CA002230885A patent/CA2230885C/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-30 AT AT01126628T patent/ATE323165T1/de active
- 1996-08-30 CA CA2653566A patent/CA2653566C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DK DK01126628T patent/DK1203817T3/da active
- 1996-08-30 ES ES01126628T patent/ES2262595T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 HU HU0900047A patent/HU227778B1/hu unknown
- 1996-08-30 EP EP01126628A patent/EP1203817B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PT PT01126628T patent/PT1203817E/pt unknown
- 1996-08-30 HU HU9900902A patent/HU225979B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DE DE69636487T patent/DE69636487T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DK DK96933009T patent/DK0851927T3/da active
- 1996-08-30 AT AT03021501T patent/ATE337399T1/de active
- 1996-08-30 DE DE69637879T patent/DE69637879D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DE DE69636046T patent/DE69636046T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PL PL96325373A patent/PL186774B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 SI SI9630644T patent/SI0851927T1/xx unknown
- 1996-08-30 TR TR2009/01109T patent/TR200901109T1/xx unknown
- 1996-08-30 EP EP03021501A patent/EP1398379B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 CZ CZ20060387A patent/CZ300688B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 ES ES03005931T patent/ES2324529T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 BR BRPI9610262-4B1A patent/BR9610262B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CZ CZ0062898A patent/CZ297406B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CZ CZ20090166A patent/CZ300953B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 AT AT06112509T patent/ATE513915T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 AT AT96933009T patent/ATE252640T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 TR TR2008/06259T patent/TR200806259T2/xx unknown
- 1996-08-30 KR KR10-1998-0701589A patent/KR100433750B1/ko not_active Expired - Fee Related
- 1996-08-30 CN CN96197639A patent/CN1117149C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 NZ NZ319377A patent/NZ319377A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DE DE69630457T patent/DE69630457T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PT PT03005931T patent/PT1347055E/pt unknown
- 1996-08-30 WO PCT/US1996/014674 patent/WO1997009428A2/en not_active Ceased
- 1996-08-30 DK DK03021501T patent/DK1398379T3/da active
-
1998
- 1998-02-27 NO NO19980883A patent/NO324372B1/no not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-10 JP JP2006034592A patent/JP4324596B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-10 JP JP2006034593A patent/JP4324597B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2006-12-19 CY CY0600033A patent/CY2570B1/xx unknown
-
2007
- 2007-02-01 NO NO20070621A patent/NO20070621L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-02-01 NO NO20070619A patent/NO20070619L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-02-01 NO NO20070618A patent/NO336288B1/no not_active IP Right Cessation
- 2007-03-23 JP JP2007077972A patent/JP4324618B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-04-08 JP JP2009094008A patent/JP2009159982A/ja not_active Ceased
- 2009-06-05 CY CY0900006A patent/CY2612B2/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PL186774B1 (pl) | Związki i sposoby do immunoterapii i diagnostyki gruźlicy | |
| US7989605B2 (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| US7927609B2 (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| EP2270170A1 (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use | |
| WO1997009428A9 (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| HK1099338A (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| HK1150852A (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use | |
| HK1059282B (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| HK1148775A (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use | |
| HK1142098A (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20090830 |