NO324372B1 - Polypeptid, DNA-sekvens som koder for polypeptidet, ekspresjonsvektor og vertscelle som omfatter DNA-molekylet, samt kombinasjonspolypeptid, blanding og diagnostisk testsett som omfatter polypeptidet og farmasoytisk blanding og vaksine som omfatter polypeptidet, et DNA-molekyl som koder for polypeptidet eller et kombinasjonspolypeptid som omfatter polypeptidet. - Google Patents
Polypeptid, DNA-sekvens som koder for polypeptidet, ekspresjonsvektor og vertscelle som omfatter DNA-molekylet, samt kombinasjonspolypeptid, blanding og diagnostisk testsett som omfatter polypeptidet og farmasoytisk blanding og vaksine som omfatter polypeptidet, et DNA-molekyl som koder for polypeptidet eller et kombinasjonspolypeptid som omfatter polypeptidet. Download PDFInfo
- Publication number
- NO324372B1 NO324372B1 NO19980883A NO980883A NO324372B1 NO 324372 B1 NO324372 B1 NO 324372B1 NO 19980883 A NO19980883 A NO 19980883A NO 980883 A NO980883 A NO 980883A NO 324372 B1 NO324372 B1 NO 324372B1
- Authority
- NO
- Norway
- Prior art keywords
- polypeptide
- seq
- amino acid
- tuberculosis
- acid sequence
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 208
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 189
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 182
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 title claims abstract description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims description 107
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 title claims description 37
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 19
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 title claims description 17
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 title claims description 10
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 title claims description 4
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 title abstract description 10
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims abstract description 110
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 48
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 claims abstract description 36
- 230000036039 immunity Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 claims abstract description 10
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims abstract description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 130
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 130
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 128
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 86
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 36
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims description 15
- 230000028993 immune response Effects 0.000 claims description 13
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 claims description 10
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 7
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 7
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 6
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 claims description 5
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 claims description 5
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 claims description 5
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 claims description 4
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 claims description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims description 2
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 45
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 38
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 11
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 abstract description 4
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 36
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 35
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 29
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 22
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 21
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 21
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 17
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 17
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 15
- 230000004044 response Effects 0.000 description 15
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 102100037850 Interferon gamma Human genes 0.000 description 13
- 230000014828 interferon-gamma production Effects 0.000 description 13
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 13
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 11
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 11
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 9
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 9
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 9
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 9
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 9
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 8
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 8
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 8
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 8
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 8
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 8
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 8
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 8
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 101710166488 6 kDa early secretory antigenic target Proteins 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 7
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 7
- 229960003130 interferon gamma Drugs 0.000 description 7
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 241001467552 Mycobacterium bovis BCG Species 0.000 description 6
- 230000019734 interleukin-12 production Effects 0.000 description 6
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 6
- UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N N,N'-diphenyl-1,4-phenylenediamine Chemical compound C=1C=C(NC=2C=CC=CC=2)C=CC=1NC1=CC=CC=C1 UTGQNNCQYDRXCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 229960000190 bacillus calmette–guérin vaccine Drugs 0.000 description 5
- 230000016396 cytokine production Effects 0.000 description 5
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 5
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 4
- 101100117387 Catharanthus roseus DPAS gene Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101100224410 Solanum tuberosum DPEP gene Proteins 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 4
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 4
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 4
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000004366 reverse phase liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 4
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 4
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 3
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 3
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 3
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 3
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 3
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 3
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 3
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 3
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 3
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 3
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 3
- GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 1,25-Dihydroxy-vitamin D3' Natural products C1CCC2(C)C(C(CCCC(C)(C)O)C)CCC2C1=CC=C1CC(O)CC(O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 108010041986 DNA Vaccines Proteins 0.000 description 2
- CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N Gly-Cys-Gly Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC([O-])=O CEXINUGNTZFNRY-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 description 2
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 description 2
- 241001049988 Mycobacterium tuberculosis H37Ra Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 239000002033 PVDF binder Substances 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N Sodium azide Chemical compound [Na+].[N-]=[N+]=[N-] PXIPVTKHYLBLMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N Sulfuric acid Chemical compound OS(O)(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000005867 T cell response Effects 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 208000036981 active tuberculosis Diseases 0.000 description 2
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 229960005084 calcitriol Drugs 0.000 description 2
- GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N calcitriol Chemical compound C1(/[C@@H]2CC[C@@H]([C@]2(CCC1)C)[C@@H](CCCC(C)(C)O)C)=C\C=C1\C[C@@H](O)C[C@H](O)C1=C GMRQFYUYWCNGIN-NKMMMXOESA-N 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 230000034994 death Effects 0.000 description 2
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 235000013861 fat-free Nutrition 0.000 description 2
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 2
- 239000007789 gas Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 2
- HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L magnesium stearate Chemical compound [Mg+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O HQKMJHAJHXVSDF-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 2
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 2
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 2
- 229920002981 polyvinylidene fluoride Polymers 0.000 description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 2
- 238000000734 protein sequencing Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000000682 scanning probe acoustic microscopy Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 2
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 2
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 2
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 2
- VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoyl]amino]propanoyl]amino]prop-2-enoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]propanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)C(=C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N VZQHRKZCAZCACO-PYJNHQTQSA-N 0.000 description 1
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 1
- DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 1,1-ethanedithiol Chemical compound CC(S)S DHBXNPKRAUYBTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 1-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(tritiooxymethyl)oxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO[3H])O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(C)=C1 IQFYYKKMVGJFEH-OFKYTIFKSA-N 0.000 description 1
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 108010042708 Acetylmuramyl-Alanyl-Isoglutamine Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N Alpha-Lactose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](CO)O[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-XLOQQCSPSA-N 0.000 description 1
- 241000024188 Andala Species 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 Chemical compound C1=CC=2C(C[C@@H]3NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](NC(=O)N(CC#CCN(CCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](CC4=CC=CC=C4)NC3=O)C(=O)N)CC=C)NC(=O)[C@@H](N)C)CC3=CNC4=C3C=CC=C4)C)=CNC=2C=C1 OBMZMSLWNNWEJA-XNCRXQDQSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 241000557626 Corvus corax Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- 229940021995 DNA vaccine Drugs 0.000 description 1
- 102100037373 DNA-(apurinic or apyrimidinic site) endonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 201000004624 Dermatitis Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N Gentamicin Chemical compound O1[C@H](C(C)NC)CC[C@@H](N)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](NC)[C@@](C)(O)CO2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N CEAZRRDELHUEMR-URQXQFDESA-N 0.000 description 1
- 229930182566 Gentamicin Natural products 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 101000599940 Homo sapiens Interferon gamma Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 1
- 101710200719 Immunogenic protein MPB64 Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 208000019693 Lung disease Diseases 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N Methyl tert-butyl ether Chemical compound COC(C)(C)C BZLVMXJERCGZMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186367 Mycobacterium avium Species 0.000 description 1
- 241000187482 Mycobacterium avium subsp. paratuberculosis Species 0.000 description 1
- 241001646725 Mycobacterium tuberculosis H37Rv Species 0.000 description 1
- 108091061960 Naked DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 101710176384 Peptide 1 Proteins 0.000 description 1
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 1
- 102000006335 Phosphate-Binding Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010058514 Phosphate-Binding Proteins Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 1
- 101710105014 Putative serine protease Proteins 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241001068263 Replication competent viruses Species 0.000 description 1
- 102000006382 Ribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010083644 Ribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 230000006052 T cell proliferation Effects 0.000 description 1
- -1 Thr and Ala Chemical class 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 206010046865 Vaccinia virus infection Diseases 0.000 description 1
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 1
- 102100023870 YLP motif-containing protein 1 Human genes 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 208000038016 acute inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006022 acute inflammation Effects 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 102000019199 alpha-Mannosidase Human genes 0.000 description 1
- 108010012864 alpha-Mannosidase Proteins 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 230000001355 anti-mycobacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 1
- 244000309464 bull Species 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011097 chromatography purification Methods 0.000 description 1
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000001268 conjugating effect Effects 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 235000021438 curry Nutrition 0.000 description 1
- ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N cyanogen bromide Chemical group BrC#N ATDGTVJJHBUTRL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229960002518 gentamicin Drugs 0.000 description 1
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004029 hydroxymethyl group Chemical group [H]OC([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000009851 immunogenic response Effects 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 238000010324 immunological assay Methods 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000000411 inducer Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 230000021633 leukocyte mediated immunity Effects 0.000 description 1
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L magnesium carbonate Chemical compound [Mg+2].[O-]C([O-])=O ZLNQQNXFFQJAID-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000001095 magnesium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910000021 magnesium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019359 magnesium stearate Nutrition 0.000 description 1
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000002480 mineral oil Substances 0.000 description 1
- 235000010446 mineral oil Nutrition 0.000 description 1
- 229940035032 monophosphoryl lipid a Drugs 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N muramyl dipeptide Chemical compound OC(=O)CC[C@H](C(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](C)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H](O)[C@@H]1NC(C)=O BSOQXXWZTUDTEL-ZUYCGGNHSA-N 0.000 description 1
- 238000002703 mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 231100000350 mutagenesis Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 208000024356 pleural disease Diseases 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000009696 proliferative response Effects 0.000 description 1
- 230000002685 pulmonary effect Effects 0.000 description 1
- 208000008128 pulmonary tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N saccharin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)NS(=O)(=O)C2=C1 CVHZOJJKTDOEJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000012266 salt solution Substances 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 230000000405 serological effect Effects 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 239000000454 talc Substances 0.000 description 1
- 229910052623 talc Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N thioanisole Chemical compound CSC1=CC=CC=C1 HNKJADCVZUBCPG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 238000011269 treatment regimen Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 208000007089 vaccinia Diseases 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/04—Antibacterial agents
- A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/10—Cells modified by introduction of foreign genetic material
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Pulmonology (AREA)
- Oncology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
Foreliggende oppfinnelse vedrører et polypeptid, DNA-sekvens som koder for polypeptidet, ekspresjonsvektor og vertscelle som omfatter DNA-molekylet, samt kombinasjonspolypeptid, blanding og diagnostisk testsett som omfatter polypeptidet og farmasøytisk blanding og vaksine som omfatter polypeptidet, et DNA-molekyl som koder for polypeptidet eller et kombinasjonspolypeptid som omfatter polypeptidet.
Nærmere bestemt vedrører oppfinnelsen polypeptider som omfatter et
Mycobacterium tuberculosis- anWgen, eller en variant derav, og det beskrives anvendelse av slike polypeptider for diagnostisering og vaksinering mot Mycobacterium tuberculosis-\ nfeks\ on.
Tuberkulose er en kronisk, infeksiøs sykdom, som vanligvis forårsakes av infeksjon med Mycobacterium tubenculosis. Den er en utbredt sykdom i utviklingsland og et økende problem i utviklede områder i verden, med ca. 8 millioner nye tilfeller og 3 millioner dødsfall hvert år. Selv om infeksjonen kan være asymptomatisk over et betydelig tidsrom, manifesterer sykdommen seg oftest som en akutt inflammasjon av lungene som resulterer i feber og uproduktiv hoste. Uten behandling er resultatet ofte alvorlige komplikasjoner og død.
Selv om tuberkulose i alminnelighet kan kontrolleres ved å benytte omfattende antibiotika-terapi, er slik behandling ikke tilstrekkelig til å hindre spredning av sykdommen. Infiserte individer kan være asymptomatiske, men bærere i en viss tid. Men selv om lydighet mot behandlingsregimet er avgjørende, er det vanskelig å overvåke pasientens oppførsel. Enkelte pasienter fullfører ikke behandlingsopplegget, og dette kan føre til at behandlingen ikke har effekt og til utvikling av medikamentresistens.
Forhindring av spredningen av tuberkulose fordrer effektiv vaksinasjon og nøyaktig, tidlig diagnostisering av sykdommen. Vaksinasjon med levende bakterier er i dag den mest effektive metode for å indusere beskyttende immunitet. Den vanligste Mycobacterium som benyttes for dette formål er Bacillus Calmette-Guerin (BCG), en avirulent stamme av Mycobacterium bovis. Sikkerheten og effektiviteten av BCG er imidlertid en kilde til kontroversitet, og enkelte land som f.eks. USA, vaksinerer ikke den generelle befolkning. Diagnosen stilles i alminnelighet ved å benytte en hudtest som innebærer intradermal eksponering for tuberkulin PPD (protein-renset derivat). Antigen-spesifikk T-cellerespons resulterer i målbar indurasjon på injeksjonsstedet 48-72 timer etter injeksjon, hvilket indikerer eksponering for Mycobacterium-antigener. Følsomheten og spesifisiteten har imidlertid vært et problem med denne test, og individer vaksinert med BCG kan ikke skjelnes fra infiserte individer.
Mens det har vært vist at makrofager virker som hovedutøveme av M. tuberculosis-\ mrr\ uri\ tel er T-celler de fremherskende induceme av slik immunitet. T-cellenes viktige rolle ved beskyttelse mot M. tobercu/os/s-infeksjon illustreres av den hyppige forekomst av M. tuberculosis i AIDS-pasienter som følge av utarmingen av CD4-T-celler assosiert med humant immunsviktvirus-infeksjon (HIV). Mycobacterium- reaktive CD4-T-celler har vist seg å være potente produsenter av gamma-interferon (IFN-y) som på sin side har vært vist å utløse de anti-mykobakterielle virkningene av makrofager i mus. Rollen til IFN-y er hos mennesket mindre klar, men studier har vist at 1,25-dihydroksy-vitamin-D3, enten for seg eller i kombinasjon med IFN-y eller tumornekrosefaktor-alfa, aktiverer humane makrofager til å inhibere M. tuberculosis-'\ nteks\ on. Det er dessuten kjent at IFN-y-stimulerer humane makrofager til å produsere 1,25-dihydroksy-vitamin-D3. Likeledes har IL-12 vært vist å spille en rolle ved stimulering av resistens mot M. tuberculosis- infeks<p>n. For en oversikt angående immunologien av M. tobercu/os/s-infeksjon, se Chan & Kaufmann i Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom (red.), ASM Press, Washington, DC, 1994.
"Cameron et al. Microbiology 1994, 140:1977-1982 identifiserer og
karakteriserer en putativ serinprotease fra Mycobacterium avium.
Yamaguchi et al., Infect.Immun., 1989, 57 (1):283-288 beskriver kloningen og karakteriseringen av et gen for det immunogene protein MPB64 fra Mycobacterium bovis BCG."
Det foreligger således behov for forbedrede vaksiner og fremgangsmåter for forhindring, behandling og påvisning av tuberkulose. Foreliggende oppfinnelse fyller disse behov og gir dessuten andre beslektede fordeler.
I korte trekk tilveiebringer oppfinnelsen forbindelser for forhindring og diagnostisering av tuberkulose. I henhold til ett aspekt tilveiebringes polypeptider som omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som har den samme biologiske virkning og som kun skiller seg i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner.
I en foretrukken utførelse kjennetegnes polypeptidet av at det omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som kun skiller seg i konservative substitusjoner.
I en annen foretrukken utførelse av oppfinnelsen kjennetegnes polypeptidet av at det består av en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som kun skiller seg i konservative substitusjoner.
I andre foretrukne utførelser av polypeptidet ifølge oppfinnelsen kjennetegnes det ved at det omfatter eller består av en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som kun skiller seg i en konservativ substitusjon.
I en annen utførelsesform omfatter polypeptidet en aminosyresekvens som er kodet for av en DNA-sekvens av SEKV. ID NR : 4.
I en foretrukket utførelsesform kjennetegnes polypeptidet av at det består av en aminosyresekvens kodet for av en DNA-sekvens av SEKV. ID NR : 4.
I henhold til relaterte aspekter av oppfinnelsen tilveiebringes også DNA-molekyl som kjennetegnes ved at det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge oppfinnelsen. Foretrukket omfatter eller består DNA-molekylet av en nukleotidsekvens av SEKV. ID NR : 4.1 andre relaterte aspekter av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes ekspresjonsvektorer som omfatter disse DNA-molekylene og vertsceller transformert eller transfektert med slike ekspresjonsvektorer.
I henhold til et annet aspekt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse kombinasjonspolypeptid som omfatter et polypeptid i henhold til oppfinnelsen, og en eller flere ytterligere immunogene M. tuberculosis- antigener som er knyttet via en peptidbinding til en enkelt aminosyrekjede.
I henhold til andre aspekter tilveiebringer foreliggende oppfinnelse farmasøytiske blandinger som omfatter et polypeptid ifølge oppfinnelsen, eller et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, eller et kombinasjonspeptid ifølge oppfinnelsen og en farmasøytisk akseptabel bærer. Oppfinnelsen tilveiebringer også vaksiner som omfatter et polypeptid ifølge oppfinnelsen, eller et DNA-molekyl ifølge oppfinnelsen, eller et fusjonsprotein ifølge oppfinnelsen og en ikke-spesifikk immunrespons forsterker.
Den ikke-spesifikke immunresponsforsterkeren kan i en foretrukken utførelsesform være en adjuvans.
Den farmasøytiske blandingen ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes i en foretrukken utførelse i en fremgangsmåte for å indusere protektiv immunitet i en pasient, nevnte fremgangsmåte omfatter administrering av den farmasøytiske . blandingen til en pasient.
Vaksinen ifølge foreliggende oppfinnelse anvendes likeledes i en foretrukken utførelse i en fremgangsmåte for å indusere protektiv immunitet i en pasient, nevnte fremgangsmåte omfatter administrering av vaksinen til en pasient.
I et ytterligere aspekt av foreliggende oppfinnelse tilveiebringes en blanding som kjennetegnes ved at den omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for anvendelse i en fremgangsmåte for detektering av tuberkulose i en pasient, nevnte fremgangsmåte omfatter:
(a) å kontakte dermalceller fra en pasient med ett eller flére polypeptider
ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, og
(b) detektering av immunresponsen på pasientens hud og derfra detektere tuberkulose i pasienten.
Foretrukket er immunresponsen som detekteres indurasjon.
I henhold til ytterligere aspekter av oppfinnelsen tilveiebringes et diagnostisk testsett som kjennetegnes ved at det omfatter:
(a) et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, og
(b) en apparatur som er tilstrekkelig for å kontakte nevnte polypeptid med dermalceller fra en pasient.
Kort beskrivelse av tegningene og sekvensbetegnelser
Figur 1A og B illustrerer stimuleringen av proliferasjon og interféron-y-produksjon i T-celler tatt fra en henholdsvis første og en andre M. tuberculosis-immun donor av de14 Kd, 20 Kd og 26 Kd antigenene som er beskrevet i Eksempel 1. Figur 2 illustrerer stimuleringen av proliferasjon og intérféron-y-produksjon i T-celler tatt fra et M. tuberculosis- mmurft individ, av de to representative polypeptidene TbRa3 og TbRa9.
SEKV. ID. NR:1 er DNA-sekvensen av TbRal.
SEKV. ID. NR:2 er DNA-sekvensen av TbRal 0.
SEKV. ID. NR:3 er DNA-sekvensen av TbRal 1.
SEKV. ID. NR:4 er DNA-sekvensen av TbRal 2.
SEKV. ID. NR:5 er DNA-sekvensen av TbRal 3. SEKV. ID. NR:6 er DNA-sekvensen av TbRal 6.
SEKV. ID. NR:7 er DNA-sekvensen av TbRal 7.
SEKV. ID. NR:8 er DNA-sekvensen av TbRal 8. SEKV. ID. NR:9 er DNA-sekvensen av TbRal 9. SEKV. ID. NR:10 er DNA-sekvensen av TbRa24. SEKV. ID. NR:11 er DNA-sekvensen av TbRa26.
SEKV. ID. NR:12 er DNA-sekvensen av TbRa28.
SEKV. ID. NR:13 er DNA-sekvensen av TbRa29. SEKV. ID. NR:14 er DNA-sekvensen av TbRa2A. SEKV. ID. NR:15 er DNA-sekvensen av TbRa3. SEKV. ID. NR:16 er DNA-sekvensen av TbRa32. SEKV. ID. NR:17 er DNA-sekvensen avTbRa35. SEKV. ID. NR:18 er DNA-sekvensen av TbRa36. SEKV. ID. NR: 19 er DNA-sekvensen av TbRa4. SEKV. ID. NR:20 er DNA-sekvensen av TbRa9. SEKV. ID. NR:21 er DNA-sekvensen av TbRaB. SEKV. ID. NR:22 er DNA-sekvensen av TbRaC
SEKV. ID. NR:23 er DNA-sekvensen av TbRaD. SEKV. ID. NR:24 er DNA-sekvensen av YYWCPG.
SEKV. ID. NR:25 er DNA-sekvensen av AAMK. SEKV. ID. NR:26 er DNA-sekvensen av TbL-23. SEKV. ID. NR:27 er DNA-sekvensen av TbL-24. SEKV. ID. NR:28 er DNA-sekvensen av TbL-25. SEKV. ID. NR:29 er DNA-sekvensen av TbL-28. SEKV. ID. NR:30 er DNA-sekvensen av TbL-29. SEKV. ID. NR:31 er DNA-sekvensen av TbH-5. SEKV. ID. NR:32 er DNA-sekvensen av TbH-8. SEKV. ID. NR:33 er DNA-sekvensen av TbH-9. SEKV. ID. NR:34 er DNA-sekvensen av TbM-1. SEKV. ID. NR:35 er DNA-sekvensen av TbM-3. SEKV. ID. NR:36 er DNA-sekvensen av TbM-6. SEKV. ID. NR:37 er DNA-sekvensen av TbM-7. SEKV. ID. NR:38 er DNA-sekvensen av TbM-9.
SEKV. ID. NR:39 er DNA-sekvensen av TbM-12.
SEKV. ID. NR:40 er DNA-sekvensen av TbM-13.
SEKV. ID. NR:41 er DNA-sekvensen av TbM-14.
SEKV. ID. NR:42 er DNA-sekvensen av TbM-15.
SEKV. ID. NR:43 er DNA-sekvensen av TbH-4.
SEKV. ID. NR:44 er DNA-sekvensen av TbH-4-FWD. SEKV. ID. NR:45 er DNA-sekvensen av TbH-12.
SEKV. ID. NR:46 er DNA-sekvensen av Tb38-1. SEKV. ID. NR:47 er DNA-sekvensen av Tb38-4.
SEKV. ID. NR:48 er DNA-sekvensen av TbL-17.
SEKV. ID. NR:49 er DNA-sekvensen av TbL-20.
SEKV. ID. NR:50 er DNA-sekvensen av TbL-21.
SEKV. ID. NR:51 er DNA-sekvensen av TbH-16.
SEKV. ID. NR:52 er DNA-sekvensen av DPEP.
SEKV. ID. NR:53 er den deduserte aminosyresekvens av DPEP.
SEKV. ID. NR:54 er proteinsekvensen av DPV N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:55 er proteinsekvensen av AVGS N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR: 56 er proteinsekvensen av AAMK N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:57 er proteinsekvensen av YYWC N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:58 er proteinsekvensen av DIGS N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:59 er proteinsekvensen av AEES N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:60 er proteinsekvensen av DPEP N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:61 er proteinsekvensen av APKT N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:62 er proteinsekvensen av DPAS N-ferminalt antigen. SEKV. ID. NR:63 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal. SEKV. ID. NR:64 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal0. SEKV. ID. NR:65 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal 1. SEKV. ID. NR:66 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal 2. SEKV. ID. NR:67 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal3. SEKV. ID. NR:68 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal 6. SEKV. ID. NR:69 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal 7. SEKV. ID. NR:70 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal 8. SEKV. ID. NR:71 er den deduserte aminosyresekvens av TbRal 9. SEKV. ID. NR:72 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa24. SEKV. ID. NR:73 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa26. SEKV. ID. NR:74 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa28. SEKV. ID. NR:75 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa29. SEKV. ID. NR:76 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa2A. SEKV. ID. NR:77 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa3. SEKV. ID. NR:78 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa32. SEKV. ID. NR:79 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa35. SEKV. ID. NR:80 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa36. SEKV. ID. NR:81 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa4. SEKV. ID. NR:82 er den deduserte aminosyresekvens av TbRa9. SEKV. ID. NR:83 er den deduserte aminosyresekvens av TbRaB. SEKV. ID. NR:84 er den deduserte aminosyresekvens av TbRaC. SEKV. ID. NR:85 er den deduserte aminosyresekvens av TbRaD. SEKV. ID. NR:86 er den deduserte aminosyresekvens av YYWCPG. SEKV. ID. NR:87 er den deduserte aminosyresekvens av TbAAMK. SEKV. ID. NR:88 er den deduserte aminosyresekvens av Tb38-1. SEKV. ID. NR:89 er den deduserte aminosyresekvens av TbH-4. SEKV. ID. NR:90 er den deduserte aminosyresekvens av TbH-8: SEKV. ID. NR:91 er den deduserte aminosyresekvens av TbH-9. SEKV. ID. NR:92 er den deduserte aminosyresekvens av TbH-12. SEKV. ID. NR:93 er aminosyresekvensen av Tb38-1 peptid 1.
SEKV. ID. NR:94 ér aminosyresekvensen av Tb38-1 peptid 2.
SEKV. ID. NR:95 er aminosyresekvensen av Tb38-1 peptid 3. SEKV. ID. NR:96 er aminosyresekvensen av Tb38^1 peptid 4. SEKV. ID. NR:97 er aminosyresekvensen av Tb38-1 peptid 5. SEKV. ID. NR:98 er aminosyresekvensen av Tb38-1 peptid 6. SEKV. ID. NR:99 er DNA-sekvensen av DPAS. SEKV. ID. NR:100 er den deduserte aminosyresekvens av DPAS. SEKV. ID. NR:101 er DNA-sekvensen av DPV.
SEKV. ID. NR: 102 er den deduserte aminosyresekvens av DPV. SEKV. !D. NR:103 er DNA-sekvensen av ESAT-6.
SEKV. ID. NR.104 er den deduserte aminosyresekvens av ESAT-6. SEKV. ID. NR:105 er DNA-sekvensen av TbH-8-2.
SEKV. ID. NR:106 er DNA-sekvensen åv TbH-9FL.
SEKV. ID. NR:107 er den deduserte aminosyresekvens av TbH-9FL SEKV. ID. NR:108 er DNA-sekvensen av TbH-9-1.
SEKV. ID. NR:109 er den deduserte aminosyresekvens av TbH-9-1. SEKV. ID. NR:110 er DNA-sekvensen av TbH-9-4.
SEKV. ID. NR:111 er den deduserte aminosyresekvens av TbH-9-4. SEKV. ID. NR:112 er DNA-sekvensen av Tb38-1F2 IN.
SEKV. ID. NR:113 er DNA-sekvensen av Tb38-2F2 RP.
SEKV. ID. NR:114 er den deduserte aminosyresekvens av Tb37-FL. SEKV. ID. NR:115 er den deduserte aminosyresekvens av Tb38-IN. ' SEKV. ID. NR:116 er DNA-sekvensen av Tb38-1 F3.
SEKV. ID. NR:117 er den deduserte aminosyresekvens av Tb38-1 F3. SEKV. ID. NR:118 er DNA-sekvensen av Tb38-1 F5.
SEKV. ID. NR:119 er DNA-sekvensen av Tb38-1F6;
SEKV. ID. NR: 120 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens av DPV.
SEKV. ID. NR:121 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens av AVGS. SEKV. ID. NR:122 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens av AAMK. SEKV. ID. NR:123 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens av
YYWC.
SEKV. ID. NR:124 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens av DIGS. SEKV. ID. NR:125 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens av AEES. SEKV. ID. NR: 126 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens av DPEP. SEKV. ID. NR: 127 er den deduserte N-terminale aminosyresekvens åv APKT. SEKV. ID. NR:128 er den deduserte aminosyresekvens av DPAS. SEKV. ID. NR: 129 er proteinsekvensen av DPPD N-terminalt antigen. SEKV. ID. NR:130-133 er proteinsekvensene av fire DPPD cyanogen-bromid-fragmenter.
SEKV. ID. NR:134 er den N-terminale proteinsekvens av XDS-antigen. SEKV. ID. NR:135 er den N-terminale proteinsekvens av AGD-antigen. SEKV. ID. NR:136 er den N-terminale protéinsekvens av APE-antigen. SEKV. ID. NR:137 er den N-terminale proteinsekvens av XYl-antigen.
Som angitt ovenfor er foreliggende oppfinnelse generelt rettet mot blandinger for forhindring, behandling og diagnostisering åv tuberkulose. Blandingene
innbefatter polypeptider som omfatter minst en aminosyresekvens av SEKV. ID NR :
66 eller en variant av et slikt antigen som har den samme biologiske virkning og som kun skiller seg i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner. Polypeptider inkluderer, men er ikke begrenset til, immunogent løselige M. tuberculosis- anWgener. Et «løselig M. tuberculosis- anWgen» er et protein av en M. tuberculosis- oppfmne\ se og forekommer i M. ftvbercu/os/s-kulturfiltrat. I denne sammenheng omfatter betegnelsen «polypeptid» aminosyrekjeder av en hvilken som helst lengde, inklusivt full-lengde proteiner (dvs. antigener), hvor aminosyrerestene er koblet sammen gjennom kovalente peptidbindinger. Et polypeptid som omfatter en immunogen del av ett av ovennevnte antigener kan således bestå fullstendig av den immunogene del eller kan inneholde ytterligere sekvenser. De ytterligere sekvensene kan avledes fra det native M. tuberculosis- anWgen eller være heterologt, og slike sekvenser kan (men ikke nødvendigvis) være immunogene;
«Immunogen» refererer seg i denne sammenheng til evnen til å utløse en immunrespons (f.eks. cellulær) i en pasient, så som et menneske, og/eller i en biologisk prøve. Særlig er antigener som er immunogene (og immunogene deler eller andre varianter av slike antigener) i stand til å stimulere celleproliferasjon, interleukin-12-produksjon og/eller interferon-y-produksjon i biologiske prøver som omfatter én eller flere celler valgt fra gruppen av T-celler, NK-celler, B-céller og makrofager, hvor cellene er avledet fra et M. tuberculosis-\ mmun\ individ. Polypeptider som omfatter i det minste en immunogen del av ett eller flere M. tuberculosis- anWgener, kan i alminnelighet benyttes for å påvise tuberkulose eller for å indusere beskyttende immunitet mot tuberkulose hos en pasient.
Blandingene og fremgangsmåten ifølge denne oppfinnelse innbefatter også varianter av ovennevnte polypeptider. En «variant» ér i denne sammenheng ét polypeptid som bare avviker fra det native antigen i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner, men slik at polypeptidets evne til å indusere en immunrespons er bibeholdt. Slike varianter kan i alminnelighet identifiseres ved å modifisere én av ovennevnte polypeptidsekvenser og evaluere de immunogene egenskapene av det modifiserte polypeptid ved for eksempel å benytte de her beskrevne representative fremgangsmåter.
En «konservativ substitusjon» er en substitusjon hvor en aminosyre er
erstattet med en annen aminosyre som har lignende egenskaper, slik at fagmannen
på peptidkjemiområdet vil forvente at sekundærstrukturen og den hydropatiske natur av polypeptidet i det vesentlige ville være uendret. Generelt representerer de følgende grupper av aminosyrer konservative endringer: (1) ala, pro, gly, glu, asp, gin, asn, ser, thr; (2) cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4) lys, arg, his;
og (5) phe, tyr, trp, his.
Varianter kan også (eller alternativt) modifiseres, for eksempel ved delesjon eller addisjon av aminosyrer som har minimal innflytelse på polypeptidets immunogene egenskaper, sekundærstruktur og hydropatiske natur. For eksempel
kan et polypeptid konjugeres til en signal- (eller leder-) sekvens i den N-terminalé ende av proteinet som ko-translasjonelt eller post-translasjonelt styrer overføringen av proteinet. Polypeptidet kan også konjugeres til en linker- eller annen sekvens, for å lette syntese, rensing eller identifisering av polypeptidet (f .eks. poly-His) eller for å forsterke binding av polypeptidet til en fast bærer. For eksempel kan et polypeptid konjugeres til et immunglobulins Fc-område.
I henhold til et lignende aspekt beskrives kombinasjonspblypeptider. Et «kombinasjonspolypeptid» er et polypeptid som omfatter minst én av ovennevnte immunogene deler og én eller flere ytterligere immunogene M. tuberculosis-
sekvenser som via en peptidkobling er forbundet til en enkelt aminosyrekjede. Sekvensene kan forbindes direkte (dvs. uten noen mellomliggende aminosyre) eller ved hjelp av en linkersekvens (f.eks. Gly-Cys-Gly) som ikke vesentlig minsker de immunogene egenskaper av de sammensatte polypeptidene.
Generelt kan M. tuberculosis- antigener og DNA-sekvenser som koder for slike antigener, fremstilles ved å benytte en hvilken som helst av en rekke fremgangsmåter. For eksempel kan løselige antigener isoleres fra M. tuberculosis-kulturtiltrater ved hjelp av kjente fremgangsmåter, herunder anionbytter- og omvendt fase kromatografi. Rensede antigener evalueres deretter med henblikk på deres evne til å utløse en passende (f.eks. cellulær) immunrespons, ved for eksempel å benytte de her beskrevne representative metoder. Immunogene antigener kan deretter sekvenseres partielt ved å benytte teknikker så som tradisjonell Edman-
kjemi. Se Edman & Berg, Eur. J. Biochem., 80:116-132,1967.
Immunogene antigener kan også fremstilles ved rekombinasjon ved å benytte
en DNA-sekvens som koder for antigenet, og som er innskutt i en ekspresjonsvektor og uttrykkes i en passende vert. DNA-molekyler som koder for løselige antigener kan isoleres ved screening av et passende M. fubercu/os/s-ekspresjonsbibliotek med
anti-sera (f.eks. kanin) spesifikt utviklet mot løselige M. tuberculosis- aritigener. DNA-sekvenser som koder for antigener som eventuelt er uløselige; kan identifiseres ved screening av et passende M. tuberculosis- genom\ sk eller cDNA-ekspresjonsbibliotek med sera tatt fra pasienter infisert med M. tuberculosis. Slike screeninger kan i alminnelighet foretas ved å benytte velkjent teknikk, f.eks. teknikk beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989.
DNA-sekvenser som koder for løselige antigener kan også oppnås ved
screening av et passende M. tuberculosis cDNA eller genomisk"DNA bibliotek méd henblikk på DNA-sekvenser som hybridiserer til degenererte oligonukleotider avledet fra partielle aminosyresekvenser av isolerte løselige antigener. Degenererte oligonukleotidsekvenser til bruk ved slik screening kan konstrueres og syntetiseres, og screeningen kan foretas som beskrevet (for eksempel) i Sambrook et al, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold
Spring Harbor, NY, 1989 (og der siterte referanser). PCR (polymerasekjedereaksjon) kan også benyttes ved å benytte ovennevnte-oligonukleotider etter kjente metoder,
for å isolere en nukleinsyre-probe fra et cDNA- eller genomisk bibliotek. Biblidtek-screeningen kan deretter foretas ved å benytte den isolerte probe.
Alternativt kan genomiske eller cDNA-bibliotek avledet fra M. tuberculosis
direkte underkastes screening ved å benytte mononukleære celler fra perifert blod (PBMC) eller T-cellelinjer eller kloner avledet fra ett eller flere M. tuberculosis-immune individer. I alminnelighet kan PBMC- og/eller T-celler for bruk i slike screeninger fremstilles som beskrevet nedenfor. Direkte bibliotek-screenihgér kan i alminnelighet foretas ved å teste forråd av uttrykte rekorhbinahte proteiner med henblikk på deres evne til å indusere proliferasjon og/eller iriterferon-y-produksjon i T-celler som skriver seg fra et M. tuberculosis-\ mmur\\ individ. Som et alternativ kan potensielle T-celle-antigener først selekteres på basis av antistoff-reaktivitet, som beskrevet ovenfor.
Uansett fremstillingsmetode har de her beskrevne antigener (og immunogene deler derav) (som eventuelt kan være løselige) evne til å indusere en immunrespons. Nærmere bestemt har antigenene evne til å indusere proliferasjon og/eller cytdkin-produksjon (dvs. interferon-y- og/eller interleukin-12-produksjon) i T-celler, NK-celler, B-celler og/eller makrofager som skriver seg fra et M. tuberculosis- immuriX individ. Valget av celletype for bruk ved evaluering av en immunogen respons mot et antigen vil selvsagt avhenge av den ønskede respons. For eksempel evalueres interleukin-12-produksjon lettest ved å benytte fremstillinger som inneholder B-céller og/eller makrofager. Et M. tuberculosis- lmmurft individ er et som ansees å være resistent mot utviklingen av tuberkulose som følge av å ha opparbeidet en effektiv T-cellerespons mot M. tuberculosis (dvs. tilnærmet fri for sykdomssymptomer). Slike individer kan identifiseres på basis av en sterk positiv (dvs. mer enn ca. 10 cm diameter indurasjon) intradermal testrespons på tuberkulose^protéiner (PPD) og fravær av ethvert tegn eller symptom på tuberkulosesykdom. T-celler, NK-celler, B-celler og makrofager tatt fra M. tuberculosis- lmmune individer, kan fremstilles ved å benytte kjente fremgangsmåter. For eksempel kan en fremstilling av PBMC (dvs. periferblod-mononukleære celler) benyttes uten videre separasjon av komponentceller. PBMC kan i alminnelighet fremstilles ved for eksempel å benytte tetthetssentrifugering gjennom Ficoll™ (Winthrop Laboratories, NY). T-cellér for anvendelse for de her beskrevne tester, kan også renses direkte fra PBMC.
Alternativt kan en anriket T-cellelinje som er reaktiv overfor mykobakterielle proteiner eller T-cellekloner som er reaktive overfor individuelle mykobakterielle proteiner, benyttes. Slike T-cellekloner kan utvikles for eksempel ved å dyrke PBMC fra M tuberculosis- immune individer med mykobakterielle proteiner i et tidsrom på 2-4 uker. Dette muliggjør ekspansjon av kun de mykobakterielle proteinspésifikke T-cellene og resulterer i en linje utelukkende bestående av slike celler. Disse cellene kan deretter klones dg testes med indivuelle proteiner, ved å benytte kjente fremgangsmåter for mer nøyaktig å definere individuell T-celle spesifisitet. I alminnelighet ansees antigener som tester positivt i bestemmelser for proliferasjon og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y og/eller interleukin-12-produksjon), foretatt ved å benytte T-celler, NK-celler, B-celler og/eller makrofager avledet fra et M. tuberculosis-\ mmun\ individ, som immunogene. Slike bestemmelser kan for eksempel foretas ved å benytte de nedenfor beskrevne representative fremgangsmåter. Immunogene deler av slike antigener kan identifiseres ved å
benytte lignende bestemmelser, og slike kan forekomme blant de polypeptider som her er beskrevet.
Den evne et polypeptid (f.eks. et immunogent antigen eller en del eller variant derav) har til å indusere celleproliferasjon, evalueres ved å bringe cellene (f.eks. T-celler og/eller NK-celler) i kontakt med polypeptidet og måle celleproliferasjonen. Den mengde polypeptid som er tilstrekkelig for evaluering av ca. 10<5> celler varierer i alminnelighet fra ca. 10 ng/mL til ca. 100 ug/ml_ og er fortrinnsvis ca. 10 u.g/mL. Inkuberingen av polypeptid med celler foretas typisk ved 37°C i ca. 6 dager. Etter inkubering med polypeptid testes cellene på proliferativ respons, hvilket kan fastslås etter kjente fremgangsmåter, som f.eks. ved å eksponere celler til en puls av radioaktivt merket tymidin og måle inkorporeringen av merkingen i cellulært DNA. Generelt ansees et polypeptid som resulterer i minst 3 gangers økning av proliferasjon i forhold til bakgrunnsverdiene (dvs. den proliferasjon som observeres for celler dyrket uten polypeptid) i stand til å indusere proliferasjon.
Et polypeptids evne til å stimulere produksjon av interferon-y og/eller interleukin-12 i celler kan evalueres ved å bringe cellene i kontakt med polypeptidet og måle det nivå av interferon-y eller interleukin-12 som produseres av cellene. Generelt vil den mengde polypeptid som er tilstrekkelig for evaluering av ca. 105
celler variere fra 10 ng/mL til ca. 100 u.g/mL, og fortrinnsvis være ca. 10 u.g/mL. Polypeptidet kan, men ikke nødvendigvis, immobiliseres på en fast bærer som f.eks. en kule eller en bionedbrytbar mikrokule som beskrevet i US-patent 4.897.268 og 5.075.109. Inkuberirigen av polypeptidet med cellene foretas i alminnelighet ved 37°C i ca. 6 dager. Etter inkubering med polypeptid, bestemmes cellene med henblikk på interferon-y og/eller interleukin-12 (eller en av deres subenheter), som kan bestemmes ved hjelp av kjente fremgangsmåter, så som ELISA (enzymbundet immunosorbent analyse) eller når det er tale om IL-12 P70-subenheten, en biotest, så som en test som måler proliferasjonen av T-celler. I alminnelighet ansees et polypeptid som resulterer i produksjon av 50 pg interferon-y per mL dyrket supematant (inneholdende 10<4->10<5> T-celler per mL) i stand til å stimulere produksjonen av interferon-y. Et polypeptid som stimulerer produksjonen av minst 10 pg/mL IL-12 P70 subenhet, og/eller minst 100 pg/mL IL-12 P40 subenhet, per 10<5 >makrofager eller B-celler (eller per 3 x 10<5> PBMC) ansees i stand til å stimulere produksjonen av IL-12.
I alminnelighet er immunogene antigener slike antigener som stimulerer proliferasjon og/eller cytokinproduksjon (dvs. interferon-y- og/eller interleukin-12-produksjon) i T-celler, NK-celler, B-celler og/eller makrofager som skriver seg fra minst ca. 25% av M. tuberculosis- immune individer. Blant disse immunogene antigenene kan polypeptider som har overlegne terapeutiske egenskaper, adskilles på basis av størrelsen av responsene i ovennevnte tester og på basis av den prosentandel individer som det observeres en respons for. I tillegg vil antigener som har overlegne terapeutiske egenskaper, ikke stimulere proliferasjon og/eller cytokinproduksjon in vitro i celler som skriver seg fra mer enn ca. 25% av individer som ikke er M. tuberculosis- immune, hvorved responser som ikke spesifikt skyldes M. føbercu/os/s-responderende celler, elimineres. De antigener som induserer en respons i en høy prosentdel av T-celle-, NK-celle-, B-celle- og/eller makrofag-preparater f ra M. tuberculosis-\ mmune individer (med en lav responsinsidens i cellepreparater fra andre individer) har overlegne terapeutiske egenskaper.
Antigener med overlegne terapeutiske egenskaper kan også identifiseres på basis av deres evne til å minske alvorlighetsgraden av M. tuberculosis-\ nieks\ on\ forsøksdyr når de administreres som en vaksine. Egnede vaksinepreparater for bruk på forsøksdyr er utførlig beskrevet nedenfor. Effektiviteten kan bestemmes på basis av antigenets evne til å gi minst ca. 50% reduksjon i bakterieantall og/eller minst ca. 40% nedsatt mortalitet etter eksperimentell infeksjon. Egnede forsøksdyr er bl.a.
mus, marsvin og primater.
Antigener som har overlegne diagnostiske egenskaper kan i alminnelighet identifiseres på basis av deres evne til å utløse en respons i en intradermal hudtest foretatt på et individ med aktiv tuberkulose, men ikke i en test foretatt på et individ som ikke er infisert med M. tuberculosis. Hudtester kan i alminnelighet foretas som nedenfor beskrevet, hvor en respons på minst 5 mm indurasjon ansees positiv.
Immunogene deler av de her beskrevne antigener kan fremstilles og identifiseres ved å benytte velkjente teknikker, som f.eks. sammenfattet i Paul, Fundamental Immunology, 3.utg., Raven Press, 1993, s. 243-247 og der siterte referanser. Slike teknikker innbefatter screening av polypeptiddeler av det native antigen med henblikk på immunogene egenskaper. De representative proliferasjons-og cytokin-produksjons-bestemmelser som her er beskrevet, kan i alminnelighet. benyttes ved disse screeninger. En immunogen del av et polypeptid er en del som i slike representative tester frembringer en immunrespons (f.eks. proliferasjon, interferon-yprodukson og/eller interleukin-12-produksjon) som i det vesentlige tilsvarer den som utvikles av antigenet i full lengde. Med andre ord kan en immunogen del av et antigen frembringe minst ca. 20%, og fortrinnsvis ca. 100%, av den proliferasjon som i den her beskrevne proliferasjonsbestemmelsesmodéll induseres av antigenet i full lengde. En immunogen del kan også, eller alternativt, stimulere produksjonen av minst ca. 20%, og fortrinnsvis ca. 100%, av det interferon-y og/eller interleukin-12 som i den her beskrevne modelltest induseres av antigenet i full lengde.
Deler og andre varianter av M. tuberculosis- anWgener kan utvikles syntetisk eller ved rekombinasjon. Syntetiske polypeptider som har færre enn ca. 100 aminosyrer, og i alminnelighet færre enn ca. 50 aminosyrer, kan frembringes ved å benytte velkjente teknikker. For eksempel kan slike polypeptider syntetiseres ved å benytte en av de kommersielt tilgjengelige fast-fase teknikker, som f.eks. Merrifield fast-fase syntesemetoden, hvor aminosyrer suksessivt adderes til en voksende aminosyrekjede. Se Merrifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146,1963. Utstyr for automatisert syntese av polypeptider er kommersielt tilgjengelig fra leverandører som Applied BioSystems, Inc. Foster City, CA, og betjenes i henhold til produsentens instruksjoner. Varianter av et nativt antigen kan i alminnelighet fremstilles ved å benytte standard mutageneseteknikk, så som oligonukleotid-rettet stedsspesifikk mutagenese. Ved å benytte standardteknikker kan også seksjoner av DNA-sekvensen fjernes for å muliggjøre fremstilling av trunkerte polypeptider.
Rekombinante polypeptider som inneholder deler og/eller varianter av et-nativt antigen, kan lett fremstilles fra en DNA-sekvens som koder for polypeptidet, ved å benytte en rekke velkjente teknikker. For eksempel kan supematanter fra egnede vert/vektor-systemer som utskiller rekombinant protein i kulturmedier, først konsentreres ved å benytte et kommersielt tilgjengelig filter. Etter konsentrering kan konsentratet avsettes på en passende rense-matriks som f.eks. en affinitetsmatriks eller en ionebytter-harpiks. Til slutt kan ett eller flere HPLC-trinn på omvendt-fase benyttes for ytterligere å rense et rekombinant protein.
En hvilken som helst av det kjente ekspresjonsvektor-utvalg kan benyttes for å uttrykke rekombinante polypeptider ifølge oppfinnelsen. Ekspresjon kan oppnås i enhver passende vertscelle som er blitt transformert eller transfektert med en ekspresjonsvektor som inneholder et DNA-molekyl som koder for ét rekombinant polypeptid. Egnede vertsceller inkluderer prokaryoter, gjær og høyere eukaryote celler. De vertscellene som fortrinnsvis benyttes er E. coli, gjær eller pattedyr-cellelinjer som COS eller CHO. De DNA-sekvensene som uttrykkes på denne måte kan kode for naturlig forekommende antigener, deler av naturlig forekommende antigener eller andre varianter derav.
Uansett fremstillingsmåte fremstilles de polypeptidene som her beskrives i alminnelighet i tilnærmet ren form. Fortrinnsvis er polypeptidene minst ca. 80% rene, mer foretrukket minst 90% rene og mest foretrukket minst 99% rene. I enkelte foretrukne utførelsesformer som er beskrevet mer detaljert nedenfor, inkorporeres dé tilnærmet rene polypeptidene i farmasøytiske blandinger eller vaksiner for bruk i én eller flere av de her omtalte metoder.
Det beskrives polypeptider som omfatter minst én immunogen del av et løselig M. tuberculosis- aritigen som har én av de etterfølgende N-terminale sekvenser, eller
en variant derav som bare avviker i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner:
hvor Xaa kan være en hvilken som helst aminosyre, fortrinnsvis en cysteinrest. En DNA-sekvens som koder for det antigen som ovenfor er angitt som (g) tilveiebringes i SEKV. ID. NR:52, og polypeptidet som kodes av SEKV. ID. NR:52 tilveiebringes i SEKV. ID. NR:53. En DNA-sekvens som koder for antigenet angitt som (a), tilveiebringes i SEKV. ID. NR:101; dens deduserte aminosyresekvens tilveiebringes i SEKV. ID. NR:102. En DNA-sekvens som tilsvarer antigen (d) ovenfor, tilveiebringes
i SEKV. ID. NR:24, en DNA-sekvens som tilsvarer antigen (c) tilveiebringes i SEKV.
ID. NR:25 og en DNA-sekvens som tilsvarer antigen (i) tilveiebringes j SEKV. ID.
NR:99; og dens deduserte aminosyresekvens tilveiebringes i SEKV. ID. NR:100.
Videre beskrives polypeptider som omfatter minst én immunogen del av et M. tuberculosis- an\\ ger\ som har én av følgende N-terminale sekvenser, eller en variant derav som bare avviker i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner:
hvor Xaa kan være en hvilken som helst aminosyre, fortrinnsvis en cysteinrest.
Det beskrives polypeptider som omfatter minst én immunogen dél av et løselig M. tuberculosis- anWgen (eller en variant av et slikt antigen) som omfatter én eller flere av de aminosyresekvenser som kodes av (a) DNA-sekvensene i SEKV. ID. NR:1, 2,4-10,13-25 og 52; (b) komplementene av slike DNA-sekvenser eller (c) DNA-sekvenser som i det vesentlige er homologe til en sekvens i (a) eller (b).
I ytterligere bestemte utførelsesf ormer beskrives polypeptider som omfatter minst én immunogen del av et M. tuberculosis- anWgen (eller en variant av et slikt antigen), som eventuelt kan være løselig, som omfatter én eller flere av de aminosyresekvenser som kodes av (a) DNA-sekvensene i SEKV. ID. NR:26-51, (b) komplementene av slike DNA-sekvenser eller (c) DNA-sekvenser som i det vesentlige er homologe til en sekvens i (a) eller (b).
M. tuberculosis- anWgenene inkluderer varianter som koder for DNA-sekvenser som er tilnærmet homologe til én eller flere DNA-sekvénser som her spesifikt er omtalt. «Tilnærmet homologi» refererer seg i denne sammenheng til DNA-sekvenser som kan hybridisere under moderat stringente betingelser. Egnede moderate stringente betingelser inkluderer forvask i en løsning av 5X SSC, 0,5% SDS, 1,0 mM EDTA (pH 8,0); hybridisering ved 50°C-65°C, 5X SSC, over natten, eller, når det er
tale om kryss-arts homologi, ved 45°C, 0,5X SSC; etterfulgt av to gangers vask ved 65°C i 20 minutter med hver av 2X, 0.5X og 0.2X SSC inneholdende 0,1 % SDS).
I henhold til et lignende aspekt tilveiebringes fusjonsproteiner som omfatter et første og et andre polypeptid ifølge oppfinnelsen eller alternativt, et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse og et kjent M. tuberculosis- anWgen, så som det ovenfor beskrevne 38 kD antigenet eller. ESAT-6 (SEKV. ID. NR:103 og 104) sammen med varianter av slike fusjonsproteiner. Fusjonsproteinene kan også innbefatte et linker-peptid mellom det første og det andre polypeptid.
En DNA-sekvens som koder for et fusjonsprotein ifølge foreliggende oppfinnelse, konstrueres ved å benytte kjente rekombinante DNA-teknikker for å sette sammen egne DNA-sekvenser som koder for de første og andre polypeptider, i
en passende ekspresjonsvektor. 3'-enden av en DNA-sekvens som koder for det første polypeptid ligeres, med eller uten en peptidlinker, til 5'-enden av en DNA-sekvens som koder for det andre polypeptid slik at sekvensenes leserammer er i fase til å tillate mRNA-translasjon av de to DNA-sekvensene til et enkelt fusjonsprotein som bibeholder den biologiske aktivitet av både det første og det andre polypeptid.
En peptidlinkersekvens kan benyttes for å adskille det første og andre polypeptid med en avstand som er tilstrekkelig til å sikre at hvert polypeptid folder seg i dets sekundære og tertiære strukturer. En slik peptidlinkersekvens inkorporeres i fusjonsproteinet ved å benytte velkjente standardteknikker. Egnede peptidlinkersekvenser kan velges på basis av følgende faktorer: (1) deres evne til å anta en fleksibel, utvidet konformasjon; (2) deres manglende evne til å anta en sekundærstruktur som vil kunne gi interaksjon med funksjonelle epitoper på det
første og andre polypeptid; og (3) mangel på hydrofobe eller ladede rester som ville kunne reagere med polypeptidets funksjonelle epitoper. Foretrukne peptidlinkersekvenser inneholder Gly-, Asn- og Ser-rester. Andre nesten nøytrale aminosyrer, som Thr og Ala, kan også benyttes i linkersekvensen. Aminosyresekvenser som kan <: >benyttes som linkere innbefatter de som er omtalt av Maratea et a/., Gene 40:39-46,
1985; Murphy et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 83:8258-8262,1986; US-patent 4.935.233 og US-patent 4.751.180. Linkersekvensen kan ha en lengde på fra 1 til ca. 50 aminosyrer. Peptidsekvenser fordres ikke når de første og andre polypeptider har ikke-essensielle N-terminale aminosyrerområder som kan benyttes til å adskille de funksjonelle domenene og forhindre sterisk forstyrrelse.
De ligerte DNA-sekvensene kobles operativt til passende transkripsjonene eller translasjonene regulatorelementer. De regulatorelementene som er ansvarlig for ekspresjon av DNA, er lokalisert bare 5' til den DNA-sekvens som koder for de første polypeptidene. Tilsvarende er stoppkodoner som fordres for å avslutte translasjon, og transkripsjonstermineringssignaler bare tilstede 3'for den DNA-sekvens som koder for det andre polypeptidet.
Det beskrives fremgangsmåter for bruk av ett eller flere av ovennevnte polypeptider eller fusjonsproteiner (eller et DNA-molekyl som koder for slike polypeptider) for i en pasient å indusere beskyttende immunitet mot tuberkulose. I denne sammenheng refererer en «pasient» seg til et hvilket som helst varmblodig dyr, fortrinnsvis et menneske. En pasient kan være angrepet av en sykdom, eller være fri for påviselig sykdom og/eller infeksjon. Med andre ord kan beskyttende immunitet induseres for å forhindre eller behandle tuberkulose.
I henhold til dette aspekt inngår i alminnelighet polypeptidet, fusjonsproteinet eller DNA-molekylet, i en farmasøytisk blanding og/eller en vaksine. Farmasøytiske blandinger kan omfatte ett eller flere polypeptider som hver kan inneholde én eller flere av ovennevnte sekvenser (eller varianter derav) og en fysiologisk akseptabel bærer. Vaksiner kan omfatte ett eller flere av ovennevnte polypeptider og en ikke-spesifikk immun.respons-enhancer, så som et adjuvans eller et liposom (som., polypeptidet inkorporeres i). Slike farmasøytiske blandinger og vaksiner kan også inneholde andre M. tuberculosis- anWgener, enten inkorporert i et kombinasjonspolypeptid eller i et separat polypeptid.
Som et alternativ kan en vaksine inneholde DNA som koder for ett eller flere polypeptider som beskrevet ovenfor, slik at polypeptidet utvikles in situ. I slike vaksiner kan DNA inngå i én av en rekke kjente avleveringssystemer, inklusivt nukleinsyre-ekspresjdnssystemer, bakterielle og virale ekspresjonssystemer.
Passende nukleinsyre-ekspresjonssystemer inneholder de nødvendige DNA-sekvenser for ekspresjon i pasienten (så som et passende promotor- og termineringssignal). Bakterielle avleveringssystemer involverer administrering av en bakterie (så som Bacillus- Calmette- Guerrin) som uttrykker en immunogen del av polypeptidet på sin celleoverflate. I henhold til en foretrukket utførelsesform kan DNA innføres ved å benytte et viralt ekspresjonssystem (f.eks. vaccinia- eller andre koppe-virus, retrovirus eller adenovirus), som kan involvere bruken av et ikké-patogent (defekt) replikasjonskompetent virus. Teknikker for inkorporering av DNA i slike ekspresjonssystemer er velkjent for fagmannen. DNA kan også være «nakent» som beskrevet for eksempel i Ulmer et al., Science 259:1745-1749,1993 og omtalt i
en oversikt av Cohen, Science 259:1691-1692,1993. Opptaket av nakent DNA kan økes ved å belegge DNA på bionedbrytbare kuler som effektivt transporteres inn i cellene.
I henhold til et lignende aspekt kan en DNA-vaksine som beskrevet ovenfor, administreres samtidig med eller suksessivt med, et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse eller et kjent M. tuberculosis- anligen, f.eks. det ovenfor beskrevne 38 kD-antigenet. For eksempel kan administrering av DNA som koder for et polypeptid ifølge foreliggende oppfinnelse, enten «nakent» eller i et avleveringssystem som beskrevet ovenfor, etterfølges av administrering av et antigen for å forsterke vaksinens beskyttende immuneffekt.
Måter for, og hyppighet av, administrering, så vel som dosering, vil variere fra individ til individ og kan tilsvare de som for tiden benyttes ved immunisering med BCG. I alminnelighet kan de farmasøytiske blandingene og vaksinene administreres ved injeksjon (f.eks. intrakutant, intramuskulært, intravenøst eller subkutant), intranasalt (f.eks. ved innsugning) eller peroralt. Mellom 1 og 3 doser kari administreres i en 1 -36 ukers periode. Fortrinnsvis administreres 3 doser med intervaller på 3-4 måneder, hvoretter booster-vaksinasjoner gis periodevis. Alternative protokoller kan være riktige for enkelte pasienter. En passende dose er en mengde polypeptid eller DNA som når den administreres som beskrevet ovenfor, er i stand til å frembringe en tilstrekkelig immunrespons i en immunisert pasient, til å beskytte pasienten mot M. tuberculosis-\ r\ ieks\ or\ i minst 1-2 år. I alminnelighet utgjør polypeptidmengden i en dose (eller produsert in situ av DNA i en dose) fra ca. 1 pg til ca. 100 mg per kg legemsvekt, typisk fra ca. 10 pg til 1 mg, og fortrinnsvis fra ca.
100 pg til ca. 1 jxg. Passende dosestørrelser vil variere med pasientens størrelse,
men vil i alminnelighet utgjøre fra ca. 0,1 mL til ca. 5 mL.
Selv om en hvilken som helst kjent bærer kan benyttes i de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen, vil bærertypen avhenge av administrasjonsmåten. For parenteral administrering, som f.eks. subkutan injeksjon, omfatter bæreren fortrinnsvis vann, saltvann, alkohol, et fett, en voks eller en buffer. For perbral administrering kan en hvilken som helst av ovennevnte bærere eller en fast bærer, så som mannitol, laktose, stivelse, magnesiumstearat, natriumsakkarin, talkum, cellulose, glukose, sukrose og magnesiumkarbonat, benyttes. Bionédbrytbare mikrokuler (f.eks. poly-melkesyre galaktid) kan også benyttes som bærere for de farmasøytiske blandingene ifølge oppfinnelsen. Egnede bionédbrytbare mikrokuler er beskrevet for eksempel i US-patent 4.897.268 og 5.075.109.
Et hvilket som helst av en rekke adjuvanser kan benyttes i vaksinene ifølge oppfinnelsen, for uspesifikt å forsterke immunresponsen. De fleste adjuvanser inneholder en substans som har til hensikt å beskytte antigenet fra hurtig katabolisme, som f.eks. aluminiumhydroksyd eller mineralolje, og en uspesifikk stimulator av immune responser, så som lipid A, Bortadella pertussis eller Mycobacterium tuberculosis. Egnede adjuvanser som for eksempel Freunds ufullstendige og Freunds komplette adjuvans (Difco Laboratories) og Merck adjuvans 65 (Merck and Company, Inc. Rahway, NJ) er kommersielt tilgjengelige. Andre passende adjuvanser er bl.a. alun, bionédbrytbare mikrokuler, monofosforyl-lipid A
og quil A.
Det tilveiebringes fremgangsmåter for å benytte ett eller flere av de ovenfor beskrevne polypeptider til diagnostisering av tuberkulose, ved å benytte en hudtest. I denne sammenheng er en «hudtest» en hvilken som helst test som foretas direkte på en pasient og hvor en hypersensitivitets- (DTH) reaksjon (som svellirig, rødhet eller dermatitt) av forsinket type, måles etter intradermal injeksjon av ett eller flere av de ovenfor beskrevne polypeptider. Slik injeksjon kan oppnås ved å benytte en hvilken som helst anordning som kan bringe polypeptidet eller polypeptidene i kontakt med pasientens hudceller, så som en tuberkulinsprøyte eller én 1 mL sprøyte. Fortrinnsvis avleses reaksjonen minst 48 timer, mer foretrukket 48-72 timer, etter injeksjon.
DTH-reaksjonen er en celle-mediert immunrespons som er sterkere hos pasienter som tidligere har vært eksponert for test-antigenet (dvs. den immunogene del av det anvendte polypeptid eller en variant derav). Responsen kan måles visuelt ved å benytte en linjal. I alminnelighet angir en respons som er sterkere enn ca.
0,5 cm i diameter, fortrinnsvis mer enn ca. 1,0 cm i diameter, en positiv respons som tyder på tuberkulose-infeksjon, som eventuelt kan være manifestert som en aktiv sykdom.
Polypeptidene ifølge denne oppfinnelse er fortrinnsvis formulert for anvendelse i en hudtest, som farmasøytiske blandinger som inneholder et polypeptid og en fysiologisk akseptabel bærer, som beskrevet ovenfor. Slike blandinger inneholder i alminnelighet én eller flere av ovennevnte polypeptider i en mengde som varierer fra ca. 1 ug til ca. 100 ug, fortrinnsvis fra ca. 10 jig til ca. 50 ug, i et volum på 0,1 mL. Fortrinnsvis er bæreren som benyttes i slike farmasøytiské blandinger en saltløsning med passende konserveringsmidler, så som fénol og/eller Tween 80™.
I en foretrukket utførelsesform er et polypeptid som benyttes i en hudtest, av tilstrekkelig størrelse til at det forblir på injeksjonsstedet under hele reaksjonsperioden. I alminnelighet er et polypeptid som har en lengde på minst 9 aminosyrer tilstrekkelig. Polypeptidet brytes også fortrinnsvis ned av makrofager i løpet av timer etter injeksjon, for å muliggjøre presentasjon for T-celler. Slike polypeptider kan inneholde repetisjoner av én eller flere av ovennevnte sekvenser og/eller andre immunogene eller ikke-immunogene sekvenser.
EKSEMPLER
EKSEMPEL 1
Rensing og karakterisering av polypeptider
fra M. fubercu/os/s-kulturfiltrat
Dette eksempel illustrerer fremstillingen av løselige M. tuberculosis-polypeptider fra kulturfiltrat. Om intet annet er angitt er alle prosentangivelser i det følgende eksempel, uttrykt som vekt per volum.
M. tuberculosis (enten H37Ra, ATCC Nr. 25177 eller H37Rv, ATCC Nr. 25618) ble dyrket i sterilt GAS-medium ved 37°C i 14 dager. Mediet ble deretter vakuumfiltrert (hvorved hovedmengden av celler ble tilbake) gjennom et 0,45 u, filter
inn i en steril 2,5 L flaske. Mediet ble deretter filtrert gjennom et 0,2 u. filter over i en
steril 4 L flaske og kulturfiltratet tilsatt NaN3 til en konsentrasjon på 0,04%. Flaskene ble deretter anbragt i et 4°C kjølerom.
Kulturfiltratet ble konsentrert ved å anbringe filtratet i et 12 L reservoar som
var autoklavert og ble matet inn i en 400 mL Amicon omrører-celle som var renset
med etanol og som inneholdt en 10.000 kDa MWCO-membran. Trykket ble holdt ved 4,2 kg/cm<2> ved å benytte nitrogengass. Denne fremgangsmåte reduserte 12 L
volumet til ca. 50 mL.
Kulturfiltratet ble dialysert inn i 0,1% ammoniumbikarbonat ved å benytte en 8.000 kDa MWCO-cellulose-estermembran, med to utskiftninger av ammoniumbikarbonatløsning. Proteinkonsentrasjonen ble deretter bestemt ved hjelp av en kommersielt tilgjengelig BCA-test (Pierce, Rockford, IL).
Det dialyserte kulturfiltrat ble deretter lyofilisert og polypeptidene resuspendert i destillert vann. Polypeptidene ble dialysert mot 0,01 mM 1,3-bis[tris(hydroksymetyl)-metylaminojpropan, pH 7,5 (Bis-Tris propan-buffer) som begynnelsesbetingelser for anionbytter-kromatografi. Fraksjoneringen ble foretatt ved å benytte gel-profusjons-kromatografi på en POROS 146 II Q/M anionbytterkolonne 4,6 mm x 1000 mm (Perseptive BioSystems, Framingham, MA) ekvilibrert i 0,01 mM Bis-Tris propanbuffer, pH 7,5. Polypeptider ble eluert med en lineær 0-0,5 M NaCI gradient i ovennevnte buffersystem. Kolonne-eluenten ble overvåket ved en bølgelengde på 220 nm.
Forrådene av polypeptider som elueres fra ionebytterkolonnen ble dialysert
mot destillert vann og lyofilisert. Det resulterende materialet ble løst i 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) pH 1,9 i vann, og polypeptidene ble renset på en Delta-Pak
C18 kolonne (Waters, Milford, MA) 300 Å porestørrelse, 5 mikron partikkelstørrelse
(3,9 x 150 mm). Polypeptidene ble eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0-60% fortynningsbuffer (0,1% TFA i acetonitril). Strømningshastigheten var 0,75 mL/minutt og HPLC-eluenten ble overvåket ved 214 nm. Faksjoner som inneholdt de eluerte polypeptidene ble oppsamlet for å gi de enkelte prøver i maksimal renhet. Det ble oppnådd ca. 200 rensede polypeptider..
De rensede polypeptidene ble deretter underkastet screening med henblikk på evnen til å indusere T-celleproliferasjon i PBMC-preparater. PBMC-preparatene fra donorer som hadde vist seg PPD-hudtest-positive og hvis T-celler ble vist å proliferere som respons på PPD og rå løselige proteiner fra MTB, ble dyrket i
medium omfattende RPM11640 supplert med 10% sammenslått humant sera og
50 ug/mL gentamicin. Rensede polypeptider ble tilsatt i to paralleller i konsentrasjoner på 0,5 til 10 u<g>/mL. Etter dyrkning i 6 dager i 96 brønns rundbunn-plater i et volum på 200 uL, ble 50 uL medium uttatt fra hver brønn for bestemmelse av IFN-y-nivåer, slik som beskrevet nedenfor. Platene ble deretter pulset med 1 u. Ci/brønn tritiert tymidin i ytterligere 18 timer og deretter høstet, hvorpå tritium-
opptaket ble bestemt ved å benytte en gass-scintillasjonsteller. Fraksjoner som i begge gjentak resulterte i tre ganger høyere proliferasjon enn den proliferasjon som ble observert i celler dyrket i bare medium, ble ansett som positive.
IFN-y ble målt ved å benytte ELISA (enzymbundetimmuriosorbent analyse). ELISA-plater ble dekket med et monoklonalt muse-antistoff mot humant IFN-y (PharMingen, San Diego, CA) i PBS i 4 timer ved romtemperatur Brønnene ble deretter blokkert med PBS inneholdende 5% (vekt/vol.) fett-fri tørrmelk i 1 time ved romtemperatur. Platene ble deretter vasket seks ganger i PBS/0,2% Twéen-20, og prøver, fortynnet 1:2 i dyrkningsmedium i ELISA-platene, ble inkubert over natten
ved romtemperatur. Platene ble vasket på nytt og et polyklOnalt kanin anti-humant IFN-y-serum fortynnet 1:3000 i PBS/10% normalt geiteserum, bie tilsatt til hver
brønn. Platene ble deretter inkubert I 2 timer ved romtemperatur, vasket og tilsatt pepperrotperoksydase-koblet anti-kanin IgG (Sigma Chemical CO. St. Louis, MO) i en 1:2000-fortynning i PBS/5% fett-fri tørrmelk. Etter inkubering i ytterligere 2 timer ved romtemperatur ble platene vasket og tilsatt TMB-substrat. Reaksjonen ble stanset med 1N svovelsyre etter 20 minutter. Optisk tetthet ble bestemt ved 450 nm ved å benytte 570nm som en referanse-bølgelengde. Fraksjoner som resulterte i at begge gjentak ga en OD som var to ganger høyere enn den gjennomsnitlige OD fra celler dyrket kun i medium, pluss 3 standardavvik, ble ansett som positive.
For sekvensering ble polypeptidene tørket hver for seg på Biobrene™- (Perkin Eimer/Applied BiOSystems Division, Foster City, CA) behandlede glassfiberf iltére. Filterne med polypeptid, ble påsatt på en Perkin Eimer/Applied BioSystems Division Procise 492 proteinsekvenseringsmaskin. Polypeptidene ble sekvensert fra aminoenden under anvendelse av tradisjonell Edman-kjemi. Aminosyresekvensen ble bestemt for hvert polypeptid ved å sammenligne retensjonstiden av PTH aminosyre-derivatet med passende PTH-derivat standarder.
Ved å benytte fremgangsmåten beskrevet ovenfor ble antigener med følgende N-terminale sekvens isolert:
hvor Xaa kan være en hvilken som helst aminosyre.
Et ytterligere antigen ble isolert ved å benytte et HPLC-microbore-
rensesystem i tillegg til den ovenfor beskrevne fremgangsmåte. Nærmere bestemt ble 20 |iL av en fraksjon som omfattet en blanding av antigener fra det tidligere beskrevne kromatografiske rensetrinn, renset på en Aquapore G18 kolonne (Perkin...; Eimer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) med en 7 mikron porestørrelse,... kolonnestørrelse 1 mm x 100 mm, i en Perkin Eimer/Applied Biosystems Divison Model 172 HPLC. Fraksjoner ble eluert fra kolonnen med en lineær gradient av 1 %/minutt acetonitril (inneholdende 0,05% TFA) j vann (0,05% TFA) ved en strømningshastighet på 80 uL/minutt. Eluenten ble overvåket ved 250 nm. Den opprinnelige fraksjon ble separert i fire hovedtopper pluss andre mindre komponenter, og det ble oppnådd et polypeptid som viste seg å ha en molekyl vekt på 12,054 Kd (ved massespektrometri) og følgende N-terminale sekvens:
Ved å benytte den ovenfor beskrevne test ble dette polypeptid vist å indusere proliferasjon og IFN-y-produksjon i PBMC-preparater.
Ytterligere løselige antigener ble isolert fra M. tofcerciv/os/s-kulturfiltrat som følger. M. tobefcu/<p>s/s-kulturfiltrat ble fremstillet som beskrevet ovenfor. Etter dialyse mot Bis-Tris propanbuffer ved pH 5,5, ble fraksjonering foretatt ved å benytte anionbytterkromatografi på en Poros QE kolonne 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems) ekvilibrert i Bis-Tris propanbuffer, pH 5,5. Polypeptider ble eluert med en lineær 0-1,5 M NaCI gradient i ovennevnte buffersystem med en strømnings-hastighet på 10 mL/minutt. Kolonne-eluenten ble overvåket ved en bølgelengde på 214 nm.
Fraksjoner eluert fra ionebytterkolonnen ble slått sammen og underkastet omvendt-fase kromatografi ved å benytte en Poros R2 kolonne 4,6 x 100 mm (Perseptive Biosystems). Polypeptidene ble eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0-100% acetonitril (0,1% TFA) med en strømningshastighet på 5 mL/minutt. Eluenten ble overvåket ved 214 nm.
Fraksjoner som inneholdt de eluerté polypeptidene ble lyofilisert og resuspendert i 80 uL vandig 0,1% TFA og underkastet en ytterligere omvendt-fase kromatografering på en Vydac C4 kolonne 4,6 x 150 mm (Western Analytical, Temecula, CA) med en lineær gradient på 0-100% acetonitril (0,1 % TFA) med eh strømningshastighet på 2 mL/minutt. Eluenten ble overvåket ved 214 rim.
Fraksjonen med biologisk aktivitet ble separert i én hovedtopp pluss andre mindre komponenter. Western blott på PVDF-membran av denne topp, viste tre hovedbånd med molekylvektene 14 Kd, 20 Kd og 26 Kd. Disse polypeptidene ble fastslått å ha henholdsvis følgende N-tenriinale sekvenser:
hvor Xaa kan være en hvilken som helst aminosyre.
Ved å benytte de ovenfor beskrevne tester ble disse polypeptidene vist å indusere proliferasjon og IFN-y-produksjon i PMBC-preparater. Fig. 1A og B viser resultatene av slike tester ved å benytte PMBC-preparater fra henholdsvis en første og en andre donor.
DNA-sekvenser som koder for antigenene ovenfor betegnet (a), (c), (d) og (g), ble oppnådd ved screening av et genomisk M. tuberculosis- bibWotek ved å benytte <æ>P og merkede degenererte oligonukleotider tilsvarende den N-terminale sekvens og som hadde en M. tuberculosis- kodon forfordeling. Screeningen foretatt ved å benytte en probe tilsvarende antigen (a) ovenfor, identifiserte en klon som hadde sekvensen angitt som SEKV. ID: NR:101. Polypeptidet kodet av SEKV. ID. NR:101 er angitt i SEKV. ID. NR: 102. Screeningen foretatt ved å benytte én probe tilsvarende antigen (g) ovenfor, identifiserte en klon som har sekvensen angitt i SEKV. ID. NR:52. Polypeptidet kodet av SEKV. ID. NR:52 er angitt i SEKV. ID.
NR:53. Screeningen foretatt ved å benytte en probe tilsvarende antigen (d) ovenfor, identifiserte en klon som har sekvensen angitt i SEKV. ID. NRI24, og screeningen foretatt med en probe tilsvarende antigen (c), identifiserte en klon som har sekvensen angitt i SEKV. ID. NR:25.
Ovennevnte aminosyresekvenser ble sammenlignet med kjente aminosyresekvenser i genbanken ved å benytte DNA STAR-systemet. Databasen som ble gjennomsøkt inneholder ca. 173.000 proteiner og er en kombinasjon.av de sveitsiske PIR-databasene sammen med translaterte proteinsekvenser (Versjon 87). Det ble ikke påvist noen signifikante homologier med aminosyresekvensene for antigenene (a)-(h) og (I).
Aminosyresekvensen for antigen (i) viste seg å være homolog med en sekvens fra M. leprae. Den fulle lengde av M. feprae-sekvensen ble amplifisert fra genomisk DNA ved å benytte sekvensen anskaffet fra GENBANK. Denne sekvensen ble deretter benyttet for screening av M. tuberculosis- b\ b\\ o\ eke\ beskrevet senere under Eksempel 2, og det ble oppnådd en full lengdes kopi av M. tubérculosis-homologen (SEKV. ID. NR:99).
Aminosyresekvensen for antigen G) ble funnet å være homolog med ét kjent M. tuberculosis- pro\ e\ n translatert fra en DNA-sekvens. Så vidt oppfinnerne kjenner
til har dette protein ikke tidligere vært vist å ha T-celle stimulerende aktivitet.
Aminosyresekvensen for antigen (k) viste seg å være beslektet med en sekvens fra M. leprae.
I de ovenfor beskrevne proljferasjons- og IFN-y-tester under bruk av tre PPD-positive donorer, er resultatene for de ovenfor angitte representative antigener, presentert i Tabell 1:
I Tabell 1 er responser som ga en stimuleringsindeks (Sl) på mellom 2 og 4 (sammenlignet med celler dyrket i bare medium) gift poeng som +, en Sl på 4-8 eller 2-4 i en konsentrasjon på 1 ug eller mindre vurdert som ++ og en Sl på mer enn 8 vurdert som +++. Antigenet med sekvens (i) viste seg å ha en høy Sl (+++) for én donor og lavere Sl (++ og +) for de to andre donorene i både proliferasjons- og IFN-y-testene. Disse resultatene tyder på at disse antigenene er i stand til å indusere proliferasjon bg/eller interferon-y-produksjon.
EKSEMPEL 2
ANVENDELSE AV PASIENTSERA FOR A ISOLERE M. TUBERCULOSlS-ANTIGENER
Dette eksempel illustrerer isoleringen av antigener fra M. tuberculosis- lysat
ved screening med serum fra M. tuberculosis- mf\ serie individer.
Tørket M. tuberculosis H37Ra (Difco Laboratories) ble tilsatt til en 2% NP40-løsning og vekselvis homogenisert og ultralydbehandlet tre ganger. Den resulterende suspensjon ble sentrifugert ved 13.000 rpm. i mikrofugerør og supernatanten sendt gjennom et 0,2 mikron injeksjonssprøyte-filter. Filtratet ble bundet til Macro Prep DEAD-kuler (BioRad, Hercules, CA). Kulene ble grundig vasket med 20 mM Tris, pH 7,5, og bundne proteiner eluert med 1M NaCI. Det oppnådde 1M NaCI eluat ble dialysert over natten mot 10 mM Tris, pH 7,5. Den dialyserte løsningen ble behandlet med DNase og RNase ved 0,05 mg/mL i 30 minutter ved romtemperatur og deretter med a-D-mannosidase, 0,5 U/mg ved pH 4,5, i 3-4 timer ved romtemperatur. Etter igjen å ha nådd pH 7,5, ble materialet fraksjonert ved FPLC over en Bio Scale-Q-20-kolonne (BioRad). Fraksjonene ble kombinert i ni forråd, konsentrert i en Centriprep 10 (Amicon, Beverley, MA) og deretter underkastet screening ved
western blotting med henblikk på serologisk aktivitet, ved å benytte et serum-forråd fra M. tuberculosis- mftserte pasienter, som ikke var immunreaktive med andre antigener ifølge foreliggende oppfinnelse.
Den mest reaktive fraksjon ble underkastet SDS-PAGE og overført til PVDF.
Et bånd på ca.85 Kd som ble kuttet ut, ga sekvensen:
hvor Xaa kan være en hvilken som helst aminosyre.
Sammenligning av denne sekvens med sekvenser i genbanken, som
beskrevet ovenfor, førte ikke til signifikante homologier med andre sekvenser...
EKSEMPEL 3
FREMSTILLING AV DNA-SEKVENSER SOM KODER FOR M. TUBERCULOSIS-ANTIGENER
Dette eksempel illustrerer fremstillingen av DNA-sekvenser som koder for M. tuberculosis- aritigener ved screening av et M. fubercu/os/s-ekspresjonsbibliotek med sera tatt fra pasienter infisert med M. tuberculosis, eller med anti-sera Utviklet mot løselige M. tuberculosis- anWgener.
A. FREMSTILLING AV LØSELIGE M. TUBERCULOSIS ANTIGENER VED Å. BENYTTE KANIN ANTI-SERA
Genomisk DNA ble isolert fra M. tuberculosis stamme H37Ra. DNA ble fordelt tilfeldig og benyttet til å konstruere et ekspresjonsbibliotek, ved å benytte Lambda ZAP ekspresjonssystemet (Stratagene, La Jolla, CA). Det ble utviklet kanin anti-sera sekretproteiner av M. tuberculosis stamme H37Ra, H37Rv og Erdman, ved å immunisere en kanin med konsentrerte supernatanter av M. tuberculqsis- kuWurer. Nærmere bestemt ble kaninen først immunisert subkutant med 200 ug protein-antigen i et totalvolum på 2 mL inneholdende 10 ug muramyl-dipeptid (Calbiochem, La Jolla, CA) og 1 mL av Freunds ufullstendige adjuvans. Fire uker senere ble kaninen gitt en subkutan booster-dose på 100 ug antigen i Freunds ufullstendig adjuvans. Tilslutt ble kaninen fire uker senere immunisert intravenøst med 50 ug protein-antigen. Anti-serumet ble benyttet til screening av ekspresjonsbiblioteket som beskrevet i Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989. Bakteriofag-plakk som uttrykte immunreaktive antigener ble renset. Fagemid fra plakk ble uttatt og nukleotidsekvensen av M. tuberculosis- klonene dedusert.
Det ble renset 32 kloner. 25 av disse representerte sekvenser som ikke tidligere var identifisert i human M. tuberculosis. Rekombinante antigener ble uttrykt og rensede antigener benyttet i den immunologiske analyse beskrevet i Eksempel 1. Proteiner ble indusert med IPTG og renset ved gel-eluering som beskrevet i Skeiky et al., J. Exp. Med. 181:1527-1537,1995. Representative sekvenser av DNA-molekyler identifisert ved denne screening er angitt som SEKV. ID. NR: 1-25. De tilsvarende predikerte aminosyresekvensene er angitt som SEKV. ID. NR:63-87.
Ved sammenligning av disse sekvensene med kjente sekvenser i genbanken under bruk av de ovenfor beskrevne databaser, viste det seg at de klonene som heretter er referert til som TbRA2A, TbRA16, TbRA18 og TbRA29 (SEKV. ID. NR:76, 68, 70, 75) oppviser noe homologi med sekvenser tidligere definert i Mycobacterium leprae, men ikke i M. tuberculosis. TbRA11, TbRA26, TbRA28 og TbDPEP (SEKV. ID. NR:65, 73, 74, 53) var tidligere identifisert i M. tuberculosis. Det ble ikke funnet signifikante homologier med TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRA19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 og de overlappende kloner TbRA35 og TbRA12 (SEKV. ID. NR:63, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71, 75, 78, 80, 79,66). Klonen TbRa24 overlapper med klon TbRa29.
Resultatene av PBMC-proliferasjons- og interferon-y-testene foretatt på representative rekombinante antigener under bruk av T-celle-preparater fra flere ulike M. tuberculosis- lmmune pasienter, er angitt i henholdsvisTabell 2 og 3.
I Tabell 2 og 3 er responser som ga en stimuleringsindeks (Sl) på mellom 1,2
og 2 (sammenlignet med cellekulturer i bare medium) betegnet ±, en Sl på 2-4 angitt Som +, en Sl på 4-8 eller 2-4 ved en konsentrasjon på 1 ug eller mindre, ble angitt som ++ og en Sl på mer enn 8 ble angitt som +++. I tillegg er virkningen av konsentrasjon på proliferasjon og interferon-y-produksjon vist for to av de ovenfor oppnådde antigener i den ledsagende figur. Både for proliferasjon og interferon-y-produksjon ble TbRa3 angitt som ++ og TbRa9 som
Disse resultatene indikerer at disse løselige antigenene kan indusere proliferasjon og/eller interferon-y-produksjon i T-celler tatt fra et M. tuberculosis-immunt individ.
B. ANVENDELSE AV PASIENTSERA FOR Å IDENTIFISERE DNA-
SEKVENSER SOM KODER FOR M. TUBERCULOSIS- AHT\ GENER
Det ovenfor beskrevne genomiske DNA-bibliotek og et ytterligere H37Rv-bibliotek, ble underkastet screening ved å benytte sammenslåtte sera tatt fra pasienter med aktiv tuberkulose. For å fremstille H37Rv-biblioteket ble genomisk DNA fra M. tuberculosis stamme H37Rv isolert, underkastet partiell Sau3A-kutting og benyttet for å konstruere et ekspresjonsbibliotek ved å benytte Lambda Zap-ekspresjonssystemet (Stratagene, La Jolla, CA). Tre ulike forråd av sera som hvert inneholdt sera tatt fra tre individer med aktiv pulmonal eller pleural sykdom, ble benyttet i ekspresjons-screeningen. Forrådene ble betegnet TbL, TbM og TbH, som refererer seg til den relative reaktivitet med H37Ra-lysat (dvs. TbL=lav reaktivitet, TbM=middels reaktivitet og TbH=høy reaktivitet) ved både ELISA og immunoblott. Et fjerde forråd av sera fra syv pasienter med aktiv pulmonal tuberkulose ble også benyttet. For alle sera manglet øket reaktivitet med det rekombinante 38 kD M. tuberculosis H37Ra-fosfat-bindénde protein.
Alle forrådene ble pre-adsorbert med E. co//lysat og benyttet til screening av H37Ra-og H37Rv-ekspresjonsbibliotekene som beskrevet i Sambrook er a/.,
Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold
Spring Harbor, NY, 1989. Bakteriofage plakk som uttrykte immunreaktive antigener,
ble renset. Fagemid fra plakkene ble uttatt og nukleotidsekvensene av M. tuberculosis- klonene dedusert.
Det ble renset 32 kloner. Av disse utgjorde 31 sekvenser som ikke tidligere var identifisert i human M. tuberculosis. Representative sekvenser av de identifiserte DNA-molekylene er angitt i SEKV. ID. NR:26-51 og 105. Av disse er TbH-8 og TbH-8-2 (SEKV. ID. NR:105) ikke-tilstøtende DNA-sekvenser fra samme klon og TbH-4 (SEKV. ID. NR:43) og TbH-4-FWD (SEKV. ID. NR:44) ikke-tilstøtende sekvenser fra den samme klon. Aminosyresekvenser for antigener senere identifisert som Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9 og TbH-12 er angitt som SEKV. ID. NR:88-92. Sammenligning av disse sekvensene med kjente sekvenser i genbanken under anvendelse av de ovenfor angitte databaser, viste ingen signifikante homologier med TbH-4, TbH-8, TbH-9 og TbM-3, selv om det ble påvist svake homologier med TbH-9. TbH-12 ble funnet å være homolog med et 34 kD antigent protein tidligere identifisert i M. paratuberculosis (tilgangsnummer S28515). Tb38-1 viste seg å være lokalisert 34 basepar oppstrøms for den åpne leseramme for antigenet ESAT-6 tidligere identifisert i M. bovis (tilgangsnummer U34848) og i M. tuberculosis (Sorensen et al., Infec. Immun. 63:1710-1717,1995).
Prober avledet fra Tb38-1 og TbH-9, begge isolert fra et H37Ra-bibliotek, ble benyttet for å identifisere kloner i et H37Rv-bibliotek. Tb38-1 hybridiserte til Tb38-1F2,Tb38-1F3, Tb38-1F5 og Tb38-1F6 (SEKV. ID. NR:112,113,116, 118 og 119). (SEKV. ID. NR:112 og 113 er ikke-tilstøtende sekvenser fra klon Tb38-1 F2). To åpne leserammer ble dedusert i Tb38-IF2; den ene tilsvarende Tb37FL (SEKV. ID. NR:114), den andre, en partiell sekvens, kan være homologen av Tb38-1 og er betegnet Tb38-IN (SEKV. ID. NR:115). Den deduserte aminosyresekvens av Tb38-1F3 er angitt i SEKV. ID. NR:117. En TbH-9-probe identifiserte tre kloner i H37Rv-biblioteket: TbH-9-FL (SEKV. ID. NR:106) som kan være homologen av TbH-9 (R37Ra), TbH-9-1 (SEKV. ID. NR:108) og TbH-9-4 (SEKV. ID. NR:110) som alle er sekvenser som er sterkt beslektet med TbH-9. De deduserte aminosyresekvensene for disse tre klonene er angitt i SEKV. ID. NR: 107,109 og 111.
Resultatene av T-celleanalyser foretatt på Tb38-1, ESAT-6 og andre representative rekombinante antigener er angitt henholdsvis i Tabell 4A, B og 5:
Disse resultatene tyder på at både M. tuberculosis- anWgener ifølge oppfinnelsen og ESAT-6 kan indusere proliferasjon og/eller interferon-y-produksjon i T-celler tatt fra et M. tuberculosis-\ rr\ mun\ individ. Så vidt oppfinnerne kjenner til, har ESAT-6 ikke tidligere vært vist å stimulere humane immunresponser.
Et sett av seks overlappende peptider som dekket aminosyresekvensen av antigenet Tb38-1, ble konstruert ved å benytte fremgangsmåten beskrevet i Eksempel 4. Disse peptidsekvensene, heretter omtalt som pep 1-6, er henholdsvis angitt i SEKV. ID. NR:93-98. Resultatene av T-celleanalyser ved bruk av disse peptidene, er vist i Tabell 6 og 7. Disse resultatene bekrefter eksistensen, og bidrar til å lokalisere T-celle-epitoper i Tb38-1 som er i stand til å indusere proliferasjon og interferon-y-produksjon i T-celler tatt fra et M. tuberculosis-\ mmurft individ.
EKSEMPEL 4
RENSING OG KARAKTERISERING AV ET POLYPEPTID FRA TUBERKULIN-RENSET PROTEIN-DERIVAT
Et M. tuberculosis- po\ ypep\\ d ble isolert fra tuberkulin-renset protein-derivat (PPD) som følger.
PPD ble med visse modifikasjoner fremstillet som publisert (Seibert, F. et al., Tuberculin purified protein derivative. Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis 44:9-25,1941). M. tuberculosis Rv-stamme ble dyrket i 6 uker i syntetisk medium i rulleflasker ved 37°C. Flasker som inneholdt bakterievekst ble deretter oppvarmet til 100°C i vanndamp i 3 timer. Kulturene ble sterilfiltrert under bruk av et 0,22 u. filter og væskefasen konsentrert 20 ganger ved å benytte en 3 kD sperre-membran.
Proteiner ble utfelt én gang med 50% ammoniumsulfat-løsning og åtte ganger med 25% ammoniumsulfat-løsning. De resulterende proteiner (PPD) ble fraksjonert ved omvendt-fase væskekromatografi (RP-HPLC) ved å benytte en 018 kolonne -
(7,8 x 300 mm; Waters, Milford, MA) i et Biocad HPLC-system (Perseptive Biosystems, Framingham, MA). Fraksjoner ble eluert fra kolonnen med en lineær gradient fra 0-100% buffer (0,1% TFA i acetonitril). Strømningshastigheten var 10 mL/minutt og eluenten ble overvåket ved 214 nm og 280 nm.
Seks fraksjoner ble oppsamlet, tørket, suspendert i PBS og individuelt testet på M. tuberculosis- mfiserte marsvin med henblikk på induksjon av DTH (delayed type hypersensitivity) reaksjon. En fraksjon viste seg å indusere en sterk DTH-reaksjon og ble deretter fraksjonert videre ved RP-HPLC på en microbore Vydac C18 kolonne (Cat. No. 218TP5115) i en Perkin Eimer/Applied Biosystems Division Model 172 HPLC. Fraksjoner ble eluert med en lineær gradient fra 5-100% buffer (0,05% TFA i acetonitril) med en strømningshastighet på 80 ul/minutt. Eluatet ble overvåket ved 215 nm. Åtte fraksjoner ble oppsamlet og testet for induksjon av DTH i M. tuberculosis- M\ serte marsvin. En fraksjon ble funnet å indusere sterk DTH med ca. 16 mm indurasjon. De andre fraksjonene induserte ikke påvisbart DTH. Den positive fraksjonen ble underkastet SDS-PAGE gelelektroforese og funnet å inneholde et enkelt proteinbånd med en molekylvekt på ca. 12 kD.
Dette polypeptid, heretter omtalt som DPPD, ble sekvensert fra aminoenden
ved å benytte en Perkin Eimer/Applied Biosystems Division Procise 492 proteinsekvenseringsmaskin som beskrevet ovenfor, og funnet å ha den N-terminale sekvens vist i SEKV. ID. NR: 129. Sammenligning av denne sekvens med kjente sekvenser i den ovenfor beskrevne genbanken, oppviste ingen kjente homologier.
Fire cyanogenbromid-fragmenter av DPPD ble isolert og funnet å ha sekvensene vist i SEKV. ID. NR:13f>133.
Den evne antigenet DPPD har til å stimulere human PBMC til å proliferere og produsere IFN-y, ble analysert som beskrevet i Eksempel 1. Som vist i Tabell 8, ble DPPD funnet å stimulere proliferasjon og utløse produksjon av store mengder IFN-y, mer enn hva som ble utløst av kommersielt PPD.
EKSEMPEL 5
SYNTESE AV SYNTETISKE POLYPEPTIDER
Polypeptider kan syntetiseres på en Millipore 9050 peptidsyntesemaskin ved å benytte FMOC-kjemi med HPTU- (0-benzotriazol-NIN,N',N,-tetrametyluronium-heksafluorfosfat) aktivering. En Gly-Cys-Gly-sekvens kan festes til aminoenden av peptidet for å oppnå en metode for konjugering eller merking av peptidet.
Avspaltning av peptidene fra den faste bæreren kan foretas ved å benytte følgende spaltningsblanding: trifluoreddiksyre:etanditiol:tioanisol:vann:fenol (40:1:2:2:3). Etter avspaltning i 2 timer ble peptidene utfelt i kald metyl-t-butyleter. Peptidpelletene kan deretter løses i vann inneholdende 0,1% trifluoreddiksyre (TFA) og lyofiliseres før rensing ved C18 omvendt-fase HPLC. En gradient av 0%-60% acetonitril (inneholdende 0,1% TFA) i vann (inneholdende 0,1% TFA) kan benyttes for å eluere peptidene. Etter lyofilisering av de rene fraksjonene, kan peptidene karakteriseres ved å benytte elektrospray massespektrometri og ved aminosyreanalyse.
Claims (24)
1. Polypeptid, karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som har den samme biologiske virkning og som kun skiller seg i konservative substitusjoner og/eller modifikasjoner.
2. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som kun skiller seg i konservative substitusjoner.
3. Polypeptid ifølge krav 2, karakterisert ved at det består av en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som kun skiller seg i konservative substitusjoner.
4. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som kun skiller seg i en konservativ substitusjon.
5. Polypeptid ifølge krav 4, karakterisert ved at det består av en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66 eller en variant av et slikt antigen som kun skiller seg i en konservativ substitusjon.
6. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert ved at det omfatter en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66.
7. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert ved at det består av en aminosyresekvens av SEKV. ID NR : 66.
8. Polypeptid ifølge kravl, karakterisert ved a t det omfatter en aminosyresekvens kodet for av en DNA-sekvens av SEKV. ID NR : 4.
9. Polypeptid ifølge krav 1,karakterisert ved at det består av en aminosyresekvens kodet for av en DNA-sekvens av SEKV. ID NR: 4.
10. DNA-molekyl, karakterisert ved a t det omfatter en nukleotidsekvens som koder for et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9.
11. DNA-molekyl i følge krav 10, karakterisert ved at det omfatter en nukleotidsekvens av SEKV. ID NR : 4.
12. DNA-molekyl i følge krav 10, karakterisert ved a t det består av en nukleotidsekvens av SEKV. ID NR: 4.
13. Ekspresjonsvektor, karakterisert ved at den omfatter et DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 12.
14. Vertscelle, karakterisert ved a t den er transformert med en ekspresjonsvektor ifølge krav 13.
15. Vertscelle ifølge krav 14, karakterisert ved at vertscellen er valgt fra gruppen bestående av E. coli, gjær og pattedyrceller.
16. Kombinasjonspolypeptid, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid i henhold til et hvilket som helst av kravene 1 til 9 og en eller flere ytterligere immunogene M. tuberculosis antigener som er knyttet via en peptidbinding til en enkelt aminosyrekjede.
17. Farmasøytisk blanding, karakterisert ved at det omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, eller et DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 12, eller et kombinasjonspolypeptid ifølge krav 16 og en farmasøytisk akseptabel bærer.
18. Vaksine, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, eller et DNA-molekyl ifølge et hvilket som helst av kravene 10 til 12, eller et kombinasjonspolypeptid ifølge krav 16 og en ikke-spesifikk immunrespons forsterker.
19. Vaksine ifølge krav 18, karakterisert ved at den ikke-spesifikke immunrespons forsterkeren er en adjuvans.
20. Farmasøytisk blanding ifølge krav 17 for anvendelse i en fremgangsmåte for å indusere protektiv immunitet i en pasient, nevnte fremgangsmåte omfatter administrering av den farmasøytiske blandingen til en pasient.
21. Vaksine ifølge krav 18 eller 19 for anvendelse i en fremgangsmåte for å indusere protektiv immunitet i en pasient, nevnte fremgangsmåte omfatter administrering av vaksinen til en pasient.
22. Blanding, karakterisert ved at den omfatter et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9 for anvendelse i en fremgangsmåte for detektering av tuberkulose i en pasient, nevnte fremgangsmåte omfatter: (c) å kontakte dermalceller fra en pasient med ett eller flere polypeptider ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, og (d) detektering av immunresponsen på pasientens hud og derfra detektere tuberkulose i pasienten.
23. Blanding ifølge krav 22, karakterisert ved at immunresponsen er indurasjon.
24. Diagnostisk testsett, karakterisert ved at det omfatter: (a) et polypeptid ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 9, og (b) en apparatur som er tilstrekkelig for å kontakte nevnte polypeptid med dermalceller fra en pasient.
Applications Claiming Priority (6)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US52343695A | 1995-09-01 | 1995-09-01 | |
| US53363495A | 1995-09-22 | 1995-09-22 | |
| US62087496A | 1996-03-22 | 1996-03-22 | |
| US65968396A | 1996-06-05 | 1996-06-05 | |
| US68057496A | 1996-07-12 | 1996-07-12 | |
| PCT/US1996/014674 WO1997009428A2 (en) | 1995-09-01 | 1996-08-30 | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| NO980883D0 NO980883D0 (no) | 1998-02-27 |
| NO980883L NO980883L (no) | 1998-04-27 |
| NO324372B1 true NO324372B1 (no) | 2007-10-01 |
Family
ID=27541835
Family Applications (4)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO19980883A NO324372B1 (no) | 1995-09-01 | 1998-02-27 | Polypeptid, DNA-sekvens som koder for polypeptidet, ekspresjonsvektor og vertscelle som omfatter DNA-molekylet, samt kombinasjonspolypeptid, blanding og diagnostisk testsett som omfatter polypeptidet og farmasoytisk blanding og vaksine som omfatter polypeptidet, et DNA-molekyl som koder for polypeptidet eller et kombinasjonspolypeptid som omfatter polypeptidet. |
| NO20070618A NO336288B1 (no) | 1995-09-01 | 2007-02-01 | Polypeptid, DNA-molekyl, ekspresjonsvektor, vertscelle, fusjonsprotein, farmasøytisk blanding, vaksine, blanding og diagnostisk sett. |
| NO20070621A NO20070621L (no) | 1995-09-01 | 2007-02-01 | Forbindelser og fremgangsmater for immunterapi og diagnose av tuberkulose |
| NO20070619A NO20070619L (no) | 1995-09-01 | 2007-02-01 | Forbindelser og fremgangsmater for immunterapi og diagnose av tuberkulose. |
Family Applications After (3)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| NO20070618A NO336288B1 (no) | 1995-09-01 | 2007-02-01 | Polypeptid, DNA-molekyl, ekspresjonsvektor, vertscelle, fusjonsprotein, farmasøytisk blanding, vaksine, blanding og diagnostisk sett. |
| NO20070621A NO20070621L (no) | 1995-09-01 | 2007-02-01 | Forbindelser og fremgangsmater for immunterapi og diagnose av tuberkulose |
| NO20070619A NO20070619L (no) | 1995-09-01 | 2007-02-01 | Forbindelser og fremgangsmater for immunterapi og diagnose av tuberkulose. |
Country Status (24)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (5) | EP0851927B1 (no) |
| JP (5) | JP4382160B2 (no) |
| KR (1) | KR100433750B1 (no) |
| CN (1) | CN1117149C (no) |
| AT (5) | ATE252640T1 (no) |
| AU (1) | AU727602B2 (no) |
| BR (2) | BR9610262B1 (no) |
| CA (3) | CA2684425A1 (no) |
| CY (2) | CY2570B1 (no) |
| CZ (3) | CZ297406B6 (no) |
| DE (4) | DE69637879D1 (no) |
| DK (4) | DK1398379T3 (no) |
| ES (4) | ES2262595T3 (no) |
| HK (1) | HK1059282A1 (no) |
| HU (2) | HU227778B1 (no) |
| IL (1) | IL123506A (no) |
| MX (1) | MX9801638A (no) |
| NO (4) | NO324372B1 (no) |
| NZ (1) | NZ319377A (no) |
| PL (1) | PL186774B1 (no) |
| PT (4) | PT1203817E (no) |
| SI (1) | SI0851927T1 (no) |
| TR (5) | TR200403064T2 (no) |
| WO (1) | WO1997009428A2 (no) |
Families Citing this family (42)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6991797B2 (en) | 1993-07-02 | 2006-01-31 | Statens Serum Institut | M. tuberculosis antigens |
| US6641814B1 (en) | 1997-04-02 | 2003-11-04 | Statens Serum Institut | Nucleic acids fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis |
| US6592877B1 (en) | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6458366B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| US6290969B1 (en) | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| BR9712298A (pt) * | 1996-10-11 | 2000-10-24 | Corixa Corp | Polipeptìdeo, molécula de dna, vetor de expressão recombinante, célula hospedeira, processo para detectar infecção por m. tuberculosis em uma amostra biológica, kit diagnóstico, anticorpos monoclonal, e, policlonal, e, proteìna de fusão |
| US6544522B1 (en) | 1998-12-30 | 2003-04-08 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6627198B2 (en) | 1997-03-13 | 2003-09-30 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| US6350456B1 (en) | 1997-03-13 | 2002-02-26 | Corixa Corporation | Compositions and methods for the prevention and treatment of M. tuberculosis infection |
| US6982085B2 (en) | 1997-04-02 | 2006-01-03 | Statens Serum Institut | TB diagnostic based on antigens from M. tuberculosis |
| ES2291810T3 (es) * | 1997-04-02 | 2008-03-01 | Statens Serum Institut | Fragmentos de acido nucleico y fragmentos de polpeptidos derivados de m. tuberculosis. |
| US7037510B2 (en) | 1997-04-18 | 2006-05-02 | Statens Serum Institut | Hybrids of M. tuberculosis antigens |
| US6555653B2 (en) * | 1997-05-20 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use |
| US6613881B1 (en) * | 1997-05-20 | 2003-09-02 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use |
| WO1999004005A1 (en) * | 1997-07-16 | 1999-01-28 | Institut Pasteur | A polynucleotide functionally coding for the lhp protein from mycobacterium tuberculosis, its biologically active derivative fragments, as well as methods using the same |
| AU750173B2 (en) * | 1997-11-10 | 2002-07-11 | Statens Serum Institut | Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis |
| EP1484405A1 (en) * | 1997-11-10 | 2004-12-08 | Statens Serum Institut | Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. Tuberculosis |
| TR200002938T2 (tr) * | 1998-04-07 | 2001-02-21 | Corixa Corporation | Mikrobakteri tüberküloz antijenlerinin füzyon proteinleri ve bunların kullanımı |
| GB9808720D0 (en) * | 1998-04-23 | 1998-06-24 | Smithkline Beecham Biolog | Novel compounds |
| WO2000026248A2 (en) * | 1998-11-04 | 2000-05-11 | Isis Innovation Limited | Tuberculosis diagnostic test |
| US6465633B1 (en) | 1998-12-24 | 2002-10-15 | Corixa Corporation | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis |
| AU2594500A (en) * | 1998-12-24 | 2000-07-31 | Corixa Corporation | Methods for using mycobacterium tuberculosis molecules as immunological adjuvants |
| EP2087906A1 (en) | 1999-05-04 | 2009-08-12 | The University of Medicine and Dentistry of New Jersey | Proteins expressed by Mycobacterium tuberculosis and not by BCG and their use as diagnostic reagents and vaccines |
| US7009042B1 (en) * | 1999-10-07 | 2006-03-07 | Corixa Corporation | Methods of using a Mycobacterium tuberculosis coding sequence to facilitate stable and high yield expression of the heterologous proteins |
| US6316205B1 (en) | 2000-01-28 | 2001-11-13 | Genelabs Diagnostics Pte Ltd. | Assay devices and methods of analyte detection |
| AU2001241738A1 (en) | 2000-02-25 | 2001-09-03 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
| AU6867801A (en) | 2000-06-20 | 2002-01-02 | Corixa Corp | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| WO2003070187A2 (en) | 2002-02-15 | 2003-08-28 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| ITRM20040091A1 (it) | 2004-02-19 | 2004-05-19 | Istituto Naz Per Le Malattie | Test immunologico rapido per la diagnosi ed il monitoraggio dell'infezione tubercolare. |
| FI119445B (fi) * | 2004-10-29 | 2008-11-14 | Waertsilae Finland Oy | Polttomoottorin polttoaineen syöttöjärjestelmän paineen värähtelyn vaimennin |
| WO2006053871A2 (en) | 2004-11-16 | 2006-05-26 | Crucell Holland B.V. | Multivalent vaccines comprising recombinant viral vectors |
| CA2821389C (en) | 2005-04-29 | 2015-11-17 | Glaxosmithkline Biologicals S.A. | Novel method for preventing or treating m tuberculosis infection |
| FR2952058B1 (fr) | 2009-10-29 | 2013-10-04 | Centre Nat Rech Scient | Procede de ligation native de polypeptides |
| MX2012008790A (es) | 2010-01-27 | 2012-08-17 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Antigenos de tuberculosis modificados. |
| KR20140029376A (ko) | 2010-12-14 | 2014-03-10 | 글락소스미스클라인 바이오로지칼즈 에스.에이. | 미코박테리움 항원성 조성물 |
| FR2971509B1 (fr) * | 2011-02-16 | 2013-02-22 | Centre Nat Rech Scient | Procede de preparation de peptides par assemblage de multiples fragments peptidiques |
| CN103290030A (zh) * | 2012-02-23 | 2013-09-11 | 上海交通大学 | 一种结核分枝杆菌标志物HtdY的重组蛋白及其制备方法和临床应用 |
| EP2844282B1 (en) * | 2012-05-04 | 2019-06-12 | Pfizer Inc | Prostate-associated antigens and vaccine-based immunotherapy regimens |
| BR112016023040A2 (pt) * | 2014-04-04 | 2018-01-16 | Vestaron Corporation | processo para aumentar a atividade ou toxicidade de um peptídeo |
| GB201513176D0 (en) | 2015-07-27 | 2015-09-09 | Glaxosmithkline Biolog Sa | Novel methods for inducing an immune response |
| FR3048286B1 (fr) * | 2016-02-26 | 2021-01-22 | Omunis | Peptides immunogenes et leur utilisation |
| CN107304231B (zh) * | 2016-04-18 | 2021-01-01 | 华中农业大学 | 一种结核分枝杆菌融合蛋白及应用 |
Family Cites Families (11)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| FR2244539A1 (en) * | 1973-07-13 | 1975-04-18 | Mitsui Pharmaceuticals | Tuberculin active proteins and peptides prepn - from tubercle bacillus |
| FR2265402A1 (en) * | 1974-03-29 | 1975-10-24 | Mitsui Pharmaceuticals | Tuberculin active proteins and peptides prepn - from tubercle bacillus |
| US4876089A (en) * | 1984-09-06 | 1989-10-24 | Chiron Corporation | Feline leukemia virus protein vaccines |
| US4751180A (en) | 1985-03-28 | 1988-06-14 | Chiron Corporation | Expression using fused genes providing for protein product |
| US4935233A (en) | 1985-12-02 | 1990-06-19 | G. D. Searle And Company | Covalently linked polypeptide cell modulators |
| US5075109A (en) | 1986-10-24 | 1991-12-24 | Southern Research Institute | Method of potentiating an immune response |
| US4897268A (en) | 1987-08-03 | 1990-01-30 | Southern Research Institute | Drug delivery system and method of making the same |
| FR2677365B1 (fr) * | 1991-06-07 | 1995-08-04 | Pasteur Institut | Proteines de mycobacterium et applications. |
| US5330754A (en) * | 1992-06-29 | 1994-07-19 | Archana Kapoor | Membrane-associated immunogens of mycobacteria |
| DK79793D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | Diagnostic test |
| DK79893D0 (da) * | 1993-07-02 | 1993-07-02 | Statens Seruminstitut | New vaccine |
-
1996
- 1996-08-30 DE DE69637879T patent/DE69637879D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PT PT01126628T patent/PT1203817E/pt unknown
- 1996-08-30 DE DE69630457T patent/DE69630457T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DE DE69636046T patent/DE69636046T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 ES ES01126628T patent/ES2262595T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 PT PT03005931T patent/PT1347055E/pt unknown
- 1996-08-30 DE DE69636487T patent/DE69636487T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 ES ES03005931T patent/ES2324529T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 JP JP51146497A patent/JP4382160B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 EP EP96933009A patent/EP0851927B1/en not_active Revoked
- 1996-08-30 PL PL96325373A patent/PL186774B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DK DK03021501T patent/DK1398379T3/da active
- 1996-08-30 TR TR2004/03064T patent/TR200403064T2/xx unknown
- 1996-08-30 ES ES96933009T patent/ES2210392T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 AT AT96933009T patent/ATE252640T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 TR TR2009/01109T patent/TR200901109T1/xx unknown
- 1996-08-30 BR BRPI9610262-4B1A patent/BR9610262B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 PT PT96933009T patent/PT851927E/pt unknown
- 1996-08-30 AT AT03005931T patent/ATE426025T1/de active
- 1996-08-30 KR KR10-1998-0701589A patent/KR100433750B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DK DK03005931T patent/DK1347055T3/da active
- 1996-08-30 AT AT06112509T patent/ATE513915T1/de not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 BR BRPI9612997-2A patent/BR9612997B1/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 WO PCT/US1996/014674 patent/WO1997009428A2/en active Application Filing
- 1996-08-30 AT AT01126628T patent/ATE323165T1/de active
- 1996-08-30 EP EP01126628A patent/EP1203817B9/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 MX MX9801638A patent/MX9801638A/es not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 HU HU0900047A patent/HU227778B1/hu unknown
- 1996-08-30 ES ES03021501T patent/ES2271449T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 TR TR2008/06258T patent/TR200806258T2/xx unknown
- 1996-08-30 CA CA002684425A patent/CA2684425A1/en not_active Abandoned
- 1996-08-30 HU HU9900902A patent/HU225979B1/hu not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CA CA2653566A patent/CA2653566C/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 EP EP03005931A patent/EP1347055B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 DK DK01126628T patent/DK1203817T3/da active
- 1996-08-30 IL IL12350696A patent/IL123506A/en not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 CZ CZ0062898A patent/CZ297406B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 AT AT03021501T patent/ATE337399T1/de active
- 1996-08-30 CZ CZ20090166A patent/CZ300953B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 DK DK96933009T patent/DK0851927T3/da active
- 1996-08-30 SI SI9630644T patent/SI0851927T1/xx unknown
- 1996-08-30 TR TR2008/06259T patent/TR200806259T2/xx unknown
- 1996-08-30 CZ CZ20060387A patent/CZ300688B6/cs not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 PT PT03021501T patent/PT1398379E/pt unknown
- 1996-08-30 CN CN96197639A patent/CN1117149C/zh not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 TR TR1998/00411T patent/TR199800411T1/xx unknown
- 1996-08-30 NZ NZ319377A patent/NZ319377A/xx not_active IP Right Cessation
- 1996-08-30 EP EP03021501A patent/EP1398379B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 AU AU71586/96A patent/AU727602B2/en not_active Expired
- 1996-08-30 EP EP06112509A patent/EP1712628B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-08-30 CA CA002230885A patent/CA2230885C/en not_active Expired - Fee Related
-
1998
- 1998-02-27 NO NO19980883A patent/NO324372B1/no not_active IP Right Cessation
-
2004
- 2004-03-08 HK HK04101684.5A patent/HK1059282A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2006
- 2006-02-10 JP JP2006034592A patent/JP4324596B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2006-02-10 JP JP2006034593A patent/JP4324597B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 2006-12-19 CY CY0600033A patent/CY2570B1/xx unknown
-
2007
- 2007-02-01 NO NO20070618A patent/NO336288B1/no not_active IP Right Cessation
- 2007-02-01 NO NO20070621A patent/NO20070621L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-02-01 NO NO20070619A patent/NO20070619L/no not_active Application Discontinuation
- 2007-03-23 JP JP2007077972A patent/JP4324618B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
2009
- 2009-04-08 JP JP2009094008A patent/JP2009159982A/ja not_active Ceased
- 2009-06-05 CY CY0900006A patent/CY2612B2/xx unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US7989605B2 (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| US7927609B2 (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| EP0851927B1 (en) | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis | |
| JP4764445B2 (ja) | 結核の免疫治療および診断のための化合物およびそれらの使用方法 | |
| WO1997009428A9 (en) | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| MM1K | Lapsed by not paying the annual fees |