KR19990044347A - 결핵의 면역치료 및 진단을 위한 화합물 및 방법 - Google Patents
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Abstract
결핵에 대한 보호 면역성을 유도하기 위한 화합물 및 방법이 기술되어 있다. 제공된 화합물은 하나 이상의 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis) 단백질의 면역원성 부위 하나 이상을 함유하는 폴리펩티드 및 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자를 포함한다. 상기 화합물은 엠. 튜버큘로시스 감염에 대한 면역을 위해 백신 및/또는 약제학적 조성물로 제형화될 수 있거나 결핵의 진단을 위해 사용될 수 있다.
Description
결핵은 일반적으로 마이코박테리움 튜버큘로시스의 감염에 의해 원인이되는 만성 감염성 질환이다. 전세계의 개발지역에서 증가하고 있는 문제일 뿐만 아니라 개발도상국의 주요 질환으로서 연간 8백만명이 발병하게 되고 3백만명이 사망하게된다. 감염이 상당한 기간동안 잠복할 수 있다 할지라도 질환은 대부분 공통적으로 폐의 급성 염증으로서 확대되어 열 및 해로운 기침을 일으킨다. 치료하지 않게 되는 경우 심각한 합병증을 유발하고 통상 사망하게 된다.
결핵이 일반적으로 연장된 항체 치료를 사용하여 억제될 수 있다 할지라도 상기 치료는 질환의 전염을 예방하는데 충분치 않다. 감염된 환자는 잠복성이지만 전염성일 수 있다. 추가로 치료 섭생에 따른 순응성이 중요하다 할지라도 환자의 거동을 검색하기란 어렵다. 몇몇 환자는 치료 과정을 완수하지 못함으로써 비효과적인 치료가 될수 있고 약제 저항성이 발생할 수 있다.
결핵의 전염을 억제하기 위해서는 효과적인 백신화 및 질환의 정확한 초기 진단이 요구된다. 현재에 생세균으로 백신화하는 것은 예방성 면역을 유도하기에 가장 효율적인 방법이다. 상기 목적을 위해 가장 일반적으로 사용되는 마이코박테리움은 마이코박테리움 보비스의 비독성 균주인 바시러스 칼메트-구에린(BCG)이다. 하지만 BCG의 안정성 및 효능은 논란의 대상이 되었고 미국과 같은 몇몇 국가는 대중들에게 백신화하지 못하게 하고 있다. 진단은 일반적으로 피부 시험을 사용하여 성취되는데 이는 튜버큘린 PPD(단백질 정제된 유도체)에 대한 피내의 노출을 포함한다. 항원 특이적인 T 세포 반응은 주입한지 48 내지 72시간 후에 주입부위에 감지할만한 경변이 발생하고 이는 마이코박테리움 항원에 노출되었음을 나타낸다. 하지만 민감성 및 특이성이 상기 시험의 문제가 되어왔고 BCG로 백신화된 환자는 감염된 환자와 구분할 수 없다.
대식세포는 엠 튜버큘로시스 면역의 주요 효과 인자로서 작용하는 것으로 밝혀진 반면에 T세포는 상기 면역의 주요 유도인자이다. 엠. 튜버큘로시스 감염에 대한 보호에 있어서 T세포의 필수적인 역할은 사람 면역결핍 바이러스(HIV) 감염과 연관된 CD4 T 세포의 고갈로 인해 AIDS 환자에게 엠, 튜버큘로시스가 빈번하게 발생되는 것으로 설명될 수 있다. 마이코박테리움 반응성 CD4 T 세포는 마우스에서 대식세포의 항마이코박테리아성 효과를 유발시키는 것으로 나타난 감마-인터페론(IFN-γ)의 강력한 생산자인 것으로 나타났다. 사람의 IFN-γ의 역할은 불명확하지만 연구는 통해 단독 또는 IFN-γ 또는 종양 괴사 인자-알파와 배합된 1,25-디하이드록시-비타민 D3가 사람 대식세포를 활성화시켜 엠 튜버큘로시스 감염을 억제시키는 것을 보여준다. 더욱이 IFN-γ가 사람 대식세포를 자극하여 1,25-디하이드록시-비타민 D3을 생산 할 수 있도록 한다는 것은 공지되어 있다. 유사하게 IL-12는 엠. 튜버큘로시스 감염에 대한 저항성을 자극하는데 중요한 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. 엠.튜버큘로시스 감염의 면역학에 대한 참고를 위해 문헌[참조: Chan and Kaufmann in Tuberculosis: Pathogenesis, Protection and Control, Bloom(ed.), ASM Press, Washington, DC, 1994]을 참조한다.
따라서, 결핵의 예방, 치료 및 검출을 위한 개선된 백신 및 방법이 당해 기술분야에 요구된다. 본 발명은 이들 필요성을 충족시키고 추가로 또 다른 관련 잇점을 제공한다.
발명의 요약
간략히 말하자면 본 발명은 결핵을 예방하고 진단하기 위한 화합물 및 방법을 제공한다. 한 측면에서, 가용성 엠.튜버큘로시스 항원의 면역원성 일부 또는 보존적인 치환 및/또는 변화만이 차이가 있는 상기 항원의 변형체를 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 상기 측면의 한가지 양태에서, 가용성 항원은 하기의 N-말단 서열중 하나를 갖는다:
(a)Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu(서열 120);
(b)Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser(서열 121);
(c)Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg(서열 122);
(d)Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro(서열 123);
(e)Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val(서열 124);
(f)Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro(서열 125);
(g)Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser(서열 126);
(h)Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly(서열 127);
(i)Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn(서열 128);
(j)Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser(서열 134);
(k)Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Tyr-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp(서열 135) 또는
(l)Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly(서열 136)
여기서 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다.
관련된 측면에서, 엠.튜버큘로시스 항원의 면역원성 일부 또는 보존적인 치환 및/또는 변화만이 차이가 있는 상기 항원의 변형체를 포함하는 폴리펩티드가 제공되는데 항원은 하기 N-말단 서열중 하나를 갖는다.
(m)Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val(서열 137) 또는
(n)Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe(서열 129)
여기서 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다.
또 다른 양태에서, 항원은 서열 1,2,4-10,13-25,52,101에 나타낸 서열, 이런한 서열과 상보적인 서열 및 중간정도의 스트린전트 조건하에서 서열 1,2,4-10,13-25,99 및 101에 나타낸 서열 또는 이의 상보적인 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열로 구성되는 그룹중에서 선택되는 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다.
관련된 측면에서, 폴리펩티드는 엠.튜버큘로시스 항원의 면역원성 일부 또는 보존적인 치환 및/또는 변화만이 차이가 있는 상기 항원의 변형체를 포함하는 폴리펩티드가 제공되는데 여기서 항원은 서열 26 내지 51에 나타낸 서열, 이런한 서열과 상보적인 서열 및 중간 정도의 스트린전트 조건하에서 서열 26 내지 51에 나타낸 서열 또는 이의 상보적인 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열로 구성되는 그룹 중에서 선택되는 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함한다.
관련된 측면에서 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열, 이들 DNA 서열을 포함하는 발현 벡터 및 이러한 발현 벡터로 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포가 제공된다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 및 제2 폴리펩티드 또는 또 다른 본 발명의 폴리펩티드 및 공지된 엠.튜버큘로시스 항원을 포함하는 융합 단백질을 제공한다.
또 다른 측면내에서 본 발명은 하나 이상의 상기 폴리펩티드, 또는 이러한 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자 및 생리적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다. 또한 본 발명은 상기 기술한 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함하는 백신 및 비특이적인 면역 반응 인핸서 및 이와 함께 상기 폴리펩티드를 암호화하는 하나 이상의 DNA 서열 및 비특이적인 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신을 제공한다.
또다른 측면에서, 하나 이상의 상기 폴리펩티드 유효량을 환자에게 투여하는 것을 포함하여 환자에게 보호 면역성을 유도하기 위한 방법이 제공된다.
본 발명의 추가의 양태에서, 환자에게서 결핵을 검출하기 위한 방법 및 진단용 키트가 제공된다. 상기 방법은 환자의 표피 세포를 하나 이상의 폴리펩티드와 접촉시키고 환자의 피부상의 면역 반응을 검출하는것을 포함한다. 진단용 키트는 폴리펩티드를 환자의 표피 세포에 점촉시키기에 충분한 장치와 조합된 하나 이상의 상기 폴리펩티드를 포함한다.
본 발명의 또 다른 측면은 후속되는 상세한 설명 및 첨부된 도면을 참조로 명백하게 될 것이다. 본 원에 기술된 모든 참조문헌은 각각 별개로 인용됨으로써 전반적인 참조문헌으로서 인용된다
본 발명은 일반적으로 마이코박테리움 튜버큘로시스(Mycobacterium tuberculosis)감염의 검출, 치료 및 예방에 관한 것이다. 본 발명은 더욱 특히 마이코박테리움 튜버큘로시스 항원, 또는 이의 일부 또는 이의 또다른 변형체 및 마이코박테리움 튜버큘로시스 감염에 대해 진단하고 백신화하기 위한 상기 폴리펩티드의 용도에 관한 것이다.
도 1A 및 B는 각각 실시예 1에서 기술된 14Kd, 20Kd 및 26Kd 항원에 의해 엠. 튜버큘로시스-면역 공여자로부터 유래된 T세포의 증식 및 인터페론-γ의 생산의 자극을 설명한다.
도 2는 2개의 대포적인 폴리펩티드 TbRa3 및 TbRa9에 의해 엠. 튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T 세포의 증식 및 인터페론-γ 생산의 자극을 설명한다.
서열 1은 TbRa1의 DNA 서열이다.
서열 2는 TbRa10의 DNA 서열이다.
서열 3은 TbRa11의 DNA 서열이다.
서열 4는 TbRa12의 DNA 서열이다.
서열 5는 TbRa13의 DNA 서열이다.
서열 6은 TbRa16의 DNA 서열이다.
서열 7은 TbRa17의 DNA 서열이다.
서열 8은 TbRa18의 DNA 서열이다.
서열 9는 TbRa19의 DNA 서열이다.
서열 10은 TbRa24의 DNA 서열이다.
서열 11은 TbRa26의 DNA 서열이다.
서열 12는 TbRa28의 DNA 서열이다.
서열 13은 TbRa29의 DNA 서열이다.
서열 14는 TbRa2A의 DNA 서열이다.
서열 15는 TbRa3의 DNA 서열이다.
서열 16은 TbRa32의 DNA 서열이다.
서열 17은 TbRa35의 DNA 서열이다.
서열 18은 TbRa36의 DNA 서열이다.
서열 19는 TbRa4의 DNA 서열이다.
서열 20은 TbRa9의 DNA 서열이다.
서열 21은 TbRaB의 DNA 서열이다.
서열 22는 TbRaC의 DNA 서열이다.
서열 23은 TbRaD의 DNA 서열이다.
서열 24는 YYWCPG의 DNA 서열이다.
서열 25는 AAMK의 DNA 서열이다.
서열 26은 TbL-23의 DNA 서열이다.
서열 27은 TbL-24의 DNA 서열이다.
서열 28은 TbL-25의 DNA 서열이다.
서열 29는 TbL-28의 DNA 서열이다.
서열 30은 TbL-29의 DNA 서열이다.
서열 31은 TbH-5의 DNA 서열이다.
서열 32는 TbH-8의 DNA 서열이다.
서열 33은 TbH-9의 DNA 서열이다.
서열 34는 TbM-1의 DNA 서열이다.
서열 35는 TbM-3의 DNA 서열이다.
서열 36은 TbM-6의 DNA 서열이다.
서열 37은 TbM-7의 DNA 서열이다.
서열 38은 TbM-9의 DNA 서열이다.
서열 39는 TbM-12의 DNA 서열이다.
서열 40은 TbM-13의 DNA 서열이다.
서열 41은 TbM-14의 DNA 서열이다.
서열 42는 TbM-15의 DNA 서열이다.
서열 43은 TbH-4의 DNA 서열이다.
서열 44는 TbH-4-FWD의 DNA 서열이다.
서열 45는 TbH-12의 DNA 서열이다.
서열 46은 Tb38-1의 DNA 서열이다.
서열 47은 Tb38-4의 DNA 서열이다.
서열 48은 TbL-17의 DNA 서열이다.
서열 49는 TbL-20의 DNA 서열이다.
서열 50은 TbL-21의 DNA 서열이다.
서열 51은 TbH-16의 DNA 서열이다.
서열 52는 DPEP의 DNA 서열이다.
서열 53은 DPEP의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 54는 DPV N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 55는 AVGS N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 56은 AAMK N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 57은 YYWC N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 58은 DIGS N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 59는 AEES N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 60은 DPEP N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 61은 APKT N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 62는 DPAS N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 63은 TbRa1의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 64는 TbRa10의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 65는 TbRa11의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 66은 TbRa12의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 67은 TbRa13의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 68은 TbRa16의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 69는 TbRa17의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 70은 TbRa18의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 71은 TbRa19의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 72는 TbRa24의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 73은 TbRa26의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 74는 TbRa28의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 75는 TbRa29의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 76은 TbRa2A의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 77은 TbRa3의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 78은 TbRa32의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 79는 TbRa35의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 80은 TbRa36의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 81은 TbRa4의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 82는 TbRa9의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 83은 TbRaB의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 84는 TbRaC의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 85는 TbRaD의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 86은 YYWCPG의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 87은 TbAAMK의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 88은 Tb38-1의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 89는 TbH-4의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 90은 TbH-8의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 91은 TbH-9의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 92는 TbH-12의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 93은 Tb38-1 펩티드 1의 아미노산 서열이다.
서열 94는 Tb38-1 펩티드 2의 아미노산 서열이다.
서열 95는 Tb38-1 펩티드 3의 아미노산 서열이다.
서열 96은 Tb38-1 펩티드 4의 아미노산 서열이다.
서열 97은 Tb38-1 펩티드 5의 아미노산 서열이다.
서열 98은 Tb38-1 펩티드 6의 아미노산 서열이다.
서열 99는 DPAS의 DNA 서열이다.
서열 100은 DPAS의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 101은 DPV의 DNA 서열이다.
서열 102는 DPV의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 103은 ESAT-6의 DNA 서열이다.
서열 104는 의 ESAT-6의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 105는 TbH-8-2의 DNA 서열이다.
서열 106은 TbH-9FL의 DNA 서열이다.
서열 107은 TbH-9FL의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 108은 TbH-9-1의 DNA 서열이다.
서열 109는 TbH-9-1의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 110은 TbH-9-4의 DNA 서열이다.
서열 111은 TbH-9-4의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 112는 Tb38-1F2IN의 DNA 서열이다.
서열 113은 Tb38-2F2 RP의 DNA 서열이다.
서열 114는 Tb37-FL의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 115는 Tb38-IN의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 116은 Tb38-1F3의 DNA 서열이다.
서열 117은 Tb38-1F3의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 118은 Tb38-1F5의 DNA 서열이다.
서열 119는 Tb38-1F6의 DNA 서열이다.
서열 120은 DPV의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 121은 AVGS의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 122는 AAMK의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 123은 YYWC의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 124는 DIGS의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 125는 AEES의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 126은 DPEP의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 127은 APKT의 추론된 N-말단 아미노산 서열이다.
서열 128은 DPAS의 추론된 아미노산 서열이다.
서열 129는DPPD N-말단 항원의 단백질 서열이다.
서열 130 내지 133은 4개의 DPPD 시아노겐 브로마이드 단편의 단백질 서열이다.
서열 134는 XDS 항원의 N-말단 단백질 서열이다.
서열 135는 AGD 항원의 N-말단 단백질 서열이다.
서열 136은 APE 항원의 N-말단 단백질 서열이다.
서열 137은 XYI 항원의 N-말단 단백질 서열이다.
상기 주지한 바와 같이 본 발명은 일반적으로 결핵의 예방, 치료 및 진단을 위한 조성물 및 방법에 관한 것이다. 본 발명의 조성물은 면역원성인 엠. 튜버큘로시스 항원의 적어도 일부 또는 단지 보존적 치환 및/또는 변화에 차이가 있는 상기 항원의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다. 본 발명의 범위내의 폴리펩티드는 면역원성인 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. "가용성 엠. 튜버큘로시스 항원"은 엠. 튜버큘로시스 배양 여과물에 존재하는 엠. 튜버큘로시스 기원의 단백질이다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "폴리펩티드"는 완전한 길이의 단백질(예: 항원)을 포함하여 임의의 길이를 갖는 아미노산쇄를 포함하며 여기서 아미노산 잔기는 펩티드 공유결합에 의해 연결된다. 따라서 상기 항원중 하나의 면역원성 일부를 포함하는 폴리펩티드는 전체적으로 면원원성 일부로 구성될 수 있거나 추가의 서열을 포함할 수 있다. 추가의 서열은 고유 엠. 튜버큘로시스 항원으로부터 유래될 수 있거나 이종성일 수 있으며 상기 서열(필요하지는 않음) 면역원성일 수 있다.
본원에서 사용되는 "면역원성"은 사람과 같은 환자 및/또는 생물학적 샘플에서 면역 반응(예: 세포성)을 유발시킬 수 있는 능력을 언급한다. 특히 면역원성인 항원(및 상기 항원의 면역원성 일부 또는 또 다른 변형체)은 세포가 엠. 튜버큘로시스-면역 환자로부터 유래된 T세포, NK세포, B세포 및 대식세포의 그룹에서 선택되는 하나 이상의 세포를 포함하는 생물학적 샘플에서 세포 증식, 인터루킨-12 생산 및/또는 인터페론-γ 생산을 자극할 수 있다. 하나 이상의 엠. 튜버큘로시스 항원의 면역원성 일부이상을 포함하는 폴리펩티드는 일반적으로 환자내 결핵을 검출하거나 결핵에 대한 보호 면역을 유도시키는데 사용될 수 있다.
본 발명의 조성물 및 방법은 또한 상기 폴리펩티드의 변형체를 포함한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "변형체"는 단지 보존적인 치환 및/또는 변화에 있어서 고유 항원과 차이가 있는 폴리펩티드이고 면역 반응을 유도할 수 있는 이의 능력은 보유된다. 일반적으로 상기 변형체는 예를들어 본원에 기술한 대표적인 방법을 사용하여 상기 폴리펩티드 서열의 하나를 변화시키고 변화된 폴리펩티드의 면역원성 특징을 평가함으로써 확인될 수 있다.
"보존적인 치환"은 아미노산이 유사한 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 치환되는 것인데 펩티드 화학 분야의 기술자는 폴리펩티드의 제2차 구조 및 하이드로패식 성질이 상당히 변화되지 않을 것으로 예상한다. 일반적으로 하기 그룹의 아미노산이 보존적인 변화를 나타낸다: (1) ala, pro, gly, asp, gln, asn, ser, thr, (2)cys, ser, tyr, thr; (3) val, ile, leu, met, ala, phe; (4)lys, arg, his; 및 (5)phe, tyr, trp, his.
또한 변형체는 (또는 다르게) 예를들어 폴리펩티드의 면역원성 성질, 2차 구조 및 하이드로패식 성질에 최소한의 영향을 미치는 아미노산의 결실 또는 첨가에 의해 변화될 수 있다. 예를들어, 폴리펩티드는 단백질의 N-말단에서 해독과 동시 또는 해독 후에 단백질의 이동을 지시하는 시그널(또는 리더)서열과 연결될 수 있다. 또한 폴리펩티드는 폴리펩티드의 합성, 정제 또는 확인을 용이하게 하거나 고체 지지체에대한 폴리펩티드의 결합을 증가시키기 위해 링커 또는 또 다른 서열과 연결될 수 있다. 예를들어, 폴리펩티드는 면역글로불린 Fc 부위에 연결될 수 있다.
관련된 측면에서, 조합 폴리펩티드가 기술되어 있다. "조합 폴리펩티드는 펩티드 연결을 통해 단일 아미노산 쇄로 연결되는 하나 이상의 상기 면역원성 일부 및 하나 이상의 추가 면역원성 엠. 튜버큘로시스 서열을 포함하는 폴리펩티드이다. 상기 서열은 직접적으로(삽입된 아미노산 없이)연결될 수 있거나 성분 폴리펩티드의 면역원성 성질을 상당히 감소시키지 않는 다양한 링커 서열(예를들어, Gly-Cys-Gly)를 통해 연결될 수 있다.
일반적으로 엠. 튜버큘로시스 항원 및 상기 항원을 암호화하는 DNA 서열은 다양한 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를들어 가용성 항원은 음이온 교환 및 역상 크로마토그래피를 포함하여 당해 기술분야에 공지된 방법에 의해 엠. 튜버큘로시스 배양 여과물로부터 분리될 수 있다. 따라서 정제된 항원은 예를들어 본원에 기술한 대표적인 방법을 사용하여 적당한 면역 반응(예: 세포성)을 유발시킬 수 있는 능력에 대해 평가된다. 면역원성 항원은 따라서 전통적인 에드만 화학법과 같은 기술을 사용하여 부분적으로 서열화될 수 있다[참조: Edman and Berg, Eur. J. Biochem. 80:116-132, 1967].
면역원성 항원은 또한 항원을 암호화하고 발현벡터에 삽입되어 적절한 숙주 세포에서 발현되는 DNA 서열을 사용하여 재조합으로 제조될 수 있다. 가용성 항원을 암호화하는 DNA 분자는 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원에 대해 특이적인 항혈청(예: 래빗)으로 적당한 엠. 튜버큘로시스 발현 라이브러리를 검색함으로써 분리될 수 있다. 가용성이거나 가용성이 아닐 수 있는 항원을 암호화하는 DNA 서열은 엠. 튜버큘로시스로 감염된 환자로부터 수득한 혈청으로 적당한 엠. 튜버큘로시스 게놈 또는 cDNA 발현 라이브러리를 검색함으로써 확인될 수 있다. 상기 검색은 일반적으로 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술된 것과 같이 당해분야의 통상적인 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 수행될 수 있다.
가용성 항원을 암호화하는 DNA 서열은 또한 분리된 가용성 항원의 부분적인 아미노산 서열로부터 유래된 변성 올리고뉴클레오타이드와 하이브리드화하는 DNA 서열을 위해 적당한 엠, 튜버큘로시스 cDNA 또는 게놈 DNA 라이브러리를 검색함으로써 수득될 수 있다. 상기 검색에 사용하기 위한 변성 올리고뉴클레오타이드 서열은 디자인되고 합성될 수 있으며 검색은 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989](및 여기에 인용된 문헌)에 기술된 바와 같이 수행될 수 있다. 폴리메라제 쇄 반응(PCR)이 또한 당해 기술분야에 공지된 방법으로 상기 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 cDNA 또는 게놈 라이브러리로부터 핵산 프로브를 분리하는데 사용될 수 있다. 따라서 라이브러리 검색은 분리된 프로브를 사용하여 수행될 수 있다.
또한 엠. 튜버큘로시스로부터 유래된 게놈 또는 cDNA 라이브러리는 하나 이상의 엠.튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 말초 혈액 단핵 세포(PBMCs) 또는 T 세포주 또는 클론을 사용하여 직접적으로 검색될 수 있다. 일반적으로 상기 검색에 사용하기 위한 PBMCs 및/또는 T 세포는 하기에 기술한 바와 같이 제조될 수 있다. 직접적인 라이브러리 검색은 일반적으로 엠, 튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T 세포의 증식 및/또는 인터페론-γ생산을 유도할 수 있는 능력에 대해 발현된 재조합 단백질을 분석함으로써 수행될 수 있다. 또한 잠재적인 T 세포 항원은 상기 기술한 바와 같이 항체 반응성을 기준으로 우선적으로 선별될 수 있다.
제조 방법에 상관없이 본원에 기술된 항원(및 이의 면역원성 부분)은 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 갖는다. 더욱 특히, 항원은 엠, 튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T 세포, NK세포, B세포 및/또는 대식세포의 증식 및/또는 사이토킨 생산(예를들어 인터페론-γ 및/또는 인터페론-12 생산)을 유도할 수 있는 능력을 갖는다. 항원에 대한 면역 반응을 평가하는데 사용하기 위한 세포 유형의 선별은 물론 목적하는 반응에 의존한다. 예를들어, 인터루킨-12 생산은 B 세포 및/또는 대식세포를 포함하는 제제를 사용함으로써 가장 용이하게 평가된다. 엠. 튜버큘로시스-면역 환자는 엠. 튜버큘로시스에 대해 효과적인 T 세포 반응을 부과하여 결핵의 발병에 저항성인 것으로 여겨지는 사람이다(예를들어 질환 증상이 상당히 없음). 상기 환자는 결핵 단백질(PPD)에 대해 피내 피부 시험의 매우 양성 반응(직경 10mm초과의 경변) 및 결핵 질환의 증후나 증상이 없는 것을 근거로 확인될 수 있다. 엠.튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T 세포, NK 세포, B 세포 및 대식세포를 당해 기술분야의 통상적인 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 예를들어, PBMCs(말초 혈액 단핵 세포)의 제조는 추가의 성분 세포를 분리하지 않고 사용될 수 있다. PBMCs는 일반적으로 예를들어, 피콜TM을 통한 밀도 원심분리를 사용하여 제조될 수 있다(Winthrop Laboratories, NY). 본원에 기술한 분석에 사용하기 위한 T 세포는 직접적으로 PBMCs로부터 정제될 수 있다. 또한 마이코박테리아성 단백질에 대해 반응성인 풍부한 T 세포주 또는 각각의 마이코박테리아성 단백질에 반응성인 T세포 클론이 사용될 수 있다. 상기 T세포 클론은 예를들어, 엠.튜버큘로시스 면역 환자의 PBMCs를 2 내지 4주 동안 마이코박테리아성 단백질과 함께 배양함으로써 합성될 수 있다. 이것은 마이코박테리아성 단백질 특이적인 T세포만이 증식하게 되고 이러한 세포들로 유일하게 구성되는 세포주가 생성된다. 이들 세포는 당해분야의 통상적인 기술자에게 공지된 방법을 사용하여 각각의 단백질로 클론될 수 있고 시험되어 보다 정확하게 각각의 T 세포 특이성을 한정할 수 있다. 일반적으로 엠. 튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T세포, NK세포, B세포 및/또는 대식세포를 사용하여 수행되는 증식 및/또는 사이토킨 생산(예를들어 인터페론-γ 및/또는 인터루킨-12 생산)을 위한 분석에서 시험 양성인 항원은 면역원성인 것으로 여겨진다. 상기 분석은 예를들어 하기에 기술한 대표적인 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 항원의 면역원성 부분은 유사한 분석을 사용하여 확인될 수 있고 본 원에 기술한 폴리펩티드내에 존재할 수 있다.
세포 증식을 유도하는 폴리펩티드(예를들어, 면역원성 항원 또는 이의 일부 또는 또 다른 변형체)의 능력은 세포(예를들어, T세포 및/또는 NK세포)를 폴리펩티드에 접촉시키고 세포 증식을 측정함으로써 평가된다. 일반적으로 약 105세포의 평가를 위해 충분한 폴리펩티드의 양은 약 10ng/mL 내지 100㎍/mL의 범위이고 바람직하게는 약 10㎍/mL이다. 세포와 함께 폴리펩티드의 배양은 전형적으로 약 6일동안 37℃에서 수행한다. 폴리펩티드와의 배양에 이어서 세포는 증식 반응에 대해 검정되고 세포를 방서선 표지된 티미딘에 노출시키고 표지의 세포성 DNA로의 혼입을 측정하는 바와 같은 당해 분야의 통상적인 기술자에게 공지된 방법에 의해 평가될 수 있다 일반적으로 상기 배경(폴리펩티드 없이 배양된 세포에 대해 관찰된 증식)하에서 증식이 3배 이상 증가시키도록하는 폴리펩티드가 증식을 유도할 수 있는 것으로 여겨진다.
세포내 인터페론-γ 또는 인터루킨-12의 생산을 자극시키는 폴리펩티드의 능력은 세포를 폴리펩티드와 접촉시키고 세포에 의해 제조된 인퍼페론-γ 또는 인터루킨-12의 농도를 측정함으로써 평가될 수 있다. 일반적으로 약 105세포의 평가를 위해 충분한 폴리펩티드의 양은 약 10ng/mL 내지 100㎍/mL의 범위이고 바람직하게는 약 10㎍/mL이다. 폴리펩티드는 문헌[미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호]에 기술된 바와 같이 비드 또는 생분해될 수 있는 미세구와 같은 고체 지지체상에 고정화될 수 있지만 그럴 필요는 없다. 세포와 함께 폴리펩티드의 배양은 전형적으로 약 6일동안 37℃에서 수행된다. 폴리펩티드와의 배양에 이어서 세포는 인터페론-γ 및/또는 인터루킨-12(이의 하나 이상의 서브유니트)를 위해 검정될 수 있고 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA) 또는 IL-12 P70 서브유니트 경우에 T세포의 증식을 측정하는 분석과 같은 생분석과 같이 당해 분야의 기술자에게 공지된 방법으로 평가될 수 있다. 일반적으로 배양된 상등액(mL당 104-105세포 포함)의 mL당 50pg이상의 인터페론-γ를 생산할 수 있는 폴리펩티드는 인터페론-γ의 생산을 자극할 수 있는 것으로 여겨진다. 105대식세포 또는 B 세포당(또는 3×105PBMC당) 10pg/mL 이상의 P70 서브유니트 및/또는 100pg/ml이상의 IL-12 P40 서브유니트의 생산을 자극하는 폴리펩티드는 IL-12의 생산을 자극할 수 있는 것으로 여겨진다.
일반적으로 면역원성 항원은 약 25% 이상의 엠.튜버큘로시스-면역 한자로부터 유래된 T 세포, NK 세포, B 세포 및/또는 대식세포에서 증식 및/또는 사이토킨 생산(예를들어 인터페론-γ 및/또는 인터루킨-12의 생산)을 자극하는 항원이다. 이들 면역원성 항원 중에서 월등한 치료적 성질을 갖는 폴리펩티드는 상기 분석에서 반응 정도 및 반응이 관찰되는 환자의 퍼센트를 근거로 구분될 수 있다. 추가로 월등한 치료적 성질을 갖는 항원은 엠.튜버큘로시스 면역원성이 아닌 25% 이상의 환자로부터 유래된 세포에서 시험관내 증식 및/또는 사이토킨 생산을 자극시키지는 않음으로써 특이적으로 엠. 튜버큘로시스 반응 세포로 인한 것이 아닌 반응을 배제한다. 엠. 튜버큘로시스 면역 환자로부터 높은 비율의 T 세포, NK 세포, B 세포 및/또는 대식세포 제제중에 반응을 유도하는 항원(또 다른 환자로부터 세포 제제중에 낮은 빈도의 반응)은 월등한 치료적 성질을 갖는다.
월등한 치료적 성질을 갖는 항원은 또한 백신으로서 투여되는 경우 실험동물에서 심각한 엠.튜버큘로시스 감염을 저하시킬 수 있는 능력을 근거로 구분될 수 있다. 실험 동물상에 사용하기에 적합한 백신 제제는 하기에 상세히 기술되어 있다. 효능은 미생물 수에 있어서 50% 이상의 감소 및/또는 실험적인 감염에 따른 치사율의 약 40% 이상의 감소를 제공하는 항원의 능력을 기준으로 결정될 수 있다. 적합한 실험 동물은 마우스, 기니아 피그 및 프리메이트를 포함한다.
월등한 진단 성질을 갖는 항원은 일반적으로 활성 결핵을 가진 환자에서 수행되는 피내 피부 시험에서 반응을 유도하는 능력을 기준으로 확인될 수 있지만 엠. 튜버큘로시스로 감염되지 않은 사람에게서 수행된 테스트에서는 확인되지 않는다.
본원에 기술된 항원의 면역원성 일부는 문헌[참조: Paul, Fundamental Immunology, 3d ed, Raven Press, 1993, pp. 243-247]에 기술된 바와 같은 공지된 기술을 사용하여 제조되고 동정된다. 상기 기술은 면역원성 성질에 대한 고유 항원의 폴리펩티드 부분의 검색을 포함한다. 본원에 기술된 대표적인 증식 및 사이토킨 생산 분석은 일반적으로 이들 검색에서 사용될 수 있다. 폴리펩티드의 면역원성 일부는 상기 대표적인 분석내에서 완전한 길이의 항원에 의해 발생할 수 있는 것과 상당히 유사한 면역 반응(예를들어, 증식, 인터페론-γ 생산 및/또는 인터루킨-12 생산)을 발생시키는 부분이다. 또 다른 말로 항원의 면역원성 부분은 본원에 기술한 모델 증식 분석에서 완전한 길이의 항원에 의해 유도된 약 20% 이상 및 바람직하게는 약 100%이상의 증식을 일으킬 수 있다. 또한 면역원성 부분은 본원에 기술한 모델 증식 분석에서 완전한 길이의 항원에 의해 유도된 약 20% 이상 및 바람직하게는 약 100%이상의 인터페론-γ 및/또는 인터루킨-12의 생산을 자극할 수 있다.
엠. 튜버큘로시스 항원의 일부 및 또 다른 변형체는 합성 또는 재조합 방법에 의해 합성될 수 있다. 약 100개의 아미노산 보다 적은 합성 폴리펩티드 및 일반적으로 약 50개 아미노산 보다 적은 합성 폴리펩티드가 당해 분야의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 합성될 수 있다. 예를들어 상기 폴리펩티드는 아미노산이 연속적으로 아미노산쇄에 첨가되는 메리필드 고체상 합성 방법과 같이 시판용 고체상 기술을 사용하여 합성될 수 있다[참조 문헌: Merifield, J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2146, 1963]. 폴리펩티드의 자동화된 합성을 위한 장치는 제조회사[Applied BioSystems. Inc., Foster City, CA]로부터 시판되고 제조회사의 지침에 따라 작동될 수 있다. 고유 항원의 변형체는 일반적으로 올리고뉴클레오타이드 지시된 부위 특이적 돌연변이와 같은 표준 돌연변이 기술을 사용하여 제조될 수 있다. DNA 서열의 절편이 또한 표준 기술을 사용하여 제거될 수 있어 절단된 폴리펩티드를 제조할 수 있다.
고유 항원의 일부 및/또는 변형체를 포함하는 재조합 폴리펩티드는 당해분야의 통상적인 기술자에게 공지된 다양한 기술을 사용하여 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열로부터 용이하게 제조될 수 있다. 예를들어, 재조합 단백질을 배양 배지로 분비하는 적합한 숙주/벡터 시스템의 상등액을 시판용 필터를 사용하여 농축시킨다 농축에 이어서 농축물을 친화성 마트릭스 또는 이온 교환 수지와 같은 적합한 정제 마트릭스에 적용시킬 수 있다. 최종적으로 하나 이상의 역상 HPLC 단계를 사용하여 추가로 재조합 단백질을 정제한다.
당해분야의 통상적인 기술자에게 공지된 다양한 발현 벡터를 사용하여 본 발명의 재조합 폴리펩티드를 발현시킨다. 발현은 재조합 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자를 포함하는 발현벡터로 형질전환되거나 형질감염된 적당한 숙주 세포에서 성취될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 원핵, 효모 및 고등 진핵 세포를 포함한다. 바람직하게, 사용되는 숙주 세포는 이. 콜리, 효모 또는 COS 또는 CHO 와 같은 포유동물 세포주이다. 상기 방법으로 발현된 DNA 서열은 천연적으로 존재하는 항원, 천연에 존재하는 항원의 일부 또는 이의 또 다른 변형체를 암호화할 수 있다.
일반적으로 제조 방법에 상관 없이 본원에 기술한 폴리펩티드는 상당히 순수한 형태로 제조된다. 바람직하게 폴리펩티드는 약 80% 이상 순수하고 보다 바람직하게는 약 90% 이상 및 가장 바람직하게는 약 99% 이상 순수하다. 하기에 상세히 기술한 몇몇 바람직한 양태에서 상당히 순수한 폴리펩티드는 본원에 기술한 하나이상의 방법에 사용하기 위해 약제학적 조성물 또는 백신으로 혼입된다.
몇몇 특정 양태에서, 본 발명은 하기의 N-말단 서열중 하나를 갖는 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원의 하나 이상의 면역원성 일부 또는 보전적인 치환 및/또는 변화에서만이 차이가 있는 이의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 기술하고 있다.
(a)Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu(서열 120);
(b)Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser(서열 121);
(c)Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg(서열 122);
(d)Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro(서열 123);
(e)Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val(서열 124);
(f)Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro(서열 125);
(g)Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser(서열 126);
(h)Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly(서열 127);
(i)Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn(서열 128);
(j)Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser(서열 134);
(k)Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Tyr-Ile-Tyr-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp(서열 135) 또는
(l)Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly(서열 136)
여기서 Xaa는 아미노산, 바람직하게는 시스테인 잔기이다.
상기 (g)와 같은 항원을 암호화하는 DNA 서열은 서열 52에 제공되고 서열 52에 의해 암호화된 폴리펩티드는 서열 53에 제공된다. 상기 (a)로서 한정된 항원을 암호화하는 DNA 서열은 서열 101로 제공되고 이의 추론된 아미노산 서열은 서열 102로 제공된다. 항원(d)에 따른 DNA 서열은 서열 24로 제공되고 항원 (c)에 따른 DNA 서열은 서열 25로 제공되며 항원(i)에 따른 DNA 서열은 서열 99로 제공되고 이의 추론된 아미노산 서열은 서열 100으로 제공된다.
추가의 특정 양태에서 본 발명은 하나이상의 N-말단 서열중 하나를 갖는 엠. 튜버큘로시스 항원의 하나이상의 면역원성 일부 또는 보존적인 치환체 및/또는 변화에서만이 차이가 있는 이의 변형체를 포함하는 폴리펩티드를 기술하고 있다.
(m)Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val(서열 137) 또는
(n)Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe(서열 129)
여기서 Xaa는 임의의 아미노산, 바람직하게는 시스테인 잔기일 수 있다.
또 다른 특정 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 1,2,4-10,13-15 및 52의 DNA 서열; (b) 상기 DNA 서열의 상보적인 서열 또는 (a) 또는 (b)의 서열과 상당히 상동성인 DNA 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하는 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원(또는 상기 항원의 변형체)의 하나 이상의 면역원성 일부를 포함하는 폴리펩티드를 기술하고 있다.
추가의 특정 양태에서, 본 발명은 (a) 서열 26 내지 51의 DNA 서열; (b) 상기 DNA 서열의 상보적인 서열 또는 (a) 또는 (b)의 서열과 상당히 상동성인 DNA 서열에 의해 암호화된 하나 이상의 아미노산 서열을 포함하고 가용성 이거나 가용성이 아닐수 있는 엠. 튜버큘로시스 항원(또는 상기 항원의 변형체)의 하나 이상의 면역원성 일부를 포함하는 폴리펩티드를 기술하고 있다.
상기 논의된 특정 양태에서, 엠. 튜버큘로시스 항원은 특히 본원에서 기술한 하나이상의 DNA 서열과 상당히 상동성인 DNA 서열에 의해 암호화된 변형체를 포함한다. 본원에 사용되는 "상당한 동족체는 중간 정도로 스트리전트 조건하에서 하이브리드화 할 수 있는 DNA 서열을 언급한다. 적합한 중간 정도의 스트린전트 조건은 5X SSC, 0.5% SDS, 1.0mM EDTA(pH 8.0)의 용액중에서 예비세척; 50 내지 65℃, 5X SSC 밤새 또는 교차종 동족체인 경우에 45℃, 0.5X SSC에서 하이브리드화에 이어서 0.1% SDS를 포함하는 각각의 2X, 0,5X 및 0.2X SSC를 20분동안 65℃에서 2회 세척함을 포함한다. 상기 하이브리드화 DNA 서열은 본 발명의 범위내에 있고 이는 코드 축퇴성으로 인해 하이브리드화 DNA 서열에 의해 암호화된 면역원성 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열이다.
관련 측면에서, 본 발명은 제1 및 제2 본 발명의 폴리펩티드, 또는 본 발명의 폴리펩티드 및 상기 기술한 38kD 항원 또는 ESAT-6(서열 103 및 104)와 같이 공지된 엠. 튜버큘로시스 항원을 포함하는 융합 단백질 및 이와 함께 융합 단백질의 변형체를 제공한다. 본 발명의 융합 단백질은 또한 제1 및 제2 폴리펩티드간의 링커 펩티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 융합 단백질을 암호화하는 DNA 서열은 공지된 재조합 DNA 기술을 사용하여 제1 및 제2 폴리펩티드를 암호화하는 분리된 DNA 서열을 적당한 발현벡터에 융합시켜 작제된다. 제1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 3'말단은 펩티드 링커의 존재 또는 부재하에서 제2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'말단에 연결되어 서열의 판독 프레임이 2개의 DNA 서열의 mRNA가 제1 및 제2 폴리펩티드 모두의 생물학적 활성을 보유하는 단일 융합 단백질로 해독될 수 있도록한다.
펩티드 링커 서열이 사용되어 각각의 폴리펩티드가 이의 2차 및 3차 구조로 폴딩되기에 충분한 거리에 의해 제1 및 제2 폴리펩티드를 분리시킬 수 있다. 상기 펩티드 링커 서열은 당해 분야에 공지된 표준 기술을 사용하여 융합단백질로 삽입된다. 적합한 링커 서열은 하기의 인자를 근거로 선택될 수 있다: (1) 연장된 유동성 형태를 적용시킬 수 있는 능력; (2) 제1 및 제2 폴리펩티드상에 기능적 에피토프와 작용할 수 있는 제2차 구조를 적용시킬 수 없는 능력; 및 (3) 폴리펩티드 기능성 에피토프와 작용할 수 있는 소수성 또는 전하를 나타내는 잔기의 부재. 발람직한 펩티드 링커 서열은 Gly, Asn 및 Ser 잔기를 포함한다. 또 다른 인접한 중성 아미노산(예: Thr 및 Ala)이 링커 서열에 사용될 수 있다. 링커로서 유용하게 사용될 수 있는 아미노산 서열은 문헌[참조: Maratea et al., Gene 40:39-46, 1985; Murphy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:8258-8262, 1986; 미국 특허 제4,935,233호 및 미국 특허 제4,751,180호]에 기술된 것을 포함한다. 링커 서열은 1 내지 50개의 아미노산 길이 일 수 있다. 펩티드 서열은 제1 및 제2 폴리펩티드가 기능적 도메인을 분리하고 입체 간섭을 예방하는데 사용될 수 있는 비필수 N-말단 아미노산 영역을 갖는 경우에 요구되지 않는다.
연결된 DNA 서열은 적합한 전사 또는 해독 조절 성분과 연결된다. DNA 발현에 대해 책임지는 조절 성분은 단지 제1 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열의 5'에 위치한다. 유사하게 종결 코돈은 해독을 종료하는데 요구되고 전사 종결 신호는 단지 제2 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 서열에 대한 3'에 존재한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 하나 이상의 상기 폴리펩티드 또는 융합 단백질(또는 상기 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 분자)를 사용하여 환자의 결핵에 대한 보호 면역을 유도하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같이 "환자"는 몇며처 온혈 동물, 바람직하게는 사람을 언급한다. 환자는 질환으로 고통을 받을 수 있거나 감지할 만한 질환 및/또는 감염이 없을 수 있다. 다른 말로 보호 면역은 결핵을 예방하거나 치료하도록 유도될 수 있다.
상기 측면에서, 폴리펩티드, 융합 단백질 또는 DNA 분자는 일반적으로 약제학적 조성물 및/또는 백신내에 존재한다. 약제학적 조성물은 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있고 이들 각각은 하나 이상의 상기 서열(또는 이의 변형체) 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 백신은 하나이상의 상기 폴리펩티드 및 비특이적인 면역 반응 인핸서[예: 애쥬반트 또는 리포좀(여기에 폴리펩티드가 포집됨]를 포함한다. 상기 약제학적 조성물 및 백신은 또한 조합 폴리펩티드로 삽입되거나 분리된 폴리펩티드내에 존재하는 또 다른 엠. 튜버큘로시스 항원을 포함할 수 있다.
또한 백신은 상기 기술한 바와 같은 폴리펩티드를 암호화하는 DNA를 포함하여 폴리펩티드가 그위치에서 합성되도록한다. 상기 백신에서 DNA는 핵산 발현 시스템, 세균 및 바이러스 발현 시스템을 포함하여 당해분야의 통상적인 기술자에게 공지된 임의의 다양한 전달 시스템내에 존재할 수 있다. 적당한 핵산 발현 시스템은 환자내에서 발현을 위해 필요한 DNA 서열(예: 적합한 프로모터 및 종료 신호)를 포함한다. 세균 전달 시스템은 세포 표면에 폴리펩티드의 면역원성 부분을 발현하는 세균(예: 바시러스-칼메트-구에린)의 투여를 포함한다. 바람직한 양태에서, DNA는 비병원성(결함) 복제 능력 바이러스의 사용을 포함할 수 있는 바이러스 발현 시스템(백시니아 또는 또다른 폭스 바이러스, 레트로바이러스 또는 아데노바이러스)을 사용하여 도입될 수 있다. DNA를 상기 발현 시스템으로 삽입하기 위한 기술은 당해분야의 기술자에게 공지되어 있다. DNA는 또한 문헌[Ulmer et al., Science 259:1745-1749, 1993 and Cohen, Science 259:1691-1692, 1993]에서 기술된 바와 같이 네이키드(naked)일 수 있다. 네이키드 DNA의 흡수는 생분해될 수 있는 비드로 DNA를 코팅하여 증가될 수 있고 이는 DNA가 효과적으로 세포로 운반된다.
관련된 측면에서, 상기 기술한 바와 같은 DNA 백신은 본 발명의 폴리펩티드 또는 상기 기술한 38kD 항원과 같은 공지된 엠. 튜버큘로시스 항원중 하나와함께 동시에 또는 연속적으로 투여된다. 예를들어 상기 기술한 바와 같이 네이키드 또는 전달 시스템내의 본 발명의 폴리펩티드를 암호화하는 DNA 투여에 이어서 항원을 투여하여 백신의 보호 면역 효과를 증가시킬 수 있다.
투여량 뿐만아니라 투여 경로 및 회수는 개인마다 다양하고 현재 BCG를 사용한 면역에 사용되는 것과 병행될 수 있다. 일반적으로 약제학적 조성물 및 백신은 주사(예: 피내, 근육내, 정맥내 또는 피하내) 또는 비강내(예: 흡입) 또는 경구적으로 투여될 수 있다. 1 내지 3회의 투여가 1 내지 36주동안 투여될 수 있다. 바람직하게, 3회 투여는 3 내지 4개월 간격으로 투여되고 부스터 백신화는 이후 주기적으로 주어질수 있다. 또 다른 프로토콜은 각각의 환자를 위해 적당할 수 있다. 적합한 투여량은 상기 기술된 바와 같이 투여되는 경우 적어도 1 내지 2년동안 엠. 튜버큘로시스 감염으로부터 환자를 보호하기에 충분한 면역화된 환자의 면역 반응을 상승시킬 수 있는 폴리펩티드 또는 DNA의 양이다. 일반적으로 투여량에 존재하는 폴리펩티드의 양(또는 투여량내 DNA에 의해 동일계에서 제조됨)은 숙주의 kg당 약 1pg 내지 약 100mg, 전형적으로는 약 10pg 내지 약 1mg이고 바람직하게는 약 100pg 내지 약 1㎍이다. 적합한 투여량은 환자의 크기에 따라 다양하지만 전형적으로 약 0.1mL 내지 약 5mL이다.
당해분야의 기술자에게 공지된 임의의 적합한 담체가 본 발명의 약제학적 조성물중에 사용되는 반면에 담체 유형은 투여방식에 따라 다양하다. 피하주사와 같은 비경구 투여를 위해 바람직한 담체는 물, 식염수, 알콜, 지방, 왁스 또는 완충액을 포함한다. 경구투여를 위해서는 상기 담체중 하나 또는 고체 담체(예: 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 탈컴, 셀룰로즈, 글루코즈, 슈크로즈 및 탄산 마그네슘)가 사용될 수 있다. 생분해될 수 있는 미세구(예: 폴리락틱 갈락티드)는 또한 본 발명의 약제학적 조성물을 위한 담체로서 사용될 수 있다. 적합한 생분해될 수 있는 미세구는 예를들어 미국 특허 제4,897,268호 및 제5,075,109호에 기술되어 있다.
임의의 다양한 애쥬반트는 본 발명의 백신에 사용되어 비특이적으로 면역 반응을 증가시키는데 사용될 수 있다. 대부분의 애쥬반트는 신속한 이화작용으로부터 항원을 보호하도록 디자인된 물질 예를들어 수산화알루미늄 또는 미네랄 오일 및 리피드 A, 보르타델라 페르투시스 또는 마이코박테리움 튜버큘로시스와 같은 면역반응의 비특이적 자극제를 포함한다. 적합한 애쥬반트는 예를들어 푸룬트의 불완전한 애쥬반트 및 푸룬트의 완전한 애쥬반트(디프코 래보라토리즈) 및 머크 애쥬반트 65(뉴저지주 라웨이 소재의 머크 및 캄파니 인코포레이티드) 로서 시판되고 있다. 또 다른 적합한 애쥬반트는 알룸, 생분해될 수 있는 미세구, 모노포스포릴 리피드 A 및 쿠일 A를 포함한다.
또 다른 측면에서, 본 발명은 상기 기술한 바와 같은 하나 이상의 폴리펩티드를 사용하여 피부 시험을 사용한 결핵을 진단하는 방법을 제공한다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "피부 시험"은 지연형 과민성(DTH)반응(예: 팽윤, 조홍 또는 피부염)이 상기 기술한 하나 이상의 폴리펩티드를 피내 주사함에 따라 관찰되는 환자에게 직접적으로 수행되는 임의의 분석이다. 상기 주사는 투베르쿨린 주사기 또는 1mL 주사기와 같은 환자의 표피 세포와 폴리펩티드 또는 폴리펩티드들을 접촉시키기에 충분한 적합한 장치를 사용하여 성취될 수 있다. 바람직하게 주사한지 적어도 48시간후 보다 바람직하게는 48 내지 72시간후에 반응이 관찰된다.
DTH 반응은 이전에 시험 항원(예: 사용된 폴리펩티드의 면역원성 부분, 또는 이의 변형체)에 노출된 환자내에서 보다 큰 세포 매개 면역 반응이다. 반응은 자를 사용하여 가시적으로 관찰될 수 있다. 일반적으로 직경 약 5㎝보다 큰, 바람직하게는 직경 약 1.0㎝보다 큰 반응은 양성 반응으로서 이는 활성 질환으로 진전되거나 진전되지 않을 수 있는 결핵 감염을 나타낸다.
본 발명의 폴리펩티드는 바람직하게 상기 기술한 바와 같은 폴리펩티드 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물로서 피부 시험에 사용하기 위해 제형화된다. 상기 조성물은 전형적으로 1.0ml 용적내에 약 1㎍ 내지 약 100㎍, 바람직하게는 약 10㎍ 내지 약 50㎍ 범위의 양으로 하나 이상의 상기 폴리펩티드를 포함한다. 바람직하게 상기 약제학적 조성물에 사용되는 담체는 적당한 방부제(예: 페놀 및/또는 트윈 80TM)와 함께 식염수 용액이다.
바람직한 양태에서 피부 시험에 사용되는 폴리펩티드는 충분한 크기로서 반응 지속 기간도안 주사부위에 남아있다. 일반적으로 9개 이상의 아미노산 길이인 폴리펩티드가 충분하다. 폴리펩티드는 또한 바람직하게 주사후 수시간이내에 대식세포에 의해 분해되어 T-세포에 제공된다. 상기 폴리펩티드는 반복되는 하나 이상의 상기 서열 및/또는 또다른 면역원성이거나 비면역원성인 서열을 포함할 수 있다.
하기 실시예는 설명하기위해 제공된 것으로서 제한하지 않는다.
실시예 1
엠. 튜버큘로시스 배양 여과물로부터 폴리펩티드의 정제 및 특징화
본 실시예는 배양 여과물로부터 엠. 튜버큘로시스 가용성 폴리펩티드의 제조를 설명한다. 다른 언급이 없다면 하기 실시예의 모든 퍼센테이지는 용적당 중량이다.
엠. 튜버큘로시스(H37Ra, ATCC 25177, 또는 H37Rv, ATCC 25618)를 14일동안 37℃에서 멸균된 GAS 배지에서 배양한다. 이어서 배지를 0.45u 여과기를 통해 멸균된 2.5L 용기로 진공 여과한다(세포가 걸러진다). 이어서 배지를 0.2u 여과기를 통해 멸균된 4L 용기에 여과시키고 NaN3를 0.04%의 농도로 배양 여과물에 첨가한다. 용기를 4℃ 냉동실에 놓는다.
배양 여과물을 여과물을 오토클레이브된 12L 저장고에 놓고 여과물을 메탄올로 세척되고 10,000 kDa MWCO 막을 포함하는 400ml 아미콘 교반 세포에 주입시킴으로써 농축한다. 압력을 질소가스를 사용하여 60psi에서 유지시킨다. 상기 방법은 12L 용적을 약 50ml로 감소시킨다.
배양 여과물을 8,000kDa MWCO 셀룰로즈 에스테르 막을 사용하여 0.1% 탄산수소 암모늄으로 투석하고 2회에 걸쳐 탄산수소 암노늄 용액을 갈아준다. 단백질 농도를 시판되고 있는 BCA 분석(Pierce, Rockford, IL)으로 결정한다.
투석된 배양 여과물을 냉동건조시키고 폴리펩티드를 증류수에 재현탁시킨다. 폴리펩티드를 음이온 교환 크로마토그래피를 위한 초기 조건인 0.01mM 1,3 비스[트리스(하이드록시메틸)-메틸아미노]프로판, pH 7.5(비스-트리스 프로판 완충액)에 대해 투석한다. 0.01mM 비스-트리스 프로판 완충액 pH 7.5로 평형화시킨 POROS 146II Q/M 음이온 교환 칼럼 4.6mm×100mm(Perseptive BioSystems, Framingham, MA)상에서 겔 프로퓨전 크로마토그래피(gel profusion chromatography)를 사용하여 수행한다. 폴리펩티드를 상기 완충액 시스템중에서 0 내지 0.5M NaCl 선형 농도 구배로 용출시킨다. 칼럼 용출액을 220nm에서 조사한다.
음이온 교환 칼럼에서 용출시킨 폴리펩티드를 증류수에 대해 투석하고 동결건조시킨다. 수득한 물질을 물중의 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA) pH 1.9중에 용해시키고 폴리펩티드를 델타-파크 C18 칼럼(Waters, Milford, MA) 300 옴스트롱 세공 크기, 5마이크론 입자 크기(3.9×150mm) 상에서 정제한다. 폴리펩티드를 0 내지 60% 희석 완충액(아세토니트릴중의 0.1% TFA)으로부터 선형 농도 구배로 칼럼으로부터 용출시킨다. 용출속도는 0.75ml/분이고 HPLC 용출액을 214nm에서 검색한다. 용출된 폴리펩티드를 포함하는 분취물을 수거하여 각각의 샘플의 순도를 극대화시킨다. 약 200개의 정제된 폴리펩티드를 수득한다.
이어서 정제된 폴리펩티드를 PBMC 제제중에 T-세포 증식을 유도할 수 있는 능력에 대해 검색된다. PPD 피부 시험 양성이고 T-세포가 PPD 및 MTB의 가용성 조단백질에 응답하여 증식하는 것으로 공지된 공여자의 PBMCs를 10% 풀된 사람 혈청 및 50㎍/ml 젠타마이신으로 보충된 RPMI 1640을 포함한 배지에서 배양한다. 정제된 폴리펩티드을 0.5 내지 10㎍/ml의 농도에서 2회 첨가한다. 200㎕용적의 50㎕ 배지중의 96웰 환저 플레이트에서 6일동안 배양한 후에 하기에 기술된 바와 같이 IFN-γ 농도 결정을 위해 각각의 웰에서 제거한다. 플레이트를 1uCi/웰의 삼중 수소화된 티미딘으로 추가로 18시간동안 펄스시키고 수거하여 가스 섬광 계수기를 사용하여 삼중수소수의 취득량을 결정한다. 단독의 배지에서 배양된 세포에서 관찰되는 증식 보다 3배이상 높은 2개의 복제물중에서 증식한 분취물은 양성인 것으로 사료된다.
IFN-γ를 효소 연결 면역흡착 분석(ELISA)을 사용하여 측정한다. ELISA 플레이트를 실온에서 4시간동안 PBS중에서 사람 IFN-γ에 대한 마우스 모노클로날 항체로 코팅시킨다. 웰을 실온에서 1시간동안 5%(W/V) 무지방 건조 우유를 포함한 PBS로 차단시킨다. 이어서 플레이트를 PBS/0.2% 트윈-20중에서 6회 세척하고 ELISA 플레이트중에 배양 배지에서 1:2로 희석된 샘플을 실온에서 밤새 배양한다. 플레이트를 다시 세척하고 PBS/10% 정상 산양 혈청중에 1:3000으로 희석된 폴리클로날 래빗 항사람 IFN-γ혈청을 각각의 웰에 첨가한다. 플레이트를 실온에서 2시간동안 배양하고 고추냉이 퍼옥시다제-커플링 항래빗 IgG(Sigma Chemical So., St. Louis, MO)를 PBS/5% 무지방 건조 밀크중에서 1:2000 희석액으로 첨가한다. 추가로 실온에서 2시간 배양한후에 플레이트를 세척하고 TMB 기질을 첨가한다. 반응을 1N 황산으로 20분후에 종료시킨다. 광학 밀도를 기준 파장으로서 570nm를 사용하여 450nm에서 결정한다. 단독의 배지에서 배양된 세포에서 평균 OD 보다 3배 이상 큰 OD와 더불어 3 표준 이탈을 보이는 2개의 복제물을 수득한 분취물은 양성인 것으로 사료된다.
서열화를 위해 폴리펩티드는 각각 바이오브렌TM(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA) 처리된 유리 섬유 여과기상으로 건조시킨다. 폴리펩티드와 함께 여과기를 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템 디비젼 프로사이즈 492 단백질 서열화기상에 로딩한다. 폴리펩티드를 아미노 말단으로부터 통상적인 에드만 화학을 사용하여 서열화한다. 아미노산 서열을 각각의 폴리펩티드에 대해 적당한 PTH 표준 유도체에 대한 PTH 아미노산 유도체의 체류시간을 비교함으로써 결정한다.
상기 기술한 방법을 사용하여 하기의 N-말단 서열을 갖는 항원을 분리한다:
(a)Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Xaa-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu(서열 54)
(b)Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ser(서열 55)
(c)Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg(서열 56)
(d)Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro(서열 57)
(e)Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val(서열 58)
(f)Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro(서열 59)
(g)Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Ala-Ala-Pro-Pro-Ala(서열 60) 및
(h)Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly(서열 61)
여기서 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다
추가의 항원은 마이크로보어 HPLC 정제 단계 및 상기 기술한 방법을 사용하여 분리한다. 특히 이전에 기술한 크로마토그래프 정제 단계로부터 항원의 혼합물을 포함한 20㎕의 분취물을 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼 모델 172 HPLC의 7마이크론 세공 크기, 칼럼 크기 1mm×100mm을 갖는 아쿠아포어 C18 칼럼(Perkin Elmer/Applied Biosystems Division, Foster City, CA)상에서 정제한다. 분취물을 유동속도 80㎕/분에서 물(0.05% TFA)중의 아세토니트릴(0.05% TFA 포함)의 1%/분 선형 농도 구배로 칼럼으로부터 용출시킨다. 용출물을 250nm에서 검색한다. 최초 분취물을 4개의 주요 피크 및 또 다른 작은 성분으로 분리하고 분자량 12,054Kd(질량 분광분석) 및 하기 N-말단 서열을 갖는 것으로 나타난 폴리펩티드를 수득한다.
(i)Asn-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Gln-Thr-Ser-Leu-Leu-Asn-Asn-Leu-Ala-Asp-Pro-Asp-Val-Ser-Phe-Ala-Asp(서열 62)
상기 폴리펩티드는 상기 기술한 방법을 사용하는 PBMC 제제중에서 증식 및 IFN-γ 생산을 유도하는 것으로 나타났다.
추가의 가용성 항원을 하기와 같이 엠. 튜버큘로시스 배양 여과물로부터 분리한다. 엠. 튜버큘로시스 배양 여과물을 상기 기술한 바와 같이 제조한다. pH 5.5 분획물에서 비스-트리스 프로판 완충액에 대한 하기의 투석을 비스-트리스 프로판 완충액 pH 5.5로 평형화시킨 포로스 QE 칼럼 4.5×100mm(Perspective Biosystems)상에서 음이온 교환 크로마토그래피를 사용하여 수행한다. 폴리펩티드를 유동속도 10ml/분에서 상기 완충 시스템중에서 0 내지 1.5M NaCl 선형 농도 구배로 용출시킨다. 칼럼 용출물을 214nm 파장에서 검색한다.
이온 교환 칼럼으로부터 용출하는 분취물을 풀화시키고 포로스 R2 칼럼 4.6×100mm(Perspective Biosystems)을 사용하여 역상 크로마토그래피한다. 폴리펩티드를 유동속도 5ml/분에서 0 내지 100% 아세토니트릴(0.1% TFA) 선형 농도 구배하여 칼럼으로부터 용출시킨다. 용출물을 214nm에서 검색한다.
용출된 폴리펩티드를 포함한 분취물을 동결건조시키고 수성 0.1% TFA 80㎕중에 재현탁시키고 추가로 비닥 C4 칼럼 4.6×150mm(Western Analytical, Temecula, CA)상에서 유동속도 2ml/분의 0 내지 100% 아세토니트릴(0.1% TFA)와 함께 역상 크로마토그래피한다. 용출물을 214nm에서 검색한다.
생물학적 활성을 갖는 분취물을 하나의 주요 피크 및 또다른 소형 성분들로 분리한다. 상기 피크를 PVDF 막상에 웨스턴 블롯하여 분자량 14Kd, 20Kd 및 26Kd의 3개의 주요 밴드를 나타낸다. 이들 폴리펩티드는 각각 하기의 N-말단 서열을 갖는 것으로 결정된다:
(j)Xaa-Asp-Ser-Glu-Lys-Ser-Ala-Thr-Ile-Lys-Val-Thr-Asp-Ala-Ser(서열 134)
(k)Ala-Gly-Asp-Thr-Xaa-Ile-Val-Gly-Asn-Leu-Thr-Ala-Asp(서열 135) 및
(l)Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly(서열 136)
여기서 Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다.
상기 기술한 분석을 사용하여 이들 폴리펩티드가 PBMC 제중에서 증식 및 IFN-γ생산을 유도하는 것으로 나타났다. 도 1A 및 B는 각각 제1 및 제2 공여자로부터의 PBMC 제제를 사용한 상기 분석의 결과를 보여준다.
상기 (a), (b), (d) 및 (g)로서 명명된 항원을 암호화하는 DNA 서열은 N-말단 서열에 상응하고 엠.튜버큘로시스 코돈 성향을 포함한 32P 말단 라벨링된 퇴화성 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 게놈 엠. 튜버큘로시스 라이브러리를 검색함으로써 수득된다. 상기 (a)에 상응하는 프로브를 사용하여 수행된 검색을 통하여 서열 101에 제공된 서열을 갖는 클론을 확인한다. 서열 101에 의해 암호화된 폴리펩티드는 서열 102에 제공된다. 상기 (g)에 상응하는 프로브를 사용하여 수행된 검색을 통하여 서열 52에 제공된 서열을 갖는 클론을 확인한다. 서열 52에 의해 암호화된 폴리펩티드는 서열 53에 제공된다. 상기 (d)에 상응하는 프로브를 사용하여 수행된 검색을 통하여 서열 24에 제공된 서열을 갖는 클론을 확인하고 상기 (c)에 상응하는 프로브를 사용하여 수행된 검색을 통하여 서열 25에 제공된 서열을 갖는 클론을 확인한다.
상기 아미노산 서열을 DNA STAR 시스템을 사용하여 유전자 은행에서 공지된 아미노산 서열과 비교한다. 검색된 데이터베이스는 약 173,000 단백질을 포함하고 해독된 단백질 서열(버젼 87)에 따른 스위스, PIR 데이터베이스와의 조합이다. 항원 (a) 내지 (h) 및 (l)에 대한 아미노산 서열과의 어떠한 상당한 상동성이 검출되지 않았다.
항원 (i)에 대한 아미노산 서열은 엠. 레프라(M. leprae)의 서열과 상동성인 것으로 밝혀졌다. 완전한 길이의 엠.레프라 서열은 유전자은행에서 수득된 서열을 사용하여 게놈 DNA로부터 증폭된다. 이어서 상기 서열은 실시예 2에서 기술한 엠.튜버큘로시스 라이브러리를 검색하는데 사용되고 엠.튜버큘로시스 상동체의 완전한 길이의 복사체를 수득한다(서열 99).
항원(i)에 대한 아미노산 서열이 DNA 서열로부터 해독된 공지된 엠.튜버큘로시스 단백질과 상동성인 것으로 밝혀졌다. 발명가의 최선의 지식을 토대로 상기 단백질이 T-세포 자극 활성을 소유한 것으로 이전에 나타나지 않았다. 항원 (k)에 대한 아미노산 서열은 엠.레프라의 서열과 관계된 것으로 밝혀졌다.
상기 기술한 증식 및 IFN-γ분석에 있어서, 3개의 PPD 양성 공여자를 사용하여 상기 제공된 대표적인 항원에 대한 결과가 표 1에 제공된다:
| 서열 | 증식 | IFN-γ |
| (a) | + | - |
| (c) | +++ | +++ |
| (d) | ++ | ++ |
| (g) | +++ | +++ |
| (h) | +++ | +++ |
표 1에서 2 내지 4(단독으로 배지중에서 배양된 세포와 비교)의 자극 지수(SI)가 주어진 반응을 +로서 표시하고 1㎍이하의 농도에서 4 내지 8 또는 2 내지 4는 ++로서 표시하며 8초과의 SI는 +++로서 표시한다. 서열(i)의 항원은 증식 및 IFN-γ 분석 모두에 있어서 한 공여자에 대해서는 높은 SI(+++)를 갖고 또 다른 두 개의 공여자에 대해서는 보다 낮은 SI(++ 및 +)를 갖는 것으로 밝혀졌다. 이들 결과는 이들 항원이 증식 및/또는 인터페론-γ 생산을 유도할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 2
엠. 튜버큘로시스 항원을 분리하기 위한 환자 혈청의 용도
본 실시예는 엠.튜버큘로시스 감염 환자의 혈청과 함께 검색함으로써 엠. 튜버큘로시스 용해질로부터 항원의 분리를 설명한다.
데시케이팅된 엠. 튜버큘로시스 H37Ra(디프코 래보라토리즈)를 2% NP40 용액에 첨가하고 또한 균질화시키며 3회 초음파 처리한다. 수득한 현탁액을 마이크로퓨즈 시험관중에서 13,000rpm으로 원심분리하고 상등액을 0.2 마이크론 주사 여과기에 통과시킨다. 여과물을 마크로 프렙 DEAE 비드(BioRad, Hercules, CA)에 고정시킨다. 상기 비드를 20mM 트리스 pH 7.5로 광범위하게 세척하고 결합한 단백질을 1M NaCl로 용출시킨다. 1M NaCl 용출물을 10mM 트리스, pH 7.5에 대해 밤새 투석한다. 투석된 용액을 실온에서 30분동안 0.05mg/ml에서 DNase 및 RNAase로 처리하고 이어서 실온에서 3 내지 4시간 동안 pH 4.5에서 α-D-만노시다제로 처리한다. pH 7.5로 전환시킨 후에 물질을 바이오 스케일-Q-20 칼럼(BioRad)상에 FPLC을 통해 분획한다. 분획물을 9개의 풀중에 혼합하고 센트리프렙 10(Amicon, Beverley, MA)중에서 농축하며 이어서 본 발명의 다른 항원과 함께 면역반응성이 없는 엠. 튜버큘로시스 감염 환자의 혈청 풀을 사용하는 혈청학적 활성에 대해 웨스턴 블롯으로 검색한다.
대부분의 반응성 분취물을 SDS-PAGE에 걸고 PVDF로 전달한다. 약 85Kd의 밴드를 절단하여 하기 서열을 수득한다:
(m)Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val(서열 137)(여기서, Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다).
상기 서열과 상기 기술된 유전자 은행의 비교는 공지된 서열과 어떠한 상당한 상동성을 나타내지 않는다.
실시예 3
엠. 튜버큘로시스 항원을 암호화하는 DNA 서열의 제조
본 실시예는 엠. 튜버큘로시스로 감염된 환자로부터 수득한 혈청 또는 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원에 대한 항혈청으로 엠. 튜버큘로시스 발현 라이브러리를 검색함으로써 엠. 튜버큘로시스 항원을 암호화하는 DNA 서열의 제조를 설명한다.
A. 래빗 항혈청을 사용하는 엠. 튜버큘로시스 가용성 항원의 제조
게놈 DNA를 엠. 튜버큘로시스 균주 H37Ra로부터 분리한다. DNA는 무작위로 절단하고 람다 ZAP 발현 시스템(Stratagene, La Jolla, CA)을 사용한 발현 라이브러리를 작제하는데 사용한다. 래빗 항혈청을 엠.튜버큘로시스 배양의 농축된 상등액을 사용하여 래빗을 면역화시킴으로써 엠. 튜버큘로시스 균주 H37Ra, H37Rv의 분비 단백질에 대해 합성한다. 특히 래빗을 10㎍ 무라밀 디펩티드(Calbiochem. La Jolla, CA) 및 1ml의 불완전한 푸룬트 애쥬반트를 포함하는 2ml의 용적중에 200㎍의 단백질 항원을 사용하여 피하내 면역화시킨다. 4주후에 래빗을 불완전한 푸룬트 애쥬반트중에 100㎍ 항원으로 피하내 부스팅시킨다. 최종적으로 래빗을 50㎍ 단백질 항원을 사용하여 피하내 면역화시킨다. 항혈청을 사용하여 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989]에 기술된 바와 같은 발현 라이브러리를 검색하는데 사용한다. 면역원성 항원을 발현하는 박테리아파아지 플라크를 정제한다. 플라크로부터 파지미드를 분리하고 엠.튜버큘로시스 클론의 뉴클레오타이드 서열을 추론한다.
32개의 클론을 정제한다. 이들 중에서 25개가 이전에 사람 엠.튜버큘로시스에서 확인되지 않은 서열을 나타낸다. 재조합 항원을 발현하고 실시예 1에서 기술한 면역학적 분석에서 사용되는 항원을 정제한다. 단백질을 IPTG로 유도하고 문헌[참조: Skeiky et al., J. Exp. Med. 181:1527-1537, 1995]에 기술된 바와 같은 겔 용출에 의해 정제한다. 상기 검색에서 확인된 DNA 분자의 대표적인 서열은 서열 1 내지 25에 제공된다. 상응하는 예상된 아미노산 서열은 서열 63 내지 87에 나타낸다.
상기 기술한 데이터베이스를 사용하는 유전자 은행에서 공지된 서열과 이들 서열을 비교하여 이후에 TbRA2A, TbRA16, TbRA18 및 TbRA29(서열 76, 68, 70, 75)로서 언급되는 클론이 마이코박테리움 레프라에서 이전에 확인된 서열과 몇몇 상동성을 나타내지만 엠. 튜버큘로시스에서는 상동성을 나타내지 않는 것으로 나타났다. TbRA11, TbRA26, TbRA28 및 TbDPEP(서열 65, 73, 74, 53)는 이전에 엠. 튜버큘로시스에서 확인되지 않았다. 어떠한 상당한 상동성이 TbRA1, TbRA3, TbRA4, TbRA9, TbRA10, TbRA13, TbRA17, TbRA19, TbRA29, TbRA32, TbRA36 및 오버랩된 클론 TbRA35 및 TbRA12(서열 63, 77, 81, 82, 64, 67, 69, 71, 75, 78, 80, 79, 66)에서 발견되지 않았다. 클론 TbRa24는 클론 TbRa29와 오버랩핑된다.
대표적인 재조합 항원상에 수행되고 여러명의 다른 엠. 튜버큘로시스 면역 환자로부터의 T-세포를 사용한 PBMC 증식 및 인터페론-γ 분석의 결과는 각각 표 2 및 표 3에 제공된다.
표 2 및 3에서 2 내지 4(단독으로 배지중에서 배양된 세포와 비교)의 자극 지수(SI)가 주어진 반응을 +로서 표시하고 1㎍ 이하의 농도에서 4 내지 8 또는 2 내지 4는 ++로서 표시하며 8 초과의 SI는 +++로서 표시한다. 추가로 증식 및 인터페론-γ 생산에 대한 농도의 효과는 첨부된 도면의 상기 항원중 2개에 대해 나타낸다. 증식 및 인터페론-γ 생산 모두를 위한 TbRa3은 ++로서 표시되고 TbRa9는 +로서 표시된다.
이들 결과는 이들 가용성 항원이 엠. 튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T-세포중에 증식 및/또는 인터페론-γ 생산을 유도할 수 있다.
B. 엠. 튜버큘로시스 항원을 암호화하는 DNA 서열을 동정하기 위한 환자 혈청의 용도
상기 기술한 게놈 DNA 라이브러리 및 추가의 H37Rv 라이브러리를 활성 튜버큘로시스와 함께 환자로부터 수득한 혈청의 풀을 사용하여 검색한다. H37Rv 라이브러리를 제조하기 위해 엠. 튜버큘로시스 균주 H37Rv 게놈 DNA를 분리하고 Sau3A를 사용하여 부분적으로 분해시키며 람다 Zap 발현 시스템(Stratagene, La Jolla, Ca)을 사용하여 발현 라이브러리를 작제하는데 사용한다. 각각 활성 폐동맥 또는 흉막 질환을 가진 3명의 환자로부터 수득한 3개의 다른 풀의 혈청을 발현 검색에 사용한다. 상기 풀들은 ELISA 및 면역블롯 포맷 모두에서 H37Ra 용해질(예를들어 TbL=낮은 반응성, TbM=중간정도의 반응성 및 TbH=높은 반응성)과 함께 상대적인 반응성을 언급하는 TbL, TbM 및 TbH로 명명된다. 폐동맥 결핵을 갖는 7명의 환자로부터 4번째 풀의 혈청을 또한 사용한다. 모든 혈청은 재조합 38kD 엠. 튜버큘로시스 H37Ra 포스페이트 결합 단백질과 함께 증가된 반응성이 없다.
모든 풀은 E.Coli 용해질과 함께 예비 흡착되고 문헌[참조: Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratories, Cold Spring Harbor, NY, 1989}에 기술된 바와 같은 H37Ra 및 H37Rv 발현 라이브러리를 검색하는데 사용된다. 면역반응성 항원을 발현하는 박테리오파지 플라크를 정제한다. 플라크로부터 파지미드를 분리하고 엠. 튜버큘로시스 클론의 뉴클레오타이드 서열을 추론한다.
32개의 클론을 정제한다. 이들중 31개가 사람 엠. 튜버큘로시스에서 이전에 확인되지 않은 서열을 나타낸다. 확인된 DNA 분자의 대표적인 서열은 서열 26 내지 51 및 105에 제공된다. 이들중 TbH-8 및 TbH-8 내지 2(서열 105)는 동일한 클론의 비연속적인 DNA 서열이고 TbH-4(서열 43) 및 TbH-4-FWD(서열 44)는 동일한 클론의 비연속적인 서열이다. 이후에 Tb38-1, TbH-4, TbH-8, TbH-9 및 TbH-12로서 확인된 항원에 대한 아미노산 서열은 서열 88 내지 92에서 나타낸다. 상기 확인된 데이터베이스를 사용한 유전자 은행에서 공지된 서열과 이들 서열의 비교는 TbH-4, TbH-8, TbH-9 및 TbM-3과 어떠한 상당한 상동성을 나타내지 않지만 약간의 상동성이 TbH-9에서는 나타난다. TbH-12는 엠. 튜버큘로시스(기탁번호 S28515)에서 이전에 확인된 34kD 항원 단백질과 상동성인 것으로 밝혀졌다. Tb38-1은 엠.보비스(M. bovis)(기탁번호 S34848) 및 엠. 튜버큘로시스(참조: Sorensen et al., Infec. Immun 63:1710-1717, 1995)에서 이전에 확인된 항원 ESAT-6에 대한 개방 판독 프레임의 34염기쌍 업스트림에 위치한 것으로 밝혀졌다.
H37Ra 라이브러리로부터 모두 분리된 Tb38-1 및 TbH-9으로부터 유래된 프로브를 사용하여 H37Rv 라이브러리에서 클론을 확인한다. Tb38-1은 Tb38-1F2, Tb38-1F3, Tb38-1F5 및 Tb38-1F6(서열 112, 113, 116, 118 및 119)와 하이브리화한다(서열 112 및 113은 클론 Tb38-1F2의 비연속적인 서열이다). 2개의 개방 판독 프레임은 Tb38-IF2에서 추론되고 하나는 Tb37FL(서열 114)에 상응하고 두 번째 부분적인 서열은 Tb38-1과 상동성일 수 있고 Tb38-IN(서열 115)으로 명명된다. Tb38-1F3의 추론된 아미노산 서열은 서열 117로 제공된다. TbH-9 프로브는 H37Rv 라이브러리에서 3개의 클론을 동정한다: TbH-9(R37Ra)과 상동성일 수 있는 TbH-9-FL(서열 106), TbH-9-1(서열 108) 및 TbH-9-4(서열 110), 이모두는 TbH-9과 고도로 관련된 서열이다. 추론된 이들 3개의 클론에 대한 아미노산 서열은 서열 107, 109 및 111에 제공된다.
Tb38-1, EAST-6 및 또 다른 대표적인 재조합 항원상에서 수행된 T-세포 분석의 결과는 각각 표 4A, B 및 5에서 제공된다.
| 항원 | 공여자 | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Tb38.1 | +++ | + | - | - | - | ++ | - | + | - | ++ | +++ |
| EAST-6 | +++ | + | + | + | - | + | - | + | + | ++ | +++ |
| TbH-9 | ++ | ++ | - | ++ | ± | ± | ++ | ++ | ++ | ++ | ++ |
| 항원 | 공여자 | ||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | |
| Tb38.1 | +++ | + | - | + | + | +++ | - | ++ | - | +++ | +++ |
| EAST-6 | +++ | + | + | + | + | + | - | + | + | +++ | +++ |
| TbH-9 | ++ | ++ | - | +++ | ± | ± | +++ | +++ | ++ | +++ | ++ |
| 항원 | 증식 | 인터페론-γ | 총계 | ||||
| 환자 4 | 환자 5 | 환자 6 | 환자 4 | 환자 5 | 환자 6 | ||
| TbH9 | ++ | ++ | ++ | +++ | ++ | ++ | 13 |
| TbM7 | - | + | - | ++ | + | - | 4 |
| TbH5 | - | + | + | ++ | ++ | ++ | 8 |
| TbL23 | - | + | ± | ++ | ++ | + | 7.5 |
| TbH4 | - | ++ | ± | ++ | ++ | ± | 7 |
| 대조구 | - | - | - | - | - | - | 0 |
이들 결과는 본 발명의 엠. 튜버큘로시스 항원 및 ESAT-6 모두가 엠. 튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T-세포에서 증식 및/또는 인터페론-γ 생산을 유도할 수 있다. 발명자의 최선의 지식을 토대로 ESAT-6은 이전에 사람 면역 반응을 자극하는 것으로 보이지 않는다.
항원 Tb38-1의 아미노산 서열을 포함하는 6개의 오버랩핑 펩티드를 실시예 4에서 기술한 방법을 사용하여 작제한다. 이후에 pep 1 내지 6으로 언급되는 이들 펩티드의 서열은 각각 서열 93 내지 98로 제공된다. 이들 펩티드를 사용한 T-세포 분석의 결과는 표 6 및 표 7에 나타낸다. 이들 결과는 상기 존재를 확인시켜주고 엠. 튜버큘로시스 면역 환자로부터 유래된 T-세포의 증식 및 인터페론-γ 생산을 유도할 수 있는 Tb38-1내에 T 세포 에피토프를 위치시키는 것을 도와준다.
| 펩티드 | 환자 | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | |
| pep1 | - | - | - | - | ± | - | - | - | - | ± | - | - | + |
| pep2 | ± | - | - | - | ± | - | - | - | ± | ± | - | - | + |
| pep3 | - | - | - | - | - | - | - | - | ± | - | - | - | ± |
| pep4 | ++ | - | - | - | - | - | + | - | ± | ± | - | - | + |
| pep5 | ++ | ± | - | - | - | - | + | - | ± | - | - | - | + |
| pep6 | - | ++ | - | - | - | - | ± | - | ± | + | - | - | + |
| 대조구 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
| 펩티드 | 환자 | ||||||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | |
| pep1 | + | - | - | - | ± | - | - | - | - | ± | - | - | + |
| pep2 | - | - | - | ± | - | - | - | ± | ± | - | - | + | |
| pep3 | - | - | - | - | - | - | - | - | ± | - | - | - | ± |
| pep4 | ++ | - | - | - | - | - | + | - | ± | ± | - | - | + |
| pep5 | ++ | ± | - | - | - | - | + | - | ± | - | - | - | + |
| pep6 | + | ++ | - | - | - | - | ± | - | ± | + | - | - | + |
| 대조구 | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - | - |
실시예 4
튜버큘린 정제된 단백질 유도체로부터 폴리펩티드의 정제 및 특징화
엠. 튜버큘로시스 폴리펩티드를 하기와 같이 튜버큘린 정제된 단백질 유도체(PPD)로부터 분리한다.
PPD는 임의의 변형과 함께 문헌[Seibert, F. et al., Tuberculin purified pretein derivative, Preparation and analyses of a large quantity for standard. The American Review of Tuberculosis 44:9-25, 1941]에 기술된 바와 같이 제조한다.
엠. 튜버큘로시스 Rv 균주를 37℃에서 롤러 용기의 합성 배지에서 6주동안 배양한다. 증식된 미생물을 포함하는 용기를 3시간동안 물 증류기에서 100℃까지 가열한다. 배양물을 0.22u 여과기를 사용하여 살균 여과하고 수성상을 3kD 절단된 막을 사용하여 20배 농축시킨다. 단백질을 50% 황산 암모늄으로 1회 침전시키고 25% 황산 암모늄 용액으로 8회 농축시킨다. 수득한 단백질(PPD)을 바이오래드 HPLC 시스템(Perspective Biosystems, Framingham MA)의 C18 칼럼(7.8×300mM; Waters Milford, MA)을 사용하여 역상 수성 크로마토그래피(RP-HPLC)에 의해 분획한다. 분획물을 0 내지 100% 완충액(아세토니트릴중의 0.1% 내지 TFA)의 선형 농도구배와 함께 칼럼으로부터 용출시킨다. 상기 유동 속도는 분당 10ml이고 용출물은 214nm 및 280nm에서 검색한다.
6개의 분획물을 수거하고 건조시키며 PBS중에 현탁시키고 지연형 과민성반응(DTH) 반응의 유도를 위해 엠. 튜버큘로시스 감염 기니아 피그에서 각각 테스트한다. 하나의 분획물은 강한 DTH 반응을 유도하는 것으로 밝혀졌고 추가로 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템 디비젼 모델 172 HPLC 중에 마이크로보어 비닥 C18 칼럼(목록 218TP5115)상에서 RP-HPLC에 의해 추가로 연속적으로 분획된다. 분획물을 유동 속도 80ul/분과 함께 5 내지 100% 완충액(아세토니트릴중의 0.05% TFA)선형 농도 구배로 용출시킨다. 용출물을 215nm에서 검색한다. 8개의 분획물을 수거하고 엠. 튜버큘로시스 감염 기니아 피그내 DTH의 유도를 위해 테스트한다. 하나의 분획물이 약 16mm 경변의 강한 DTH를 유도하는 것으로 밝혀졌다. 또 다른 분획물은 검출할만한 DTH를 유도하지 않는다. 양성 분획물을 SDS-PAGE 겔 전기영동시키고 약 12kD 분자량의 단일 단백질 밴드를 포함하는 것으로 밝혀졌다.
이후에 DPPD로서 언급되는 상기 폴리펩티드는 상기 기술한 바와 같이 퍼킨 엘머/어플라이드 바이오시스템스 디비젼 프로사이즈 492 단백질 서열화기를 사용하여 아미노 말단으로부터 서열화하고 서열 129에 나타낸 N-말단 서열을 갖는 것으로 밝혀졌다. 상기 서열과 상기 기술한 바와 같은 유전자 은행의 공지된 서열과의 비교는 어떠한 공지된 상동성을 보여주지 않는다. 4개의 DPPD의 시아노겐 브로마이드를 분리하고 서열 130 내지 133내에 나타낸 서열을 갖는 것으로 나타났다.
증식 및 IFN-γ에 대한 사람 PBMC를 자극하기 위한 항원 DPPD의 능력은 실시예 1에서 기술바와 같이 분석한다. 표 8에서 보여지는 바와 같이 DPPD는 증식을 자극하고 시판되는 PPD에 의해 유발되는 것보다 대량의 IFN-γ의 생산을 유발시키는 것으로 밝혀졌다.
| PBMC 공여자 | 자극인자 | 증식(CPM) | IFN-γ(OD450) |
| A | 배지 | 1,098 | 0.17 |
| PPD(시판용) | 8,394 | 1.29 | |
| DPPD | 13,451 | 2.21 | |
| B | 배지 | 450 | 0.09 |
| PPD(시판용) | 3,929 | 1.26 | |
| DPPD | 6,184 | 1.49 | |
| C | 배지 | 541 | 0.11 |
| PPD(시판용) | 8,907 | 0.76 | |
| DPPD | 23,024 | >2.70 |
실시예 5
합성 폴리펩티드의 합성
폴리펩티드를 HPTU(O-벤조트리아졸-N,N,N',N'-테트라메틸우로늄 헥사플루오로포스페이트) 활성과 함께 FMOC 화학을 사용하여 밀리포어 9050 펩티드 합성기 상에서 합성할 수 있다. Gly-Cys-Gly 서열은 펩티드의 아미노 말단에 결합되어 펩티드의 결합 또는 라벨링의 방법을 제공한다. 고체 지지체로부터 펩티드의 절단은 하기의 절단 혼합물을 사용하여 수행한다: 트리플루오로아세트산:에탄디티올;티오아니졸:물:페놀(40:1:2:2:3). 2시간 동안 절단시킨후에 펩티드를 냉각된 메틸-3급-부틸-에테르중에서 침전시킬 수 있다. 펩티드 펠렛을 이어서 0.1% 트리플루오로아세트산(TFA)를 포함한 물중에서 용해시키고 C18 역상 HPLC에 의한 정제전에 동결건조시킨다. 물(0.1% TFA를 포함)중에서 0% 내지 60% 아세토니트릴(0.1% TFA)의 농도구배가 사용되어 펩티드를 용출시킬 수 있다. 순수한 분획물을 동결건조시킨후에 펩티드를 전기분무 질량 분광 분석기 및 아미노산 분석을 사용하여 특징화될 수 있다.
상기 기술된 것으로부터 본 발명의 특정 양태가 설명을 목적으로 본원에 기술되어 있다 할지라도 본 발명의 취지 및 범위에서 이탈함이 없이 다양한 변형이 수행될 수 있다고 평가될 수 있다.
서열 목록
(1) 일반정보:
(i) 출원인: 코릭사 코포레이션
(ii) 발명의 명칭: 결핵의 면역치료 및 진단을 위한 화합물 및 방법
(iii) 서열수: 137
(iV) 서신 주소:
(A) 수신인: 시드 앤드 베리 엘엘피
(B) 가: 애비뉴 701 콜롬비아 센터 6300
(C) 시: 시애틀
(D) 주: 워싱턴
(E) 국명: USA
(F) 우편번호: 98104-7092
(v) 컴퓨터 판독 형태:
(A) 매질형: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 작동 시스템: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: 페이턴트인 릴리즈 #1.0. 비전 #1.30
(vi) 현 출원정보:
(A) 출원번호:
(B) 출원일: 1996. 8. 27
(C) 분류:
(viii) 대리인 정보:
(A) 성명: 마키 데이비드 제이.
(B) 등록번호: 31,392
(C) 참조/도켓 번호: 210121.411PC
(ix) 통신 정보:
(A) 전화: (206) 622-4900
(B) 팩스: (206) 682-6031
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 766 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(2) 서열 3에 대한 정보:
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(2) 서열 4에 대한 정보:
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(2) 서열 5에 대한 정보:
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(2) 서열 6에 대한 정보:
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(2) 서열 15에 대한 정보:
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(2) 서열 16에 대한 정보:
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(2) 서열 17에 대한 정보:
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(2) 서열 18에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1482 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 19에 대한 정보:
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(A) 길이: 876 염기쌍
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(2) 서열 20에 대한 정보:
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(2) 서열 21에 대한 정보:
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(2) 서열 22에 대한 정보:
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(2) 서열 28에 대한 정보:
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(2) 서열 31에 대한 정보:
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(A) 길이: 267 염기쌍
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(2) 서열 36에 대한 정보:
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(A) 길이: 181 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(2) 서열 37에 대한 정보:
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(A) 길이: 290 염기쌍
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(2) 서열 38에 대한 정보:
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(A) 길이: 34 염기쌍
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(2) 서열 39에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 155 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(2) 서열 40에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 53 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 41에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 132 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(2) 서열 42에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 132 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(2) 서열 43에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 702 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 44에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 298 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 45에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1058 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 45:
(2) 서열 46에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 327 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 47에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 170 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 48에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 127 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 49에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 81 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
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(2) 서열 50에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 149 염기쌍
(B) 유형: 핵산
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(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 50:
(2) 서열 51에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 355 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 51:
(2) 서열 52에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 999 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 52:
(2) 서열 53에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 332 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 53:
(2) 서열 54에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 54:
(2) 서열 55에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 55:
(2) 서열 56에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 19 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 56:
(2) 서열 57에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 57:
(2) 서열 58에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 14 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 58:
(2) 서열 59에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 13 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 59:
(2) 서열 60에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 17 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 60:
(2) 서열 61에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 61:
(2) 서열 62에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 62:
(2) 서열 63에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 187 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 63:
(2) 서열 64에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 148 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 64:
(2) 서열 65에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 230 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 65:
(2) 서열 66에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 132 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 66:
(2) 서열 67에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 100 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 67:
(2) 서열 68에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 163 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 68:
(2) 서열 69에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 344 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 69:
(2) 서열 70에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 485 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 70:
(2) 서열 71에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 267 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 71:
(2) 서열 72에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 97 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 72:
(2) 서열 73에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 364 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 73:
(2) 서열 74에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 309 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 74:
(2) 서열 75에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 580 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 75:
(2) 서열 76에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 233 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 76:
(2) 서열 77에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 66 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 77:
(2) 서열 78에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 69 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 78:
(2) 서열 79에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 355 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 79:
(2) 서열 80에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 205 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 80:
(2) 서열 81에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 286 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 81:
(2) 서열 82에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 173 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 82:
(2) 서열 83에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 107 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 83:
(2) 서열 84에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 125 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 84:
(2) 서열 85에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 117 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 85:
(2) 서열 86에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 103 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 86:
(2) 서열 87에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 88 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 87:
(2) 서열 88에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 95 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 88:
(2) 서열 89에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 166 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 89:
(2) 서열 90에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 5 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 90:
(2) 서열 91에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 263 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 91:
(2) 서열 92에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 303 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 92:
(2) 서열 93에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 93:
(2) 서열 94에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 16 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 94:
(2) 서열 95에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 95:
(2) 서열 96에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 96:
(2) 서열 97에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 27 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 97:
(2) 서열 98에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 28 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 98:
(2) 서열 99에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 507 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 99:
(2) 서열 100에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 168 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 100:
(2) 서열 101에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 500 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 101:
(2) 서열 102에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 96 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 102:
(2) 서열 103에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 154 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 103:
(2) 서열 104에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 51 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 104:
(2) 서열 105에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 282 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 105:
(2) 서열 106에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1565 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 106:
(2) 서열 107에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 391 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 107:
(2) 서열 108에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 259 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 108:
(2) 서열 109에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 86 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 109:
(2) 서열 110에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1109 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 110:
(2) 서열 111에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 341 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 111:
(2) 서열 112에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 1256 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 112:
(2) 서열 113에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 432 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 113:
(2) 서열 114에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 368 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 114:
(2) 서열 115에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 12 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 115:
(2) 서열 116에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 396 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 116:
(2) 서열 117에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 80 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 117:
(2) 서열 118에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 387 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 118:
(2) 서열 119에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 272 염기쌍
(B) 유형: 핵산
(C) 쇄: 단일
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 119:
(2) 서열 120에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 20 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 120:
(2) 서열 121에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 121:
(2) 서열 122에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 19 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 122:
(2) 서열 123에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 123:
(2) 서열 124에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 14 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 124:
(2) 서열 125에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 13 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 125:
(2) 서열 126에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 17 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 126:
(2) 서열 127에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 127:
(2) 서열 128에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 30 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 128:
(2) 서열 129에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 22 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 129:
(2) 서열 130에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 7 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 130:
(2) 서열 131에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 10 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(ix) 특징:
(D) 또다른 정보: /주지="2번째 잔기가 Pro 또는 Thr중 하나일 수 있다
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 131:
(2) 서열 132에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 9 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(ix) 특징:
(D) 또다른 정보: /주지=3번째 잔기가 Gln 또는 Leu중 하나일 수 있다
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 132:
(2) 서열 133에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 9 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 133:
(2) 서열 134에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 134:
(2) 서열 135에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 135:
(2) 서열 136에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 15 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 136:
(2) 서열 137에 대한 정보:
(i) 서열 특징:
(A) 길이: 21 아미노산
(B) 유형: 아미노산
(C) 쇄:
(D) 형태: 선형
(xi) 서열 기술: SEQ ID NO: 137:
Claims (34)
- (a)Asp-Pro-Val-Asp-Ala-Val-Ile-Asn-Thr-Thr-Cys-Asn-Tyr-Gly-Gln-Val-Val-Ala-Ala-Leu(서열 120);(b)Ala-Val-Glu-Ser-Gly-Met-Leu-Ala-Leu-Gly-Thr-Pro-Ala-Pro-Ser(서열 121);(c)Ala-Ala-Met-Lys-Pro-Arg-Thr-Gly-Asp-Gly-Pro-Leu-Glu-Ala-Ala-Lys-Glu-Gly-Arg(서열 122);(d)Tyr-Tyr-Trp-Cys-Pro-Gly-Gln-Pro-Phe-Asp-Pro-Ala-Trp-Gly-Pro(서열 123);(e)Asp-Ile-Gly-Ser-Glu-Ser-Thr-Glu-Asp-Gln-Gln-Xaa-Ala-Val(서열 124);(f)Ala-Glu-Glu-Ser-Ile-Ser-Thr-Xaa-Glu-Xaa-Ile-Val-Pro(서열 125);(g)Asp-Pro-Glu-Pro-Ala-Pro-Pro-Val-Pro-Thr-Thr-Ala-Ala-Ser-Pro-Pro-Ser(서열 126);(h)Ala-Pro-Lys-Thr-Tyr-Xaa-Glu-Glu-Leu-Lys-Gly-Thr-Asp-Thr-Gly(서열 127);(i)Asp-Pro-Ala-Ser-Ala-Pro-Asp-Val-Pro-Thr-Ala-Ala-Gln-Leu-Thr-Ser-Leu-Leu-Leu-Asn-Ser-Leu-Ala-Asp-Pro-Asn-Val-Ser-Phe-Ala-Asn(서열 128) 및(j)Ala-Pro-Glu-Ser-Gly-Ala-Gly-Leu-Gly-Gly-Thr-Val-Gln-Ala-Gly(서열 136)로 구성되는 그룹(여기서, Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다)에서 선택된 N-말단 서열을 갖는 항원임을 특징으로 하는, 가용성 엠. 튜버큘로시스(M. tuberculosis) 항원의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩티드 또는 항원의 보존적인 치환부 및/또는 변형부에서만 상이한 변이체.
- (a)Asp-Pro-Pro-Asp-Pro-His-Gln-Xaa-Asp-Met-Thr-Lys-Gly-Tyr-Tyr-Pro-Gly-Gly-Arg-Arg-Xaa-Phe(서열 129) 및(b)Xaa-Tyr-Ile-Ala-Tyr-Xaa-Thr-Thr-Ala-Gly-Ile-Val-Pro-Gly-Lys-Ile-Asn-Val-His-Leu-Val(서열 137)로 구성되는 그룹(여기서, Xaa는 임의의 아미노산일 수 있다)중에서 선택된 N-말단 서열을 갖는 항원임을 특징으로하는, 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩티드 또는 항원의 보존적인 치환부 및/또는 변형부에서만 상이한 변이체.
- 항원이 서열 1, 2, 4 내지 10, 13 내지 25, 52, 99 및 101에 나타낸 서열로 구성되는 그룹중에서 선택된 DNA 서열, 이의 상보적인 서열 및 중간 정도의 스트린전트(stringent) 조건하에서 서열 1, 2, 4 내지 10, 13 내지 25, 52, 99 및 101에 나타낸 서열 또는 이의 상보적인 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩티드 또는 항원의 보존적인 치환부 및/또는 변형부에서만 상이한 변이체.
- 항원이 서열 26 내지 51로 나타낸 서열로 구성되는 그룹 중에서 선택된 DNA 서열, 이의 상보적인 서열 및 중간 정도의 스트린전트 조건하에서 서열 26 내지 51에 나타낸 서열 또는 이의 상보적인 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열에 의해 암호화된 아미노산 서열을 포함함을 특징으로 하는, 가용성 엠. 튜버큘로시스 항원의 면역원성 부위를 포함하는 폴리펩티드 또는 항원의 보존적인 치환부 및/또는 변형부에서만 상이한 변이체.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 DNA 분자.
- 제5항에 따른 DNA 분자를 포함하는 발현 벡터.
- 제6항에 따른 발현 벡터로 형질전환된 숙주 세포.
- 제7항에 있어서, 숙주세포가 이. 콜라이, 효모 및 포유동물 세포로 구성되는 그룹중에서 선택되는 숙주세포.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 하나 이상 및 이의 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제5항에 따른 DNA 분자 하나 이상 및 이의 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 서열 3, 11 및 12에 나타낸 DNA 서열 하나 이상 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 하나 이상 및 비특이적인 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 서열 134 및 135에 나타낸 서열로 구성되는 그룹중에서 선택된 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드 및 비특이적인 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 서열 3, 11 및 12로 구성되는 그룹중에서 선택된 DNA 서열, 이의 상보적인 서열 및 서열 3, 11 및 12에 나타낸 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 하나 이상 및 비특이적인 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 제12항 내지 제14항중 어느 한 항에 있어서, 비특이적인 면역 반응 인핸서가 애쥬반트인 백신.
- 제5항에 따른 하나 이상의 DNA 분자 및 비특이적인 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 서열 3, 11 및 12에 나타낸 DNA 서열 하나 이상 및 비특이적인 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 제16항 또는 제17항에 있어서, 비특이적인 면역 반응 인핸서가 애쥬반트인 백신.
- 제9항 내지 제11항중 어느 한 항에 따른 약제학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여 환자에게 보호 면역성을 유발시키는 방법.
- 제12항 내지 제18항중 어느 한 항에 따른 백신을 환자에게 투여함을 포함하여 환자에게 보호 면역성을 유발시키는 방법.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 2개 이상을 포함하는 융합 단백질.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 하나 이상 및 ESAT-6을 포함하는 융합 단백질.
- 제21항 또는 제22항에 따른 융합 단백질 및 생리학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
- 제21항 또는 제22항에 따른 융합 단백질 및 비특이적인 면역 반응 인핸서를 포함하는 백신.
- 제24항에 있어서, 비특이적인 면역 반응 인핸서가 애쥬반트인 백신.
- 제23항에 따른 약제학적 조성물을 환자에게 투여함을 포함하여 환자에게 보호 면역성을 유발시키는 방법.
- 제24항 또는 제25항에 따른 백신을 환자에게 투여함을 포함하여 환자에게 보호 면역성을 유발시키는 방법.
- (a) 환자의 피부 세포를 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 하나 이상과 접촉시키고; (b) 환자 피부상의 면역 반응을 검출하여 이로부터 환자의 결핵을 검출함을 포함하는, 환자의 결핵 검출 방법.
- (a) 환자의 피부 세포를 서열 134 및 135에 나타낸 서열로 구성되는 그룹중에서 선택된 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드와 접촉시키고; (b) 환자 피부상의 면역 반응을 검출하여 이로부터 환자의 결핵을 검출함을 포함하는, 환자의 결핵 검출 방법.
- (a) 환자의 피부 세포를 서열 3, 11 및 12로 구성되는 그룹중에서 선택된 DNA 서열, 이의 상보적인 서열 및 서열 3, 11 및 12에 나타낸 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 하나 이상과 접촉시키고; (b) 환자 피부상의 면역 반응을 검출하여 이로부터 환자의 결핵을 검출함을 포함하는, 환자의 결핵 검출 방법.
- 제28항 내지 제30항중 어느 한 항에 있어서, 면역 반응이 경화(induration)인 방법.
- 제1항 내지 제4항중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드 및 (b) 폴리펩티드를 환자의 피부 세포에 접촉시키기에 충분한 장치를 포함하는 진단용 키트.
- (a) 서열 134 및 135에 나타낸 서열로 구성되는 그룹중에서 선택된 N-말단 서열을 갖는 폴리펩티드 및 (b) 폴리펩티드를 환자의 피부 세포와 접촉시키기에 충분한 장치를 포함하는 진단용 키트.
- (a) 서열 3, 11 및 12로 구성되는 그룹중에서 선택된 DNA 서열, 이의 상보적인 서열 및 서열 3, 11 및 12에 나타낸 서열과 하이브리드화하는 DNA 서열에 의해 암호화된 폴리펩티드 및 (b) 폴리펩티드를 환자의 피부 세포와 접촉시키기에 충분한 장치를 포함하는 진단용 키트.
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