KR20040100263A

KR20040100263A - 쯔쯔가무시 감염의 검출에 유용한 재조합 단백질, 이를코딩하는 유전자, 및 이를 이용한 진단 키트

Info

Publication number: KR20040100263A
Application number: KR1020030032553A
Authority: KR
Inventors: 박미연; 박만석; 심수경; 최영실; 이혜경; 이병철; 김상범
Original assignee: 대한민국(관리부서 질병관리본부장)
Priority date: 2003-05-22
Filing date: 2003-05-22
Publication date: 2004-12-02
Also published as: KR100514438B1

Abstract

본 발명은 쯔쯔가무시 감염의 검출에 유용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 갖는 재조합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 숙주세포로부터 상기 재조합 단백질을 제조하는 방법, 및 상기 재조합 단백질을 포함하는 쯔쯔가무시의 감염을 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다.

본 발명에 따른 재조합 단백질은 높은 항원성을 가지고 있을 뿐 아니라, 발현벡터로 쉽게 클로닝할 수 있어 항원의 대량생산이 가능하므로 진단 시약 또는 진단 키트를 효과적으로 제조할 수 있다.

Description

쯔쯔가무시 감염의 검출에 유용한 재조합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 및 이를 이용한 진단 키트{A recombinant protein useful for the detection of tsutsugamushi infection, a gene encoding the same, and a diagnostic kit using the same}

본 발명은 쯔쯔가무시 감염의 검출에 유용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 갖는 재조합 단백질, 이를 코딩하는 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현벡터, 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포, 상기 숙주세포로부터 상기 재조합 단백질을 제조하는 방법, 및 상기 재조합 단백질을 포함하는 쯔쯔가무시의 감염을 검출하기 위한 진단 키트에 관한 것이다.

쯔쯔가무시증은 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia Tsutsugamushi)의 감염에 의한 급성 발열성 질환의 하나로 일본, 중국, 말레이시아, 태국, 베트남 등을 포함하는 아시아 지역에서 호발하는 질환으로서(장 한국의 쯔쯔가무시병. 서흥출판사 p21-27,1994), 10월에 가장 호발하며 대부분 가을철인 9월과 12월 초 사이에 발생한다(김 등 감염 20:105-116, 1988).

주로 사람에게는 들판에서 작업이나 캠핑 등의 야외 활동을 하면서 쯔쯔가무시균을 갖고 있는 진드기에 물려 감염된다. 임상증상으로는 감염된 진드기가 부착하여 흡인한 부위에 가피(eschar)를 동반한 궤양이 나타나는 것이 특징이며, 고열, 오한, 두통, 반점구진성 발진, 림프절 종대가 나타난다.

쯔쯔가무시증의 진단은 크게 임상증상 및 이화학 소견에 의한 임상적 진단, 원인균 분리에 의한 세균학적 진단 및 혈청내 항체 유무를 측정하는 혈청학적 진단에 의해 이루어진다(김 등 감염 20:105-116, 1988, 장 등 대한미생물 학회지 24: 281-289, 1989).

임상적 진단은 급성 발열성 질환 환자에서 가피, 발진 및 림프절 종대 등의 존재를 증명함으로써 이루어지나, 초기 임상 증상이 비 특이적인 경우가 있고, 가피(eschar)의 위치에 따라 세심한 주의를 기울이지 않으면 발견하기 힘들며, 재 감염 시에는 가피가 나타내지 않는 경우도 있어 진단 시 문제점이 있다. 또한 비슷한 시기에 급성 발열성 질환인 렙토스피라증, 발진열, 신증후군 출혈열 등이 호발하는데 발병 초기에는 이들 질환의 임상 소견이 유사하여 임상증상 만으로 감별 진단하는데 많은 문제점이 있다(박 등 대한 내과학회지 45:497-509,1993, 배현주 감염학 연수 강좌 p79-87, 2001).

원인균인 오리엔티아 쯔쯔가무시(Orientia Tsutsugamushi)를 환자 혈액에서 분리하는 세균학적 진단은 원인균 분리를 위한 감수성 동물 접종, 세포배양과 생물 안전 시설(Biosafty level 3)이 갖춰져야 하며, 동정에 걸리는 시간이 3주 이상 소요되어 실제 환자 치료에 검사 결과를 이용하기는 불가능하다.

따라서, 쯔쯔가무시증의 진단은 통상 임상 증상과 혈청학적 진단에 의해 이루어지게 된다(장 등 대한 미생물 학회지 24:281-289, 1989). 전통적으로 쯔쯔가무시균은 Gillam, Karp, Kato 혈청형 등으로 분류(Derrick, E. H., et al., Lancet. 13:833-838, 1964, Bennet, B. L., et al., J. Immunol. 62:453-461, 1949, Shishido, A., et al., Jpn .J. Med. Sci. Biol. 11:383-399, 1958)되어 왔으며, 한국, 일본, 태국 등지에서 혈청학적으로 차이를 보이는 균주가 분리됨에 따라 보령(Boryong), 연천(Yonchon)의 국내 분리 균주( Chang, W.H., et al., J. Clin. Microbiol. 28:(4) 685-688, 1990, Seong, S. Y., et al., Microbiol. Immunol.41(6):437-443, 1997) 및 Shimokoshi, Kawasaki, kuroki, TA716, TA763, TH1817(Tamura. A., et al., Microbiol. Immunol. 28(8):873-882, 1984, Yamamoto. S., et al., Microbiol. Immunol. 30(7) : 611-620, 1986, Ohashi. N., et al., J. Clin. Microbiol. 28(9): 2111-2113, 1990) 등 혈청학적 분류가 더욱 세밀해 지고 있다.

혈청학적 방법은 비특이적인 웰-휄릭스(Weil-Felix) 반응, 보체 결합 시험, 간접 면역 형광항체법, 효소 면역시험, 간접 면역 퍼옥시다제 시험, 수동 적혈구 응집 반응이 있다(Wolf, J. W., 32:352-360, 1931, Yamamoto, S., et al., J. Clin. Microbiol. 15:1128-1132, 1982, Suto T., Clin. Virol. 84:425-429, 1980, 김 등 감염 20:105-116, 1988; 장 등 대한미생물 학회지 24: 281-289, 1989; 최 대한의학협회지 31:608-611, 1988; 김 등 대한 내과 학회지 50:77-86, 1996 ), 이중 세포배양균을 사용하는 미세 간접면역 형광항체법(Micro Indirect Immunofluroscence Assay; MIFA)이 널리 사용되고 있으나, 진단에 사용되는 쯔쯔가무시균을 세포배양으로 유지 계대하고 배양 기간이 2주 이상 걸리며, 사용되는 배지의 제조 및 가격이 고가이고, 진단의 판독에 숙련도가 요구되는 등 객관적인 표준화에 따른 여러 문제점이 알려져 있다(Robinson et al., Am. J. Trop. Med. 25:900-905, 1976).

최근, PCR을 이용한 쯔쯔가무시증 진단법(Sugita Y., et al., J. Med. Microbiol. 37:357-360, 1992)이 연구되고 있다. 국내의 경우 보령 분리주의 표면 항원 단백질(56kDa)의 재조합 항원을 면양 적혈구에 부착시킨 수동 혈구응집법(Passive hamagglutination Assay: PHA) (Kim I.S., et al., J. Clin. Microbiol. 31:2057-2060, 1993)과 이를 이용한 진단 키트 및 ELISA 법을 이용한 진단법(Kim I.S., et al., J. Clin. Microbiol. 31:598-605, 1993)이 개발된 바 있다. 그러나, 널리 사용되고 있는 수동 혈구 응집법은 간접 면역 형광항체법과 비교하면 양성 예측도가 낮아 조기 진단에 적용하기 적절치 못한 실정이다.

또한, 국외의 경우 Karp주의 재조합 56kDa 항원부위를 개량한 ELISA 법( Ching W. M., et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 5(4):519-526, 1998), 급속 면역크로마토그래피 반응법(Rapid immunochromatographic flow assay: RAF)( Ching W. M., et al., Clin. Diagn. Lab. Immunol. 8(2):409-414, 2001)이 개발된 바 있다. 그러나, 일선 의료기관과 임상센타에서 수입품으로 진단하기에는 키트 가격이 비싸 현실성이 떨어지고 국내 분리주의 생산품으로 대체해야 할 필요성이 대두된다.

본 발명자들은 국내에서 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주(Orientia tsutsugamushiPajoo) 순수분리한 바 있으며, 이 균주로부터 외피 단백질(56kDa)의 유전자 및 해당 유전자로부터 발현된 외피 단백질을 밝혀내어 엔씨비아이 진뱅크 허가번호(NCBI genbank accession number) 제AF430142호를 획득한 바 있다.

한편, 상기 표면 항원 단백질을 이용하여 쯔쯔가무시 감염을 검출하기 위한 진단 키트를 개발하기 위해서는, 상기 표면 항원 단백질을 효과적으로 발현벡터에 클로닝하여 숙주세포에서 발현시켜 대량으로 제조하여야 한다. 그러나, 통상의 일반적 벡터를 사용하여 외래단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터를 제조할 경우, 목적하는 재조합 외래단백질 및 숙주 대장균 세포에서의 발현, 정제 과정에서 산업적으로 이용하기에 회수율이 낮아 비효율적으로 생산되는 경우가 빈번히 발생하여, 대량생산이 곤란한 문제점이 있다. 더욱이, 클로닝을 위해 단백질(항원)의 N- 및 C- 말단을 변화시킬 경우에는 항원의 3차원적 구조가 변경되게 되어 항원성 즉, 민감도 및 특이성이 낮아진다는 문제가 발생하게 된다.

이에, 본 발명자들은 순수 국내 분리주인 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주(Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 높게 유지하면서, 유전공학적 방법으로 대량생산이 가능한 재조합 단백질, 및 이를 코딩하는 유전자를 개발하고자 연구를 거듭한 결과, 56kDa의 표면 항원 단백질의 양말단에 특정 아미노산 서열을 도입했을 경우, 효과적으로 발현벡터를 제작할 수 있을 뿐 아니라, 진단에 필수적인 민감도와 특이성을 높게 유지할 수 있다는 것을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서, 본 발명은 쯔쯔가무시균 감염의 검출에 유용한 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 갖는 신규의 재조합 단백질 및 이를 코딩하는 유전자를 제공하는 것을 목적으로 한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터 및 이러한 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 숙주세포로부터 상기 재조합 단백질을 제조하는 방법을 제공하는 것을 포함한다.

또한, 본 발명의 목적은 상기 재조합 단백질을 포함하는 쯔쯔가무시균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트를 제공하는 것을 포함한다.

도 1은 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo) 재조합 표면항원을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현벡터 p56kDa를 구축하는 과정을 도식적으로 나타내고,

도 2는 발현벡터 p56kDa로 형질 전환된 대장균의 세포파쇄액을 12% SDS-PAGE 한 결과를 나타내고,

도 3은 발현된 재조합 단백질의 정제과정을 확인하기 위한 10% SDS-PAGE 결과를 나타내고,

도 4a 및 4b는 재조합 단백질로 얻어진 IgG 및 IgM ELISA 반응성과 대응 미세간접 면역 형광항체법(MIFA) 역가의 스캐터그램이고,

도 5는 쯔쯔가무시증 및 이와 유사질환과의 교차반응 시험결과(웨스턴 블롯팅)를 나타낸다.

상기 목적을 달성하기 위해, 본 발명은 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 갖는 변이체를 제공한다.

상기 서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질은 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주(Orientia tsutsugamushiPajoo)의 다양한 항원 결정기 중 특이 표면항원을 코딩하는 56kDa 단백질의 양 말단에 추가적으로 아미노산 서열이 도입되어 있다. 즉, N-말단에는 GSRISLEWLPLKNKFNSFKEIR의 22개 아미노산이 추가로 연결되고, C-말단에는 GSF의 3개 아미노산이 추가로 연결된다. 이러한 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 재조합 단백질은 하기 시험예에서 확인할 수 있는 바와 같이 높은 민감도 및 특이성을 나타냄으로써 쯔쯔가무시 감염의 검출을 위한 진단 키트에 효과적으로 사용될 수 있다.

또한 상기 변이체는 상기 양말단에 추가된 아미노산 서열 또는 56kDa의 표면항원 서열에서 치환, 결손, 또는 삽입과 같은 변형을 갖는 단백질을 말하며, 이러한 변형에도 불구하고 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 갖는 단백질을 포함한다.

본 발명은 상기 재조합 단백질 또는 변이체를 코딩하는 유전자를 제공한다. 본 발명에 따른 유전자는 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주(Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원을 코딩하는 유전자와 함께 전서열 및 후서열을 포함하며, 바람직하게는 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자이다. 본 발명에 따른 유전자는 삽입되는 벡터와 공동으로 작용하는 제한 효소 작용 부위를 포함하고 있어 효과적으로 발현벡터에 클로닝할 수 있어, 쯔쯔가무시증 진단에 필수적인 항원의 대량생산을 가능하게 한다.

본 발명은 상기 유전자를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 본 발명의 발현벡터에는 상기 재조합 단백질을 발현시킬 수 있도록 통상의 프로모터 서열, 번역개시 서열 및 터미네이터 서열이 포함될 수 있다. 본 발명의 발현벡터는 재조합 단백질의 정제가 용이하도록 단백질의 N-말단부위에 히스티딘이 융합되는 벡터를 사용하여 설계하는 것이 바람직하며, 도1에 기재된 바와 같이 본 발명에 따른 유전자를 pET-15b(Novagen사, USA)에 삽입하여 제조된 p56kDa인 것이 더욱 바람직하다.

또한, 본 발명은 상기 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포를 제공한다. 본 발명에서 사용가능한 숙주 세포로는 박테리아와 같은 원핵세포, 효모와 같은 진핵세포 또는 다세포 유기체 세포와 같은 포유동물 세포가 사용될 수 있으나, 발현을 통한 대량생산을 위해서는 대장균이 경제적으로 바람직하다. 더욱 바람직하게는, 본 발명의 숙주 세포는 수탁번호 제 KCCM 10489 호의 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B(Escherichia coliNIH/BL/56kDa-ET15B)이다.

또한, 본 발명은 상기 숙주 세포를 배양하고, 분리하는 단계를 포함하는 상기 재조합 단백질 또는 변이체의 제조방법을 제공한다. 바람직하게는, 본 발명의 제조방법은 His-결합 레진을 이용한 크로마토그라피에 의한 정제공정을 더욱 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 재조합 단백질 또는 변이체를 포함하는, 사람 및 포유동물에서 쯔쯔가무시균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트를 제공한다. 본 발명의 진단 키트에 있어서, 상기 재조합 단백질 또는 변이체는 본 발명에 따른 제조방법에 의해 제조하는 것이 바람직하다. 또한, 본 발명의 진단키트에 사용되는 검출방법은 ELISA법 또는 급속 면역크로마토그래피 반응법(Rapid immunochromatographic flow assay: RFA)인 것이 바람직하다.

ELISA 키트의 경우 본 발명의 재조합 단백질 항원이 코팅된 플레이트에 1차 항체인 검체를 반응시킨 후 퍼옥시다제로 라벨된 2차 항체를 결합시킨 다음 OPD(주황색), ABTS(초록색) 또는 TMB(분홍색)의 기질과 반응시키도록 구성될 수 있다. 급속 면역크로마토그래피 반응법(Rapid immunochromatographic flow assay: RFA) 키트의 경우 본 발명의 재조합 단백질 항원을 골드에 흡착 고정시킨 후 글래스 패드 위의 맴브레인에 점적하고 그 위에 호스라디시 퍼옥시다제 또는 알칼라인 포스파타제가 결합된 2차 항체를 점적한 다음 검체인 혈청을 글래스 패드 위에 떨어뜨려 반응시키도록 구성될 수 있다.

본 발명의 진단 키트는 쯔쯔가무시 이외의 다른 병원균을 함께 진단하기 위하여 1종 이상의 재조합 항원을 더 포함할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 이들 실시예는 본발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.

실시예 1. 오리엔티아 쯔쯔가무시의 순수 분리 및 염색체 DNA 분리

오리엔티아 쯔쯔가무시 파주(Orientia tsutsugamushiPajoo)를 2% 소태아혈청(fetal bovine serum)이 첨가된 DMEM 배지에서 배양된 L₉₂₉세포주(한국세포주은행)에 접종한 후, 34℃의 CO₂배양기(5%)에서 배양하였다. 미세 간접 면역형광항체법(MIFA)으로 균의 성장을 확인한 후, 균을 40% 퍼콜(Percoll)과 초원심분리(ultra centrifuge)(Bekman Sw 55Ti)를 이용하여 순수 분리하였다. QIAamp blood DNA kit(Qiagen사)를 이용하여 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주(Orientia tsutsugamushiPajoo)의 염색체 DNA를 분리하였다.

실시예 2. 올리고 뉴클레오타이드 합성, 정제 및 분석

오리엔티아 쯔쯔가무시 표면 항원 단백질을 코딩하는 유전자를 증폭하여 그 염기서열을 확인하기 위한 27머(mer)의 2개의 프라이머(서열번호 3 및 서열번호 4)를 합성하였다. 또한, 상기 올리고 뉴클레오타이드로 증폭된 DNA 조각으로부터 벡터로의 클로닝을 위한 유전자를 증폭하기 위해, 제한효소 인식 부위가 삽입된 30머의 2개의 프라이머(서열번호 5 및 서열번호 6)를 합성하였다.

상기에서, 올리고 뉴클레오타이드는 자동화된 뉴클레오타이드 합성기(ABI-Pharmacia사, 미국)를 이용하여 합성하였다. 이렇게 합성된 각 올리고 뉴클레오타이드는 15% 폴리아크릴아마이드젤(TE-붕산, pH8.3)에서 전기영동하여 합성 올리고뉴클레오타이드를 분리하였다. 전기영동 후 260nm와 280nm 파장을 갖는 자외선으로 올리고 뉴클레오타이드의 순도와 농도를 확인하였으며 이렇게 분리된 올리고 뉴클레오타이드 용액은 영하 70℃에서 감압하여 동결 건조하였다.

실시예 3. 중합효소연쇄반응(PCR)

주형 DNA(50ng), 10㎕의 10×LATaq중합효소완충액(500mM KCl, 15mM MgCl₂및 10mM Tris-HCl, pH8.3), 10㎕의 dNTP's 혼합액(dGTP, dATP, dTTP, dCTP 각 1.25mM씩 함유), 프라이머(실시예 2에서 합성한 올리고 뉴클레오타이드) 1㎕씩, 0.5㎕의 LATaqDNA 중합효소(Takara사, 일본)를 혼합한 용액에 증류수를 가하여 전체 양이 100㎕가 되게 하였다. 목적 유전자 염기 서열의 경우, 주형 DNA는 실시예 1에서 분리한 오리엔티아 쯔쯔가무시의 염색체 DNA이고 프라이머는 서열번호 3 및 서열번호 4의 올리고 뉴클레오타이드이며; 재조합 단백질의 클로닝을 위한 유전자 증폭의 경우, 주형 DNA는 염기서열 분석을 위한 PCR 결과로 나온 DNA 절편이며 프라이머는 서열번호 5 및 서열번호 6의 올리고 뉴클레오타이드이다.

PCR 반응을 위하여 온도순환기(Thermal cycler, Perkin-Elmer사, 미국)를 사용하였으며 변성 (denaturation) (94℃, 30초), 결합(annealing), (50℃, 30초), 연장 (extension) (72℃, 1분)을 30회 진행시키고, 마지막으로 72℃에서 5분간 추가반응시켰다. 그런 다음, 중합효소를 제거하기 위하여 PCR 정제 키트(Promega사, 미국)를 사용하였으며 정제된 PCR 산물은 추후의 실험에 사용하였다.

실시예 4. 발현벡터의 제조

유전자의 발현을 위하여 실시예 3에서 2차로 증폭한 유전자와 발현벡터인 pET-15b(Novagen사, 미국)를XhoI(NEB사, 미국)과BamHI(NEB사, 미국)으로 각각 절단한 다음, 발현벡터 0.1㎍과 재조합 단백질 유전자 30ng을 혼합하고 10배 농도의 접합 농축액(10mM DTT 및 100mM MgCl₂, 10mM ATP를 함유한 600mM Tris-HCl, pH7.5) 1㎕ 및 T4 DNA 연결효소(NEB사, 미국) 10 단위(Unit)를 가하여 전제부피를 10㎕로 조정하고 16℃에서 18시간 반응시켜 발현벡터 pET-15b(Takara사, 일본)에 상기 유전자가 삽입된 환상의 플라스미드를 제조하였으며, 이를 p56kDa라 명명하였다. 상기 플라스미드는 7308bp이다 (참조: 도1).

도1은 본 발명에 따른 발현벡터의 구축과정을 도식적으로 나타낸 것이다. 상기 발현벡터 p56kDa는 형질전환체인 대장균(Escherichia coli) BL21(Novagen사, 미국)에 삽입하였으며 형질전환된 대장균 BL21으로부터 발현벡터인 p56kDa를 재추출하여 제한효소를 처리하고 1% 아가로스 젤 전기영동하여 이중 제한효소 부위가 전기 발현벡터 p56kDa에 존재하는 것을 확인함으로써, 본 발명의 재조합 단백질 유전자가 바르게 삽입되었다는 것을 확인하였다. 또한, 상기 플라스미드(발현벡터)로부터 제조된 DNA 조각의 염기서열을 결정한 결과 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것으로 확인되었다.

실시예 5. 형질전환체의 제조

실시예 4에서 제조된 발현벡터 p56kDa 10ng을 이미 형질전환에 적합하도록제조된 대장균(E. coli) NovaBlue(Novagen사, 미국) 20㎕에 첨가하여 얼음 속에서 약 30분간 반응시키고 42℃에서 40초간 열충격을 주어 재조합 벡터가 형질전환체인 대장균 속으로 들어가도록 하였다. 다시 얼음 속에서 2분간 정치시키고 80㎕의 SOC 액체배지(GIBCO BRL사, 미국)를 넣고 37℃에서 1시간 진탕배양하여 엠피실린(Sigma사, 미국)이 100㎍/㎖ 함유된 고체 LB 배지에 배양하여 형질전환체를 선별하였다.

이때 상기 발현벡터 p56kDa를 함유하고 있는 형질전환체를 대장균 NIH/NV/56kDa-GEMT(Escherichia coli)로 명명하였으며, p56kDa 벡터를 함유하고 있는 형질전환체를 대장균 BL21(Novagen사, 미국)로 형질전환시킨 후 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B(Escherichia coli)로 명명하고, 한국 미생물 보존센터에 2003. 4. 30자로 기탁하였다.(수탁번호 KCCM 10489)

실시예 6. 재조합 단백질의 발현

형질전환체 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B을 100㎍/㎖의 엠피실린이 함유된 LB 고체배지에 접종하고 37℃에서 24시간 배양하고 배양된 균체를 LB 액체배지 5㎖에 현탁하여 균탁도가 600nm에서 흡광도가 0.6이 되도록 조절한 다음, 이 배양액 5㎖을 엠피실린이 100㎍/㎖ 함유된 LB 액체배지 500㎖에 접종하여 600nm의 흡광도에서 0.7-1.0이 되도록 37℃에서 200rpm으로 진탕 배양하였다. 이어 IPTG(isopropyl-β-D-thiogalactopylanoside, 바이오니아사, 한국)를 최종 농도가 1mM이 되도록 넣고, 37℃에서 200rpm으로 37℃에서 4∼5시간 진탕배양 (200 rpm)하여 발현을 유도시켰다. 배양 후 원심분리하여 균을 모으고 1/15M 인산완충 식염수(phosphate buffered saline, pH7.4)에 현탁시키고 균을 파쇄하여 파쇄액을 10% SDS-PAGE하였다(참조:도2). 도2에서 제 M 레인은 분자량 크기 마커이고, 제 1레인은 IPTG 유도 전의 세포 파쇄액을 전기 영동한 결과이며 제 2레인은 IPTG 유도 후 4시간 배양한 균의 파쇄액을 전기영동한 결과이며 화살표는 발현된 재조합 단백질의 위치를 나타낸다. 도2에 나타낸 바와 같이, 형질전환체 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B에서 재조합 단백질이 발현됨을 알 수 있다.

실시예 7. 재조합 단백질의 정제

재조합 단백질이 삽입된E.coliBL21을 배양하고 IPTG를 최종 농도 1mM 되도록 넣어주고 37℃에서 1.5시간 진탕배양 (200 rpm)하여 유도(induction) 시킨 후 4℃에서 5000 rpm으로 10분간 원심 분리하여 균체를 회수하고 PBS로 2회 세척했다. 준비된 균체를 10 ㎖의 PBS로 현탁시킨 후 균액을 15,000 psi에서 깨고 얼음 속에서 차게 유지시킨 후, 4℃에서 8,000rpm으로 10분간 원심분리하였다. 불용성의 침전체는 PBS 10ml로 2회 세척한 다음 용해액(lysis buffer)(20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH7.8)) 7-8ml에 현탁한 후 4℃에서 하룻밤 용해시켰다. 이 과정을 반복하여 12,000rpm에서 10분간 원심분리하고, 상등액을 취한 후 50% Ni-NTA 충진제(slurry) (Qiagen사) 4㎖를 용해액으로 2-3회 세척한 후 상등액과 섞어 상온에서 2-3시간 동안 결합시켰다. 컬럼에 상등액-충진제 혼합물이 거품이 발생되지 않도록 조심스럽게 충진하고 혼합액을 용출시킨 후 세척액(washing buffer)(10mM IMDZ, 20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8M Urea(pH6.0)) 10㎖으로 컬럼을 4회 세척했다. 세척된 컬럼에 용출 완충액(elute buffer)(300mM IMDZ, 20mM Na₂HPO₄, O.5M NaCl, 8MUrea(pH6.0)) 3ml를 통과시켜 재조합 단백질을 회수했다. 정제 과정 중의 단백질 변화 추이를 10% SDS-PAGE로 전기영동을 실시하여 정제과정이 정상적으로 진행되었는지 확인했다. (참조: 도3) 도3에서 레인1은 세포 파쇄액, 레인 2는 유출액, 레인 3-5는 세척된 액, 레인 6-9는 용출액에 대한 결과를 나타낸 것이다. 니켈 충진제를 보유하는 컬럼에 의해 히스티딘 잔기를 갖는 항원 단백질이 정제됨을 관찰 할 수 있었다. 정제된 재조합 항원 단백질의 발현양은 평균 765 ㎍ (17 ㎍/㎖) 이었다.

실시예 8. 정제된 재조합 단백질 항원을 이용한 ELISA 반응

실시예 7에서 정제된 재조합 단백질을 항원으로 이용하여 ELISA IgG, IgM를 실시하고 MIFA로 측정한 항체가와 민감도, 특이성을 비교하였다.

시료는 본 실험실에서 보관하고 있는 혈청을 대상으로 MIFA로 측정한 항체가에 따라 선정되었고 렙토스피라증, 신증후군출혈열과 교차 반응을 나타내지 않는 혈청을 사용하였다. ELISA는 정제된 일정량의 재조합 단백질을 코팅용액 (100ml 당 Na₂CO₃0.159 g, NaHCO₃0.293 g)로 희석해서 96홈(well) 플레이트에 100 ㎕씩 넣고 4℃에서 18-24시간 정치하였다. 재조합 단백질 용액을 완전히 제거하고 2% 소태아혈청을 포함한 완충액(PBS)(NaCl 8 g, KH₂PO₄0.2 g, Na₂HPO₄·7H₂O 2.17 g, KCl 0.2 g/ℓ, 저지 용액) 200 ㎕를 넣고 37℃에서 2시간 동안 반응시켰다. 저지 용액을 완전히 제거하고 0.01% 트윈-20(Tween-20)을 포함한 완충액 (PBS-T)로 5회 세척하고 1차 항체로 사용할 환자혈청을 완충액으로 1:100으로 희석하여 각 홈(well) 당 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. 200 ㎕의 완충액으로 각 홈을 5회 세척하고 2차 항체는 퍼옥시다제로 라벨된 항혈청 IgG (Sigma사, 미국)를 PBS에 1:25,000으로 희석해서 각 홈에 100 ㎕씩 넣고 37℃에서 1시간 동안 반응하였다. IgM을 검출하기 위한 2차 항체도 퍼옥시다제로 라벨된 항혈청 IgM (Sigma사, 미국)을 1:25000으로 희석해서 사용하였다. 반응이 끝난 후 완충액으로 각 홈을 5번 세척하였다. 발색제로 우레아 하이드로젠 퍼록시다제(urea hydrogen peroxide) (268mg)가 포함된 인산염 완충제 (Phosphate-citrate) 1정과 페닐렌디아민 디하이드로크로라이드 (o-Phenylene diamine dihydrochloride)(8mg) 1정을 20ml의 증류수에 10분 이상 녹여 준비하고 충분히 세척된 96홈 플래이트의 물기를 완전히 제거한 후 발색시약 100㎕씩을 홈에 첨가했다. 발색이 시작된 후 20분이 지나면 각 홈에 2 노르말(N)의 과산화수소(H₂O₂) 50 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정했다. 도4a는 재조합 단백질로 얻어진 쯔쯔가무시증 환자 혈청의 IgG ELISA 반응성과 대응하는 MIFA에 의한 역가의 스캐터그램이며, 도4b는 재조합 단백질로 얻어진 쯔쯔가무시증 환자 혈청의 IgM ELISA 반응성과 대응하는 간접 면역형광항체법(IFA)에 의한 역가의 스캐터그램이며, 점선은 대조군 건강한 사람의 평균 플러스 2D 반응을 나타낸다. 하기 표 1에 재조합 단백질 ELISA의 민감도(sensitivity)와 특이성(specificity)을 나타내었다. 활성 감염은 MIFA 역가 128 이상 또는 임상 증상의 존재 중 어느 하나로 정의되었으며, 사용된 컷오프는 대조군 건강한 사람의 평균 플러스 2SD 반응으로 결정되었으며, 괄호 안의 숫자는 ELISA양성 (민감도) 또는 음성(특이도) 혈청의 개수를 시험된 각각의 혈청 개수로나눈 값이다.

측정	민감도(%)	특이성(%)
재조합 단백질 IgM	83 (25/30)	97 (29/30)
재조합 단백질 IgG	83.8 (62/74)	96.6 (84/87)

상기 표1에서 알 수 있듯이, 쯔쯔가무시증 양성, 음성으로 판정된 혈청을 위 검체를 사용하여 재조합 항원 단백질을 이용한 ELISA(IgG) 결과는 MIFA IgG에 대해 83.8%, IgM은 83%의 민감도를 나타내었으며 특이성의 비교에 있어는 MIFA에 대해 IgG는 96.6%, IgM은 97%의 특이성을 나타냈다. 특히 질병의 진단에 있어 IgM 수치는 초기 감염의 지표로 이용되는 중요한 지표가 되므로 재조합 항원 단백질을 이용한 ELISA(IgM) 결과는 유의성이 높다.

실시예 9. 정제된 재조합 항원에 대한 효능 측정 및 교차반응

실시예 6에서 제조한 재조합 단백질 정제액 중 일정량을 취해 SDS-PAGE 전기영동을 실시한 후 니트로셀룰로오즈(NC)막 (Bio-Rad사, 미국)으로 반건조 전이(Hoefer사, 미국)를 이용하여 항원을 전이시켰다. 전이가 끝난 막을 1× 트리스-완충 식염수(TBS; 50 mM Tris-HCl, 200mM NaCl, pH 7.4)으로 5분간 3회 세척한 후 5% 탈지우유 (Difco Co.사, 미국)가 포함된 1× TBS-0.05% 트윈 20(TTBS)로 24시간 동안 저지반응(blocking)을 실시하였다. 탈지우유로 처리된 NC 막을 TTBS로 5분씩 3회 세척하고 대조군 및 쯔쯔가무시증 양성, 음성 환자 혈청을 5% 탈지우유를 가한 TTBS로 1:100 희석하여 NC 막에 처리하고 상온에서 18시간 동안 교반한 후 TTBS로 5분씩 3회 세척하였다. 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase, AP)가 결합된 항-인간-IgG(Anti-human-IgG, Sigma사, 미국)를 1:3,000으로 5% 탈지우유를 가한 TBS로 희석하여 상온에서 2시간 반응시킨 후 TTBS로 5분씩 3회 세척하였다. 발색은 5% NBT (nitro blue tetrazolium chloride in 70% dimethylformamide, Sigma사, 미국)와 5% BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate in 100% dimethylformamide, Sigma사, 미국)를 이용하여 NC 막을 발색시켰다.

기타 유사질환과의 교차반응 시험은 렙토스피라증, 신증후군출혈열, 바이러스성간염, 말라리아 등의 유사질환 환자 혈청들을 대상으로 위와 동일한 방법으로 웨스턴블럿 시험을 실시하여 교차반응 여부를 실시했다(참조: 도5). 도5의 1 레인은 음성대조군 2-5 레인은 쯔쯔가무시증 양성 혈청, 6레인은 쯔쯔가무시증 음성 혈청, 7 레인은 렙토스피라증 음성 혈청, 8-11 레인은 렙토스피라증 양성 혈청, 12-13 레인은 신증후군출혈열 양성혈청, 14-15 레인은 신증후군출혈열 음성혈청, 16-17 레인은 B형 바이러스성 간염 양성 혈청, 18-19레인은 C형 바이러스성간염 양성 혈청, 20-22 레인은 말라리아 양성 혈청, 23-24 레인은 말라리아 음성 혈청을 대상으로 교차 반응 시험을 한 결과를 나타냈다. 즉 재조합 단백질을 항원으로 한 웨스턴 블럿 결과 쯔쯔가무시증 양성 환자 혈청 모두에서는 특이밴드가 나타났고, 유사 질환인 렙토스피라증, 신증후군출혈열 혈청과 바이러스성 간염 양성, 말라리아 양성 혈청들과도 교차반응을 보이지 않았다. 그러나 8레인의 렙토스피라 양성 혈청에서 반응을 보인 것은 쯔쯔가무시증과의 이중 감염예로 사료된다. 한편 쯔쯔가무시증, 렙토스피라증, 신증후군출혈열 음성환자 혈청에서 모두 음성 결과를 나타내어 재조합 항원 단백질이 높은 항체 특이성을 갖는 것을 알 수 있으며, 이러한 재조합항원은 감별진단에 효과적으로 이용될 수 있다.

이상에서 상세히 설명한 바와 같이, 본 발명에 따른 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 갖는 재조합 단백질 또는 변이체는 쯔쯔가무시 감염자 또는 환자의 혈청 내의 항체에 대하여 우수한 반응성을 나타내며, 상기 재조합 단백질 또는 변이체를 코딩하는 본 발명에 따른 유전자는 그 발현과 유전자 조작이 용이하도록 인위적으로 설계되었을 뿐 아니라, 배양이 어려우며 시간이 오래 걸리는 쯔쯔가무시균의 배양에 비하여 대장균 형질전환체에 삽입되어 발현됨으로써 배양이 간단하여 산업적 유용성을 극대화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 또는 변이체는 쯔쯔가무시증의 진단 시약 또는 진단 키트, 혹은 쯔쯔가무시증의 예방 또는 치료용 백신의 제조에 유용성분으로서 이용될 수 있고, 오리엔티아 쯔쯔가무시에 대한 항체 생산에도 이용될 수 있다.

<110> Republic of Korea (National Institute of Health) <120> A recombinant protein useful for the detection of tsutsugamushi infection, a gene encoding the same, and a diagnostic kit using the same <160> 6 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 560 <212> PRT <213> Escherichia coli <400> 1 Gly Ser Arg Ile Ser Leu Glu Trp Leu Pro Leu Lys Asn Lys Phe Asn 1 5 10 15 Ser Phe Lys Glu Ile Arg Met Lys Lys Ile Met Leu Ile Ala Ser Ala 20 25 30 Met Ser Ala Leu Ser Leu Pro Phe Ser Ala Ser Ala Ile Glu Leu Gly 35 40 45 Asp Glu Gly Gly Leu Glu Cys Gly Pro Tyr Ala Lys Val Gly Val Val 50 55 60 Gly Gly Met Ile Thr Gly Ala Glu Ser Ala Arg Leu Asp Gln Ala Asp 65 70 75 80 Thr Thr Gly Lys Lys His Leu Pro Leu Thr Thr Ser Met Pro Phe Gly 85 90 95 Gly Thr Leu Asn Ala Gly Met Thr Ile Thr Pro Trp Leu Arg Ala Glu 100 105 110 Leu Gly Val Met Tyr Leu Arg Asn Ile Ser Ala Glu Val Glu Val Gly 115 120 125 Lys Gly Lys Val Glu Val Gly Lys Gly Lys Ala Asp Ser Gly Gly Gly 130 135 140 Thr Asp Ala Pro Ile Arg Lys Arg Phe Lys Leu Thr Pro Pro Gln Pro 145 150 155 160 Thr Ile Met Pro Ile Ser Ile Ala Asp Arg Asp Phe Gly Ile Asp Ile 165 170 175 Arg Asn Ile Pro Gln Ala Gln Ala Gln Ala Ala Gln Pro Gln Leu Asn 180 185 190 Asp Glu Gln Arg Ala Ala Ala Arg Val Ala Trp Leu Lys Asn Tyr Ala 195 200 205 Gly Ile Asp Tyr Arg Val Lys Asp Pro Asn Asn Pro Asn Gly Pro Met 210 215 220 Val Ile Asn Pro Val Leu Leu Asn Ile Pro Gln Gly Asn Pro Asn Pro 225 230 235 240 Val Gly Asn Pro Pro Gln Arg Ala Asn Gln Pro Ala Asp Phe Ala Ile 245 250 255 His Asn His Glu Gln Trp Arg Tyr Met Val Leu Asp Leu Leu His Tyr 260 265 270 Gln Met Leu Ile Asn Leu Ala Ile Leu Leu Ser Lys Tyr Leu Ser Asp 275 280 285 Lys Ile Thr Gln Ile Tyr Asn Asp Ile Arg Pro Phe Ala Asp Ile Val 290 295 300 Gly Ile Asp Val Pro Asn Gly Ala Leu Pro Asn Ser Ala Ser Val Glu 305 310 315 320 Gln Ile Gln Asn Lys Met Gln Glu Leu Asn Glu Leu Leu Glu Glu Val 325 330 335 Arg Asp Ser Phe Glu Gly Tyr Ile Gly Gly Asn Ala Phe Ala Asn Gln 340 345 350 Ile Gln Leu Asn Phe Val Ile Pro Gln Gln Ala Gln Gln Gln Gln Gln 355 360 365 Gln Gly Gln Gly Gln Gln Gln Gln Ala Gln Ala Thr Ala Gln Glu Ala 370 375 380 Ala Ala Ala Ala Ala Val Arg Leu Leu Asn Gly Asn Asp Gln Ile Val 385 390 395 400 Gln Leu Tyr Lys Asp Leu Val Lys Leu Lys Arg His Ala Gly Phe Lys 405 410 415 Lys Ser Met Asp Lys Leu Ala Ala Gln Gln Glu Glu Asp Ala Lys Gln 420 425 430 Lys Glu Glu Asp Ala Lys Gln Lys Glu Gly Ser Cys Lys Lys Asp Asp 435 440 445 Lys Glu Gly Val Ser Lys Glu Thr Glu Phe Asp Leu Ser Met Ile Val 450 455 460 Gly Gln Val Lys Leu Tyr Ala Asp Leu Val Ala Thr Glu Ser Phe Ser 465 470 475 480 Ile Tyr Ala Gly Val Gly Ala Gly Leu Ala His Thr Tyr Gly Lys Ile 485 490 495 Asp Asp Lys Asp Ile Lys Gly His Thr Gly Met Val Ala Ser Gly Ala 500 505 510 Leu Gly Val Ala Ile His Ala Ala Glu Gly Val Tyr Val Asp Ile Glu 515 520 525 Gly Ser Tyr Met Tyr Ser Phe Ser Lys Ile Glu Glu Arg Tyr Ser Ile 530 535 540 Asn Pro Leu Met Ala Ser Ile Ala Val Arg Tyr Asn Phe Gly Ser Phe 545 550 555 560 <210> 2 <211> 1683 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 2 ggctcgagaa ttagtttaga atggttacca ctaaaaaata aatttaattc ttttaaggag 60 attagaatga aaaaaattat gttaattgct agtgcaatgt ctgcgttgtc gttgccgttt 120 tctgctagtg cgatagaatt gggggatgaa ggaggattag agtgtggtcc ttatgctaaa 180 gttggagttg tcggaggaat gattactggc gcagaatctg ctcgcttgga tcaagctgat 240 actactggca aaaaacactt gccattaaca acctcgatgc catttggtgg tacattaaat 300 gcaggtatga caattactcc atggcttaga gcagagctag gggttatgta ccttagaaat 360 ataagcgctg aggttgaagt aggtaaaggc aaggttgaag taggtaaagg caaggcagat 420 tctggaggtg ggacagatgc tcctatacgt aagcggttta aacttacacc tcctcagcct 480 actataatgc ctataagtat agctgatcgt gactttggga ttgatattcg taacatacct 540 caggcgcaag cgcaagctgc gcagcctcag cttaatgatg agcaacgtgc tgcagctagg 600 gtcgcttggt taaagaatta tgctggtatt gactataggg taaaagatcc taataatcct 660 aatgggccta tggttataaa tccggtgttg ttaaatattc cacagggtaa ccctaatcct 720 gttggaaatc caccgcagcg agcaaatcag cctgcagatt ttgcgataca taaccatgag 780 caatggaggt atatggtatt ggacttgctg cattatcaaa tgctaataaa cctagcgatc 840 ctcctgtcaa agtatctaag tgataaaatt actcagatat ataatgatat aaggccattt 900 gctgatatag ttggtattga tgttcctaat ggtgctttgc ctaatagtgc atctgtcgaa 960 cagatacaga ataaaatgca agaattaaac gagctattag aagaggtcag agattctttt 1020 gaggggtata ttggtggtaa tgcttttgct aatcagatac agttgaattt tgtcataccg 1080 cagcaagcac agcagcagca gcagcagggg caagggcagc aacagcaagc tcaagctaca 1140 gcgcaagaag cagcagcagc agcagctgtt aggcttttaa atggcaatga tcagattgtg 1200 cagttatata aagatcttgt taaattgaag cgtcatgcag gatttaagaa atctatggat 1260 aaattagctg ctcaacaaga agaagatgca aagcaaaaag aagaagatgc aaagcaaaaa 1320 gaaggtagct gcaagaagga cgataaagaa ggagtaagca aagaaacaga gtttgatctg 1380 agtatgattg ttggtcaagt taaactctat gctgatctag ttgcaactga atcattctca 1440 atatatgctg gtgttggtgc agggttagct catacttatg gaaaaataga tgataaggat 1500 attaaagggc atacaggcat ggttgcatca ggggcgcttg gtgtagcaat tcatgctgct 1560 gagggtgtgt atgtggacat agaaggtagt tatatgtact cattcagtaa aatagaagag 1620 aggtattcaa taaatcctct tatggcaagt attgctgtac gctataactt ctagggatcc 1680 ttt 1683 <210> 3 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 3 tagtgtggct aaataattag tttagaa 27 <210> 4 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 4 tttaaagaaa aactagaagt tatagcg 27 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 5 ggctcgagaa ttagtttaga atggttacca 30 <210> 6 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 6 aaaggatccc tagaagttat agcgtacagc 30

Claims

서열번호 1의 아미노산 서열로 표시되는 재조합 단백질 또는 서열번호 1의 아미노산 서열과 90% 이상의 상동성을 가지고 오리엔티아 쯔쯔가무시 파주 (Orientia tsutsugamushiPajoo)의 표면항원 활성을 갖는 변이체.
제1항에 따른 재조합 단백질 또는 변이체를 코딩하는 유전자.
제2항에 있어서, 서열번호 2의 염기서열로 표시되는 유전자.
제2항에 따른 유전자를 포함하는 발현벡터.
제4항에 있어서, 상기 발현벡터가 p56kDa인 것을 특징으로 하는 발현벡터.
제4항에 따른 발현벡터로 형질전환된 숙주 세포.
제6항에 있어서, 수탁번호 제 KCCM 10489 호의 대장균 NIH/BL/56kDa-ET15B(Escherichia coliNIH/BL/56kDa-ET15B)인 것을 특징으로 하는 숙주 세포.
제6항 또는 제7항에 따른 숙주 세포를 배양하고 분리하는 단계를 포함하는 제1항에 따른 재조합 단백질 또는 변이체의 제조방법.
제1항에 따른 재조합 단백질 또는 변이체를 포함하는, 사람 및 포유동물에서 쯔쯔가무시균의 감염을 검출하기 위한 진단 키트.
제9항에 있어서, 상기 검출방법은 ELISA법 또는 면역크로마토그래피 반응법(Rapid immunochromatographic flow assay: RFA)인 것을 특징으로 하는 진단 키트.