KR100734995B1 - 마이코플라즈마 뉴모니아 검출용 항체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 마이코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)에 속하는 미생물을 특이적으로 높은 감도에서 신속하게 검출하는 방법, 이 검출에 사용하는 검출용 항체, 검출용 시약 키트 및 검출에 사용하는 검출용 항체의 제조 방법을 제공한다.
즉, 본 발명은 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 리보좀 단백질에 대한 항체로서, 이 미생물에 특이적으로 반응하는 항체, 이 항체를 사용하여 검체 중의 상기 미생물을 검출하는 방법 및 이 항체를 포함하는 검출용 시약 키트에 관한 것으로, 리보좀 단백질로서는 리보좀 단백질 L7/L12 단백질을 들 수 있으며, 폐렴의 원인 미생물의 감염 검출에 사용된다.
마이코플라즈마 뉴모니아, 리보좀 단백질, 폴리크로날 항체, 모노크로날 항체.
Description
본 발명은 일반적인 폐렴의 원인 미생물인 마이코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)에 속하는 미생물의 검출에 유용한 항체, 이 미생물의 검출 방법, 이 미생물의 검출용 시약 키트, 및 이 미생물 검출용 항체의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 의약품 업계, 특히 마이코플라즈마 뉴모니아에 의해 야기되는 비정형 폐렴 진단에 중요하며, 의약품 산업상 유용하다.
본 발명은 검체, 예를 들면 목구멍 면봉, 조직 샘플, 체액, 실험용 용액 및 배양물로부터 채취된 검체 중에 포함되는 미생물인 마이코플라즈마 뉴모니아를 검출하는 데 유용하다.
미생물 감염증의 진단은 통상 감염 부위 등에서의 원인균의 검출 내지 혈청, 체액 중의 원인균에 대한 항체 검출에 의해 확정된다. 특히, 이 진단은 원인균의 검출이 환자에 대한 신속한 치료를 가능하게 하는 의미에서 중요하다.
감염증 원인균의 검출은 일반적으로 원인균의 분리 배양을 거쳐, 그 생리학적, 생화학적 또는 구조적인 특성에 기초하여 이것을 동정하는 배양 동정법, 원인 균의 유전자를 폴리머라제 연쇄 반응 (Polymerase chain reaction, PCR)법 또는 특이적 핵산 혼성화에 의해 증폭시키고, 이것을 검출하는 유전자적 진단법 및 항체와 원인균의 항원 마커와의 특이적 반응을 이용하여 원인균을 검출하는 면역학적 방법으로 분류된다.
그러나, 배양 동정법 또는 유전자적 진단법을 사용하는 경우에는 결과를 얻는 데 장시간을 필요로 한다. 따라서, 원인균을 단시간에 높은 감도로 검출할 수 있고, 신속하고도 적절한 환자 치료로 이어지는 면역학적 방법에 의한 진단이 널리 사용되고 있다.
종래부터 면역학적 방법에 의한 감염증 원인균의 검출에는, 균종에 의해 여러가지 마커 항원과 항체의 조합이 사용되고 있다.
마이코플라즈마 뉴모니아는 폐렴, 기관지염 및 인두염의 일반적인 원인균이다. 작은 진균 모양의 그람음성균이며, 선택적으로 인간 체내에 침입하여 병을 일으킨다. 일반 사회에서 집단적으로 발병하는 폐렴의 약 15 내지 20 ％ 및 한정된 집단 내의 폐렴의 50 ％까지가 마이코플라즈마 뉴모니아에 의해 야기된다고 여겨지고 있다 (Ragnar Norrby 1999).
이 균은 매우 미세하여 배양하기 어려운 미생물이며, 농후 배지 중에서 작은 콜로니를 형성한다. 영양 부화 한천 배지 중에서의 마이코플라즈마 뉴모니아의 성장은 매우 완만하며, 배지 중에 균체를 동정하기까지 적어도 21일을 필요로 한다 (Granato, Poe, et al. 1980). 인간 체내에 기원을 갖는 몇가지 마이코플라즈마 종의 미생물은 동일한 생화학적 반응을 일으킨다. 한편, 세포벽이 없기 때문에 밝 은 현미경하에서의 관찰을 한층 더 어렵게 한다 (Knudson and MacLeod 1979). 따라서, 신속하게 병원균으로서 검출하는 진단법으로서 그람염색법과 배양법 등을 적용할 수 없다.
마이코플라즈마 뉴모니아 검출의 유전자 서열에 사용되는 DNA 혼성화 분석 프로브는 Hyman 등, Buck 등 및 Bernet 등, (Hyman, Yogev et al. 1987; Bernet, Garret et al. 1993; Buck, 0'Hara et al. 1993) 등에 의해 보고되어 있다. 마이코플라즈마 뉴모니아 리보좀 RNA (rRNA) 검출에 사용되는 프로브는 Tilton 등 (Tilton, Dias et al. 1980), Yogev 등 (Yogev, Halachmi et al. 1988), Gobel 등 (Gobel, Geiser et al. 1987), Zivin과 Monahan (EP0 305145) 및 Gobeland와 Stanbridge (EPO 250662) 등에 기재되어 있다. Kai 등 (Kai, Kamiya et al. 1987) 및 Jensen 등 (Jensen, Sondergard-Andersen et al. 1993) 등은 마이코플라즈마 뉴모니아의 16S rRNA 서열의 프라이머를 기재하고 있다. 여기에 기재된 모든 프로브는 마이코플라즈마 뉴모니아의 DNA 또는 마이코플라즈마 뉴모니아와 마이코플라즈마 게니탈리움(Mycoplasma genitalium)의 DNA에 대하여 설계되어 있다. 이들 프로브는 비교적 감도가 높기 때문에 극히 최근에 이용이 가능해진 기술, 예를 들면 PCR법을 이용하여 이들을 포획한다. PCR법은 매우 감도가 높으며, 나아가 혼성화보다도 단시간에 행할 수 있다. 그러나, 배양 마이코플라즈마 뉴모니아에 음성인 무증상의 인간, 및 병이 치유된 후의 활동하는 인간에게 양성을 나타내는 유사 양성의 문제가 종종 존재한다.
일본 특허 공개 (소)63-298호 공보에는 약 43 kD (kiloDalton)의 마이코플라 즈마 뉴모니아의 막항원 단백질에 대한 모노크로날 항체를 사용한 웨스턴 블롯법을 기초로 하는 면역 검출법이 기재되어 있다. 그러나, 상기 항체 및 해당 항체를 사용하는 검출법은 특이성이 낮아 마이코플라즈마 뉴모니아에 대한 종의 특이적 진단을 위해서는 불충분하다는 문제를 갖는다. 또한, 이 진단법에 따르면 결과가 나오기까지 적어도 5시간이 걸린다는 문제도 있다 (Madsen et al. 1988),
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해 이루어진 것이다. 즉, 본 발명은 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물을 특이적으로 높은 감도에서 신속하게 검출하는 방법, 그 검출에 사용하는 검출용 항체, 검출용 시약 키트를 제공하는 것을 과제로 한다. 또한, 본 발명은 그 검출에 사용하는 검출용 항체의 제조 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명자들은 모든 미생물에 있어서 동일한 기능이 보존되어 있는 단백질을 유용한 항원 단백질로서 발견하였다. 통상, 이러한 단백질의 구조 변화는 매우 적다고 예상된다. 그러나 놀랍게도 상기 단백질에 대한 항체는 미생물종 또는 속에 특이적이며, 이 단백질에 대한 항체는 미생물종 또는 속에 특이적인 식별에 사용하는 것이 가능한 다양성을 가짐과 동시에, 대상이 되는 미생물에 대해서는 그 모든 혈청형을 검출할 수 있는 것이 발견된 것이다. 더욱 상세하게는, 상기 단백질은 아미노산 서열의 변화를 거쳐 동일종 사이에서는 구조가 완전 동일하며, 종이 다른 경우에는 구조의 변화를 수반하는 종 특이성을 나타내는 유용한 단백질이다.
본 발명자들은 모든 미생물 세포에 동일 기능의 분자로서 존재하며, 나아가 그 아미노산 구조가 미생물마다 상이할 정도로 차이점을 갖는 세포 내 분자, 특히 리보좀 단백질의 1종인 리보좀 단백질(Ribosomal Protein) L7/L12 단백질에 주목하였다. 리보좀 단백질 L7/L12 단백질은 분자량 약 13 kD의 단백질이며, 단백질 합성에 필수적인 리보좀 단백질로서 존재하는 것이 알려져 있다. 특히 마이코플라즈마 뉴모니아를 포함하는 몇가지 미생물에서는 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 전체 아미노산 서열이 해석되어 있다.
본 발명자들은 이 분자가 미생물 사이에서 유사함에도 불구하고, 그 일부에 각 미생물 고유의 구조 부분을 갖는 것에 주목하고, 이 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 대한 항체를 사용함으로써 여러가지 미생물, 세균종에 특이적이고, 동시에 모든 동일 균종 내의 혈청형에 대하여 검출이 가능한 것을 발견하였다.
본 발명자들은 마이코플라즈마 뉴모니아의 상기 단백질에 특이적인 항체를 얻을 수 있고, 또한 이 항체를 사용함으로써 마이코플라즈마 뉴모니아의 특이적인 검출이 가능한 것을 발견하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명에 의해 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 대하여 특이적인 모노크로날 항체가 발견되고 개발되었다. 이 항체는 신규한 것이며, 종래 공지된 어떠한 항체와도 다르며, 상기 단백질과 특이적으로 반응하는 성질을 갖는다.
서열표에 있어서 서열 1 및 2는 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자의 DNA 서열 및 대응하는 아미노산 서열 (NCBI database accession #NC 000912)이다. 또한, 서열표에 기재된 아미노산 서열의 좌단 및 우단은 각각 아미노기 말단 (이하, N 말단) 및 카르복실기 말단 (이하, C 말단)이며, 또한 염기 서열의 좌단 및 우단은 각각 5' 말단 및 3' 말단이다. 크로스 매치 테스트의 아미노산 서열의 아미노산은 한문자의 약자로 표시되어 있다. 또한, 크로스 매치 테스트에서의 「+」 표기는 상이한 아미노산이지만 소수성 등의 성질이 유연 관계에 있는 아미노산을 말하며, 「」의 공란은 성질도 포함하여 전혀 상이한 아미노산을 나타낸다. 또한, 본 발명에서 설명되는 유전자 조작의 일련의 분자 생물학적 실험은, 통상의 실험서 기재 방법에 의해 행할 수 있다. 상기 통상의 실험서로서는, 예를 들면 문헌 [Molecular Cloning, A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Sambrook, J 등 (1989)]을 들 수 있다.
본 발명에 있어서 "미생물"이란 마이코플라즈마 뉴모니아를 의미하고, 특히 호흡기에서의 병원성을 가지며 마이코플라즈마 감염증의 원인균으로서 진단의 의의가 높은 미생물을 말한다. 본 발명에 있어서 "미생물과 특이적으로 반응하는 항체"란 미생물종 또는 속에 특이적으로 반응하는 항체를 가리키지만, 미생물 감염증의 진단에 있어서는 미생물종에 특이적으로 반응하는 항체가 특히 유용하다.
본 발명에 있어서 항체는 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체를 가리키며, 상기 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 전체 길이 또는 그의 부분 펩티드를 사용하여 제조할 수 있다. 항체를 제조하기 위한 펩티드의 길이는 특별히 한정되지 않지만, 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 대한 항체의 경우, 이 단백질을 특징짓는 길이면 충분하며, 바람직하게는 5 아미노산 이상, 특히 바람직하게는 8 아미노산 이상의 펩티드를 사용할 수 있다. 이 펩티드 또는 전체 길이 단백질을 그대로 또는 KLH (keyhole-limpet hemocyanin) 및 BSA (bovine serum albumin)와 같은 캐리어 단백질과 가교한 후 필요에 따라 보조제와 함께 동물에 접종시키고, 그 혈청을 회수함으로써 리보좀 단백질 L7/L12 단백질을 인식하는 항체 (폴리크로날 항체)를 포함하는 항 혈청을 얻을 수 있다. 또한, 항 혈청으로부터 항체를 정제하여 사용할 수도 있다. 접종하는 동물로서는 양, 말, 염소, 토끼, 마우스, 래트 등을 들 수 있으며, 특히 폴리크로날 항체의 제조에는 양, 토끼 등이 바람직하다. 또한, 하이브리도마 세포를 제조하는 공지된 방법에 의해 모노크로날 항체를 얻는 것도 가능하지만, 이 경우에는 마우스가 바람직하다.
또한, 상기 단백질의 전체 길이 또는 5 잔기 이상, 바람직하게는 8 잔기 이 상의 아미노산 서열을 글루타티온 S-트랜스페라제(GST) 등과 융합 단백질로 한 것을 정제하거나, 또는 미정제한 채 항원으로서 사용할 수도 있다.
성서 (Antibodies; A laboratory manual, E. Harlow et al., Cold Spring Harbor Laboratory Press)에 기재된 각종 방법 및 유전자 클로닝법 등에 의해 분리된 이뮤노글로불린 유전자를 사용하여 배양한 세포에 발현시킨 유전자 재조합 항체에 의해서도 제조할 수 있다.
본 발명의 마커 항원으로서 사용할 수 있는 리보좀 단백질 L7/L12에 대한 항체는 이하의 방법 또는 그 밖의 유사한 방법에 의해 취득할 수 있지만, 이들 방법으로 한정되는 것은 아니다.
a) 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 유전자 서열 및 아미노산 서열이 공지된 미생물에 대해서는, 다른 미생물에서의 상기 단백질의 아미노산 서열과의 유사성이 적은 영역에 대하여 펩티드 단편을 합성하고, 그것을 면역원으로서 폴리크로날 항체, 또는 모노크로날 항체를 제조함으로써 목적하는 항체를 취득할 수 있다.
또한, 공지된 상기 유전자의 양단 부위에서의 DNA 서열을 프로브로 한 PCR 방법에 의한 유전자 증폭, 상동 부분 서열을 주형 프로브로 한 혼성화법 등 통상의 유전자 조작 방법을 이용함으로써 상기 유전자의 전체 길이 서열을 취득할 수 있다.
그 후, 다른 단백질 유전자와의 융합 유전자 등을 구축하고, 대장균 등을 숙주로서 공지된 유전자 도입 방법에 의해 숙주 내에 해당 융합 유전자를 삽입하여 대량으로 발현시킨 후에, 융합 단백질로서 사용한 단백질에 대한 항체 친화성 칼럼 법 등에 의해 발현 단백질을 정제함으로써 목적으로 하는 단백질 항원을 취득할 수 있다. 이 경우 리보좀 단백질 L7/L12의 전체 길이 단백질이 항원이 되기 때문에 미생물 사이에서 보존되어 있는 아미노산 부분에 대한 항체를 취득해도 본 발명의 목적에 합치하지 않는다. 따라서, 본 방법에 의해 취득한 항원에 대해서는 공지된 방법에 의해 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 취득하고, 해당하는 미생물하고만 반응하는 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 목적하는 항체를 취득할 수 있다.
b) 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 아미노산 서열이 알려져 있지 않은 미생물에 대해서는, 그 중 하나의 방법으로 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 아미노산 서열이 균종 사이에서 50 내지 60 ％ 상동하므로, 그 아미노산 서열의 상동 부분의 서열을 기초로 하여 PCR법에 의한 특정 서열 부분의 유전자 증폭 및 상동 부분 서열을 주형 프로브로 한 혼성화법 등 통상의 유전자 조작 방법을 이용함으로써 상기 단백질 유전자를 쉽게 취득할 수 있다.
그 후 다른 단백질 유전자와의 융합 유전자 등을 구축하고, 대장균 등을 숙주로 하여 공지된 유전자 도입 방법에 의해 숙주 내에 해당 융합 유전자를 삽입하여 대량으로 발현시킨 후에, 융합 단백질로서 사용한 단백질에 대한 항체 친화성 칼럼법 등에 의해 발현 단백질을 정제함으로써 목적으로 하는 단백질 항원을 취득할 수 있다. 이 경우 리보좀 단백질 L7/L12의 전체 길이 단백질이 항원이 되기 때문에 미생물 사이에서 보존되어 있는 아미노산 부분에 대한 항체를 취득해도 본 발명의 목적에 합치하지 않는다. 따라서, 본 방법에 의해 취득한 항원에 대해서는 공지된 방법에 의해 모노크로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 취득하고, 해당하는 미생물하고만 반응하는 항체를 생산하는 클론을 선택함으로써 목적하는 항체를 취득할 수 있다.
c) 또는 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 아미노산 서열이 알려져 있지 않은 경우의 별도의 방법으로서, 공지된 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 아미노산 서열 중 미생물 사이에서 보존되어 있는 공통 서열 부분에 상당하는 5 내지 30 아미노산의 합성 펩티드를 제조하고, 그 펩티드 서열에 대하여 공지된 방법으로 폴리크로날 항체 또는 모노크로날 항체를 제조한다. 이 항체를 이용한 친화성 칼럼 크로마토그래피에 의해 목적하는 미생물 세포 파쇄액을 정제함으로써 고도로 정제된 리보좀 단백질 L7/L12 단백질을 취득할 수 있다. 단백질의 정제도가 부족한 경우에는 공지된 정제 방법인 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피, 겔 여과 등의 방법에 의해 정제한 후, 제조한 항체에 의한 웨스턴 블롯 등의 방법에 의해 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 용출 획분을 동정하여 정제 단백질을 얻을 수 있다. 얻어진 정제 리보좀 단백질 L7/L12 단백질 항원을 기초로 하여 공지된 방법에 의해 하이브리도마를 취득하고, 목적하는 미생물에 특이적으로 반응하는 하이브리도마를 선택함으로써 목적하는 항체를 취득할 수 있다.
상기 방법 a), b) 및 c)에 의해 얻어진 여러가지 미생물에 특이적인 본 발명의 항체는 여러가지 면역학적 분석법에 사용함으로써, 목적으로 하는 미생물에 특이적인 각종 진단 시약 및 키트를 제공할 수 있다. 예를 들면, 이 항체는 공지된 측정 방법인 폴리스티렌 라텍스 입자 상에 상기 항체를 흡착시킨 응집 반응, 마이 크로 타이터 플레이트 중에서 행하는 공지 기술인 ELISA법, 기존의 이뮤노크로마토그래피법, 착색 입자 또는 발색 능력을 갖는 입자, 또는 효소 또는 형광체로 표지된 상기 항체와 함께 포획(capture) 항체로 피복된 자기 미립자 등을 사용하는 샌드위치 분석 등 공지된 모든 면역 측정 방법에 사용할 수 있다.
항체를 사용하는 미생물 진단 방법이란, 폴리스티렌 라텍스 입자 상에 상기 항체를 흡착시킨 응집 반응, 마이크로 타이터 플레이트 중에서 행하는 공지 기술인 ELISA법, 기존의 이뮤노크로마토그래피법, 착색 입자 또는 발색 능력을 갖는 입자, 또는 효소 또는 형광체로 표지된 상기 항체와 함께 포획 항체로 피복된 자기 미립자 등을 사용하는 샌드위치 분석 등 공지된 모든 면역 측정 방법을 이용하는 진단 방법을 의미한다.
또한, 특히 항체를 사용하는 유용한 미생물 진단 방법으로서 일본 특허 공표 (평)7-509565호 공보에 기재되어 있는 실리콘, 질화규소 등에 의해 형성된 광학 박막 상에서 항체 반응을 행하여 광간섭 원리 등에 의해 검출하는 이른바 광학적 면역 분석 (OIA, Optical Immunoassay) 등이 고감도 진단 방법으로서 유용하다.
또한, 상기 검출 방법에 있어서 필요시되는 미생물로부터의 세포 내 마커 항원의 추출 방법으로서는, Triton X-100, Tween-20을 비롯한 여러가지 계면활성제를 사용한 추출 시약에 의한 처리법, 적당한 프로테아제 등의 효소를 사용하는 효소 처리법, 물리적 방법에 의한 미생물 세포의 파쇄를 비롯하여 공지된 세포 구조의 파쇄 방법이 이용된다. 계면활성제 등의 조합에 의해 미생물별로 시약에 의한 최적의 추출 조건을 설정하는 것이 바람직하다.
또한, 본 발명에서의 항체를 사용하는 미생물 검출용 시약 키트란, 해당 검출 방법을 이용한 검출용 시약 키트에 상당한다.
마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 아미노산 서열 및 DNA 서열을 서열표에 나타내었다. 따라서, 이 미생물의 경우에는 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 아미노산 서열을, 서열표에 "크로스 매치"라고 기재한 유사한 미생물의 동종의 단백질과 비교하는 것이 가능하다. 상동성이 낮은 세그멘트의 펩티드를 합성하고, 이에 대한 폴리크로날 또는 모노크로날 항체를 제조하는 것은 미생물에 대한 특이성을 갖는 것의 선택을 생략할 수 있게 한다.
특히 폴리크로날 항체의 경우, 면역된 동물의 항 혈청을 단백질 A 칼럼 등으로 정제하여 IgG 획분을 취득한 후, 또한 동물 면역에 사용한 합성 펩티드에 의한 친화성 정제를 실시하는 것이 바람직하다.
또한, 해당 미생물의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 DNA 서열로부터 N 말단과 C 말단의 서열에 기초하여 PCR 프라이머가 제조되었다.
이 PCR 프라이머의 상동성을 이용하고, 게놈 DNA를 이용하여 PCR법에 의해 DNA 단편을 증폭시키고, 이것을 추출하여 통상법에 의해 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자의 단편을 취득할 수 있다. 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자의 전체 길이는 이들 단편의 DNA 서열 정보를 분석함으로써 알 수 있다.
취득한 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자는, 예를 들면 GST 등과 융합 단백질 유전자를 구성하고, 적당한 발현용 플라스미드를 사용하 여 발현 벡터를 구축한 후, 대장균 등을 형질 전환하여 상기 단백질을 대량 발현시킬 수 있다. 형질 전환된 대장균을 적당량 배양하고, 균체 파쇄액을 GST를 이용한 친화성 칼럼으로 정제함으로써 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질과 GST의 융합 단백질을 얻을 수 있다.
이 단백질을 그대로 또는 GST 부분을 절단한 후, 항원 단백질로서 공지된 방법에 의해 복수의 하이브리도마 클론을 확립하고, 마이코플라즈마 뉴모니아 항체 또는 균체 파쇄액 또는 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 특이적인 반응을 나타내는 항체를 선택함으로써, 목적하는 특이적 모노크로날 항체를 취득하는 것도 가능하다.
본 발명에 기초하여 제조된 항체는, 공지된 측정 방법인 폴리스티렌 라텍스 입자 상에 상기 항체를 흡착시킨 응집 반응, 마이크로 타이터 플레이트 중에서 행하는 공지된 기술인 ELISA법, 기존의 이뮤노크로마토그래피법, 착색 입자 또는 발색 능력을 갖는 입자, 또는 효소 또는 형광체로 표지된 상기 항체와 함께 포획 항체로 피복된 자기 미립자 등을 사용하는 샌드위치 분석 등 공지된 모든 면역 측정 방법에 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에 기초하여 제조된 항체는 모든 면역 측정 방법에 있어서 해당 항원 단백질을 고상 또는 액상 중에서 포획하는, 이른바 포획 항체로서 기능할 수 있음과 동시에 퍼옥시다제 및 알칼리포스파타제 등의 효소를 공지된 방법에 의해 수식하여 이른바 효소 표지 항체로 함으로서 검출용 항체로서도 기능할 수 있다.
이하의 예는 본 발명을 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명에 대하여 그 범위를 한정하는 것은 전혀 아니다.
<실시예 1>
마이코플라즈마 뉴모니아로부터의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자의 클로닝
마이코플라즈마 뉴모니아 (ATCC15531, ATCC로부터 분양, 구입)를 마이코플라즈마 슈플레멘트 (Mycoplasma Supplement) (DIFCO, 0836-68-9)를 첨가한 PPLO 한천 배지 (DIFCO, 0412-17-3) 상에 적당량 식균한 후, CO2 배양기 내에서 37 ℃, 5 ％ CO2의 조건하에 5시간 배양하였다. 생육한 콜로니를 최종적으로 5×109 CFU/㎖ 전후가 되도록 TE 완충액 (와꼬 쥰야꾸 고교 제조)에 현탁하였다. 이 현탁액 약 1.5 ㎖를 미량 원심 튜브에 옮겨 10,000 rpm으로 2분간 원심 분리하고, 상등액을 제거하였다. 침전 부분을 567 ㎕의 TE 완충액에 재현탁하였다. 또한, 30 ㎕의 10 ％ SDS와 3 ㎕의 20 ㎎/㎖ 프로테이나제 K 용액을 첨가하여 잘 혼합하고, 37 ℃에서 1시간 배양하였다. 현탁액을 56 ℃에서 1시간 더 배양하였다. 이어서, 10 ％의 세틸트리메틸암모늄브로마이드/0.7 M NaCl 용액을 80 ㎕ 첨가하여 잘 혼합한 후, 65 ℃에서 10분간 배양하였다. 동일 체적의 24:1의 클로로포름-이소아밀알콜 혼합액을 700 ㎕ 첨가하여 잘 교반하였다.
이 용액을 미량 원심기에서 12,000 rpm으로 5분간 4 ℃에서 원심 처리한 후, 수층 획분을 새로운 미량 원심관으로 옮겼다. 여기에 0.6 배량의 이소프로판올을 첨가하고 튜브를 잘 흔들어 DNA의 침전을 형성하였다. 흰 DNA 침전을 유리 막대로 떠 1 ㎖의 70 ％ 에탄올 (-20 ℃로 냉각한 것)이 들어간 별도의 미량 원심관으로 옮겼다. 그 후, 튜브를 10,000 rpm으로 5분간 원심 분리하고, 상등액을 조심히 제거하였다. 1 ㎖의 70 ％ 에탄올을 추가하여 혼합물을 5분간 더 원심 분리하였다.
다시 상등액을 제거한 후, 침전을 100 ㎕의 TE 완충액에 용해하여 DNA 용액을 얻었다. 이 게놈 DNA 용액의 농도를 문헌 [Molecular Cloning, A laboratory manual, 1989, Eds. Shambrook, J., Fritsch, E. F., and Maniatis, T., Cold Spring harbor Laboratory Press의 E5, Spectrophotometric Determination of the Amount of DNA or RNA]의 방법에 따라 정량하였다.
이 게놈 DNA 중 10 ng을 사용하여 PCR (polymerase chain reaction)을 행하였다. PCR은 Taq 폴리머라제 (다까라 슈조사 제조, 코드 R001A)를 사용하였다. 효소에 첨부된 완충액 5 ㎕, 효소에 첨부된 dNTP 혼합물 4 ㎕ 및 각 200 pmol의 올리고뉴클레오티드 (서열표 서열 3 및 4에 나타낸 것)를 효소에 첨가하였다. 전체 용량이 50 ㎕가 되도록 정제수를 첨가하였다.
이 혼합물을 TaKaRa PCR Thermal Cycler 480을 사용하여 95 ℃에서 1분, 50 ℃에서 2분, 72 ℃에서 3분을 5 사이클 행한 후, 95 ℃에서 1분, 60 ℃에서 2분, 72 ℃에서 3분을 25 사이클 행하였다. 이 PCR 생성물의 일부를 사용하여 1.5 ％ 아가로스 겔 중에서 전기 영동을 실시하였다. 에티듐브로마이드 (닛본 진사 제조)로 염색한 후, 자외선하에서 관찰하여 약 400 bp의 cDNA가 증폭되어 있는 것을 확인하였다. 제한 효소 BamHI 및 XhoI을 사용하여 절단한 후, 1.5 ％ 아가로스 겔 중에서 전기 영동과 에티듐브로마이드에 의한 염색을 행하였다. 겔로부터 약 400 bp의 밴드를 절취하였다. 이 밴드를 Suprec01 (다까라 슈조 가부시끼 가이샤 제조)로 정제하고, 일반적인 벡터인 pGEX-6P-1 (파마시아사 제조)에 삽입하였다. 이 벡터는 목적하는 유전자 단편을 적당한 제한 효소 부위에 삽입함으로써 GST 단백질과의 융합 단백질을 발현할 수 있는 목적 분자의 발현 벡터로서 기능할 수 있다.
구체적으로는 벡터 pGEX-6P-1과 상기의 DNA를 그 몰비가 1:3이 되도록 혼합하여 T4 DNA 리가제 (인비트로겐사 제조)로 벡터에 DNA를 삽입하였다. DNA를 삽입한 벡터 pGEX-6P-1은 대장균의 원 샷 콤피텐트 셀에 유전자학적 방법에 의해 도입하고, 이어서 50 ㎍/㎖의 암피실린 (시그마사)을 포함하는 반고체형의 배양 플레이트인 LB L-브로스 한천 (다까라 슈조 가부시끼 가이샤 제조)에 접종하였다. 플레이트를 37 ℃에서 12시간 배양하고, 성장한 콜로니를 무작위로 선택하여 동일 농도의 암피실린을 포함하는 L-브로스 배양액에 접종하였다. 37 ℃에서 8시간 진탕 배양ㆍ집균한 후, 위저드 미니프렙(Wizard Miniprep)을 사용하여 첨부된 설명서에 따라 플라스미드를 분리하였다. 플라스미드는 제한 효소 BamHI/XhoI로 절단 처리하였다. 약 370 bp의 DNA를 절단함으로써 PCR 생성물의 삽입을 확인하였다. 삽입된 DNA의 염기 서열을 상기 클론을 사용하여 결정하였다.
삽입 DNA 단편의 염기 서열 결정은 어플라이드 바이오시스템즈 (Applied Biosystems)사 제조의 형광 시퀀서를 사용하여 실시하였다.
시퀀스 샘플의 제조는 PRISM, Ready Reaction Dye Terminator Cycle Sequencing Kit (어플라이드 바이오시스템즈사 제조)를 사용하여 행하였다. 우선, 9.5 ㎕의 반응액, 4.0 ㎕의 0.8 pmol/㎕ T7 프로모터 프라이머 (Gibco BRL), 및 6.5 ㎕의 0.16 ㎍/㎕ 템플레이트 DNA를 0.5 ㎖의 마이크로 튜브에 첨가하여 혼합하였다. 혼합물을 2층의 100 ㎕ 광유로 피복한 후, 25 사이클 PCR 증폭 처리를 행하였다. 여기에서 1 사이클은 96 ℃에서의 30초간 처리, 55 ℃에서의 15초간 처리, 및 60 ℃에서의 4분간 처리로 이루어진다. 생성물을 4 ℃에서 5분간 유지하였다. 반응 종료 후, 80 ㎕의 무균 정제수를 첨가하여 교반하였다. 생성물을 원심 분리하고, 수층을 페놀-클로로포름 혼합액으로 3회 추출하였다. 10 ㎕의 3 M 아세트산 나트륨 pH 5.2와 300 ㎕의 에탄올을 100 ㎕의 수층에 첨가하여 교반하였다. 그 후 14,000 rpm으로 실온에서 15분간 원심 분리하고, 침전을 회수하였다. 침전을 75 ％ 에탄올로 세정한 후, 진공하에 2분간 정치하여 건조시키고 시퀀스용 샘플로 하였다. 시퀀스 샘플은 4 ㎕의 10 mM EDTA를 포함하는 포름아미드에 용해하여 90 ℃에서 2분간 변성시켰다. 이것을 얼음 중에서 냉각하여 시퀀스로 사용하였다.
무작위로 선택한 5개의 클론 중 2개는 PCR에 사용한 프로브와 서열상의 상동성을 갖고 있었다. 또한, 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 유전자 서열과 일치한 DNA 서열이 명백하였다. 그 구조 유전자 부분의 전체 염기 서열 및 대응하는 아미노산 서열은 서열표 서열 1 및 2에 나타낸 바와 같은 서열이었다. 이 유전자 단편은 확실히 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 유전자를 코딩하는 것이었다.
<실시예 2>
마이코플라즈마 뉴모니아로부터의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자의 대장균에 서의 대량 발현과 정제
발현 벡터를 삽입한 대장균을 LB 배지 중에서 50 ㎖, 37 ℃에서 하룻밤 배양하였다. 500 ㎖의 2배 농도의 YT 배지를 37 ℃에서 1시간 가열하였다. 하룻밤 배양한 대장균액 50 ㎖를 상술한 500 ㎖의 배지에 넣었다. 1시간 후, 550 ㎕의 100 mM 이소프로필 β-D(-)-티오갈락토피라노시드(IPTG)를 도입하여 4시간 배양하였다. 생성물을 회수하고, 250 ㎖의 원심 튜브에 옮겨 7000 rpm으로 10분간 원심 분리하였다. 상등액을 제거하고 50 mM Tris 완충액 pH 7.4, 25 ％ 수크로스를 포함하는 용균(Lysis) 완충액 25 ㎖씩에 용해하였다. 또한, 10 ％ NP-40 1.25 ㎖, 1 M MgCl2 125 ㎕를 첨가하여 플라스틱 튜브에 옮겼다. 빙냉하에서 1분간 초음파 처리를 5회 행하였다. 그 후, 12,000 rpm으로 15분간 원심 분리하고, 상등액을 회수하였다.
이어서, PBS로 조절한 글루타티온 아가로스 칼럼에 상기의 상등액을 흡착시켰다. 이어서, 20 mM Tris 완충액 pH 7.4, 4.2 mM MgCl2, 1 mM 디티오트레이톨 (DTT)을 포함하는 세정액으로 칼럼을 2 베드 볼륨분 세정하였다. 5 mM의 글루타티온을 포함하는 50 mM Tris 완충액 pH 9.6 중에서 용리 처리하였다. 용출 획분의 단백질 함유량을 피그멘트 결합법 (Bradford법; BioRad Co.)으로 결정하여 주획분을 취득하였다.
얻어진 정제 GST 융합 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 순도를 전기 영동법에 의해 확인했더니 약 75 ％로서, 면역원으로서 충분한 순도를 확보할 수 있었다.
<실시예 3>
마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 대한 모노크로날 항체의 제조
우선, 마우스 면역에 대해서는 마이코플라즈마 뉴모니아의 GST 융합 리보좀 단백질 L7/L12 단백질 항원 100 ㎍을 200 ㎕의 PBS에 용해한 후, 프로인트의 완전 보조제를 200 ㎕ 첨가하여 혼합하였다. 에멀젼화한 후 200 ㎕를 복강 내에 주사하였다. 동일 에멀젼화 항원을 2주 후, 4주 후 및 6주 후에 복강 내에 주사하였다. 2배 농도의 에멀젼화 항원을 10주 후 및 14주 후에 복강 내에 주사하였다. 최종 면역화 종료 3일 후에 비장을 적출하여 세포 융합하였다.
무균적으로 추출한 마우스의 비세포 108개에 대하여 골수종 세포 2×107개를 유리 튜브에 옮겨 잘 혼합한 후 1500 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상등액을 제거하고, 그 후 세포를 잘 혼합하였다.
세포 융합에 사용한 골수종 세포는 NS-1계의 세포주를 사용하여 10 ％의 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 배양하고, 세포 융합 2주 전부터 0.13 mM의 아자구아닌, 0.5 ㎍/㎖의 MC-210, 10 ％의 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 1주일 배양한 후, 10 ％의 소태아 혈청을 포함하는 RPMI1640 배지에서 1주일 더 배양한 것을 사용하였다.
37 ℃로 유지한 RPMI1640 배양액 50 ㎖를 혼합 세포 시료에 첨가하여 1,500 rpm으로 원심 분리하였다. 상등액을 제거한 후, 37 ℃로 유지한 50 ％ 폴리에틸렌글리콜 1 ㎖를 첨가하여 1분간 교반하였다. 37 ℃로 유지한 RPMI1640 배양액 10 ㎖를 첨가하고, 혼합액을 살균한 피펫으로 약 5분간 흡인ㆍ배출함으로써 세차게 교반하였다.
5분간 1,000 rpm으로 원심 분리하여 상등액을 제거한 후, 세포 농도가 5×106/㎖가 되도록 30 ㎖ HAT 배양액을 첨가하였다. 이 혼합물을 균일해질 때까지 교반하고, 0.1 ㎖씩을 96 구멍의 배양 플레이트에 부어 37 ℃, 7 ％의 탄산 가스 분위기하에서 배양하였다. HAT 배지를 1일, 1주 및 2주에 각각 0.1 ㎖씩 첨가하고, ELISA법에 의해 원하는 항체를 생산하는 세포를 스크리닝하였다.
0.05 ％의 아지드화 소다를 포함하는 PBS 중에 용해한 GST 융합 리보좀 단백질 L7/L12 단백질 및 GST 단백질을 각각 10 ㎍/㎖ 농도로 희석한 액체를 100 ㎕씩 96 구멍 플레이트에 각각 분액하여 4 ℃에서 하룻밤 흡착시켰다.
상등액을 제거한 후, 1 ％ 소혈청 알부민 용액 (PBS 중) 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 블록킹하였다. 상등액을 제거한 후, 생성물을 세정액 (0.02 ％ Tween20, PBS)으로 세정하였다. 여기에 융합 세포의 배양액 100 ㎖를 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 상등액을 제거하고, 침전을 세정액으로 세정하였다. 이어서, 농도 50 ng/㎖의 퍼옥시다제로 표지한 염소 항-마우스 IgG 항체 용액 100 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켰다. 상등액을 제거하고, 생성물을 다시 세정액으로 세정하였다. TMB 용액 (KPL사 제조)을 100 ㎕씩 첨가하여 혼합물을 실온에서 20분간 반응시켰다. 착색한 후 1 N의 황산 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지하고, 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
그 결과, GST 융합 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에만 반응하고 GST 단백질에는 반응하지 않는 양성 웰이 발견되어, 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 대한 항체가 포함되어 있는 것이 판명되었다.
따라서, 양성 웰 중의 세포를 각각 회수하여 24 구멍 플라스틱 플레이트 중에 HAT 배지에서 배양하였다.
배양한 융합 배지를 세포수가 약 20개/㎖가 되도록 HT 배지에서 희석하고, 50 ㎕를 HT 배지에 현탁한 6주령의 마우스 세포 106개와 96 구멍 배양 플레이트 중에서 혼합하였다. 혼합 후, 7 ％ C02의 조건하에 37 ℃에서 2주간 배양하였다.
배양 상등액 중의 항체 활성을 상술한 ELISA법으로 동일하게 검정하고, 리보좀 단백질 L7/L12 단백질과의 반응 양성의 세포를 회수하였다. 또한, 동일한 희석 검정, 클로닝 조작을 반복하여 하이브리도마 MPRB-1 내지 5의 총 5 클론을 취득하였다.
<실시예 4>
마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질을 검출하는 모노크로날 항체의 선택
상술한 바와 같이 취득한 양성 하이브리도마 세포를 사용하여 정법에 따라 모노크로날 항체를 생산 회수하였다.
구체적으로는 RPMI1640 배지 (10 ％ FCS 삽입)를 사용하여 계대 배양한 세포를 미리 2주 전에 0.5 ㎖의 프리스탄을 복강 내에 주사한 Blab/C 마우스의 복강 내 에 5×106개 (PBS 중) 주사하였다. 3주 후 복수를 회수하고, 그 원심 분리 상등액을 취득하였다.
얻어진 항체를 포함하는 용액을 단백질 A 칼럼 (5 ㎖, 파마시아 제조)에 흡수시켜 3 배량의 PBS로 세정하였다. 이어서, 시트르산 완충액 pH 3으로 용출하였다. 항체 획분을 회수하고, 각 하이브리도마에 의해 생산된 모노크로날 항체를 취득하였다. 이 5 균주의 하이브리도마 유래의 모노크로날 항체를 사용하여 ELISA법에 의해 평가하였다.
모노크로날 항체의 평가에는 샌드위치 분석법을 이용하였다. 제조된 모노크로날 항체를 퍼옥시다제에 결합시킴으로써 검출용 항체로서 사용하였다.
효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제 (시그마 등급 VI)를 사용하고, 결합에는 시약 S-아세틸티오아세트산 N-히드록시숙신이미드를 사용하여 문헌 [Analytical Bio-chemistry 132(1983), 68-73]에 기재되어 있는 방법에 따라 행하였다. ELISA 반응에 있어서는 시판되고 있는 항 마이코플라즈마 뉴모니아 폴리크로날 항체 (바이오디자인(Biodesign)사, 토끼)를 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 액체를 100 ㎕씩 96 구멍 플레이트에 각각 분액하여 4 ℃에서 하룻밤 흡착시켰다.
상등액을 제거한 후, 1 ％ 소혈청 알부민 용액 (PBS 중) 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 블록킹하였다. 상등액을 제거한 후, 생성물을 세정액 (0.02 ％ Tween20, PBS)으로 세정하였다. 여기에 각 미생물의 배양액에 농도 0.3 ％가 되는 양의 Triton X-100을 첨가하여 상온에서 5분간 추출함으로써 얻어진 항 원 용액 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 상등액을 제거하고, 생성물을 다시 세정액으로 세정하였다. 이어서, 농도 5 ㎍/㎖의 퍼옥시다제 표지 항 리보좀 단백질 L7/L12 단백질 항체 용액 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 상등액을 제거하고, 생성물을 다시 세정액으로 세정하였다. TMB 용액 (KPL사 제조)을 100 ㎕씩 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분간 반응시켰다. 착색한 후 1 N의 황산 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지하였다. 450 nm의 흡광도를 측정하였다.
효소 표지 항체로서 하이브리도마 MPRB-1 유래의 모노크로날 항체를 사용한 경우, 시험한 마이코플라즈마 뉴모니아의 모든 균주를 106개/㎖의 감도로 검출함과 동시에 다른 헤모필러스 인플루엔자 (Haemophilus influenzae), 클렙시엘라 뉴모니아 (Klebsiella pneumoniae), 클라미디아 뉴모니아 (Chlamydia pneumoniae) 및 나이세리아 메닌지타이즈 (Neisseria meningitides) 등의 미생물에 대하여 108개/㎖의 고농도에서도 반응성을 나타내지 않고, 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 대한 모노크로날 항체를 사용함으로써 마이코플라즈마 뉴모니아에 특이적인 반응성을 갖는 항체를 취득하는 것을 명확하게 확인할 수 있었다. 이 항체는 AMMP-1이라고 명명되었다. 표 2는 AMMP-1을 사용한 결과만을 나타낸다. 별도의 미생물과 교차 반응을 나타내는 다른 항체를 사용한 결과는 여기에서 언급하지 않는다.
| 검출결과 (106 세포/ml) | |
| 엠. 뉴모니아 (M. pneumoniae) | + |
| 검출결과 (108 세포/ml) | |
| 엔. 메닌지타이즈 (N. meningitides) | - |
| 엔. 락타미카 (N. lactamica) | - |
| 엔. 뮤코사 (N. Mucosa) | - |
| 엔. 시카 (N. sicca) | - |
| 에이치. 인플루엔자 (H. influenzae) | - |
| 비. 카타르해리스 (B. catarrharis) | - |
| 엔. 고노르호에아 (N. gonorrhoeae) | - |
| 이. 콜라이 (E. coli) | - |
| 케이. 뉴모니아 (K. pneumoniae) | - |
| +; 포지티브, -; 네가티브 | |
<실시예 5>
리보좀 단백질 L7/L12 단백질 고정화 친화성 칼럼을 사용한 마이코플라즈마 뉴모니아 리보좀 단백질 L7/L12 단백질과 특이적으로 반응하는 폴리크로날 항체의 취득
실시예 1에 기재된 방법에 의해 취득한 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질 또는 Triton X-100 처리한 균체의 상등액을 항원으로서 사용하였다. 100 ㎍의 항원을 포함하는 생리 식염수 약 1.2 ㎖를 프로인트 보조제 1.5 ㎖와 함께 유화하였다. 에멀젼을 SPF 일본 백색 토끼에 피하 주사하여 토끼를 면역화하였다. 2주간 걸러씩 5 내지 6회 면역시켜 항체값을 확인하였다.
항체값의 확인은 ELISA법에 의해 실시하였다. 0.05 ％의 아지드화 소다를 포함하는 PBS 중에 용해한 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질을 10 ㎍/㎖의 농도로 희석한 액체를 100 ㎕씩 96 구멍 플레이트에 분액하고, 4 ℃에서 하룻밤 흡착시켰다. 상등액을 제거한 후, 1 ％ 소혈청 알부민 용액 (PBS 중) 200 ㎕를 첨가하여 실온에서 1시간 반응시켜 블록킹하였다. 상등액을 제거한 후, 생성물을 세정액 (0.02 ％ Tween20, PBS)으로 세정하였다. 정상적인 토끼 혈청 및 면역화된 토끼의 항 혈청을 희석하여 얻어진 용액 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 2시간 반응시켰다. 상등액을 제거하고, 생성물을 다시 세정액으로 세정하였다. 이어서, 농도 50 ng/㎖의 퍼옥시다제 표지 항 토끼 IgG 항체 용액 100 ㎕를 첨가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 상등액을 제거하고, 생성물을 다시 세정액으로 세정하였다. OPD 용액 (시그마사 제조)을 100 ㎕씩 첨가하고, 혼합물을 실온에서 20분간 반응시켰다. 착색한 후 1 N의 황산 100 ㎕를 첨가하여 반응을 정지하였다. 492 nm의 흡광도를 측정하였다.
항체값 상승을 확인한 후, 대량 채혈을 실시하였다. 귀동맥에서 혈액을 유리로 된 원심관에 채취하여 37 ℃에서 1시간 방치한 후, 4 ℃에서 하룻밤 정치하였다. 그 후, 3000 rpm으로 5분간 원심 분리하여 상등액을 회수하였다. 얻어진 항 혈청은 4 ℃에서 보존하였다.
마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질을 고정화한 친화성 칼럼을 제조하였다. HiTrap NHS 활성화 칼럼 (1 ㎖, 파마시아사 제조)을 사용하였다. 칼럼을 1 mM HCl로 치환한 후 바로 리보좀 단백질 L7/L12 단백질의 PBS 용액 (1 mg/㎖)을 첨가하였다. 칼럼을 30분간 정치한 후, 블록킹 시약을 첨가하여 PBS로 평형화하였다.
이 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질 고정화 친화성 칼럼을 사용하여, 마이코플라즈마 뉴모니아의 Triton X-100 처리한 균체의 상등액을 항원으로서 얻어진 항 혈청 중의 폴리크로날 항체를 정제하였다. 이 항 혈청을 PBS로 5배 희석하고, 0.45 ㎛의 필터를 통과시킨 후, 유속 0.5 ㎖/분으로 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질 고정화 칼럼에 흡착시켰다. 그 후, 0.1 M 글리신 완충액 pH 2.1로 칼럼으로부터 용출시키고, 바로 1 M Tris 완충액 pH 9.0으로 중화한 후, 항체값 측정법과 동일한 ELISA법에 의해 목적으로 하는 항체의 용출 획분을 회수하였다.
이와 같이 하여 얻어진 폴리크로날 항체는 일본 특허 공표 (평)7-509565호 공보에 기재되어 있는 OIA법에 의해 평가하였다.
정제한 항체는 OIA법의 포획 항체로서 사용하였다. 또한, 검출 항체로서는 실시예 4에 기재한 AMCT-1 모노크로날 항체를 퍼옥시다제로 효소 표지한 것을 사용하였다. 효소 표지는 양고추냉이 퍼옥시다제 (시그마 등급 VI)를 사용하고, 결합에는 시약 S-아세틸티오아세트산 N-히드록시숙신이미드를 사용하여 문헌 [Analytical Bio-chemistry 132 (1983), 68-73]에 기재되어 있는 방법에 따라 행하였다.
OIA 반응에 있어서는 0.05 ％ 아지드화 나트륨을 포함하는 PBS 중의 정제 폴리크로날 항체를 10 ㎍/㎖의 농도로 0.1 M HEPES 완충액 pH 8.0으로 희석한 액체를 50 ㎕씩 실리콘 웨이퍼 상에 첨가하고, 실온에서 30분간 반응시킨 후, 증류수로 세정하고, 사카로스 및 알칼리 처리 카제인을 포함하는 코팅 용액으로 코팅한 후, 사용하였다.
상기 조작으로 얻어진 각 미생물의 배양액에 농도 0.5 ％가 되는 양의 Triton X-100을 첨가하여 상온에서 5분간 추출함으로써 얻어진 항원 용액 15 ㎕를 상기 실리콘 웨이퍼 상에 첨가하고, 실온에서 10분간 반응시켰다. 이어서, 20 ㎍/㎖ 퍼옥시다제 표지화 모노크로날 항체를 15 ㎕ 첨가하여 10분간 반응시켰다. 증류수로 세정한 후, TMB 용액 (KPL사 제조)을 15 ㎕씩 첨가하고, 혼합물을 실온에서 5분간 반응시켰다. 생성물을 증류수로 세정하고, 효소 반응에 의해 생성된 청색을 육안으로 관찰하였다.
그 결과, 표 3에 나타낸 바와 같이 정제 폴리크로날 항체 APMP-1을 포획 항체로서 사용함으로써 마이코플라즈마 뉴모니아를 108개/㎖의 감도로 검지할 수 있는 것과, 또한 다른 미생물의 반응성은 검지할 수 없는 것이 밝혀졌다. 이와 같이 하여 마이코플라즈마 뉴모니아의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질을 고정화한 친화성 칼럼에 의해 마이코플라즈마 뉴모니아에 특이적으로 반응하는 폴리크로날 항체를 취득하는 것을 확인하였다.
| 검출결과 (108 세포/ml) | ||
| 엠. 뉴모니아 | + | |
| 에이치. 인플루엔자 | ATCC10211 | - |
| 이. 콜라이 | ATCC25922 | - |
| 이. 패칼리스 (E. faecalis) | ATCC19433 | - |
| 케이. 뉴모니아 | ATCC13883 | - |
| 엔. 고노르호에아 | IID821 | - |
| 엔. 락타미카 | ATCC23970 | - |
| 엔. 메닌지타이즈 | ATCC13090 | - |
| 피. 아에루기노사 (P. aeruginosa) | ATCC27853 | - |
| 그룹B 스트렙토코쿠스 (GroupB Streptococcus) | ATCC12386 | - |
| 에스. 아우레우스 (S. aureus) | ATCC25923 | - |
| 에스. 뉴모니아 (S. pneumoniae) | ATCC27336 | - |
| 에스. 피오게네스 (S. pyogenes) | ATCC19615 | - |
| +; 포지티브, -; 네가티브 | ||
본 발명에 따르면 미생물의 진화 과정에서 기능적으로 유지된 세포 내 분자에 대한 항체를 사용하여 특정한 종의 미생물을 특이적으로 검출할 수 있을 뿐만 아니라, 동일종 내에서의 모든 혈청형의 미생물을 양호한 정밀도로 검출할 수 있다.
이러한 항체로서 미생물의 리보좀 단백질, 리보좀 단백질 L7/L12 단백질에 대한 항체를 사용하여 마이코플라즈마 뉴모니아의 검출을 양호한 정밀도로 행할 수 있다.
또한, 이러한 항체를 구성 요소로 하는 미생물 검출용 시약 키트를 사용함으로써, 미생물의 검출을 보다 범용적으로 양호한 정밀도로써 행할 수 있다.
인용 문헌:
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<151> 2000-01-31
<160> 4
<210> 1
<211> 369
<212> DNA
<213> Mycoplasma pneumoniae
<400> 1
atg gca aaa cta gat aaa aac caa tta att gaa tcg ttg aag gaa atg 48
Met Ala Lys Leu Asp Lys Asn Gln Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Met
1 5 10 15
acc atc atg gaa atc gat gaa atc att aag gct gta gaa gaa gct ttt 96
Thr Ile Met Glu Ile Asp Glu Ile Ile Lys Ala Val Glu Glu Ala Phe
20 25 30
gga gta tcg gca aca cct gta gta gct gct ggt gct gtt ggt ggt aca 144
Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Val Gly Gly Thr
35 40 45
caa gaa gct gct agc gaa gtg act gtg aaa gtt act ggt tac act gac 192
Gln Glu Ala Ala Ser Glu Val Thr Val Lys Val Thr Gly Tyr Thr Asp
50 55 60
aac gct aaa tta gct gtg tta aag ctt tac cgc gaa att gct ggt gtt 240
Asn Ala Lys Leu Ala Val Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Ala Gly Val
65 70 75 80
ggt tta atg gaa gct aaa act gct gtg gaa aaa ctt cct tgt gtt gtt 288
Gly Leu Met Glu Ala Lys Thr Ala Val Glu Lys Leu Pro Cys Val Val
85 90 95
aag caa gac atc aaa cct gaa gaa gct gaa gaa ctt aaa aag cgt ttc 336
Lys Gln Asp Ile Lys Pro Glu Glu Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Phe
100 105 110
gtt gaa gtt gga gca act gtt gaa atc aaa taa 369
Val Glu Val Gly Ala Thr Val Glu Ile Lys
115 120
<210> 2
<211> 122
<212> PRT
<213> Mycoplasma pneumoniae
<400> 2
Met Ala Lys Leu Asp Lys Asn Gln Leu Ile Glu Ser Leu Lys Glu Met
1 5 10 15
Thr Ile Met Glu Ile Asp Glu Ile Ile Lys Ala Val Glu Glu Ala Phe
20 25 30
Gly Val Ser Ala Thr Pro Val Val Ala Ala Gly Ala Val Gly Gly Thr
35 40 45
Gln Glu Ala Ala Ser Glu Val Thr Val Lys Val Thr Gly Tyr Thr Asp
50 55 60
Asn Ala Lys Leu Ala Val Leu Lys Leu Tyr Arg Glu Ile Ala Gly Val
65 70 75 80
Gly Leu Met Glu Ala Lys Thr Ala Val Glu Lys Leu Pro Cys Val Val
85 90 95
Lys Gln Asp Ile Lys Pro Glu Glu Ala Glu Glu Leu Lys Lys Arg Phe
100 105 110
Val Glu Val Gly Ala Thr Val Glu Ile Lys
115 120
<210> 3
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 마이코플라즈마 뉴모니아로부터의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자 취득에 사용한 PCR의 프라이머 DNA
<400> 3
aatggatcca tggcaaaact agataaaaa 29
<210> 4
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 마이코플라즈마 뉴모니아로부터의 리보좀 단백질 L7/L12 유전자 취득에 사용한 PCR의 프라이머 DNA
<400> 4
tgactcgagt tatttgattt caacagttgc 30
Claims (28)
- 마이코플라즈마 뉴모니아 (Mycoplasma pneumoniae)에 속하는 세균의 리보좀 단백질 L7/L12에 특이적으로 반응하는, 세균의 리보좀 단백질 L7/L12에 대한 항체이며, 해당 세균의 종 또는 속을 다른 종 또는 속으로부터 판별할 수 있는 항체.
- 삭제
- 제1항에 있어서, 항체가 모노크로날 또는 폴리크로날인 항체.
- 제1항에 있어서, 항체가 효소와 결합된 항체인 항체.
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 삭제
- 제3항에 있어서, 항체가 효소와 결합된 항체인 항체.
- 제1항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- 제3항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- 제4항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- 제10항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- a) 검체를 용해액과 접촉시켜 미생물로부터 리보좀 단백질을 추출하는 단계, b) 추출한 검체를 포획 항체, 즉 제1항에 기재된 항체가 고체 표면 상에 고정된 항체와 접촉시킴으로써 리보좀 단백질과 포획 항체와의 사이에 항원 항체 복합체를 형성시키는 단계 및 c) 검출용 항체, 즉 제1항에 기재된 항체를 사용하여 항원 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 검체 중의 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- a) 검체를 용해액과 접촉시켜 미생물로부터 리보좀 단백질을 추출하는 단계, b) 추출한 검체를 포획 항체, 즉 제3항에 기재된 항체가 고체 표면 상에 고정된 항체와 접촉시킴으로써 리보좀 단백질과 포획 항체와의 사이에 항원 항체 복합체를 형성시키는 단계 및 c) 검출용 항체, 즉 제3항에 기재된 항체를 사용하여 항원 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 검체 중의 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- a) 검체를 용해액과 접촉시켜 미생물로부터 리보좀 단백질을 추출하는 단계, b) 추출한 검체를 포획 항체, 즉 제4항에 기재된 항체가 고체 표면 상에 고정된 항체와 접촉시킴으로써 리보좀 단백질과 포획 항체와의 사이에 항원 항체 복합체를 형성시키는 단계 및 c) 검출용 항체, 즉 제4항에 기재된 항체를 사용하여 항원 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 검체 중의 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- a) 검체를 용해액과 접촉시켜 미생물로부터 리보좀 단백질을 추출하는 단계, b) 추출한 검체를 포획 항체, 즉 제10항에 기재된 항체가 고체 표면 상에 고정된 항체와 접촉시킴으로써 리보좀 단백질과 포획 항체와의 사이에 항원 항체 복합체를 형성시키는 단계 및 c) 검출용 항체, 즉 제10항에 기재된 항체를 사용하여 항원 항체 복합체를 검출하는 단계를 포함하는, 검체 중의 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출 방법.
- 제15항에 있어서, 검출용 항체가 효소와 결합된 항체이며, 항원 항체 복합체가 이 효소의 특이적 기질에 의해 검출되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제16항에 있어서, 검출용 항체가 효소와 결합된 항체이며, 항원 항체 복합체가 이 효소의 특이적 기질에 의해 검출되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 검출용 항체가 효소와 결합된 항체이며, 항원 항체 복합체가 이 효소의 특이적 기질에 의해 검출되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제18항에 있어서, 검출용 항체가 효소와 결합된 항체이며, 항원 항체 복합체가 이 효소의 특이적 기질에 의해 검출되는 것임을 특징으로 하는 방법.
- 제1항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출용 시약 키트.
- 제3항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출용 시약 키트.
- 제4항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출용 시약 키트.
- 제10항에 기재된 항체를 사용하는 것을 특징으로 하는, 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 검출용 시약 키트.
- 유전자 조작 방법에 의해 또는 미생물로부터의 단리 정제에 의해 얻어진 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질, 그의 부분 펩티드, 또는 그의 부분 펩티드에 상당하는 합성 펩티드를 면역원으로 하는 것을 특징으로 하는, 제1항에 기재된 항체의 제조 방법.
- 유전자 조작 방법에 의해 또는 미생물로부터의 단리 정제에 의해 얻어진 마이코플라즈마 뉴모니아에 속하는 미생물의 리보좀 단백질 L7/L12 단백질, 그의 부분 펩티드, 또는 그의 부분 펩티드에 상당하는 합성 펩티드를 면역원으로 하는 것을 특징으로 하는, 제3항에 기재된 항체의 제조 방법.
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