JP3448056B2

JP3448056B2 - 免疫検定用試験ストリップ

Info

Publication number: JP3448056B2
Application number: JP51485594A
Authority: JP
Inventors: イルッカサカリコウヴォネン、; エイヴォルヘレナスヴェンス、; サリハンネルティカノジャ、; ペッカアンテロトゥルネン、; ラウリマルクスシヴォネン、
Original assignee: オイメディックスバイオケミカエービー
Priority date: 1992-12-29
Filing date: 1993-12-29
Publication date: 2003-09-16
Anticipated expiration: 2018-09-16
Also published as: US5712170A; US5965458A; FI92882B; EP0677170A1; EP0677170B1; FI92882C; AU5701594A; FI925922A0; FI925922A; DE69328120D1; JPH08505224A; PL304890A1; WO1994015215A1; DE69328120T2; PL172246B1

Description

【発明の詳細な説明】本発明は、別個の試薬、装置または器具を必要としな
い迅速な免疫検定法を提供する試験ストリップに関す
る。この検定法は、前記試験ストリップの特定の領域を
液体の試料中に浸漬し、次に免疫反応の結果、短時間で
起こる前記ストリップの肉眼で見える変化を観察するこ
とによって簡単に実施できる。また本発明は、前記試験
ストリップの有利な工業的製造方法ならびに該試験スト
リップの診断測定および環境分析測定における使用に関
する。

免疫検定法は抗体を使用することに基づいている。抗
体は、強力な特異性によって所望の被検体に結合する生
物学的に提供される反応体を含有している。免疫検定法
は、その感度と特異性は価値が高いので主として臨床医
学用に開発されている。しかし免疫検定法は、空気、水
および土壌中の汚染物の検出、食品の品質管理などに信
頼性が高い検定法を提供することによって環境分析にも
役立つ充分な可能性がある。

近年、各種の環境汚染物の分析に対する要望が増大し
ている。問題になっている環境がヒトまたは動物に対し
て危険である可能性があるか否かを評価するには、汚染
物の量を確認する必要がある。例えば、ガソリンスタン
ドの回りの土壌が各種の発癌性物質を含有する燃料残留
物を含有しているか否か、飲用水中に病原菌がいるか否
か、野菜類に殺虫剤の発癌性残留物がないか否か、木材
産業の排水中に腐朽もしくはスライム生成を防止する化
学薬剤の残留物が存在しているか否かなどを分析する必
要がある。また環境が汚染されていることが発見された
場合には分析によって浄化プロセスを監視する必要があ
る。さらに新たな汚染は、毒性化学薬剤の投与量を分析
によって試験することによって防止することができる。
いくつかの技術分野で、潜在的に有害な化合物の最大濃
度に関する法律ならびに各種の勧告があるが、これらも
信頼性の高い分析法が必要である。

環境内で試験されている化合物は非常に多数なので、
現在の分析法には多くの種類がある。細菌は微生物の培
養と同定法によって検出される。他の汚染物に対しては
伝統的な分析化学の方法が使用されている。多くの発癌
性化合物、例えば殺虫剤は芳香族環を含有する小さな分
子でありそしてガスクロマトグラフィ分析を行うのに好
適である。これらの分析は複雑な抽出工程によって行う
ことが多い。場合によっては、生物検定法のタイプの測
定法が使用されている（例えば藻類の毒素は、試料のマ
ウスに対する作用を試験することによって検出され
る）。

前記の分析は複雑な装置を必要とすることが非常に多
いので大部分の分析法は大系列で実施するのには適して
いない。このため測定費用が上昇し、実際に分析を要す
る多数の試料の試験が阻害される。一般的性質（例えば
水もしくは土壌の試料のpHまたは特定の重金属の検出）
のごく少数の測定だけが、迅速検定法を用いてサンプリ
ング場所で実施できるに過ぎない。

臨床化学で永年にわたって用いられている迅速試験法
の例としては、尿のpH、グルコースおよびタンパク質の
試験法が挙げられる。これらの試験手段は、試料中に浸
漬し、パッケージの色モデルによって判定されるストリ
ップで構成されている。色の変化は通常、pH指示薬また
は特異的な酵素反応に基づいている。

免疫化学的方法は高価でかつ実施することが面倒であ
ると永年にわたって考えられてきたので最も強く要求さ
れる測定にしか用いられなかった。しかし最近の数年間
で、迅速免疫化学試験法が臨床化学の要求に対して開発
されている。前記の試験法は、訓練されていない職員
が、特別の装置なしで数分間で実施することが可能で、
試験結果は肉眼で読取ることができる。この方法は、家
庭で利用するのに適している妊娠試験に特に用いられて
いる。

この種の迅速試験法の最も有用な技術的変法が英国公
告特許第2204398B号に開示されているがその診断試験法
は２種の抗体に基づいていた方法である。これら抗体の
一方は、ニトロセルロースの膜にラインの形態で付着さ
せてある。他方の抗体は、同じ膜上で乾燥させた着色ラ
テックスまたは金コロイドの粒子の表面に付着させてあ
る。試験は、液体試料を前記の膜に吸収させることによ
って実施する。上記粒子は試料液の流れで分離され、被
検体は前記粒子上の抗体に結合する。前記被検体は、他
の分子部位によって、前記ライン形態で存在している他
方の抗体にも結合して、眼でみえる着色したラインが生
成して前記被検体が存在していることを示す。この種の
免疫クロマトラフィによる試験法は膜上での流動に基づ
いており“側方流動法（lateral flow technique）”と
呼ばれることが多い。

また上記の方法は半定量分析または定量分析にも用い
られる。被検体分子が非常に小さいので２種の抗体の同
時結合が不可能な場合は競合原理を用いることができ、
この場合、抗体は１種だけ用い、これに加えて標識を付
けた被検体が用いられる。この場合、試料中に被検体が
存在することは、例えば着色ラインが存在しないことに
よって示される。

米国特許第5141850号に開示されている免疫化学迅速
試験法では、試料は、可動抗体試薬を含有する２領域を
有する多孔性試験膜に吸収させる。前記試薬の一方には
シグナル生成標識が付けられている。第三の固定領域
は、非シグナル生成抗体を捕獲できる物質を含有してい
る。試料が被検抗原を含有している場合、両方の抗体は
前記抗原に結合し次にその複合体が上記固定捕獲物質に
捕捉されて色の生成が起こる。

他の簡単な免疫化学試験装置が、中でも以下の特許刊
行物に記載されている。すなわちPCT/EP 86/00055号
（酵素免疫学の原理が利用されているので別々の試薬を
要する）；英国特許第1589234A号とヨーロッパ特許願公
開第0225054A1号（酵素免疫反応は、試料を添加した
後、展開溶液中にストリップの一端を浸漬することによ
って始まる）；ヨーロッパ特許第0186799B1号（その構
造体は試料液に溶解する試薬を含有する重ね合ったスト
リップで構成されている）；ヨーロッパ特許願公開第04
21294A2号（側方流動原理でセレンコロイドを使用する
ことが記載され、膜上に“＋”形でコートされている試
験抗体と対称抗体をもっている）；ヨーロッパ特許第01
49168B1号（反応がガラス毛管内のクロマトグラフィの
担体物質の層で起こる）である。

上記の従来技術の文献には免疫化学試験法の診断にお
ける使用が記載されている。一方、ヨーロッパ特許願公
開第0520202A2号には、特に環境汚染物の分析を目的と
する免疫化学試験法が記載されている。被検体は標識抗
体複合体を含有する反応層中に移動し、その反応層中で
前記被検体は前記標識を置換し代わりに前記反応層中で
結合できる。脱離した標識はその反応層を通って透明な
他の層に移動し、次いでその濃度は視覚で直接検出する
ことができる。

米国特許第5104811号には、ストリップ様バッキング
に接着された吸収パッドとこのパッドから短い距離をへ
だてて該バッキングに接着された少なくとも一つの免疫
化学反応層を用いる迅速診断試験法が記載されている。
このパッドから反応層への液体の移動は、繊維の移動層
または反応層とバッキング間の毛管空隙で行われ、前記
空隙はその端縁が閉じられている。

試験法の使用は全世界で増大しているので、充分な設
備が整った実験室の条件下だけでなく、他のほとんどど
こでも、例えば家庭で、工場もしくは野外の条件下で、
電力もしくは清浄水なしでも実施できるような簡単な試
験法を開発する必要性が高まっている。訓練されていな
い人でもその試験を実施できなければならない。試験の
性能は、迅速で高感度かつ高信頼性でなければならな
い。試験法の構造物は複雑な方法なしで製造できるよう
充分簡単でなければならない。しかし、試験ストリップ
は、環境野外条件に耐えられるよう充分に強力でなけれ
ばならない。

本発明は、製造を考慮して簡単でかつ有利な構造を有
する試験ストリップを提供するものである。試験は、試
験ストリップを試料中に浸漬し次いで結果を観察するこ
とによって簡単に行うことができる。試験器具の形態は
ストリップ様であるにもかかわらず、必須の反応が保護
されたチャンバー様の空隙内で起こる。また積層構造の
試験ストリツプは有利な工業的生産包装方法を用いるこ
とができる。

本発明の試験ストリップは以下の明細書と本発明を示
す図面で一層詳細に説明する。本発明の固有の特徴は後
記の特許請求の範囲で定義する。

したがって本発明の目的は特定の免疫化学試験領域を
有する迅速免疫検定法用試験ストリップであり、その試
験ストリップはバッキングシートを備え、そのシートに
は受容端パッド（receiving end pad）とこのパッドか
ら距離をへだてて終了端パッド（finishing end pad）
とが接着されている。これらパッドの間に試験膜が設け
られている。前記膜は、直接にまたは前記受容端パッド
を通じて、試料と液体流で接触させるものである。前記
膜は、前記バッキングに対して、距離をとって平行に配
置されている。前記試験ストリップは、前記バッキング
と前記膜がこれらの間に、その端縁が開いている空隙を
規定していることを特徴としている。前記チャンバー
は、前記膜の中で起こる免疫反応の保護された反応チャ
ンバーとして作動する。

本発明の試験ストリップは、両面に一つずつ、合計二
つの支持カバーまたはバッキングを備えていることが好
ましい。前記バッキングの一つは、少なくとも一部分が
透明でそのため試験膜に色が生成したのを見ることがで
きることが有利である。

バッキングと試験膜の間のパッドは、吸収性パッドが
有利であり、特に受容端の吸収性パッドは試験膜を越え
て延出して、液体試料をこの吸収性パッドを通って試験
膜中に流動させることができる。前記パッドは多孔質の
材料で製造されているので、非均質試料中に存在してい
る可能性がある固体の不純物を保持するフィルターとし
て作動する。終了端にもパッドとして吸収性材料を使用
することによって、試験ストリップの反応領域を通る連
続液体流動が保証される。

試験膜は好ましくは、固定試薬を含有する試験領域
と、対照物質を含有する対照領域を備えている。可動標
識を含有する標識領域は、試験膜に設けるかまたは受容
端の吸収性パッド中に設けて、液体流で運ばれる試験領
域に標識を移動させることができる。本発明のストリッ
プは可動性であるが標識なしの試薬を含有していてもよ
い。その場合、その試験領域は前記試薬を捕獲できる物
質を含有している。異なる被検体を試験するため、同じ
ストリップ内に二つ以上の試験膜があってもよく、また
は同じ膜が各々異なる試薬を含有する二つ以上の領域を
具備していてもよい。また本発明のストリップは、異な
る被検体の濃度を半定量的に測定するため、いくつもの
異なる濃度の同じ試薬もしくは標識を含有していてもよ
い。

また本発明は、試験ストリップの特に有利な製造方法
を提供する連続工業的製造法に関する。本発明の製造法
では、免疫化学反応に対して特異的な一つ以上の標識化
合物および／または試験物質を、試験膜材料の全長にわ
たって試薬領域として設置する。これらの領域は別々に
縦方向に続いている。対照物質を含有する一層幅の狭い
一つの領域を、試験物質を含有する領域の隣りの膜材料
上に設けることが有利である。これらの設置された領域
はその後に乾燥される。パッド材料の少なくとも二つの
帯状体（string）を、別個の長いバッキング支持材料の
上に、互いに距離をおいて接着する。パッド材料の帯状
体の一つは１種以上の免疫化学試薬を含有し、それは帯
状体中で予め乾燥される。試薬領域が前記パッド間の空
隙に対面するように、上記のようにして製造した全長の
試験膜を、上記のパッド材料帯状体の上に配置する。大
きさが少なくともバッキング支持材料の大きさである透
明なカバリング支持材料を試験膜とパッド帯状体の頂部
に接着して、所望の大きさの試験ストリップに切断でき
る長い積層試験ストリップの原反を提供する。

また本発明は、診断時および環境分析時の迅速免疫検
定法への試験ストリップの使用に関する。

以下に、下記図面を参照して本発明を一層詳細に説明
する。

図１は本発明の試験ストリップの好ましい実施態様の
斜視図である。

図1Aは図１に示す実施態様の別々の部品の分解図を示
す。

図２は本発明の試験ストリップで用いられる試験膜お
よびその一実施態様の領域を示す。

図３は本発明の試験ストリップの他の実施態様の概略
断面図を示す。

図１と図1Aは本発明の試験ストリップの好ましい実施
態様を示す。参照番号10で示す試験ストリップの裏面
は、プラスチックまたはある種の他の適切な硬質材料で
製造されたバッキング１で形成されている。前記バッキ
ング１の両端には、比較的薄いパッド3,5が設けられて
いる。前記パッドは吸収容量が高くかつ化学的に不活性
な材料で製造することが好ましい。受容末端におけるパ
ッド３は、その吸収容量を増やしかつその中の液体流の
速度を上げるため、各種の物質で処理してもよい。吸収
性パッド３の領域７は乾燥された標識付き試薬を含有し
ている。試験膜２は、そこで、検出すべき実際の反応が
起こるが、吸収性パッド３と５の間に配置される。

吸収性パッド３と５は空隙４によって隔てられ、この
空隙４は試験膜２の反応領域すなわち単一もしくは複数
の反応領域を有する領域にわたって充分長く延びてい
る。空隙４におけるこれらの領域は、少なくとも一つの
特異的抗体のライン８といずれかの対照のライン９を備
えている。試験ストリップ10を生産するとき、膜２は、
膜２の暴露された反応性試験面が空隙４に対面する方式
で、パッド３と５の頂部に配置される。膜２およびパッ
ド３と５の間の接触面積はそれぞれ液体の流動を起こし
て維持するのに充分に大きくなければならない。

上記の配列によって、試験膜２の反応面がどの材料と
も接触しない構造が形成されている。代わりに膜２とバ
ッキング１の間に空隙４があり、この空隙は小チャンバ
ーと言えるが、両側が開放されているので膜２の上の液
体流動は阻害されない。空隙４が狭くなるように吸収性
パッド３と５は約0.5〜3mmの厚みが有利である。空隙４
が狭いので、反応チャンバー内の雰囲気はその湿度を保
持しかつ空気流で起こる乾燥は液体の流動を阻害しな
い。

もう一つのバッキングすなわちカバー６は膜２とパッ
ド3,5の頂部に接着することが有利である。前記カバー
６は、好ましくは試験ストリップ10と同じ大きさの透明
シートで、例えばPVC、PEまたはPCのような透明プラス
チック製である。前記カバーは、膜２とパッド3,5を保
護し、液体が蒸発しないようにしかつその構造を強化す
る。カバー６は透明であるから試験結果はどんなもので
あろうとも目視することができる。このカバーは、適切
な方法で塗装してもよく、または前記ストリップの試験
ラインが形成されている領域以外の部分を覆うことによ
って試験結果の判定を容易にする単一もしくは複数のテ
ープ（図示せず）を備えていてもよい。またはカバー６
は、試験結果が見えるように単一もしくは複数の開口を
切りこんで設けた非透明の材料で製造してもよい。ある
いは、バッキング１が透明で、反応を空隙４を通じて観
察してもよい。

図２は、すべての領域が試験膜２の上に配置されてい
る試薬領域の他の実施態様を示す。参照番号７は標識と
して使用される粒子が乾燥砂糖溶液の層の上で乾燥され
た領域を示し；領域８′と８″は二つの異なる被検体に
特異的な抗体を含有し；そして領域９には対照抗体が結
合されている。

本発明の試験法は側方流動原理に基づいている。すな
わち反応は膜２の上で起こり、この膜の化学特性は、反
応に必要な抗体と他の物質をその膜に設置できるように
選択される。前記膜は、その中に液体流動を起こし、次
いで検出に必要な物質（例えばラテックス、金属コロイ
ドまたは他の粒子ならびに可溶性分子）を前記流動で運
ぶことができるように適切な方式で多孔質でなければな
らない。試験膜２用に適切な材料はニトロセルロースで
ある。前記膜は代わりにナイロンまたは他のある種の適
切な材料で製造することができる。

試験膜２が非常に薄い場合、それ自体の支持体（図に
は示していない）に試験膜を接着することが有利であ
る。これによって、試験ストリップ組立ての前に行うコ
ーティング工程での試験膜の処理が容易になる。反応の
検出を、前記膜の支持体を有する側で眼で見て行いたい
場合は、前記支持体は透明でなければならない。

試験膜２の領域の数と位置は被検体によって変えるこ
とができる。同じ膜が、同じ試料中の異なる被検体を検
出しまたは対応して異なる濃度の同じ被検体を検出する
ためいくつもの試薬を含有していてもよい。また試験ス
トリップはいくつもの試験膜を備えていてもよい。この
ような場合、試験膜間にとぎれることのない流動がなけ
ればならず、このような連続した流動は、例えば前記の
膜を少なくとも一部分をお互いの頂部に配置するかまた
はそれら膜間に多孔質の相互接続膜を配置することによ
って達成することができる。

本発明の試験ストリップを使えば、ストリップ10の受
容端を、試料中もしくは原試料の抽出液中に特定のレベ
ルまで入れることによって妊娠試験、食品のリステリア
試験（Listeria test）または水のアトラジン試験のよ
うな試験を行うことができる。液体は前記受容端でパッ
ド３に吸収され、その受容端からさらに試験膜２に移動
する。対照ライン９は、該液体流がこのラインに到達す
ると直ちに目視可能になる。試験が免疫測定の原理に基
づいている場合、他方の特異的試験ラインも着色した場
合試験結果は陽性である。

図３は本発明の試験ストリップの他の実施態様を示
し、バッキング１が多孔質の試験膜２を保持している。
前記膜の受容端から所定の距離をおいて不活性支持パッ
ド３がある。もう一つの支持パッド５が膜−バッキング
結合体の反対側の末端に接着され、パッド３と５の間に
中空の空間が残っている。パッド３と５の頂部にカバー
６が接着され、端縁が開いている空隙４が形成される方
式で前記パッドを覆っている。バッキング１もしくはカ
バー６、または両者は透明な材料で製造されている。

この実施態様において、試験膜２は同時に吸収パッド
として作動して液体は前記膜に直接吸収される。この解
決策の利点は構造が簡単でかつ液体流が吸収パッドと試
験膜との間の流動の関連に左右されないことである。カ
バー６および／またはパッド３もバッキング１に等しい
延長部分をもっていてもよい。この場合、液体はその露
出端縁を通じて試験膜２に吸収される。

使用時、試験膜の前記領域を試料液中に浸漬しないよ
うにすることが大切である。反応は液体の前部が試験膜
にそって前進している間にのみ起こる。したがって浸漬
する深さはユーザに指示すべきであり、浸漬レベルを示
すマークを試験ストリップ自体に付けることが最も好ま
しい。

一つの試験実施方法は次のとおりである。すなわち、
試験ストリップ10の受容端を印をつけた線まで試料中に
浸漬し、前記受容端の吸収パッド３に充分な量の液体を
吸収させた後ただちに、試験ストリップを試料から取り
出して前記ラインが現れるまで静置する。

液体の前部が試験膜中を妨害されずに移動することを
保証するため、液体を吸収し易くするとか（例えば米国
のBioRad Laboratories社が製造しているTween 20のよ
うな界面活性剤）、移動する粒子に適切な電荷を生じさ
せる（例えば緩衝イオン）適切な物質で処理した膜を使
用することが好ましい。また未処理の膜を、それに試験
に特異的な領域を付与する前に、適切な溶液に浸漬し次
いで乾燥して処理してもよい。

試験の機能を改善する効果を有する先に述べたような
試薬は、乾燥することによって吸収パッド３または試験
膜２の受容端の中に添加してもよい。前記膜から標識粒
子を液体流によって放出させることは、砂糖溶液のよう
な適切な混合物を標識粒子の領域の下側で乾燥させるこ
とによって容易に行うことができる。本発明の好ましい
試験ストリップの構造は、吸収パッドと吸収膜がカバー
とバッキングの間に設けられその吸収端縁は開放されて
いる構造であるが、この構造によって試験を簡単に実施
することができる。ストリップを液体中に浸漬している
とき吸収は制約されないので、試料は試験ストリップに
ピペットで加える必要がない。ストリップ内の狭い空隙
４で形成されたチャンバー様空間で液体流は乱されない
ようかつ空気流で乾燥を起こさないよう保護される。

本発明の試験ストリップは、正しい大きさの予め切断
された部品を用いて順次製造することができることは明
らかである。しかし本発明の試験ストリップはその端縁
が開いている積層構造であるから、迅速で自動式の費用
効率の高い工業的生産方法を開発することが可能であ
る。したがって、その試薬領域を有する試験膜は、特定
の生産ラインで予め製造しておいて、次にストリップの
各種要素を積層して長い試験ストリップのバンドを作る
ことによって試験ストリップを他の生産ラインで組立て
ることができる。

試験膜は、試験膜の材料のロールをほどいて処理し次
いで試験膜のロールに再び捲き取るという一つの生産ラ
インで製造することが好ましい。試験膜に必要な試薬
は、連続ラインとして試験膜の材料に付与して乾燥させ
る。このようにして、高感度の試験膜が可及的に少ない
機械ステップで処理され損傷から保護される。試験膜に
試薬が成功裡にかつ堅実に付与されていることは、光学
的検出装置の下を通過する試薬のラインの幅を監視する
ことによって簡単に観察し確かめることができる。試薬
を均一に付与することは、信頼性の高い試験を行うため
に重要である。製造方法は高速なので、試験膜は、周囲
の空気中に存在しているかもしれないような未制御の妨
害要因の影響下にはごく短時間しか滞留しない。

試験ストリップの組立てに用いる材料はすべて、ロー
ルの形態で入手できるように選択することが有利であ
る。試験ストリップの生産ラインは、試験膜を含む各種
の材料をロールから正しい順序で供給し、例えば接着剤
で接着することによって一つの材料を他の材料の上に積
層するよう計画される。

一般的な製造方法では、接着剤または接着テープなど
を、バッキング材料のロールから供給されるバッキング
のバンドの上に付与される。次いでパッドの材料が、互
いに距離をおいてその間に空隙が残るように、バッキン
グのバンドの予め決められた領域の上に、パッド材料の
ロールから供給される。特に受容端でパッドを形成する
パッド材料は液体流を改善する物質で予め処理してもよ
い。また前記パッド材料も試験に特異的な試薬を含有し
ていてもよい。予め処理された試験膜材料はそのロール
からほどかれ、パッド材料の帯状体の頂部でかつ該帯状
体の間の位置に配置される。前記の膜は一方の面に保護
層をもっていてもよい。この場合、試薬が露出されてい
る面は前記空隙に対面していなければならない。最後
に、透明なプラスチック製バンドがカバリング材料のロ
ールから供給され、前記バッキング上の膜とパッドの結
合体に取り付けられる。そのカバー材料は、少なくとも
その両端でパッド材料の帯状体および試験膜の材料にも
接着される。最終的にその積層物を均一に押圧して接着
を確実に行う。

生産ラインは連続的に作動するので、単一の試験スト
リップの均一な品質は容易に監視することができる。例
えば機械的公差が満たされていることを検査することが
できる。生産ラインは、試薬および／または積層に使用
する材料のロールの幅を変えることによって、各種の試
験の要件に適合するように容易にかつ迅速に調節するこ
とができる。

積層後製造された長い試験ストリップの原反は、試験
ストリップの生産ラインの末端で所望の幅の試験ストリ
ップに切断される。前記の切断によって生成した新しい
断面は吸収パッドの端縁が均一な性質であることを保証
し、その結果、試料はよい再現性で均一に吸収される。
このことは一方では試験結果の精密さに対して好ましい
効果をもたらす。

仕上げ処理がなされた試験ストリップは、伝統的な方
法で単一包装（例えば水分を捕捉する物質の袋が入って
いるプラスチック積層物のポーチ）に包装される。しか
し、本発明の試験ストリップの構造は軽量で小さいか
ら、例えば水分が透過せず強靱で取扱い易いアルミニウ
ムチューブのような円筒状チューブ内に包装するのも有
利である。

本発明の試験ストリップは例えば妊娠試験に用いるこ
とができる。この試験は尿もしくは血清に対して直接実
施するよう設計可能であり、測定される被検体は胎盤が
分泌するヒト絨毛性ゴナドトロピン（hCG）である。

しかし本発明の試験ストリップは、ある種の特定の化
合物すなわち疾患もしくは病態生理学的状態に関連して
いるかまたは体内に人工的に導入された化合物が試料中
に存在しているか否かを検出する他の多くの診断試験に
も適用できる。この種の±試験は、微生物によって起こ
る感染症の診断に特に適している。

試料は液体であり、リウマチ性疾患でリウマチ因子の
存在を示す場合は血清であり、腎臓の損傷によって起こ
るアルブミンの漏洩があるのを示す場合は尿であり、ま
たは髄膜炎を起こす細菌の存在を示す場合は脊髄液であ
る。また試料は粘膜もしくは固体でもよく、この場合、
試験される化合物は最初に適切な液体で抽出される。こ
のような応用例は、患者の泌尿生殖器の粘膜から採取し
た試料中のクラミジアの抗原の検出である。対応して試
料は、例えばストレプトコッカス・エイ（Streptococcu
s A.）を検出するため咽喉の粘膜から採取してもよい。
腸癌に関連する、糞便中の潜血は、糞便試料中のヒトヘ
モグロビンの存在を示す本発明の試験ストリップを用い
て該試料中に検出できる。肺炎を起こす肺炎球菌（Pneu
mococcus）の存在は痰の試料中に検出することができ
る。胎膜の破裂は、膣分泌物の試料中にIGFBP−１と呼
ばれるタンパク質が存在することを示すことによって検
出することができる。２種の異なるレベルの濃度の、IG
FBP−１に対する抗体を同じ試験に用いると、分娩に対
する感受性に関連する低濃度のIGFBP−１または胎膜の
破裂によって起こる高濃度のIGFBP−１を検出すること
ができる。また本発明の試験ストリップは、血清中の、
ヘリコバクター・ピロリ（Helicobacter pylori）に対
するIgGクラスの抗体のような感染症に関連がある抗体
の存在を示すことができる。この細菌は胃潰瘍の重要な
病原因子であることが確かめられている。

また本発明の試験ストリップは多くの環境分析の試験
に適用することができる。本発明の試験ストリップは伝
統的な方法に比べていくつもの利点がある。本発明の試
験は迅速で安価でありかつ簡単である。わずか数分間で
同様の感度と特異性を有する試験を実施する方法は、従
来技術には全く存在しない。試験を実施すること自体に
特別の装置を必要とせずかつ職員に特別の訓練は全く必
要でない。試料の前処理は、大部分の伝統的な方法に必
要な前処理より著しく簡単である。免疫化学による方法
の特異性は抗体の特異性に基づいているので試料を洗浄
する特別な工程は全く不要である。試料は液体の形態に
変換すれば充分である。

伝統的なクロマトグラフィ法および他の対応する方法
を用いて測定するのにうまく適応できないが、免疫法に
は好適な被検体（例えばすべてのタンパク質）がある。
したがって本発明は全く新しい試験法になる可能性があ
る。

本発明の試験は安価でかつ実施し易いので、例えば汚
染領域を充分に検査しかつ充分な期間にわたって状況を
監視するために充分な数の試験を行うことができる。食
品の場合、充分大きいサンプリングを行うことができ
る。温室の所有者は土壌の殺虫剤が浄化されていくのを
追跡することができる（現在は充分長いと思われる期
間、待つ以外に方法がない）。食料の小規模生産でも、
食品の清浄性を充分に追跡することができる。

本発明の試験ストリップを用いて各種の選別システム
を開発することができる。例えば特定のグループの物質
（“ポリ芳香族炭化水素類”、アフラトキシン類など）
を検出する迅速試験法を設計することができる。すなわ
ち現場で実施した選別試験で陽性の結果が得られたなら
ば試料はより複雑な実験室の方法で各種の成分について
さらに分析する。また単一被検体の迅速な選別は（その
濃度が許容限界より高いことを示すことによって）定性
試験法を用いて行うことが可能であり、そして選別試験
の結果が陽性であった場合、時間はかかるが一層高感度
の実験室の定量法を用いてより正確な試験を実施でき
る。

本発明の試験ストリップの取りあげる価値がある環境
への適切な適応例は、例えば土壌と水が汚染されている
地域のPCPもしくはPCBの濃度を測定するためまたは芳香
族炭化水素または塩素化脂肪族炭化水素を検出するた
め、このような汚染地域を選別することである。工業地
域では、例えば油化合物、溶媒および殺虫剤のような各
種の化学薬剤の放出を監視することができる。食品中に
各種の毒素、抗生物質、ヒスタミン、微生物または殺虫
剤が存在することを試験することができる。放散ガス中
のベンゾピレンのような発癌性化合物を測定することが
できる。石油燃料用マーカーとして用いられる芳香族環
構造を有するトルエンおよび類縁化合物を、汚染土壌中
に検出できる。

以下の実施例は本発明を例示するが本発明を限定する
ものではない。

実施例１妊娠試験標識の製造：本発明の試験ストリップを製造するた
め、青色のラテックス粒子をhCGに対するモノクローナ
ル抗体でコートした。この粒子の大きさは200nmであっ
た。このようにして作った検出標識は、緩衝液中１％の
懸濁液として貯蔵した。

試験膜の製造（例１）：試験膜を製造するのに用いた
材料は薄い透明なプラスチック製バッキングに接着した
ニトロセルロースであった。その膜の長さは30mmであっ
た。砂糖溶液をその膜の一端から9mmの領域で乾燥さ
せ、次いで上記標識を乾燥砂糖領域の上に付与した。前
記膜の前記末端から18mmの位置に第二の幅の狭い領域を
設けた。この第二領域は、hCGに対する他のモノクロー
ナル抗体の緩衝液による溶液を含有している。第三の幅
の狭い領域を第二の領域から2mmのところに設けた。こ
の第三領域はマウス免疫グロブロリンに対する抗体を含
有している。

試験膜の製造（例２）：例１と同じ材料を使用した
が、第二と第三の領域だけを膜の上に設置した。前記第
一領域のラテックス標識は、代わりに、試験ストリップ
の受容端で使用した吸収パッド中で乾燥させた。

試験ストリップの組立て：白色ポリエステルシートを
6mm×120mmの大きさのピースに切断して試験ストリップ
用のバッキング支持体を製造した。試験ストリップの両
端に位置する吸収パッドを製造するのに使用した材料
は、二つのポリエチレンティシューの間に約1mmの厚み
の層のレーヨン繊維を挿入したものであった。30mmピー
スのパッド材料をバッキング支持体の受容端に接着しそ
して対応して70mmのピースを反対側の末端に接着した。
例２では受容端のパッドには標識試薬を含有させた。上
記のようにして製造した乾燥試験膜は、パッドの頂部に
配置し、両端の約5mmずつを両方のパッドに重ねた。コ
ートしたニトロセルロースの面は、パッド、バッキング
および膜の間に形成された中空のチャンバー様空隙に対
し下方に向けた。透明ポリエステルのカバリング支持シ
ートはバッキングの大きさのピースに切断した。そのカ
バーをパッドに接着しそしてその数mmにそって膜にも部
分的に接着させた。非透明のテープをカバーの両端に接
着して、わずか10mm幅の空白を、特異的ラインと対照ラ
インが形成された部位にカバーせずに残した。

いくつかの試験ストリップは、反応性のニトロセルロ
ースの面が上方に向いているような方式で試験膜がバッ
キング支持体に接着されるように組立てた。パッドは、
上記の方式に対応する方式で試験膜の両端に接触するよ
う配置した。やはり透明カバーを頂部に接着した。ニト
ロセルロースの面には接着を行わなかった。前記の組立
て体と比べてみた結果の差は、チャンバー様の空隙が膜
の下方ではなくて上方にあることである。

妊娠試験の実施 1. 試験ストリップの受容端を試料中20mmの深さまで浸
漬させた。

2. ストリップを試料から取り出した。

3. ５分後、試験ストリップに現れる青色ラインの数を
記録して試験結果を判定した。

試験結果の判定：可視ラインが現れ試験結果が陽性であると判断される
よう充分な標識に捕捉させる最少のhCG濃度が約50IU/
であるような量の抗体を特異的ラインに加えた。標識は
クラスIgGに属するマウス抗体でコートされているの
で、対照ラインに加えられたマウス免疫グロブリンに対
する抗体は液体流が運ぶ標識を非特異的に捕捉する。こ
れらの溶液は、hCGの濃度が高くても、目視可能な対照
ラインが生成して液体流が適正な方式で前進し試験が作
動していることを示すように、特異的ラインに結合しな
い充分な量の標識が存在するような比率で添加した。青
色の対照ラインが出現するとその試験は信頼性のある方
式で作動していることを示した。

試験シリーズの試験結果を以下の表１に示す。既知量
のhCGを、陰性であることが分かっている試料に予め加
えた。

試験膜をバッキング支持体に接着した試験ストリップ
は同一の試験結果を示した。

実施例２胎膜の破裂を検出する試験胎膜の破裂を検出する試験は、膣分泌物の試料中にIG
FBP−１（インシュリン様増殖因子結合タンパク質−
１）が存在していることを示すことに基づいている。標
識、試験膜および試験ストリップの組立ては、測定され
るタンパク質がIGFBP−１であるから標識と特異的ライ
ンに用いる抗体はIGFBP−１に対するモノクローナル抗
体であることを除いて、実施例１と同じ方式で実施し
た。

試料：膣分泌物の試料は滅菌ダクロンスワブで採取し
た。スワブに吸収された試料は、予め決められた比率で
希釈緩衝液で抽出した。

試験の実施： 1. 試験ストリップの受容端を、上記試料抽出液中20mm
の深さまで浸漬した。

2. ストリップを試料から取り出した。

試験シリーズの試験結果を下記の表２に示す。羊水を
塩溶液で希釈した（その羊水の試料中のIGFBP−１の濃
度は既知であった）。

使用された試験希釈液中、200μg/というIGFBP−１
の濃度は、膣分泌物試料中では羊水が存在していること
によってしか起こり得ないような高い濃度と考えられる
ので、胎膜が破裂したことを示すと判定できる。

実施例３糞便中の潜血を検出する試験（二つの被検体）この試験は、癌患者の腸内で出血が起こった後、糞便
中に存在する血液を検出するのを目的とするものであ
る。この試験は、ヒトヘモグロビンとヒトアルブミンの
両者の存在を示すことに基づいて設計した。アルブミン
は癌とは関連がないタンパク質漏出の結果糞便中に入り
うるので、ヘモグロビンは血液の一層特異的なマーカー
である。一方アルブミンは糞便中でヘモグロビンより安
定である。標識、試験膜および試験ストリップの組立て
は、二つの被検体を検出しなければならないので、ヘモ
グロビン抗体でコートされた粒子ならびにアルブミン抗
体でコートされた粒子を含有する混合標識を製造したこ
とを除いて実施例１と同じ方式で実施した。対応して二
つの異なる特異的ラインを膜上に設けた。これら特異的
ラインを設けるとき、試験ができるだけ敏感でなければ
ならないよう配慮した。

試料：糞便の小試料を緩衝溶液中に懸濁させた。その
懸濁液はできるだけ均一でなければならないが、濾過し
て濾液を試験管に移した。

試験の実施： 1. 試験ストリップの受容端を上記濾液中に20mmの深さ
まで浸漬した。

2. ストリップを試料から取り出した。

ライン数が１のときその試験は陰性であることを意味
し、ライン数が３のときは陽性であることを意味する。
２本のラインしか現れなかった場合は、新しい試料を採
取することを推奨する。

実施例４土壌中のトルエンを検出する試験抗体の調製：当該技術分野の当業者に知られている方
法（例えば、Stenman U.−H.ら、J.Immunol.Methods、4
6巻、337〜345頁、1981年参照）を用いて生成させる。
抗原の種類はハプテンなのでマウスは比較的大きな分子
量の抗原誘導体で免疫化する必要がある。それ故、免疫
化のため、トリル酢酸をウシ血清アルブミン（BSA）に
共有結合で接合させる（接合および免疫化に接合体を使
用することについては、Burdon R.H.およびvan Knippen
berg P.H.編集“Laboratory Techniques in Biochemist
ry and Molecular Biology"Elsevier社（アムステルダ
ム）Vol.19,1988年発行95〜130頁のMuller S.の報告；
またはHudson L.およびHay F.C.著“Practical Immuno
logy"、Blackwell社（オックスホード）1983年発行１〜
23頁参照）。抗体の選別には、放射線免疫検定法を使用
する。

この方法に必要な放射性標識は次のようにして調製す
る。トリル酢酸を少なくとも一つのチロシン残基を含有
する担体ペプチドに接合させ（接合については上記文献
参照）次にその接合体を標準のクロラミンＴ法を用いて
¹²⁵Iで標識する。得られたトルエンと反応性のモノクロ
ーンを燃料中に見られる類縁化合物との交差反応につい
て試験する。この場合、抗体は、燃料汚染のマーカーが
陽性の試験結果を起こすとき試験で用いられるので、交
差反応は有害ではなく望ましい。

試験ストリップの製造：標識、試験膜および試験スト
リップの組立ては、試験膜の特異的ラインを、第二の抗
体の代わりに抗原（トリル酢酸−担体ペプチド接合体）
でコートすることによって製造することを除いて実施例
１に記載したのと同様にして実施する。標識粒子に結合
させた抗体はモノクローナル抗トルエン抗体である。

試料の調製：標準重量の試料物質を、既知容積のメタ
ノールで抽出する。その抽出液を、予め決められた容積
比（少なくとも1:5）にて希釈緩衝液で希釈し、試験の
試料として使用する。

試験の実施 1. 試験ストリップの受容端を試料液中20mmの深さまで
浸漬した。

2. ストリップを試料液から取り出す。

3. ５分後、試験ストリップ中に現れる青色ラインの数
を記録して試験結果を判定する。

判定：この試験は競合の原理に基づいている。試料中
の抗原は、標識抗体の結合部位に対して、特異的試験ラ
イン中の抗原と競合する。石油燃料中に見られるトルエ
ンもしくはトルエン類縁化合物が非常に少量であっても
（原試料中約5ppm以上に相当）結合部位を遮断してしか
も青色の特異的ラインがストリップ上に形成されないよ
うに、標識の抗体の量を調節する。それ故２本の青色ラ
インが現れたときは試験は陰性であると判定できる。青
色ライン（対照ライン）が１本しか現れなかった場合、
その試験は陽性でその土壌試料は汚染されている。

実施例５食品中のサルモネラ（Salmonella）属の種を検出する試
験抗体の調製：サルモネラ菌に対するマウスモノクロー
ナル抗体を、当該技術分野の当業者に知られている方法
（例えば、Stenman U.−H.ら、J.Immunol.Methods、46
巻、337〜345頁、1981年参照）を用いて発生させた。サ
ルモネラ属の種の細胞壁の抽出液を免疫化を行う際の抗
原として用いる。抗体を選別するのに、マイクロウェル
プレートを同じ細胞壁抽出液でコートするELISA法を使
用する。抗原でコートされた面に結合した抗体を、酵素
（HRP、西洋ワサビペルオキシダーゼ）で標識を付けた
ウサギ抗マウス免疫グロブリンで検出する。陽性を示す
クローンを、他の主病原性サルモネラ菌の種の細胞壁抽
出液を用いてELISA法で試験する。広い群特異性が望ま
しい。選択されたモノクローンを、交差反応について試
験して、食品中には普通であることが分かっている他の
細菌との有害な反応を除外する。

試験ストリップの製造：標識、試験膜および試験スト
リップの組立ては実施例１に記載しているのと同様にし
て実施する。サルモネラ菌のモノクローナル抗体を、標
識粒子および試験膜上の特異的ラインにコートする。

試料の調製：食品の試料の強化培養を行い、抗原暴露
に好ましい検定緩衝液で希釈した培地をこの試料の試料
として使用する。サルモネラ菌によってひどく汚染され
ていると予想される場合、試料が液体であるかまたは液
体の形態で懸濁させることができるとき、試験は、元の
試料を希釈することによって強化を行わずに実施するこ
とができる。

試験の実施 1. 試験ストリップの受容端を試料液中20mmの深さまで
浸漬する。

2. ストリップを試料液から取り出す。

3. ５分後、試験ストリップに現れる青色ラインの数を
記録して試験結果を判定する。

判定：青色ラインがストリップ中に１本現れた場合、
その試験結果は陰性である。青色ラインが２本現れた場
合、その試験はサルモネラ菌の種に対し陽性である。こ
の試験は1m当り10万〜百万個以上の細菌を検出するこ
とができる。

これまで本発明を、診断試験および環境試験の特定の
実施態様を参照して説明してきた。前記実施例は例示す
るだけを目的としており当該技術分野の当業者は、本発
明の範囲を逸脱することなく、後記特許請求の範囲によ
って定義されている限界内で本発明を変えることができ
ることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ティカノジャ、サリハンネルフィンランド，エフアイエヌ―00100 ヘルシンキ，ヴェイネメイセンカトゥ 29 ビー 24 (72)発明者トゥルネン、ペッカアンテロフィンランド，エフアイエヌ―80100 ジョエンスー，プーセペンカトゥ８ (72)発明者シヴォネン、ラウリマルクスフィンランド，エフアイエヌ―00250 ヘルシンキ，マンネルヘイミンティエ 45 エー５ (56)参考文献特開昭63−172962（ＪＰ，Ａ) 特開平３−279861（ＪＰ，Ａ) 特開昭61−62866（ＪＰ，Ａ) 特開昭60−89753（ＪＰ，Ａ) 特表平１−503174（ＪＰ，Ａ) (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) G01N 33/543

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】迅速免疫検定法用試験ストリップ（10）で
あって、前記試験ストリップ（10）が特異的な免疫化学
試薬領域（7,8,9）を有し、バッキング（１）およびこ
のバッキングに接着された受容端パッド（３）と受容端
パッドから距離をおいてバッキングに接着された終了端
パッド（５）とを備え、さらに試験膜（２）が前記パッ
ド（3,5）の間に設けられ、この膜（２）は試料と液体
流で接触させるのを目的とするもので前記バッキング
（１）とは距離をおいて平行である試験ストリップ（1
0）において；前記バッキング（１）と前記膜（２）が、それら自体の
間に、その端縁が開いている空隙（４）を規定している
ことを特徴とする迅速免疫検定法用試験ストリップ。
【請求項２】前記受容端パッド（３）が吸収性材料製で
ある請求の範囲１記載の試験ストリップ。
【請求項３】前記終了端パッド（５）が吸収性材料製で
ある請求の範囲２記載の試験ストリップ。
【請求項４】前記ストリップが二つのバッキングを有
し、その一方がバッキング支持体（１）を形成し、他方
が少なくとも一部分が透明のカバー（６）を形成し、前
記パッド（3,5）と前記試験膜（２）が前記バッキング
支持体（１）と前記カバー（６）の間に配置され、その
結果、前記パッド（3,5）、前記試験膜（２）および前
記バッキング（1,6）の一方が、それらの間に、保護さ
れた反応チャンバーとして機能する前記の端縁が開いた
空隙（４）を形成する請求の範囲１〜３のいずれか一つ
に記載の試験ストリップ。
【請求項５】前記試験膜（２）が、多孔性材料製であ
り、前記試験膜（２）の少なくとも一部分が前記バッキ
ング（1,6）の一方に接着されている請求の範囲１〜４
のいずれか一つに記載の試験ストリップ。
【請求項６】前記多孔性材料がニトロセルロースまたは
ナイロンである請求の範囲５記載のストリップ。
【請求項７】前記受容端パッド（３）または前記膜
（２）が、被検体に対する抗体のような免疫化学試薬で
コートされた可動着色粒子を含有する一つ以上の標識領
域（７）を含有し、ならびに前記空隙（４）に対応する
領域内の前記膜（２）が、他の抗体または前記被検体の
接合体のような免疫化学試薬を含有する一つ以上の試験
領域（8,8′,8″）および適正な流動状態を示す一つの
対照領域（９）を有する請求の範囲１〜６のいずれか一
つに記載の試験ストリップ。
【請求項８】前記標識領域（７）が、１種以上の被検体
に対する異なる特異的免疫化学試薬および／または異な
る濃度の１種以上の特異的免疫化学試薬を含有している
請求の範囲７記載の試験ストリップ。
【請求項９】前記標識領域（７）が、（ａ）モノクローナルhCG抗体、（ｂ）モノクローナルIGFBP−１抗体、（ｃ）ヘモグロビン抗体とアルブミン抗体の両者、（ｄ）モノクローナル抗トルエン抗体、または（ｅ）モノクローナルサルモネラ抗体、からなる抗体でコートされた着色粒子を含有し；ならび
に前記試験領域（8,8′,8″）がそれぞれ（ａ）他のモノクローナルhCG抗体、（ｂ）他のモノクローナルIGFBP−１抗体、（ｃ）他のヘモグロビン抗体と他のアルブミン抗体、（ｄ）トルエン接合体、または（ｅ）モノクローナルサルモネラ抗体、を含有する請求の範囲１〜８のいずれか一つに記載の試
験ストリップ。
【請求項１０】下記ステップ：（ａ）１種以上の免疫化学試薬の別個の連続した領域
を、連続長の試験膜上に、縦方向に付与して乾燥し；（ｂ）パッドの材料の少なくとも二つの別個の連続帯状
体を、互いに距離をおいて、連続長のバッキング材料に
接着し；（ｃ）ステップ（ａ）で製造した連続長の試験膜をパッ
ドの材料の前記帯状体の上に配置して、前記試薬領域を
パッド材料の前記帯状体の間に形成された空隙と並べ；（ｄ）連続長の透明カバー材料を、前記パッドの帯状体
と前記連続長の試験膜の上に接着し；次いで（ｅ）得られたストリップの原反を切断して所望の大き
さの試験ストリップを得る；を含んでなることを特徴とする、請求の範囲１〜９のい
ずれか一つに記載の試験ストリップを製造する方法。
【請求項１１】標識試験の一つ以上の連続領域を前記連
続長の膜上にまたはパッド材料の前記帯状体の一方の上
に付与して乾燥する請求の範囲10記載の方法。
【請求項１２】迅速免疫化学環境分析用試験ストリップ
（10）であって；前記試験ストリップ（10）がストリップ様バッキング
（１）ならびにそのバッキングに接着されて液体試料を
吸収する受容端パッド（３）および前記受容端パッド
（３）から距離をおいて該バッキングに接着された終了
端パッド（５）を備え、試験膜（２）が前記パッド（3,
5）の間に液体流接触状態で設置され、前記膜（２）が
前記バッキング（１）に対し距離をおいて平行に配置さ
れ、前記バッキング（１）、前記パッド（3,5）および
前記膜（２）の間に空隙（４）を形成し、前記空隙
（４）はその端縁が開いており、１種以上の環境被検体
と、前記試験ストリップ（10）上の領域（7,8,9）に含
有されている特異的免疫化学試薬との間の免疫化学反応
を行う保護された反応チャンバーとして作動する試験ス
トリップ。
【請求項１３】迅速診断免疫検定法用試験ストリップ
（10）であって；前記試験ストリップ（10）がストリップ様バッキング
（１）ならびにそのバッキングに接着されて液体試料を
吸収する受容端パッド（３）および前記受容端パッド
（３）から距離をおいて該バッキングに接着された終了
端パッド（５）を備え、試験膜（２）が前記パッド（3,
5）の間に液体流接触状態で設置され、前記膜（２）が
前記バッキング（１）に対し距離をおいて平行に配置さ
れ、前記バッキング（１）、前記パッド（3,5）および
前記膜（２）の間に空隙（４）を形成し、前記空隙
（４）はその端縁が開いており、１種以上の診断被検体
と、前記試験ストリップ（10）上の領域（7,8,9）に含
有されている特異的免疫化学試薬との間の免疫化学反応
を行う保護された反応チャンバーとして作動する試験ス
トリップ。