CN101809156A - 体内扩增人类肝细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了使用还有延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的免疫缺陷小鼠，在体内扩增人类肝细胞的方法。方法包括将人类肝细胞移植到免疫缺陷和Fah缺陷小鼠中，允许肝细胞扩增，以及收集扩增的人类肝细胞。方法还允许将人类肝细胞连续移植到次级、第三级、第四级或其它小鼠中。还提供了含有纯合的Fah、Rag2和112rg基因中的缺失或点突变的突变小鼠。

Description

体内扩增人类肝细胞的方法
与相关申请的交叉引用
本申请要求2007年6月5日提交的美国临时申请No.60/933,432的优先权益，该临时申请在此以其全文引为参考。
关于政府支持的陈述
本发明在美国政府的支持下，在国立卫生研究院国家糖尿病和消化及肾脏疾病研究所(National Institute of Diabetes and Digestive andKidney Diseases of the National Institutes of Health)的资助DK051592下作出。美国政府在本发明中拥有一定权利。
技术领域
本公开涉及用于扩增人类肝细胞的方法，具体来说涉及利用免疫缺陷小鼠扩增人类肝细胞的方法。
背景技术
肝脏是异生化合物、包括医用药物代谢的重要位点。因为许多肝酶是种属特异性的，因此必需使用培养的初级人类肝细胞或它们的微粒体级份，来评估候选药物的代谢(Brandon等，Toxicol.Appl.Pharmacol.189：233-246，2003；Gomez-Lechon等，Curr.Drug Metab.4：292-312，2003)。尽管微粒体肝细胞级份可用于阐释某些代谢功能，但其它的测试依赖于活的肝细胞。例如，某些化合物诱导肝酶，因此它们的代谢随着时间而变化。为了分析酶的诱导，肝细胞不仅必须是活的，而且是完全分化和有功能的。
对于药物代谢和其它研究来说，典型情况下肝细胞从器官供体的遗体分离，并运送到要进行测试的场所。遗体来源的肝细胞的状态(存活性和分化状态)是高度不同的，许多细胞制备物的质量勉强合格。高质量人类肝细胞的可获得性受到了下述事实的进一步妨碍，即它们不能在组织培养中大量扩增(Runge等，Biochem.Biophys.Res.Commun.274：1-3，2000；Cascio S.M.，Artif.Organs 25：529-538，2001)。在铺板后，细胞存活，但是不分裂。来自容易获得的哺乳动物物种、例如小鼠的肝细胞，不适合于药物测试，因为它们具有不同的成套代谢酶，并在诱导研究中响应不同。永生的人类肝脏细胞(肝细胞瘤)或胚胎成肝细胞也不足以代替完全分化的成年细胞。在微生物学领域也需要对人类肝细胞进行研究。许多人类病毒，例如引起肝炎的病毒，不能在任何其它细胞类型中复制。
由于这些限制，扩增初级人类肝细胞的方法是高度需要的。因此，本文提供了用于扩增人类肝细胞的强有力的系统。
发明概要
本文提供了体内扩增人类肝细胞的方法。方法包括将分离的人类肝细胞注射到免疫缺陷小鼠中，允许肝细胞扩增，以及收集人类肝细胞。
在几个实施方案中，将人类肝细胞施用于免疫缺陷接受体小鼠，其中小鼠还缺陷延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)。在某些实施方案中，小鼠是Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠。在其它实施方案中，小鼠是Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-(FpmRG)小鼠。在本方法的某些实施方案中，在注射人类肝细胞之前，将编码人类尿激酶的载体施用于小鼠。在其它实施方案中，在肝细胞注射前，从小鼠消除了巨噬细胞。
在某些实例中，人类肝细胞在接受体小鼠、例如FRG小鼠或FpmRG小鼠中扩增至少大约2周。从接受体小鼠收集扩增的人类肝细胞。在一个实施方案中，将分离的人类肝细胞注射到接受体小鼠的脾脏中，并从小鼠的肝脏收集扩增的人类肝细胞。收集的肝细胞可以被导入另一个接受体小鼠，例如FRG小鼠或FpmRG小鼠，用于进一步扩增。因此，方法可以重复使用，以进一步扩增人类肝细胞。
在本文提供的方法的一个实施方案中，在肝细胞注射之前，对Fah缺陷的小鼠施用抑制、阻止或延迟肝脏疾病发生的药剂。一种这样的药剂是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)。NTBC或其它适合的药剂，可以通过任何适合的手段施用，包括但不限于在饮用水中，在食物中，或通过注射。任选，在肝细胞注射后，NTBC还施用至少大约3天到至少大约6天。
在几个实施方案中，人类肝细胞从器官供体或从肝脏外科切除术获得。在某些实施方案中，人类肝细胞源自于干细胞。在其它实施方案中，人类肝细胞在注射前超低温保藏。在其它实施方案中，人类肝细胞来自于肝细胞的细胞系。
本文还提供了遗传修饰的小鼠，其基因组对于Fah、Rag2和Il2rg基因中的缺失或点突变来说是纯合的，使得缺失或点突变导致了功能性FAH、RAG-2和IL-2Rγ蛋白的表达的丧失，其中小鼠是免疫缺陷的，并表现出降低的肝功能，并且其中人类肝细胞可以在小鼠中扩增。在一个实施方案中，缺失导致了B细胞、T细胞和NK细胞的完全丧失。在另一个实施方案中，小鼠表达人类尿激酶。
从下面的几个实施方案的详细描述中，并参考随附的图，上述的以及其它的特点和优点将变得更加明显。
附图说明
图1a是显示了在用人类肝细胞移入和再增殖后，三重突变FRG小鼠(#471)和两只杂合子同窝仔畜(#469，#470)的相对重量的图。FRG小鼠在移植后6周维持了其体重；但是，Il2rg基因杂合子同窝仔畜持续地减重。NTBC只在第一和第四周施用，这用阴影指示。图1b是凝胶的数字照片，显示了来自肝细胞-接受体肝脏的基因组DNA上人类Alu序列的PCR扩增产物。只有FRG小鼠是阳性的。图1c-e是显示了野生型(图1c)、Fah(-/-)(图1d)和人源化小鼠肝脏(图1e)中的FAH酶活性的图片。FAH底物浓度在野生型小鼠肝脏中下降了，但是使用Fah-/-小鼠肝脏时没有变化。人源化小鼠肝脏显示出充足的酶活性。图1f是再增殖的小鼠肝脏中FAH免疫染色的数字照片，显示出超过80％的肝细胞是FAH阳性的(由暗染色和大的箭头指示)。小箭头区别指示了FAH阴性细胞。图1g是同样的肝脏切片的H&E染色的数字照片，显示了人类肝细胞嗜曙红性低(由箭头指示)。原始放大倍数x200。
图2a-h是来自嵌合小鼠的组织学和免疫组织化学组织切片的数字照片。图2a是数字照片，显示了FAH阳性人类肝细胞整合到小鼠肝脏组织中，并且不扰乱接受体肝脏的微观结构。图2b是数字照片，显示了高度再增殖的嵌合肝脏也保留了正常的结构。图2c和2d是H&E染色的数字照片，显示了人类肝细胞簇嗜曙红性低。图2e是数字照片，显示了对FAH染色的连续切片。图2f是数字照片，显示了对HepPar染色的连续切片。图2g是来自高度再增殖小鼠的肾脏切片的数字照片，显示出即使在移植后4个月，也没有肾小管或肾小球破坏。图2h是数字照片，显示了脾脏中FAH阳性的人类肝细胞。原始放大倍数x100(图2c)，x200(图1a、2b、2e、2f和2g)，x400(图2d和2h)。
图3a是一系列凝胶切片，显示了来自嵌合小鼠肝脏的RT-PCR产物。人类ALB、FAH、TAT、TF、TTR和UGT1A1基因在嵌合小鼠肝脏(#697和#785)中表达。人类肝细胞和小鼠肝细胞被分别用作阳性和阴性对照。图3b(正常作图)和图3c(对数作图)是显示了使用ELISA测定的初级肝细胞接受体的人类血白蛋白浓度的图。系统的阈值浓度为大约0.005μg/ml。图3d(正常作图)和图3e(对数作图)是显示了次级接受体的人类白蛋白浓度的图。对数作图显示了白蛋白浓度的倍增时间是大约一周。
图4a是示意图，显示了从初级细胞开始(在最左侧的深色框中)的连续的移植流程。深色框指示了再增殖的连续接受体，白色框指示了移入的小鼠。只有1/4的初级接受体再增殖，但是所有的6个次级接受体都移入了。图4b是凝胶的数字照片，显示了来自连续移植的接受体肝脏的Alu序列的PCR扩增产物。图4c-e是通过FAH免疫细胞化学分析的肝细胞的数字照片，证明了来自第三级小鼠的培养的肝细胞超过70％对FAH是阳性的。图4f-h是组织切片的数字照片，显示了连续移植的小鼠肝脏的FAH免疫组织化学。初级(图4f)、次级(图4g)和第三级(图4h)接受体肝脏通过人类肝细胞进行了再增殖。
图5a-c是嵌合小鼠肝细胞的抗小鼠白蛋白抗体和抗FAH抗体免疫细胞化学的数字照片。大多数来自嵌合肝脏的肝细胞是小鼠白蛋白或FAH单一阳性的。图5d-f是嵌合小鼠肝细胞的抗人类白蛋白抗体和抗FAH抗体免疫细胞化学的数字照片。大多数肝细胞是人类白蛋白和FAH双重阳性的。原始放大倍数x100。图5g-l是显示了嵌合小鼠肝细胞的流式细胞术分析的图。使用了FITC结合的抗HLA A、B、C抗体和PE结合的抗H-2Kb抗体。显示了针对HLA-A、B、C的对照人类肝细胞(图5g)；针对HLA-A、B、C的对照小鼠肝细胞(图5i)；针对H-2Kb的对照人类肝细胞(图5h)；针对H-2Kb的对照小鼠肝细胞(图5j)；以及来自两个高度嵌合小鼠的肝细胞(图5k和图51)，它们对于HLA或H-2Kb各是阳性的。
图6a和6b是显示了乙氧基9-羟基-3-异吩唑酮-O-脱乙基酶(CYP1A1依赖性)的代谢(图6a)，以及睾酮向6-β-羟基睾酮的转化(CYP3A4介导的)(图6b)的图。分析了来自三只具有不同的人类肝细胞再增殖水平(M790 10％；M697 30％；M785 60％)的小鼠的培养肝细胞。图6c是描绘了通过定量RT-PCR测定的与药物代谢、运输和结合相关的人类特异性基因的mRNA水平图。人类药物代谢基因的比例是成年人类肝细胞典型的。
图7a-h是描绘了在来自三只具有不同的人类肝细胞再增殖水平(M790 10％；M697 30％；M785 60％)的小鼠的肝细胞中，肝脏特异性基因和参与药物代谢的基因的基础基因表达水平的图。图7a是三个样品中肝脏特异性基因的基础表达的条形图，针对小鼠肌动蛋白mRNA进行归一化。图7b-h是对β-萘黄铜(BNF)、苯巴比妥(PB)和利福平(Rif)作出响应，对参与药物代谢的mRNAs的诱导的条形图，相对于在未诱导的培养物中的诱导。显示的是CYP3A4(图7b)，CYP2B6(图7c)，CAR(核激素受体)(图7d)，MDR1(转运蛋白)(图7e)，MRP(图7f)，BSEP(转运蛋白)(图7g)，以及PXR(核激素受体)(图7h)。CYP3A4被苯巴比妥的诱导甚至比在酶的水平上更显著。
序列列表
在随附的序列列表中列出的核酸和氨基酸序列，使用了核苷酸碱基的标准字母缩写和氨基酸的三字母编码，正如在37C.F.R.1.822中定义的。每个核酸序列只显示了一条链，但是应该理解对显示的链的任何引用也包含了互补链。在随附的序列列表中：
SEQ ID NOs：1和2是用于扩增人类Alu序列的PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：3是人类ALB的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：4是人类ALB的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：5是小鼠Alb的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：6是小鼠Alb的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：7是人类TAT的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：8是人类TAT的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：9是人类TF的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：10是人类TF的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：11是人类FAH的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：12是人类FAH的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：13是人类TTR的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：14是人类TTR的反向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：15是人类UGT1A1的正向RT-PCR引物的核酸序列。
SEQ ID NO：16是人类UGT1A1的反向RT-PCR引物的核酸序列。
详细描述
I.缩写
AAV    腺相关病毒
ALB     白蛋白
ALT     丙氨酸氨基转移酶
AST     天冬氨酸氨基转移酶
BNF     β-萘黄酮
DAB     二氨基联苯胺
ELISA   酶联免疫吸附分析
EROD    乙氧基9-羟基-3-异吩唑酮-O-脱乙基酶
FACS    荧光激活细胞分拣
FAH     延胡索酰乙酰乙酸水解酶
FISH    荧光原位杂交
FITC    荧光素异硫氰酸酯
FRG     Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-三重突变小鼠
HLA     人类白细胞抗原
IL-2Rγ 白介素-2受体γ
MHC     主要组织相容性复合物
NTBC    2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮
PB      苯巴比妥
PBS     磷酸盐缓冲盐水
PCR     聚合酶链反应
PE      藻红蛋白
PFU     噬斑形成单位
RAG     重组酶活化基因
Rif     利福平
RT-PCR  反转录聚合酶链反应
TAT     酪氨酸氨基转移酶
TF      转铁蛋白
TTR     运甲状腺素蛋白
UGT1A1  UDP葡萄糖醛酸转移酶1家族，多肽A1
uPA     尿激酶纤溶酶原激活物
II.术语
除非特别指明，技术术语按照常规用法使用。分子生物学中常用术语的定义可以在Benjamin Lewin的《基因V》(Genes V，由OxfordUniversity Press出版，1994(ISBN 0-19-854287-9))，Kendrew等主编的《分子生物学百科全书》(The Encyclopedia of Molecular Biology，由Blackwell Science Ltd.出版，1994(ISBN 0-632-02182-9))，以及Robert A.Meyers主编的《分子生物学和生物技术：综合桌面参考》(Molecular Biology and Biotechnology：a Comprehensive DeskReference，由VCH Publishers，Inc.出版，1995(ISBN 1-56081-569-8))中发现。
为了便于浏览本发明的各种不同实施方案，提供了下面对具体术语的解释：
抑制或阻止肝脏疾病发生的药剂：当施用于FRG小鼠、FpmRG小鼠或其它类型的Fah缺陷小鼠时，在小鼠中阻止、延迟或抑制肝脏疾病发生的化合物或组合物。肝脏疾病或肝功能障碍的特征为多种征兆或症状中的任何一种，包括但不限于肝脏组织学的改变(例如坏死、炎症、发育异常或肝癌)，肝脏特异性酶和其它蛋白(例如天冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白)的水平的改变，或肝脏总体衰竭。在一个实施方案中，抑制肝脏疾病的药剂是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)。
羊水细胞：在胚胎周围的羊水中发现的细胞。
抗体：包含一种或多种基本上由免疫球蛋白基因或免疫球蛋白基因片段编码的多肽的蛋白(或蛋白复合物)。已识别到的免疫球蛋白基因包括κ、λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数的免疫球蛋白可变区基因。轻链被分类为κ或λ。重链被分类为γ、μ、α、δ或ε，它们相应地分别定义了免疫球蛋白类型IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
基本的免疫球蛋白(抗体)结构单位一般是四聚体。每个四聚体由两对同样的多肽链构成，每对具有一条“轻链”(大约25kDa)和一条“重链”(大约50-70kDa)。每条链的的N-末端定义了大约100到110个或以上氨基酸的可变区，主要负责抗原识别。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指这些轻链和重链。
本文中使用的术语“抗体”包括完整的免疫球蛋白以及许多已充分定性的片段。例如，与靶蛋白(或蛋白或融合蛋白中的表位)结合的Fabs、Fvs以及单链Fvs(SCFvs)，也是该蛋白(或表位)的特异性结合剂。这些抗体片段定义如下：(1)Fab，含有抗体分子的单价抗原结合片段的片段，通过用木瓜蛋白酶消化完整抗体而得到完整的轻链和一条重链的一部分而产生；(2)Fab′，通过用胃蛋白酶处理完整抗体，然后通过还原产生完整的轻链和一部分重链而获得的抗体分子的片段；每个抗体分子获得两个Fab′片段；(3)(Fab′)2，通过用胃蛋白酶处理整个抗体，随后不进行还原而获得的抗体的片段；(4)F(ab′)2，两个Fab′片段通过两个二硫键连接在一起的二聚体；(5)Fv，遗传工程的片段，含有表达为两条链的轻链可变区和重链可变区；以及(6)单链抗体，遗传工程分子，含有轻链可变区和重链可变区，通过适合的肽接头连接成遗传融合的单链分子。制造这些片段的方法是常规的(参见，例如Harlow和Lane，《抗体使用实验指南》(Using Antibodies：ALaboratory Manual)，CSHL，New York，1999)。
用于本公开的方法的抗体可以是单克隆的或多克隆的。仅仅是举例，单克隆抗体可以从鼠类杂交瘤、按照Kohler和Milstein的经典方法(Nature 256：495-97，1975)或其衍生方法制备。单克隆抗体生产的详细步骤描述在Harlow和Lane，《抗体使用实验指南》(UsingAntibodies：A Laboratory Manual)，CSHL，New York，1999中。
B细胞：一种类型的淋巴细胞，在体液免疫应答中发挥重要作用。B细胞的基本功能是制造针对可溶性抗原的抗体。B细胞是获得性免疫系统的必要组分。
收集：本文中使用的“收集”扩增的人类肝细胞，是指从已经注射过分离的人类肝细胞的小鼠(也被称为接受体小鼠)取出扩增的肝细胞的过程。收集任选包括将肝细胞与其它细胞类型分离开。在一个实施方案中，从Fah缺陷小鼠的肝脏收集扩增的人类肝细胞。在某些实施例中，从FRG小鼠或FpmRG小鼠的肝脏收集扩增的人类肝细胞。
白介素受体的共同γ链(Il2rg)：编码白介素受体的共同γ链的基因。Il2rg是许多白介素的受体成分，包括IL-2、IL-4、IL-7和IL-15(Di Santo等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：377-381，1995)。Il2rg缺陷的动物表现出B细胞和T细胞减少，并缺乏自然杀伤细胞。
超低温保藏的：本文使用的“超低温保藏的”是指通过冷却到低零下温度，例如77K或-196℃(液氮的沸点)，来保存或维持的细胞或组织。在这些低温下，任何生物活性、包括导致细胞死亡的生物化学反应，都被有效终止。
降低的肝脏功能：用于度量肝脏的健康或功能的许多参数中任何一个的异常变化。降低的肝脏功能在本文中也被称为“肝脏功能障碍”。肝脏功能可以通过本技术领域熟知的许多手段中的任何一种进行评价，例如但不限于检查肝脏组织学和测量肝脏酶或其它蛋白。例如，肝脏功能障碍可以由肝脏的坏死、炎症、氧化损伤或发育异常所指示。在某些情况下，肝脏功能障碍由肝癌指示，例如肝细胞癌。可以被测试以评估肝脏功能障碍的肝脏酶和蛋白的例子，包括但不限于丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、胆红素、碱性磷酸酶和白蛋白。肝脏功能障碍也可以导致肝脏总体衰竭。用于测试肝脏功能的方法在本技术领域中是众所周知的，例如由Grompe等(GenesDev.7：2298-2307，1993)和Manning等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.96：11928-11933，1999)讲述的，它们在本文中引为参考。
缺陷：本文中使用的“Fah缺陷”或“Fah中的缺陷”是指动物例如小鼠，在Fah中含有突变，导致了Fah mRNA表达和/或功能性FAH蛋白的显著减少或不存在。在一个实施方案中，Fah缺陷的动物在Fah基因中含有纯合的的缺失。作为一个例子，纯合的缺失是在Fah的外显子5中。在另一个实施方案中，Fah缺陷的动物在Fah基因中含有一个或多个点突变。适合的Fah点突变的例子在本技术领域中是已知的(参见例如Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.950：641-645，2001，在此引为参考)。
消除：减少或除去。本文中使用的“巨噬细胞消除”是指清除、除去、减少或杀死动物中的巨噬细胞的过程。已经被消除巨噬细胞的动物，不一定完全不含巨噬细胞，但是至少表现出巨噬细胞数量的减少或活性的降低。在一个实施方案中，巨噬细胞消除导致有功能的巨噬细胞减少了至少10％、至少25％、至少50％、至少75％、至少90％或100％。
移入：将细胞或组织植入到动物中。本文中使用的人类肝细胞在接受体小鼠中的移入，是指人类肝细胞在注射后变得植入到接受体小鼠中的过程。移入的人类肝细胞能够在接受体小鼠中扩增。正如本文所述，“显著移入”是指在接受体小鼠中，肝脏中至少大约1％的肝细胞是人类的。“高度移入的”小鼠，是其肝脏中至少大约30％的肝细胞是人类的小鼠。但是，移入效率可以更高，例如小鼠肝脏中至少大约40％、至少大约50％、至少大约60％、至少大约70％、至少大约80％、至少大约90％或至少大约95％的肝细胞是人类肝细胞。
胚胎干(ES)细胞：从发育中的囊胚的内部细胞团分离的多能细胞。ES细胞是多能细胞，意味着它们可以产生身体中存在的所有细胞(骨骼、肌肉、脑细胞等)。用于产生鼠类ES细胞的方法可以在美国专利No.5,670,372中发现，在此引为参考。用于产生人类ES细胞的方法可以在美国专利No.6,090,622、PCT公布No.WO 00/70021和PCT公布No.WO 00/27995中发现，每个都在此引为参考。
扩增：增加数量。本文中使用的“扩增”人类肝细胞，是指允许细胞分裂发生，使得人类肝细胞的数量增加的过程。正如本文所述，使人类肝细胞在接受体小鼠中扩增至少大约4周、至少大约6周、至少大约8周、至少大约12周、至少大约16周、至少大约20周、至少大约20周或至少大约28周。在一个实施方案中，使人类肝细胞扩增多达大约6个月。从扩增产生的人类肝细胞的数量可以是不同的。在一个实施方案中，扩增产生了至少1千万、至少2千万、至少3千万、至少4千万或至少5千万个肝细胞。假设最初注射了1百万个肝细胞，并且有大约10％移入，则肝细胞扩增可以在大约10倍到大约500倍的范围内。在某些实施方案中，人类肝细胞在接受体小鼠中的扩增，导致增加了至少10倍、至少50倍、至少100倍、至少150倍、至少200倍、至少250倍、至少300倍、至少400倍、至少500倍或至少1000倍。
FRG小鼠：在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)、重组酶活化基因2(Rag2)和白介素接受体的共同γ链(Il2rg)基因中具有纯合缺失的突变小鼠。在本文中也被称为Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-。本文中使用的Fah、Rag2和Il2rg基因中的纯合缺失，是指在含有突变的小鼠中不表达有功能的FAH、RAG-2和IL-2Rγ蛋白。
FpmRG小鼠：在重组酶活化基因2(Rag2)、和白介素受体的共同γ链(Il2rg)基因中具有纯合缺失，以及在延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)中具有纯合点突变的突变小鼠。在FpmRG小鼠的Fah基因中的点突变，导致了mRNA中的错误拼接和外显子7的丢失(Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 98：641-645，2001)。在本文中也称为Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-。本文中使用的Rag2和Il2rg基因中的纯合缺失，是指在含有突变的小鼠中不表达有功能的RAG-2和IL-2Rγ蛋白。此外，在Fah基因中具有纯合点突变的小鼠，不表达有功能的FAH蛋白。
延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)：催化酪氨酸分解代谢最后一步的代谢酶。具有纯合的Fah基因缺失的小鼠表现出改变的肝脏mRNA表达和严重的肝脏功能障碍(Grompe等，Genes Dev.7：2298-2307，1993，在此引为参考)。Fah基因中的点突变已经被显示引起肝脏衰竭和产后致死(Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98(2)：641-645，2001，在此引为参考)。
逐渐降低：本文中使用的“逐渐降低”NTBC的剂量，是指随着时间、例如经过几天时间减少施用于Fah缺陷小鼠的NTBC剂量的过程。在一个实施方案中，NTBC剂量经过大约6天时间逐渐降低，其中剂量以大约1或2天的间隔降低，使得在大约1周后，不再施用NTBC。NTBC的逐渐降低可以在更短或更长的时间过程中进行，剂量减少之间的时间间隔也可以更短或更长。
肝细胞：一种类型的细胞，占肝脏细胞质质量的70-80％。肝细胞参与蛋白合成，蛋白储存和碳水化合物转化，胆固醇、胆盐和磷脂的合成，以及外源和内源物质的解毒、修饰和排泄。肝细胞也引发胆汁的形成和分泌。肝细胞制造血清白蛋白、纤维蛋白原和凝血酶原类型的凝血因子，是脂蛋白、血浆铜蓝蛋白、转铁蛋白、补体和糖蛋白合成的主要位点。此外，肝细胞具有代谢、解毒和失活外源化合物例如药物和杀虫剂以及内源化合物类如类固醇的能力。
纯合的：在一个或多个基因座处具有同样的等位基因。本文中使用的“对于缺失纯合”，是指生物体基因的两个等位基因具有同样的缺失。
免疫缺陷：缺乏免疫系统的至少一种必需功能。本文中使用的“免疫缺陷”小鼠是缺乏免疫系统的特定组分或缺乏免疫系统的特定组分的功能的小鼠。在一个实施方案中，免疫缺陷小鼠缺乏有功能的B细胞、T细胞和/或NK细胞。在另一个实施方案中，免疫缺陷小鼠还缺乏巨噬细胞。
分离的：“分离的”肝细胞是指从具体的来源、例如器官供体获得的，随后与其它细胞类型基本上分离开或从中纯化出来的肝细胞。
巨噬细胞：组织中源自于被称为单核细胞的特定白细胞的一种细胞。单核细胞和巨噬细胞都是吞噬细胞，在脊椎动物的非特异性防御
(或先天免疫)以及特异性防御(或细胞介导的免疫)中都发挥作用。它们的功能是作为静止或运动细胞吞噬(吞没然后消化)细胞碎片和病原体，并刺激淋巴细胞和其它免疫细胞对病原体作出响应。
自然杀伤(NK)细胞：一种形式的细胞毒性淋巴细胞，构成了先天免疫系统的主要成分。NK细胞在肿瘤和病毒感染的细胞的宿主排斥中，发挥了主要作用。
接受体：本文使用的“接受体小鼠”是用本文描述的分离的人类肝细胞注射的小鼠。典型情况下，一部分(百分率可以不同)人类肝细胞移入到接受体小鼠中。在一个实施方案中，接受体小鼠是免疫缺陷小鼠，它进一步缺陷Fah。在另一个实施方案中，接受体小鼠是Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠，它进一步缺陷Fah。在另一个实施方案中，接受体小鼠是FRG小鼠。在另一个实施方案中，接受体小鼠是FpmRG小鼠。
重组酶活化基因2(Rag2)：参与免疫球蛋白与T细胞受体位点的重组的基因。Rag2基因缺陷的动物不能经历V(D)J重组，导致完全失去有功能的T细胞和B细胞(Shinkai等，Cell 65：855-867，1992)。
连续移植：用于体内扩增人类肝细胞的过程，其中收集在第一只小鼠中扩增的肝细胞，并例如通过注射，移植到第二只小鼠中进行进一步扩增。连续移植可以进一步包括第三级、第四级或更多级的小鼠。
干细胞：具有产生未改变的子细胞(自身更新；细胞分裂产生了至少一个与亲代细胞完全相同的子代细胞)和产生特化的细胞类型(潜能)的独特能力的细胞。干细胞包括但不限于胚胎干(ES)细胞、胚胎生殖(EG)细胞、生殖干(GS)细胞(GS)、人类间充质干细胞(hMSCs)、脂肪组织衍生的干细胞(ADSCs)多能成人祖细胞(MAPCs)、多能成人生殖干细胞(maGSCs)和不受限制的身体干细胞(USSCs)。干细胞在体内的功能是替换在动物的正常生命期间破坏的细胞。一般来说，干细胞可以不受限制地分裂。在分裂后，干细胞可以保持为干细胞、变成前体细胞或进入终末分化。前体细胞是可以产生至少一种给定细胞类型的完全分化的有功能细胞的细胞。一般来说，前体细胞可以分裂。分裂后，前体细胞可以保持为前体细胞，或可以进入终末分化。在一个实施方案中，干细胞产生肝细胞。
T细胞：一种类型的白细胞、或淋巴细胞，在细胞介导的免疫中发挥中心作用。T细胞与其它类型的淋巴细胞、例如B细胞和NK细胞的差别在于，在它们的细胞表面上存在被称为T细胞受体(TCR)的特异性受体。一般来说，据信胸腺是T细胞发生的主要器官。转入基因：被导入到生物体的细胞或基因组中的外源核酸序列。
转基因动物：非人类动物、通常为哺乳动物，具有非内源的(异源的)核酸序列作为染色体外元件存在于其一部分细胞中，或稳定地整合在其种系DNA中(即在其大多数或所有细胞的基因组序列中)。异源核酸通过例如按照本技术领域熟知的方法对宿主动物的胚胎或胚胎干细胞进行遗传操作，导入到这样的转基因动物的种系中。“转基因”意指这样的异源核酸，例如表达构建物形式的异源核酸(例如用于产生“敲入”转基因动物)，或者在插入到靶基因中或附近后导致靶基因的表达降低的异源核酸(例如用于产生“敲除”转基因动物)。“敲除”基因意味着改变基因的序列，导致靶基因的功能降低，优选使得靶基因的表达不能检测到或不显著。转基因敲除动物可以包含靶基因的杂合敲除或靶基因的纯合敲除。“敲除”也包括条件性敲除，其中靶基因的改变，可以在例如将该动物暴露于促进靶基因改变的物质后、导入促进靶基因位点处的重组的酶(例如Cre-lox系统中的Cre)后、或使用其它在出生后引导靶基因改变的方法后，才发生。
载体：允许插入外源核酸而不破坏载体在宿主细胞中的复制和/或整合能力的核酸分子。载体可以包含允许其在宿主细胞中复制的核酸序列，例如复制原点。载体也可以包含一种或多种选择性标记基因或其它遗传元件。整合载体能够将其自身整合到宿主核酸中。表达载体是含有必要的调控序列而允许插入的基因转录和反义的载体。在本文描述的一个实施方案中，载体含有编码尿激酶、例如人类尿激酶的序列。在一个实施方案中，载体是质粒载体。在另一个实施方案中，载体是病毒载体，例如腺病毒载体或腺相关病毒(AAV)载体。
尿激酶：也被称为尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)，尿激酶是一种丝氨酸蛋白酶。尿激酶最初从人类尿液中分离，但是存在于几种生理位置中，例如血流和细胞外基质中。主要的生理学底物是纤溶酶原，它是丝氨酸蛋白酶纤溶酶的无活性的酶原形式。纤溶酶的活化触发了蛋白水解级联，它根据生理环境参与血栓溶解或细胞外基质降解。在本文提供的方法的一个实施方案中，在肝细胞注射之前将尿激酶施用于接受体小鼠。在某些实施方案中，尿激酶是人类尿激酶。在某些实施方案中，人类尿激酶是分泌形式的尿激酶。在某些实施方案中，人类尿激酶是修饰的、非分泌形式的尿激酶(参见美国专利No.5,980,886，在此引为参考)。
除非另有解释，否则在本文中使用的所有技术和科学术语，都与本发明所属技术领域中的普通专业人员所通常理解的具有同样的意义。没有数量指示的名词形式包含了其复数的指称物，除非上下文明确表明不是这样。同样地，单词“或”意在包括“和”，除非上下文明确表明不是这样。因此，“包含A或B”意味着包括A、或B、或A和B。此外，应该理解，对于核酸或多肽给出的所有的碱基尺寸或氨基酸尺寸，以及所有的分子量或分子质量值，都是近似值，仅供描述。尽管与本文描述的相似的或等价的方法和材料可用于本发明的实践或试验，但下面描述了适合的方法和材料。所有在本文中提到的的出版物、专利申请、专利和其它参考文献，在此以其全文引为参考。在有冲突的情况下，以本发明的说明、包括术语的解释为准。此外，材料、方法和实例仅仅是说明性的，不打算进行限制。
III.几个实施方案的概述
本文提供了强有力的体内扩增人类肝细胞的系统。方法包括将分离的人类肝细胞移植到酪氨酸分解代谢酶延胡索酰乙酰乙酸水解酶(Fah)缺陷的免疫缺陷小鼠中。在一个实施方案中，免疫缺陷小鼠是Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠。在一个实施方案中，Fah缺陷小鼠包含Fah的纯合缺失。在另一个实施方案中，Fah缺陷小鼠在Fah中含有一个或多个点突变，使得蛋白的功能和/或生产显著降低。正如本文所述，Fah、重组酶活化基因2(Rag2)和白介素受体的共同γ链(Il2rg)缺陷的三重突变小鼠，提供了用于体内扩增人类肝细胞的有效的体内系统。在某些实施方案中，小鼠是Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠。在某些实施方案中，小鼠是Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-(FpmRG)小鼠。
本文公开了体内扩增人类肝细胞的方法，包括通过例如注射，将分离的人类肝细胞移植到免疫缺陷和Fah缺陷小鼠中(也被称为接受体小鼠)，使人类肝细胞扩增至少大约2周，并从小鼠收集扩增的人类肝细胞。肝细胞可以使用本技术领域已知的任何适合的手段进行移植。在一个实施方案中，通过例如注射，将分离的人类肝细胞移植到接受体小鼠的脾脏中。在另一个实施方案中，从接受体小鼠的肝脏收集扩增的人类肝细胞。使人类肝细胞在接受体小鼠中扩增一段时间，该时间足以使人类肝细胞能够扩增。扩增的准确时间长度可以通过常规实验凭经验确定。在一个实施方案中，使人类肝细胞扩增多达6个月。在另一个实施方案中，使人类肝细胞扩增至少大约4周，至少大约6周，至少大约8周，至少大约12周，至少大约16周，至少大约20周，至少大约24周或至少大约28周。肝细胞扩增的程度可以各不相同。在某些实施方案中，人类肝细胞在接受体小鼠中的扩增，导致增加了至少约10倍、至少约50倍、至少约100倍、至少约150倍、至少约200倍、至少约250倍、至少约300倍、至少约400倍、至少约500倍或至少约1000倍。
还提供了体内扩增人类肝细胞的方法，其中在注射人类肝细胞之前，向接受体小鼠施用编码尿激酶基因的载体。在一个实施方案中，尿激酶基因是人类尿激酶。野生型的尿激酶是分泌蛋白。因此，在某些实施方案中，人类尿激酶是分泌形式的尿激酶(Nagai等，Gene 36：183-188，1985，在此引为参考)。人类尿激酶(分泌形式)的序列在本技术领域中是已知的，例如但不限于GenBank登记号Nos.AH007073(1993年8月3日交存)、D11143(1996年5月9日交存)、A18397(1994年7月21日交存)、BC002788(2003年8月19日交存)、X02760(1993年4月21日交存)、BT007391(2003年5月13日交存)、NM 002658(2004年10月1日交存)和X74039(1994年2月20日交存)，在此引为参考。
在某些实施方案中，人类尿激酶是修饰的、非分泌形式的尿激酶。例如，Lieber等(Proc.Natl.Acad.Sci.92：6210-6214，1995，在此引为参考)描述了通过在尿激酶的羧基末端插入编码内质网滞留信号的序列，或通过用氨基末端RR滞留信号(Strubin等，Cell 47：619-625，1986；Schutze等，EMBO J.13：1696-1705，1994，二者在此引为参考)和通过间隔肽与膜II型蛋白Iip33分离的跨膜锚(Strubin等，Cell 47：619-625，1986)代替pre-uPA信号肽，产生了非分泌形式的尿激酶。非分泌形式的尿激酶也描述在美国专利No.5,980,886中，在此引为参考。
编码尿激酶的载体，可以是任何类型的适合于投送到小鼠中并能够表达尿激酶基因的载体。这样的载体包括病毒载体或质粒载体。在一个实施方案中，载体是腺病毒载体。在另一个实施方案中，载体是AAV载体。编码尿激酶的载体可以通过本技术领域已知的任何适合的手段施用。在一个实施方案中，载体通过静脉内施用。在一种情况下，载体通过眼球后注射施用。编码尿激酶的载体可以在注射人类肝细胞之前的任何时间施用。典型情况下，载体被施用至允许有足够的时间使尿激酶表达。在一个实施方案中，载体在肝细胞注射前24到48小时施用。
本文还提供了体内扩增人类肝细胞的方法，其中在注射人类肝细胞之前，对接受体小鼠进行了巨噬细胞消除。在一个实施方案中，在巨噬细胞消除之前，向接受体小鼠施用编码尿激酶的载体。在另一个实施方案中，在巨噬细胞消除后，向接受体小鼠施用编码尿激酶的载体。在另一个实施方案中，没有向巨噬细胞消除的接受体小鼠施用编码尿激酶的载体。可以使用本技术领域熟知的许多方法中的任何一种从接受体小鼠消除巨噬细胞，例如通过使用化学物质或抗体。例如，可以通过施用拮抗剂，例如有毒物质、包括C12MDP，或改变巨噬细胞发生、功能和/或存活性的抗体，来除去巨噬细胞。拮抗剂的施用通过熟知的技术来进行，包括使用脂质体，例如在欧洲专利No.1552740中描述的，在此引为参考。含有氯屈膦盐的脂质体也可以用于消除巨噬细胞，正如由van Rijn等(Blood 702：2522-2531，2003)描述的，在此引为参考。
在本文描述的方法的实施方案中，在肝细胞注射之前，向Fah缺陷小鼠施用抑制、延迟或阻止小鼠中肝脏疾病发生的药剂。药剂可以是本技术领域已知的抑制肝脏疾病的任何化合物或组合物。一种这样的药剂是2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)。NTBC的施用用于调控Fah缺陷小鼠中肝脏疾病的发生。剂量、用药时间表以及施用方法，可以根据需要进行调整，以阻止Fah缺陷小鼠中的肝脏功能障碍。在一个实施方案中，NTBC施用的剂量为大约0.01mg/kg/天到大约0.50mg/kg/天。在另一个实施方案中，NTBC施用的剂量为大约0.05mg/kg/天到大约0.10mg/kg/天，例如大约0.05mg/kg/天，大约0.06mg/kg/天，大约0.07mg/kg/天，大约0.08mg/kg/天，大约0.09mg/kg/天或大约0.10mg/kg/天。NTBC可以在注射人类肝细胞之前和/或肝细胞注射后选定的时间施用。根据需要，在肝细胞扩增时间期间，NTBC可以撤销或重新施用。在一个实施方案中，在肝细胞注射前和肝细胞注射后至少大约3天，向Fah缺陷小鼠施用NTBC。在另一个实施方案中，在肝细胞注射前和肝细胞注射后至少大约6天，向Fah缺陷小鼠施用NTBC。在一种情况下，NTBC的剂量在干细胞注射后经6天的时间过程逐渐降低。NTBC可以通过任何适合的手段施用，例如但不限于在引用水中、在食物中或通过注射。在一个实施方案中，在肝细胞注射前在引用水中施用的NTBC的浓度是大约1到大约8mg/L，例如大约1mg/L，大约2mg/L，大约3mg/L，大约4mg/L，大约5mg/L，大约6mg/L，大约7mg/L或大约8mg/L。在另一个实施方案中，在肝细胞注射前在引用水中施用的NTBC的浓度是大约1到大约2mg/L，例如大约1.0mg/L，大约1.2mg/L，大约1.4mg/L，大约1.6mg/L，大约1.8mg/L或大约2.0mg/L。
分离的人类肝细胞可以从许多不同来源的任何一个中获得。在一个实施方案中，人类肝细胞从器官供体的肝脏分离。在另一个实施方案中，人类肝细胞从外科切除术分离。在另一个实施方案中，人类肝细胞从干细胞衍生，例如胚胎干细胞、间充质衍生的干细胞、脂肪组织衍生的干细胞、多能成人祖细胞或不受限制的身体干细胞。在另一个实施方案中，人类肝细胞衍生自单核细胞或羊水细胞，因此在体外获得了干细胞或祖细胞，以产生肝细胞。在另一个实施方案中，人类肝细胞在注射前超低温保藏。
本文还提供了在Fah缺陷的接受体小鼠中连续移植人类肝细胞的方法。方法包括从第一只接受体小鼠收集扩增的人类肝细胞，并进一步在第二、第三、第四只或更多级的接受体小鼠中扩增肝细胞。可以使用许多技术中的任何一种从小鼠收集人类肝细胞。例如，可以按照下面实施例中的描述，通过灌注小鼠肝脏，然后温和切碎，来收集肝细胞。此外，可以使用众所周知的方法，例如通过使用特异性识别人类细胞或人类肝细胞的抗体，将肝细胞与其它细胞类型、组织和/或碎片分离开。这样的抗体包括但不限于与I类主要组织相容性抗原特异性结合的抗体，例如抗人类HLA-A、B、C抗体(Markus等，CellTransplantation 6：455-462，1997)。然后可以通过淘选(利用了与固体基质结合的单克隆抗体)、荧光激活的细胞分拣(FACS)、磁珠分离等，来分离与肝细胞结合的抗体。可选的收集肝细胞的方法在本技术领域中是熟知的。
本文还提供了遗传修饰的小鼠，其基因组对于Fah、Rag2和Il2rg基因中的缺失或点突变来说是纯合的，使得缺失或点突变导致了功能性FAH、RAG-2和IL-2Rγ蛋白的表达的丧失，其中小鼠是免疫缺陷的，并表现出降低的肝功能，并且其中人类肝细胞可以在小鼠中扩增。在一个实施方案中，缺失导致了B细胞、T细胞和NK细胞的完全丧失。在另一个实施方案中，小鼠表达尿激酶。在一个实施方案中，尿激酶是人类尿激酶。在一种情况下，尿激酶的表达是由于并入了编码尿激酶的转基因。另一种情况下，尿激酶的表达是由于施用了编码尿激酶、例如分泌或非分泌形式的尿激酶的载体。编码尿激酶的载体可以是任何类型的适合于投送到小鼠并能够表达尿激酶基因的载体。在一个实施方案中，载体是腺病毒载体。在另一个实施方案中，载体是AAV载体。在某些实施方案中，小鼠是FRG小鼠。在某些实施方案中，小鼠是FpmRG小鼠。
IV.用于扩增人类肝细胞的遗传修饰的小鼠株
几个团队已经尝试了在啮齿动物中移入和扩增初级人类肝细胞(美国专利No.6,509,514；PCT公布No.WO 01/07338；美国公布No.2005-0255591)。Dandri等(Hepatology 33：981-988，2001)首先报道了带有人类肝细胞的小鼠肝脏的成功再增殖。从那以后，其它团队报道了将人类肝细胞成功地移入小鼠。在所有这些研究中，使用的动物是在白蛋白启动子的转录控制下表达尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)的转基因小鼠(Sandgren等，Cell 66：245-256，1991)。uPA的过表达引起了代谢破坏，导致了小鼠肝细胞的细胞死亡，而不影响不表达转基因的移植的人类肝细胞。alb-uPA转基因在各种不同免疫缺陷背景上的杂交，防止了人类细胞的排斥(Tateno等，Am.J.Pathol.165：901-912，2004；Katoh等，J.Pharm.Sci.96：428-437，2007；Turrini等，Transplant.Proc.38：1181-1184，2006)。
尽管在这些模型中已经报道了高达70％的移入水平，但系统有几个主要的缺点，阻止了其广泛使用。首先，alb-uPA转基因在生命的早期阶段变得失活或丢失。因此，必需在非常早(14日龄)移植人类细胞并使用对转基因纯合的小鼠。这种狭窄的移植时间窗口严重限制了模型的灵活性。其次，转基因的自发失活产生了转基因阴性的、健康的小鼠肝细胞的集合。这些回复体鼠类肝细胞，在再增殖过程中与人类细胞有效地竞争。因此，不可能在人类细胞连续移植后再增殖次级接受体。第三，在该模型中，肝脏疾病发作非常早，从而降低了转基因小鼠的生存力。因此，难以培育出足够数量的实验动物。此外，转基因小鼠具有出血的倾向，增加了手术中的死亡率。最后，alb-uPA转基因动物，一旦再增殖到人类细胞超过50％后，将发生肾脏疾病。据认为，这是由于人类补体对肾上皮的作用而引起的。为了获得非常高的人类移入水平，必需用抗补体蛋白酶抑制剂处理移植小鼠(Tateno等，Am.J.Pathol.165：901-912，2004)。因为这些许多限制，更强有力的用于扩增人类肝细胞的系统是高度需要的。
本文描述了高度有效的体内扩增人类肝细胞的方法，使用了具有独特的基因缺失组合的遗传修饰的小鼠。人类肝细胞在小鼠肝脏中的成功移入和扩增，需要具有某种程度的肝脏功能障碍的免疫缺陷小鼠。已经在多种不同类型的免疫缺陷小鼠、包括RAG-2敲除或SCID小鼠中，用人类肝细胞再增殖了小鼠肝脏，这两种小鼠都缺乏B细胞和T细胞(美国专利No.6,509,514；PCT公布No.WO 01/07338；美国公布No.2005-0255591)。为了获得肝脏功能障碍，将免疫缺陷小鼠与尿激酶纤溶酶原激活物(uPA)转基因小鼠杂交。uPA在小鼠肝脏中的表达，对于小鼠肝细胞产生了生长劣势，促进了移植的人类肝细胞的扩增(PCT公布No.WO 01/07338)。为了避免uPA转基因的限制，对Fah缺陷小鼠分析了它们使人类肝细胞扩增的能力。FAH是催化酪氨酸分解代谢的最后一步的代谢酶。具有Fah基因的纯合缺失的小鼠，表现出改变的肝脏mRNA表达和严重的肝脏功能障碍(Grompe等，GenesDev.7：2298-2307，1993)。
当Fah突变杂交到裸鼠或RagI-/-(Mombaerts等，Cell 68：869-877，1992)背景上时，用人类肝细胞再增殖小鼠肝脏没有成功，这最可能是由于免疫排斥引起的。Fah缺陷小鼠与NOD/SCID小鼠的杂交(Dick等，Stem Cell 15：199-203，1997)，产生的小鼠中观察到偶尔的人类肝细胞移入；但是，这些动物发生快速肝衰竭，可能是由于SCID小鼠中存在的双链断裂DNA修复缺陷所致。本文公开了缺乏T细胞、B细胞和NK细胞的Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)三重突变小鼠。Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠在本技术领域中是已知的(Traggiai等，Science 304：104-107，2004；Gorantla等，J.Virol.57：2700-2712，2007)。
正如在下面的实施例中描述的，人类肝细胞在FRG小鼠中的移入和扩增令人吃惊地高效。例如，FRG小鼠可以用1百万个分离的人类肝细胞进行注射。假设效率为10％，十万个人类肝细胞移入到接受体小鼠中。那么，扩增后从FRG小鼠的平均产量是大约3千万到大约4千5百万个人类肝细胞，这相当于人类肝细胞增加300到450倍。FRG小鼠也可以用于人类肝细胞的连续移植。连续移植可以包括多只小鼠，每只小鼠可以产生人类肝细胞的至少大约150倍的扩增。
含有Fah缺陷的任何免疫缺陷小鼠都适合于本文描述的方法。在一个实施方案中，小鼠是在Fah中也有缺陷的Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠。Fah缺陷小鼠可以含有例如Fah的纯合缺失，或Fah的一个或多个点突变。Fah缺陷(例如通过点突变或纯合缺失)导致了Fah mRNA表达和/或有功能的FAH蛋白的显著降低，或不存在。除了FRG小鼠之外，本文描述了对Fah基因中的点突变纯合的免疫缺陷小鼠(Rag2-/-/Il2rg-/-)(在本文中称为FpmRG小鼠)，也是用于人类肝细胞体内移入和扩增的适合小鼠。
V.人类肝细胞的分离和投送
使用Fah缺陷小鼠用于人类肝细胞体内扩增的显著优点，是使用源自于各种不同来源的人类肝细胞移入小鼠的能力。正如在下面的实施例中描述的，人类肝细胞可以源自于遗体捐献者或肝脏切除术，或者可以从商业来源获得。此外，正如本文显示，FRG小鼠可以使用来自于所有年龄的供体的人类肝细胞，或使用超低温保藏的肝细胞，成功地移植。在人类肝细胞的分离和移植之间通常存在延迟(典型为1到2天)，这可能导致肝细胞的存活力不佳。但是，即使当用存活力有限的肝细胞移入时，FRG小鼠系统也能够扩增人类肝细胞。
分离人类肝细胞的方法在本技术领域中是众所周知的。例如，从器官供体或肝脏切除术分离人类肝细胞的方法，描述在PCT公布Nos.WO 2004/009766和WO 2005/028640，以及美国专利Nos.6,995,299和6,509,514中，它们都在此引为参考。肝细胞可以从经皮获取的或通过腹部外科手术获取的肝脏活体组织获得。用于移植到接受体小鼠、例如FRG小鼠中的人类肝细胞，通过本技术领域任何已知的便利方法从人类肝脏组织分离。可以将肝脏组织机械或酶法分散，以提供单细胞悬液，或可以使用完整人类肝组织的片段。例如，通过常规的胶原酶灌注(Ryan等，Meth.Cell Biol.73：29，1976)，然后进行低速离心，将肝细胞从供体组织分离。然后可以通过不锈钢筛网过滤，随后进行密度梯度离心，来纯化肝细胞。可选地，其它的用于富集肝细胞的方法也可以使用，例如荧光激活的细胞分拣、淘选、磁珠分离、在离心场中淘洗，或本技术领域熟知的任何其它方法。可以使用类似的肝细胞分离方法，从接受体小鼠肝脏收集被扩增的人类肝细胞。
可选地，可以使用Guguen-Guillouzo等描述的技术来制备人类肝细胞(Cell Biol.Int.Rep.6：625-628，1982)，该文献在此引为参考。简单来说，分离肝脏或其一部分，并将套管导入门静脉或门脉分支。然后经套管对肝组织进行灌注，使用无钙缓冲液，然后使用在HEPES缓冲液中在氯化钙溶液(例如大约0.075％氯化钙)中含有胶原酶(例如大约0.025％胶原酶)的酶溶液，以每分钟30到70毫升的流速在37℃进行灌注。将灌注过的肝组织切碎成小片(例如大约1立方毫米)。在与上述相同的缓冲液中37℃下酶法消化大约10-20分钟，同时轻轻搅拌，以产生细胞悬液。通过将细胞悬液通过60-80微米的尼龙筛网进行过滤，收集释放的肝细胞。然后将收集到的肝细胞在pH7.0的冷HEPES缓冲液中使用缓慢离心洗涤，以除去胶原酶和细胞碎片。非实质细胞可以通过三碘苯甲酰氨基葡萄糖梯度离心(参见美国专利No.6,995,299)来除去。
人类肝细胞可以从新鲜组织(例如在死亡后数小时内获得的组织)或新鲜冷冻的组织(例如冷冻和维持在或低于0℃的新鲜组织)获得。优选情况下，人类组织没有可检测的病原体，在形态学和组织学方面正常，基本无疾病。用于植入的肝细胞可以是最近分离的，例如在几小时内，或者如果细胞维持在适合的储存介质中，可以在较长的时期后进行移植。在下面实施例中描述的一种这样的介质是VIASPANTM(用于保存腹内器官的通用主动脉冲洗液和冷藏溶液；也被称为威斯康辛大学溶液(University of Wisconsin solution)或UW)。在移植之前，肝细胞也可以被超低温保藏。超低温保藏肝细胞的方法在本技术领域中是熟知的，描述在美国专利No.6,136,525中，在此引为参考。
除了从器官供体或肝脏切除术获得人类肝细胞之外，用于植入的细胞也可以是在移植到接受体动物中后，发育或分化成能够扩增的人类肝细胞的人类干细胞或肝细胞前体细胞。具有ES细胞性质的人类细胞从内囊胚细胞团(Thomson等，Science 282：1145-1147，1998)和发育的生殖细胞(Shamblott等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95：13726-13731，1998)分离，并且已经产生人类胚胎干细胞(参见美国专利No.6,200,806，在此引为参考)。正如在美国专利No.6,200,806中公开的，ES细胞可以从人类或非人类灵长动物产生。一般来说，灵长类ES细胞在存在ES细胞培养基的情况下，在鼠类胚胎成纤维细胞的汇合层上分离。ES培养基一般由80％的Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM；无丙酮酸，高糖配方，Gibco BRL)，以及20％的胎牛血清(FBS；Hyclone)，0.1mMβ-巯基乙醇(Sigma)，1％非必需氨基酸储液(GibcoBRL)构成。ES细胞与成年人中存在的定向“专能”干细胞相比，区别性的特点包括ES细胞在培养中无限期地维持未分化状态的能力，以及ES具有发育成每种不同细胞类型的潜力。人类ES(hES)表达SSEA-4，这是被特异性单克隆抗体识别的糖脂细胞表面抗原(参见例如Amit等，Devel.Biol.227：271-278，2000)。
源自于人类间充质干细胞(hMSCs)的人类肝细胞也可用于本文描述的方法中。将骨髓衍生的hMSCs连续暴露于肝源性因子，导致干细胞分化成具有肝细胞性质的细胞(参见Snykers等，BMC Dev Biol.7：24，2007；Aurich等，Gut.56(3)405-15，2007，每个文献在此引为参考)。骨髓衍生的间充质干细胞和脂肪组织衍生的干细胞(ADSCs)的肝源性分化也已被描述(参见Talens-Visconti等，World JGastroenterol.12(36)：5834-45，2006，在此引为参考)。人类肝细胞也可以从单核细胞产生。Ruhnke等(Transplantation 79(9)：1097-103，2005，在此引为参考)描述了从终末分化的外周血单核细胞产生类肝细胞(NeoHep)的细胞。NeoHep细胞在形态学、肝细胞标志物的表达、各种分泌和代谢功能，以及药物解毒活性方面，与初级人类肝细胞类似。此外，源自于羊水细胞的人类肝细胞，也可以使用在本文描述的方法中。
人类ES细胞系已有，并可用于本文公开的方法中。人类ES细胞也可以源自于体外受精(IVF)胚胎的植入前胚胎。对未使用过的人类IVF产生的胚胎进行实验，如果胚胎小于14日龄，在许多国家是允许的，例如新加坡和英国。只有高质量的胚胎适合于ES分离。用于将单细胞人类胚胎培养成扩增的囊胚的目前确定的培养条件，已经被描述(参见Bongso等，Hum Reprod.4：706-713，1989)。人类胚胎与人类输卵管细胞的共培养，导致产生了高的囊胚质量。在细胞共培养或在改进的确定培养基中生长的源自于IVF的扩增的人类囊胚，允许分离人类ES细胞(参见美国专利No.6,200,806)。
在一个实施方案中，通过移植例如通过注射到脾脏中，将人类肝细胞投送到接受体小鼠。肝细胞可以通过其它手段投送，例如通过注射到肝实质或门静脉中。注射到接受体小鼠中的人类肝细胞的数量可以是不同的。在一个实施方案中，注射了大约105到大约107个人类肝细胞。在另一个实施方案中，注射了大约5x105到大约5x106个人类肝细胞。在一个示例性实施方案中，注射了大约106个人类肝细胞。
VI.在Fah缺陷小鼠中扩增的人类肝细胞的应用
可以使用本技术领域已知的许多技术中的任何一种，从接受体小鼠收集人类肝细胞。例如，可以将小鼠麻醉，使用导管插管于门静脉或下腔静脉。然后可以用适合的缓冲液(例如无钙和无镁的EBSS，添加有0.5mM EGTA和10mM HEPES)对肝脏进行灌注，然后进行胶原酶处理(例如使用EBSS添加有0.1mg/ml胶原酶XI和0.05mg/mlDNase I的溶液)。可以将肝脏轻柔地切碎，通过尼龙筛网(例如连续通过70μm和40μm的尼龙筛网)进行过滤，然后离心并清洗细胞。
可以使用本技术领域任何熟知的技术，将从接受体小鼠收集的人类肝细胞与非人类细胞或其它污染物(例如组织或细胞碎片)分离开。例如，这样的方法包括使用与人类肝细胞选择性结合的抗体。这样的抗体包括但不限于特异性结合I类主要组织相容性抗原的抗体，例如抗人类HLA-A、B、C抗体(Markus等，Cell Transplantation 6：455-462，1997)。特异性针对人类细胞或人类肝细胞的抗体，可以用于各种不同的技术中，包括FACS、淘选或磁珠分离。FACS使用了多种颜色通道、低角度和钝角光散射检测通道和阻抗通道，以及其它更复杂水平的检测，来分离或分拣抗体结合的细胞(参见美国专利No.5,061,620)。磁性分离涉及了使用顺磁性颗粒，它们：1)与人类特异性抗体结合；2)与能够结合人类特异性抗体的检测抗体结合；或3)与能够结合生物素化的抗体的亲和素结合。淘选涉及与固相基质、例如琼脂糖珠、聚苯乙烯珠、中空纤维膜或塑料培养皿结合的单克隆抗体。被抗体结合的细胞，可以通过简单地将固相支持物与样品物理分离，从样品中分离出来。
正如在下面的实施例中描述的，在从接受体小鼠收集的扩增的人类肝细胞中，检测了参与药物结合和解毒的、包括几种肝细胞转运蛋白的基因的表达。最近的研究显示了这些结合途径(Kostrubsky等，Drug.Metab.Dispos.28：1192-1197，2000)和肝细胞转运蛋白(Kostrubsky等，Toxicol.Sci.90：451-459，2006)在预测药物毒性中发挥的关键作用。与对外源药物例如利福平或PB、或BNF的CYP诱导的正常人类应答一样，在FRG小鼠中扩增的人类肝细胞对核激素受体转录因子、结合途径和主要转运蛋白的表达，也允许对这些基因产物在人类药物代谢和毒性中的作用，进行体内评估。测试分离的肝细胞中化合物毒性的方法，在本技术领域中是熟知的，描述在例如PCT公布No.WO 2007/022419中，在此引为参考。
本公开还考虑到了在接受体小鼠中扩增并从其中收集的人类肝细胞，作为人类肝细胞的来源，用于在需要这样的治疗的对象中进行肝脏重建。通过导入肝细胞在患者中重建肝组织，是对急性肝衰竭患者的潜在的治疗性选择，也可以在肝脏移植前作为暂时处理，或对患有孤立性代谢缺陷的患者用作确定性治疗(Bumgardner等，Transplantation 65：53-61，1998)。肝细胞重建可以用于例如为基因疗法导入遗传修饰的肝细胞，或用于替换由于疾病、物理或化学损伤或肿瘤而引起的肝细胞损失(美国专利No.6,995,299，在此引为参考)。例如，已经报道了在患有家族性高胆固醇血症的患者的基因疗法中，使用转染的肝细胞(Grossman等，Nat.Genet.6：335，1994)。此外，扩增的人类肝细胞可用于放置在人造肝辅助装置中。
在FRG小鼠中扩增的并从其中收集的人类肝细胞，也可用于各种不同的微生物学研究。许多病原性病毒，包括丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒，只能够在人类宿主或初级人类肝细胞中复制。因此，具有足够的初级人类肝细胞来源，对于这些病原体的研究来说是关键的。扩增的人类肝细胞可用于病毒感染或复制的研究，或用于研究以鉴定缓和肝病毒感染的化合物。使用初级人类肝细胞研究肝病毒的方法，描述在欧洲专利No.1552740、美国专利No.6,509,514和PCT公布No.WO00/17338，每个专利在此引为参考。
VII.使用Fah缺陷小鼠作为人类肝脏疾病的模型系统
免疫缺陷的、Fah缺陷的小鼠也可用作人类肝脏疾病的模型系统。这些用人类肝细胞移入的的小鼠，包括还包含Fah缺陷的Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠(例如FRG小鼠或FpmRG小鼠)，可用于产生各种不同病因造成的肝脏疾病的模型，这些病因包括但不限于暴露于毒素、传染病、遗传病或恶性肿瘤。用人类肝细胞移入和重建的Fah缺陷小鼠，可用于获得对这些疾病的更好的了解，以及用于鉴定可以阻止、阻碍或逆转疾病过程的药剂。例如，Fah缺陷的小鼠可用于测试基因疗法载体。基因治疗的目的载体可以施用于Fah缺陷小鼠，并可以评估载体对植入的人类肝细胞的影响。
同样地，含有人类肝细胞的Fah缺陷小鼠可用于筛选化合物，例如毒素或药剂，在体内情况下对人类肝细胞的影响。怀疑引起或有助于肝脏疾病的药剂，可以通过将有效量的药剂施用于Fah缺陷小鼠，并评估药剂对移入的人类细胞的功能的影响，来进行筛选。例如，Fah缺陷小鼠可用于鉴定能够抑制或防止由嗜肝性病原体引起的感染的药剂。为了鉴定例如药剂，可以将Fah缺陷小鼠暴露于病原体或用病原体接种，在之后或事先施用试验药剂。然后对小鼠的感染征兆进行评估，并任选与没有用药剂处理的和/或没有用病原体感染的对照小鼠进行比较。
当Fah缺陷小鼠被用作由毒素引起的肝脏疾病的模型时，被注射的人类肝细胞在暴露于毒剂之前，必须移入并允许扩增适当的时间长度。肝细胞扩增所需的时间量，可以根据经验确定，这在本技术领域的普通专业人员的能力范围内。产生最近似模拟相应的人类病症的结果所需的毒剂的量，可以通过使用多只暴露于渐增剂量的毒剂的Fah缺陷小鼠来确定。毒剂的例子包括但不限于乙醇、对乙酰氨基酚、苯妥英、甲基多巴、异烟肼、四氯化碳、黄磷和鬼笔环肽。
在Fah缺陷小鼠被用作恶性肿瘤肝脏疾病的模型的实施方案中，恶性肿瘤可以通过暴露于转化剂或通过导入恶性肿瘤细胞来产生。转化剂或恶性肿瘤细胞的导入，可以与人类肝细胞的最初定殖导入同时进行，或优选在人类肝细胞已经开始在宿主动物中增殖后进行。在转化剂的情况下，优选在人类肝细胞活跃增殖的时候施用转化剂。这样的转化剂可以全身性施用于动物，或局部施用到肝脏本身中。恶性肿瘤细胞可以直接接种到肝脏中。例如，对Fah缺陷小鼠使用人类肝细胞进行移植。在人类肝细胞植入后，对小鼠施用转化剂，或用恶性肿瘤细胞接种。可选地，转化剂或恶性肿瘤细胞可以与人类肝细胞结合施用。在恶性肿瘤在小鼠中发生后，这可以通过本技术领域已知的许多方法中的任何一种来确定，Fah缺陷小鼠可以用作人类肝癌的模型。
VIII.编码尿激酶的载体
在本文描述的方法的一些实施方案中，在人类肝细胞移植之前，向Fah缺陷小鼠施用编码尿激酶的载体。在一个实施方案中，尿激酶(也被称为尿激酶纤溶酶原激活物(uPA))是分泌形式的人类尿激酶。在另一个实施方案中，尿激酶是修饰的、非分泌形式的尿激酶(参见美国专利No.5,980,886，在此引为参考)。任何类型的适合于在小鼠中表达尿激酶的载体都可以考虑。这样的载体包括质粒载体或病毒载体。适合的载体包括但不限于DNA载体、腺病毒载体、反转录病毒载体、假型反转录病毒载体、AAV载体、长臂猿白血病病毒载体、VSV-G、VL30载体、脂质体介导的载体，等等。在一个实施方案中，病毒载体是腺病毒载体。腺病毒载体可以源自于任何适合的腺病毒，包括任何腺病毒血清型(例如但不限于Ad2和Ad5)。腺病毒载体可以是第一、第二、第三和/或第四代腺病毒载体或无肠腺病毒载体(gutlessadenoviral vector)。非病毒载体可以由不同结构的质粒、磷脂、脂质体(阳离子或阴离子)构成。在另一个实施方案中，病毒载体是AAV载体。AAV载体可以是本技术领域已知的任何适合的AAV载体。
编码尿激酶的病毒和非病毒载体在本技术领域中是众所周知的。例如，编码人类尿激酶的腺病毒载体描述在美国专利No.5,980,886以及Lieber等(Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92(13)：6210-4，1995)中。美国专利申请公布No.2005-176129和美国专利No.5,585,362描述了重组腺病毒载体，美国专利No.6,025,195公开了用于肝脏特异性表达的腺病毒载体。美国专利申请公布No.2003-0166284描述了用于目标基因、包括尿激酶的肝脏特异性表达的腺相关病毒(AAV)载体。美国专利Nos.6,521,225和5,589,377描述了重组AAV载体。PCT公布No.WO0244393描述了含有人类尿激酶纤溶酶原激活物基因的病毒和非病毒载体。能够高水平表达人类尿激酶基因的表达载体公开在PCT公布No.WO 03087393中。每个上述专利和出版物在此引为参考。
编码尿激酶的载体可以任选包含表达控制序列，包括适合的启动子、增强子、转录终止子、蛋白编码基因前的起始密码子(即ATG)、用于内含子以及维持该基因的正确阅读框以允许mRNA正确翻译的拼接信号，以及终止密码子。一般来说，表达控制序列包括启动子，足以指导转录的最小序列。
表达载体可以包含复制原点、启动子，以及允许对转化细胞进行表型筛选的特定基因(例如抗生素抗性盒式元件)。一般来说，表达载体将包含启动子。启动子可以是诱导型的或组成型的。启动子可以是组织特异性的。适合的启动子包括胸苷激酶启动子(TK)、金属硫蛋白I、多角体、神经元特异性烯醇化酶、酪氨酸羟化酶、β-肌动蛋白或其它启动子。在一个实施方案中，启动子是异源启动子。
在一个实施例中，编码尿激酶的序列位于所需启动子的下游。任选还包含增强子元件，它一般可以位于载体上任何位置而仍然具有增强效应。但是，活性增加的量，一般将随着距离而减小。
编码尿激酶的载体可以通过各种不同的途径施用，包括但不限于静脉内、腹膜内或经门静脉进行血管内灌注。施用的载体的量是变化的，可以使用常规的实验来确定。在一个实施方案中，以大约1x108到大约1x1010噬斑形成单位的剂量向FRG小鼠施用编码尿激酶的腺病毒载体。在一个优选实施方案中，剂量是大约5x109噬斑形成单位。
在一个示例性实施方案中，向FRG小鼠施用编码人类尿激酶的腺病毒载体。与其它类型的病毒载体相比，腺病毒载体具有几个优点，例如它们可以被生产成具有非常高的感染性颗粒滴度；它们感染大量种类的细胞；它们将基因有效地转移到没有正在分裂的细胞中；以及它们很少整合到客体基因组中，这避免了由于插入性诱变导致细胞转化的风险(Douglas和Curiel，Science and Medicine，1997年3月/4月，44-53页；Zern和Kresinam，Hepatology：25(2)，484-491，1997)。可用于编码尿激酶的代表性的腺病毒载体由Stratford-Perricaudet等(J.Clin.Invest.90：626-630，1992)，Graham和Prevec(在《分子生物学方法：基因转移和表达方法7》中(In Methods in Molecular Biology：GeneTransfer and Expression Protocols 7：109-128，1991))，以及Barr等(GeneTherapy，2：151-155，1995)进行了描述，这些文献在此引为参考。
提供了下面的实施例以说明某些具体特点和/或实施方案。这些实施例不应该被解释为将本发明局限于所描述的具体特点或实施方案。
实施例
正如在下面的实施例中所描述的，人类肝细胞的移入和扩增在FRG小鼠中高度有效。从宏观上来说，FRG肝脏在尺寸和形状上是正常的，组织学检查没有发现与具有免疫能力的Fah-/-小鼠有显著差异。此外，FRG小鼠在施用NTBC时生长良好，完全可育。
在一个实施方案中，在FRG小鼠中，肝脏疾病的程度和选择性压力可以通过施用和撤销NTBC进行控制(Grompe等，Nat.Genet.70：453-460，1995)。撤销NTBC为移植的人类肝细胞提供了选择优势。能够容易地控制肝脏疾病的程度，使动物的管理和外科手术更加容易。此外，Fah缺陷突变是缺失，不能通过转基因失活而回复到野生型。因此，在Fah敲除肝脏中不存在来自内源回复体小鼠细胞的竞争。这意味着FRG小鼠可以在任何年龄时用人类肝细胞移入，并且连续移植是可行的。此外重要的是，FRG小鼠不需要施用补体抑制剂就可以高度再增殖，而以前的研究显示，当使用人类细胞再增殖超过50％时，为了防止肾衰竭，需要使用补体抑制剂(Tateno等，Am.J.Pathol.165：901-912，2004)。这不仅在动物管理中具有实践重要性，而且也除去了潜在的药理学干扰源。
人类肝细胞在FRG小鼠中的再增殖效率可以超过大约70％(小鼠肝脏中70％或以上的肝细胞是人类的)。来自单只再增殖FRG小鼠的平均产量是大约30-45百万个人类肝细胞。然后可以在被称为连续移植的过程中，使用从单只FRG小鼠扩增的肝细胞来再增殖多达100只次级FRG接受体小鼠。
在本文描述的新系统中，可以实现连续移植。连续移植不仅允许使人类肝细胞扩增扩大，而且提供了通过几代接受体小鼠扩增具有相同基因型的人类细胞的手段。它也意味着用于进一步移植的高质量的人类肝细胞来源总是在掌握中。在本文中，证实了至少四轮肝细胞移植是可行的。此外，从连续移植分离的人类肝细胞的存活性可以超过大约80％，肝细胞容易帖附到胶原蛋白包被的平板上。根据估计的10％的移入效率(100,000个细胞)和再增殖后最终收获大约15百万个扩增的人类肝细胞，在每一轮中可以实现至少150倍的体内扩增。因此，人类肝细胞在FRG小鼠中的总扩增可以超过500百万倍。
使用来自各种不同来源和不同品类的分离的人类肝细胞，在FRG小鼠中进行人类肝细胞的移入和扩增是可能的。人类肝细胞的来源包括但不限于遗体捐献者、肝脏切除术和可商购来源。正如本文显示的，使用任何年龄的供体，人类肝细胞移入和扩增都是成功的。此外，在本文中证明，即使在肝细胞以前被超低温保藏的情况下，人类肝细胞也能在FRG小鼠中成功地扩增。与需要在肝细胞分离后立即移植的系统相比，这是明显的优势。
实施例1：Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠的产生
产生了几个品系的免疫缺陷Fah敲除小鼠。在裸鼠、nod/scid或RagI-/-背景上杂交Fah突变是不成功的。为了产生完全缺乏T细胞、B细胞和NK细胞、但是没有DNA修复缺陷的免疫缺陷的Fah-/-小鼠品系，产生了Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠。将雄性Fah-/-129S4小鼠(Grompe等，Genes Dev.7：2298-2307，1993)与雌性Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠(Taconic)进行杂交。所有动物都用含有浓度为1.6mg/L的2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)的饮用水维持(Grompe等，Nat.Genet.70：453-460，1995)。为了证实每只动物的基因型，在从脚趾组织分离的200ng基因组DNA上进行了基于PCR的基因分型(Grompe等，Genes Dev.7：2298-2307，1993；Traggiai等，Science 304：104-107，2004)。
FRG小鼠，如果在它们的饮用水中持续提供NTBC，能够生长良好并完全可育。从宏观上来说，FRG小鼠的肝脏在尺寸和形状上是正常的，组织学检查显示出常规的Fah-/-小鼠与FRG小鼠之间没有差异。与常规Fah-/-小鼠相同，NTBC撤销在FRG小鼠中导致了逐渐的肝细胞损伤，并最终在4-8周后死亡(Overturf等，Nat.Genet.12：266-273，1996)。
实施例2：组织学和移入检测分析
组织学和免疫细胞化学
FAH免疫组织化学按照以前的描述进行(Wang等，Am.J.Pathol.161：565-574，2002)。简单来说，将固定在pH 7.4的10％磷酸盐缓冲的福尔马林中的肝脏和肾脏组织，在100％乙醇中脱水，并在58℃下包埋在石蜡中。将去石蜡的4μm切片用苏木精和曙红染色。对于免疫组织化学来说，将切片用3％H2O2的甲醇溶液进行处理，用于阻断内源性过氧化物酶。在与第一抗体温育之前，也进行了亲和素和生物素阻断。将切片与抗FAH兔抗体或HepPar抗体(DAKO)在室温温育2小时。然后与HRP结合的第二抗体温育。信号通过二氨基联苯胺(DAB)检测。
FAH酶分析
将延胡索酰乙酰乙酸与来自接受体肝脏的胞质酶肝脏级份温育，消失速度在330nm处通过分光光度法测量。野生型和Fah-/-肝脏被分别用作阳性和阴性对照。延胡索酰乙酰乙酸从尿黑酸通过酶法制备(Knox等，Methods Enzymol.2：287-300，1955)。
Alu序列的基因组PCR
基因组DNA使用DNeasy组织试剂盒(Qiagen)从肝脏分离。人类Alu序列按照标准程序，使用下列引物通过PCR扩增：5′-GGCGCGGTGGCTCACG-3′(SEQ ID NO：1)和5′-TTTTTTGAGACGGAGTCTCGCTC-3′(SEQ ID NO：2)。
肝细胞特异性基因表达的RT-PCR
总RNA使用RNeasy微量试剂盒(Qiagen)从肝脏分离。互补DNA通过反转录酶，使用oligo-dT引物合成。表1中显示的引物用于人类或小鼠特异性cDNA扩增。
表1
用于扩增肝细胞特异性基因的RT-PCR引物
  引物序列   引物描述  SEQ ID NO：
  ATGGATGATTTCGCAGCTTT   人类ALB正向   3
  引物序列   引物描述  SEQ ID NO：
  TGGCTTTACACCAACGAAAA   人类ALB反向   4
  TACAGCGGAGCAACTGAAGA   小鼠Alb正向   5
  TTGCAGCACAGAGACAAGAA   小鼠Alb反向   6
  CCGGGAGAGTTTTACCACAA   人类TAT正向   7
  CCTTCCCTAGATGGGACACA   人类TAT反向   8
  CTGACCTCACCTGGGACAAT   人类TF正向   9
  CCTCCACAGGTTTCCTGGTA   人类TF反向   10
  TTTGGGACCACTGTCTCTCC   人类FAH正向   11
  CTGACCATTCCCCAGGTCTA   人类FAH反向   12
  ATGGCTTCTCATCGTCTGCT   人类TTR正向   13
  GCTCCTCATTCCTTGGGATT   人类TTR反向   14
  GTGCCTTTATCACCCATGCT   人类UTG1A1正向   15
  TCTTGGATTTGTGGGCTTTC   人类UTG1A1反向   16
人类白蛋白测量
每星期一次，从左隐静脉使用肝素处理过的取血毛细管收集少量血液。在用Tris缓冲的盐水稀释1,000或10,000x后，使用人类白蛋白ELISA定量试剂盒(Bethyl)，按照制造商的规程测量人类白蛋白浓度。
荧光免疫细胞化学
将来自人源化小鼠肝脏的肝细胞悬浮在Dulbecco修改的Eagle培养基(DMEM)中，在1型胶原蛋白包被的6孔板上铺板。将贴附的细胞用4％聚甲醛固定15分钟，用5％脱脂乳阻断。兔抗FAH抗体、山羊抗人类白蛋白抗体(Bethyl)、山羊抗小鼠白蛋白抗体(Bethyl)1/200稀释后用作第一抗体。ALEXATM Fluoro 488抗山羊IgG抗体(Invitrogen)或ALEXATM Fluoro 555抗兔IgG抗体(Invitrogen)被用作第二抗体。照片用AXIOVERTTM 200显微镜，使用Nikon数字相机捕获。
FACS分析
在将接受体的肝脏离散后，将实质细胞在4℃下与荧光素异硫氰酸酯(FITC)结合的抗人类白细胞抗原(HLA)-A、B、C抗体(BDPharmingen)和藻红蛋白(PE)结合的抗小鼠H2-K(b)抗体(BDPharmingen)温育30分钟。然后将它们用PBS清洗两次，使用FACSCALIBURTM(Becton Dickinson)流式细胞仪进行分析。FITC结合的和PE结合的IgG被用作阴性对照。
荧光原位杂交
总基因组DNA探针通过总小鼠和人类基因组DNA的缺口翻译产生。Cy3-dUTP的掺入按照制造商的推荐(Invitrogen)进行。最终的探针浓度是200ng/μl。将带有附着的细胞的载片用100mg/ml的RNase在37℃处理1小时，并用2X SSC冲洗3次，每次3分钟。在洗涤步骤后，将载片在70％、90％和100％乙醇中脱水，每种溶液中3分钟。将染色体在70％甲酰胺/2X SSC中，在75℃变性3分钟，然后在冰冷的70％、90％和100％乙醇中脱水，每种溶液中3分钟。将探针混合物在75℃变性10分钟，在37℃预杂交30分钟。将探针涂敷到载片上，在37℃下、在加湿箱中温育过夜。杂交后的洗涤由三次在50％甲酰胺/2X SSC中的3分钟冲洗，以及三次在PN缓冲液(0.1M Na2HPO4，0.1M NaH2PO4，pH 8.0，2.5％NONIDETTM P-40)中的3分钟冲洗组成，都在45℃下进行。然后将载片用Hoechst(0.2μg/ml)复染，盖上盖玻片，在UV荧光(Zeiss)下观察。
实施例3：人类肝细胞的分离和超低温保藏
按照以前描述的程序，从不用于肝脏移植的供体肝脏分离了人类肝细胞(Strom等，Cell Transplant.15：S 105-110，2006)。简单来说，将肝组织用添加有0.5mM EGTA(Sigma)和HEPES(Cellgro)的不含钙和镁的Hanks平衡盐溶液(Cambrex)灌注，然后用含有100mg/L胶原酶XI(Sigma)和50mg/L脱氧核糖核酸酶I(Sigma)的Eagle′s最低基本培养基(Cambrex)通过现有的血管系统进行消化。将细胞用添加有7％牛血清(Hyclone)的Eagle′s最低基本培养基以50xg洗涤3次，每次2分钟。将沉淀的肝细胞转移到冷的VIASPANTM中(用于保存腹内器官的通用主动脉冲洗液和冷藏溶液；也被称为威斯康辛大学溶液(University of Wisconsin solution)或UW)。
将运输的肝细胞以每毫升5x106个肝细胞转移到添加有10％胎牛血清和10％二甲亚砜的VIASPANTM中。将超低温管用纸巾厚厚包裹，在-80℃储存1天，最后转移到液氮中。对于融化来说，将细胞在37℃水浴中快速预热，并逐渐加入DMEM，以最小化DMSO浓度变化的速度。
实施例4：FRG小鼠肝脏用人类肝细胞的再增殖
尿激酶的过表达已被显示在几种系统中增加了肝细胞的移入(Lieber等，Hum.Gene Ther.6：1029-1037，1995)。因此，进行了实验以确定在人类肝细胞移植之前施用表达尿激酶的腺病毒是否是有益的。表达分泌形式的人类尿激酶(尿激酶纤溶酶原激活物；uPA)的腺病毒载体，以前已经描述过(Lieber等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.92：6210-6214，1995和美国专利No.5,980,886，在此引为参考)。
分离供体肝细胞，并在分离后24-36小时进行移植。在大多数情况下，细胞在运输过程中保存在VIASPANTM溶液中，保持在4℃下。但是，在两个实验中，移植了超低温保藏的肝细胞。供体肝细胞的存活性和质量是高度可变的，铺板效率在10％到60％的范围内。
对于移植来说，使用了下面的通用步骤。在移植前24-48小时，对成年(6到15周龄的)雄性和雌性FRG小鼠静脉内(眼球后)注射uPA腺病毒(每只小鼠5x109噬斑形成单位(PFU))。通过27号针，脾内注射含有1百万个活的人类肝细胞(通过锥虫蓝排斥确定)的100μl Dulbecco′s修改的基本培养基。在接下来的6天内逐渐撤销NTBC(第0-2天1.6mg/L；第3-4天0.8mg/L；第5-6天0.4mg/L)，并在移植一周后完全撤销。停止NTBC两周后，对动物重新使用药物5天，然后再次撤销。
在三个独立的移植中，在首先接受uPA腺病毒的接受体中观察到了人类肝细胞在FRG小鼠中的大量移入。因此，在大多数随后的移植实验中，使用了uPA预处理的方案。
总的来说，在导入uPA腺病毒方案后，来自9个不同供体的人类肝细胞被成功地使用，没有发生移入失败的情况。其中，7个分离自脑死亡器官供体的肝脏，两个分离自外科肝脏切除术。供体年龄的范围在1.2到64岁之间(表2)。
表2
每个肝细胞供体的移入结果的概述
供体 来源 年龄(岁)   移植的小鼠的数量   人类白蛋白阳性(％)
  A   遗体   1.8   6   N/A
  B   切除术   55   9   3(33)
  C   切除术   50   5   1(20)
  D   遗体   1.2   2   1(50)
  E   遗体(超低温保藏)   55   5   2(40)
  F   商购(超低温保藏)   N/A   8   1(13)
  G   遗体   64   6   2(33)
  H   遗体   59   5   3(60)
  I   遗体   1.3   6   4(60)
在所有实验中，使用该方案，至少一个接受体变得明显被人类肝细胞移入(＞1％人类细胞)，无论使用哪个细胞批次。移入通过不同的方法得到了证明，包括组织学、DNA分析、酶分析以及在后面实验中的人类血清白蛋白。在由白蛋白水平监测的移植中，43个初级接受体中的17个(39.5％；范围为12到67％)变得再增殖(表2和图3)。其中，7个高度再增殖(30-90％)，并获得了＞1mg/ml的白蛋白水平。不仅来自遗体肝脏的肝细胞，而且来自肝脏切除术的肝细胞，也移入了。此外，超低温保藏的细胞也成功地移入。
在高度移入的小鼠(＞30％再增殖)中，被移植的FRG小鼠的重量在第二次NTBC撤销期间稳定，但是对Il2rg杂合的较少免疫缺陷的同胎仔畜(Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-)植入同样细胞后持续地损失体重(图1a)。在三重突变小鼠中这种体重的稳定，表明植入的人类肝细胞代替了患病的Fah-/-接受体肝细胞的功能。在体重完全稳定后(在最初移植后2-3个月)，收获接受体肝脏。从宏观来说，FRG肝脏在形状和重量上正常，没有肉眼可见的结节。对人类特异性Alu DNA序列进行的基因组PCR，在FRG接受体肝脏中是阳性的，而Il2rg杂合子都是阴性的(图1b)。为了直接证实再增殖细胞的肝细胞功能，分析了FAH酶活性(Knox等，Methods Enzymol.2：287-300，1955)。
接受体小鼠肝脏具有相当量的FAH酶活性，等于或超过正常小鼠肝脏(图1c-e)。因为FAH专门表达在完全分化的肝细胞中，这表明植入的人类肝细胞，当移入到小鼠肝脏时，不是去分化的或异常的。FAH的免疫染色证实，超过70％的肝脏实质被FAH阳性人类肝细胞再增殖(图1f和图1g)。
使用另外的接受体肝脏进行了组织学和免疫组织化学检查(图2a和图2b)。FAH阳性人类肝细胞显示出完全整合到接受体肝脏的结构中。在几个接受体中，移入的肝细胞占据了超过80％的实质，而不扰乱接受体肝脏的组织(图2b、2e和2f)。无性系扩增的人类肝细胞，可以在形态学上，通过尺寸、以及它们的苍白的细胞质，与小鼠肝细胞清楚地区分(图2c和图2d)。人类肝细胞的尺寸相对较大，它们的细胞质看起来明亮，可能是因为如以前报道的糖原积累(Meuleman等，Hepatology 41：847-856，2005)。FAH阳性的肝细胞对于HepPar抗体也是阳性的，该抗体特异性标记人类肝细胞，但是不标记小鼠对应物(图2e和图2f)。相反，FAH阴性区域显示出坏死性炎症，并包含发育异常的肝细胞，与在撤销NTBC后在常规Fah-/-小鼠中的发现一致。
为了检查再增殖的人类肝细胞是否表达成熟的肝细胞特异性基因，在从接受体肝脏提取的信使RNA上进行了RT-PCR。人类白蛋白(ALB)、FAH、转铁蛋白(TF)、运甲状腺素蛋白(TTR)、酪氨酸氨基转移酶(TAT)和UGT1A1基因在接受体肝脏中丰富表达(图3a、图6c和图7)。通过测量血液人类白蛋白浓度，也评估了肝细胞的功能性。使用了对人类白蛋白特异性的ELISA试剂盒，检测阈值是0.05μg/ml，使用1∶100稀释的样品。人类白蛋白首次在移植到初级接受体中后4到10周时检测到。尽管最初在水平上存在某些波动，但然后浓度相对稳定地持续增加几周(图3b和图3c)。
为了保持高度再增殖的小鼠长期存活，可能需要药理学蛋白酶抑制剂；由供体肝细胞产生的人类补体可能损伤接受体肾脏(参见Tateno等，Am.J.Pathol.165：901-912，2004)。因此，对几只(n＝3)高度再增殖的小鼠进行了长期的观察。这些小鼠在撤销NTBC 4个月时没有损失体重，它们的人类白蛋白浓度保持稳定。此外，它们的肾脏在收获时在宏观和组织学上是正常的(图2g)。
实施例5：人类肝细胞的连续移植
以前描述的肝脏异体再增殖模型的一个限制是不能进一步扩增移入的人类肝细胞。为了测试在FRG小鼠系统中连续移植的可行性，对高度再增殖的初级接受体的肝脏(大约70％人类细胞)进行灌注，使用标准的胶原酶消化步骤收集实质肝细胞。
将用人类细胞再增殖的小鼠麻醉，用24号导管对门静脉或下腔静脉进行插管。使用添加有0.5mM EGTA和10mM HEPES的不含钙和镁的EBSS，对肝脏灌注5分钟。将溶液替换为添加有0.1mg/ml胶原酶XI(sigma)和0.05mg/ml DNase I(sigma)的EBSS，灌注10分钟。将肝脏在第二种溶液中轻轻切碎，连续地通过70μm和40μm的尼龙筛网进行过滤。在150xg离心5分钟后，将沉淀进一步以50xg清洗两次，每次2分钟。通过锥虫蓝排斥实验评估细胞的数量和存活性。
将悬浮在100μl DMEM中的1百万个活细胞，通过27号针注射到接受体脾脏中。将肝细胞移植到次级FRG接受体中，而不分离Fah阳性人类和Fah阴性小鼠肝细胞。与用于初级移入的细胞相反，通过该方式收获的人类肝细胞的存活性＞80％，它们可以容易地粘附在胶原蛋白包被的培养板上(图4c-e)。在移入次级接受体后，连续移植以同样的方式继续进行，植入到第三级和第四级接受体中。在每一代中，某些但不是所有接受体小鼠的血液人类白蛋白，变得高度阳性(图4a)。在连续移植接受体中高度再增殖小鼠的百分率较高(17/28，与7/43相比)，白蛋白增加的速度也更一致(图3e)。这可能表明肝细胞的连续传代富集了最可移植的人类肝细胞，或者它可能仅仅简单地反映了从供体小鼠新鲜收获的细胞的较高的质量和存活性。来自白蛋白阳性小鼠的肝脏样品的基因组PCR，显示出在每一代中存在人类DNA(图4b)。由人类肝细胞进行的肝脏再增殖也由针对FAH的荧光免疫染色所证实(图4c-e)。组织学检测显示出移入的人类肝细胞在每一代中形态学相似，是明显的FAH阳性(图4f-h)。
实施例6：肝细胞再增殖不是细胞融合的结果
最近在尿激酶转基因小鼠中用灵长类细胞进行的肝脏再增殖的报道，证明了细胞融合可能潜在地造成了表观上的“肝细胞再增殖”(Okamura等，Histochem.Cell Biol.125：247-257，2006)。因为在该研究中使用了uPA转基因小鼠，这些发现提出了在其它小鼠肝脏人源化的报道中，也是细胞融合也可能是其机理。造血细胞与肝细胞之间的细胞融合，也已经在Fah缺陷小鼠中观察到(Wang等，Nature422：897-901，2003)。小鼠和人类细胞之间的细胞融合将极大地降低人源化小鼠肝脏对药物应用的价值。为了证实再增殖的肝细胞在起源上是真正人类的，进行了针对人类或小鼠特异性白蛋白和FAH的双重免疫染色。大多数(＞95％)的小鼠白蛋白阳性肝细胞事实上对FAH是阴性的，大多数FAH阳性肝细胞对小鼠白蛋白是阴性的(图5a-c)。另一方面，几乎所有(＞90％)的人类白蛋白阳性的肝细胞也是FAH阳性的，而剩余的肝细胞是双重阴性的(图5d-f)。
白蛋白是分泌的蛋白，因此通过从其它细胞摄取异源白蛋白，细胞可以显示出抗体阳性。为了进一步证实没有细胞融合，将人类和小鼠抗主要组织相容性复合物(MHC)抗体用于流式细胞术。每种抗体被证实是种属特异性的(图5g-j)。在高度再增殖的肝脏中，没有发现对这两个物种的表面标志物阳性的肝细胞(图5k和图51)。
最后，使用人类和小鼠全基因组探针在来自高度再增殖的移植接受体上进行了荧光原位杂交(FISH)。来自高度再增殖的初级(嵌合小鼠#531)和第四级(嵌合小鼠#631)小鼠的肝细胞，与人类或小鼠总基因组DNA进行杂交。记录了对人类探针或鼠类探针阳性的细胞的百分率(表3)。对照是纯的人类和小鼠肝细胞，或人类和小鼠肝细胞的等量混合物。如果在嵌合肝脏中发现的人类细胞是细胞融合的产物，许多肝细胞将对人类和小鼠探针是双重阳性的，因此对小鼠和人类DNA阳性的细胞的百分率将超过100％。反之，则百分率的总和很近似于100％，与在人类和鼠类肝细胞的混合物中进行时一样。此外，在高度再增殖小鼠的脾脏中检测到了人类肝细胞(图2h)，尽管事实上脾脏不含能够用作人类细胞的融合配偶体的鼠类肝细胞。因此，双重阳性细胞(融合产物)不占人类细胞的主要部分。
表3
在再增殖肝细胞中检测人类和小鼠DNA
  小鼠探针阳性(％)   人类探针阳性(％)   百分率总和
  鼠类肝细胞   87/87(100)   0/103(0)   100
  人类肝细胞   0/99(0)   107/107(100)   100
  混合物   38/101(38)   68/115(59)   97
  嵌合小鼠#531   15/100(15)   95/111(86)   101
  嵌合小鼠#631   23/87(26)   69/94(73)   99
合在一起，这些结果表明融合事件如果发生的话，是罕见的，即使在进行连续移植时，绝大多数的再增殖细胞也是纯粹人类来源的。因此，在FRG小鼠中扩增的人类肝细胞只具有人类遗传和生物化学性质。
实施例7：人源化小鼠中药物代谢的功能定性
检测了嵌合小鼠中人类肝脏特异性基因的基本表达和诱导。按照Kostrubsky等(DrugMetab.Dispos.27：887-894，1999)和Wen等(DrugMetab.Dispos.30：977-984，2002)的描述，分别进行了培养的肝细胞的睾酮代谢和乙氧基9-羟基-3-异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD)活性的评估。RNA分离、cDNA合成和实时PCR按照Komoroski等(Drug Metab.Dispos.32：512-518，2004)的描述进行。引物从Applied Biosystems获得，特异性针对人类CYP1A1(Hs00153120_ml)、CYP1A2(Hs00167927_ml)、CYP3A4(Hs00430021_ml)、CYP3A7(Hs00426361_al)、CYP2B6(Hs00167937_gl)、CYP2D6(Hs00164385_al)、多药抗性相关蛋白MRP2(Hs00166123_ml)、胆盐输出泵BSEP(Hs00184829_ml)、CAR(Hs00231959_ml)、白蛋白(Hs00609411_ml)、HNF4α(Hs00230853_ml)、亲环蛋白(Hs99999904_ml)和小鼠肌动蛋白(Ma00607939_sl)。
建立了分离的肝细胞培养物，并暴露于细胞色素P450基因的原型诱导物。结果证明，细胞色素(CYP1A1、CYP1A2、CYP2B6、CYP3A4、CYP3A7)、转运蛋白(BSEP、MRPT)和药物结合酶(UGT1A1)的基本基因表达水平，与在培养的正常成年人类肝细胞中发现的完全一样(图6c，图7)。此外，由化合物例如β-萘黄酮(BNF)、苯巴比妥(PB)和利福平(Rif)诱导的基因样式，与从正常人类细胞所预计的相同。除了人类药物代谢基因的mRNA表达水平之外，还测量了人类CYP1A和3A家族成员的酶活性。已知在人类肝脏中，乙氧基9-羟基-3-异吩唑酮-O-脱乙基酶(EROD)活性由CYP1A1和1A2介导。结果显示，在人源化小鼠肝脏细胞中，EROD活性通过先前暴露于BNF而特异性、强有力地诱导(图6a)。相反，先前暴露于PB或利福平，特异性诱导了睾酮转化成6-β-羟基睾酮，这是CYP3A4介导的代谢的特异性度量(图6b)。因此，在这些标准药物代谢分析中，来自再增殖FRG肝脏的肝细胞与正常的人类成年肝细胞不能区分开。
实施例8：在肝细胞再增殖之前消除巨噬细胞
初级移入没有在100％的FRG接受体小鼠中发生，即使预先施用尿激酶腺病毒。有可能在FRG小鼠中存在的正常数量肝脏巨噬细胞，通过促进先天免疫应答，限制了人类细胞移入。
为了消除可能的巨噬细胞引发的免疫应答，在人类肝细胞移植之前对FRG小鼠进行了巨噬细胞消除。巨噬细胞消除可以使用多种本技术领域熟知的方法中的任何一种来实现，包括化学消除(Schiedner等，Mol.Ther.7：35-43，2003)或通过使用抗体(McKenzie等，Blood 106：1259-1261，2005)。巨噬细胞也可以使用含有氯膦酯的脂质体(van Rijn等，Blood 102：2522-2531，2003)进行删除。其它用于消除巨噬细胞的化合物和组合物，描述在美国专利公布No.2004-0141967和PCT公布No.WO 02/087424中，它们在此引为参考。在消除巨噬细胞后，使用人类肝细胞，按照在本文前面的实施例中描述的方法，对FRG小鼠进行移植或连续移植。
实施例9：在FpmRG小鼠中人类肝细胞的移入
FRG小鼠在Fah基因的外显子5中含有缺失(FahΔ外显子5)。为了证实人类肝细胞可以被移入其它Fah缺陷的模型中，并在其中扩增，产生了在Fah中含有点突变的小鼠品系。这些小鼠被称为Fah点突变(Fahpm)小鼠，在Fah基因中具有点突变，导致了在Fah mRNA中的错误拼接并失去外显子7(Aponte等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA98：641-645，2001，在此引为参考)。在Fahpm小鼠和FahΔ外显子5小鼠之间没有检测到表型的差异。
将Fahpm小鼠与Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠杂交(如在实施例1中所述)，产生了纯合的Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-(FpmRG)三重突变小鼠。按照在实施例4中描述的方法，用人类肝细胞移植两组Fahpm小鼠。在肝细胞移植前大约24-48小时，小鼠接受uPA腺病毒的静脉内注射(眼球后)。为了比较，平行地用人类肝细胞移植FRG小鼠。在移植后2和3个月，在Fahpm小鼠的外周血中检测到了显著高水平的(23μg/ml)人类血清白蛋白。这些人类血清白蛋白的血液水平，与在同时移植的FRG小鼠中发现的水平相似。
这些结果表明，Fahpm小鼠可以用人类肝细胞再增殖到与FRG小鼠同样的程度。因此，人源化的肝脏再增殖不是具有FaΔ外显子5突变的FRG小鼠独有的，而是可以用任何品系的Fah缺陷小鼠实现。
本公开提供了用于人类肝细胞体内扩增的方法。本公开还提供了可用于体内扩增人类肝细胞的遗传修饰的免疫缺陷小鼠。显然，所描述的方法的准确细节可以被改变或修饰，而不背离所述发明的精神。我们对落于所附权利要求书的范围和精神内的所有这种修饰和改变的要求权利。
序列表
     斯坦福大学
 
<120>体内扩增人类肝细胞的方法
 
<130>SCT094655-70
 
<150>US 60/933,432
<151>2007-06-05
 
<160>16
 
<170>PatentIn version 3.3
 
<210>1
<211>16
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>1
ggcgcggtgg ctcacg                                                16
 
<210>2
<211>23
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>2
ttttttgaga cggagtctcg ctc                                        23
 
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>3
atggatgatt tcgcagcttt                                       20
 
<210>4
<211>20
<212>DNA
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<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>4
tggctttaca ccaacgaaaa                                       20
 
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>5
tacagcggag caactgaaga                                       20
 
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>6
ttgcagcaca gagacaagaa                                       20
<210>7
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>7
ccgggagagt tttaccacaa                                            20
 
<210>8
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
<223>Synthetic oligonucleotide
 
<400>8
ccttccctag atgggacaca                                            20
 
<210>9
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial sequence
 
<220>
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Claims (42)

1.用于体内扩增人类肝细胞的方法，包括
1)将分离的人类肝细胞移植到Rag2-/-/Il2rg-/-小鼠中，其中小鼠的Fah表达缺陷；
2)使人类肝细胞扩增至少大约2周；以及
3)从小鼠收集人类肝细胞。
2.权利要求1的方法，其中小鼠对Fah基因中的缺失是纯合的。
3.权利要求2的方法，其中小鼠是Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-(FRG)小鼠。
4.权利要求1的方法，其中小鼠对Fah基因中的点突变是纯合的。
5.权利要求4的方法，其中小鼠是Fahpm/Rag2-/-/Il2rg-/-(FpmRG)小鼠。
6.权利要求1-5任一项的方法，其中在注射人类肝细胞之前，将编码人类尿激酶的载体施用于小鼠。
7.权利要求6的方法，其中尿激酶是分泌形式的尿激酶。
8.权利要求6的方法，其中尿激酶是非分泌形式的尿激酶。
9.权利要求6-8任一项的方法，其中载体是腺病毒载体。
10.权利要求6-8任一项的方法，其中载体是腺相关病毒载体。
11.权利要求6-10任一项的方法，其中载体经静脉内施用。
12.权利要求6-11任一项的方法，其中载体在肝细胞注射前大约24到48小时施用。
13.权利要求1-12任一项的方法，其中在肝细胞注射之前，对小鼠施用2-(2-硝基-4-三氟甲基-苯甲酰基)-1，3环己二酮(NTBC)。
14.权利要求13的方法，其中NTBC以大约0.05mg/kg/天到大约0.10mg/kg/天的剂量施用。
15.权利要求13或权利要求14的方法，其中小鼠在肝细胞注射后，还施用NTBC至少大约3天。
16.权利要求13或权利要求14的方法，其中小鼠在肝细胞注射后，还施用NTBC至少大约6天。
17.权利要求16的方法，其中在肝细胞注射后，NTBC的剂量在6天的时间期间中逐渐减少。
18.权利要求13-17任一项的方法，其中NTBC在饮用水中进行施用。
19.权利要求18的方法，其中在肝细胞注射前在饮用水中进行施用的NTBC的浓度是大约1到大约8mg/L。
20.权利要求13-17任一项的方法，其中NTBC在食物中进行施用。
21.权利要求13-17任一项的方法，其中NTBC通过注射施用。
22.权利要求1-21任一项的方法，其中使人类肝细胞扩增至少大约6周。
23.权利要求1-21任一项的方法，其中使人类肝细胞扩增多达大约6个月。
24.权利要求1-23任一项的方法，其中分离的人类肝细胞被注射到小鼠的脾脏或门静脉中。
25.权利要求1-24任一项的方法，其中扩增的人类肝细胞从小鼠的肝脏收集。
26.权利要求1-25任一项的方法，其中人类肝细胞从器官供体的肝脏分离，从外科切除术分离，或源自于干细胞、单核细胞或羊水细胞。
27.权利要求26的方法，其中肝细胞在注射前超低温保藏。
28.权利要求1-27任一项的方法，还包括在肝细胞注射前从FRG小鼠消除巨噬细胞。
29.权利要求28的方法，其中消除巨噬细胞包括化学消除。
30.权利要求28的方法，其中消除巨噬细胞包括使用特异性结合巨噬细胞的抗体。
31.权利要求1-30任一项的方法，还包括通过连续移植扩增所收集的人类肝细胞。
32.遗传修饰的小鼠，其基因组对于Fah、Rag2和Il2rg基因中的缺失或一个或多个点突变是纯合的，使得所述缺失或点突变导致功能性FAH、RAG-2和IL-2Rγ蛋白的表达的丧失，其中小鼠是免疫缺陷的，并表现出降低的肝功能，并且其中人类肝细胞可以在小鼠中扩增。
33.权利要求32的小鼠，其中所述缺失或点突变导致B细胞、T细胞和NK细胞的完全丧失。
34.权利要求32或权利要求33的小鼠，其中小鼠是FRG小鼠。
35.权利要求32或权利要求33的小鼠，其中小鼠是FpmRG小鼠。
36.权利要求32-35任一项的小鼠，其中小鼠表达人类尿激酶。
37.权利要求36的小鼠，其中尿激酶是分泌形式的尿激酶。
38.权利要求36的小鼠，其中尿激酶是非分泌形式的尿激酶。
39.权利要求36-38任一项的小鼠，其中人类尿激酶的表达是掺入编码人类尿激酶的转基因所致。
40.权利要求36-38任一项的小鼠，其中人类尿激酶的表达是施用编码人类尿激酶的载体所致。
41.权利要求40的小鼠，其中载体是腺病毒载体。
42.权利要求40的小鼠，其中载体是腺相关病毒载体。
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