CN114340646A - 诱导体内器官发育的微创细胞移植方法 - Google Patents

Abstract

本文提供了在对象的淋巴结中移植细胞和生长异位组织的方法和系统。在某些实施方式中，本文提供的方法和系统使得微创细胞移植能够治疗有需要的患者。在某些实施方式中，本文提供的方法和系统包括使用超声内窥镜检查。

Description

诱导体内器官发育的微创细胞移植方法

优先权要求

本申请要求于2019年4月11日提交的美国临时申请序列62/832,492的优先权，其内容通过引用整体并入本文。

介绍

本发明涉及用于将细胞移植到对象的淋巴结中以产生功能性异位组织和器官的微创方法。

背景技术

对器官移植和/或再生的需求很大。然而，可用于移植到绝症患者的器官短缺代表了全球性的医学、社会和经济挑战。此外，全器官移植对接受者自身的健康状况有严格的要求。例如，目前美国每年约有30,000名终末期肝病(ESLD)患者不符合标准肝移植的条件。

全器官移植的另一种方法可能涉及细胞移植以再生衰竭的器官。例如，肝细胞移植(HT)可以延长和提高ESLD患者的生活质量，这些患者被认为不适合标准肝移植并且没有其它治疗选择。然而，由于多种原因，针对患病器官的原位细胞疗法可能不可行，从终末期肝硬化和纤维化肝脏中可能缺乏适当的环境到完全迪乔治综合征(DiGeorge syndrome)中缺乏胸腺。

对于患有ESLD的患者，可能存在重大挑战：大多数细胞疗法旨在促进细胞植入原生患病肝脏。移植的肝细胞通常通过门静脉注射到脾脏(患者的脾动脉或啮齿动物的脾实质)或肝内。移植到脾动脉中的肝细胞在初次注射脾脏后可以迅速主动或被动地迁移到患病肝脏，预计移植肝细胞将在那里发生肝脏再生。然而，由于移植的解剖部位，这种方法有很大的局限性。这些ESLD患者中的大多数(Takahashi等，2014)都有脾肿大和脾功能亢进，对于通过脾动脉循环进入脾实质的所有细胞(例如，红细胞、白细胞和血小板)，脾脏中可发生侵袭性细胞捕获，随后发生吞噬作用和细胞破坏。此外，作为门静脉供应到肝实质的主要成分，移植的肝细胞可以通过脾静脉进一步引导至肝脏。这些细胞可以从门静脉三联征循环到肝血窦，在那里肝细胞对小门静脉分支和肝血窦的部分阻塞导致暂时性门脉高压、初始缺血和许多移植细胞的死亡(da Fonseca等人，2008)。移植的肝细胞克服肝窦内皮细胞屏障和植入到肝实质内的能力非常有限。此外，ESLD患者可能有显著程度的肝纤维化和肝硬化，这可能是已经受到进行性细胞结构紊乱的限制的肝小叶内随后细胞生长的主要限制因素。

因此，仍然需要能够产生具有合理解剖特征的功能性器官的新型基于细胞的器官再生方法。还需要针对ESLD、代谢性肝病和急性肝衰竭的新疗法。

发明概述

一方面，本发明提供了一种在对象中移植一种或多种细胞并生长异位组织的微创方法。在某些实施方式中，该方法包括通过腔内途径(endoluminal approach)推进内窥镜，例如进入对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道，利用经腔途径(transluminal approach)将附接到内窥镜的针穿过内脏壁插入淋巴结，并通过针将一种或多种细胞递送到淋巴结中，从而使一种或多种细胞植入并在淋巴结中产生异位组织。

在某些实施方式中，在放射成像或超声成像的帮助下执行推进内窥镜、插入针或执行两者。在某些实施方式中，放射成像包括动态放射成像、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或两者。在某些实施方式中，淋巴结在对象的腹腔或胸腔中。在某些实施方式中，淋巴结位于对象的纵隔或腹膜后区域。

在某些实施方式中，在本发明的对象中移植一种或多种细胞并生长异位组织的微创方法包括：在超声或放射成像的帮助下将针插入对象腹腔或胸腔的淋巴结中，并通过针将一种或多种细胞递送到淋巴结中，从而使一种或多种细胞在淋巴结中植入、扩增并分化为异位组织。在某些实施方式中，该方法还包括：推进内窥镜穿过对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道，并利用经腔途径将附接到内窥镜的针穿过内脏壁插入对象的淋巴结。在某些实施方式中，推进内窥镜、插入针或两者都在淋巴结的超声成像的帮助下进行。在某些实施方式中，放射成像包括动态放射成像、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或两者。在某些实施方式中，内窥镜包括被配置为检测淋巴结的超声探头。

在某些实施方式中，一种或多种细胞包括肝细胞、胰腺细胞或胰岛、肾细胞或碎片、胸腺细胞或碎片、或肺细胞或碎片。在某些实施方式中，一种或多种细胞对于对象是自体的、同种异体的或异种的。在某些实施方式中，一种或多种细胞对于对象是同系的。

在某些实施方式中，本文公开的方法进一步包括从活供体组织中分离一种或多种细胞。在某些实施方式中，本文公开的方法进一步包括在递送之前从冷冻保存中回收一种或多种细胞。在某些实施方式中，该方法进一步包括向对象施用免疫抑制剂以减少一种或多种细胞的免疫排斥。

在某些实施方式中，该方法包括将一种或多种细胞递送到腹腔或胸腔中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个淋巴结中。

在某些实施方式中，一种或多种细胞包括平均直径为约20μm的细胞。在某些实施方式中，每次递送到单个淋巴节的一种或多种细胞包含至少约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。在某些实施方式中，针递送针悬浮液形式的一种或多种细胞，其中每毫升的悬浮液具有至少约1000万、2000万、2500万、3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。在某些实施方式中，针递送悬浮液形式的一种或多种细胞，其中每毫升悬浮液具有至少约1000万、2000万、3000万、4000万或5000万个活细胞。在某些实施方式中，一种或多种细胞以细胞群的形式被递送到淋巴结中，其中细胞群具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％、或约100％的活细胞。在某些实施方式中，一种或多种细胞以细胞群的形式递送到淋巴结中，其中，当一种或多种细胞通过针时，所述递送导致细胞群中的细胞活力百分比降低小于约20％、15％、10％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或0.5％。

在某些实施方式中，针的内径至多为约700μm、600μm、500μm、450μm、400μm、300μm、260μm、250μm或200μm。在某些实施方式中，针的内径至多为约260μm。在某些实施方式中，针的外径至多为约1mm、900μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、520μm、510μm、500μm、480μm、450μm，或400μm。在某些实施方式中，针的外径至多为约510μm。在某些实施方式中，针至多为约19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5或27号规格。在某些实施方式中，针最多为约25号。在某些实施方式中，针至多为约25号，并且针递送悬浮液形式的一种或多种细胞，其中每毫升悬浮液具有至少约5000万个活细胞，以及其中一种或多种细胞包含至少约65％的活细胞。

在某些实施方式中，一种或多种细胞包括肝细胞并且异位组织是异位肝组织。在某些实施方式中，该方法治疗对象的肝脏疾病或病症。在某些实施方式中，肝脏疾病或病症是与饮酒相关的终末期肝病或肝纤维化，甲型、乙型、丙型或丁型肝炎感染，非酒精性脂肪肝，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，胆道闭锁，囊性纤维化，阿拉吉耶综合征(Alagille syndrome)，梅毒，布鲁氏菌病，寄生虫感染，化学品暴露，慢性胆道疾病，布加综合征(Budd-Chiary Syndrome)，奥斯勒病(Osler Disease)或右心衰竭。在某些实施方式中，肝脏疾病或病症与代谢紊乱有关，包括酪氨酸血症、枫糖浆尿病、苯丙酮尿症、Crigler-Najjar综合征、草酸中毒、高草酸尿症、血色病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病、家族性肝内胆汁淤积综合征、半乳糖血症、糖原贮积病、或家族性淀粉样多发性神经病。在某些实施方式中，对象已经接受了减少对象肝脏的血液供应并诱导肝细胞功能障碍的经颈静脉肝内门体分流术(TIPS)或门腔分流外科手术，其中，所述门腔分流外科手术包括端到侧门腔分流术、侧到侧门腔分流术、伴插入H-或C-移植物的中腔静脉分流术、或中央或远端脾肾分流术。在某些实施方式中，该方法治疗对象的终末期肝病。

在某些实施方式中，一种或多种细胞包括肾细胞或肾碎片并且异位组织是异位肾组织。在某些实施方式中，该方法治疗对象的肾脏疾病或病症。在某些实施方式中，肾病或病症是终末期肾病。

在某些实施方式中，一种或多种细胞包括胰腺细胞或胰岛并且异位组织是异位胰腺组织。在某些实施方式中，该方法治疗导致对象中胰岛素分泌减少或缺乏的内分泌胰腺疾病或病症。在某些实施方式中，胰腺疾病或病症是导致对象胰岛素分泌减少的I型糖尿病、II型糖尿病或慢性胰腺炎。

在某些实施方式中，一种或多种细胞包括肺细胞或肺碎片并且异位组织是异位肺组织。在某些实施方式中，该方法治疗对象的肺部疾病或病症。在某些实施方式中，肺部病或病症是慢性阻塞性肺病(COPD)。在某些实施方式中，COPD由以下原因引起：香烟烟雾(smoke)、污染和烟气(fume)、α-1-抗胰蛋白酶、囊性纤维化、慢性哮喘、肺气肿、慢性支气管炎、或特发性肺纤维化。

在某些实施方式中，一种或多种细胞包括胸腺细胞或胸腺碎片，并且异位组织是异位胸腺组织。在某些实施方式中，胸腺细胞或碎片获自供体对象并且异位胸腺组织在对象中诱导供体对象对来自供体对象的细胞移植的供体特异性耐受性。在某些实施方式中，疾病或病症是与年龄相关的免疫系统功能紊乱，并且异位胸腺组织调节对象的免疫功能。

在某些实施方式中，淋巴结靠近胃肠道，并且内窥镜沿着胃肠道推进。在某些实施方式中，淋巴结包括以下一种或多种：十二指肠周围淋巴结、胃周围淋巴结、胰周淋巴结、肠系膜淋巴结、回结肠淋巴结、中结肠淋巴结、胃淋巴结、肝脾淋巴结、脾门淋巴结、食管旁淋巴结淋巴结、心旁淋巴结、主动脉旁淋巴结、主动脉后淋巴结、外侧主动脉淋巴结、主动脉前淋巴结、小弯淋巴结、肝总淋巴结、脾动脉淋巴结、腹腔干淋巴结淋巴结、髂淋巴结或腹膜后淋巴结。在某些实施方式中，淋巴结包括十二指肠周围淋巴结。在某些实施方式中，淋巴结靠近呼吸道，并且内窥镜沿着呼吸道推进。在某些实施方式中，淋巴结包括纵隔区域中的一个或多个淋巴结。在某些实施方式中，淋巴结包括以下一种或多种：胸骨旁淋巴结、肋间淋巴结、上膈淋巴结、上气管支气管淋巴结、下气管支气管淋巴结、支气管肺淋巴结、气管旁淋巴结或肺内淋巴结。在某些实施方式中，淋巴结靠近泌尿道并且内窥镜沿着泌尿道推进。在某些实施方式中，淋巴结包括腹膜后区域的一个或多个淋巴结。在某些实施方式中，淋巴结包括以下一种或多种：髂外淋巴结、髂内淋巴结、腔静脉腰淋巴结、主动脉腰淋巴结、浅表腹股沟淋巴结、深腹股沟淋巴结、主腔静脉间膀胱周围淋巴结、闭孔膀胱周围淋巴结淋巴结、或骶前膀胱周围淋巴结。

在某些实施方式中，对象是人。在某些实施方式中，对象是非人动物。

在某些实施方式中，异位组织在将多种细胞中的一种递送到淋巴结后约5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、或约200天内形成。

本发明还提供了一种在有需要的对象中治疗肝脏疾病的方法。在某些实施方式中，该方法包括通过腔内途径将内窥镜推进到对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道中，借助超声成像利用经腔途径将附接到内窥镜的针穿过内脏壁插入对象的淋巴结中，以及通过针将一种或或多种细胞递送到淋巴结中，从而使一种或多种细胞在淋巴结内植入并产生异位肝组织。在非限制性实施方式中，异位组织在将多种细胞中的一种递送到淋巴结后约5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、或约200天内形成。

本发明提供了一种用于在对象中移植肝细胞和生长异位肝脏的系统，包括内窥镜和注射器，注射器具有针和包含在其中的悬浮液中的细胞群，其中每毫升悬浮液具有约2500万至约1亿个活肝细胞，以及其中针至多为约25号规格。在某些实施方式中，内窥镜和针被配置为沿着对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道推进。在某些实施方式中，注射器被配置为经由针递送一种或多种细胞。在某些实施方式中，内窥镜包括超声探头。在某些实施方式中，超声探头被配置为检测对象腹腔中的淋巴结。在某些实施方式中，每毫升悬浮液具有至少约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。在某些实施方式中，注射器中的细胞群具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的活细胞。在某些实施方式中，注射器中的细胞群具有至少约65％的活细胞。在某些实施方式中，注射器中的细胞群包含至少约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。在某些实施方式中，注射器中的细胞群包含至少约5000万个活细胞/mL，并且细胞群包含至少约65％的活细胞。

通过引用纳入

本说明书中提及的所有出版物、专利和专利申请均以引用方式并入本文，其程度就如同每个单独的出版物、专利或专利申请被具体地和单独地指示为以引用方式并入一样。

附图简要说明

本公开的新颖特征在所附权利要求中具体阐述。利用了本公开的原理以及附图，通过参考以下阐述说明性实施例的详细描述，将获得对本公开的特征和优点的更好的理解：

图1A是内窥镜医师对实验动物进行超声内窥镜检查以将EUS引导的细胞递送到淋巴结的图片。

图1B是超声图像，显示了细针穿刺针到达附近淋巴结(LN)的超声图像。

图2显示了外科医生将肝细胞直接注射到实验动物十二指肠周围淋巴结的图片。

图3是总结从供体动物分离并通过不同规格的针的不同批次肝细胞的细胞活力百分比的条形图。

图4显示了实验动物在门腔分流术之前和之后打开的腹腔的图片，以及门腔分流术的示意图(最右侧)。

图5是显示根据本公开的临床前研究的实验设计的图。

图6A显示了正常肝组织中CK-18(一种肝细胞标志物)的阳性染色。

图6B显示了在临床前研究中接受肝细胞内窥镜超声(EUS)注射后6天淋巴结中CK-18免疫染色信号的存在。

图6C显示在临床前研究中接受肝细胞直接注射后6天淋巴结中CK-18免疫染色信号的存在。

图7A显示在通过内窥镜超声(EUS)注射将自体肝细胞移植到淋巴结中后约90天淋巴结中肝组织的存在。

图7B显示在通过内窥镜超声(EUS)注射将同种异体肝细胞移植到淋巴结中后约90天淋巴结中肝组织的存在。

图7C显示在通过内窥镜超声(EUS)注射将自体肝细胞移植到淋巴结中后约60天，淋巴结中肝组织和延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)阳性肝细胞的存在。

图7D显示了在通过内窥镜超声(EUS)注射将同种异体肝细胞移植到淋巴结中约150天后，淋巴结中肝组织和FAH阳性肝细胞的存在。

发明详述

为清楚起见，但不作为限制，目前公开的主题的详细描述分为以下小节：

1.概述；

2.定义；

3.细胞递送方法；

4.从移植细胞生产异位组织；

5.疾病和病症；

6.对象；

7.系统；和

8.套件。

1.概述

作为概述，本公开涉及用于诱导体内器官发生发育的微创手术的方法和系统。本文提供了通过将细胞递送到对象的淋巴结中从而在对象中移植细胞和生长异位组织的方法和系统。从具有适当解剖学和功能特征的淋巴结内递送的细胞或组织碎片生长异位组织的过程被称为体内器官发生。本公开实现的微创手术可实现异位组织的产生，所述异位组织可为对象补充或增强一个或多个器官的正常功能。

如上所述，与当前移植疗法，尤其是原位器官移植相关的一个问题可能是，许多患有终末期疾病(例如终末期肝病或肾病)的患者不再适合原位器官移植或其他类型细胞移植所需的大手术。大手术可能存在重大风险，鉴于这些患者的健康状况恶化，他们的预后可能很差。一方面，本公开提供了一种微创手术(例如，内窥镜超声(EUS))来解决这个问题。该方法和系统可以使用淋巴结作为天然生物反应器在异位部位产生解剖学上完整且完全或至少部分功能的器官。本文提供的方法和系统可以尽可能降低通常需要其它外科手术的患有终末器官疾病的患者的发病率和死亡率。本公开还可以允许在门诊患者的基础上进行本文所述的至少一些外科手术，因此可以降低初始手术的成本。

如本文所用，术语“异位组织”可以指存在于身体的异位(非原生)位置并且具有一种或多种与通常存在于身体的原生位置的健康器官或组织相似或相同的形态和/或功能特性的组织。术语“功能性异位组织”可以指具有通常存在于身体的原生位置的健康器官或组织的一种或多种功能的异位组织。术语“异位位置”可用于描述相对于对象的原生位置的位置，例如，异位位置可以指与对象身体中的原生位置不同的位置。例如，淋巴结中的肝脏在健康的正常哺乳动物体内是异位的，即异位肝脏，因为通常在淋巴结中找不到肝组织。根据本公开的一些方面，异位组织可以在淋巴结中生长，该淋巴结包含在形态上类似于肝细胞的细胞群并且可以共同执行健康的原生肝脏可以行使的一种或多种功能。

在某些实施方式中，该方法包括将内窥镜推进到对象的体腔或封闭的体腔中。在某些实施方式中，该方法包括将内窥镜推进到对象的胃肠道(GI)、呼吸道或泌尿道中。

在某些实施方式中，通过腔内途径将内窥镜推进到对象的体腔中。如本文所用，本文所用的术语“腔内途径”是指本领域已知的用于将内窥镜插入对象的体腔中的任何途径，例如方法和装置。例如，但不作为限制，该方法包括将内窥镜通过腔内途径推进到对象的胃肠道(GI)、呼吸道或泌尿道中。

在某些实施方式中，该方法还可包括将针插入对象的淋巴结中，其中该针附接到内窥镜。在某些实施方式中，附接到内窥镜的针穿过内脏壁插入到淋巴结中。内脏壁的非限制性实例包括围绕中空内脏和/或沿着腔道的器官的解剖结构，例如胃、十二指肠、气管、支气管或膀胱。在某些实施方式中，该方法进一步包括通过经腔途径插入针。如本文所用，术语“经腔途径”是指本领域已知的用于通过使用内窥镜将工作器械(例如，针)插入管腔的任何途径，例如方法和装置。

在某些实施方式中，该方法进一步包括通过针将一种或多种细胞递送到淋巴结中。在某些实施方式中，该方法包括将一个单细胞递送到淋巴结中。在某些实施方式中，该方法包括将细胞群递送到淋巴结中。在某些实施方式中，细胞群包括一种细胞类型。在某些实施方式中，细胞群包括至少两种细胞类型。在某些实施方式中，递送到淋巴结中的一种或多种细胞可以在淋巴结中植入并产生异位组织。

在某些实施方式中，推进内窥镜、插入针或两者通过微创或非侵入性方法进行。例如，可以在本文提供的方法中应用超声介导的成像或其他检测方法来定位目标淋巴结。在此过程中，超声成像或其他方法，例如微创或无创检测方法，可用于推进内窥镜、定位合适的目标淋巴结、或监测针穿过内脏壁或进入目标淋巴结中的任何一种。

在另一方面，本公开提供的方法包括在超声的帮助下将针插入对象的腹腔、骨盆或胸腔中的淋巴结中。该方法还可包括通过针将一种或多种细胞递送到淋巴结中。淋巴结的超声引导定位可以通过任何可用的技术进行。例如，但不作为限制，可以使用超声成像来识别和定位用于细胞注射的合适淋巴结。在某些实施方式中，超声光谱法可用于检测淋巴结。在某些实施方式中，超声成像或光谱法可以与用于淋巴结定位的其他检测方法结合使用。

在某些实施方式中，该方法包括将细胞群递送到对象的淋巴结中，肝细胞群在淋巴结中植入并产生异位肝脏。在某些实施方式中，该方法进一步包括减少对象肝脏的血液供应。本公开已经发现，对象肝脏血液供应的减少有利于淋巴结中异位肝脏的生长。

2.定义

在本申请中，除非另有特别说明，否则单数的使用包括复数。必须注意的是，在说明书中使用的单数形式“一”、“一种”和“这种”包括复数所指对象，除非上下文另有明确规定。

在本申请中，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。如本文所用，术语“和/或”和“其任何组合”及其语法等价形式可以互换使用。这些术语可以表示任何组合都是特别考虑的。仅出于说明目的，以下短语“A、B和/或C”或“A、B、C或其任何组合”可表示“单独A；单独B；单独C；A和B；B和C；A和C；以及A、B和C”。术语“或”可以结合使用或分开使用，除非上下文特别指代分开使用。

此外，使用术语“包括”以及其他形式，例如“包含”和“含有”，不是限制性的。

说明书中对“一些实施方式”、“某些实施方式”、“一个实施方式”、“一种实施方式”或“其他实施方式”的引用意味着结合实施方式描述的特定特征、结构或特性包括在本发明的至少一些实施方式中，但不一定是所有实施方式中。

如在本说明书和权利要求中使用的，词语“包括”(以及任何形式的包括，例如“包含”和“含有”)、“具有”(以及任何形式的具有，例如“有”和“具备”)、“含有”(以及任何形式的含有，例如“包括”和“包含”)或“包含”(以及任何形式的包含，例如“含有”和“包含”)是包容性或开放性的，并不排除额外的、未提及的元素或方法步骤。预期本说明书中讨论的任何实施方式可关于本公开的任何方法或组合物实施，反之亦然。此外，本公开的组合物可用于实现本公开的方法。

如本文所用，与参考数值及其语法等价形式相关的术语“约”可包括数值本身和该数值正负10％的值范围。

术语“约”或“大约”是指在由本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差范围内，这将部分取决于如何测量或确定该值，即测量系统的极限。例如，根据本领域的实践，“约”可以表示在1个标准偏差以内或超过1个标准偏差。或者，“约”可以表示给定值的最多20％、最多10％、最多5％或最多1％的范围。在另一个例子中，量“约10”包括10和从9到11的任何量。在又一个例子中，与参考数值相关的术语“约”还可以包括正负10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％的数值范围。或者，特别是对于生物系统或过程，术语“约”可表示在一个数量级内，优选在5倍以内，更优选在2倍以内。在申请和权利要求中描述特定值的情况下，除非另有说明，否则应假定术语“约”的含义在特定值的可接受误差范围内。

3.细胞递送方法

在某些实施方式中，本公开的方法和系统利用内窥镜将细胞经腔递送到对象的淋巴结中。在某些实施方式中，淋巴结位于通过使用内窥镜可到达的体腔或封闭体腔附近或之内。。在某些实施方式中，淋巴结位于对象的腹腔、骨盆或胸腔中。

如本文所用，术语“内窥镜”可指可引入对象(例如，人类对象或非人哺乳动物对象，例如狗、猪、马、驴、兔、牛、小鼠或大鼠)体内的任何仪器，并提供对象内部的视图。有时，该视图提供视觉检查，例如，当内窥镜配备有照明光学器件或以其他方式辅助照明时。在某些实施方式中，本公开的内窥镜包括或附接到一个或多个检测探针或与一个或多个检测探针相关联并提供不同的检测模式用于检查对象的内部。例如，内窥镜可具有用于视觉检查的照明光学器件，用于超声介导检测(例如超声成像)的超声探头，或用于辐射、红外信号、射频信号或荧光信号的检测器。

本文所述的内窥镜可包括以下部件中的一个或多个：沿对象的腔道(例如，胃肠道、呼吸道或泌尿道)行进的刚性或柔性管；用于照亮受检器官或物体的光传输系统；将图像从物镜传输到观察者、目镜或在体内显示由内窥镜捕获的图像视频系统的透镜系统；一个或多个允许医疗器械或机械手进入的通道。光源可以在体外或迷你尺寸并配备在内窥镜内部。当光源在体外时，光可以通过光纤系统传输。可以有光学系统，例如光纤，用于传输在体内捕获的光图像。附加地或替代地，本文提供的内窥镜可以配备(例如，包括作为部件或附接到)用于不同目的的其他检测仪器。

本文提供的方法可以包括在对象的体腔或封闭的体腔中推进内窥镜。体腔的非限制性实例包括：胃肠(GI)道(例如食道、胃、十二指肠、小肠、大肠、结肠、胆管、直肠、肛门)、呼吸道(例如鼻、下呼吸道)、耳、泌尿道、子宫颈、子宫和输卵管。封闭的体腔的非限制性实例包括：腹腔和盆腔。在某些实施方式中，本文公开的方法包括在对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道中推进内窥镜。

在某些实施方式中，本文公开的方法包括沿对象的体腔或在封闭的体腔内推进内窥镜以将细胞递送至位于体腔或封闭的体腔附近或其中的至少一个淋巴结中。在某些实施方式中，基于细胞移植的目的选择淋巴结的位置。在某些实施方式中，基于适合细胞移植的淋巴结来选择体腔和/或封闭的体腔。

在某些实施方式中，本文公开的方法包括沿胃肠道推进内窥镜以将细胞递送到胃肠道附近的一个或多个淋巴结中。内窥镜(例如，食管镜或胃镜)可用于将细胞递送到靠近胃肠道上部或下部的淋巴结。例如，食管镜可用于将细胞递送到靠近食道的淋巴结，而胃镜可用于将细胞递送到胃周和/或十二指肠周围淋巴结。使用本文提供的方法可将细胞递送至其中的胃肠道附近淋巴结的非限制性实例包括：十二指肠周围淋巴结、胃周围淋巴结、胰周淋巴结、肠系膜淋巴结、回结肠淋巴结、中结肠淋巴结、胃淋巴结、肝脾淋巴结、脾门淋巴结、食管旁淋巴结、心旁淋巴结、主动脉旁淋巴结、主动脉后淋巴结、主动脉外侧淋巴结、主动脉前淋巴结、小弯淋巴结、肝总淋巴结、脾动脉淋巴结、腹腔轴淋巴结、髂淋巴结和腹膜后淋巴结。内窥镜可以从对象的嘴或在某些实施方式中从对象的鼻子引入。或者，内窥镜可以从对象的肛门引入，例如，可以使用直肠镜、乙状结肠镜或结肠镜将细胞递送到靠近直肠或结肠的淋巴结中。在某些实施方式中，内窥镜是柔性的以沿着胃肠道行进，并且为了细胞移植的目的而进行调查检查以定位合适的淋巴结进行细胞移植。

在某些实施方式中，本文公开的方法包括沿着对象的呼吸道推进内窥镜以将细胞递送到靠近呼吸道的一个或多个淋巴结中。例如，但不作为限制，支气管镜或喉镜用于靶向靠近对象的气管或肺支气管或喉部的淋巴结。使用本文提供的方法可将细胞递送到其中的呼吸道附近淋巴结的非限制性实例包括：胸骨旁淋巴结、肋间淋巴结、上膈淋巴结、上气管支气管淋巴结、下气管支气管淋巴结、支气管肺淋巴结、气管旁淋巴结和肺内淋巴结。支气管镜或喉镜可以从对象的嘴巴引入，或者在某些实施方式中，从对象的鼻子引入。

在某些实施方式中，本文公开的方法包括沿着对象的尿道推进内窥镜以将细胞递送到尿道附近的一个或多个淋巴结中。例如，但不限于，膀胱镜用于靶向靠近尿道或膀胱的淋巴结。膀胱镜可以从对象的尿道引入。使用本文提供的方法可以将细胞递送到其中的尿道附近淋巴结的非限制性实例包括以下一种或多种：髂外淋巴结、髂内淋巴结、腔静脉腰淋巴结、主动脉腰淋巴结、浅表腹股沟淋巴结、深腹股沟淋巴结、主腔静脉间膀胱周围淋巴结、闭孔膀胱周围淋巴结、或骶前膀胱周围淋巴结。

在某些实施方式中，本文公开的方法包括在封闭的体腔(例如，腹腔、骨盆腔)中推进内窥镜以将细胞递送到封闭的体腔内部或附近的至少一个淋巴结中。在某些实施方式中，内窥镜通过小切口例如腹部表面上的小切口被引入封闭的体腔。在某些实施方式中，封闭的体腔是腹腔或骨盆腔。腹腔或骨盆腔内部或附近淋巴结的非限制性实例包括：脾淋巴结、肝淋巴结、囊性淋巴结、椎间孔淋巴结、右/左胃淋巴结、幽门淋巴结、幽门上淋巴结、幽门下淋巴结、幽门后淋巴结、胰腺上淋巴结、下淋巴结、胰十二指肠上/下淋巴结、肠系膜下淋巴结、乙状结肠淋巴结、直肠上淋巴结、结肠系膜淋巴结、左侧结肠淋巴结、右侧结肠淋巴结、中结肠淋巴结、阑尾淋巴结、回结肠淋巴结、盲肠后淋巴结、顶盖前淋巴结、肠系膜上淋巴结、左腰淋巴结、外侧主动脉淋巴结和主动脉前淋巴结。

在某些实施方式中，本文公开的方法和系统使用超声来定位将移植细胞的淋巴结，和/或用于引导推进内窥镜穿过体腔或封闭的体腔、插入针或其任意组合。超声波是频率高于人类听觉听觉上限的声波，其频率大约可以超过20kHz一直到几千兆赫。超声成像(或超声检查)可以根据应用本文提供的方法和系统的预期目的以多种方式进行。超声检查的非限制性实例可包括：多普勒超声检查、对比超声检查、分子超声检查、弹性成像、介入性超声检查和加压超声检查。在某些实施方式中，本文使用的超声成像技术具有高空间和/或时间分辨率，用于定位适合注射的淋巴结，使用诸如在国际专利公开WO2018222724A1和WO2018134729A1中描述的技术，其中每一份文献均是以引用方式并入本文。

在本公开的某些实施方式中，本文公开的方法结合超声成像使用内窥镜，其中内窥镜附接到超声探头(例如，作为内窥镜的部分或作为单独的部件)。术语“超声内窥镜”、“内窥镜超声”或“EUS”在本文中可互换使用，可以指将内窥镜与超声结合以检测(例如，获得其图像)和/或操纵胸部、腹部和骨盆的内部器官，或身体的任何其他内部结构。本文提供的方法和系统中使用的EUS仪器和技术可以是目前市售的那些，和/或如美国专利公开US20060106306A1和US20070237373A1和国际专利公开WO1998009247A1中所述的那些，它们各自并入本文全文参考。

在某些实施方式中，目标淋巴结(例如，一种或多种细胞将被递送到其中的淋巴结)的超声成像是在其他成像技术例如放射成像的帮助下进行的。放射成像可包括动态放射成像(荧光镜检)、计算机断层扫描(CT)或磁共振成像(MRI)。例如，但不作为限制，执行计算机断层扫描(CT)以获得整个身体或对象的一些局部器官或组织的解剖信息。在某些实施方式中，磁共振或任何其他可用的医学技术与超声成像结合使用或代替超声成像用于在对象的腹腔、骨盆或胸腔中定位目标淋巴结。

本文提供的方法和系统可包括使用针将一种或多种细胞递送到淋巴结中。针可以是注射器的一部分，其可以被配置为接收待递送的细胞并将细胞通过针推出以进行递送。本文提供的针可被配置为具有一定程度的锋利度和刚度。例如，但不作为限制，执行计算机断层扫描(CT)以获得整个身体或对象的一些局部器官或组织的解剖信息。在某些实施方式中，针还被配置为穿透胃肠道壁(例如食道壁、胃壁、肠壁或结肠壁)、呼吸道、泌尿道(例如尿道壁或膀胱壁)，以便针可以到达腔道外的淋巴结。本领域已知的任何合适的针均可用于本文公开的方法。

在某些实施方式中，针附接到内窥镜，例如作为内窥镜的一部分或作为单独的装置。针可以是细针抽吸(FNA)方法中使用的那些。FNA针可以是市售的或专门设计用于应用本公开的教导的目的。FNA针通常用于活检目的，例如，切入组织并抽吸组织碎片以进行诊断。在本文提供的方法和系统中，FNA针可替代地用于细胞递送目的。在某些实施方式中，FNA针通过线性阵列回声内窥镜EUS/FNA设备操作。示例性EUS/FNA设备可以被配置用于FNA针(例如，具有实心可移除管芯的空心针)在半刚性保护鞘内的受控和测量的推进。EUS/FNA设备还可以有一个带有端口的手柄，用于插入或取出管芯，以及用于连接注射器，活细胞通过注射器插入。在某些实施方式中，将针插入保护鞘内，进入用来自回声内窥镜设备的EUS探头声学识别的淋巴结。然后可以将针从鞘中取出并在直接超声引导下经腔插入目标淋巴结。连接到注射器尖端的旋塞可以帮助在针体内产生和保持真空。一旦针尖位于目标淋巴结中并移除管芯，就可以将在培养基中含有活细胞的注射器连接到针柄上。打开旋塞阀后，放置在淋巴结实质内的针可以在直接观察下迅速注入细胞。针可以在手柄的远端部分具有可调节的垫片/滑块，以允许调整退出范围(scope)的鞘的长度，这可以在注射附近的淋巴结时确保附加的安全性和准确性。

在某些实施方式中，针被配置，例如针的尺寸被配置，以便于将细胞注射到淋巴结中。在某些实施方式中，针的尺寸(例如，规格)是基于目标淋巴结的位置、要递送的细胞类型和要递送的细胞量来选择的。在某些实施方式中，针越小，到达并插入目标淋巴结越灵活。在某些实施方式中，将相对较小的针插入小的目标淋巴结更容易，否则则围绕相对较大的针展开。在某些实施方式中，针的尺寸，例如针的内径，被配置为允许细胞被推出而不会堵塞针。如本文所述，针的尺寸是指针尖的尺寸，而不是针与注射器的其他部分连接处的针毂的尺寸。如本文所公开的，针的外径是指从尖端到针壁外侧的第一全径，而针的内径是指从尖端到针壁内侧的第一全径。

在某些实施方式中，针的内径至多约为700μm,600μm,500μm,450μm,400μm,300μm,260μm,250μm或200μm。在某些实施方式中，针的内径至多约为260μm。在某些实施方式中，针的内径至多约为700μm,600μm,500μm,450μm,400μm,300μm,260μm,250μm或200μm。在某些实施方式中，针的内径约为260μm。针的外径至多约为1mm,900μm,800μm,750μm,700μm,650μm,600μm,550μm,520μm,510μm,500μm,480μm,450μm或400μm。在某些实施方式中，针的外径至多约为510μm。在某些实施方式中，针的外径至多约为1mm,900μm,800μm,750μm,700μm,650μm,600μm,550μm,520μm,510μm,500μm,480μm,450μm或400μm。在某些实施方式中，针的外径至多约为510μm。在某些实施方式中，针具有特定规格，如根据ISO 7864:2016所规定的。例如，但不作为限制，针为约19,19.5,20,20.5,21,21.5,22,22.5,23.5,24,24.5,25,25.5,26,26.5或27号规格(ga)。在某些实施方式中，针至多为约19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5或27号规格。针至多可以是约25号。如本文所述，当针的尺寸相对于特定规格尺寸进行比较时，根据ISO 7864:2016的规定，在针的外径和该特定规格的标准化皮下注射针的外径之间进行比较。在某些其他实施方式中，针具有相对小的外径和相对大的内径。在某些实施方式中，针具有非标准尺寸，例如具有薄壁，同时保持大内径和小外径。

针注射器内的细胞总数和细胞浓度是根据多种因素选择的，例如，要注射的细胞的大小、要产生的异位组织的类型、细胞的增殖能力，异位组织的目标质量，注射针的大小，以及目标淋巴结的大小。

在某些实施方式中，本文所述的注射器接收至少约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、2亿、3亿、400亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、100亿、200亿、500亿、或1000亿个注射用细胞。在某些实施方式中，本文所述的注射器具有约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、2亿、3亿、400亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、100亿、200亿、500亿、或1000亿个注射用细胞。在某些实施方式中，本文所述的注射器具有至多约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、2亿、3亿、400亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、100亿、200亿、500亿、或1000亿个注射用细胞。在某些实施方式中，注射器接收约5000万至约2亿个注射用细胞。

在某些实施方式中，本文所述的注射器接收至少约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个肝细胞用于异位肝的产生。在某些实施方式中，本文所述的注射器具有约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个肝细胞用于异位肝的产生。在某些实施方式中，本文所述的注射器接收至多约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个肝细胞用于异位肝的产生。在某些实施方式中，注射器接收约5000万至约2亿细胞用于异位肝的产生。

在某些实施方式中，本文所述的注射器具有每毫升至少约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、200 10亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、或100亿个细胞的细胞悬浮液。在某些实施方式中，本文所述的注射器具有每毫升约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、200 10亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、或100亿个细胞的细胞悬浮液。在某些实施方式中，本文所述的注射器具有每毫升至多约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、200 10亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、或100亿个细胞的细胞悬浮液。

在某些实施方式中，本文所述的注射器接收每毫升具有至少约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞的肝细胞悬浮液，用于产生异位肝。在某些实施方式中，本文所述的注射器接收每毫升具有约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞的肝细胞悬浮液，用于产生异位肝。在某些实施方式中，本文所述的注射器接收每毫升具有至多约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞的肝细胞悬浮液，用于产生异位肝。

在某些实施方式中，用于注射肝细胞的针被选择为至多约25号规格，并且该针在具有至少约5000万个活细胞/mL的悬浮液中递送包括肝细胞的细胞。在某些实施方式中，注射器中的细胞群具有至少约65％的活细胞。

不希望受制于某个理论，递送到淋巴结中的细胞的活力对于异位组织的形成和功能可能是重要的。在某些实施方式中，需要控制细胞群中的活力百分比。注射器，例如针，可以配置为在递送过程中保持细胞的活力。例如，可以配置悬浮液的针尺寸和细胞浓度，以便在细胞递送过程中当细胞通过针时活力百分比不会显着降低。在某些实施方式中，细胞递送导致当细胞通过针时细胞群中细胞活力百分比降低小于约20％、15％、10％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或0.5％。在某些实施方式中，当细胞在细胞递送期间通过针时，细胞活力百分比的降低小于约10％(例如，与注射前的细胞活力相比)。

在某些实施方式中，本文提供的方法包括减少对象肝脏的血液供应，并将一种或多种肝细胞递送到对象的淋巴结中。对象肝脏血液供应的减少可诱导肝细胞功能障碍，例如至少一些肝细胞的功能障碍或死亡，并因此导致肝脏功能的降低或丧失。不希望受特定理论的束缚，在肝脏血液供应减少后对象肝脏功能的降低或丧失可以对肝细胞移植到淋巴结后异位肝脏在淋巴结中的生长产生代偿性影响。换言之，在某些实施方式中，减少肝脏血液供应的步骤促进淋巴结中异位肝的形成，和/或在某些实施方式中，改善了淋巴结中异位肝的功能性能。在该方法的某些实施方式中，当与减少肝脏血液供应的步骤联合进行时，通过直接注射(例如，通过大手术或经皮注射)肝细胞或在EUS引导下注射肝细胞来进行细胞递送。

手术方法可用于减少肝脏的血液供应，这可能涉及重新引导来自门静脉的血液流入。例如，进行经颈静脉肝内门体分流术(TIPS)以建立流入的门静脉和流出的肝静脉之间的直接连通，从而可以减少通过肝脏的血流量。TIPS是指肝脏内的人工通道，它在门静脉和肝静脉之间建立联系。TIPS已被用作独立疗法，以减轻终末期肝病导致的进行性门静脉高压对内脏和全身血液动力学的有害影响。在某些实施方式中，本文公开的方法包括将TIPS与淋巴结中的肝细胞移植组合使用以在淋巴结中产生异位肝脏。

经颈静脉肝内门体分流器可以通过涉及打开腹腔的大手术或微创手术放置在肝脏中。在某些实施方式中，经颈静脉肝内门体分流器在荧光镜引导下放置。可以通过颈部的颈内静脉进入肝脏。一旦确认进入颈静脉，就可以放置导丝和导引鞘，以方便分流器的放置。该步骤可以通过从上腔静脉进入下腔静脉，最后进入肝静脉来进入患者的肝静脉。一旦导管进入肝静脉，就可以获得楔形压力来计算肝脏中的压力梯度。在此之后，可以注射二氧化碳来定位门静脉。然后，一种称为Colapinto的特殊针可以穿过肝实质，将肝静脉连接到靠近肝脏中心的大门静脉。接下来可以通过沿着针形成的腔道在肝脏内充气血管成形术球囊来创建分流器的通道。可以通过放置称为支架或内移植物的特殊网状管以维持高压门静脉和低压肝静脉之间的管道，从而完成分流。手术后，可以制作荧光图像以显示放置情况。

在某些其他实施方式中，进行门腔分流术以在门静脉和下腔静脉之间建立连通，以减少对肝脏的血液供应。门腔分流器可以通过外科手术方法放置，例如但不限于实施例2中描述的方法。可以使用的其他外科手术包括：端对侧或侧对侧门腔静脉分流术(SSPCS)、伴插入H-或C-移植物的中腔静脉分流术(MCS)和脾肾分流术(SRS)(中央或远端)。

在某些实施方式中，肝细胞在肝脏的血液供应减少后被递送至淋巴结。在某些实施方式中，在减少肝脏血液供应的步骤之后立即进行肝细胞移植。在某些实施方式中，肝细胞移植在减少肝脏血液供应的步骤之后的一段时间进行，例如约1小时、2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、7天、10天、2周、3周或4周。在某些实施方式中，这样的间隔不能长于特定时间长度，以避免可能危及生命的完全肝衰竭。例如但不作为限制，间隔短于约12小时、18小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、7天、10天、2周、3周，或4周。或者，也可以在减少肝脏血液供应的步骤之前不久进行肝细胞移植。在某些实施方式中，该间隔可以短于约1小时、2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、7天、10天、2周，或3周。两个步骤之间的间隔取决于肝脏血液供应减少的程度和接受手术的对象的健康状况。医生根据具体情况进行的医学评估可以参与确定本文所述的两个步骤之间的间隔。

移植排斥可能是与任何涉及植入非自体器官或细胞的移植手术相关的问题。可以应用免疫抑制来预防或改善由根据本公开内容的方法的手术导致的移植排斥。例如，可以在细胞移植完成之前不久或之后立即，或在手术后约1小时、2小时、6小时、12小时、18小时、24小时、36小时、2天、3天、4天、5天、7天、10天、2周、4周、6周、2个月、3个月、4个月、5个月、6个月、9个月、12个月、18个月、2年、3年、4年，甚至更长的时间向对象施用免疫抑制剂药物。

可以应用不同的免疫抑制方法。例如，但不作为限制，对象被施用免疫抑制剂用于诱导免疫抑制，其可以包括为了预防急性排斥的目的而在移植后立即以强化剂量给予的所有药物。相关药物的非限制性实例可包括：甲泼尼龙、Atgam、胸腺球蛋白、OKT3、巴利昔单抗、琥钠甲强龙(Solumedrol)和达利珠单抗(Daclizumab)。还可以向对象施用免疫抑制剂以维持免疫抑制，这可以包括在移植之前、期间或之后给予以达长期维持的所有免疫抑制药物。例如，但不限于，泼尼松、环孢菌素、他克莫司、霉酚酸酯(Mycophenolate Mofetil)、硫唑嘌呤、普乐可复(Prograf)或雷帕霉素可用于如本文所述的维持性免疫抑制。在某些实施方式中，还可以向对象施用用于抗排斥免疫抑制的免疫抑制剂，其可以包括在移植后的初始阶段或特定的后续阶段(例如急性排斥反应诊断后一直到30天)，为治疗急性排斥反应而给予的所有免疫抑制药物。相关药物的非限制性实例可包括：甲基强的松龙、Atgam、OKT3、胸腺球蛋白、巴利昔单抗或达利珠单抗。可用于本发明方法的免疫抑制剂的其他实例还可包括其他类固醇(例如皮质类固醇、地塞米松和泼尼松)，Cox-1和Cox-2抑制剂，大环内酯类抗生素(例如雷帕霉素和他克莫司)，以及限制、减少或抑制B细胞、T细胞和/或其他先天免疫活性的其他物质。

4.从移植细胞生产异位组织

本文提供的方法和系统可用于移植各种类型的细胞，包括但不限于肝细胞、肾细胞或肾组织碎片、胰腺细胞或胰岛、胸腺细胞或胸腺碎片、或肺细胞或肺组织碎片。移植到淋巴结中的细胞可以植入并形成异位组织，其可以补充或增强对象正常器官的一种或多种功能。

待移植到淋巴结中的细胞可以是同质细胞群或异质细胞群，这取决于细胞移植的目的。例如，在某些实施方式中，将一群同质肝细胞递送到淋巴结中以产生异位肝。在某些实施方式中，当培养异位肝脏时，异质细胞群(例如具有额外其他肝实质细胞的肝细胞)被递送到淋巴结中。在某些实施方式中，为了在淋巴结中产生异位肾的目的，将异质肾细胞或肾碎片群递送到淋巴结中。在某些实施方式中，获得来自供体对象的胚胎肾或通过体外分化方法产生的肾类器官(例如在国际专利公开WO2014182885A2、WO2019006127A1和WO2018227101A1中描述的那些，其各自以引用方式并入本文)，并将其加工(例如，切碎或研磨)成小碎片并重新悬浮在液体中以形成待递送到淋巴结中的溶液。该溶液包含构成胚胎肾或肾类器官的不同类型的细胞。在某些实施方式中，将异质胰腺细胞群递送到淋巴结中以产生异位胰腺。

本文提供的方法和系统可以涉及将治疗有效量的细胞递送到对象的淋巴结中。当提及待移植或递送的细胞群时，本文所用的术语“治疗有效量”可指细胞群(例如待移植的细胞)或包括待移植细胞的组合物中的相关细胞的量，其可有效产生以适用于任何医学治疗的合理收益/风险比在接受淋巴结细胞移植的对象中获得预期的治疗效果。例如，但不作为限制，移植到对象中的细胞群的量足以在移植意欲治疗的疾病或病症(例如，终末期肝病或肾病)的一种或多种症状中产生统计学显著的、可测量的变化。治疗有效量的确定取决于应用本发明方法或系统的预期医学目的。治疗有效量可随对象的病史、年龄、状况、性别以及对象的医学状况的严重性和类型，以及其他药物活性剂的施用而变化。

根据应用本文提供的方法和系统的预期目的，可以将不同量的细胞递送到淋巴结中以用于异位组织的生长。每个淋巴结可以递送至少100万、200万、300万、400万、500万、700万、900万、1000万、1500万、2000万、3000万、4000万、4500万、5000万、5500万左右、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、1.5亿、2亿、3亿、5亿、7.5亿、8亿、9亿、10亿、50亿、100亿、200亿、300亿、500亿、甚至更多的细胞。在某些实施方式中，可以将约1000万、1500万、2000万、3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞递送到单个淋巴结中。在某些实施方式中，可在单个淋巴结中递送约5000万至约2亿个细胞。

待递送的细胞群可具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％或约100％的活细胞。可以应用可用于促进细胞活力的措施以维持待递送细胞群中的细胞活力水平。在某些实施方式中，在细胞递送之前，可以测量细胞群的活力状态(例如，活力百分比或其他细胞活力参数)以确保有活力的细胞群被递送并且因此可以在淋巴结中产生功能性异位组织。

在非限制性实施方式中，异位组织可在将所公开的各种类型的细胞移植到淋巴结中后至少约5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、或约200天形成。例如但不限于，肝细胞可以通过EUS递送到淋巴结中，并且植入的肝细胞可以在肝细胞移植后约60、约90、或约150天形成肝组织。在非限制性实施方式中，异位组织可在将所公开的各种类型的细胞移植到淋巴结中后约5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、或约200天内形成。例如，但不作为限制，肝细胞可以通过EUS递送到淋巴结中，并且植入的肝细胞可以在肝细胞移植后约60天、约90天或约150天内开始形成肝组织。

要递送的细胞可以从不同来源通过多种不同方法获得。细胞对于对象可以是同种异体的、异种的或自体的。细胞可以直接从活体供体组织中获得。例如，根据美国专利9125891B2和6610288B1、美国专利公开20120045764A1和20040110289A1中描述的方法分离和制备用于移植的肝细胞，这些专利均通过引用并入本文。在某些实施方式中，待递送的细胞获自体外来源。干细胞(例如胚胎干细胞、诱导多能干细胞、滋养层干细胞或任何其他类型的多能或专能干细胞)可以在体外培养并分化成适合应用本文提供的方法和系统的目的的某些类型的细胞或细胞群。例如，如上所述，肾类器官或胰岛是使用体外分化方法获得的，并且它们被制备用于本文所述的移植方法。待递送的细胞也可以在移植前储存，例如冷冻保存。可以使用标准的冷冻保存和复苏过程，只要细胞活力水平适合随后的细胞递送和淋巴结中的异位组织形成。在某些实施方式中，待递送的细胞被遗传修饰以使得细胞的一种或多种基因被修饰，或者细胞被修饰以表达一种或多种外源基因。任何可用的基因编辑方法，例如同源重组、转座酶/转座子、锌指核酸酶、TALEN和CRIPSR，例如CRISPR-Cas9技术，都可以应用于待递送细胞的基因修饰。

细胞可以制备并悬浮在用于移植的溶液中。在某些实施方式中，含有细胞群的悬浮液还可包括药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体。如本文所用，术语“药学上可接受的”可以指在合理医学判断的范围内适合用于与对象(例如，人类对象或非人动物)的组织接触的那些化合物、材料、组合物和/或剂型，没有过度的毒性、刺激、过敏的反应或其他问题或并发症，与合理的收益/风险比相称。

如本文所用，术语“溶液”可包括药学上可接受的载体或稀释剂，本发明的细胞在其中保持存活。药学上可接受的载体和稀释剂包括盐水、缓冲水溶液、溶剂和/或分散介质。此类载体和稀释剂的使用是本领域公知的。该溶液优选是无菌的并且具有易注射性的程度的流体。通过使用例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等，该溶液在制造和储存条件下可以是稳定的并且可以防止微生物如细菌和真菌的污染作用。本公开的溶液可以通过将如本文所述的活的、功能性细胞掺入药学上可接受的载体或稀释剂以及根据需要的上文列举的其他成分，然后过滤除菌来制备。

可用作用于本公开的目的的药学上可接受的赋形剂的物质或材料的非限制性实例可包括：糖类，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、甲基纤维素、乙基纤维素、微晶纤维素和醋酸纤维素；黄蓍胶粉；麦芽；明胶；润滑剂，例如硬脂酸镁、十二烷基硫酸钠、滑石粉；可可脂和栓剂蜡；油类，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇类，例如甘油、山梨糖醇、甘露糖醇和聚乙二醇(PEG)；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；海藻酸；无热原水；等渗盐水；林格溶液；乙醇；pH缓冲溶液；聚酯、聚碳酸酯和/或聚酐；填充剂，例如多肽和氨基酸；血清成分，例如血清白蛋白、高密度脂蛋白和低密度脂蛋白；C2-C12醇，例如乙醇；以及其他用于药物制剂的无毒相容物质。润湿剂、着色剂、脱模剂、涂层剂、甜味剂、调味剂、加香剂、防腐剂和抗氧化剂也可存在于制剂中。诸如“赋形剂”、“载体”、“药学上可接受的载体”等术语在本文中可互换使用。如本文所用，术语“药学上可接受的赋形剂”可以指药学上可接受的材料、组合物或载剂，例如液体或固体填充剂、稀释剂、载体、制造助剂(例如润滑剂、滑石、硬脂酸镁、钙或锌、或硬脂酸)或溶剂包封材料，参与将化合物、材料或细胞携带或运输到身体的器官或部分。在与制剂的其他成分(例如待移植的细胞)相容的意义上，每种赋形剂必须是“可接受的”，并且对对象无害。

在被递送到淋巴结中后，本公开的细胞可以在淋巴结中植入、增殖并产生异位组织。如本文所用，术语“植入”或其语法上的等价形式可指将一种或多种细胞植入目标淋巴结并在淋巴结内存活并变得具有生物活性(例如，行使细胞功能)的过程。如本文所用，术语“增殖”或其语法等价形式可指细胞经历一个或多个系列的有丝分裂并产生多个后代细胞的过程，增殖过程可导致细胞计数呈指数增加。在某些实施方式中，细胞以高水平增殖，使得最终产生的异位组织的质量显著高于递送至淋巴结的细胞的原始质量。在某些实施方式中，细胞增殖处于中等水平。在某些实施方式中，例如，与最初移植的细胞质量相比，质量增加为至少约1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、17.5倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、150倍、200倍、300倍、400倍、500倍、或1000倍。在某些实施方式中，例如，与最初移植的细胞数量相比，细胞数量增加至少约1.2倍、1.5倍、2倍、2.5倍、3倍、3.5倍、4倍、4.5倍、5倍、6倍、7倍、7.5倍、8倍、9倍、10倍、12倍、15倍、17.5倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、120倍、150倍、200倍、300倍、400倍、500倍、或1000倍。

在某些实施方式中，血管化可发生在接受细胞移植物的淋巴结中，例如，在淋巴结内(在某些实施方式中，在异位组织内)可以有血管浸润并形成脉管系统网络。在某些实施方式中，浸润性脉管系统网络可形成向异位组织供血的基础。在某些实施方式中，浸润性脉管系统网络可帮助将代谢产物或材料运输至异位组织和/或从异位组织运输。例如，但不限于，异位肝脏可产生糖原、葡萄糖和/或胆汁，其可通过在移植部位(淋巴结)内部形成的脉管系统网络运输到主血流中。在某些实施方式中，异位胰腺可以产生和分泌胰岛素、胰高血糖素和/或生长抑素，它们也可以通过淋巴结内形成的脉管系统网络引入对象身体的主血流中。在某些实施方式中，淋巴循环系统还充当异位组织产生的物质的运输通道。在某些实施方式中，淋巴系统因此可以通过它们在身体其他部位的串扰向血液循环系统提供这些物质。

5.疾病和病症

该方法和系统可用于治疗对象的疾病或病症。在某些实施方式中，该方法和系统可用于在淋巴结中培养一种或多种异位组织，其补充或增强对象的器官功能，并因此可以改善疾病的一种或多种症状或治愈对象正在遭受的疾病或病症。

A.肝脏疾病和病症

在某些实施方式中，该方法和系统可用于将肝细胞递送到对象的淋巴结中，允许肝细胞在淋巴结中植入并产生异位肝脏。异位肝脏可以具有正常健康肝脏器官可以行使的一种或多种功能，例如但不限于：产生胆汁，有助于在消化过程中清除小肠中的废物和分解脂肪；产生血浆蛋白，例如白蛋白；产生胆固醇、磷脂和脂蛋白，有助于将脂肪输送到全身；通过将多余的葡萄糖转化为糖原进行储存(糖原生成)和在需要葡萄糖时糖原解聚(糖酵解)来调节血糖；将多余的碳水化合物和蛋白质转化为脂肪酸和甘油三酯；氨基酸的脱氨基和转氨基；将氨基酸的非含氮部分转化为葡萄糖或脂质；氧化甘油三酯以产生能量；加工血红蛋白以利用其铁含量(肝脏储存铁)；将有毒氨转化为尿素；血液透析以清除某些药物和其他有毒物质；合成凝血所需的凝血因子；通过产生免疫因子和清除血液中的细菌来抵抗感染；从红细胞中清除胆红素。

在某些实施方式中，该方法和系统可用于治疗多种不同的肝脏疾病或病症。这些肝脏疾病或病症可涉及肝功能衰竭或一种或多种肝功能的降低。可以通过本公开的方法治疗的肝病和/或病症的非限制性实例包括：急性肝衰竭、肝硬化、肝癌、肝炎、脂肪肝病和非酒精性脂肪肝病。肝脏病症可与代谢紊乱(例如小儿代谢紊乱)相关，包括但不限于酪氨酸血症、枫糖浆尿病、苯丙酮尿症、Crigler-Najjar综合征、草酸中毒、高草酸尿症、血色病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病、家族性肝内胆汁淤积综合征和家族性淀粉样多发性神经病。本发明的方法和系统特别适用于治疗终末期肝病和/或肝纤维化，例如由乙型肝炎感染、丙型肝炎感染、饮酒、肝硬化、非酒精性脂肪性肝炎或血色病引起的那些。

在某些实施方式中，本文提供的方法和系统当应用于有需要的对象时改善与肝脏疾病或病症相关的一种或多种症状，例如恢复一种或多种肝功能，和/或在某些实施方式中，延长在细胞移植之前患有危及生命的肝脏疾病或病症的对象的存活经历。例如，接受根据本公开的肝细胞移植的对象可以发现他们的肝功能测试的结果有所改善，例如丙氨酸转氨酶(ALT)测试、天冬氨酸转氨酶(AST)测试、碱性磷酸酶(ALP)测试、白蛋白测试，胆红素测试。与其他健康对象相比或与同一对象在患有肝脏疾病或病症之前的测试结果相比，这种改善可以是恢复至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约100％。在某些实施方式中，接受肝细胞移植的对象的寿命延长至少约6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、18年、20年、25年、30年、40年、50年、60年，甚至更久。

B.肾脏疾病和病症

在某些实施方式中，该方法和系统可用于将肾细胞或肾组织碎片递送到对象的淋巴结中，允许肾细胞在淋巴结中植入并产生异位肾。异位肾可以具有正常健康肾器官可以行使的一种或多种功能。例如，异位肾可以在某种程度上或完全行使肾脏的主要功能：产生尿液，这可能涉及从血液中过滤小分子量物质(例如，代谢废物)以产生超滤液，最终变成尿液，同时保留血液中的细胞和大蛋白；将某些物质(例如离子、葡萄糖)从超滤液中重吸收到管周毛细血管中。在某些实施方式中，异位肾还可以像正常肾一样参与全身稳态的维持，例如但不限于酸碱平衡、电解质浓度、细胞外液量和血压。

在某些实施方式中，该方法和系统可用于治疗多种不同的肾脏疾病或病症。此类肾脏疾病或病症可涉及肾衰竭或一种或多种肾功能的降低。可以通过本公开的方法治疗的肾病和/或病症的非限制性实例包括：急性肾衰竭、慢性肾病、肾小球肾炎、狼疮、多囊肾病、肾病、肾炎、肾畸形和肾癌。本方法和系统可特别用于治疗终末期肾病(肾功能衰竭)，例如由糖尿病、自身免疫性疾病(例如狼疮和IgA肾病)、遗传病(例如多囊肾病)、肾病综合征和泌尿道问题引起的肾病。

在某些实施方式中，本文提供的方法和系统当应用于有需要的对象时改善与肾脏疾病或病症相关的一种或多种症状，例如恢复一种或多种肾功能，和/或在某些实施方式中，延长在细胞移植之前患有危及生命的肾脏疾病或病症的对象的存活经历。例如，但不作为限制，接受根据本公开的肾细胞或碎片移植的对象发现他们的肾功能测试的结果有所改善，例如血清肌酐的血液测试、肾小球滤过率(GFR)，血尿素氮(BUN)。与其他健康对象相比或与同一对象在患有肾脏疾病或病症之前的测试结果相比，这种改善可以是恢复至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约100％。在某些实施方式中，接受肾细胞或碎片移植的对象的寿命延长至少约6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、18年、20年、25年、30年、40年、50年、60年，甚至更久。

C.胰腺疾病和病症

在某些实施方式中，该方法和系统用于将胰腺细胞(例如，胰腺β、α、δ、ζ或γ细胞)或胰岛递送到对象的淋巴结中，从而允许胰腺细胞或胰岛植入并产生淋巴结中的异位胰腺。异位胰腺可以具有正常健康胰腺器官可以行使的一种或多种功能。例如，但不作为限制，异位胰腺分泌胰岛素、胰高血糖素、生长抑素或胰多肽中的一种或多种。在某些实施方式中，异位胰腺响应生理刺激适当地分泌一种或多种内分泌激素。在某些实施方式中，异位胰腺响应于血糖浓度的增加而分泌胰岛素和/或响应于血糖浓度的降低而分泌胰高血糖素，这可以帮助维持血糖水平的稳态。这种分泌响应可以与生理刺激的变化成比例。例如，血糖升高越多，异位胰腺分泌的胰岛素就越多，其比例可以至少部分等于或类似于其他健康对象的正常健康胰腺或同一对象在患胰腺疾病之前的胰腺。

在某些实施方式中，该方法和系统可用于治疗多种不同的胰腺疾病或病症。这些胰腺疾病或病症可涉及胰腺功能衰竭或一种或多种胰腺功能的降低。通过本文提供的方法和系统治疗的胰腺疾病或病症可以是内分泌胰腺疾病或病症。可以通过本公开的方法治疗的胰腺疾病和/或病症的非限制性实例包括：急性胰腺炎、慢性胰腺炎、遗传性胰腺炎和胰腺癌。本方法和系统可特别用于治疗胰腺衰竭或需要胰腺移植的其他情况。

在某些实施方式中，本文提供的方法和系统当应用于有需要的对象时改善与胰腺疾病或病症相关的一种或多种症状，例如恢复一种或多种胰腺功能，和/或在某些实施方式中，延长在细胞移植之前患有危及生命的胰腺疾病或病症的对象的存活经历。例如，但不作为限制，接受根据本公开的胰腺细胞或胰岛移植的对象可以发现血糖控制的改善。与其他健康对象相比或与同一对象在患有胰腺疾病或病症之前的测试结果相比，这种改善可以是恢复至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或约100％。在某些实施方式中，接受胰腺细胞或胰岛移植的对象的寿命延长至少约6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年、9年、10年、12年、15年、18年、20年、25年、30年、40年、50年、60年，甚至更久。

D.免疫系统功能障碍/免疫缺陷疾病和病症

在某些实施方式中，该方法和系统用于将胸腺细胞或胸腺碎片递送到对象的淋巴结中，允许胸腺细胞或碎片在淋巴结中植入并产生异位胸腺。在某些实施方式中，异位胸腺补充或增强正常健康胸腺器官可以行使的一种或多种功能。例如，但不限于，异位胸腺可以参与身体的免疫调节，因为它参与了T细胞的生长、发育、成熟和选择。根据本公开的异位胸腺的产生可用于增强或调节具有免疫系统功能障碍的对象的免疫系统功能，例如在老年对象(例如，年龄大于50、55、60、65、70、75、80或85岁)，或在患有免疫缺陷疾病或病症的对象中，所述免疫缺陷疾病或病症包括例如X连锁无丙种球蛋白血症(XLA)、常见变异免疫缺陷(CVID)、严重联合免疫缺陷(SCID)、严重烧伤、化疗、放疗、糖尿病、营养不良、适应性免疫缺陷综合征(AIDS)、白血病、严重病毒感染和多发性骨髓瘤。

在某些实施方式中，在来自同一供体对象的器官或其他细胞移植之前，将来自供体对象的胸腺细胞或碎片引入受体对象的淋巴结。淋巴结中异位胸腺的产生可以诱导受体对象对供体对象的耐受性，这对随后的器官或细胞移植是有益的。在这些实施方式中，胸腺细胞移植可以在器官或其他细胞移植之前至少约5天、1周、2周、3周、4周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月或1年进行，从而可以在受体中建立对供体对象的适当免疫耐受。此处描述的胸腺细胞移植可以与任何类型的器官移植或任何其他细胞类型的移植联合应用，并且可以减少在接受其他相同器官或细胞移植但没有根据本公开的胸腺细胞移植的受体中看到的移植排斥反应。

接受本公开的细胞移植的对象的寿命可以延长至少约6个月、9个月、1年、2年、3年、4年、5年、6年、7年、8年年、9年、10年、12年、15年、18年、20年、25年、30年、40年、50年、60年，甚至更长。

E.肺部疾病和病症

在某些实施方式中，该方法和系统用于将肺细胞或肺组织碎片递送到对象的淋巴结中，从而允许肺细胞或碎片植入淋巴结并在淋巴结中产生异位肺。异位肺可以具有正常健康胰腺肺可以行使的一种或多种功能。例如，异位肺可以用于慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者。异位肺可增加肺功能质量，COPD患者进行性纤维化可严重降低肺功能质量。在某些实施方式中，经历肺缩小手术的患者不适合进行标准肺移植，可能适合在支气管周围淋巴结内移植肺细胞。

在某些实施方式中，该方法和系统可用于治疗多种不同的肺部疾病或病症。这些肺部疾病或病症可涉及肺衰竭或一种或多种肺功能的降低。可以通过本发明的方法治疗的肺部疾病和/或病症的非限制性实例包括慢性阻塞性肺病(COPD)。COPD可能由以下原因引起：香烟烟雾和进一步使用烟草、污染(化学物质、灰尘或有毒物质)和烟气、遗传疾病(例如，α-1-抗胰蛋白酶、囊性纤维化)、慢性哮喘、肺气肿、慢性支气管炎或特发性肺纤维化。

在某些实施方式中，本文提供的方法和系统可以改善与肺部疾病或病症相关的一种或多种症状，例如恢复一种或多种肺功能，和/或在某些实施方式中，延长在细胞移植之前患有危及生命的肺部疾病或病症的对象的存活经历。

6.对象

根据本发明可以接受细胞移植的对象可以是任何人患者，例如ESLD患者、肾衰竭患者、I型糖尿病患者或等待器官移植的患者。在某些实施方式中，对象处于医学治疗的特定阶段。

根据本发明接受细胞移植的对象可以是任何年龄并且可以是成人、新生儿、婴儿或儿童。在某些实施方式中，对象是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、65、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、58、59、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、69597、98或99岁，或其中的范围内(例如，2至20岁，20至40岁，或40至90岁)。此外，对象可以是男性或女性。

对象接受根据本公开的细胞移植的适合性可以由经过认证的医生确定。在某些实施方式中，在进行细胞移植之前可能需要对对象的健康状况进行综合评估。在某些实施方式中，对对象的健康状况的要求可以显著低于其他器官或细胞移植手术。不希望受特定理论的束缚，与通常为器官移植而进行的大手术相比，根据本公开的微创手术可以显著降低外科手术的风险。此外，考虑到细胞将被移植到一个或多个淋巴结，而不是患病器官，由于患病器官没有先决条件的限制，因此对象的健康状况的要求可以进一步显著降低。

本文公开的任何方法和系统也可用于非人对象，例如用于研究目的或兽医学目的的实验室或农场动物。非人对象的非限制性实例包括：狗、山羊、豚鼠、仓鼠、小鼠、猪、非人类灵长类动物(例如，大猩猩、猿、猩猩、狐猴、或狒狒)、大鼠、羊或牛。

7.系统

本公开还提供了用于在淋巴结中移植细胞和生长功能性异位组织的系统。该系统可以包括内窥镜和注射器，该注射器具有针和包含在其中的悬浮液中的一种或多种细胞。内窥镜和针可以被配置为沿着对象的体腔(例如，胃肠道、呼吸道或泌尿道)或封闭的体腔(例如，腹腔、骨盆腔或胸腔)一起推进，并且注射器可以被配置为通过针递送一种或多种细胞。

如上所述，在某些实施方式中，悬浮液每毫升可以具有至少约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、200 10亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、或100亿个细胞。在某些实施方式中，本文所述的注射器具有每毫升约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、200 10亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、或100亿个细胞的细胞悬浮液。在某些实施方式中，本文所述的注射器具有每毫升至多约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万、1亿、200 10亿、3亿、4亿、5亿、6亿、7亿、8亿、9亿、10亿、30亿、50亿、80亿、或100亿个细胞的细胞悬浮液。

在某些实施方式中，本文所述的注射器容纳每毫升具有至少约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞的肝细胞悬浮液，用于产生异位肝。在某些实施方式中，本文所述的注射器容纳每毫升具有约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞的肝细胞悬浮液，用于产生异位肝。在某些实施方式中，本文所述的注射器容纳每毫升具有至多约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞的肝细胞悬浮液，用于产生异位肝。

如上所述，在某些实施方式中，针的内径至多为约700μm、600μm、500μm、450μm、400μm、300μm、260μm、250μm或200μm。在某些实施方式中，针的内径至多为约260μm。在某些实施方式中，针的内径为约700μm、600μm、500μm、450μm、400μm、300μm、260μm、250μm或200μm。在某些实施方式中，针的内径为约260μm。针的外径至多为约1mm、900μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、520μm、510μm、500μm、480μm、450μm，或400μm。在某些实施方式中，针的外径至多为约510μm。在某些实施方式中，针的外径为约1mm、900μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、520μm、510μm、500μm、480μm、450μm，或400μm。在某些实施方式中，针的外径为约510μm。在某些实施方式中，针具有特定规格，如根据ISO 7864:2016所规定的。例如，但不作为限制，针为约19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5或27号规格(ga)。在某些实施方式中，针至多为约19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5或27号规格。例如，但不作为限制，系统的针至多可以是约25号规格。在某些实施方式中，针具有非标准尺寸，例如具有薄壁，同时保持大内径和小外径。

本文提供的系统和方法对于平均直径为约20μm的细胞例如肝细胞特别有用。不希望受某些理论的束缚，待递送的细胞的大小可以是决定悬浮液中工作细胞浓度、用于细胞递送的针的内径，以及细胞递送前和细胞递送后注射器中的细胞活力水平的影响因素。对于平均直径小于20μm的细胞，针尺寸可以小于25号，虽然与平均直径约20μm的细胞相比，悬浮液中的细胞浓度和总细胞数可能更高，各参数如上所述。另一方面，对于平均直径超过20μm的细胞，针尺寸可以例如大于25号，虽然与平均直径约20μm的细胞相比，悬浮液中的细胞浓度和总细胞数可能更低，各参数如上所述。

8.套件(Kit)

本公开进一步提供包含可用于执行本文公开的任何方法的材料的套件。在某些实施方式中，套件包括含有一种或多种本文公开的细胞的容器。在某些实施方式中，细胞可以在冷冻的容器中提供。在某些实施方式中，细胞可以在溶液(例如培养基)中提供。在某些实施方式中，容器可包含约1000万至约5亿个细胞。在某些实施方式中，容器可包含同质的细胞群。或者，容器可包含异质的细胞群。可在容器中提供的细胞的非限制性实例包括：肝细胞、肾细胞或肾组织碎片、胰腺细胞或胰岛、胸腺细胞或胸腺组织碎片、或肺细胞或肺组织碎片。

在某些实施方式中，套件还可包括第二容器，第二容器包含用于将细胞引入淋巴结的溶液，如本文所述。

在某些实施方式中，套件还可包括如本文所述的用于将细胞递送至淋巴结的装置(或系统)。在某些实施方式中，套件还可包括如本文所述的内窥镜。在某些实施方式中，内窥镜联接到针上。例如，但不作为限制，套件可包括如本文所述的用于将细胞递送至淋巴结的针和/或内窥镜。这种递送装置的非限制性示例在以上系统部分中公开。

实施例

提供以下实施例以进一步说明本发明的一些实施例，但并非用于限制本发明的范围；通过它们的示例性可以理解，可以替代地使用本领域技术人员已知的其他程序、方法或技术。

实施例1：用于移植和活力测试的肝细胞分离

该实施例证明，当细胞悬浮液通过根据本公开的某些尺寸的针递送时，分离的肝细胞的活力没有受到显著影响。该实施例证明根据本公开的一种示例性方法分离和递送的肝细胞可以具有适合移植的活力。

根据以下方案分离肝细胞。首先，从供体犬身上通过手术获得左肝叶，并在装有冰的双袋容器中在冷藏技术下运输(在4℃下用贝尔泽溶液(Belzer solution)静态保存)用于进一步处理。使用Seglen描述的两步胶原酶灌注方法(Seglen PO，制备分离的大鼠肝细胞(Preparation of isolated rat liver cells)，Methods Cell Biol,1976；13:29-63)分离肝细胞。简而言之，在任意大血管中放置一个入口插管或插管。在培养皿中，肝脏在37℃下用EDTA溶液(0.02％)以50ml/分钟的流速灌注10分钟。随后，胶原酶溶液(37℃)以相同的流速循环通过肝脏样品。十分钟后，肝囊被破坏，消化后的肝实质悬浮在含有葡萄糖酸钙和人血清白蛋白的冰冷的汉克斯溶液或Plasma-Lyte A溶液中。将所得肝细胞悬液过滤洗涤3次。

在下面描述的整个实验中，使用台盼蓝排除试验来确定悬浮液中不同步骤中分离的肝细胞的活力。在这些实验中，在通过不同规格的EUS FNA针之前和之后，测试了具有不同细胞浓度的不同批次悬浮液的细胞活力。图3是总结了从两批次细胞的实验中获得的细胞活力结果的图。如图所示，大多数(如果不是全部)测试溶液，在通过任何测试EUS针之前和之后，具有相似的细胞活力水平。

实验中使用的针：

19号规格(19ga)针(Covidien：参考号DSN-19-01)：死体积约为1.2mL。

22号规格(22ga)针(Covidien：参考号N22-05)：死体积约为0.5mL。

25号规格(25ga)针(Covidien：参考号DSN-25-01)：死体积约为1.1mL。

批次#1:

供体ID#:6303.

肝脏消化和单细胞肝细胞分离后的初始活力：59.5％。总共42.4亿活肝细胞(5.3M/mL，总共800mL溶液)。

3次洗涤循环后并准备好移植的细胞活力：72.04％。总共4.29亿活肝细胞(2.86M/mL，在800mL中总共占150mL溶液)。

将4.29亿活肝细胞重新悬浮在大约20毫升中，并使用19、22和25号EUS针测试其活力。表1总结了在本实验中测试的不同组中获得的活力分数。对照代表未通过任何EUS针但在测试后活力评估之前以相同方式处理的溶液。

表1：批次#1的活力结果

批次#2:

供体ID#:6302.

肝脏消化和单细胞肝细胞分离后的初始活力：67.5％。对于总共约50亿个活的分离肝细胞(5.5M/mL，共900mL溶液)，使用600ml溶液(约33亿个细胞)进行实验。

3次洗涤循环后并准备好移植的细胞活力：

总共6.24亿活肝细胞的活力为71.7％(4.16M/mL，150mL溶液中)。

存储在UW中过夜用于第二天移植。

总共5.67亿活肝细胞的活力为76.3％(8.1M/ml，70ml溶液中)。

14管，107肝细胞/ml，每管2ml冷冻保存。

总共13亿个细胞的存活率为69.7％(9.1M/ml，150ml溶液中)。

肝细胞以25M/ml和50M/ml重悬，并使用19、22和25号EUS针测试活力。表2和3总结了在本实验中测试的不同组中获得的活力分数。对照代表未通过任何EUS针但在测试后活力评估之前以相同方式处理的溶液。

表2：25M/mL溶液的批次#2的活力结果

表3：50M/mL溶液的实验#2的活力结果

实施例2：作为肝衰竭模型的犬门腔静脉分流术

本实施例描述了创建用于研究治疗肝衰竭的再生医学的动物模型的示例性外科手术。

如图4所示，可以执行完整的门腔分流术来切断进入肝脏的主要血流，这会导致肝损伤。使用合适的外科缝合器将允许在几乎不失血的情况下进行该手术。肝门内主要门静脉(PV)的松动之后是胆总管(CBD)和肝主动脉(HA)的分离。主要PV的近端解剖朝向肠系膜上静脉(SMV)和脾静脉(SV)之间的汇合处。进一步松动肝下下腔静脉(IVC)并进行远端解剖朝向肾静脉。在PV向IVC尾部松动之前，使用铰接式血管内钉在分叉(右和左分支)之前对主PV进行完整的结扎和横断。进行PV向IVC的完全尾部松动，并在PV与IVC之间进行端侧吻合(6-0Prolene的运行缝合)。该步骤包括部分夹紧IVC和完全夹紧近端PV。完全止血后，关闭腹腔。动物从全身麻醉完全恢复后在手术室拔管。

实施例3：EUS引导的肝细胞递送用于淋巴结器官发生的临床前研究

本实施例阐述了通过EUS引导将肝细胞递送到十二指肠周围淋巴结(LN)来治疗大型动物(犬)模型中的肝衰竭。

本文所述的大型动物模型(犬类)的临床前实验由美国农业部指导方针下的IACUC协议批准，并在宾夕法尼亚州匹兹堡海马克阿勒格尼健康网络(Allegheny HealthNetwork)的收费服务实验室进行。在这些实验中，肝细胞移植是在犬模型中进行的，该模型中在手术产生完整的门腔分流术(PCS)后已诱发肝功能衰竭。

简而言之，对两组动物进行了测试，以确认肝细胞移植到十二指肠周围淋巴结(PDLN)诱导产生具有正常肝细胞结构和完整功能的新异位肝芽(器官发生)。对照组接受完整的手术PCS，然后将生理盐水假输注到LN。在通过EUS途径将自体或同种异体肝细胞移植到PDLN之前，研究组进行相同的初始PCS手术。两组均接受由他克莫司和泼尼松组成的非特异性免疫抑制治疗。两组均在初始手术后随访6个月。对照组动物在研究期间经历渐进性肝衰竭，死亡率为30％。研究组动物没有表现出长期的肝功能衰竭迹象，也没有死亡。这些动物显示出最初移植肝细胞的PDLN位点扩大的迹象。在研究尸检结束时，这些动物显示出这些PDLN中异位肝组织的发育，具有正常的解剖学和组织学特征。PDLN中的异位肝脏在研究期间显示出可持续肝功能的临床和实验室证据。

如图5中的研究图表所示，第1组作为第4-7组的供体组，其中第4-7组接受肝细胞(HT)的同种异体移植。第2组接受PCS手术以及向其LN中注入安慰剂(生理盐水)。第3组为自体对照组。第4组和第5组以低剂量水平(75MHT；25M肝细胞/mL，1mL溶液注射到3个LN中的每一个中)或中等剂量水平(150M HT；50M肝细胞/mL，将1mL溶液注射到3个LN中的每一个中)将HT(如图2所示)直接注射到LN中。第6组和第7组通过微创内窥镜超声(EUS)方法(如图1A和1B所示)接受HT移植，其中低剂量和中剂量均如上所述。

最初的终点是在90天时(第2-7组中各自处死N＝2)，从第91-180天开始进行额外的长期安全随访，在第120天(第2-7组中各自N＝1)、第150天(第2-7组中各自N＝1)临时处死研究动物，以及在第180天研究结束时处死动物(第2-7组中各自N＝1)。

从每个时间点处死的动物中收集淋巴结，固定在多聚甲醛中，并包埋在最佳切割温度化合物或石蜡中。制备切片，并用苏木精和伊红(H&E)或苏木精和抗延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)免疫染色进行染色。FAH在肝细胞中高度表达，因此可用于鉴定肝细胞。切片成像，并组织学评估移植肝细胞的存在和异位肝组织的形成。

统计学分析

最初的终点是在90天时具有新植入的肝细胞的淋巴结的大小和重量(g)。中大型犬(23.7kg)的全尺寸肝脏重约767±48g，这也可作为完全移植的异位肝脏重量的估计值和治疗组内肝脏重量的标准偏差。六个治疗组中的四个接受75M(低剂量)或150M(中等剂量)的同种异体肝细胞，通过直接注射或内窥镜输注到它们的淋巴结中。对4个同种异体组的协方差(ANCOVA)进行双向分析，根据动物的总重量(kg)进行调整，用于测试主要效应以及剂量水平和输注类型的相互作用的终点差异。每个治疗组的五(5)只狗使用α＝0.05(2侧)的F检验，提供92％的功效来检测每个主要效应的两个水平之间的77g终点差异(0.8效应量)，以及当效应量为0.6时，提供75％的功效来检测剂量水平和输注类型之间的相互作用。不希望受特定理论的束缚，基于先前报道的发现(Kam等人，1987，Sohlenius-Sternbeck，2006)，肝脏重量和总重量之间可能存在潜在的线性关系以及显著的相关性。这是对整体功效的保守估计，因为它没有考虑协变量调整。

具有相同终点和协变量的单向方差分析也用于对治疗组差异以及六组之间的相关成对比较进行整体F检验。这6组包括上述4个同种异体组加上通过内窥镜输注75M自体肝细胞的组和通过内镜输注生理盐水的对照组。每组五(5)只狗可以提供100％的功效，以使用α＝0.05(2侧)的整体F检验检测至少一个154g(20％植入)与相等均值的零假设的差异。对于使用Tukey Kramer(成对)多重比较方法以保持0.05显著性水平的所有降压测试，此样本大小可以达到90％的功效，以检测至少230g(30％植入)的差异。这些功效计算是通过PASS 12(Hintze,2013)得出的。

外科手术与实验方法

(I)线路布置和动物支持

用PE导管插入右颈静脉并开始使用0.9％NaCl IV支持液。在整个手术过程中，通过注射泵或推注疗法施用和维持麻痹剂。外周动脉用PE导管插管。双腔、远距离中心静脉通路(上腔静脉)通过右宫颈切开术和直接进入右颈外静脉进一步放置。腹部手术完成后，永久性中心线通路在后颈部区域插入和外化。通过放置在动物体表上的电极监测心电登记。持续监测直肠温度。动物支持符合SOP ANI-017美国农业部监管物种存活手术指南(Guidelines for Performing Survival Surgery in USDA Regulated Species)和ANI-032麻醉患者体温调节指南(Thermal Regulation of the Anesthetized Patient)。

(II)左肝叶段切除术用于后续肝细胞分离

动物在全身麻醉下稳定后以无菌方式准备和覆盖。通过中线切口进入腹腔。最初解剖肝门并分离左侧段(LLS)。左门静脉(PV)和左肝动脉(HA)被隔离并用血管胶带环绕。LLS是通过受控的实质横切结合使用铰接式血管内钉来切除的。左侧段切除术导致大约20％的肝脏总体积被切除。一旦肝脏左侧段从手术区域中取出，标本将在无菌条件下在后备(back table)(BT)程序中进行处理。BT包括用冷乳酸林格(LR)冲洗左侧PV和左侧HA以去除所有血液(冲洗步骤)，然后注入Belzer溶液用于随后的肝脏保存。肝段被包装在一个双层塑料袋中，并放置在冰冷却器上，以便随后运输到实验室进行随后的细胞分离(以获得肝细胞)。

(III)门腔分流术

在完成左外侧段切除术后，进行肝门的扩展手术切除。根据实施例2中描述的方法进行完整的门腔分流术。

(IV)肝细胞分离用于移植

根据实施例1中描述的方法分离肝细胞。过滤并洗涤所得肝细胞悬浮液。台盼蓝排除试验用于确定分离的肝细胞的活力。在自体移植组中(其中动物接受了自己的肝细胞)，动物在全身麻醉下再保持5小时，同时分离细胞并准备随后的输注。

(V)通过直接手术输注进行肝细胞移植

在获得用于质量控制(细胞活力、细胞计数、培养和敏感性)的样本后，由外科医生进行肝细胞移植。根据指定的实验组确定，肠系膜和十二指肠周围淋巴结通过直接手术方法或通过内窥镜注射(如下所述)接受直接实质内细胞输注(在小体积(1至3毫升)输液培养基中，细胞产量为25x10⁶至50x10⁶个活细胞/毫升)。将异位肝细胞注入淋巴结后，完全实现了适当的止血。在实现细致的止血后，用抗生素和抗真菌剂(新霉素500毫克/升、多粘菌素15,000单位/千克/升、杆菌肽1000单位/千克/升和两性霉素B4毫克/千克/升)大量冲洗腹腔。腹壁以三层方式封闭，不使用引流管。密封手术敷料放置在皮肤闭合处。动物从全身麻醉手术中适当恢复，并在手术室进一步拔管。随后将动物转移到配备适当的动物设施以接受术后护理。

(VI)通过腔内内窥镜途径的肝细胞移植

内窥镜注射是在PCS完成后在全身麻醉下对动物进行的。在EUS方面具有丰富经验的经过认证的胆胰内窥镜医师执行这些过程。线性回声内窥镜(Olympus GF-UCT 180)用于这些实验。内窥镜通过动物的嘴进入并推进到胃和十二指肠。内窥镜超声(EUS)探头有助于并指导十二指肠周围淋巴结(LN)的定位。通过经胃和/或经十二指肠途径直接到达淋巴结。一旦用细针抽吸(FNA)针(波士顿科学，19-25G针)正确进入LN，手术外科医生将在通过此EUS引导针成功插入LN后协助内窥镜医师进行肝细胞移植过程。先前分离的肝细胞保存在含有25x10⁶个细胞/mL或50x10⁶个细胞/mL的溶液中。使用细针抽吸(FNA)针(波士顿科学，19-25G针)将溶液中的肝细胞直接移植到十二指肠周围LN。一旦手术过程完成，动物就会从全身麻醉过程中适当恢复，并在手术室进一步拔管。随后将动物转移到配备适当的动物设施以接受它们的术后护理。

(VII)恢复和术后护理

允许动物在适当监测下从麻醉中恢复，同时恢复自主通气。在手术后的前2-3天(如果有指示，可以是更长的时间)，由训练有素的临床前设施工作人员每天24小时监测动物，然后在研究期间至少每天监测。动物的术后护理在研究主任的指导下与兽医协商。

这些动物受到密切和频繁的监测。每只动物都根据以下用于评估和缓解疼痛的物种特异性标准进行评估：发声、抑郁、呼吸增加>50％(基于20次/分钟，犬的平均呼吸速率)。此外，还监测心率。温度也受到监控。

疼痛管理和监测

使用疼痛评分系统，最初每小时监测动物的以下术后疼痛和痛苦指标，包括但不限于：总体活动水平、手术伤口、食欲和对饮食的态度。

基于以下指标，使用镇痛剂治疗术后疼痛：心率增加约10-15％；和呼吸频率增加约40％。疼痛是通过定期给予：丁丙诺啡或布托啡诺和酮洛芬，或与兽医协商确定的其他辅助镇痛药来控制的。

所有动物接受术后丁丙诺啡(0.01mg/kg IV q6-8h)镇痛。如果需要附加或替代的镇痛剂，可辅以酮洛芬(1-2mg/kg IV)和布托啡诺(0.1mg/kg IV q6h)。

附加支持和预防措施

动物在第1周每天接受IV抗生素，并在术后期间接受附加药物治疗。术后动物接受根据临床和实验室参数调整的维持静脉输液。

此外，在整个术后期间，监测胃动力(肠梗阻等)。

在手术操作结束时放置一条中心线。在研究期间清洁和维护该静脉通路，除非有感染迹象、动物痛苦或狗造成的创伤。

免疫抑制(IS)治疗：

在肝细胞移植之前，动物在手术室接受甲强龙(Solumedrol)(1g IV)。术后IS方案如下：

在本研究期间，普乐可复(Prograf)(约0.3mg/kg)Po q12-进行相应的监测和调整以防止毒性。

泼尼松20mg po qd x 1周

泼尼松10mg po qd x 1周

在本研究期间，强的松5mg po qd。

实施例4：EUS引导的肝细胞递送用于淋巴结器官发生的临床前研究

本实施例阐述了通过EUS引导将肝细胞递送到十二指肠周围淋巴结(LN)来治疗大型动物(犬)模型中的肝衰竭。

本文所述的大型动物模型(犬类)的临床前实验由美国农业部指导方针下的IACUC协议批准，并在宾夕法尼亚州匹兹堡海马克阿勒格尼健康网络(Allegheny HealthNetwork)的收费服务实验室进行。在这些实验中，肝细胞移植是在犬模型中进行的，该模型中在手术开发出完整的门腔分流术(PCS)后已诱发肝功能衰竭。

简而言之，对各组动物进行了测试，以确认肝细胞移植到十二指肠周围淋巴结(PDLN)诱导产生具有正常肝细胞结构和完整功能的新异位肝芽(器官发生)。在通过EUS途径或直接注射将自体或同种异体肝细胞移植到PDLN之前，研究组进行了完整的PCS手术。所有组均接受由他克莫司和泼尼松组成的非特异性免疫抑制治疗。各组在初始手术后随访150天。

动物通过直接注射到LN(如图2所示)或通过微创内窥镜超声(EUS)途径(如图1A和1B所示)接受HT。这些动物接受了7500万个HT(25M肝细胞/mL，1mL溶液注射到3个LN中的每一个中)或1.5亿个HT(50M肝细胞/mL，1mL溶液注射到3个LN的每一个中)。

在第6、60、90或150天处死动物。

图6A显示正常肝组织中CK-18(肝细胞的标志物)的阳性染色，图6B和6C显示分别通过EUS和直接注射移植后6天淋巴结中CK-18免疫染色的肝细胞的存在。这些早期结果表明，直接注射和EUS注射组的淋巴结中均存在肝细胞。原代肝细胞通过EUS进入淋巴结成功形成肝组织。

图7A-7D显示了通过EUS移植肝细胞后肝组织的形成。从在每个时间点处死的动物中收获淋巴结，固定在多聚甲醛中，并包埋在石蜡中。制备切片，并用苏木精和伊红(H&E)或苏木精和抗延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)免疫染色进行染色。FAH在肝细胞中高度表达，因此可用于鉴定肝细胞。切片成像，并组织学评估移植肝细胞的存在和异位肝组织的形成。

图7A显示了通过EUS移植自体肝细胞后淋巴结的组织学图像。EUS移植每个淋巴结约25x10⁶个自体肝细胞，移植后约90天收集淋巴结。淋巴结切片用苏木精和伊红(H&E)染色。H&E染色的更高放大倍数(右)显示肝组织(箭头)由植入的肝细胞形成。

图7B显示了通过EUS移植同种异体肝细胞后淋巴结的组织学图像。EUS移植每个淋巴结约50x10⁶个同种异体肝细胞，移植后约90天收集淋巴结。淋巴结切片用H&E染色。肝组织(箭头)由不同部位的淋巴结中植入的肝细胞形成。

图7C显示了通过EUS移植自体肝细胞后淋巴结的组织学图像。EUS移植每个淋巴结约50x10⁶个自体肝细胞，移植后约60天收集淋巴结。淋巴结切片用H&E(右图)或苏木精和抗延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)免疫染色(左图)进行染色。肝组织(箭头)在不同部位的淋巴结中形成，包括FAH-阳性肝细胞。

图7D显示了通过EUS移植同种异体肝细胞后淋巴结的组织学图像。EUS移植每个淋巴结约25x10⁶个同种异体肝细胞，移植后约150天收集淋巴结。淋巴结切片用H&E(右图)或苏木精和抗延胡索酰乙酰乙酸水解酶(FAH)免疫染色(左图)进行染色。肝组织(箭头)在不同部位的淋巴结中形成，包括FAH-阳性肝细胞。

研究组动物没有表现出长期的肝功能衰竭迹象，也没有死亡。这些动物显示出最初移植的肝细胞的PDLN位点扩大的迹象。在研究尸检结束时，这些动物显示出这些PDLN中异位肝组织的发育，具有正常的解剖学和组织学特征。PDLN中的异位肝脏显示出在研究期间肝组织可持续的证据。

外科手术与实验方法

(I)线路布置和动物支持

用PE导管插入右颈静脉并开始使用0.9％NaCl IV支持液。在整个手术过程中，通过注射泵或推注疗法施用和维持麻痹剂。外周动脉用PE导管插管。双腔、远距离中心静脉通路(上腔静脉)通过右宫颈切开术和直接进入右颈外静脉进一步放置。腹部手术完成后，永久性中心线通路在后颈部区域插入和外化。通过放置在动物体表上的电极监测心电登记。持续监测直肠温度。动物支持符合SOP ANI-017美国农业部监管物种存活手术指南(Guidelines for Performing Survival Surgery in USDA Regulated Species)和ANI-032麻醉患者体温调节指南(Thermal Regulation of the Anesthetized Patient)。

(II)左肝叶段切除术用于后续肝细胞分离

动物在全身麻醉下稳定后以无菌方式准备和覆盖。通过中线切口进入腹腔。最初解剖肝门并分离左侧段(LLS)。左门静脉(PV)和左肝动脉(HA)被隔离并用血管胶带环绕。LLS是通过受控的实质横切结合使用铰接式血管内钉来切除的。左侧外侧段切除术导致大约20％的肝脏总体积被切除。一旦肝脏左侧段从手术区域中取出，标本将在无菌条件下在后备(BT)程序中进行处理。BT包括用冷乳酸林格(LR)冲洗左侧PV和左侧HA以去除所有血液(冲洗步骤)，然后注入Belzer溶液用于随后的肝脏保存。肝段被包装在一个双层塑料袋中，并放置在冰冷却器上，以便随后运输到实验室进行随后的细胞分离(以获得肝细胞)。

(III)门腔分流术

在完成左外侧段切除术后，进行肝门的扩展手术切除。根据实施例2中描述的方法进行完整的门腔分流术。

(IV)肝细胞分离用于移植

根据实施例1中描述的方法分离肝细胞。过滤并洗涤所得肝细胞悬浮液。台盼蓝排除试验用于确定分离的肝细胞的活力。在自体移植组中，动物接受了自己的肝细胞，动物在全身麻醉下再保持5小时，同时分离细胞并准备随后的输注。

(V)通过直接手术输注进行肝细胞移植

在获得用于质量控制(细胞活力、细胞计数、培养和敏感性)的样本后，由外科医生进行肝细胞移植。根据指定的实验组确定，肠系膜和十二指肠周围淋巴结通过直接手术方法或通过内窥镜注射(如下所述)接受直接实质内细胞输注(在小体积(1至3毫升)输液培养基中，细胞产量为25x10⁶至50x10⁶个活细胞/毫升)。将异位肝细胞注入淋巴结后，完全实现了适当的止血。在实现细致的止血后，用抗生素和抗真菌剂(新霉素500毫克/升、多粘菌素15,000单位/千克/升、杆菌肽1000单位/千克/升和两性霉素B4毫克/千克/升)大量冲洗腹腔。腹壁以三层方式封闭，不使用引流管。密封手术敷料放置在皮肤闭合处。动物从全身麻醉手术中适当恢复，并在手术室进一步拔管。随后将动物转移到配备适当的动物设施以接受术后护理。

(VI)通过腔内内窥镜途径(EUS)的肝细胞移植

内窥镜注射是在PCS完成后在全身麻醉下对动物进行的。在EUS方面具有丰富经验的经过认证的胆胰内窥镜医师执行这些过程。线性回声内窥镜(Olympus GF-UCT 180)用于这些实验。内窥镜通过动物的嘴进入并推进到胃和十二指肠。内窥镜超声(EUS)探头有助于并指导十二指肠周围淋巴结(LN)的定位。通过经胃和/或经十二指肠途径直接到达淋巴结。一旦用细针抽吸(FNA)针(波士顿科学，19-25G针)正确进入LN，手术外科医生将在通过此EUS引导针成功插入LN后协助内窥镜医师进行肝细胞移植过程。先前分离的肝细胞保存在含有25x10⁶个细胞/mL或50x10⁶个细胞/mL的溶液中。使用细针抽吸(FNA)针(波士顿科学，19-25G针)将溶液中的肝细胞直接移植到十二指肠周围LN。一旦手术过程完成，动物就会从全身麻醉过程中适当恢复，并在手术室进一步拔管。随后将动物转移到配备适当的动物设施以接受它们的术后护理。

(VII)恢复和术后护理

允许动物在适当监测下从麻醉中恢复，同时恢复自主通气。在手术后的前2-3天(如果有指示，可以是更长的时间)，由训练有素的临床前设施工作人员每天24小时监测动物，然后在研究期间至少每天监测。动物的术后护理在研究主任的指导下与兽医协商。

这些动物受到密切和频繁的监测。每只动物都根据以下用于评估和缓解疼痛的物种特异性标准进行评估：发声、抑郁、呼吸增加>50％(基于20次/分钟，犬的平均呼吸速率)。此外，还监测心率。还监测温度。

疼痛管理和监测

使用疼痛评分系统，最初每小时监测动物的以下术后疼痛和痛苦指标，包括但不限于：总体活动水平、手术伤口、食欲和对饮食的态度。

基于以下指标，使用镇痛剂治疗术后疼痛：心率增加约10-15％；和呼吸频率增加约40％。疼痛是通过定期给予：丁丙诺啡或布托啡诺和酮洛芬，或与兽医协商确定的其他辅助镇痛药来控制的。

所有动物接受术后丁丙诺啡(0.01mg/kg IV q6-8h)镇痛。如果需要额外的或替代的镇痛剂，可辅以酮洛芬(1-2mg/kg IV)和布托啡诺(0.1mg/kg IV q6h)。

额外的支持和预防措施

动物在第1周每天接受IV抗生素，并在术后期间接受额外的药物治疗。术后动物接受根据临床和实验室参数调整的维持静脉输液。

此外，在整个术后期间，监测胃动力(肠梗阻等)。

在手术过程结束时放置一条中心线。在研究期间清洁和维护该静脉通路，除非有感染迹象、动物痛苦或狗造成的创伤。

免疫抑制(IS)治疗：

在肝细胞移植之前，动物在手术室接受甲强龙(Solumedrol)(1g IV)。术后IS方案如下：

在本研究期间，普乐可复(Prograf)(约0.3mg/kg)Po q12-进行相应的监测和调整以防止毒性。

泼尼松20mg po qd x 1周

泼尼松10mg po qd x 1周

在本研究期间，强的松5mg po qd。

虽然在此已经示出和描述了本公开的优选的实施方式，但是对于本领域技术人员来说，这些实施方式仅作为示例提供是显而易见的。在不脱离本公开的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、变换和替换。应当理解，在实践本公开时可以采用本公开的实施方式的各种替代方案。以下权利要求旨在限定本公开的范围，并且由此涵盖在这些权利要求及其等同物的范围内的方法和结构。

本申请通篇引用了各种专利、专利申请、出版物、产品说明、协议和序列登录号，其全部内容通过引用整体并入本文用于所有目的。

Claims (74)

1.一种在对象中移植一种或多种细胞并生长异位组织的微创方法，包括：

(a)通过腔内途径将内窥镜推进到对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道，

(b)利用经腔途径将附接到内窥镜的针穿过内脏壁插入对象的淋巴结，和

(c)通过针将一种或多种细胞递送到淋巴结中，从而使一种或多种细胞植入并在淋巴结中产生异位组织。

2.如权利要求1所述的方法，其中，在放射成像或超声成像的帮助下执行推进内窥镜、插入针或执行两者。

3.如权利要求2所述的方法，其中，所述放射成像包括动态放射成像、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或两者。

4.如权利要求1-3中任一项所述的方法，其中，所述淋巴结在所述对象的腹腔或胸腔中。

5.如权利要求4所述的方法，其中，所述淋巴结位于对象的纵隔或腹膜后区域。

6.一种在对象中移植一种或多种细胞并生长异位组织的微创方法，包括：

(a)在超声或放射成像的帮助下，将针插入对象的腹腔或胸腔的淋巴结中，和

(b)通过针将一种或多种细胞递送到淋巴结中，从而使一种或多种细胞植入并在淋巴结中产生异位组织。

7.如权利要求6所述的方法，其中，该方法还包括：推进内窥镜穿过对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道，并利用经腔途径将附接到内窥镜的针穿过内脏壁插入对象的淋巴结。

8.如权利要求2-7中任一项所述的方法，其中，在淋巴结的超声成像的帮助下执行推进内窥镜、插入针或执行两者。

9.如权利要求8所述的方法，所述放射成像包括动态放射成像、计算机断层扫描(CT)、磁共振成像(MRI)或两者。

10.如权利要求1、2、7、8或9中任一项所述的方法，其中，所述内窥镜包括被配置为检测所述淋巴结的超声探头。

11.如权利要求1-10中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括肝细胞、胰腺细胞或胰岛、肾细胞或肾组织碎片、胸腺细胞或胸腺组织碎片、或肺细胞或肺组织碎片。

12.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞对于所述对象是自体的、同种异体的或异种的。

13.如权利要求1-11中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞与所述对象是同系的。

14.如权利要求1-11中任一项所述的方法，还包括从活供体组织中分离所述一种或多种细胞。

15.如权利要求1-11中任一项所述的方法，还包括在递送之前从冷冻保存中回收所述一种或多种细胞。

16.如权利要求1-15中任一项所述的方法，其中，所述方法包括将一种或多种细胞递送到腹腔或胸腔中的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个淋巴结中。

17.如权利要求1-16中任一项所述的方法，还包括向对象施用免疫抑制剂以减少所述一种或多种细胞的免疫排斥。

18.如权利要求1-17中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括平均直径为约20μm的细胞。

19.如权利要求1-18中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括肝细胞并且所述异位组织是异位肝组织。

20.如权利要求18或19所述的方法，其中，每次递送到单个淋巴节的一种或多种细胞包含至少约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。

21.如权利要求18-20中任一项所述的方法，其中，所述针递送针悬浮液形式的一种或多种细胞，其中每毫升的悬浮液具有至少约1000万、2000万、2500万、3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。

22.如权利要求18-21中任一项所述的方法，其中，所述针递送悬浮液形式的一种或多种细胞，其中每毫升悬浮液具有至少约1000万、2000万、3000万、4000万或5000万个活细胞。

23.如权利要求18-22中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞以细胞群的形式被递送到淋巴结中，其中所述细胞群具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％、或约100％的活细胞。

24.如权利要求23所述的方法，其中，所述一种或多种细胞以细胞群的形式递送到淋巴结中，其中，当一种或多种细胞通过针时，所述递送导致细胞群中的细胞活力百分比降低小于约20％、15％、10％、9％、8.5％、8％、7.5％、7％、6.5％、6％、5.5％、5％、4.5％、4％、3.5％、3％、2.5％、2％、1.5％、1％或0.5％。

25.如权利要求18-23中任一项所述的方法，其中，所述针的内径不大于约700μm、600μm、500μm、450μm、400μm、300μm、260μm、250μm或200μm。

26.如权利要求18-25中任一项所述的方法，其中，所述针的内径不大于约260μm。

27.如权利要求18-26中任一项所述的方法，其中，所述针的外径不大于约1mm、900μm、800μm、750μm、700μm、650μm、600μm、550μm、520μm、510μm、500μm、480μm、450μm，或400μm。

28.如权利要求18-27中任一项所述的方法，其中，所述针的外径不大于约510μm。

29.如权利要求18-28中任一项所述的方法，其中，所述针的尺寸不大于约19、19.5、20、20.5、21、21.5、22、22.5、23.5、24、24.5、25、25.5、26、26.5或27号规格。

30.如权利要求18-29中任一项所述的方法，其中，所述针的尺寸不大于约25号规格。

31.如权利要求18-30中任一项所述的方法，其中，所述针不大于约25号规格，并且所述针递送悬浮液形式的一种或多种细胞，其中每毫升悬浮液具有至少约5000万个活细胞，以及其中一种或多种细胞包含至少约65％的活细胞。

32.如权利要求19-31中任一项所述的方法，其中，所述方法治疗所述对象的肝脏疾病或病症。

33.如权利要求32所述的方法，其中，所述肝脏疾病或病症是与饮酒相关的终末期肝病或肝纤维化，甲型、乙型、丙型或丁型肝炎感染，非酒精性脂肪肝，自身免疫性肝炎，原发性胆汁性肝硬化，原发性硬化性胆管炎，胆道闭锁，囊性纤维化，阿拉吉耶综合征，梅毒，布鲁氏菌病，寄生虫感染，化学品暴露，慢性胆道疾病，布加综合征，奥斯勒病或右心衰竭。

34.如权利要求32所述的方法，其中，所述肝脏疾病或病症与代谢紊乱有关，包括酪氨酸血症、枫糖浆尿病、苯丙酮尿症、Crigler-Najjar综合征、草酸中毒、高草酸尿症、血色病、α-1抗胰蛋白酶缺乏症、威尔逊病、家族性肝内胆汁淤积综合征、半乳糖血症、糖原贮积病、或家族性淀粉样多发性神经病。

35.如权利要求19-32中任一项所述的方法，其中，所述对象已经接受了减少对象肝脏的血液供应并诱导肝细胞功能障碍的经颈静脉肝内门体分流术(TIPS)或门腔分流外科手术，其中，所述门腔分流外科手术包括端到侧门腔分流术、侧到侧门腔分流术、伴插入H-或C-移植物的中腔静脉分流术、或中央或远端脾肾分流术。

36.如权利要求35所述的方法，其中，所述方法治疗所述对象的终末期肝脏疾病。

37.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括肾细胞或肾组织碎片并且所述异位组织是异位肾组织。

38.如权利要求37所述的方法，其中，所述方法治疗所述对象的肾脏疾病或病症。

39.如权利要求38所述的方法，其中，所述肾脏疾病或病症是终末期肾脏疾病。

40.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括胰腺细胞或胰岛并且所述异位组织是异位胰腺组织。

41.如权利要求40所述的方法，其中，所述方法治疗导致对象中胰岛素分泌减少或缺乏的内分泌胰腺疾病或病症。

42.如权利要求41所述的方法，其中，所述胰腺疾病或病症是导致对象胰岛素分泌减少的I型糖尿病、II型糖尿病或慢性胰腺炎。

43.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括肺细胞或肺组织碎片并且所述异位组织是异位肺组织。

44.如权利要求43所述的方法，其中，所述方法治疗所述对象的肺部疾病或病症。

45.如权利要求44所述的方法，其中，所述肺部病或病症是慢性阻塞性肺病(COPD)。

46.如权利要求45所述的方法，其中，所述COPD由以下原因引起：香烟烟雾、污染和烟气、α-1-抗胰蛋白酶、囊性纤维化、慢性哮喘、肺气肿、慢性支气管炎、或特发性肺纤维化。

47.如权利要求1-16中任一项所述的方法，其中，所述一种或多种细胞包括胸腺细胞或胸腺组织片段，并且所述异位组织是异位胸腺组织。

48.如权利要求47所述的方法，其中，所述胸腺细胞或胸腺组织片段获自供体对象并且异位胸腺组织在对象中诱导供体对象对来自供体对象的细胞移植的供体特异性耐受性。

49.如权利要求47所述的方法，其中，所述疾病或病症是与年龄相关的免疫系统功能紊乱，并且异位胸腺组织调节对象的免疫功能。

50.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中，所述淋巴结靠近胃肠道，并且沿胃肠道推进内窥镜。

51.如权利要求50所述的方法，其中，所述淋巴结包括以下一种或多种：十二指肠周围淋巴结、胃周围淋巴结、胰周淋巴结、肠系膜淋巴结、回结肠淋巴结、中结肠淋巴结、胃淋巴结、肝脾淋巴结、脾门淋巴结、食管旁淋巴结淋巴结、心旁淋巴结、主动脉旁淋巴结、主动脉后淋巴结、外侧主动脉淋巴结、主动脉前淋巴结、小弯淋巴结、肝总淋巴结、脾动脉淋巴结、腹腔干淋巴结淋巴结、髂淋巴结或腹膜后淋巴结。

52.如权利要求50所述的方法，其中，所述淋巴结包括十二指肠周围淋巴结。

53.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中，所述淋巴结靠近呼吸道，并且沿呼吸道推进内窥镜。

54.如权利要求53所述的方法，其中，所述淋巴结包括纵隔区域中的一个或多个淋巴结。

55.如权利要求53或54所述的方法，其中，所述淋巴结包括以下一种或多种：胸骨旁淋巴结、肋间淋巴结、上膈淋巴结、上气管支气管淋巴结、下气管支气管淋巴结、支气管肺淋巴结、气管旁淋巴结或肺内淋巴结。

56.如权利要求1-49中任一项所述的方法，其中，所述淋巴结靠近尿道，并且沿尿道推进内窥镜。

57.如权利要求56所述的方法，其中，所述淋巴结包括腹膜后区域中的一个或多个淋巴结。

58.如权利要求56或57所述的方法，其中，所述淋巴结包括以下一种或多种：髂外淋巴结、髂内淋巴结、腔静脉腰淋巴结、主动脉腰淋巴结、腹股沟浅淋巴结、腹股沟深淋巴结、主动脉腔间膀胱周围淋巴结、闭孔膀胱周围淋巴结淋巴结、或骶前膀胱周围淋巴结。

59.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中，所述对象是人。

60.如权利要求1-57中任一项所述的方法，其中，所述对象是非人动物。

61.如权利要求1-60中任一项所述的方法，其中，所述异位组织在将多种细胞中的一种递送到淋巴结后约5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、或200天内形成。

62.一种治疗有需要的对象的肝脏疾病的方法，包括：

(a)通过腔内途径将内窥镜推进到对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道，

(b)在超声成像的帮助下，利用经腔途径将附接到内窥镜的针穿过内脏壁插入对象的淋巴结中，和

(c)通过针将一种或多种细胞递送到淋巴结中，从而使一种或多种细胞植入并在淋巴结中产生异位肝脏组织。

63.如权利要求62所述的方法，其中，所述异位组织在将多种细胞中的一种递送到淋巴结后约5天、10天、15天、20天、25天、30天、35天、40天、45天、50天、55天、60天、65天、70天、75天、80天、85天、90天、95天、100天、110天、120天、130天、140天、150天、160天、170天、180天、190天、或200天内形成。

64.一种用于在对象中移植肝细胞和生长异位肝脏的系统，包括内窥镜和注射器，注射器具有针和包含在其中的悬浮液中的细胞群，其中每毫升悬浮液具有约2500万至约1亿个活肝细胞，以及其中针至多为约25号规格。

65.如权利要求64所述的系统，其中，所述内窥镜和针被配置为沿着对象的胃肠道、呼吸道或泌尿道推进。

66.如权利要求64或65所述的系统，其中，所述注射器被配置为经针递送一种或多种细胞。

67.如权利要求64-66中任一项所述的系统，其中，所述内窥镜包括超声探头。

68.如权利要求64-67中任一项所述的系统，其中，所述超声探头被配置为检测所述对象腹腔中的淋巴结。

69.如权利要求64-68中任一项所述的系统，其中，每毫升悬浮液具有至少约3000万、4000万、4500万、5000万、5500万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。

70.如权利要求64-69中任一项所述的系统，其中，注射器中的细胞群具有至少约50％、55％、60％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、80％、85％、90％、95％、或约100％的活细胞。

71.如权利要求64-69中任一项所述的系统，其中，所述注射器中的细胞群具有至少约65％的活细胞。

72.如权利要求64-71中任一项所述的系统，其中，注射器中的细胞群包含至少约1000万、2000万、3000万、4000万、5000万、6000万、7000万、8000万、9000万或1亿个细胞。

73.如权利要求64-72中任一项所述的系统，其中，注射器中的细胞群包含至少约5000万个活细胞/mL，并且细胞群包含至少约65％的活细胞。

74.一种用于执行如权利要求1-63中任一项所述的方法的套件。

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