CN105145486A - Rag2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用 - Google Patents

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王婷婷
邱彬
邓然
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Abstract

本发明公开了RAG2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用。利用RAG2基因敲除的大鼠为载体，移植患者自身的肿瘤组织，成功建立了具有个性化的人源化RAG2基因敲除大鼠肿瘤治疗模型。该治疗模型建立了不同通路异常的肿瘤模型，忠实地模拟了患者自身肿瘤疾病的情况，可通过每个患者的特点来评价抗肿瘤功效的药物和治疗方法。利用RAG2基因敲除大鼠建立个性化肿瘤治疗模型的方法工序简单，所建立的RAG2基因敲除大鼠肿瘤治疗模型具有周期短，成瘤率高，费用低的优点，对于不同种类的肿瘤组织均可以成瘤，因此可以广泛被应用于肿瘤的个性化治疗中。

Description

RAG2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用
技术领域
本发明涉及RAG2基因敲除大鼠在建立个性化肿瘤治疗模型中的应用。
背景技术
肿瘤是对人类威胁最大的疾病之一，相对于其它疾病，肿瘤临床治疗的有效率目前仍然偏低。随着人类基因组学、药物基因组学及肿瘤分子生物学研究的不断深入，研究者对肿瘤多成因、异质性的特点有了更加全面的认识。基因组测序研究发现，相同病理类型的肿瘤之间基因突变重复很少；相同类型肿瘤的不同个体之间的基因突变谱差异很大，这是造成相同病理类型肿瘤具有不同临床表型的生物学基础，也是同类型肿瘤的不同个体对相同治疗反应很不一样的原因，因此个体化治疗已经成为肿瘤临床治疗的发展方向和最有效的手段。个体化治疗致力于寻找可预测特异性治疗应答的疾病特征以改善个体化治疗效果，因此建立个性化的肿瘤治疗模型是一种简便而直接的手段。
肿瘤动物模型的建立是研究致瘤机制、抗肿瘤药物检测和肿瘤分子生物学极其重要的手段。由于伦理限制、成本高、操作不便等原因，利用与人类接近的灵长类动物进行的试验是有限的，而且临床上的观察和研究也较为浅显。大鼠由于容易饲养、方便操作、成本低等优点，是目前生物医学基础和应用的主要模型之一。人源化大鼠模型是指带有功能性的人类基因、细胞或组织的大鼠模型，这种模型通常被用做人类疾病体内研究的活体替代模型，能够建立可用于移植人类造血组织和人体免疫的动物品系。近年来人源化大鼠模型已被证明在解码人类疾病奥秘中具有巨大的优势和广泛的应用前景，成为人类疾病研究和临床前应用研究的重要工具之一。利用大鼠建立各种个性化肿瘤治疗模型，用以具体研究每个患者自身的情况，以便评价具有抗肿瘤功效的药物和制定有效的治疗方法，是研究发展的趋势。
重组激活基因(recombination-activatinggene,RAG)编码重组激活蛋白，其中两个重组激活基因RAG1和RAG2所编码的RAG1蛋白和RAG2蛋白构成的复合体蛋白酶参与了V(Variable)基因片段、D(Diversity)基因片段和J(Joining)基因片段的基因重组[即V(D)J重排]过程并起着关键的作用。基因的重排是淋巴细胞表面标志发生过程中的一个重要过程，对于细胞成熟后的功能和结构有着重要的作用，因此RAG2基因对于淋巴细胞分化发育十分关键。大鼠重组激活基因2(recombination-activatinggene2,RAG2)位于大鼠的2号染色体，由3个外显子组成，编码序列位于外显子3中。当RAG2基因被敲除后，大鼠体内的V(D)J重排丧失，T和B淋巴细胞分化、发育被完全阻断，导致重度联合免疫缺陷病。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是如何建立个性化肿瘤治疗模型，进行个性化肿瘤治疗。
为解决上述技术问题，本发明首先提供了RAG2基因敲除大鼠在构建肿瘤治疗模型中的应用。
上述应用中，所述RAG2基因敲除大鼠无肿瘤。
上述应用中，所述肿瘤来源于人。
上述应用中，所述肿瘤可为实体瘤或非实体瘤。
上述应用中，所述肿瘤可为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤可为肝癌、甲状腺癌、直肠癌和胃癌中任一种。
为解决上述技术问题，本发明还提供了构建肿瘤治疗模型的方法。
本发明所提供的构建肿瘤治疗模型的方法，包括将肿瘤接种于RAG2基因敲除大鼠，获得接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，获得具有所述肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，所述具有肿瘤的RAG2基因敲除大鼠为肿瘤治疗模型。
上述方法中，所述RAG2基因敲除大鼠无肿瘤。
上述方法中，所述肿瘤可接种于所述RAG2基因敲除大鼠的前肢腋窝皮下或背部。
上述方法中，所述肿瘤来源于人。
上述方法中，所述肿瘤可为组织和/或细胞，具体可为组织，进一步的，所述组织为实体瘤，所述接种的实体瘤块的体积可为0.125mm3-0.5mm3，具体可为0.18mm3。
上述方法中，所述肿瘤可为恶性肿瘤，所述恶性肿瘤可为肝癌、甲状腺癌、直肠癌和胃癌中任一种。
上述方法中，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间为30d-90d，具体地，当所述肿瘤为肝癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可为32d；当所述肿瘤为甲状腺癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可为60d；当所述肿瘤为直肠癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可为49d；当所述肿瘤为胃癌时，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间具体可为45d。
上文中，RAG2基因敲除大鼠是将SD大鼠的RAG2基因敲除得到的大鼠。所述RAG2基因敲除大鼠中没有成熟的T淋巴细胞和B淋巴细胞。所述RAG2基因敲除大鼠的基因型为RAG2-/-。
实验证明，利用RAG2基因敲除大鼠为载体，移植患者自身的肿瘤组织，成功建立了具有个性化的人源化RAG2基因敲除大鼠肿瘤治疗模型。与已有的免疫缺陷的小鼠移植肿瘤模型相比，该治疗模型建立了不同通路异常的肿瘤模型，忠实地模拟了患者自身肿瘤疾病的情况，可通过每个患者的特点来评价抗肿瘤功效的药物和治疗方法。利用RAG2基因敲除大鼠建立个性化肿瘤治疗模型的方法工序简单，周期短，成瘤率高，费用低的优点，对于不同种类的肿瘤组织均可以成瘤，接种了肝癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率为100％，接种了甲状腺癌和直肠癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率均为66.7％，接种了胃癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率为33.3％。接种肝癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的肿瘤出现的时间是32d，接种甲状腺癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的肿瘤出现的时间是60d，接种直肠癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的肿瘤出现的时间是49d，接种胃癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的肿瘤出现的时间是45d，因此可以广泛被应用于肿瘤的个性化治疗中。
附图说明
图1为四种RAG2基因敲除大鼠的测序结果。其中，rag2-WT代表野生型SD大鼠，红框部分代表EarⅠ酶的识别位点；#4-缺1个碱基代表4号RAG2基因敲除大鼠；#13-缺2个碱基代表13号RAG2基因敲除大鼠；#15-缺5个碱基代表15号RAG2基因敲除大鼠；#33-缺7个碱基代表33号RAG2基因敲除大鼠。
图2为RAG2基因敲除大鼠的RAG2基因的酶切鉴定结果。其中，泳道M为DNA分子量Marker，泳道1为RAG2+/-大鼠(基因型为RAG2+/-)基因组DNA的酶切产物，泳道2为野生型SD大鼠基因组DNA的酶切产物，泳道3和4均为RAG2-/-大鼠(基因型为RAG2-/-)基因组DNA的酶切产物，泳道5为阴性对照。
图3为RAG2基因敲除大鼠的RAG2基因的表达水平的实时荧光定量PCR分析结果。其中，WT代表野生型SD大鼠，KO代表RAG2-/-大鼠(基因型为RAG2-/-)。
图4为RAG2基因敲除大鼠中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和粒细胞的相对计数。其中，WT代表野生型SD大鼠，KO代表RAG2-/-大鼠(基因型为RAG2-/-)。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下述实施例中的SD大鼠(野生型SD大鼠)为北京华阜康生物科技股份有限公司的产品。
下述实施例中的AmbionmMESSAGESP6TranscriptionKit为英潍捷基(上海)贸易有限公司的产品。
下述实施例中的肿瘤组织来源于人的肝癌、甲状腺癌、直肠癌和胃癌。
RAG2基因敲除大鼠在隔离环境条件下饲养，该环境设施采用无菌隔离装置以保存无菌或无外来污染动物。隔离装置内的空气、饲料、水、垫料和设备均为无菌，动物和物料的动态传递须经特殊的传递系统，该系统既能保证与环境的绝对隔离，又能满足转运动物时保持内环境一致。
下述实施例中所用试剂的配制：
磷酸盐缓冲液：7.9gNaCl，0.2gKCl，0.24gKH2PO4(或1.44gNa2HPO4)，1.8gK2HPO4，加蒸馏水定容至1L，pH值为7.4，120℃高压蒸汽灭菌20min后室温(20-30℃)保存。
实施例1、利用RAG2基因敲除大鼠建立个性化肿瘤治疗模型
一、RAG2基因敲除大鼠的获得
大鼠RAG2基因位于大鼠的2号染色体，由3个外显子组成，编码序列位于外显子3中。RAG2基因敲除大鼠是利用TALEN技术创建，针对大鼠RAG2基因(GeneID:295953，http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/295953)设计的TALEN靶点序列如下CTAAAGATTCCTGCTACctcccacctcttcgttacCCAGCTACTTGCTCGT，其中左边TALE识别序列如下:CTAAAGATTCCTGCTAC；右边TALE识别序列如下:ACGAGCAAGTAGCTGG；中间为间隔序列。针对左边TALE识别序列的重复可变的双连氨基酸残基位点(RepeatVariantDi-residue,RVD)的序列如下：HDNGNINININNNINGNGHDHDNGNNHDNGNIHD。针对右边TALE识别序列的RVD序列如下：NIHDNNNINNHDNININNNGNINNHDNGNNNN。TALEN质粒组装使用Talen(增强型)打靶质粒构建试剂盒(北京唯尚立德生物科技有限公司，产品目录号VK006-05)进行，具体操作参见说明书(http://www.v-solid.com/t/v-solid/uf/files/pdf/Tale合成试剂盒说明书-2014.5.29.pdf)，获得组装的两个TALEN表达质粒。通过AmbionmMESSAGESP6TranscriptionKit将两个组装的TALEN表达质粒分别转录合成两条mRNA，将合成的两条mRNA通过显微操作注射到SD大鼠的受精卵(受精卵为SD大鼠的卵细胞与SD大鼠的精子通过受精获得的)，获得含有合成的两条mRNA的受精卵。将含有合成的两条mRNA的受精卵移植到假孕SD大鼠受体母鼠体内，待移植了含有合成的两条mRNA的受精卵的假孕SD大鼠受体母鼠产下幼鼠21天后提取幼鼠的DNA。以提取的幼鼠DNA为模板，利用TALEN位点两端的特异引物针对设计靶位点位置设计PCR引物，分别为RAG2T_F(5’-GGCCTAAGAGATCCTGCCCT-3’)和RAG2T_R(5’-AAAGACAGCCCGTCCTGAAGT-3’)，进行PCR扩增反应，PCR扩增得到长度约为511bp的片段。将获得的PCR扩增产物进行测序以鉴定是否存在大鼠RAG2基因的突变，以野生型SD大鼠的DNAPCR扩增产物作为对照。测序结果如图1所示，通过TALEN技术，共获得四种不同基因敲除的大鼠，基因组DNA碱基缺失个数分别为1、2、5和7个，它们均造成了RAG2基因的移码突变，因而全部造成RAG2基因的缺失，分别编号为4号、13号、15号和33号RAG2基因敲除大鼠。
其中15号RAG2基因敲除大鼠缺失5个碱基，造成移码突变，使野生型SD大鼠2号染色体编码序列翻译得到的第128位氨基酸对应的密码子突变为终止密码子，进而造成RAG2基因的缺失，后续实验均采用15号RAG2基因敲除大鼠(标记为15号RAG2+/-大鼠)进行。将15号RAG2+/-大鼠与野生型SD大鼠进行交配繁殖，将产生的F1代的RAG2+/-大鼠之间进行交配，产生F2代大鼠，F2代大鼠的杂合型RAG2基因敲除大鼠(基因型为RAG2+/-)，下文简称RAG2+/-大鼠，含有CTCTTCG序列(EarⅠ酶特定识别序列)；F2代大鼠的纯合型RAG2基因敲除大鼠(基因型为RAG2-/-)，下文简称RAG2-/-大鼠，不含有CTCTTCG序列(EarⅠ酶特定识别序列)。分别提取野生型SD大鼠、RAG2+/-大鼠及RAG2-/-大鼠的基因组DNA，进行酶切鉴定。使用NEB公司的EarⅠ酶(产品目录号为R0528)进行，酶切体系如下：
加灭菌双蒸水至总体积为50μL
先37℃反应2小时，然后65℃反应25分钟，酶切完成。
将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，电泳结果如图2所示，野生型SD大鼠基因组DNA的PCR产物存在EarⅠ酶的酶切产物，即含有约300bp和150bp的两个大小不同的片段；RAG2+/-大鼠既存在约300bp和150bp两个大小不同的EarⅠ酶的酶切产物条带，又含有大小约450bp的非EarⅠ酶的酶切条带；RAG2-/-大鼠中只含有约450bp非EarⅠ酶的酶切条带，因此确定为F2代中纯合型RAG2基因敲除大鼠(基因型为RAG2-/-)。将等体积水替代基因组DNA作为阴性对照。
将酶切鉴定获得的F2代RAG2-/-大鼠和野生型SD大鼠进行实时荧光定量PCR(QuantitativeReal-timePCR,QRT-PCR)分析，RAG2上游引物为：5’-TGATGCTCGTTGAGGTATGG-3’，下游引物为5’-TGGGTCTATTTGTGGGCTCT-3’；内参使用β-actin，β-actin上游引物为：5’-CACCCGCGAGTACAACCTTC-3’，β-actin下游引物为：5’-CCCATACCCACCATCACACC-3’。实验重复3次。结果如图3所示，在RAG2-/-大鼠的肝脏中，RAG2基因的表达水平明显降低，是野生型SD大鼠的0.0085倍，说明在RAG2-/-大鼠中，RAG2基因被成功敲除，实验结果具有统计学意义。
分别将酶切鉴定获得的F2代RAG2-/-大鼠和野生型SD大鼠中的T淋巴细胞、B淋巴细胞、NK细胞和粒细胞进行流式细胞术分析，抗体RatT/B/NKCellCocktail(为碧迪医疗器械(上海)有限公司(BD)的产品，产品目录号为BD558495)能够检测T淋巴细胞上的CD3分子，B淋巴细胞上的CD45RA分子，NK细胞上的CD161a分子，可用于T淋巴细胞、B淋巴细胞和NK细胞的流式细胞术分析；抗体PEMouseAnti-RatGranulocytes(为碧迪医疗器械(上海)有限公司(BD)的产品，产品目录号为BD550002)用于粒细胞的流式细胞术分析。结果如图4所示，相对计数(百分比)是通过流式结果对相应被染色的细胞圈门得出的。RAG2-/-大鼠T淋巴细胞的相对计数是(百分比)野生型SD大鼠的0.0293倍(RAG2-/-大鼠T淋巴细胞的相对计数为0.267％，野生型SD大鼠T淋巴细胞的相对计数为9.1％)；RAG2-/-大鼠B淋巴细胞的相对计数(百分比)是野生型SD大鼠的0.0431倍(RAG2-/-大鼠B淋巴细胞的相对计数为0.233％，野生型SD大鼠B淋巴细胞的相对计数为5.4％)；RAG2-/-大鼠NK细胞的相对计数(百分比)是野生型SD大鼠的3.24倍(RAG2-/-大鼠NK细胞的相对计数为9.5％，野生型SD大鼠NK细胞的相对计数为2.93％)；RAG2-/-大鼠粒细胞的相对计数(百分比)是野生型SD大鼠的0.96倍(RAG2-/-大鼠粒细胞的相对计数为0.7％，野生型SD大鼠粒细胞的相对计数为0.73％)；证实在RAG2-/-大鼠中没有成熟的T淋巴细胞和B淋巴细胞。
上述实验结果表明F2代中RAG2-/-大鼠中的RAG2基因被成功敲除，适用于建立个性化肿瘤治疗模型，下文中的RAG2基因敲除大鼠即为F2代RAG2-/-大鼠。
本实施例利用RAG2基因敲除大鼠建立个性化肿瘤治疗模型，具体方法如下：
1、在无菌条件下切取患者瘤块，分别为肝癌肿瘤瘤块、甲状腺癌肿瘤瘤块、直肠癌瘤瘤块和胃癌肿瘤瘤块，采用磷酸盐缓冲液将肝癌肿瘤瘤块、甲状腺癌肿瘤瘤块、直肠癌瘤瘤块和胃癌肿瘤瘤块清洗4遍，分别将肝癌肿瘤瘤块、甲状腺癌肿瘤瘤块、直肠癌瘤瘤块和胃癌肿瘤瘤块分割成体积均为0.18mm3的接种肿瘤块，获得肝癌接种肿瘤块、甲状腺癌接种肿瘤块、直肠癌接种肿瘤块和胃癌接种肿瘤块。
2、造模组取4周龄RAG2基因敲除大鼠(雄性,大鼠重量在90-120g之间)进行肿瘤的移植；对照组取4周龄正常野生型SD大鼠(雄性,大鼠重量在90-120g之间)。在RAG2基因敲除大鼠的前肢腋窝剪开—个小口，用无钩眼科镊子夹取步骤1的接种肿瘤块，送入切口内皮下，将步骤1的肝癌接种肿瘤块、甲状腺癌接种肿瘤块、直肠癌接种肿瘤块和胃癌接种肿瘤块分别接种于RAG2基因敲除大鼠的前肢腋窝皮下，每种类型肿瘤接种RAG2基因敲除大鼠3只，分别获得接种了肝癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠(造模组1)、甲状腺癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠(造模组2)、直肠癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠(造模组3)和胃癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠(造模组4)；对照组采用相同的步骤将步骤1的相同体积的肝癌接种肿瘤块、甲状腺癌接种肿瘤块、直肠癌接种肿瘤块和胃癌接种肿瘤块分别接种于正常野生型SD大鼠的前肢腋窝皮下，每种类型肿瘤接种正常野生型SD大鼠3只，分别获得接种了肝癌肿瘤瘤块的正常野生型SD大鼠(对照组1)、甲状腺癌肿瘤瘤块的正常野生型SD大鼠(对照组2)、直肠癌肿瘤瘤块的正常野生型SD大鼠(对照组3)和胃癌肿瘤瘤块的正常野生型SD大鼠(对照组4)。
3、将接种了不同种类肿瘤的造模组RAG2基因敲除大鼠和对照组正常野生型SD大鼠在隔离环境条件下饲养，观察并记录造模组RAG2基因敲除大鼠和对照组正常野生型SD大鼠的局部肿瘤结节形成的时间。
接种当天记为第1天，造模组1的RAG2基因敲除大鼠在接种后32天出现了肿瘤，对照组1的正常野生型SD大鼠均未出现肿瘤；造模组2的RAG2基因敲除大鼠在接种后60天出现了肿瘤，对照组2的正常野生型SD大鼠均未出现肿瘤；造模组3的RAG2基因敲除大鼠在接种后49天出现了肿瘤，对照组3的正常野生型SD大鼠均未出现肿瘤；造模组4的RAG2基因敲除大鼠在接种后45天出现了肿瘤，对照组4的正常野生型SD大鼠均未出现肿瘤。
在饲养90天后计算接种了不同类型肿瘤的造模组RAG2基因敲除大鼠的肿瘤形成率和接种了不同类型肿瘤的对照组正常野生型SD大鼠的肿瘤形成率。结果见表1，数据显示利用RAG2基因敲除大鼠成功建立了不同类型肿瘤的个性化肿瘤治疗模型，接种了肝癌肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠(造模组1)的成瘤率最高，为100％；接种了甲状腺癌(造模组2)和直肠癌(造模组3)肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率均为66.7％；接种了胃癌(造模组4)肿瘤瘤块的RAG2基因敲除大鼠的成瘤率为33.3％。
表1、接种不同种类肿瘤的大鼠成瘤率
造模组 成瘤大鼠只数/只 成瘤率/％ 对照组 成瘤大鼠只数/只 成瘤率/％
造模组1 3 100 对照组1 0 0
造模组2 2 66.7 对照组2 0 0
造模组3 2 66.7 对照组3 0 0
造模组4 1 33.3 对照组4 0 0

Claims (10)

1.RAG2基因敲除大鼠在构建肿瘤治疗模型中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述肿瘤来源于人。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：所述肿瘤为恶性肿瘤。
4.根据权利要求1-3中任一所述的应用，其特征在于：所述恶性肿瘤为肝癌、甲状腺癌、直肠癌和胃癌中任一种。
5.构建肿瘤治疗模型的方法，包括将肿瘤接种于RAG2基因敲除大鼠，获得接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，获得具有所述肿瘤的RAG2基因敲除大鼠，所述具有肿瘤的RAG2基因敲除大鼠为肿瘤治疗模型。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述肿瘤来源于人。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述肿瘤为组织和/或细胞。
8.根据权利要求5-7中任一所述的方法，其特征在于：所述肿瘤为恶性肿瘤。
9.根据权利要求5-8中任一所述的方法，其特征在于：所述恶性肿瘤为肝癌、甲状腺癌、直肠癌和胃癌中任一种。
10.根据权利要求5-9中任一所述的方法，其特征在于：饲养所述接种了肿瘤的RAG2基因敲除大鼠的时间为30d-90d。
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