CN102277420A - 鸭子的育种方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种鸭子的育种方法，利用20个STR荧光标记在亲代和子代鸭个体间进行亲子鉴定，从而建立起系谱记录，保证育种工作的连续性。采用亲子鉴定技术建立选育群体的系谱记录，不但可以降低育种中的工作量，而且准确性可以大大提高，从而提高选种的准确性，加快水禽的育种进展，同时提高了种鸭产蛋率、受精率和孵化率，具有较好的经济效益。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及了通过STR标记的PCR扩增和检测以及亲缘关系鉴定的方法进行鸭育种。
背景技术
鸭作为世界上饲养量最大的水禽，具有生活力强、耐粗饲等生物学特性，能够为人类提供肉、蛋、羽绒等产品，在世界禽类生产中占有重要地位。我国是世界上最大的肉鸭生产国和消费国，在养禽业中的比重越来越大，尤其是南方养鸭业发展迅猛，但是也存在着行业整体水平较低、品种单一的问题。我国有许多具有优良遗传特性的地方鸭品种，但是缺乏有效的开发利用，鸭的育种工作进展缓慢，科技含量较低，有必要借助分子生物学的手段辅助提升鸭育种的技术水平和加快育种进展。
建立完整准确的系谱记录是鸭育种工作的基础，对于提升我国鸭育种水平，提高育种效率有着重要作用和意义。利用STR技术建立鸭群的系谱记录可以在不改变目前鸭地面散养、自由交配的饲养模式前提下准确的建立起两代鸭群间的系谱记录，而且准确快速，有利于加快鸭的选育进展。该技术建立推广后将会对其他水禽的育种工作产生非常大的促进作用。
随着畜牧业科技的进步，现代畜牧养殖业和育种业都已广泛采用人工授精技术，极大地提高了经济效益并且加快了育种进程。在禽类的人工授精技术研究中鸡的人工授精技术研究开展的比较早，技术成熟，而且笼养鸡非常适合推广人工授精技术，该技术在鸡的育种和生产中有普遍应用。人工授精技术有效地解决了笼养鸡的配种问题，大大提高了公母比例，减少了公鸡的饲养量，节省了费用；在水禽育种中，由于育种技术相对比较落后，人工授精技术还不成熟，同时也受限于水禽的饲养特点，导致水禽笼养技术难度较大，目前大多采用地面散养；种水禽禽舍通常还有洗浴池，以利于提高受精率，这种饲养方式也制约了人工授精技术在鸭育种中的应用。目前我国绝大部分水禽育种场在水禽育种中多采用小群体内随机交配繁殖后代，造成系谱记录工作非常繁琐，需要充足的人员和场地提供支持，而且很容易出错，严重影响选育效果。目前常用的配种方法是将1只公鸭和5只母鸭放在一个小圈舍中，公母鸭均戴上肩号或者翅号，让其自由交配，每天晚上母鸭产蛋前由饲养员逐一检查，将要产蛋的母鸭分别放到封闭的笼子里，第二天下蛋后再由饲养员逐一记录每只种蛋的亲本编号，在孵化后完成两代间的系谱记录。这种方法一方面要占用大量的场地设施，每天还要占用大量的劳动力，而且很容易出现记录错误等问题；另一方面这种选配方法中公鸭的性能对受精率的影响很大，而且由于公母鸭组合相对固定，会使一些优秀个体遗传基因不能结合，影响选育的进展。
采用大群体随机交配可以使所有公母鸭都有交配的机会，大大提升了群体的遗传多样性，有利于优良性状的表现，而且性能优秀的公母鸭会繁殖较多的后代，可以加快选育的速度。但是大群体随机交配时使用人工记录系谱是无法实现的，而利用STR标记进行亲子鉴定就可以重建亲本和子代间的系谱记录，保证育种工作的连续性。采用亲子鉴定技术建立选育群体的系谱记录，不但可以降低育种中的工作量，而且准确性可以大大提高，从而提高选种的准确性，加快水禽的育种进展。
亲子鉴定(parentage identification)又称亲权鉴定、个体识别等，它是利用生物学、分子遗传学及医学的理论和技术，从子代和亲代的形态构造或生理机能、遗传的物质基础等方面的相似特点，分析遗传特征，判断亲代与子代是否有亲缘关系的方法(钱林东等，2010)。亲子鉴定技术在日常法医检验以及畜牧业生产中有重要的应用价值，亲子鉴定方法有多种，早期的有血型测试法、白细胞抗原鉴定法和染色体多态性鉴定法等；随着分子遗传学研究的深入，多种基因组水平的分子遗传标记检测技术已应用到亲子鉴定中来，这些DNA分子标记技术是以个体间遗传物质内核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。DNA分子标记具有诸多优点，其中最适合用于亲子鉴定的DNA分子标记有：线粒体DNA标记、DNA指纹标记、小卫星变异重复序列标记、微卫星标记STR等(Hill等， 
2008)。
微卫星标记(microsatellite marker)又称简单重复序列(simple sequence repeats，SSR)、短串联重复(short tandemrepeat，STR)等，已被广泛应用于连锁图谱的构建、个体识别、亲子鉴定、基因定位、遗传多样性分析、疾病诊断等领域。利用微卫星标记进行亲子鉴定在人类法医学上已有广泛应用，在动植物中也有大量报道。利用DNA微卫星标记和SNP位点对未知系谱的动物群体进行亲缘关系鉴定在国际上已有成功应用。1996年国际动物遗传学会(ISAG，International Society of Animal Genetics，http://www.isag.org)年会上提出了牛、猪、马、狗等几种家畜亲子鉴定中使用的微卫星标记建议。张亚平等1995年分离了10个大熊猫微卫星标记可用于大熊猫的亲子鉴定，张于光等在2003年将微卫星标记应用于东北虎的亲子鉴定，都取得了很好的效果，具有很高的准确度；叶俊华等(2005)采用多重PCR和基因组扫描技术检测了公安部直属四家警犬基地进口种犬和准繁犬7个品种共269头样本10个微卫星DNA多态性，结果发现该10个微卫星位点的非父排除率为99.7287％、个体识别率为99.999％，建立了警犬STR-DNA亲子鉴定方法；Ellegren等(1992)用5个马科的微卫星标记判定马的亲权关系可使排除率达98％以上，10个标记排除率达99.99％；Glowatzki-Mullis等(1995)利用不同染色体上的6个多态STR标记检测了238头牛的等位基因频率，成功解决了用传统的血型鉴定方法无法确定的35头牛的亲权确认问题；Ozkan等(2009)利用12个微卫星标记对荷斯坦奶牛群体进行了亲子鉴定分析，其中包括了由ISAG推荐的9个位点，结果表明这12个标记的排除概率至少为99.9％，大部分(95.3％)的亲权关系得到了确认；Stevanovic等(2009，2010)
利用11个微卫星标记分别在不同的西门塔尔牛群体中进行亲子鉴定，结果表明其排除概率可以达到99.9％。
目前STR标记在禽类中进行亲子鉴定的研究极少，多用于遗传多样性分析以及遗传基因的流动等(Qu等，
2006；Berthouly等，2008，2009)；在水禽中利用STR标记进行亲子鉴定的研究极少，Reichart等(2010)利用蛋白质指纹技术和10个微卫星标记鉴定了棕硬尾鸭间的亲缘关系。以上研究结果表明鸭的微卫星DNA标记研究已经取得了重要进展并有了很好的应用，如何进一步在鸭的育种工作中发挥更大的作用是一个非常值得研究的领域。
发明内容
为了解决鸭育种中存在的大群随机交配群体无法建立系谱关系的问题，加快育种进展，本发明研制了一种利用20个STR标记对未知亲缘关系的鸭亲本与子代间进行亲子鉴定的技术方法，并提供了该技术的操作方法。
本发明涉及一种鸭子的育种方法，将亲本的公母鸭大群体圈养并进行编号，收集种蛋并入孵，对孵化后的子代雏鸭进行编号，其包括如下步骤：对亲本和子代鸭提取DNA，按照表1合成荧光引物；
表1多重PCR扩增的引物组合以及微卫星标记信息
对提取的DNA进行多重PCR扩增，并进行电泳检测，对电泳结果进行分析得到所有个体的基因型数据，对亲本和子代进行亲缘关系分析，计算每个子代其最可能的父母亲个体，根据分析结果分别选取置信度最高的一个公鸭和母鸭为亲本进行育种。
在本发明的一个优选实施方式中，优选按表2所述的条件进行PCR扩增：
表2多重PCR扩增的引物组合以及反应条件
在本发明的一个优选实施方式中，上述的亲本鸭子为巢湖鸭。
在本发明的一个优选实施方式中，共同圈养的亲本公鸭的数量为10-60只；亲本母鸭的数量为50-300只。
在本发明的一个优选实施方式中，通过软件对电泳结果和/或亲缘关系进行分析，所述的软件选自GeneMaper和/或Cervus。
在本发明中，PCR产物检测包括如下步骤：将PCR扩增产物进行稀释后，优选进行5-10倍稀释，与分子量内标混合后在ABI 3730xl型DNA测序仪上进行电泳。
结果分析：电泳结果利用GeneMaper 3.0软件进行处理，获得每个个体STR标记的基因型数据。将每个个体的基因型数据利用软件Cervus 2.0进行计算，分析个体间亲缘关系的概率，排除非亲子关系的个体，最后获得亲本与子代间的系谱记录。
本发明具有至少下述一个或多个方面的优点：
1.高通量：本发明通过大量的摸索研究，不断优化改进PCR反应条件，将20个STR标记进行优化组合，形成了7个多重PCR反应体系，将工作量降低了66.7％，节省了大量的时间、人工和费用。
2.准确率高：根据孟德尔遗传学理论，利用20个STR标记进行鸭亲子鉴定，其非父排除概率可达到99.999％以上。在鸭育种群中进行该技术验证时其准确率达到98.969％。
3.提高经济效益：使用本发明后可以节省种鸭繁殖交配时组成小圈的场地，减少基础设施投资；减轻饲养员的工作量，进而可以提高单人饲养规模；本发明不需要每晚将产蛋母鸭抓入产蛋笼，减少了产蛋鸭群的应激，提高种鸭的产蛋率，受精率和孵化率；从而整体提高了种鸭场的经济效益。
附图说明
图1a，1b：实施例2的Genemapper分析结果。
具体实施方式
实施例1：对已知系谱记录的两代巢湖鸭群体检验本发明的准确率
选取繁殖性能良好的40周龄巢湖鸭种鸭300只，均戴翅号，其中50只公鸭，250只母鸭，随机分成50个圈舍，每个圈舍内1只公鸭5只母鸭，记录每个圈舍内公母鸭翅号。组成小圈15天后开始收集种蛋，记录每枚种蛋的父母鸭翅号，连续收集8天后入孵。每天晚上9点由饲养员将即将产蛋的母鸭抓进单独的产蛋笼内，第二天早晨再将产蛋后的母鸭放出，并在产下的种蛋上记录父母鸭翅号，入种蛋库保存至入孵。每天早晨收集种蛋时核对每个圈舍内的公母鸭翅号，防止圈舍间个体混淆，剔除混淆个体所产种蛋。孵化后出雏时给雏鸭戴翅号，并详细记录其父母鸭翅号，建立系谱记录；42日龄选留后获得388只子代鸭。在留种期间统计该种鸭群体母鸭饲养日产蛋率。
对300只亲本及388只子代巢湖鸭采血，提取DNA，按照表1合成荧光引物，按照表2的多重PCR反应体系和条件进行PCR扩增，并进行电泳检测。电泳结果用GeneMapper v3.0软件进行分析，得到所有个体的基因型数据，用软件Cervus 2.0对亲本和子代进行亲缘关系分析，计算每个子代其最可能的父母亲个体，根据分析结果分别选取置信度最高的一个公鸭和母鸭确认为其亲本，最后建立系谱记录。将使用本发明建立的系谱记录与之前孵化时建立的系谱记录进行对照，在388个留种子代个体中有四个个体在进行亲本认定时两者结果不一致，且均为父本或母本一方出现差异，其准确率为98.969％。
实施例2在未知系谱记录的两代巢湖鸭群体中检验本发明的效果
在巢湖鸭原种场进行本方法的应用试验。
继续利用上述实施例1中的300只巢湖鸭种鸭，在完成实施例1中的试验后将该鸭群集中到一个大的圈舍内进行大群饲养，随机交配。饲养15天后每天收集种蛋，入种蛋库保存，共收集8天的种蛋入孵。出雏时给雏鸭带翅号，42日龄选留后获得423只子代个体。采集全部子代个体血液，提取DNA后进行多重PCR扩增，并进行基因型检测，亲本基因型在实施例1中已经获得，对亲本和子代的基因型数据进行分析，建立两代巢湖鸭间的系谱记录。以上实验室工作部分方法同实施例1。结果在423只子代个体有420只个体可以全部认定亲本，另外3只个体可以认定双亲中的一方。
两个实施例种鸭群不同的交配方式对各项生产指标的影响见表3。
表3两个实施例中种鸭群的母鸭饲养日产蛋率、入孵蛋受精率和入孵蛋孵化率
| 组别 | 母鸭饲养日产蛋率 | 入孵蛋受精率 | 入孵蛋孵化率 |
| 实施例1 | 77.35％ | 84.91％ | 87.79％ |
| 实施例2 | 81.04％ | 89.23％ | 88.25％ |
应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。
序列表
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<120>Title：鸭子的育种方法
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Claims (5)
1.一种鸭子的育种方法，将亲本的公母鸭大群体圈养并进行编号，收集种蛋并入孵，对孵化后的子代雏鸭进行编号，其特征在于包括如下步骤：对亲本和子代鸭提取DNA，按照下表合成荧光引物；
使用表中的引物对提取的DNA进行多重PCR扩增，并进行荧光电泳检测，对电泳结果进行分析得到所有个体的基因型数据，对亲本和子代进行亲缘关系分析，计算每个子代其最可能的父母亲个体，根据分析结果分别选取置信度最高的一个公鸭和母鸭为亲本进行育种。
2.根据权利要求1所述的鸭子的育种方法，其特征在于按下表所述的条件进行PCR扩增：
3.根据权利要求1或2所述的鸭子育种方法，其特征在于所述的亲本鸭子为巢湖鸭。
4.根据权利要求1或2所述的鸭子育种方法，其特征在于共同圈养的亲本公鸭的数量为10-60只；亲本母鸭的数量为50-300只。
5.根据权利要求1或2所述的鸭子育种方法，其特征在于通过软件对电泳结果和/或亲缘关系进行分析，所述的软件选自GeneMaper和/或Cervus。
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2011
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