CN116334077B - 一种气道上皮细胞shp-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用 - Google Patents
一种气道上皮细胞shp-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种气道上皮细胞SHP‑1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术，对SHP‑1靶基因进行定点修饰，构建Flox小鼠(SHP‑1fl/fl)，再利用气道上皮细胞Clara蛋白启动Cre系统诱导SHP‑1特异性敲除，构建了一种气道上皮细胞SHP‑1基因特异性敲除的小鼠模型(SHP‑1Δ/Δ)。本发明中所述SHP‑1Δ/Δ小鼠的构建方法解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，所得基因编辑小鼠模型在支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病的机制探索及药物制备方面具有重要临床转化价值。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。
背景技术
目前，进行基因功能研究最直接有效的方法是构建转基因和/或基因敲除动物模型。CRISPR/Cas9技术通过导向RNA(sgRNA)介导核酸内切酶Cas9蛋白进行靶向DNA序列识别并造成DNA双链断裂，以同源重组或非同源末端连接方式修复受损DNA，从而实现对目标位点实现基因的定点敲除和/或敲入等多种修饰。
条件性基因敲除动物模型主要是通过特异性重组酶系统Cre-LoxP来实现，将带有特定flox位点的转基因小鼠与细胞特异性表达Cre酶的转基因小鼠杂交可以获得特定组织细胞中基因敲除的小鼠。这种条件基因敲除的方法需要同时构建两种转基因小鼠(Flox小鼠和Cre小鼠)，且更换Cre酶的基因启动子可以实现多种条件(如药物诱导、特定时间、特定组织等)下基因敲除。
Src同源区2蛋白酪氨酸磷酸酶-1(Src Homology 2domain-containing proteintyrosine Phosphatase-1，SHP-1)，由PTPN6(SHP-1、PTP1C、HCP)基因编码。SHP-1高表达于造血细胞，而低表达于上皮细胞，对于多种细胞因子、生长因子受体和免疫受体具有负调节作用。有文献报道，全身性SHP-1功能缺陷小鼠肺组织中可出现自发性Th2型炎症反应，包括嗜酸性粒细胞增多症、粘液化生、气道上皮细胞肥大、气道高反应性、上皮细胞和肺纤维化等。
目前，气道上皮细胞SHP-1在哮喘、慢阻肺或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病中的功能尚不清楚。因此，提供一种构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠的模型，对于研究哮喘、慢阻肺和肺纤维化等具有重要意义。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法及其应用。本发明基于CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对SHP-1靶基因进行定点修饰，构建Flox小鼠，再与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/fl的SHP-1Δ/Δ小鼠，再利用气道上皮细胞Clara蛋白(CC10)启动Cre系统诱导SHP-1特异性敲除，构建了一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。本发明中所述SHP-1Δ/Δ小鼠的构建方法基于CRISPR/Cas9技术，解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，筛选出气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的纯合后代，在哮喘、慢阻肺、肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病机制研究及药物制备方面具有重要应用价值。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。
在本发明中，所述靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA的作用位点为SHP-1基因Exon2-Exon9的侧翼区域，所述sgRNA的编辑效率高，脱靶率低，1loxp同源重组效率为18.18％，而对应编号的2loxp全部实现同源重组(效率为100％)。
第二方面，本发明提供一种靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统，所述基因编辑系统包括第一方面所述的靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA。
优选地，所述sgRNA分别靶向SHP-1基因Exon9的下游和SHP-1基因Exon2的上游。
优选地，所述基因编辑系统还包括Cas9 mRNA和同源重组Donor。
优选地，所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述同源重组Donor中含有SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列。
优选地，所述同源重组Donor的构建引物包括SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ IDNO:5和SEQ ID NO:6所示的核苷酸序列。
本发明中，所述同源重组Donor的结构为具有100bp的双翼同源臂，并且靶点处插入loxP元件序列及外侧20-24bp保护碱基的单链DNA。所述同源重组Donor的构建引物包括：1loxp-sg1-F(SEQ ID NO:3)、1loxp-sg1-R(SEQ ID NO:4)、2loxp-sg2-F(SEQ ID NO:5)和2loxp-sg2-R(SEQ ID NO:6)。
第三方面，本发明提供一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
(1)构建第二方面所述的靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统；
(2)利用步骤(1)所述基因编辑系统对小鼠受精卵进行基因编辑，再进行杂交，构建Flox小鼠；
(3)将Flox小鼠与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl /fl的小鼠，利用气道上皮细胞Clara蛋白启动Cre系统诱导，构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。
优选地，所述构建方法包括如下具体步骤：
(a)分别制备靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、Cas9 mRNA和同源重组Donor；
(b)将sgRNA、Cas9 mRNA和Donor同时注射到小鼠受精卵中，经基因整合，得到SHP-1基因Exon9的下游和Exon2的上游分别插入含有loxP元件的片段的基因重组受精卵，将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，得到F0代小鼠；
(c)将F0代中的阳性小鼠与野生型小鼠WT进行交配，获得F1代小鼠，在F1代杂合子小鼠SHP-1fl/WT之间进行杂交，得到可稳定传代的F2代小鼠，对获得的F2代小鼠进行PCR鉴定和测序，筛选F2代纯合子SHP-1fl/fl小鼠和杂合子SHP-1fl/WT小鼠；
(d)将F2代纯合子SHP-1fl/fl小鼠或杂合子SHP-1fl/WT小鼠与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选出基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/WT的F3代小鼠；
(e)将筛选出的F3代小鼠与F2纯合子代小鼠SHP-1fl/fl回交，筛选出基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/fl的F4代SHP-1Δ/Δ小鼠；
(f)F4代SHP-1Δ/Δ小鼠通过腹腔注射他莫昔芬，构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。
本发明利用CRISPR/Cas9技术，通过同源重组的原理，对靶基因进行定点修饰。具体过程如下：靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA选择和设计、sgRNA载体构建、sgRNA转录和纯化，同时构建同源重组Donor。将Cas9 mRNA、gRNA和Donor同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9mRNA在体内翻译Cas9蛋白，Cas9蛋白在sgRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，断裂的双链在修复过程中以Donor为模板产生修复，从而实现对靶基因的修饰。经过F0代、F1代、F2代可繁育纯合子SHP-1fl/fl小鼠培育，CC10-CreER工具鼠杂交及鉴定等过程筛选纯合子后代(SHP-1Δ/Δ)用于研究。
优选地，所述SHP-1基因Exon9的下游插入的含有loxP元件的片段包括如SEQ IDNO:8所示的核苷酸序列。
优选地，所述SHP-1基因Exon2的上游插入的含有loxP元件的片段包括如SEQ IDNO:9所示的核苷酸序列。
优选地，步骤(c)中，所述对获得的F2代小鼠进行PCR鉴定的特异性引物对包括：
短链筛选鉴定引物对：鉴定SHP-1基因Exon2的上游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组无条带，Mutant组得到315bp的条带；
1loxp插入鉴定引物对：鉴定SHP-1基因Exon2的上游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组得到430bp的条带，Mutant组得到508bp的条带；
2loxp插入鉴定引物对：鉴定SHP-1基因Exon2的下游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组得到390bp的条带，Mutant组得到476bp的条带。
本发明中鉴定策略的设计原理如下：
针对SHP-1基因不同转录本对应的公共外显子区域，在5kb-10kb的区域内的设计sgRNA并体外转录，同时构建同源重组Donor。将Cas9 mRNA、sgRNA、Donor同时注射到小鼠的受精卵中。Cas9 mRNA在体内翻译Cas9蛋白，Cas9蛋白在sgRNA引导下结合到靶位点进而造成DNA双链断裂，断裂的双链在修复过程中以Donor为模板产生修复，从而实现对靶基因的修饰。
优选地，所述短链筛选鉴定引物对包括：SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
本发明中，所述短链筛选鉴定引物对包括：NEO-3F(SEQ ID NO:10)和Ptpn6-1loxp-tR1(SEQ ID NO:11)。
优选地，所述1loxp插入鉴定引物对包括SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
本发明中，所述1loxp插入鉴定引物对包括Ptpn6-1loxp-tf2(SEQ ID NO:12)和Ptpn6-1loxp-tR2(SEQ ID NO:13)。
优选地，所述2loxp插入鉴定引物对包括SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
本发明中，所述2loxp插入鉴定引物对包括ptpn6-2loxp-tf2(SEQ ID NO:14)和ptpn6-2loxp-tr(SEQ ID NO:15)。
优选地，步骤(c)中，所述测序采用的扩增引物包括：扩增1loxp的引物对和扩增2loxp的引物对；
其中，所述扩增1loxp的引物对包括SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；所述扩增2loxp的引物对包括SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
本发明中，扩增1loxp的引物对包括NEO-3F(SEQ ID NO:10)和Ptpn6-1loxp-tR1(SEQ ID NO:11)；扩增2loxp的引物对包括ptpn6-2loxp-tf1(SEQ ID NO:16)和LAR3(SEQID NO:17)。
优选地，步骤(c)中，所述测序采用的测序引物包括SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
本发明中，所述测序采用的测序引物包括：1loxp的测序引物Ptpn6-1loxp-tR2(SEQ ID NO:13)和2loxp的测序引物ptpn6-2loxp-tf2(SEQ ID NO:14)。
本发明中所述SHP-1Δ/Δ小鼠的构建方法解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，所得基因编辑小鼠模型在支气管哮喘(哮喘)、慢性阻塞性肺疾病(慢阻肺)或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病的机制探索及药物制备方面具有重要临床转化价值。
第四方面，本发明提供一种构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒，所述试剂盒包括靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、同源重组Donor、Cas9 mRNA。
优选地，所述靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA包括SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
优选地，所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述同源重组Donor中含有SEQ IDNO:7所示的核苷酸序列。
优选地，所述试剂盒还包括对Flox小鼠进行PCR鉴定的特异性引物对，所述引物对包括短链筛选鉴定引物对、1loxp插入鉴定引物对或2loxp插入鉴定引物对中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述短链筛选鉴定引物对包括SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列。
优选地，所述1loxp插入鉴定引物对包括SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示的核苷酸序列。
优选地，所述2loxp插入鉴定引物对包括SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示的核苷酸序列。
本发明中，所述短链筛选鉴定引物对包括NEO-3F(SEQ ID NO:10)和Ptpn6-1loxp-tR1(SEQ ID NO:11)。所述1loxp插入鉴定引物对包括Ptpn6-1loxp-tf2(SEQ ID NO:12)和Ptpn6-1loxp-tR2(SEQ ID NO:13)。所述2loxp插入鉴定引物对包括ptpn6-2loxp-tf2(SEQID NO:14)和ptpn6-2loxp-tr(SEQ ID NO:15)。
优选地，所述试剂盒还包括对Flox小鼠进行测序的扩增引物和测序引物。
优选地，所述扩增引物包括：扩增1loxp的引物对和扩增2loxp的引物对；
其中，所述扩增1loxp的引物对包括SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示的核苷酸序列；所述扩增2loxp的引物对包括SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示的核苷酸序列。
本发明中，所述扩增1loxp的引物对包括NEO-3F(SEQ ID NO:10)和Ptpn6-1loxp-tR1(SEQ ID NO:11)；所述扩增2loxp的引物对包括ptpn6-2loxp-tf1(SEQ ID NO:16)和LAR3(SEQ ID NO:17)。
优选地，所述测序引物包括SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示的核苷酸序列。
本发明中，所述测序引物包括：1loxp的测序引物Ptpn6-1loxp-tR2(SEQ ID NO:13)和2loxp的测序引物ptpn6-2loxp-tf2(SEQ ID NO:14)。
优选地，所述试剂盒还包括对CC10-CreER工具鼠进行PCR鉴定的特异性引物对，所述引物对包括SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20。
第五方面，本发明提供一种呼吸系统重大慢性疾病的治疗和/或预防药物的筛选装置，所述筛选装置采用采用气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型进行药物筛选，所述小鼠模型由第三方面所述气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法和/或第四方面所述构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒构建得到。
优选地，所述呼吸系统重大慢性疾病包括哮喘、慢阻肺或肺纤维化中任意一种或至少两种的组合。
第六方面，本发明提供第一方面所述的靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、第二方面所述的靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统、第三方面所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法、第四方面所述的构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒或第五方面所述的呼吸系统重大慢性疾病的治疗和/或预防药物的筛选装置中任意一种或至少两种的组合在疾病机制探索和/或疾病药物制备中的应用。
综上所述，本发明中的新型基因编辑小鼠模型，是呼吸系统重大慢性疾病机制探索的体内研究载体；也是新型药物制备的动物检测平台。
本发明中所涉及的核苷酸序列如下所示：
SEQ ID NO:1：caacaagggcagacgctcacagg。
SEQ ID NO:2：gagacagtacctcaatacggtgg。
SEQ ID NO:3：taggcaacaagggcagacgctcac。
SEQ ID NO:4：aaacgtgagcgtctgcccttgttg。
SEQ ID NO:5：taggagacagtacctcaatacgg。
SEQ ID NO:6：aaacccgtattgaggtactgtct。
SEQ ID NO:7：ataacttcgtatagcatacattatacgaagttat。
SEQ ID NO:8：
catcgcattgtctgagtaggtgataacttcgtatagcatacattatacgaagttatggactaacagaagaacccgttgtg。
SEQ ID NO:9：
tctgaggcggaaagaaccagataacttcgtatagcatacattatacgaagttatatgttcttgcccaaggtcagttgg。
SEQ ID NO:10：tctgaggcggaaagaaccag。
SEQ ID NO:11：ttttgaattctgcttgccag。
SEQ ID NO:12：gtgctctgtcccatctccc。
SEQ ID NO:13：tctgcttgccagccctca。
SEQ ID NO:14：ccgctcatccgttctttt。
SEQ ID NO:15：atgagaggatgttatgcatgtgt。
SEQ ID NO:16：aggtcccagggctgatct。
SEQ ID NO:17：cacaacgggttcttctgttagtcc。
SEQ ID NO:18：actcactattgggggtgtgg。
SEQ ID NO:19：aggctcctggctggaatagt。
SEQ ID NO:20：ccaaaagacggcaatatggt。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明基于CRISPR/Cas9技术，解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，筛选出气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的纯合后代，在哮喘、慢阻肺或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病的机制研究及药物制备方面具有重要应用价值。
附图说明
图1为Flox小鼠进行PCR鉴定和测序的策略设计图。
图2为短链筛选鉴定引物对的扩增产物的电泳结果图。
图3为1loxp插入鉴定引物对的扩增产物的电泳结果图。
图4为2loxp插入鉴定引物对的扩增产物的电泳结果图。
图5为扩增1loxp的引物对的扩增产物的电泳结果。
图6为扩增2loxp的引物对的扩增产物的电泳结果。
图7为扩增1loxp的引物对的扩增产物的测序结果图。
图8为扩增2loxp的引物对的扩增产物的测序结果图。
图9为F3代小鼠PCR鉴定电泳图。
图10为F4代小鼠PCR鉴定电泳图。
图11为通过qRT-PCR对SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠不同组织SHP-1mRNA的转录水平的检测结果。
图12为通过Western blot对SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠不同组织SHP-1蛋白的表达水平的检测结果。
图13为通过免疫荧光检测SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠肺组织中SHP-1的表达与分布。
图14为检测屋尘螨(HDM)诱导的哮喘模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠肺泡灌洗液的细胞计数和细胞分类。
图15A为检测HDM诱导的哮喘模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠的气道炎症。
图15B为检测HDM诱导的哮喘模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠的气道黏液高分泌。
图15C为检测HDM诱导的哮喘模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠的气道重塑。
图16为HDM诱导的哮喘模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠气道高反应性。
图17为检测弹性蛋白酶(Elastase)诱导的肺气肿模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠肺组织的病理特点。
图18为Elastase诱导的肺气肿模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠肺气肿的定量分析。
图19为检测博来霉素(Bleomycin)诱导的肺纤维化模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠肺组织胶原沉积情况。
图20为Bleomycin诱导的肺纤维化模型中，SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠肺组织羟脯胺酸检测的定量分析。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA，所述sgRNA的核苷酸序列包括SEQID NO:1和SEQ ID NO:2。
SEQ ID NO:1：caacaagggcagacgctcacagg。
SEQ ID NO:2：gagacagtacctcaatacggtgg。
实施例2
本实施例提供一种靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统，所述基因编辑系统含有实施例1中的靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA，以及Cas9 mRNA和同源重组Donor；所述sgRNA分别靶向SHP-1基因Exon9的下游和SHP-1基因Exon2的上游；所述同源重组Donor的结构为具有100bp的双翼同源臂，并且靶点处插入loxP元件序列及外侧20-24bp保护碱基的单链DNA；所述同源重组Donor的构建引物包括：1loxp-sg1-F(SEQ ID NO:3)、1loxp-sg1-R(SEQ IDNO:4)、2loxp-sg2-F(SEQ ID NO:5)和2loxp-sg2-R(SEQ ID NO:6)；
SEQ ID NO:3：taggcaacaagggcagacgctcac。
SEQ ID NO:4：aaacgtgagcgtctgcccttgttg。
SEQ ID NO:5：taggagacagtacctcaatacgg。
SEQ ID NO:6：aaacccgtattgaggtactgtct。
实施例3
本实施例提供一种构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒，所述构建方法的核心步骤如下所示：
(1)所述试剂盒包括靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、同源重组Donor、Cas9 mRNA。
所述靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示；所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述loxP元件包括SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
(2)所述试剂盒还包括对Flox小鼠进行PCR鉴定的特异性引物对，包括短链筛选鉴定引物对、1loxp插入鉴定引物对和2loxp插入鉴定引物对。
所述短链筛选鉴定引物对包括：NEO-3F(SEQ ID NO:10)和Ptpn6-1loxp-tR1(SEQID NO:11)。
SEQ ID NO:10：tctgaggcggaaagaaccag。
SEQ ID NO:11：ttttgaattctgcttgccag。
所述1loxp插入鉴定引物对包括Ptpn6-1loxp-tf2(SEQ ID NO:12)和Ptpn6-1loxp-tR2(SEQ ID NO:13)。
SEQ ID NO:12：gtgctctgtcccatctccc。
SEQ ID NO:13：tctgcttgccagccctca。
所述2loxp插入鉴定引物对包括ptpn6-2loxp-tf2(SEQ ID NO:14)和ptpn6-2loxp-tr(SEQ ID NO:15)。
SEQ ID NO:14：ccgctcatccgttctttt。
SEQ ID NO:15：atgagaggatgttatgcatgtgt。
(3)所述试剂盒还包括对小鼠进行测序的扩增引物和测序引物。所述扩增引物包括：扩增1loxp的引物对和扩增2loxp的引物对；
所述扩增1loxp的引物对包括NEO-3F(SEQ ID NO:10)和Ptpn6-1loxp-tR1(SEQ IDNO:11)；所述扩增2loxp的引物对包括ptpn6-2loxp-tf1(SEQ ID NO:16)和LAR3(SEQ IDNO:17)。
SEQ ID NO:16：aggtcccagggctgatct。
SEQ ID NO:17：cacaacgggttcttctgttagtcc。
(4)构建Flox小鼠后，需要对Flox小鼠鉴定和测序，Flox小鼠进行PCR鉴定和测序的策略设计图如图1所示，所述PCR鉴定采用的引物如下所示：
(a)短链筛选鉴定引物对：NEO-3F和Ptpn6-1loxp-tR1，鉴定SHP-1基因Exon2的上游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组无条带，Mutant组得到315bp的条带；
(b)1loxp插入鉴定引物对：Ptpn6-1loxp-tf2和Ptpn6-1loxp-tR2，鉴定SHP-1基因Exon2的上游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组得到430bp的条带，Mutant组得到508bp的条带；
(c)2loxp插入鉴定引物对：ptpn6-2loxp-tf2和ptpn6-2loxp-tr，鉴定SHP-1基因Exon9的下游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组得到390bp的条带，Mutant组得到476bp的条带。
所述PCR鉴定的具体步骤如下所示：
(a)DNA的提取：剪取小鼠脚趾，通过酚氯仿裂解法提取基因组DNA，ddH2O溶解，4℃保存。
(b)PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定其基因型：PCR的3对引物为：短链筛选鉴定引物对、1loxp插入鉴定引物对和2loxp插入鉴定引物对。
反应体系(20μL)包括：Premix Taq 10μL、上游及下游引物各0.8μL、模板DNA 2μL、加ddH2O补足体积。
反应条件：95℃预变性5min；95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s，35个循环；72℃延伸7min；最后4℃保存备用。
(c)PCR反应终产物10μL进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定小鼠基因型。
(d)判断标准(其中，短链是指采用短链筛选鉴定引物对进行扩增后的产物；1loxp是指采用1loxp插入鉴定引物对进行扩增后的产物；2loxp是指采用2loxp插入鉴定引物对进行扩增后的产物)：
野生型小鼠SHP-1WT/WT：短链无条带、1loxp(430bp)、2loxp(390bp)；
杂合子SHP-1fl/WT小鼠：短链(315bp)、1loxp(430bp和508bp)、2loxp(390bp和476bp)；
纯合子SHP-1fl/fl小鼠：短链(315bp)、1loxp(508bp)、2loxp(476bp)。
测序采用的扩增引物包括：扩增1loxp的引物对NEO-3F和Ptpn6-1loxp-tR1，扩增2loxp的引物对ptpn6-2loxp-tf1和LAR3。
所述测序的具体步骤如下所示：
(a)利用NEO-3F和Ptpn6-1loxp-tR1，对含有1loxp序列的DNA片段进行PCR扩增，并以Ptpn6-1loxp-tR2为测序引物进行测序，并根据PCR产物测序峰型图确定1loxp序列的正确性；
(b)利用ptpn6-2loxp-tf1和LAR3，对含有2loxp序列的DNA片段进行PCR扩增，并以ptpn6-2loxp-tf2为测序引物进行测序，并根据PCR产物测序峰型图确定2loxp序列的正确性。
实施例4
本实施例提供一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，所述构建方法的核心步骤如下所示：
(1)将预先构建好的Cas9 mRNA、sgRNA和同源重组Donor显微注射到小鼠的受精卵中，获得F0代小鼠。
(2)将F0代中的阳性小鼠与野生型小鼠WT交配，获得F1代小鼠。
(3)在F1代中筛选杂合子小鼠SHP-1fl/WT，并进行杂交，获得可稳定传代的F2代小鼠进行PCR鉴定和测序，筛选F2代纯合子SHP-1fl/fl小鼠和杂合子SHP-1fl/WT小鼠。
PCR鉴定的结果如图2、图3和图4所示：图2为短链筛选鉴定引物对的扩增产物的电泳结果图，图3为1loxp插入鉴定引物对的扩增产物的电泳结果图，图4为2loxp插入鉴定引物对的扩增产物的电泳结果图。综合图2、图3和图4中可知，2021年4月15日出生的F2代Flox小鼠，5#和9#为纯合子SHP-1fl/fl小鼠，15#和17#为杂合子SHP-1fl/WT小鼠，其余为野生型SHP-1WT/WT小鼠。
测序的结果如图5、图6、图7和图8所示：图5为扩增1loxp的引物对的扩增产物的电泳结果，图6为扩增2loxp的引物对的扩增产物的电泳结果；图7为扩增1loxp的引物对的扩增产物的测序结果图，图8为扩增2loxp的引物对的扩增产物的测序结果图。综合图5、图6、图7和图8中可知，2021年4月15日出生的F2代Flox小鼠，5#、9#、15#、17#均正确插入loxP元件。
(4)将F2代纯合子SHP-1fl/fl小鼠或杂合子SHP-1fl/WT小鼠与CC10-CreER+/-工具鼠杂交，筛选出基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/WT的F3代小鼠。
(a)对于Flox小鼠而言，判断标准为：
野生型小鼠SHP-1WT/WT：短链无条带、1loxp(430bp)、2loxp(390bp)；
杂合子SHP-1fl/WT小鼠：短链(315bp)、1loxp(430bp和508bp)、2loxp(390bp和476bp)；
纯合子SHP-1fl/fl小鼠：短链(315bp)、1loxp(508bp)、2loxp(476bp)。
(b)对于CC10-CreER小鼠而言，判断标准为：
野生型小鼠(CC10-CreER-/-)：CC10-WT(550bp)、CC10-Mutant无条带；
杂合子Cre小鼠(CC10-CreER+/-)：CC10-WT(550bp)、CC10-Mutant(245bp)；
纯合子Cre小鼠(CC10-CreER+/+)：CC10-WT无条带、CC10-Mutant(245bp)。
检测CC10-CreER小鼠的引物如下所示：
SEQ ID NO:18：actcactattgggggtgtgg。
SEQ ID NO:19：aggctcctggctggaatagt。
SEQ ID NO:20：ccaaaagacggcaatatggt。
F3代小鼠的PCR鉴定电泳图如图9所示，2021年9月10日出生的F3代小鼠中，2#、5#和6#基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/WT。
(5)将筛选出的F3代小鼠与F2代小鼠SHP-1fl/fl回交，筛选出基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/fl的F4代SHP-1Δ/Δ小鼠。F4代小鼠的PCR鉴定电泳图如图10所示，2022年1月15日出生的F4代小鼠中，4#基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/fl。
(6)扩增繁育后，大量获得SHP-1Δ/Δ小鼠，饲养至6-8周，腹腔注射他莫昔芬进行诱导，构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。
实施例5
本实施例使用qRT-PCR、Western Blot和免疫荧光三种方法，鉴定他莫昔芬诱导后SHP-1Δ/Δ小鼠气道上皮细胞SHP-1表达缺陷，所述鉴定方法的核心步骤如下所示：
(1)他莫昔芬诱导后，分别提取SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠不同组织的总RNA(脾脏、肺、气道)，通过qRT-PCR鉴定不同组织中SHP-1mRNA的转录情况。qRT-PCR的结果如图11所示，SHP-1mRNA在SHP-1Δ/Δ小鼠气道组织中表达量显著低于SHP-1fl/fl小鼠(p＜0.0001)，SHP-1mRNA在SHP-1Δ/Δ小鼠肺组织中表达量也显著低于SHP-1fl/fl小鼠(p＜0.005)，但在脾脏等其他组织中，SHP-1表达量无明显差异。
(2)他莫昔芬诱导后，分别提取SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠不同组织的总蛋白(脾脏、骨髓、肺、气道)，通过Western Blot鉴定不同组织中SHP-1蛋白的表达情况。WesternBlot鉴定的结果如图12所示，用β-actin作为内参，Western Blot的结果与qRT-PCR的结果一致，SHP-1蛋白在SHP-1Δ/Δ小鼠气道组织中表达量明显低于SHP-1fl/fl小鼠，SHP-1蛋白在SHP-1Δ/Δ小鼠肺组织中表达量也低于SHP-1fl/fl小鼠，但在脾脏、骨髓等其他组织中，SHP-1表达量无明显差异。
(3)他莫昔芬诱导后，通过多聚甲醛固定SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠的肺组织，石蜡包埋后制备白片，使用不同种属来源的单克隆抗体分别标记气道上皮细胞Clara蛋白(CC10)和SHP-1蛋白，再通过免疫荧光的方法，观察SHP-1蛋白(红色荧光)和Clara蛋白(绿色荧光)的相关性、表达量和组织分布情况。如图13所示，SHP-1在SHP-1Δ/Δ小鼠气道上皮Clara细胞中表达量明显低于SHP-1fl/fl小鼠。
实施例6
本实施例首先通过HDM诱导哮喘动物模型，再通过肺泡灌洗液细胞计数和细胞分类、H&E染色、糖原(PAS)染色、Masson染色、肺功能等多种方法，评估SHP-1Δ/Δ小鼠气道炎症、气道黏液高分泌、气道重塑和气道高反应性，所述评估方法的核心步骤如下所示：
(1)哮喘动物模型构建完成后，通过肺泡灌洗收集SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠的肺泡灌洗液。一方面，通过细胞计数板计算白细胞总数；另一方面，通过Diff-Quik染色进行细胞类型区分。如图14所示，SHP-1Δ/Δ小鼠肺泡灌洗液细胞总数、淋巴细胞计数、嗜酸性粒细胞计数、中性粒细胞计数显著高于SHP-1fl/fl小鼠(p＜0.05)，巨噬细胞计数无差异。基线水平、未造模的SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠相比，肺泡灌洗液细胞计数和细胞分类无差异。
(2)哮喘动物模型构建完成后，通过多聚甲醛固定SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠的肺组织。石蜡包埋后，通过H&E染色、PAS染色和Masson染色的方法，对小鼠肺组织病理表型进行分析。如图15A、图15B和图15C所示，SHP-1Δ/Δ小鼠在气道炎症、气道黏液高分泌和气道重塑方面显著严重于SHP-1fl/fl小鼠。
(3)哮喘动物模型构建完成后，将SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠麻醉后固定于小鼠肺功能检测仪器内。从低到高设置乙酰胆碱雾化浓度：0mg/mL、3.125mg/mL、6.25mg/mL、12.5mg/mL、25mg/mL和50mg/mL，系统自动描计不同乙酰胆碱浓度下的气道阻力。如图16所示，SHP-1Δ/Δ小鼠在25mg/mL和50mg/mL的乙酰胆碱浓度刺激下，气道阻力显著重于SHP-1fl /fl小鼠。基线水平、未造模的SHP-1Δ/Δ小鼠和SHP-1fl/fl小鼠相比，气道阻力无差异。
实施例7
本实施例首先通过Elastase诱导慢阻肺动物模型，再通过H&E染色、平均线性截距等方法，评估SHP-1Δ/Δ小鼠肺组织空隙扩大的情况，所述评估方法的核心步骤如下所示：
(1)慢阻肺动物模型构建完成后，通过多聚甲醛固定SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠的肺组织。石蜡包埋后，通过H&E染色的方法，对小鼠肺组织病理表型进行分析。如图17所示，SHP-1Δ/Δ小鼠肺泡间隔破裂、相互融合形成含气囊腔，且显著严重于SHP-1fl/fl小鼠。
(2)通过ImageJ软件，对SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠肺组织肺气肿程度进行定量分析。如图18所示，SHP-1Δ/Δ小鼠肺组织空隙的平均线性截距显著大于SHP-1fl/fl小鼠。
实施例8
本实施例首先通过Bleomycin诱导肺纤维化动物模型，再通过Masson染色、羟脯胺酸测定等方法，评估SHP-1Δ/Δ小鼠肺组织胶原沉积纤维化的情况，所述评估方法的核心步骤如下所示：
(1)肺纤维化动物模型构建完成后，通过多聚甲醛固定SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠的肺组织。石蜡包埋后，通过Masson染色的方法，对小鼠肺组织病理表型进行分析。染色结果如图19所示，SHP-1Δ/Δ小鼠肺间质大量胶原纤维增生，形成胶原沉积灶，弥漫性肺结构紊乱伴炎症细胞浸润，且显著严重于SHP-1fl/fl小鼠。
(2)通过羟脯胺酸检测试剂盒对SHP-1fl/fl小鼠和SHP-1Δ/Δ小鼠肺组织胶原生成情况进行定量分析。定量分析结果如图20所示，SHP-1Δ/Δ小鼠羟脯胺酸含量显著高于SHP-1fl /fl小鼠。
综上，本发明中所述气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠的构建方法基于CRISPR/Cas9技术，解决了传统基因敲除技术中基因脱靶率高、动物成活率低的问题，筛选出气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的纯合后代，并且在哮喘、慢性阻塞性肺疾病或肺纤维化等呼吸系统重大慢性疾病机制研究及药物制备方面具有重要应用价值。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (19)
1.一种靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA的核苷酸序列由SEQ IDNO:1和SEQ ID NO:2组成；所述sgRNA分别靶向SHP-1基因Exon9的下游和SHP-1基因Exon2的上游。
2.一种靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统，其特征在于，所述基因编辑系统包括权利要求1所述的靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA；
所述sgRNA分别靶向SHP-1基因Exon9的下游和SHP-1基因Exon2的上游；
所述基因编辑系统还包括Cas9 mRNA和同源重组Donor；
所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述同源重组Donor中含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列；
所述同源重组Donor的构建引物如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ IDNO:6所示。
3.一种气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
（1）构建权利要求2所述的靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统；
（2）利用步骤（1）所述基因编辑系统对小鼠受精卵进行基因编辑，再进行杂交，构建Flox小鼠；
（3）将Flox小鼠与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/fl的小鼠（SHP-1Δ/Δ），利用气道上皮细胞Clara蛋白启动Cre系统诱导，构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。
4.根据权利要求3所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下具体步骤：
（a）分别制备靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、Cas9 mRNA和同源重组Donor；
（b）将sgRNA、Cas9 mRNA和Donor同时注射到小鼠受精卵中，经基因整合，得到SHP-1基因Exon9的下游和Exon2的上游分别插入含有loxP元件片段的基因重组受精卵，将注射后存活的受精卵移植到假孕母鼠子宫中，得到F0代小鼠；
（c）将F0代中的阳性小鼠与野生型小鼠WT进行交配，获得F1代小鼠，在F1代杂合子小鼠SHP-1fl/WT之间进行杂交，得到可稳定传代的F2代小鼠，对获得的F2代小鼠进行PCR鉴定和测序，筛选F2代纯合子Flox小鼠（SHP-1fl/fl）和杂合子Flox小鼠（SHP-1fl/WT）；
（d）将F2代纯合子SHP-1fl/fl小鼠或杂合子SHP-1fl/WT小鼠与CC10-CreER工具鼠杂交，筛选出基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/WT的F3代小鼠；
（e）将筛选出的F3代小鼠与F2代纯合子SHP-1fl/fl小鼠回交，筛选出基因型为CC10-CreER+/-×SHP-1fl/fl的F4代SHP-1Δ/Δ小鼠；
（f）F4代SHP-1Δ/Δ小鼠通过腹腔注射他莫昔芬，构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除的小鼠模型。
5.根据权利要求4所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述SHP-1基因Exon9的下游插入含有loxP元件的片段，所述含有loxP元件的片段如SEQ ID NO:8所示。
6.根据权利要求4所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述SHP-1基因Exon2的上游插入含有loxP元件的片段，所述含有loxP元件的片段如SEQ ID NO:9所示。
7.根据权利要求4所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤（c）中，所述对获得的F2代小鼠进行PCR鉴定的特异性引物对包括：
短链筛选鉴定引物对：鉴定SHP-1基因Exon2的上游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组无条带，Mutant组得到315 bp的条带；
1loxp插入鉴定引物对：鉴定SHP-1基因Exon2的上游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组得到430 bp的条带，Mutant组得到508 bp的条带；
2loxp插入鉴定引物对：鉴定SHP-1基因的Exon9下游是否插入有1个loxP位点，判断标准：WT组得到390 bp的条带，Mutant组得到476 bp的条带。
8.根据权利要求7所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述短链筛选鉴定引物对如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示。
9.根据权利要求7所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述1loxp插入鉴定引物对如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示。
10.根据权利要求7所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，所述2loxp插入鉴定引物对如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示。
11.根据权利要求4所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤（c）中，所述测序采用的扩增引物包括：扩增1loxp的引物对和扩增2loxp的引物对；
其中，所述扩增1loxp的引物对如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；所述扩增2loxp的引物对如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示。
12.根据权利要求4所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法，其特征在于，步骤（c）中，所述测序采用的测序引物如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
13.一种构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、同源重组Donor和Cas9 mRNA；
所述靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成；所述sgRNA分别靶向SHP-1基因Exon9的下游和SHP-1基因Exon2的上游；
所述同源重组Donor中含有loxP元件，所述同源重组Donor中含有如SEQ ID NO:7所示的核苷酸序列。
14.根据权利要求13所述的构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对Flox小鼠进行PCR鉴定的特异性引物对，所述引物对包括短链筛选鉴定引物对、1loxp插入鉴定引物对或2loxp插入鉴定引物对中任意一种或至少两种的组合；
所述短链筛选鉴定引物对如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；
所述1loxp插入鉴定引物对如SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13所示；
所述2loxp插入鉴定引物对如SEQ ID NO:14和SEQ ID NO:15所示。
15.根据权利要求13所述的构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对Flox小鼠进行测序的扩增引物和测序引物；
所述扩增引物包括：扩增1loxp的引物对和扩增2loxp的引物对；
其中，所述扩增1loxp的引物对如SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11所示；所述扩增2loxp的引物对如SEQ ID NO:16和SEQ ID NO:17所示；
所述测序引物如SEQ ID NO:13和SEQ ID NO:14所示。
16.根据权利要求13所述的构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括对所述CC10-CreER工具鼠进行PCR鉴定的特异性引物对，所述引物对如SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19和SEQ ID NO:20所示。
17.一种呼吸系统重大慢性疾病的治疗和/或预防药物的筛选装置，其特征在于，所述筛选装置采用气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型进行药物筛选，所述小鼠模型由权利要求3-12中任一项所述气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法和/或权利要求13-16中任一项所述构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒构建得到。
18.根据权利要求17所述的呼吸系统重大慢性疾病的治疗和/或预防药物的筛选装置，其特征在于，所述呼吸系统重大慢性疾病包括哮喘、慢阻肺或肺纤维化中任意一种或至少两种的组合。
19.权利要求1所述的靶向小鼠SHP-1基因的sgRNA、权利要求2所述的靶向小鼠SHP-1基因的基因编辑系统、权利要求3-12中任一项所述的气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的构建方法、权利要求13-16中任一项所述的构建气道上皮细胞SHP-1基因特异性敲除小鼠模型的试剂盒或权利要求17或18所述的呼吸系统重大慢性疾病的治疗和/或预防药物的筛选装置中任意一种在疾病机制探索和/或药物制备中的应用。
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Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108866004A (zh) * | 2018-06-26 | 2018-11-23 | 奥妙生物技术（广州）有限公司 | Shp-1敲除的t细胞及其构建方法 |
| CN113519460A (zh) * | 2021-06-30 | 2021-10-22 | 华南农业大学 | 一种诱导型子宫上皮特异性基因工程鼠的构建及应用 |
| CN113678789A (zh) * | 2021-08-26 | 2021-11-23 | 嘉兴学院 | Mir-379/410基因簇敲除的小鼠模型及其构建方法 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US20200080056A1 (en) * | 2018-09-06 | 2020-03-12 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | CRISPR-Cas9 Knock-out of SHP-1/2 to Reduce T cell Exhaustion in Adoptive Cell Therapy |
-
2022
- 2022-07-29 CN CN202210907894.7A patent/CN116334077B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| SHP-1在Ⅱ型肺泡上皮细胞中去磷酸化调控β-Catenin并抑制肺纤维化损伤的研究;陈子;《中国博士学位论文全文数据库医药卫生科技辑》(第6期);全文 * |
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| Publication number | Publication date |
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| CN116334077A (zh) | 2023-06-27 |
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