CN110438159B - 一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法,该方法将小鼠第7号染色体上的Bag3基因的第128541926位碱基由胞嘧啶替换为胸腺嘧啶,并按sgRNA1转录产物︰sgRNA2转录产物︰Cas9转录产物︰Bag3基因突变同源重组模板=1︰1︰2︰1的质量比对小鼠的胚胎进行基因编辑,不仅显著提高了同源重组时的基因定点突变效率,而且所构建的小鼠品系具有成活率高和寿命长的优点。
Description
技术领域
本发明涉及突变或遗传工程,具体涉及选育脊椎动物小鼠模型的方法,该方法使用微量注射法将外来DNA稳定地引入染色体中。
背景技术
Bcl-2相关抗凋亡蛋白3(Bcl-2associated athanogene 3,Bag3)在正常人体组织中表达较弱或不表达,但在横纹肌(心肌、骨骼肌)细胞中高表达于Z盘,主要辅助Z盘蛋白质有序折叠,维持机械压力诱发下肌纤维的完整。目前的研究已经证实Bag3基因突变导致横纹肌结构改变形成肌原纤维肌病,主要表现为进行性运动功能下降和心功能衰竭,病人成年之前常死亡。该病属于罕见的运动系统重大病,但目前该病的分子病理机制并不清楚,因而也缺乏有效的治疗方法。
小鼠Bag3基因位于小鼠第7号染色体,共有4个外显子。Bag3基因进化上较为保守,Bag3基因主要特异性的表现在小鼠横纹肌Z盘。为了深入研究Bag3基因突变肌原纤维肌病的分子病理机制,韩国和日本的研究者采用经典的同源重组的方式,利用Cre-Loxp系统同源敲除系统获得同时删除Bag3第4外显子以及CAIR-1基因的杂合子小鼠,杂合子与野生型经过杂交后获得双基因缺陷小鼠,但双缺陷小鼠生长迟缓,出生后3w即死亡(Youn D Y,etal.Bis deficiency results in early lethality with metabolic deterioration andinvolution of spleen and thymus)。Sachiko Homma等美国科学家通过使用一组逆转录病毒插入诱变的小鼠胚胎干细胞克隆来鉴定单个逆转录病毒插入选择性破坏小鼠Bag3基因的细胞,然后回交到C57BL/6小鼠,建立Bag3缺陷小鼠,但这些缺陷小鼠1-2周明显生长迟缓,4周即死亡(Homma S,et al.BAG3Deficiency Results in Fulminant Myopathy andEarly Lethality)。由于上述基因打靶技术效率极低,构建的转基因小鼠死亡率高,无法进行疾病模型的长期观察和深入研究。
临床工作中发现Bag3基因突变主要是由于基因的单核苷酸多态性引起的,所谓的单核苷酸多态是指在基因组水平上单个核苷酸(A、C、G、T)发生变异(转换、插入或缺失)所引起的序列的多态性。而上述已建立的模型小鼠则是删除Bag3基因的某个外显子,或者选择性破坏小鼠Bag3基因的细胞,可见,这些方法对基因的完整性破坏性较大,所产生的后代小鼠生育率降低、明显生长迟缓,出生后4周内即死亡,无法开展细致、深入的研究。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法,该方法的基因编辑效率高,且所构建的小鼠品系具有成活率高和寿命长的优点。
本发明解决上述问题的技术方案如下:
一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法,该方法包括以下步骤:
(1)利用CHOPCHOP网站所提供的sgRNA设计平台,依据小鼠第7号染色体上的Bag3基因第128541921-128541946位的碱基序列设计两条与所述碱基序列互补的sgRNA序列sgRNA1和sgRNA2;其中,所述sgRNA1序列如SEQ NO.1所示,所述sgRNA2序列如SEQ NO.2所示;
(2)依据互补原则,设计出sgRNA1的互补序列SEQ NO.3和sgRNA2的互补序列SEQNO.4;然后,将SEQ NO.1的3’端与SEQ NO.3的5’端相连成双链,将SEQ NO.2的3’端与与SEQNO.4的5’端相连成双链;
(3)使用限制性核酸内切酶BsaI分别对两个骨架载体pGL3-U6-sgRNA-Puromycin进行酶切,然后将步骤(2)所得双链分别插入两个骨架载体pGL3-U6-sgRNA-Puromycin的酶切位置,并扩增纯化,得到sgRNA1表达质粒和sgRNA2表达质粒;
(4)通过T7体外转录试剂盒对pST1374-Cas9-ZFNLS表达质粒与步骤(3)得到的sgRNA1表达质粒和sgRNA2表达质粒分别进行体外转录,并用凝胶回收试剂盒回收转录产物,得到sgRNA1转录产物、sgRNA2转录产物和Cas9转录产物;
(5)将小鼠第7号染色体上的Bag3基因的第128541926位碱基由胞嘧啶替换为胸腺嘧啶,并以所述第128541926位碱基为中心向Bag3基因序列的上游和下游各选择61个碱基得到如SEQ NO.5所示序列,然后按SEQ NO.5所示序列合成出Bag3基因突变同源重组模板;
(6)按sgRNA1转录产物︰sgRNA2转录产物︰Cas9转录产物︰Bag3基因突变同源重组模板=1︰1︰2︰1的质量比将步骤(4)得到的三种转录产物与步骤(5)得到的Bag3基因突变同源重组模板混合并稀释,然后将所得到的得到混合溶液显微注射到小鼠受精卵中,再移植入的另一只小鼠子宫内代孕,得到基因纯合子点突变小鼠;
(7)选择雄性基因纯合子点突变小鼠与野生型同种雌鼠杂交繁殖,得到杂合子突变小鼠;
(8)让杂合子突变小鼠雌雄交配繁殖,然后从中选取纯合子点突变小鼠雌雄交配繁殖,得到所述的基因突变小鼠模型。
上述步骤(4)所述的T7体外转录试剂盒优选美国,Ambion公司生产的T7体外转录试剂盒AM1345。
上述步骤(4)所述的凝胶回收试剂盒优选德国,QIAGEN公司生产的QIAquick GelExtraction Kit凝胶回收试剂盒28704。
上述步骤(6)所述将步骤(4)得到的三种转录产物与步骤(5)得到的Bag3基因突变同源重组模板混合并稀释的要求是:使稀释液中sgRNA1转录产物的终浓度为25ng/μl,sgRNA2转录产物的终浓度为25ng/μl,Cas9转录产物的终浓度为50ng/μl,Bag3基因突变同源重组模板的终浓度为25ng/μl。
现有采用CRISPR/Cas敲除技术进行基因编辑时,设计的sgRNA剪切位点多为一个剪切位置,在DNA被剪切成功后,依靠DNA的损伤修复机制而产生目的基因敲除效果;本申请则采用双sgRNA对Bag3基因128541921-128541946位的总长为26bp的碱基序列进行精确切割,从而产生DNA特定位置的双链缺口,随后按sgRNA1转录产物︰sgRNA2转录产物︰Cas9转录产物︰Bag3基因突变同源重组模板=1︰1︰2︰1的质量比对小鼠的胚胎进行基因编辑,可提高同源重组时的基因定点突变效率。
为克服了现有技术将小鼠Bag3基因整体敲除而导致成活率低、寿命短的缺点,本方法采用仅将小鼠第7号染色体上的Bag3基因的第128541926位碱基由胞嘧啶替换为胸腺嘧啶的方法得到基因纯合子点突变小鼠,对模型小鼠的损伤显著降低,从而使模型小鼠成活率高达64%,寿命长达13个月。本方法还具有制作简单、成本低的优点。
附图说明
图1为sgRNA序列对应的靶点位置与sgRNA1和sgRNA2的切割位点的结构示意图。
图2为sgRNA脱靶效应分析图。
图3为pGL3-U6-sgRNA-Puromycin质粒图谱,图谱中显示出酶切位点。
图4为pST1374-Cas9-ZF-NLS质粒图谱。
图5为检测小鼠胚胎基因编辑效率的电泳条带图,图中自左向右依次是,泳道1为DNA Marker、泳道2为未突变胚胎基因组DNA、泳道3至泳道8均为突变的胚胎基因组DNA。
图6为F0代小鼠Bag3基因点突变的Sanger法测序的DNA序列光谱图,其中,上图为野生型小鼠DNA序列,下图为突变型小鼠DNA序列;方框内所示的碱基位置为突变位点。
图7为F1代小鼠Bag3基因点突变的Sanger法测序DNA序列光谱图,其中,上图为野生型小鼠DNA序列,下图为F1代杂合子小鼠DNA序列。
图8为F1代小鼠靶向等位基因的点突变mRNA转录的氨基酸序列图。
图9为突变纯合子小鼠基因Sanger法测序的DNA序列光谱图。
具体实施方式
例1(基因突变小鼠模型的构建)
本实施例以C57BL/6小鼠为例详细本发明所述基因突变小鼠模型的构建方法,该方法的具体步骤如下:
1.CRISPR/Cas9基因敲除靶位点设计
在National Center for Biotechnology Information(NCBI)网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)上查询C57BL/6小鼠Bag3基因的基因组DNA序列及其功能结构域;根据CRISPR/Cas敲除原理,利用CHOPCHOP网站(http://chopchop.cbu.uib.no/)所提供的sgRNA设计平台,依据小鼠第7号染色体上的Bag3基因128541921-128541946位的碱基序列(总长为26bp,位于第3外显子上),设计出2条与该碱基序列互补结合的sgRNA序列(sgRNA1和sgRNA2)。所述的sgRNA序列如下所示:
sgRNA1序列:TGCTCATGTATCACGGGGAT(SEQ NO.1),
sgRNA2序列:ATATTCTGCTCATGTATCAC(SEQ NO.2);
上述sgRNA序列对应的靶点位置与sgRNA1和sgRNA2的切割位点见图1。
然后,通过网站(http://crispr.mit.edu/),对sgRNA1和sgRNA2进行脱靶效应分析。脱靶效应是指sgRNA未能正确结合在实验所需的剪切位置,而与其他位置的碱基序列结合,从而导致剪切效率较低或者剪切失败。每个潜在脱靶位点都有一个得分,该得分是通过计算sgRNA与脱靶位点的错配结合碱基数量以及PAM序列的错配距离得出。此得分越高则表明潜在脱靶位点结合sgRNA的可能性越低。脱靶分析结果显示sgRNA1的得分为89,sgRNA2的得分为70,得分均较高,说明所设计的sgRNA序列特异性高,而脱靶可能性低。脱靶分析结果如图2所示。
接着,依据碱基互补配对原则,设计出如下所示的sgRNA1互补序列和sgRNA2互补序列:sgRNA1互补序列:ATCCCCGTGATACATGAGCA(SEQ NO.3),
sgRNA2互补序列:GTGATACATGAGCAGAATAT(SEQ NO.4);
然后,采用退火的方法将SEQ NO.1的3’端与SEQ NO.3的5’端相连成双链,将SEQNO.2的3’端与与SEQ NO.4的5’端相连成双链。
2.构建sgRNA表达载体
(1)按把发明人提供的序列由上海生工生物工程股份有限公司合成sgRNA1、sgRNA2和sgRNA1与sgRNA2的互补序列,并连接成上述的两条双链。
(2)通过使用限制性核酸内切酶BsaI对两个sgRNA骨架载体pGL3-U6-sgRNA-Puromycin进行酶切,得到酶切后sgRNA骨架载体。所述sgRNA骨架载体pGL3-U6-sgRNA-Puromycin的结构及酶切位点如图3所示。
在进行上述酶切前取2μgsgRNA骨架载体pGL3-U6-sgRNA-Puromycin加入ddH2O配制成浓度为0.25μg/μL的载体。上述酶切反应体系如下:
上述酶切反应的具体方法如下:
A、离心混匀后于37℃水浴酶切2h以上,65℃10min终止酶切,取出冰浴骤冷,得到酶切后的sgRNA骨架载体;
B、取酶切后的sgRNA骨架载体,经过1%琼脂糖电泳纯化,采用凝胶回收试剂盒(TaKaRa,AI51866A)对酶切后的sgRNA骨架载体进行回收。
(3)回收的酶切后的sgRNA骨架载体与步骤(1)所得的两个双链进行连接,得到sgRNA1表达质粒和sgRNA2表达质粒。该步骤的具体方法为:将按下述反应体系配制的反应液离心混匀后于4℃过夜,得到sgRNA1表达质粒和sgRNA2表达质粒。
质粒连接反应体系如下:
3.体外转录获得sgRNA表达质粒和Cas9表达质粒的转录产物
先利用T7体外转录试剂盒(Ambion,AM1345)中的核酸内切酶对sgRNA1表达质粒、sgRNA2表达质粒以及Cas9表达质粒进行线性化,再用所述T7体外转录试剂盒将sgRNA1表达质粒、sgRNA2表达质粒以及Cas9表达质粒(pST-Cas9-ZFNLS质粒如图4所示)进行体外转录,获得sgRNA1转录产物、sgRNA2转录产物和Cas9转录产物。
4.同源重组模板序列构建
(5)将小鼠第7号染色体上的Bag3基因的第128541926位碱基由胞嘧啶替换为胸腺嘧啶,并以所述第128541926位碱基为中心向Bag3基因的上游和下游各选择61个碱基得到如SEQ NO.5所示序列,交上海生工生物工程股份有限公司合成,得到Bag3基因的突变同源重组模板,该同源重组模板的DNA序列如SEQ NO.5所示:
5.C57BL/6小鼠胚胎的显微注射
A、将sgRNA1转录产物、sgRNA2转录产物和Cas9转录产物以及Bag3基因突变同源重组模板,按sgRNA1转录产物︰sgRNA2转录产物︰Cas9转录产物︰Bag3基因突变同源重组模板=1︰1︰2︰1的质量比混合并稀释,使sgRNA1转录产物的终浓度为25ng/μl,sgRNA2转录产物的终浓度为25ng/μl,Cas9转录产物的终浓度为50ng/μl,Bag3基因突变同源重组模板的终浓度为25ng/μl,得到混合溶液;
B、让C57BL/6小鼠交配,在受精后30min之内,用吸管吸取胚胎转移至用琼脂糖制作的显微注射专用培养皿中,然后用显微注射仪器将所述混合溶液注射入体外受精小鼠受精卵的原核部分,构建形成特定的小鼠胚胎细胞(受精卵),即完成在小鼠胚胎细胞中基因定点突变的编辑;
6.基因编辑效率检测
(1)提取小鼠胚胎基因组
于胚胎注射基因编辑混合物50小时后,分别收集未进行基因编辑的胚胎(共3枚胚胎)和基因编辑的胚胎(共18枚胚胎)于2mL无菌离心管中,每管3只胚胎,按照下述方法提取基因组DNA,具体步骤如下:
向装有胚胎的离心管中加入500μL细胞裂解液,3μL蛋白酶K,置于55℃水浴锅中裂解2小时,此期间每隔0.5小时,轻轻颠倒混匀,以保证胚胎被充分裂解完全;裂解完成后,放在振荡器上充分震荡,加入等体积预先冷却的异丙醇于离心管中,充分颠倒混匀,于4℃条件下,12000×g离心8min,倒掉上清液;加入75%乙醇600μL,于4℃条件下,12000×g离心8min,弃上清液,室温风干30min;加入80-100μL去离子水,充分吹打混匀。得到未突变和突变的胚胎基因组DNA。
(2)PCR扩增目的序列
提取未突变和突变的胚胎基因组DNA(DNA模板)后,根据CRISPR靶位点(Bag3基因的第128541926位碱基)上下游约150-200bp的基因组区域,利用PrimerPremier5.0软件设计PCR引物序列以扩增出目的DNA片段;其中所述PCR引物序列:
正向引物:GGAGTGGTGCTGGAGATTGAAACC(SEQ No.6);
反向引物:GAAGCACCTCTGACGGGTGAACCT(SEQ No.7)。
PCR反应体系如下:
PCR反应步骤和条件如下:
A、震荡混匀PCR反应体系后,4℃离心,于PCR仪上进行扩增反应,得到PCR产物;其中PCR反应条件为:预变性94℃3min,其中变性94℃30s,退火55℃30s,延伸72℃23s共30个循环,再72℃3min;
B、待反应结束后,离心PCR产物,取1μL样品点样于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,检测PCR产物大小是否正确。
(3)T7核酸内切酶I法检测基因编辑效率
首先,取未突变和突变的胚胎基因组DNA的PCR扩增产物各500ng混匀,置于95℃热水中进行变性,然后自然冷却至室温,得到未突变和突变的DNA杂交产物。然后使用T7E1检测试剂盒进行基因编辑效率的检测,该检测的反应体系如下:
具体检测方法如下:
于胚胎注射基因编辑混合物50小时后,分别收集未进行基因编辑的胚胎(共3枚未突变胚胎)和进行基因编辑的胚胎(共18枚突变胚胎)。3枚胚胎为1组,放进2mL无菌离心管中,按照下述方法提取基因组DNA,共得到7管提取的DNA,分别为未突变胚胎基因组DNA、突变胚胎基因组DNA 1、突变胚胎基因组DNA 2、突变胚胎基因组DNA 3、突变胚胎基因组DNA4、突变胚胎基因组DNA 5和突变胚胎基因组DNA 6。具体步骤如下:
混匀体系后,于37℃水浴锅中酶切反应40min,获得未突变和突变的酶切后DNA;将未突变和突变的酶切后DNA上样于浓度为2%(g/mL)的琼脂糖凝胶的样品孔中,每个样品孔中上样DNA 1000ng,进行琼脂糖电泳;电泳条件为:电压100V,电泳时间为45min,以分子大小不同的DNA片段混合物为Marker(购于北京索莱宝生物公司,产品编号:M1600),并将电泳结果在凝胶成像系统中拍照,得到如图5所示的琼脂糖凝胶电泳图。上述的琼脂糖凝胶中含有浓度为500ng/mL溴化乙锭。
电泳结束后,使用ImageJ软件测算各泳道DNA条带的灰度值,并计算基因编辑效率,基因编辑效率(%)=(300bp DNA条带灰度值+206bp DNA条带灰度值)/3个DNA条带的总灰度值×100。
结果显示,进行了基因编辑操作的胚胎的剪切效率较高,其中泳道4的3枚胚胎的编辑效率达到了91.9%。
在进行基因编辑效率检测后,选取的母鼠与结扎公鼠合笼,获取代孕母鼠,将注射后的受精卵移植入代孕母鼠的子宫内,将代孕母鼠放在干净的笼盒中,并保温待其清醒后放回笼架饲养,至此受精卵移植完成,待F0代小鼠出生。
7.F0代小鼠基因编辑效率检测
通过对F0代小鼠剪脚趾提取基因组DNA,通过特异性引物(特异性引物的上下游序列如SEQ NO.6和SEQ NO.7所示)进行PCR实验,扩增出目的DNA片段,并进行测序,结果如图6所示。获得了3只雄性F0代纯合子点突变小鼠。
具体操作步骤如下:
(1)提取基因编辑后F0代小鼠基因组
待F0代小鼠出生1周后,剪取脚趾,使用DNA提取试剂盒(TaKaRa,UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取基因组DNA。
(2)PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后,根据CRISPR靶位点上下游各150bp的基因组区域,利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列(SEQ No.6和SEQ No.7),扩增出目的DNA片段。
PCR反应体系如下:
PCR反应步骤和条件如下:
A、震荡混匀PCR反应体系后,4℃离心,于PCR仪上进行扩增反应,得到PCR产物;其中PCR反应条件为:预变性94℃3min,其中变性94℃30s,退火55℃30s,延伸72℃23s共30个循环,再72℃3min;
B、待反应结束后,离心PCR产物,取1μL样品点样于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,检测PCR产物大小是否正确;
(3)使用2.0%琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物,在紫外下切下目的条带,采用凝胶回收试剂盒(TaKaRa,AI51866A)进行纯化回收,进行基因测序;将获得的3只纯合子突变的F0代雄性小鼠与C57BL/6野生型雌鼠合笼,进行传代繁育和种群扩大,以获得阳性F1代小鼠。
8.获得F1代基因突变体小鼠
对获得的F1代小鼠的DNA进行PCR扩增(PCR扩增的引物如SEQ NO.6和SEQ NO.7所示)和基因测序,检测Bag3基因的点突变效率,确定突变稳定遗传到F1代小鼠,并筛选出F1代突变小鼠,共获得6只F1代小鼠,雄性2只,雌性4只,基因型均为杂合子(检测结果如图7所示)。F1代小鼠靶向等位基因的点突变mRNA转录的氨基酸序列如图8所示(阴影部分表示突变序列P变L)。
具体操作步骤如下:
(1)提取基因编辑后F1代小鼠基因组
待F1代小鼠出生4周后,剪取脚趾,使用DNA提取试剂盒(TaKaRa,UniversalGenomic DNA Extraction Kit Ver.5.0)提取基因组DNA。
(2)PCR扩增目的序列
提取基因组DNA之后,根据CRISPR靶位点上下游各150bp的基因组区域,利用Primer Premier 5.0软件设计引物序列(SEQ No.6和SEQ No.7),扩增出目的DNA片段。
PCR反应体系如下:
PCR反应步骤和条件如下:
A、震荡混匀PCR反应体系后,4℃离心,于PCR仪上进行扩增反应,得到PCR产物;其中PCR反应条件为:预变性94℃3min,其中变性94℃30s,退火55℃30s,延伸72℃23s共30个循环,再72℃3min;
B、待反应结束后,离心PCR产物,取1μL样品点样于2.0%琼脂糖凝胶上进行电泳,检测PCR产物大小是否正确;
(3)若PCR产物正确,在紫外下切下目的条带,采用凝胶回收试剂盒(TaKaRa,AI51866A)进行纯化回收并测序;
结果共获得6只F1代小鼠,雄性2只,雌性4只,基因型均为杂合子,基因型结果如图9所示。测序结果有双峰出现的则证明是杂合子,确定突变稳定遗传到F1代小鼠。
9.获得F2代Bag3基因点突变纯合子小鼠
从F1代突变体中挑选相同突变的杂合子突变雌鼠和杂合子突变雄鼠,合笼1周后,将受孕雌鼠单笼饲养,分娩获得F2代杂交小鼠。小鼠出生后8周后,剪尾提取组织DNA,通过PCR反应和基因测序检测,筛选出Bag3基因点突变体纯合子。具体操作步骤同步骤8的F1代基因突变体小鼠选育方法。
10.获得Bag3基因点突变纯合子小鼠种系
从F2代突变体中挑选纯合子突变的雌鼠和雄鼠,合笼1周后,将受孕雌鼠单笼饲养,分娩得到纯合子小鼠。纯合子小鼠出生后8周后,剪尾提取组织DNA,通过PCR扩增反应鉴定基因类型。
将得到的纯合子小鼠合笼饲养,继续繁殖,扩大种群。
例2(成活率和寿命统计分析)
例1所述基因突变小鼠模型的构建过程,通过四次配种繁育和基因型鉴定,共得到Bag3基因点突变纯合子小鼠61只,其中,F0代纯合子2只,F2代纯合子5只,繁育获得的纯合子小鼠54只,测序结果见图9。54只纯合子小鼠中雄鼠33只,雌鼠21只。最大小鼠年龄为13月龄,胎鼠出生存活率为64%(死亡胎鼠多为畸形以及发育不全);与已有文献报道的BAG3基因敲除鼠在出生4-6周均会死亡,本实验方法的存活率大幅升高,并且明显提高了基因编辑效率。
四次繁育的雌鼠的平均产仔率分别为:第一次繁育平均每只雌鼠产仔5.5只;第二次繁育平均每只雌鼠产仔5只;第三次繁育平均每只雌鼠产仔5.1只;第四次繁育平均每只雌鼠产仔4.1只。具体统计结果见下表:
纯系小鼠繁殖率以及存活率统计
序列表
<110> 广州中医药大学(广州中医药研究院)
<120> 一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tgctcatgta tcacggggat 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atattctgct catgtatcac 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
atccccgtga tacatgagca 20
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
gtgatacatg agcagaatat 20
<210> 5
<211> 123
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccctcctccg gcaggagcag tctgggtagc catcagctcc ccaggggcta catccccatc 60
ctcgtgatac atgagcagaa tatcacccgg ccagcagccc agccctcctt ccaccaagcc 120
cag 123
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggagtggtgc tggagattga aacc 24
<210> 7
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
gaagcacctc tgacgggtga acct 24
Claims (1)
1.一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法,该方法包括以下步骤:
(1)利用CHOPCHOP网站所提供的sgRNA设计平台,依据小鼠第7号染色体上的Bag3基因第128541921-128541946位的碱基序列设计两条与所述碱基序列互补的sgRNA序列sgRNA1和sgRNA2;其中,所述sgRNA1序列如SEQ NO.1所示,所述sgRNA2序列如SEQ NO.2所示;
(2)依据互补原则,设计出sgRNA1的互补序列SEQ NO.3和sgRNA2的互补序列SEQ NO.4;然后,将SEQ NO.1的3’端与SEQ NO.3的5’端相连成双链,将SEQ NO.2的3’端与与SEQ NO.4的5’端相连成双链;
(3)使用限制性核酸内切酶BsaI分别对两个骨架载体pGL3-U6-sgRNA-Puromycin进行酶切,然后将步骤(2)所得双链分别插入两个骨架载体pGL3-U6-sgRNA-Puromycin的酶切位置,并扩增纯化,得到sgRNA1表达质粒和sgRNA2表达质粒;
(4)通过T7体外转录试剂盒对pST1374-Cas9-ZFNLS表达质粒与步骤(3)得到的sgRNA1表达质粒和sgRNA2表达质粒分别进行体外转录,并用凝胶回收试剂盒回收转录产物,得到sgRNA1转录产物、sgRNA2转录产物和Cas9转录产物;
(5)将小鼠第7号染色体上的Bag3基因的第128541926位碱基由胞嘧啶替换为胸腺嘧啶,并以所述第128541926位碱基为中心向Bag3基因序列的上游和下游各选择61个碱基得到如SEQ NO.5所示序列,然后按SEQ NO.5所示序列合成出Bag3基因突变同源重组模板;
(6)按sgRNA1转录产物︰sgRNA2转录产物︰Cas9转录产物︰Bag3基因突变同源重组模板=1︰1︰2︰1的质量比将步骤(4)得到的三种转录产物与步骤(5)得到的Bag3基因突变同源重组模板混合并稀释,然后将所得到的得到混合溶液显微注射到小鼠受精卵中,再移植入的另一只小鼠子宫内代孕,得到基因纯合子点突变小鼠;
(7)选择雄性基因纯合子点突变小鼠与野生型同种雌鼠杂交繁殖,得到杂合子突变小鼠;
(8)让杂合子突变小鼠雌雄交配繁殖,然后从中选取纯合子点突变小鼠雌雄交配繁殖,得到所述的基因突变小鼠模型。
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