CN116287003A - 腓骨肌萎缩症小鼠模型及其构建方法与应用 - Google Patents

腓骨肌萎缩症小鼠模型及其构建方法与应用 Download PDF

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Abstract

本申请涉及生物技术领域，尤其涉及一种腓骨肌萎缩症小鼠模型及其构建方法与应用。提供了一种腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法，包括：通过序列分析和小角散射构象分析，得到与腓骨肌萎缩症相关的基因突变位点R329H；利用CRISPR‑Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，得到突变受精卵；将所述突变受精卵转入假孕雌鼠子宫，所述假孕雌鼠开始培育，得到腓骨肌萎缩症小鼠模型。构建得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，可以用于腓骨肌萎缩症相关药物的研究。

Description

腓骨肌萎缩症小鼠模型及其构建方法与应用
技术领域
本申请属于生物技术领域，尤其涉及一种腓骨肌萎缩症小鼠模型及其构建方法与应用。
背景技术
腓骨肌萎缩症(Charcot-Marie-Tooth，CMT)亦称为遗传性运动感觉神经病(HMSN)，具有明显的遗传异质性，临床主要特征是四肢远端进行性的肌无力和萎缩伴感觉障碍。CMT是最常见的遗传性周围神经病之一(发病率约为1/2500)。根据临床和电生理特征，CMT分为两型：CMT1型(脱髓鞘型)，神经传导速度(NCV)减慢(正中神经传导速度s)，CMT2型(轴突型)，神经传导速度正常或轻度减慢(正中神经传导速度>38m/s)。多数呈常染色体显性遗传，也可呈常染色体隐性或X-连锁遗传。
脱髓鞘型常染色体隐性遗传的CMT主要特征是发病年龄早，常在儿童期起病，神经传导速度减慢，周围神经有髓纤维髓鞘脱失或减少。随着分子遗传学的进展，已发现其至少有7个疾病基因位点，分别为8q13-21.1，11q22，11p15，5q23-33，8q24，19q13.1-13.3，10q22-23。其中5种疾病基因已被克隆，分别为神经节苷脂诱导的分化蛋白1(GDAP1)、肌管蛋白相关蛋白2(MTMR2)、N-myc Downstream-Regulated Gene 1(NDRG1)、早期生长反应蛋白2(EGR2)、轴突周围蛋白(periaxin)等基因的突变已被发现能导致本病。其中，脱髓鞘型常染色体隐性遗传的CMT又分成7个亚型，具体如下：CMT4A、CMT4B、CMT4C、CMT4D、CMT4E、CMT4F、HMSN-Russe。
轴突型常染色体隐性遗传的CMT主要特征是发病年龄相对较早，常在青春期起病，神经传导速度正常或轻度减慢，神经病理学显示为轴突变性。已发现两个基因位点1q21.2-21.3、19q13.3与之有关，分别命名为CMT2B1、CMT2B2，核纤层蛋白A/C基因(LMNA)的突变可导致CMT2B1，具体如下：轴突型常染色体隐性遗传的CMT常见的亚型，具体包括：CMT2B1、CMT2B2。
虽然CMT是一组明显临床和遗传异质性的疾病，目前也已定位了一些疾病位点，并克隆了一些疾病基因，但是目前国内外的有关腓骨肌萎缩症的动物模型十分少，不利于进行相应药物研发，因此，有必要提供一种安全有效的腓骨肌萎缩症有关的小鼠模型，为科学研究提供可靠的基础。
发明内容
本申请的目的在于提供一种腓骨肌萎缩症小鼠模型及其构建方法与应用，旨在解决现有技术中国内外的有关腓骨肌萎缩症的动物模型十分少，不利于进行相应药物研发的问题。
为实现上述申请目的，本申请采用的技术方案如下：
第一方面，本申请提供一种腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
通过序列分析和小角散射构象分析，得到与腓骨肌萎缩症相关的基因突变位点R329H；
利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，得到突变受精卵；
将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫，假孕雌鼠开始培育，得到腓骨肌萎缩症小鼠模型。
进一步，序列分析包括：基于序列保守性，对与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点进行分析，筛选得到保守性位点R329。
进一步，与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点包括N71、G102、R329、E688、E778、D893。
进一步，小角散射构象分析包括：将与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点分别进行回转半径和最大密度分析，筛选得到构象变化的的基因突变位点R329H。
进一步，基因突变位点R329H的回转半径为
Figure BDA0004101498960000031
最大密度为/>
Figure BDA0004101498960000032
进一步，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因的步骤中，包括：
设计用于DNA双链切割的gRNA，gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示gRNA3和gRNA4；
采用gRNA对DNA进行双链切割后，以Donor oligo模板同源重组修复，且Donoroligo模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
在R329H点突变基因的上下游分别设计上游引物、下游引物以及测序引物，进行PCR扩增，以鉴定所述受精卵的Aars基因中是否插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，上游引物、下游引物和测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
进一步，PCR扩增的程序如下：
95℃预变性3min；35个循环的如下反应程序：95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s；72℃过度延伸5min。
进一步，PCR扩增的体系如下：
Figure BDA0004101498960000041
进一步，将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫的步骤中，包括：
选取4-5周龄的雌鼠，并对所述雌鼠进行激素超排处理；
将经过激素超排处理的雌鼠与公鼠合笼，得到单细胞受精卵；
将正常雌鼠与结扎公鼠合笼，得到假孕雌鼠；
将Cas9-D10A mRNA、Donor oligo、gRNA3和gRNA4混合得混合物，并将混合物注射至单细胞受精卵内，得到突变受精卵；
将突变受精卵于培养基内培养后移植到假孕雌鼠的输卵管内。
第二方面，本申请提供一种腓骨肌萎缩症小鼠模型，腓骨肌萎缩症小鼠模型采用腓骨肌萎缩症小鼠模型的制备方法制备得到。
第三方面，本申请提供腓骨肌萎缩症小鼠模型在筛选预防或治疗腓骨肌萎缩症的药物中的应用。
本申请第一方面提供的腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法，是基于序列分析和小角散射构象分析先确定了基因突变位点，再利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得突变受精卵，再将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫进行培育，获得腓骨肌萎缩症小鼠模型。且得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的后肢以及后爪都有明显的蜷缩，说明腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，可以用于腓骨肌萎缩症相关药物的研究。该构建方法安全有效，操作简单，模型动物饲养周期短，构建的动物模型稳定性好、重复性好，成功率高，有利于广泛应用。
本申请第二方面提供的腓骨肌萎缩症小鼠模型，由于得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型采用腓骨肌萎缩症小鼠模型的制备方法制备得到，得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的后肢以及后爪都有明显的蜷缩，腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，因此，得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型可以广泛用于腓骨肌萎缩症相关药物的研究。
本申请第三方面提供的腓骨肌萎缩症小鼠模型在筛选预防或治疗腓骨肌萎缩症的药物中的应用，由于制备得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，因此，腓骨肌萎缩症小鼠模型有利于应用在筛选预防或治疗腓骨肌萎缩症的药物研发中。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本申请的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本申请实施例提供的AlaRSCMT相关基因突变位点保守性分析图。
图2是本申请实施例提供的野生型小鼠及其同窝突变鼠的悬尾实验分析图。
图3是本申请实施例提供的3月龄野生型小鼠以及同窝突变小鼠四肢拉力变化及其统计分析图。
图4是本申请实施例提供的5周龄野生型小鼠以及同窝突变小鼠坐骨神经电镜图片。
图5是本申请实施例提供的野生型小鼠余同窝突变小鼠的轴突直径的比较分析图和分布分析图。
图6是本申请实施例提供的3月龄野生型小鼠与同窝突变小鼠的神经肌肉接头染色图。
图7是本申请实施例提供的3月龄野生型小鼠与同窝突变小鼠的神经肌肉接头染色结果统计分析图。
具体实施方式
为了使本申请要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例，对本申请进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本申请，并不用于限定本申请。
本申请中，术语“和/或”，描述关联对象的关联关系，表示可以存在三种关系，例如，A和/或B，可以表示：单独存在A，同时存在A和B，单独存在B的情况。其中A，B可以是单数或者复数。字符“/”一般表示前后关联对象是一种“或”的关系。
本申请中，“至少一个”是指一个或者多个，“多个”是指两个或两个以上。“以下至少一项(个)”或其类似表达，是指的这些项中的任意组合，包括单项(个)或复数项(个)的任意组合。例如，“a,b,或c中的至少一项(个)”，或，“a,b,和c中的至少一项(个)”，均可以表示：a,b,c,a-b(即a和b),a-c,b-c,或a-b-c，其中a,b,c分别可以是单个，也可以是多个。
应理解，在本申请的各种实施例中，上述各过程的序号的大小并不意味着执行顺序的先后，部分或全部步骤可以并行执行或先后执行，各过程的执行顺序应以其功能和内在逻辑确定，而不应对本申请实施例的实施过程构成任何限定。
在本申请实施例中使用的术语是仅仅出于描述特定实施例的目的，而非旨在限制本申请。在本申请实施例和所附权利要求书中所使用的单数形式的“一种”和“该”也旨在包括多数形式，除非上下文清楚地表示其他含义。
本申请实施例说明书中所提到的相关成分的重量不仅仅可以指代各组分的具体含量，也可以表示各组分间重量的比例关系，因此，只要是按照本申请实施例说明书相关组分的含量按比例放大或缩小均在本申请实施例说明书公开的范围之内。具体地，本申请实施例说明书中的质量可以是μg、mg、g、kg等化工领域公知的质量单位。
术语“第一“、“第二”仅用于描述目的，用来将目的如物质彼此区分开，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。例如，在不脱离本申请实施例范围的情况下，第一XX也可以被称为第二XX，类似地，第二XX也可以被称为第一XX。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。
本申请实施例第一方面提供一种腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
S01.通过序列分析和小角散射构象分析，得到与腓骨肌萎缩症相关的基因突变位点R329H；
S02.利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，得到突变受精卵；
S03.将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫，假孕雌鼠开始培育，得到腓骨肌萎缩症小鼠模型。
本申请实施例第一方面提供的腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法，是基于序列分析和小角散射构象分析先确定了基因突变位点，再利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得突变受精卵，再将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫进行培育，获得腓骨肌萎缩症小鼠模型。且得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的后肢以及后爪都有明显的蜷缩，说明腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，可以用于腓骨肌萎缩症相关药物的研究。该构建方法安全有效，操作简单，模型动物饲养周期短，构建的动物模型稳定性好、重复性好，成功率高，有利于广泛应用。
步骤S01中，通过序列分析和小角散射构象分析，得到与腓骨肌萎缩症相关的基因突变位点R329H。
在一些实施例中，如附图1所示，序列分析包括：基于序列保守性，对与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点进行分析，筛选得到保守性位点R329。
在一些实施例中，与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点包括N71、G102、R329、E688、E778、D893。
在一些实施例中，进行小角散射构象分析包括：将与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点分别进行回转半径和最大密度分析，筛选得到构象变化的的基因突变位点R329H。
在一些实施例中，各个突变基因位点的回转半径和最大密度分析如下表1所示，可以看出，基因突变位点R329H的回转半径为
Figure BDA0004101498960000092
最大密度为/>
Figure BDA0004101498960000093
因此，选择R329H作为基因突变位点进行构建。
表1
Figure BDA0004101498960000091
步骤S02中，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，得到突变受精卵。
在一些实施例中，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因的步骤中，包括：
设计用于DNA双链切割的gRNA，gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示gRNA3和gRNA4；
SEQ ID NO:1gRNA3:GGATCCTTCGCCGAGCTGTTCGG。
SEQ ID NO:2gRNA4:TCCGTCTCAGCACGTACCTGTGG。
采用gRNA对DNA进行双链切割后，以Donor oligo模板同源重组修复，且所述Donoroligo模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中加粗字体的碱基为p.R329H，斜体字体的碱基为同义突变p.R326＝和p.I327＝，下划线字体的碱基为引入的EcoRI限制性内切酶位点。
SEQ ID NO:3Donor oligo模板：CTAGGGGTGTCTCCTAGCTAACTAAC ACTAAGGTCCGCCTCCCACAGGTACGTGCTGAGAAGAATTCTTCATCGAG CTGTTCGGTATTCCCATGAGAAACTGAATGCCAGCAGGGGTTTCTTCGCTA CATTG。
在R329H点突变基因的上下游分别设计上游引物、下游引物以及测序引物，进行PCR扩增，以鉴定受精卵的Aars基因中是否插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，上游引物、下游引物和测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQID NO:6所示。
SEQ ID NO:4上游引物：CATCAGCTAGGTCTTGGCAGAATAGG。
SEQ ID NO:5下游引物：GGCTGAGAGTCTTGAGAAACTGCAC。
SEQ ID NO:6测序引物：AGATCAGGCTGGCCTCAAACTC。
在一些实施例中，PCR扩增的程序如下：
95℃反应3min；
「95℃反应15s；
60℃反应15s；
72℃反应60s」，重复35个循环；
72℃反应5min。
在一些实施例中，PCR扩增的体系如下：
Figure BDA0004101498960000101
Figure BDA0004101498960000111
步骤S03中，将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫，假孕雌鼠开始培育，得到腓骨肌萎缩症小鼠模型。
在一些实施例中，将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫的步骤中，包括：
选取4-5周龄的雌鼠，并对雌鼠进行激素超排处理；
将经过激素超排处理的雌鼠与公鼠合笼，得到单细胞受精卵；
将正常雌鼠与结扎公鼠合笼，得到假孕雌鼠；
将Cas9-D10AmRNA、Donor oligo、gRNA3和gRNA4混合得混合物，并将混合物注射至单细胞受精卵内，得到突变受精卵；
将突变受精卵于培养基内培养后移植到假孕雌鼠的输卵管内。
具体的，4-5周龄的雌鼠可以选择发育良好的C57BL/6J雌鼠。
具体的，激素超排处理可以选择在4-5周龄的雌鼠的腹腔内依次注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10IU和人绒毛促性腺激素(hCG)10IU，且孕马血清促性腺激素和人绒毛促性腺激素的注射间隔时间为48h。
具体的，所述正常雌鼠可以选择8周龄以上的正常ICR雌鼠，具有适应性强，体格健壮，繁殖力强，生长速度快，实验重复性较好，母性好等优势，极少出现吃仔或不带仔的情况。
具体的，混合物中Cas9-D10A mRNA的终浓度为100ng/μl，Donor oligo的终浓度为100ng/μl，gRNA3的终浓度为50ng/μl，gRNA4的终浓度为50ng/μl。
具体的，混合物采用显微注射方法直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内，通过调节半定量仪的注射时间和注射压力来调整合适的注射量，以溶液明显流入胞浆而不至于导致细胞死亡为止。
具体的，Cas9-D10AmRNA的序列表如SEQ ID NO:7所示：ATGTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTCGCCGAAGAAAAAGCGCAAGGTCGAAGCGTCCGACAAGAAGTACAGCATCGGCCTGGCCATCGGCACCAACTCTGTGGGCTGGGCCGTGATCACCGACGAGTACAAGGTGCCCAGCAAGAAATTCAAGGTGCTGGGCAACACCGACCGGCACAGCATCAAGAAGAACCTGATCGGAGCCCTGCTGTTCGACAGCGGCGAAACAGCCGAGGCCACCCGGCTGAAGAGAACCGCCAGAAGAAGATACACCAGACGGAAGAACCGGATCTGCTATCTGCAAGAGATCTTCAGCAACGAGATGGCCAAGGTGGACGACAGCTTCTTCCACAGACTGGAAGAGTCCTTCCTGGTGGAAGAGGATAAGAAGCACGAGCGGCACCCCATCTTCGGCAACATCGTGGACGAGGTGGCCTACCACGAGAAGTACCCCACCATCTACCACCTGAGAAAGAAACTGGTGGACAGCACCGACAAGGCCGACCTGCGGCTGATCTATCTGGCCCTGGCCCACATGATCAAGTTCCGGGGCCACTTCCTGATCGAGGGCGACCTGAACCCCGACAACAGCGACGTGGACAAGCTGTTCATCCAGCTGGTGCAGACCTACAACCAGCTGTTCGAGGAAAACCCCATCAACGCCAGCGGCGTGGACGCCAAGGCCATCCTGTCTGCCAGACTGAGCAAGAGCAGACGGCTGGAAAATCTGATCGCCCAGCTGCCCGGCGAGAAGAAGAATGGCCTGTTCGGCAACCTGATTGCCCTGAGCCTGGGCCTGACCCCCAACTTCAAGAGCAACTTCGACCTGGCCGAGGATGCCAAACTGCAGCTGAGCAAGGACACCTACGACGACGACCTGGACAACCTGCTGGCCCAGATCGGCGACCAGTACGCCGACCTGTTTCTGGCCGCCAAGAACCTGTCCGACGCCATCCTGCTGAGCGACATCCTGAGAGTGAACACCGAGATCACCAAGGCCCCCCTGAGCGCCTCTATGATCAAGAGATACGACGAGCACCACCAGGACCTGACCCTGCTGAAAGCTCTCGTGCGGCAGCAGCTGCCTGAGAAGTACAAAGAGATTTTCTTCGACCAGAGCAAGAACGGCTACGCCGGCTACATTGACGGCGGAGCCAGCCAGGAAGAGTTCTACAAGTTCATCAAGCCCATCCTGGAAAAGATGGACGGCACCGAGGAACTGCTCGTGAAGCTGAACAGAGAGGACCTGCTGCGGAAGCAGCGGACCTTCGACAACGGCAGCATCCCCCACCAGATCCACCTGGGAGAGCTGCACGCCATTCTGCGGCGGCAGGAAGATTTTTACCCATTCCTGAAGGACAACCGGGAAAAGATCGAGAAGATCCTGACCTTCCGCATCCCCTACTACGTGGGCCCTCTGGCCAGGGGAAACAGCAGATTCGCCTGGATGACCAGAAAGAGCGAGGAAACCATCACCCCCTGGAACTTCGAGGAAGTGGTGGACAAGGGCGCTTCCGCCCAGAGCTTCATCGAGCGGATGACCAACTTCGATAAGAACCTGCCCAACGAGAAGGTGCTGCCCAAGCACAGCCTGCTGTACGAGTACTTCACCGTGTATAACGAGCTGACCAAAGTGAAATACGTGACCGAGGGAATGAGAAAGCCCGCCTTCCTGAGCGGCGAGCAGAAAAAGGCCATCGTGGACCTGCTGTTCAAGACCAACCGGAAAGTGACCGTGAAGCAGCTGAAAGAGGACTACTTCAAGAAAATCGAGTGCTTCGACTCCGTGGAAATCTCCGGCGTGGAAGATCGGTTCAACGCCTCCCTGGGCACATACCACGATCTGCTGAAAATTATCAAGGACAAGGACTTCCTGGACAATGAGGAAAACGAGGACATTCTGGAAGATATCGTGCTGACCCTGACACTGTTTGAGGACAGAGAGATGATCGAGGAACGGCTGAAAACCTATGCCCACCTGTTCGACGACAAAGTGATGAAGCAGCTGAAGCGGCGGAGATACACCGGCTGGGGCAGGCTGAGCCGGAAGCTGATCAACGGCATCCGGGACAAGCAGTCCGGCAAGACAATCCTGGATTTCCTGAAGTCCGACGGCTTCGCCAACAGAAACTTCATGCAGCTGATCCACGACGACAGCCTGACCTTTAAAGAGGACATCCAGAAAGCCCAGGTGTCCGGCCAGGGCGATAGCCTGCACGAGCACATTGCCAATCTGGCCGGCAGCCCCGCCATTAAGAAGGGCATCCTGCAGACAGTGAAGGTGGTGGACGAGCTCGTGAAAGTGATGGGCCGGCACAAGCCCGAGAACATCGTGATCGAAATGGCCAGAGAGAACCAGACCACCCAGAAGGGACAGAAGAACAGCCGCGAGAGAATGAAGCGGATCGAAGAGGGCATCAAAGAGCTGGGCAGCCAGATCCTGAAAGAACACCCCGTGGAAAACACCCAGCTGCAGAACGAGAAGCTGTACCTGTACTACCTGCAGAATGGGCGGGATATGTACGTGGACCAGGAACTGGACATCAACCGGCTGTCCGACTACGATGTGGACCATATCGTGCCTCAGAGCTTTCTGAAGGACGACTCCATCGACAACAAGGTGCTGACCAGAAGCGACAAGAACCGGGGCAAGAGCGACAACGTGCCCTCCGAAGAGGTCGTGAAGAAGATGAAGAACTACTGGCGGCAGCTGCTGAACGCCAAGCTGATTACCCAGAGAAAGTTCGACAATCTGACCAAGGCCGAGAGAGGCGGCCTGAGCGAACTGGATAAGGCCGGCTTCATCAAGAGACAGCTGGTGGAAACCCGGCAGATCACAAAGCACGTGGCACAGATCCTGGACTCCCGGATGAACACTAAGTACGACGAGAATGACAAGCTGATCCGGGAAGTGAAAGTGATCACCCTGAAGTCCAAGCTGGTGTCCGATTTCCGGAAGGATTTCCAGTTTTACAAAGTGCGCGAGATCAACAACTACCACCACGCCCACGACGCCTACCTGAACGCCGTCGTGGGAACCGCCCTGATCAAAAAGTACCCTAAGCTGGAAAGCGAGTTCGTGTACGGCGACTACAAGGTGTACGACGTGCGGAAGATGATCGCCAAGAGCGAGCAGGAAATCGGCAAGGCTACCGCCAAGTACTTCTTCTACAGCAACATCATGAACTTTTTCAAGACCGAGATTACCCTGGCCAACGGCGAGATCCGGAAGCGGCCTCTGATCGAGACAAACGGCGAAACCGGGGAGATCGTGTGGGATAAGGGCCGGGATTTTGCCACCGTGCGGAAAGTGCTGAGCATGCCCCAAGTGAATATCGTGAAAAAGACCGAGGTGCAGACAGGCGGCTTCAGCAAAGAGTCTATCCTGCCCAAGAGGAACAGCGATAAGCTGATCGCCAGAAAGAAGGACTGGGACCCTAAGAAGTACGGCGGCTTCGACAGCCCCACCGTGGCCTATTCTGTGCTGGTGGTGGCCAAAGTGGAAAAGGGCAAGTCCAAGAAACTGAAGAGTGTGAAAGAGCTGCTGGGGATCACCATCATGGAAAGAAGCAGCTTCGAGAAGAATCCCATCGACTTTCTGGAAGCCAAGGGCTACAAAGAAGTGAAAAAGGACCTGATCATCAAGCTGCCTAAGTACTCCCTGTTCGAGCTGGAAAACGGCCGGAAGAGAATGCTGGCCTCTGCCGGCGAACTGCAGAAGGGAAACGAACTGGCCCTGCCCTCCAAATATGTGAACTTCCTGTACCTGGCCAGCCACTATGAGAAGCTGAAGGGCTCCCCCGAGGATAATGAGCAGAAACAGCTGTTTGTGGAACAGCACAAGCACTACCTGGACGAGATCATCGAGCAGATCAGCGAGTTCTCCAAGAGAGTGATCCTGGCCGACGCTAATCTGGACAAAGTGCTGTCCGCCTACAACAAGCACCGGGATAAGCCCATCAGAGAGCAGGCCGAGAATATCATCCACCTGTTTACCCTGACCAATCTGGGAGCCCCTGCCGCCTTCAAGTACTTTGACACCACCATCGACCGGAAGAGGTACACCAGCACCAAAGAGGTGCTGGACGCCACCCTGATCCACCAGAGCATCACCGGCCTGTACGAGACACGGATCGACCTGTCTCAGCTGGGAGGCGACAGCCCCAAGAAGAAGAGAAAGGTGGAGGCCAGCTAA。
在一些实施例中，假孕雌鼠培育的条件为：繁殖温度为25℃-28℃，湿度为40％-60％时间为19-22天。
在一些实施例中，对构建得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型需要进行鉴定，才能确定小鼠是否为突变型小鼠进行使用。
在一些实施例中，由于突变型小鼠引入了一个同义突变的酶切位点，将CGGATC同义突变为AGAATT(ECOR1酶切位点)，引入酶切位点使得在将小鼠的全基因组DNA提取出来，并经过扩增得到产物后，经过酶切鉴定小鼠是野生型还是突变型，突变型的小鼠基因组DNA扩增产物可以被酶切成两段。在此基础上通过测序进行验证，从而在对构建成功的小鼠经过鼠尾的全基因组提取后扩增得到的PCR产物可以被酶切成两个片段，而野生型小鼠则不能被酶切割，结果显示已经成功得到了AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型。
在一些实施例中，通过对小鼠基因组进行提取后，对提取到的DNA进行目的基因的扩增从而来鉴定小鼠的基因型。
在一些实施例中，对提取到的DNA进行目的基因的扩增引物为Mouse Aars(R329H)-F:CATCAGCTAGGTCTTGGCAGAATAGG以及Mouse Aars(R329H)-R:GGCTGAGAGTCTTGAGAAACTGCAC。
在一些实施例中，扩增体系如下：
2XPCR MIX：10μL；
Primer F：1μL；
Primer R：1μL；
DNA(从鼠尾中提取的全基因组)：3μL；
H2O：1μL。
在一些实施例中，扩增程序如下：
95℃反应2min；
「95℃反应15s；
56℃反应30s；
68℃反应1min」，重复38个循环；
68℃反应10min。
通过对提取的DNA进行扩增后，进行测序验证，进一步确定得到的小鼠模型为AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型。
本申请实施例第二方面提供一种腓骨肌萎缩症小鼠模型，腓骨肌萎缩症小鼠模型采用腓骨肌萎缩症小鼠模型的制备方法制备得到。
本申请实施例第二方面提供的腓骨肌萎缩症小鼠模型，由于得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型采用腓骨肌萎缩症小鼠模型的制备方法制备得到，得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的后肢以及后爪都有明显的蜷缩，腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，因此，得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型可以广泛用于腓骨肌萎缩症相关药物的研究。
本申请实施例第三方面提供腓骨肌萎缩症小鼠模型在筛选预防或治疗腓骨肌萎缩症的药物中的应用。
本申请实施例第三方面提供的腓骨肌萎缩症小鼠模型在筛选预防或治疗腓骨肌萎缩症的药物中的应用，由于制备得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，因此，腓骨肌萎缩症小鼠模型有利于应用在筛选预防或治疗腓骨肌萎缩症的药物研发中。
下面结合具体实施例进行说明。
实施例1
腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法
包括如下步骤：
(1)通过序列分析和小角散射构象分析，得到与腓骨肌萎缩症相关的基因突变位点R329H。
其中，基于序列保守性，对与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点进行分析，筛选得到保守性位点R329；进行小角散射构象分析包括：将与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点分别进行回转半径和最大密度分析，筛选得到构象变化的的基因突变位点R329H，基因突变位点R329H的回转半径为
Figure BDA0004101498960000151
最大密度为/>
Figure BDA0004101498960000152
因此，选择R329H作为基因突变位点进行构建。
(2)利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，得到突变受精卵。
其中，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因的步骤中，包括：
①设计用于DNA双链切割的gRNA，gRNA包括gRNA3和gRNA4；其核苷酸序列如下：
SEQ ID NO:1gRNA3:GGATCCTTCGCCGAGCTGTTCGG。
SEQ ID NO:2gRNA4:TCCGTCTCAGCACGTACCTGTGG。
②采用gRNA对DNA进行双链切割后，以Donor oligo模板同源重组修复，且所述Donor oligo模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其中加粗字体的碱基为p.R329H，斜体字体的碱基为同义突变p.R326＝和p.I327＝，下划线字体的碱基为引入的EcoRI限制性内切酶位点。
SEQ ID NO:3Donor oligo模板：CTAGGGGTGTCTCCTAGCTAACTAAC ACTAAGGTCCGCCTCCCACAGGTACGTGCTGAGAAGAATTCTTCATCGAG CTGTTCGGTATTCCCATGAGAAACTGAATGCCAGCAGGGGTTTCTTCGCTA CATTG。
③在R329H点突变基因的上下游分别设计上游引物、下游引物以及测序引物，进行PCR扩增，其扩增体系和扩增程序如下，以鉴定受精卵的Aars基因中是否插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因。
SEQ ID NO:4上游引物：CATCAGCTAGGTCTTGGCAGAATAGG。
SEQ ID NO:5下游引物：GGCTGAGAGTCTTGAGAAACTGCAC。
SEQ ID NO:6测序引物：AGATCAGGCTGGCCTCAAACTC。
PCR扩增的程序如下：
95℃反应3min；
「95℃反应15s；
60℃反应15s；
72℃反应60s」，重复35个循环；
72℃反应5min。
PCR扩增的体系如下：
Figure BDA0004101498960000161
Figure BDA0004101498960000171
(3)将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫，假孕雌鼠开始培育，得到腓骨肌萎缩症小鼠模型。
其中，将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫以及假孕雌鼠开始培育的步骤中，包括：
i、选4-5周龄发育良好的C57BL/6J雌鼠，在其腹腔内注射孕马血清促性腺激素(PMSG)10IU，48小时后注射人绒毛促性腺激素(hCG)10IU，进行激素超排处理；
ii、将步骤i中经过激素超排处理的C57BL/6J雌鼠，与C57BL/6J公鼠按1:1合笼，次日清晨挑选检栓成功的雌鼠，从检栓成功的雌鼠中得到单细胞受精卵；
iii、选8周龄以上的正常ICR雌鼠与输精管结扎过的ICR公鼠按1:1合笼，次日选取检栓成功的雌鼠，即为假孕ICR雌鼠；
iv、将预混好的Cas9-D10A mRNA(100ng/μl)、Donor oligo(100ng/μl)，gRNA3(50ng/μl)，gRNA4(50ng/μl)的混合物利用显微注射的方法直接注入单细胞受精卵的一细胞的胞浆内，通过调节半定量仪的注射时间和注射压力来调整合适的注射量，以溶液明显流入胞浆而不至于导致细胞死亡为止，得到突变受精卵；
v、将步骤iv得到的突变受精卵放置KSOM培养基内培养2h；然后移植到假孕ICR雌鼠的输卵管内，然后于温度26℃、湿度50％的条件下，培育21天，待产仔后，得到腓骨肌萎缩症小鼠模型。
(4)对得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型进行鉴定，确定腓骨肌萎缩症小鼠模型为AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型。
其中，鉴定方法包括：
对得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的基因组进行提取后，对提取到的DNA进行目的基因的扩增从而来鉴定小鼠的基因型。
其中，对提取到的DNA进行目的基因的扩增引物为Mouse Aars(R329H)-F:CATCAGCTAGGTCTTGGCAGAATAGG以及Mouse Aars(R329H)-R:GGCTGAGAGTCTTGAGAAACTGCAC。
扩增体系如下：
2XPCR MIX：10μL；
Primer F：1μL；
Primer R：1μL；
DNA(从鼠尾中提取的全基因组)：3μL；
H2O：1μL。
扩增程序如下：
95℃反应2min；
「95℃反应15s；
56℃反应30s；
68℃反应1min」，重复38个循环；
68℃反应10min。
通过对提取的DNA进行扩增后，进行测序验证，进一步确定得到的小鼠模型为AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型。
性能测试
(1)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型(附图简称为AlaRSCMT)和野生型小鼠(附图简称为AlaRSWT)进行悬尾试验，具体步骤为：抓着小鼠的尾巴将小鼠提起，观察小鼠四肢运动的变化。
(2)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型和同年龄的野生型小鼠的四肢拉力进行检测，具体步骤为：手提小鼠尾部，将小鼠四肢放于拉力网上，水平向后拉动小鼠，每次拉三下，仪器会自动记录最大值，测三次后，取平均值分析组间统计学差异。
(3)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型和的野生型小鼠进行坐骨神经分析，具体步骤为：坐骨神经染色及电镜方法：心脏灌流后，将小鼠用PBS与戊二醛1:1配比灌流小鼠以固定坐骨神经，将坐骨神经在戊二醛中过夜固定，通过分级乙醇系列，然后是丙酮，然后嵌入环氧树脂中。使用切片机切割超薄切片，并用4％醋酸铀酰和柠檬酸铅染色，后用电子显微镜观察坐骨神经髓鞘以及轴突。
(4)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型和的野生型小鼠进行远端运动肌肉即腓肠肌进行神经肌肉接头染色分析，具体步骤为：将心脏灌流后的小鼠，用4％的PFA灌流固定全身，直至尾巴开始摇摆，取出需要的腓肠肌组织后，进一步在4％PFA中固定过夜，接着用30％的蔗糖沉淀组织，待其沉在底部时，将组织取出，用OCT包埋剂在液氮中进行包埋，待其在液氮中冻住后，放入-80直至切片时取出。切片时，将包埋块放在冰冻切片机上进行切片。将切片拿出晾干后，进行破膜1h，然后在组织周围用免疫组化笔画圈，在其中加入一抗Snp以及NF145，4度过夜后，孵育二抗Rabbit-488以及a-BTX，待洗去非特异性结合后，用封片剂将片子封住，用激光共聚焦显微镜拍摄。
结果分析
(1)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型和野生型小鼠进行悬尾试验的结果分析：如图2所示，发现AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型的具有明显的表型，AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型的后肢以及后爪都有明显的蜷缩，说明AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响。
(2)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型和同年龄的野生型小鼠的四肢拉力进行检测的结果分析：如图3所示，发现相比与同年龄的野生型小鼠，突变鼠的四肢拉力明显降低，并且差距具有统计学差异，这进一步说明了突变影响力小鼠的行动能力。
(3)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型和的野生型小鼠进行坐骨神经分析，结果如图4所示，在病理层面，对小鼠的坐骨神经进行甲苯胺蓝染色及电子显微镜的拍摄，统计轴突的各种参数，如图5所示，经过分析发现突变小鼠的轴突直径明显减小，并且大直径轴突占比明显减少，这说明AlaRS基因突变使得小鼠的外周神经发生了病理变化。
(4)对得到的AlaRSR329H杂合突变的小鼠模型和的野生型小鼠进行远端运动肌肉即腓肠肌进行神经肌肉接头染色分析，结果如图6所示，用激光共聚焦显微镜进行拍摄，如图7所示，经过统计分析发现CMT小鼠神经肌肉接头的去神经支配的比例明显增加，这进一步说明突变使得小鼠获得一些神经退行性疾病的症状。
综上，提供的腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法，是基于序列分析和小角散射构象分析先确定了基因突变位点，再利用CRISPR-Cas9基因编辑技术获得突变受精卵，再将突变受精卵转入假孕雌鼠子宫进行培育，获得腓骨肌萎缩症小鼠模型。且得到的腓骨肌萎缩症小鼠模型的后肢以及后爪都有明显的蜷缩，说明腓骨肌萎缩症小鼠模型的肢体运动协调能力受到一定的影响，具有腓骨肌萎缩症病理的特征，可以用于腓骨肌萎缩症相关药物的研究。该构建方法安全有效，操作简单，模型动物饲养周期短，构建的动物模型稳定性好、重复性好，成功率高，有利于广泛应用。
以上所述仅为本申请的较佳实施例而已，并不用以限制本申请，凡在本申请的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种腓骨肌萎缩症小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
通过序列分析和小角散射构象分析，得到与腓骨肌萎缩症相关的基因突变位点R329H；
利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，得到突变受精卵；
将所述突变受精卵转入假孕雌鼠子宫，所述假孕雌鼠开始培育，得到腓骨肌萎缩症小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述序列分析包括：基于序列保守性，对与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点进行分析，筛选得到保守性位点R329。
3.根据权利要求2所述的构建方法，其特征在于，所述与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点包括N71、G102、R329、E688、E778、D893。
4.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述小角散射构象分析包括：将与腓骨肌萎缩症相关的丙氨酰tRNA合成酶的位点分别进行回转半径和最大密度分析，筛选得到构象变化的的基因突变位点R329H。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述基因突变位点R329H的回转半径为
Figure FDA0004101498910000011
最大密度为/>
Figure FDA0004101498910000012
6.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，利用CRISPR-Cas9基因编辑技术在受精卵的E8基因中插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因的步骤中，包括：
设计用于DNA双链切割的gRNA，所述gRNA包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所示gRNA3和gRNA4；
采用所述gRNA对DNA进行双链切割后，以Donor oligo模板同源重组修复，且所述Donoroligo模板的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
在所述R329H点突变基因的上下游分别设计上游引物、下游引物以及测序引物，进行PCR扩增，以鉴定所述受精卵的Aars基因中是否插入R329H点突变基因和限制性内切酶位点基因，所述上游引物、所述下游引物和所述测序引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示。
7.根据权利要求6所述的构建方法，其特征在于，
所述PCR扩增的程序如下：
95℃预变性3min；35个循环的如下反应程序：95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸60s；72℃过度延伸5min；和/或
所述PCR扩增的体系如下：
Figure FDA0004101498910000021
8.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，将所述突变受精卵转入假孕雌鼠子宫的步骤中，包括：
选取4-5周龄的雌鼠，并对所述雌鼠进行激素超排处理；
将经过所述激素超排处理的雌鼠与公鼠合笼，得到单细胞受精卵；
将正常雌鼠与结扎公鼠合笼，得到假孕雌鼠；
将Cas9-D10A mRNA、Donor oligo、gRNA3和gRNA4混合得混合物，并将所述混合物注射至所述单细胞受精卵内，得到突变受精卵；
将所述突变受精卵于培养基内培养后移植到所述假孕雌鼠的输卵管内。
9.一种腓骨肌萎缩症小鼠模型，其特征在于，所述腓骨肌萎缩症小鼠模型采用权利要求1～8任一所述的腓骨肌萎缩症小鼠模型的制备方法制备得到。
10.如权利要求9所述的腓骨肌萎缩症小鼠模型在筛选预防或治疗腓骨肌萎缩症的药物中的应用。
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Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105821062A (zh) * 2015-01-09 2016-08-03 深圳华大基因科技有限公司 Amsh基因突变体及其应用
CN110438159A (zh) * 2019-07-03 2019-11-12 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法
CN111424053A (zh) * 2020-04-20 2020-07-17 福州大学 一种轴突型腓骨肌萎缩症果蝇模型的构建方法及应用
US20210393591A1 (en) * 2018-10-26 2021-12-23 The Jackson Laboratory Treatments for charcot-marie-tooth disease

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105821062A (zh) * 2015-01-09 2016-08-03 深圳华大基因科技有限公司 Amsh基因突变体及其应用
US20210393591A1 (en) * 2018-10-26 2021-12-23 The Jackson Laboratory Treatments for charcot-marie-tooth disease
CN110438159A (zh) * 2019-07-03 2019-11-12 广州中医药大学(广州中医药研究院) 一种引发肌原纤维肌病的基因突变小鼠模型的构建方法
CN111424053A (zh) * 2020-04-20 2020-07-17 福州大学 一种轴突型腓骨肌萎缩症果蝇模型的构建方法及应用

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CAI JL等，: "A stress-free strategy to correct point mutations in patient iPS cells", STEM CELL RES., vol. 53, pages 328 - 332 *

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