KR20240031238A - Crispr 뉴클레이스를 포함하는 유전자 편집 시스템 및 이의 용도 - Google Patents

Crispr 뉴클레이스를 포함하는 유전자 편집 시스템 및 이의 용도 Download PDF

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KR20240031238A
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KR
South Korea
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nucleotides
sequence
rna
gene editing
polypeptide
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KR1020237044997A
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English (en)
Inventor
데이비드 에이. 스콧
노아 마이클 자키모
프라투샤 휸웰
후-카이 셰이
Original Assignee
아버 바이오테크놀로지스, 인크.
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Abstract

(a) 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산; (b) 역전사효소(RT) 폴리펩타이드 또는 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산; (c) 가이드 RNA(gRNA) 또는 gRNA를 암호화하는 제3 핵산으로서, gRNA는 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위(CRISPR 뉴클레이스 결합 부위) 및 관심 게놈 부위 내의 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하고, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한, 상기 제3 핵산; 및 (d) 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산으로서, RT 공여체 RNA는 프라이머 결합 부위(PBS) 및 주형 서열을 포함하는, 상기 제4 핵산을 포함하는 유전자 편집 시스템.

Description

CRISPR 뉴클레이스를 포함하는 유전자 편집 시스템 및 이의 용도
관련 출원에 대한 상호참조
본 출원은 35 U.S.C. § 119(e)하에 2021년 6월 1일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/195,621호, 2021년 8월 23일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/236,047호, 2021년 10월 28일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/272,937호 및 2022년 1월 14일자로 출원된 미국 특허 가출원 제63/299,695호에 대한 우선권을 주장하며, 이들 기초출원 각각의 내용은 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
서열 목록
본 출원은 ASCII 형식으로 전자적으로 제출되고 여기에 전체가 참조에 의해 원용되어 있는 서열 목록을 포함한다. 2022년 5월 30일에 생성된 상기 ASCII 사본은 이름이 116928-0042-0001WO00_SEQ.txt이고, 크기가 385,353 바이트이다.
집합적으로 CRISPR-Cas 또는 CRISPR/Cas 시스템으로 알려진 일정한 간격으로 주기적으로 분포하는 짧은 회문 반복서열(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat: CRISPR) 및 CRISPR-관련(Cas) 유전자는 외부 유전적 요소로부터 특정 종을 방어하는 고세균 및 세균의 적응 면역계이다.
본 개시내용은 적어도 부분적으로 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i2 폴리펩타이드) 및 역전사효소뿐만 아니라 CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드에 의한 관심 유전자 부위에서의 절단을 매개하는 가이드 RNA(gRNA) 및 관심 게놈 부위에 혼입될 목적하는 서열의 합성을 매개하는 역전사 공여체 RNA를 포함하는 유전자 편집 시스템의 개발에 기초하고 있다. 본 명세서에 보고된 바와 같이, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 높은 편집 효율과 정확성으로 다양한 게놈 부위에서 성공적인 유전자 편집을 달성하였다. 이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 다음과 같은 유리한 특징 중 적어도 하나를 보여준다:
1. Cas12i 폴리펩타이드에 특이적인 것과 같은 본 명세서에 기재된 편집 주형 RNA 중 다수는 트랜스-활성화 CRISPR RNA(trans-activating CRISPR RNA: tracrRNA) 구성요소를 필요로 하지 않으므로, 프라임 편집 가이드 RNA(prime editing guide RNA: pegRNA)보다 작다. 추가적으로, Cas12i 폴리펩타이드-역전사효소 융합체와 같은 본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체 중 다수는 Cas9-역전사효소 융합체보다 작다. 이들 양태는 모두 전달 및 합성 비용의 측면에서 바람직하다.
2. 본 명세서에 기재된 편집 주형 RNA는 pegRNA의 프라이머 결합 부위(primer binding site: PBS)보다 더 긴 PBS를 갖도록 설계될 수 있다. 이 특징은 표적 핵산에 혼입시키는 편집 효율을 증가시킬 수 있다.
3. 본 명세서에 기재된 바와 같이 비-PAM 가닥(즉, PAM 모티프가 존재하는 가닥의 상보적 가닥; 본 명세서에서 표적 가닥으로도 기재됨)에만 결합하도록 설계된 편집 주형 RNA를 포함하는 유전자 편집 시스템은 프라임 편집 시스템에 비 해 더 넓은 창에 걸쳐 편집을 혼입시킬 수 있다. 특히, Cas12i 폴리펩타이드-역전사효소 시스템은 Cas12i 폴리펩타이드 및 RNA 가이드의 전체 인식 서열을 다시 작성할 수 있다. 따라서, 이러한 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체 및 편집 주형 RNA에 의한 표적 핵산의 재표적화를 회피하는 데 더 효율적일 수 있다.
따라서, 유전자 편집 시스템, 약제학적 조성물 또는 이를 포함하는 키트, 유전자 편집 시스템을 사용하여 유전자 변형된 세포를 생산하는 방법 및 이에 따라 생성된 세포가 본 명세서에 제공된다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 다음을 포함하는 유전자 편집 시스템을 특징으로 한다: (a) 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산; (b) 역전사효소(reverse transcriptase: RT) 폴리펩타이드 또는 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산; (c) 가이드 RNA(gRNA) 또는 gRNA를 암호화하는 제3 핵산으로서, gRNA는 유형 V CRISPR 뉴클레이스(CRISPR 뉴클레이스 결합 부위)에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위 및 관심 게놈 부위 내 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하고, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)에 인접해 있는, 상기 가이드 RNA(gRNA) 또는 gRNA를 암호화하는 제3 핵산; 및 (d) 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산으로서, RT 공여체 RNA는 프라이머 결합 부위(PBS) 및 주형 서열을 포함하는, 상기 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템 내의 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드는 Cas12 폴리펩타이드이다. 일부 예에서, Cas12 폴리펩타이드는 Cas12i 폴리펩타이드, 예를 들어, Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 경우에, Cas12i 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Cas12i2 폴리펩타이드이다.
일부 경우에, Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2의 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035 및/또는 S1046 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함한다. 예를 들어, 하나 이상의 돌연변이는 아미노산 치환이며, 이는 선택적으로 D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, S1046G 또는 이들의 조합이다. 일례에서, Cas12i2 폴리펩타이드는 D581, D911, I926 및 V1030의 위치에 돌연변이(예를 들어, D581R, D911R, I926R 및 V1030G의 아미노산 치환)를 포함한다. 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩타이드는 D581, I926 및 V1030의 위치에 돌연변이(예를 들어, D581R, I926R 및 V1030G의 아미노산 치환)를 포함한다. 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩타이드는 D581, I926, V1030 및 S1046 위치에 돌연변이(예를 들어, D581R, I926R, V1030G 및 S1046G의 아미노산 치환)를 포함한다. 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩타이드는 D581, G624, F626, I926, V1030, E1035 및 S1046 위치에 돌연변이(예를 들어, D581R, G624R, F626R, I926R, V1030G, E1035R 및 S1046G의 아미노산 치환)를 포함한다. 또 다른 예에서, Cas12i2 폴리펩타이드는 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035 및 S1046 위치에 돌연변이(예를 들어, D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R 및 S1046G의 아미노산 치환)를 포함한다. 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템에 사용하기 위한 예시적인 Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 7 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 예시적인 Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 다른 예에서, 예시적인 Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
다른 경우에, Cas12i 폴리펩타이드는 감소된 crRNA 처리 활성을 가지며, 선택적으로 Cas12i 폴리펩타이드는 서열번호 2의 H485 위치 및/또는 H486 위치에 돌연변이를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 제1 핵산은 제1 벡터(예를 들어, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터)에 위치한다. 다른 경우에, 제1 핵산은 제1 메신저 RNA(mRNA)이다.
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템에서, RT 폴리펩타이드는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus: MMLV)-RT, 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus: MMTV)-RT, 마라톤-RT 또는 RTx-RT(예를 들어, 서열번호 29의 아미노산 서열을 포함할 수 있는 MMLV RT)일 수 있다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템은 RT 폴리펩타이드를 포함한다. 대안적으로, 시스템은 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산을 포함한다. 일부 경우에, 제2 핵산은 제2 벡터(예를 들어, 아데노-관련 바이러스 벡터 또는 AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터)에 위치한다. 일례에서, 유전자 편집 시스템은 유형 V CRISPR 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산 및 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산 모두를 포함하는 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 포함한다. 다른 예에서, RT를 암호화하는 제2 핵산은 제2 mRNA이다. 일례에서, 유전자 편집 시스템은 유형 V CRISPR 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 mRNA 및 RT를 암호화하는 제2 mRNA를 모두 포함하는 단일 RNA 분자를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드와 RT 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산(예를 들어, 바이러스 벡터와 같은 벡터)을 포함한다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 2개의 개별 폴리펩타이드로서 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 및 RT 폴리펩타이드를 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템에서, 스페이서 서열은 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 예에서, 스페이서 서열은 20개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시형태에서, PAM은 5'-TTN-3'의 모티프를 포함한다. 일부 경우에(예를 들어, Cas12i2 폴리펩타이드와 관련하여), PAM은 표적 서열에 대해 5'에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, 하나 이상의 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위는 직접 반복 서열(들)이다. 일부 경우에, 각각의 직접 반복 서열은 23개 내지 36개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일례에서, 직접 반복 서열은 23개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 예에서, 직접 반복 서열은 적어도 23개의 뉴클레오타이드 길이인 서열번호 15 내지 17 및 241 내지 247 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호 17) 또는 이의 단편과 적어도 90% 동일하다. 특정 예에서, 직접 반복 서열은 적어도 23개의 뉴클레오타이드 길이인 서열번호 15 내지 17 및 241 내지 247 중 어느 하나(예를 들어, 서열번호 17) 또는 이의 단편이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 gRNA를 포함한다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 gRNA를 암호화하는 제3 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 제3 핵산은 제3 벡터에 위치하며, 이는 선택적으로 바이러스 벡터이다. 일부 예에서, 유전자 편집 시스템은 gRNA를 암호화하는 제3 핵산 및 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 및/또는 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 및/또는 제2 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템의 RT 공여체 RNA의 PBS는 5개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 예에서, PBS는 10개 내지 60개의 뉴클레오타이드 길이이다. 특정 예에서, PBS는 10개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 경우에, PBS는 표적 서열의 상보적 영역에 인접한 PBS-표적화 부위에 결합한다. PBS-표적화 부위는 표적 서열의 상보적 영역의 상류에 있다. 예를 들어, PBS-표적화 부위는 표적 서열의 상보적 영역의 상류에 있는 3개 내지 10개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 4개 내지 10개의 뉴클레오타이드)일 수 있다. 대안적으로, PBS-표적화 부위는 표적 서열의 상보적 영역과 중첩될 수 있다. 다른 경우에, PBS-표적화 부위는 표적 서열에 인접하거나 또는 이와 중첩된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템의 RT 공여체 RNA의 주형 서열은 5개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, 주형 서열은 30개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 경우에, 주형 서열은 관심 게놈 부위와 상동일 수 있고, 관심 게놈 부위에 비해 하나 이상의 뉴클레오타이드 변이를 포함한다. 일부 예에서, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변이는 표적 서열 내에 위치한다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변이는 PAM에 위치한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템은 RT 공여체 RNA를 포함한다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산을 포함한다. 일부 예에서, 제4 핵산은 제4 벡터에 위치하며, 이는 선택적으로 제4 바이러스 벡터이다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템은 RT 공여체 RNA를 암호화하는 핵산 및 가이드 RNA, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 및 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 하나 이상의 추가적인 핵산을 포함하는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 gRNA 및 RT 공여체 RNA를 포함하는 단일 RNA 분자를 포함한다. 이러한 단일 RNA는 임의의 적합한 순서로 배열될 수 있는 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 스페이서 서열, PBS 및 주형 서열을 포함한다. 일부 예에서, 단일 RNA 분자는 gRNA와 RT 공여체 RNA 사이에 링커를 추가로 포함한다. 이러한 링커는 헤어핀 구조를 포함할 수 있다. 일례에서, 단일 RNA 분자는, 5'에서 3'로, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 스페이서 서열, 주형 서열 및 PBS를 포함한다. 또 다른 예에서, 단일 RNA 분자는, 5'에서 3'로, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 스페이서 서열, 링커, 주형 서열 및 PBS를 포함한다. 또 다른 예에서, 단일 RNA 분자는, 5'에서 3'로, 주형 서열, PBS, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 스페이서 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, 단일 RNA 분자는, 5'에서 3'로, 주형 서열, PBS, 링커, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 스페이서 서열을 포함한다.
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 임의의 단일 RNA 분자는 5' 말단 보호 단편, 3' 말단 보호 단편 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 5' 말단 보호 단편 및 3' 말단 보호 단편 각각은 2차 구조, 예를 들어, 헤어핀, 슈도노트(pseudoknot) 또는 삼중 구조를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA이다. 특정 예에서, 5' 말단 보호 단편, 3' 말단 보호 단편 또는 둘 다는 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상을 포함할 수 있다. 5' 말단 보호 단편, 3' 말단 보호 단편 또는 둘 다는 임의의 인간 서열과 상동이 아닌(염기 페어링을 통해 임의의 인간 서열에 결합할 수 없음) 하나 이상의 분절을 추가로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 2개의 개별 RNA 분자로서 임의의 gRNA 및 임의의 RT 공여체 RNA를 포함한다. 일부 예에서, gRNA, RT 공여체 RNA 또는 둘 다는 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편을 추가로 포함할 수 있다. 각각의 보호 단편은 2차 구조, 예를 들어, 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA이다. 다른 예에서, 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편은 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동이 아닌 하나 이상의 분절을 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템은 하나 이상의 지질 나노입자(lipid nanoparticle: LNP)를 포함할 수 있으며, 이는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 암호화 핵산, RT 폴리펩타이드 또는 암호화 핵산, 가이드 RNA 또는 암호화 핵산, RT 공여체 RNA 또는 암호화 핵산 또는 이들의 임의의 조합을 포괄한다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 (i) 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 암호화 핵산, RT 폴리펩타이드 또는 암호화 핵산, 가이드 RNA 또는 암호화 핵산, RT 공여체 RNA 또는 암호화 핵산으로부터 선택되는 최대 3개의 구성요소를 집합적으로 포함하는 하나 이상의 지질 나노입자(LNP); 및 (ii) 유전자 편집 시스템의 나머지 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 벡터는 하나 이상의 바이러스 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터일 수 있다.
일부 예에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드, RT 폴리펩타이드, gRNA 및 RT 공여체 RNA를 포함한다. 일부 경우에, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 및/또는 RT 폴리펩타이드는 gRNA 및/또는 RT 공여체 RNA와 복합체(예를 들어, 리보핵단백질(ribonucleoprotein: RNP) 복합체)를 형성한다.
일부 양태에서, 본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템 및 약제학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 약제학적 조성물 및 유전자 편집 시스템의 구성요소를 포함하는 키트를 제공한다.
다른 양태에서, 본 개시내용은 또한 세포를 유전자 편집하는 방법을 특징으로 하며, 해당 방법은 숙주 세포를 유전자 편집하기 위해 숙주 세포를 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템 또는 이를 포함하는 약제학적 조성물과 접촉시키는 단계를 포함한다. 일부 예에서, 숙주 세포는 시험관내에서 배양된다. 다른 예에서, 접촉시키는 단계는 유전자 편집 시스템을 숙주 세포를 포함하는 대상체에게 투여하는 것에 의해 수행된다.
또한, 본 개시내용의 범위 내에 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템에 의해 생산될 수 있는 유전자 변형된 세포의 집단이 있다. 일부 예에서, 유전자 변형된 세포는 유전자 편집 시스템에 의해 편집될 수 없는 세포를 포함할 수 있으며, 예를 들어, PAM, 표적 서열 또는 둘 다에 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
또 다른 양태에서, 본 개시내용은 (i) 유형 V CRISPR 뉴클레이스(CRISPR 뉴클레이스 결합 부위)에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위; (ii) 유전자 부위 내의 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열로서, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한, 상기 스페이서 서열; (iii) 프라이머 결합 부위(PBS); 및 (iv) 주형 서열을 포함하는 유전자 편집 RNA 분자를 특징으로 한다. 일부 실시형태에서, 유전자 편집 RNA 분자는 본 명세서에 개시된 것과 같은 하나 이상의 링커를 추가로 포함할 수 있다.
일부 예에서, RNA 분자는, 5'에서 3'로, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 스페이서 서열, 주형 서열 및 PBS를 포함한다. 다른 예에서, RNA 분자는, 5'에서 3'로, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 스페이서 서열, 링커, 주형 서열 및 PBS를 포함한다. 또 다른 예에서, RNA 분자는, 5'에서 3'로, 주형 서열, PBS, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 스페이서 서열을 포함한다. 또 다른 예에서, RNA 분자는, 5'에서 3'로, 주형 서열, PBS, 링커, CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 스페이서 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 RNA 분자는 5' 말단 보호 단편, 3' 말단 보호 단편 또는 둘 다를 추가로 포함할 수 있다. 보호 단편 각각은 2차 구조, 예를 들어, 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA이다. 다른 예에서, 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편은 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동이 아닌 하나 이상의 분절을 포함한다.
또한, 본 개시내용은 (i) 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위(CRISPR 뉴클레이스 결합 부위) 및 유전자 부위 내의 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA로서, 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한, 상기 가이드 RNA; 및 (ii) 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산으로서, RT 공여체 RNA는 프라이머 결합 부위(PBS) 및 주형 서열을 포함하는, 상기 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산을 포함하는 유전자 편집 RNA 분자(2개의 개별 RNA 분자) 세트를 특징으로 한다. 일부 예에서, gRNA, RT 공여체 RNA 또는 둘 다는 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편을 추가로 포함한다. 각각의 보호 단편은 2차 구조, 예를 들어, 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조를 형성할 수 있다. 일부 예에서, 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA이다. 다른 예에서, 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편은 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동이 아닌 하나 이상의 분절을 포함한다.
또한, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 RNA 분자 또는 유전자 편집 RNA 분자 세트를 암호화하는 DNA 분자 또는 DNA 분자 세트가 본 명세서에 제공된다. 일부 예에서, 제76항의 DNA 분자 또는 DNA 분자 세트는 벡터 또는 벡터 세트에 포함되며, 선택적으로 벡터 또는 벡터 세트는 바이러스 벡터이다.
또한, CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소를 포함하는 융합 폴리펩타이드가 본 명세서에 제공된다. 임의의 이러한 CRISPR 뉴클레이스-RT 융합 폴리펩타이드는 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템에 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 유형 V CRISPR 뉴클레이스, 예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드이다. 일부 예에서, Cas12i 폴리펩타이드는 Cas12i2 폴리펩타이드, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 것이다. 특정 예에서, 융합 폴리펩타이드는 25 내지 26 및 219 내지 223의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, Cas12i 폴리펩타이드는 Cas12i4 폴리펩타이드이다. 일부 예에서, Cas12i4 폴리펩타이드는 MMLV RT와 같은 역전사효소와 융합될 수 있다. 이러한 융합 Cas12i4-RT 융합 폴리펩타이드는 서열번호 53의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
발현 벡터와 같은 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터)를 포함하여 임의의 CRISPR 뉴클레이스-RT 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 임의의 핵산도 본 개시내용의 범위 내에 있다.
본 발명의 하나 이상의 실시형태의 세부사항은 아래의 설명에서 제시된다. 본 발명의 다른 특징 또는 장점은 다음의 도면과 여러 실시형태의 상세한 설명, 그리고 첨부된 청구범위로부터 명백해질 것이다.
다음 도면은 본 명세서의 일부를 형성하고 본 개시내용의 소정의 양태를 추가로 입증하기 위해 포함되며, 이는 본 명세서에 제시된 특정 실시형태의 상세한 설명과 함께 도면을 참조함으로써 더 잘 이해될 수 있다.
도 1a 내지 도 1b는 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템을 보여주는 개략도를 포함한다. 도 1a는 역전사효소 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드)에 융합된 CRISPR 뉴클레이스 및 RNA 가이드의 3' 말단에서 RT 공여체 RNA에 융합된 RNA 가이드를 포함하는 유전자 편집 시스템을 보여주는 개략도이다. RT 공여체 RNA는 역전사 주형 서열 및 PBS를 포함한다. PBS는 표적 핵산의 PAM-가닥(비표적 가닥으로도 알려져 있음)에 대한 실질적인 상보성을 포함한다. 도 1b는 역전사효소에 융합된 Cas9 닉케이스(nickase)(왼쪽) 및 역전사효소에 융합된 Cas12i 닉케이스(오른쪽)를 보여준다. RNA 가이드의 3' 말단에 융합된 RT 공여체 RNA를 사용하면, 편집은 표적 핵산의 PAM 가닥에 혼입된다.
도 2는 역전사효소 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드)에 융합된 CRISPR 뉴클레이스 및 RNA 가이드의 5' 말단에서 RT 공여체 RNA에 융합된 RNA 가이드를 포함하는 예시적인 유전자 편집 시스템을 보여주는 개략도이다. RT 공여체 RNA는 PBS 및 역전사 주형 서열을 포함한다. PBS는 표적 핵산의 PAM 가닥에 대한 상보성을 포함한다.
도 3은 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드), 역전사효소 폴리펩타이드, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 보여주는 개략도이다. RT 공여체 RNA는 역전사 주형 서열 및 PBS를 포함한다. 편집은 CRISPR 뉴클레이스에 의한 절단 후 게놈에 혼입된다.
도 4는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드), 역전사효소 폴리펩타이드, RNA 가이드 및 RNA 역전사 주형 서열을 보여주는 개략도이다. RT 공여체 RNA는 PBS 및 역전사 주형 서열을 포함한다. 편집은 CRISPR 뉴클레이스의 존재하에 게놈에 혼입된다.
도 5는 역전사효소 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드)에 융합된 CRISPR 뉴클레이스 및 RNA 가이드의 3' 말단에서 RT 공여체 RNA에 융합된 표적 핵산에 대한 미스매치를 포함하는 RNA 가이드를 포함하는 예시적인 유전자 편집 시스템을 보여주는 개략도이다. RT 공여체 RNA는 PBS를 포함한다. PBS는 표적 핵산의 비-PAM 가닥(표적 가닥 또는 TS로도 알려져 있음)에 대한 상보성을 포함한다.
도 6a 내지 도 6b는 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템을 보여주는 개략도를 포함한다. 도 6a는 역전사효소 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드)에 융합된 CRISPR 뉴클레이스 및 RNA 가이드의 3' 말단에서 RT 공여체 RNA에 융합된 RNA 가이드를 포함하는 예시적인 유전자 편집 시스템을 보여주는 개략도이다. RT 공여체 RNA는 역전사 주형 서열 및 PBS를 포함한다. RNA 가이드의 스페이서 서열 및 PBS가 표적 핵산에 결합되면, 역전사 주형 서열은 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 루프를 형성한다. PBS는 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 대한 상보성을 포함한다. PAM 가닥 및 비-PAM 가닥에서 변이형 Cas12i2 절단 부위는 삼각형으로 표시된다. RNA 가이드의 3' 말단에 융합된 RT 공여체 RNA를 사용하면, 편집은 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 혼입된다. 도 6b는 편집, 역전사 주형 서열 및 PBS의 위치 지정을 보여주며, 여기서 역전사 주형 서열 및 PBS의 길이는 다양할 수 있다.
도 7은 역전사효소 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드)에 융합된 CRISPR 뉴클레이스 및 RNA 가이드의 5' 말단에서 RT 공여체 RNA에 융합된 RNA 가이드를 포함하는 예시적인 유전자 편집 시스템을 보여주는 개략도이다. RT 공여체 RNA는 PBS 및 역전사 주형 서열을 포함한다. PBS는 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 대한 상보성을 포함한다.
도 8a 내지 도 8c는 예시적인 Cas12i2 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체를 보여주는 개략도를 포함한다. 도 8a는 실시예 1에서 테스트된 RT 공여체 RNA에 융합된 변이형 Cas12i2 RNA 가이드의 개략도이다. RNA 가이드의 스페이서는 5'-TTT-3' PAM에 인접한 비-PAM 가닥에 결합한다. RT 공여체 RNA는 역전사 주형 서열 및 PBS를 포함한다. 스페이서 서열 및 PBS가 표적 핵산에 결합하면, 역전사 주형 서열은 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 루프를 형성한다. PBS는 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 대한 상보성을 포함한다. 이 개략도에서, PBS는 13개의 뉴클레오타이드 길이이고, 역전사 주형 서열은 34개의 뉴클레오타이드 길이이다. PBS는 비-PAM 가닥에 대한 상보성이 절단 부위(삼각형)에서 시작하도록 설계되었다. 도 8b은 실시예 1에서 테스트된 바와 같이 AAVS1_T7 게놈 부위를 표적으로 하는 예시적인 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체를 보여준다. 다양한 PBS 길이가 테스트되었다(13개, 30개 및 60개의 뉴클레오타이드). RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체는 표적 서열에 치환(S), 삽입(I), 결실(D) 또는 헤어핀(H)을 도입하도록 설계되었다. 도 8c는 실시예 1에 기술된 바와 같이 AAVS1_T7 게놈 부위(상부 패널), EMX1_T6 게놈 부위(중간 패널) 및 VEGFA_T5 게놈 부위(하부 패널)에 도입된 암호화된 편집(치환, 삽입 및 결실)을 보여준다. 도 8a의 서열은 위에서 아래로 서열번호 65 내지 67이다. 도 8b의 서열은 위에서 아래로 서열번호 74 내지 80 및 87 내지 89이다. 도 8c의 서열은 위에서 아래로 서열번호 248 내지 259이다.
도 9a 내지 도 9j는 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템으로부터 발생하는 유전자 편집 효율을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 9a는 AAVS1_T6 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드를 사용하여 서열번호 4의 변이형 Cas12i2와 서열번호 25 및 서열번호 26의 C-말단 및 N-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집으로 분석된 NGS 리드(read)의 백분율을 보여준다. 도 9b는 서열번호 26 및 서열번호 25의 N-말단 및 C-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체와 AAVS1_T6 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집으로 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체는 13개, 30개 또는 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이를 갖고, AAVS1_T6 게놈 부위에 치환(S), 삽입(I), 결실(D) 또는 헤어핀(H)을 도입하도록 설계되었다. 도 9c는 AAVS1_T7 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드를 사용하여 서열번호 4의 변이형 Cas12i2와 서열번호 25 및 서열번호 26의 C-말단 및 N-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집으로 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. 도 9d는 서열번호 26 및 서열번호 25의 N-말단 및 C-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체와 AAVS1_T7 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집을 사용하여 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체는 13개, 30개 또는 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이를 갖고, AAVS1_T7 게놈 부위에 치환(S), 삽입(I), 결실(D) 또는 헤어핀(H)을 도입하도록 설계되었다. 도 9e는 EMX1_T6 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드를 사용하여 서열번호 4의 변이형 Cas12i2와 서열번호 25 및 서열번호 26의 C-말단 및 N-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체에 의해 도입된 indel 및 암호화된 편집으로 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. 도 9f는 서열번호 26 및 서열번호 25의 N-말단 및 C-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체와 EMX1_T6 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체에 의해 도입된 indel 및 편집을 사용하여 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체는 13개, 30개 또는 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이를 갖고, EMX1_T6 게놈 부위에 치환(S), 삽입(I), 결실(D) 또는 헤어핀(H)을 도입하도록 설계되었다. 도 9g는 VEGFA_T2 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드를 사용하여 서열번호 4의 변이형 Cas12i2와 서열번호 25 및 서열번호 26의 C-말단 및 N-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집으로 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. 도 9h는 서열번호 26 및 서열번호 25의 N-말단 및 C-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체와 VEGFA_T2 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집을 사용하여 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체는 13개, 30개 또는 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이를 갖고, VEGFA_T2 게놈 부위에 치환(S), 삽입(I), 결실(D) 또는 헤어핀(H)을 도입하도록 설계되었다. 도 9i는 VEGFA_T5 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드를 사용하여 서열번호 4의 변이형 Cas12i2와 서열번호 25 및 서열번호 26의 C-말단 및 N-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집으로 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. 도 9j는 서열번호 26 및 서열번호 25의 N-말단 및 C-말단 Cas12i2-MMLV RT 융합체와 VEGFA_T5 게놈 부위를 표적으로 하는 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체에 의해 유도된 indel 및 암호화된 편집을 사용하여 분석된 NGS 리드의 백분율을 보여준다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체는 13개, 30개 또는 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이를 갖고, VEGFA_T5 게놈 부위에 치환(S), 삽입(I), 결실(D) 또는 헤어핀(H)을 도입하도록 설계되었다.
도 10은 역전사효소에 융합된 Cas12i 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i2 닉케이스)를 보여주는 개략도이다. RNA 가이드의 5' 말단 또는 3' 말단에 융합된 RT 공여체 RNA를 사용하면, 암호화된 편집은 표적 핵산의 PAM 가닥에 혼입된다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA의 말단은 엑소뉴클레이스 또는 엔도뉴클레이스 활성을 방지하기 위해 보호될 수 있다. PBS 길이는 약 3개 내지 100개의 뉴클레오타이드로 다양할 수 있으며, PAM 가닥에 대한 실질적인 상보성을 포함할 수 있다. 헤어핀과 같이 구조화된 RNA는 스페이서와 역전사 주형 서열 사이에 도입될 수 있다.
도 11은 제2 직접 반복(DR)-스페이서 서열에 추가로 융합된 RNA 가이드-RT 공여체 RNA를 보여주는 개략도이다. 추가적인 DR-스페이서는 엑소뉴클레이스 활성을 저해한다.
도 12a 내지 도 12b는 편집 주형 RNA(유전자 편집 RNA)의 예시적인 설계를 보여주는 개략도를 포함한다. 도 12a는 3' 말단 보호를 추가로 포함하는 편집 주형 RNA(5'- 뉴클레이스 결합 서열 - DNA-결합 서열 - 역전사 주형 - PBS -3')를 도시하는 개략도이다. 3' 말단 보호는 화학적 말단 보호(도면의 상단 부분) 또는 헤어핀(도면의 하단 부분)일 수 있다. 헤어핀은 직접 반복 서열과 같은 뉴클레이스 결합 서열일 수 있다. 도 12b는 5' 말단 보호가 있거나 없는 편집 주형 RNA(5'-역전사 주형 - PBS 뉴클레이스 결합 서열 - DNA-결합 서열-3')를 도시하는 개략도이다. 5' 말단 보호는 도면의 하단 부분에 나타낸 바와 같은 헤어핀(예를 들어, 직접 반복 서열과 같은 뉴클레이스 결합 서열)일 수 있다.
도 13a 내지 도 13d는 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템으로부터 발생하는 유전자 편집 효율을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 13a는 AAVS1_T7 게놈 부위(서열번호 30)에서 서열번호 112의 RNA 가이드 또는 서열번호 123 내지 137의 편집 주형 RNA를 사용한 Cas12i2(서열번호 4) 및 Cas12i2-RT(서열번호 25)의 활성을 보여준다. indel을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 흰색 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 회색 막대로 표시되었다. 암호화된 편집을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 체크무늬 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 검은색 막대로 표시되었다. 도 13b는 EMX1_T6 게놈 부위(서열번호 34)에서 서열번호 114의 RNA 가이드 또는 서열번호 138 내지 152의 편집 주형 RNA를 사용한 Cas12i2(서열번호 4) 및 Cas12i2-RT(서열번호 25)의 활성을 보여준다. indel을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 흰색 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 회색 막대로 표시되었다. 암호화된 편집을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 체크무늬 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 검은색 막대로 표시되었다. 도 13c는 VEGFA_T2(서열번호 36)에서 서열번호 116의 RNA 가이드 또는 서열번호 153 내지 167의 주형 RNA를 사용한 Cas12i2(서열번호 4) 및 Cas12i2-RT(서열번호 25)의 활성을 보여준다. indel을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 흰색 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 회색 막대로 표시되었다. 암호화된 편집을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 체크무늬 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 검은색 막대로 표시되었다. 도 13d는 VEGFA_T5 게놈 부위(서열번호 38)에서 서열번호 118의 RNA 가이드 또는 서열번호 168 내지 182의 편집 주형 RNA를 사용한 Cas12i2(서열번호 4) 및 Cas12i2-RT(서열번호 25)의 활성을 보여준다. indel을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 흰색 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 회색 막대로 표시되었다. 암호화된 편집을 갖는 것으로 분석된 NGS 리드 %는 Cas12i2의 경우 체크무늬 막대로 표시되고, Cas12i2-RT의 경우 검은색 막대로 표시되었다.
도 14a 내지 도 14c는 RNA 가이드 또는 편집 주형 RNA를 사용하여 Cas12i2의 절단 패턴을 확인하는 데 사용되는 검정의 단계를 도시하는 개략도를 포함한다. 도 14a는 표적 서열 및 바코드를 포함하는 올리고 구성을 보여준다. 도 14b는 5' 및 3' 오버행을 평활 말단화(blunt)시키기 위한 절단 산물의 처리 또는 5' 오버행을 필인(fill in)시키기 위한 말단 복구를 보여준다. 도 14c는 절단 산물의 증폭을 보여준다.
도 15a 내지 도 15e는 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하는 유전자 편집을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 15a는 AAVS1_T2 게놈 부위의 PAM 가닥 및 비-PAM 가닥에서 서열번호 2의 Cas12i2에 의해 유도된 시험관내 절단 부위(삼각형)를 도시하는 개략도이다. 도 15b는 필인 처리 후 5' 절단 산물의 증폭으로부터 얻은 리드 길이의 히스토그램이다. 도 15c는 필인 처리 후 3' 절단 산물의 증폭으로부터 얻은 리드 길이의 히스토그램이다. 도 15d는 평활 말단화(blunting) 처리 후 5' 절단 산물로부터 얻은 리드 길이의 히스토그램이다. 도 15e는 평활 말단화 처리 후 3' 절단 산물의 증폭으로부터 얻은 리드 길이의 히스토그램이다. 각각의 리드 길이 히스토그램은 도 15b 내지 도 15e의 x-축에 도시된 바와 같이 표적 서열에 매핑된다.
도 16a 내지 도 16b는 EMX1_T6 게놈 부위(도 16a) 및 VEGFA_T5 게놈 부위(도 16b)의 PAM 가닥 또는 비-PAM 가닥에서 서열번호 2의 Cas12i2 또는 서열번호 4의 변이형 Cas12i2에 의해 유도된 시험관내 절단 부위(삼각형)를 보여준다. 기준 막대(오른쪽)는 시퀀싱 리드 수로 측정된 경우 절단 빈도를 나타낸다.
도 17a 내지 도 17b는 예시적인 게놈 크기에서의 유전자 편집 결과를 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 17a는 AAVS1_T7 게놈 부위(서열번호 30), EMX1_T6 게놈 부위(서열번호 34) 또는 VEGFA_T5 게놈 부위(서열번호 38)에 4개의 뉴클레오타이드 삽입을 도입하는 편집 주형 RNA에 의한 활성을 보여준다. 편집 주형 RNA는 34개의 뉴클레오타이드 역전사 주형 서열 및 3개, 8개, 13개, 30개 또는 60개의 뉴클레오타이드 PBS로 구성된다. 암호화된 편집 대 총 편집의 비는 y-축에 도시되어 있다. 도 17b는 AAVS1_T7 게놈 부위(서열번호 30), EMX1_T6 게놈 부위(서열번호 34) 또는 VEGFA_T5 게놈 부위(서열번호 38)에 4개의 뉴클레오타이드 삽입을 도입하는 데 있어서 편집 주형 RNA에 의한 활성을 보여준다. 편집 주형 RNA는 13개의 뉴클레오타이드 PBS 및 14개, 24개, 34개, 44개 또는 54개의 뉴클레오타이드 역전사 주형 서열로 구성된다. 암호화된 편집 대 총 편집의 비는 y-축에 도시되어 있다. 도 17a의 서열은, 위에서 아래로, 서열번호 90 내지 92이다. 도 17b의 서열은, 위에서 아래로, 서열번호 90 내지 92이다.
도 18은 U2OS 세포의 AAVS1_T7 게놈 부위(서열번호 32) 및 EMX1_T6 게놈 부위(서열번호 34)에 혼입된 암호화된 편집을 보여준다.
도 19a 내지 도 19b는 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하는 유전자 편집 절차를 예시하는 개략도를 포함한다. 도 19a는 역전사효소 및 pegRNA에 융합된 Cas9를 포함하는 Cas9 프라임 편집기를 도시하는 개략도이다. Cas9에 의한 PAM 가닥의 절단 후 표적 DNA에 프라이머가 생성된다. 프라이머와 pegRNA의 혼성화는 역전사가 개시되게 한다. 도 19b는 역전사효소 및 편집 주형 RNA에 융합된 유형 V CRISPR 뉴클레이스를 도시하는 개략도이다. 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 의한 비-PAM 가닥의 절단 후 표적 DNA에 프라이머가 생성된다. 프라이머와 편집 주형 RNA의 혼성화는 역전사가 개시되게 한다.
도 20a 내지 도 20c는 나타낸 바와 같이 Cas12i2-RT 융합 폴리펩타이드를 갖는 다양한 게놈 부위에서의 편지을 보여주는 다이어그램을 포함한다. 도 20a는 AAVS1 게놈 부위에서 서열번호 219 내지 223의 변이형 Cas12i2-RT 융합체에 의해 도입된 indel 편집(흰색 막대) 또는 암호화된 편집(회색 막대)을 포함하는 NGS 리드 %를 보여주는 플롯이다. 도 20b는 EMX1 게놈 부위에서 서열번호 219 내지 223의 변이형 Cas12i2-RT 융합체에 의해 도입된 indel 편집(흰색 막대) 또는 암호화된 편집(회색 막대)을 포함하는 NGS 리드 %를 보여주는 플롯이다. 도 20c는 VEGFA 게놈 부위에서 서열번호 219 내지 223의 변이형 Cas12i2-RT 융합체에 의해 도입된 indel 편집(흰색 막대) 또는 암호화된 편집(회색 막대)을 포함하는 NGS 리드 %를 보여주는 플롯이다.
도 21은 변이형 Cas12i2(서열번호 4) 또는 변이형 Cas12i2-RT 융합체(서열번호 219)와 RNA 가이드 또는 편집 주형 RNA에 의해 도입된 indel 편집 또는 암호화된 편집을 포함하는 NGS 리드 %를 보여주는 플롯이다. RNA 가이드 및 편집 주형 RNA는 변형되지 않았거나, 또는 말단 포스포로티오에이트 백본 연결 및/또는 2'O-메틸 뉴클레오타이드로 구성되었다.
도 22는 AAVS1 게놈 부위에서 변이형 Cas12i4-RT 융합체에 의해 도입된 indel 편집(흰색 막대) 또는 암호화된 편집(회색 막대)을 포함하는 NGS 리드 %를 보여주는 플롯이다.
도 23은 AAVS1, EMX1 또는 VEGFA 게놈 부위에서 변이형 Cas12i2 또는 변이형 Cas12i2-RT 융합체, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA에 의해 도입된 indel 편집(흰색 막대) 또는 암호화된 편집(회색 막대)을 포함하는 NGS 리드 %를 보여주는 플롯이다.
본 개시내용은 유형 V 뉴클레이스 또는 이를 암호화하는 핵산, RNA 가이드 또는 이를 암호화하는 핵산, 역전사효소 또는 이를 암호화하는 핵산 및 RT 공여체 RNA 또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 유전자 편집 시스템에 관한 것이다. 또한, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템을 사용하여 세포를 유전자 편집하는 방법, 이에 따라 생산된 유전적으로 조작된 세포 및 유전자 편집 시스템과 관련된 유전자 편집 RNA 분자 또는 RNA 분자 세트뿐만 아니라 이를 생산하기 위한 DNA 분자(들)를 포함하는 약제학적 조성물 및 키트가 본 명세서에 제공된다.
정의
본 개시내용은 특정 실시형태 및 소정의 도면을 참조하여 설명될 것이지만, 본 개시내용은 이에 제한되지 않고 청구범위에 의해서만 제한된다. 이하에 제시된 용어는 일반적으로 달리 명시되지 않는 한 일반적인 의미로 이해되어야 한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "활성"은 생물학적 활성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성은 효과기 활성을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 활성은 효소적 활성, 예를 들어, 효과기의 촉매 능력을 포함한다. 예를 들어, 활성은 뉴클레이스 활성을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 활성은 RNA로부터 DNA를 생성하거나 또는 표적 서열에 편집을 도입시키는 효소의 능력을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "~에 인접해 있는"은 또 다른 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열에 매우 근접한 뉴클레오타이드 또는 아미노산 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레오타이드가 두 서열을 분리하지 않는(즉, 바로 인접해 있는) 경우, 뉴클레오타이드 서열은 또 다른 뉴클레오타이드 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 소수의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 뉴클레오타이드)가 두 서열을 분리하는 경우, 뉴클레오타이드 서열은 또 다른 뉴클레오타이드 서열과 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 제1 서열은, 두 서열이 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개 또는 15개의 뉴클레오타이드만큼 분리되어 있는 경우, 제2 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 제1 서열은, 두 서열이 최대 2개의 뉴클레오타이드, 최대 5개의 뉴클레오타이드, 최대 8개의 뉴클레오타이드, 최대 10개의 뉴클레오타이드, 최대 12개의 뉴클레오타이드 또는 최대 15개의 뉴클레오타이드만큼 분리되어 있는 경우, 제2 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 제1 서열은, 두 서열이 2개 내지 5개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 6개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 6개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 6개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 6개 내지 12개의 뉴클레오타이드, 8개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 8개 내지 12개의 뉴클레오타이드, 10개 내지 12개의 뉴클레오타이드, 10개 내지 15개의 뉴클레오타이드 또는 12개 내지 15개의 뉴클레오타이드만큼 분리되어 있는 경우, 제2 서열에 인접해 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "CRISPR 뉴클레이스"는 핵산에 결합하고 단일-가닥 절단 또는 이중-가닥 절단을 도입할 수 있는 RNA-가이드된 효과기를 지칭한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 유형 II CRISPR 뉴클레이스 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 문헌[Makarova et al. "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPRJ. 1(5):325-36 (2018)]에 기술되어 있는 바와 같은 효과기이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유형 II" 및 "유형 II 뉴클레이스"는 RuvC 도메인 및 HNH 도메인을 포함하는 뉴클레이스를 지칭한다. 유형 II 뉴클레이스는 유형 II-A 뉴클레이스, 유형 II-B 뉴클레이스 또는 유형 II-C 뉴클레이스일 수 있다. 일부 실시형태에서, 유형 II 뉴클레이스는 tracrRNA를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 유형 II 뉴클레이스는 Cas9 폴리펩타이드이다. Cas9 폴리펩타이드는 이중-가닥 DNA 표적을 절단할 수 있거나 또는 닉케이스일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "유형 V" 및 "유형 V 뉴클레이스"는 RuvC 도메인을 갖는 RNA-가이드된 CRISPR 뉴클레이스를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스는 tracrRNA를 필요로 하지 않는다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스는 tracrRNA를 필요로 한다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스는 Cas12 폴리펩타이드, 예컨대, Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j(CasPhi) 폴리펩타이드이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "Cas12i 폴리펩타이드"(본 명세서에서 Cas12i로도 지칭됨)는 RNA 가이드에 의해 특정된 표적 핵산 상의 표적 서열에 결합하는 폴리펩타이드를 지칭하되, 폴리펩타이드는 야생형 Cas12i 폴리펩타이드와 적어도 일부 아미노산 서열 상동성을 갖는다. 일부 실시형태에서, Cas12i 폴리펩타이드는 본 명세서에 언급된 특허 대상과 목적에 대해 참조에 의해 원용되어 있는 미국 특허 제10,808,245호의 서열번호 1 내지 5 및 11 내지 18 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시형태에서, Cas12i 폴리펩타이드는 본 출원의 서열번호 8, 2, 11 및 9 중 어느 하나와 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 81%, 적어도 82%, 적어도 83%, 적어도 84%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 Cas12i 폴리펩타이드는 관련 개시내용이 본 명세서에 언급된 특허 대상 및 목적에 대해 참조에 의해 원용되어 있는 WO/2021/202800에 기술되어 있는 바와 같은 Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas12i 폴리펩타이드 표적 핵산(예를 들어, 닉(nick) 또는 이중 가닥 절단)을 절단한다.
두 핵산 또는 두 아미노산 서열의 "동일성 퍼센트"(일명 서열 동일성)는 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77, 1993]에서와 같이 수정된 문헌[Karlin and Altschul Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-68, 1990]의 알고리즘을 사용하여 결정된다. 이러한 알고리즘은 문헌[Altschul, et al. J. Mol. Biol. 215:403-10, 1990]의 NBLAST 및 XBLAST 프로그램(버전 2.0)에 통합되어 있다. BLAST 뉴클레오타이드 검색은 본 발명의 핵산 분자와 상동인 뉴클레오타이드 서열을 얻기 위해 NBLAST 프로그램, 점수=100, 단어 길이=12를 사용하여 수행될 수 있다. BLAST 단백질 검색은 본 발명의 단백질 분자와 상동인 아미노산 서열을 얻기 위해 XBLAST 프로그램, 점수=50, 단어 길이=3을 사용하여 수행될 수 있다. 두 서열 사이에 갭이 존재하는 경우, 문헌[Altschul et al., Nucleic Acids Res. 25(17):3389-3402, 1997]에 기술되어 있는 바와 같은 Gapped BLAST가 이용될 수 있다. BLAST 및 Gapped BLAST 프로그램을 이용하는 경우, 각각의 프로그램(예를 들어, XBLAST 및 NBLAST)에 대한 기본 매개변수가 사용될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "복합체"는 2개 이상의 분자의 그룹을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 복합체는 서로 상호작용(예를 들어, 결합, 접촉, 부착)하는 폴리펩타이드 및 핵산 분자를 포함한다. 일부 실시형태에서, 용어 "복합체"는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)와 역전사효소 폴리펩타이드의 회합을 지칭하는 데 사용된다. 예를 들어, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 Cas12i2 폴리펩타이드)와 역전사효소 폴리펩타이드의 복합체는, 예를 들어, 이량체화 도메인(예를 들어, 류신 지퍼)을 통한 두 폴리펩타이드의 이종이량체, 항체, 나노바디 또는 압타머일 수 있다. 일부 실시형태에서, 용어 "복합체"는 RNA 가이드와 RT 공여체 RNA의 회합을 지칭하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 용어 "복합체"는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스), 역전사효소 폴리펩타이드, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA의 회합을 지칭하는 데 사용된다. 일부 실시형태에서, 용어 "복합체"는 역전사효소 폴리펩타이드와 RT 공여체 RNA의 회합을 지칭하는 데 사용된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "뉴클레이스에 의해 인식 가능한 결합 부위" 또는 "뉴클레이스 결합 서열"은 CRISPR 뉴클레이스에 결합할 수 있는 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 RNA 서열이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 직접 반복 서열이다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 유형 II CRISPR 뉴클레이스 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 유형 II CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 결합 부위 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 결합 부위)에 결합할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "결실"은 참조 서열에 대해 핵산 서열에서의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들의 손실을 지칭한다. 결실을 포함하는 서열을 만드는 방법에는 특별한 과정이 암시되어 있지 않다. 예를 들어, 결실을 포함하는 서열은 개별 뉴클레오타이드로부터 직접 합성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 결실은 참조 서열을 제공한 다음 변경함으로써 이루어진다. 핵산 서열은 유기체의 게놈에 있을 수 있다. 핵산 서열은 세포에 있을 수 있다. 핵산 서열은 DNA 서열일 수 있다. 결실은 프레임시프트 돌연변이 또는 비프레임시프트 돌연변이일 수 있다. 본 명세서에 기재된 결실은 최대 수 킬로베이스의 결실을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "편집"은 관심 게놈 부위와 같은 표적 핵산의 뉴클레오타이드 서열에 도입된 하나 이상의 변형을 지칭한다. 편집은 서열 본 명세서에 정의된 바와 같은 표적 내에서 발생할 수 있다. 대안적으로, 편집은 표적 서열 외부(예를 들어, 표적 서열에 인접한 곳)에서 발생할 수 있다. 편집은 하나 이상의 치환, 하나 이상의 삽입, 하나 이상의 결실 또는 이들의 조합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "융합" 및 "융합된"은 적어도 2개의 뉴클레오타이드 또는 단백질 분자의 연결을 지칭한다. 예를 들어, "융합" 및 "융합된"은 자연에서 별개의 유전자(예를 들어, 유형 V 뉴클레이스 및 역전사효소 폴리펩타이드)에 의해 암호화되는 적어도 2개의 폴리펩타이드 도메인의 연결을 지칭할 수 있다. 융합은 N-말단 융합, C-말단 융합 또는 분자내 융합일 수 있다. 일부 양태에서, 도메인은 단일 폴리펩타이드를 생산하기 위해 전사되고 번역된다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어 "융합" 및 "융합된"은 2개의 RNA 분자(예를 들어, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA)와 같은 2개의 핵산 분자의 연결을 지칭하는 데 사용된다. 융합은 5' 융합, 3' 융합 또는 분자내 융합일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "삽입"은 참조 서열에 대해 핵산 서열에서의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들의 획득을 지칭한다. 삽입을 포함하는 서열을 만드는 방법에는 특별한 과정이 암시되어 있지 않다. 예를 들어, 삽입을 포함하는 서열은 개별 뉴클레오타이드로부터 직접 합성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 삽입은 참조 서열을 제공한 다음 변경함으로써 이루어진다. 핵산 서열은 유기체의 게놈에 있을 수 있다. 핵산 서열은 세포에 있을 수 있다. 핵산 서열은 DNA 서열일 수 있다. 삽입은 프레임시프트 돌연변이 또는 비프레임시프트 돌연변이일 수 있다. 본 명세서에 기재된 삽입은 최대 수 킬로베이스의 삽입을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "프로토스페이서 인접 모티프" 또는 "PAM 서열"은 표적 서열에 인접한 DNA 서열을 지칭한다. 일부 실시형태에서, PAM 서열은 효소 활성을 위해 필요하다. 이중-가닥 DNA 분자에서, PAM 모티프를 포함하는 가닥은 "PAM-가닥"이라고 하고, 상보적 가닥은 "비-PAM 가닥"이라고 한다. RNA 가이드는 본 명세서에 개시된 표적 서열과 상보적인 비-PAM 가닥 부위에 결합하고, 본 명세서에 기재된 바와 같은 PAM 서열은 PAM-가닥에 존재한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PAM 가닥"은 PAM 모티프를 포함하는 표적 핵산(이중-가닥) 가닥을 지칭한다. 일부 실시형태에서, PAM 가닥은 코딩(예를 들어, 센스) 가닥이다. 다른 실시형태에서, PAM 가닥은 논코딩(예를 들어, 안티센스 가닥)이다. 용어 "비-PAM 가닥"은 PAM 가닥의 상보적 가닥을 지칭한다. gRNA는 염기-페어링을 통해 비-PAM 가닥과 결합하기 때문에, 비-PAM 가닥은 표적 가닥으로도 알려져 있는 반면, PAM 가닥은 비표적 가닥으로도 알려져 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "표적 서열"은 PAM 모티프에 인접한(PAM 가닥 상의) DNA 단편을 지칭한다. 표적 서열의 상보적 영역은 비-PAM 가닥에 있다. 표적 서열은 PAM 모티프에 바로 인접할 수 있다. 대안적으로, 표적 서열 및 PAM은 작은 서열 분절(예를 들어, 최대 5개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 최대 4개, 3개, 2개 또는 1개의 뉴클레오타이드)만큼 별도로 존재할 수 있다. 표적 서열은 PAM 모티프를 인식하는 CRISPR 뉴클레이스에 따라 PAM 모티프의 3' 말단 또는 PAM 모티프의 5' 말단에 위치할 수 있으며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 표적 서열은 Cas12i 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 개시된 것들과 같은 Cas12i2 폴리펩타이드)의 경우 PAM 모티프의 3' 말단에 위치한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "RNA 가이드" 또는 "RNA 가이드 서열"은 본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레이스의 관심 게놈 부위로의 표적화를 용이하게 하는 RNA 분자 또는 변형된 RNA 분자를 지칭한다. 예를 들어, RNA 가이드는 PAM 가닥이 표적 서열과 상보적인, 예를 들어, 특정 핵산 서열과 상보적이도록 설계된 비-PAM 가닥의 부위를 인식(이에 결합)하는 분자일 수 있다. RNA 가이드는 스페이서 및 뉴클레이스 결합 서열(예를 들어, 직접 반복(DR) 서열)을 포함한다. 용어 CRISPR RNA(crRNA), pre-crRNA 및 성숙 crRNA도 본 명세서에서 RNA 가이드를 지칭하는 데 사용된다. RNA 가이드의 5' 말단 또는 3' 말단은 본 명세서에 개시된 바와 같은 RT 공여체 RNA에 융합될 수 있다. 일부 경우에, RNA 가이드는, 예를 들어, 표적 서열의 상보적 서열에 결합하는 RNA 가이드에 포함된 DNA-결합 서열에 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함하는 변형된 RNA 분자일 수 있다. 일부 예에서, DNA-결합 서열은 DNA 서열 또는 DNA/RNA 하이브리드 서열을 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "스페이서" 및 "스페이서 서열"(일명 DNA-결합 서열)은 표적 서열(DNA 서열)의 RNA 등가물인 RNA 가이드의 일부이다. 스페이서는 표적 서열(PAM 가닥 내)과 상보적인 부위에서 염기-페어링을 통해 비-PAM 가닥에 결합할 수 있는 서열을 포함한다. 이러한 스페이서는 표적 서열에 특이적인 것으로도 알려져 있다. 일부 경우에, 스페이서는 RNA-DNA 서열 차이를 제외하고 표적 서열과 적어도 75%(예를 들어, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98% 또는 적어도 99%) 동일할 수 있다. 일부 경우에, 스페이서는 RNA-DNA 서열 차이를 제외하고 표적 서열과 100% 동일할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상보적"은 제1 및 제2 폴리뉴클레오타이드가 염기-페어링을 통해 이중-가닥 복합체를 형성하여 제1 폴리뉴클레오타이드와 복합체를 형성하는 효과기 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i2 폴리펩타이드, Cas12i2-역전사효소 융합 폴리펩타이드 또는 이들의 변이체)가 제2 폴리뉴클레오타이드에 작용(예를 들어, 절단)할 수 있도록 제2 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, 표적 서열의 상보적 서열)에 대해 소정의 수준의 상보성을 갖는 제1 폴리뉴클레오타이드(예를 들어, RNA 가이드의 스페이서 서열)를 지칭한다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 실질적으로 상보적일 수 있으며, 즉, 제2 폴리뉴클레오타이드와 적어도 약 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%의 상보성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 제1 폴리뉴클레오타이드는 제2 폴리뉴클레오타이드와 완전히 상보적이며, 즉, 제2 폴리뉴클레오타이드와 100%의 상보성을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "역전사효소" 및 "RT"는 전형적으로 RNA- 및 DNA-의존적 DNA 중합 활성 및 RNA-DNA 하이브리드에서 RNA의 절단을 촉매하는 RNase H 활성을 포함하는 3가지 효소적 활성을 갖는 다기능성 효소를 지칭한다. 역전사효소는 RNA 주형으로부터 DNA를 생성할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "역전사 공여체 RNA" 및 "RT 공여체 RNA"는 역전사 주형 서열(주형 서열) 및 프라이머 결합 부위(PBS)를 포함하는 RNA 분자를 지칭한다. RT 공여체 RNA는 RNA 가이드의 5' 말단 또는 3' 말단에서 RNA 가이드에 융합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "PBS-표적화 부위"는 PBS가 결합하는 영역을 지칭한다. PBS-표적화 부위는 표적 서열과 상보적인 비-PAM 가닥의 영역(예를 들어, 상류)에 인접할 수 있다. 예를 들어, PBS-표적화 부위는 표적 서열과 상보적인 영역의 상류에 있는 3개 내지 10개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 3개의 뉴클레오타이드 또는 4개의 뉴클레오타이드)일 수 있다. 일부 경우에, PBS-표적화 부위는 표적 서열과 상보적인 비-PAM 가닥의 영역에 바로 인접할 수 있다. 다른 예에서, PBS-표적화 부위는 표적 서열과 상보적인 비-PAM 가닥의 영역과 중첩될 수 있다. 대안적으로, PBS-표적화 부위는 PAM 가닥 상의 표적 서열에 인접하거나, 이의 상류에 있거나 또는 이와 중첩될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "역전사 주형 서열" 또는 "주형 서열"은 역전사효소에 의한 DNA 합성을 위한 주형의 역할을 하는 RNA 분자 또는 RT 공여체 RNA의 단편을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 유전자 편집이 필요한 게놈 부위에 혼입될 편집을 포함한다. 일부 경우에, RT 공여체 RNA의 역전사 주형 서열에 의해 매개되는 편집은 PAM 서열, 표적 서열 또는 둘 다를 방해하거나 또는 제거한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "편집 주형 RNA" 또는 "유전자 편집 RNA"(상호교환적으로 사용됨)는 RNA 가이드(스페이서 및 본 명세서에 개시된 것들과 같은 CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위 포함) 및 RT 공여체 RNA(PBS 및 역전사 주형 서열 포함)를 포함하는 RNA 분자 또는 RNA 분자 세트를 지칭한다. 유전자 편집 RNA는 CRISPR 뉴클레이스에 의해 관심 게놈 부위 내의 표적 서열에서 절단을 매개하고, 유전자 편집 RNA의 주형 서열을 기반으로 CRISPR 뉴클레이스 절단에 의해 생성된 자유 DNA 가닥의 자유 3' 말단에서 DNA 단편을 합성할 수 있다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA 또는 유전자 편집 RNA는 RT 공여체 RNA에 연결된(예를 들어, 융합된) RNA 가이드를 포함하는 단일 RNA 분자이다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는, 5'에서 3'로, CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위, 스페이서 서열, PBS 및 RT 공여체 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA 또는 유전자 편집 RNA는, 5'에서 3'로, CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위, 스페이서, 주형 서열 및 PBS를 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA 또는 유전자 편집 RNA는, 5'에서 3'로, 주형 서열, PBS, CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위 및 스페이서 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 링커를 추가로 포함한다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위와 PBS 사이 또는 스페이서 서열과 RT 공여체 RNA 사이에 링커를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "치환"은 참조 서열에 대해 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들의 다른 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드들로의 대체를 지칭한다. 치환을 포함하는 서열을 만드는 방법에는 특별한 과정이 암시되어 있지 않다. 예를 들어, 치환을 포함하는 서열은 개별 뉴클레오타이드로부터 직접 합성될 수 있다. 다른 실시형태에서, 치환은 참조 서열을 제공한 다음 변경함으로써 이루어진다. 핵산 서열은 유기체의 게놈에 있을 수 있다. 핵산 서열은 세포에 있을 수 있다. 핵산 서열은 DNA 서열일 수 있다. 본 명세서에 기재된 치환은 최대 수 킬로베이스의 치환을 지칭한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "상류" 및 "하류"는 단일 핵산(예를 들어, DNA) 서열 내의 상대적 위치를 지칭한다. "상류" 및 "하류"는 각각 RNA 전사가 일어나는 5'에서 3' 방향과 관련된다. 첫 번째 서열의 3' 말단이 두 번째 서열의 5' 말단 앞에서 발생할 때, 첫 번째 서열은 두 번째 서열의 상류이다. 첫 번째 서열의 5' 말단이 두 번째 서열의 3' 말단 뒤에서 발생할 때, 첫 번째 서열은 두 번째 서열의 하류이다. 일부 실시형태에서, 용어 "상류" 및 하류"는 비-PAM 가닥과 관련하여 사용된다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, PBS는 표적 서열의 상류에 있는 비-PAM 가닥 서열과 상보적이다. 이와 같이, 일부 실시형태에서, PBS는 스페이서 서열이 결합하는 서열의 상류 서열에 결합하고, 스페이서 서열은 PBS가 결합하는 서열의 하류에 결합한다.
I. 유전자 편집 시스템
프라임 편집은 표적 서열에 치환, 작은 삽입 또는 작은 결실을 도입하기 위해 개발되었다. 프라임 편집 접근법은 역전사효소에 융합된 Cas9 닉케이스 및 프라임 편집 가이드 RNA(pegRNA)에 의존한다. pegRNA는 표적 유전자좌의 비-PAM 가닥(PAM 서열의 반대편 가닥)에 결합할 수 있는 스페이서 서열, 표적 유전자좌의 PAM 가닥(PAM 서열을 포함하는 가닥)에 결합할 수 있는 프라이머 결합 부위(PBS) 및 편집을 포함하는 역전사 주형 서열을 포함한다. pegRNA의 스페이서 서열 비-PAM 가닥의 표적 서열에 결합하고, 닉케이스 Cas9는 PAM 가닥에 닉을 형성한다. 이는 PBS에 혼성화할 수 있는 표적 유전자좌의 PAM 가닥에 3' 플랩(flap)을 노출시킨다. 그런 다음, 역전사효소는 역전사 주형을 카피하여 3' 플랩을 연장시킨다. 예를 들어, 도 19a를 참조한다. DNA 복구 메커니즘을 통해, 편집은 표적 유전자좌에 혼입된다.
일부 양태에서, 편집 표적 핵산을 (예를 들어, 관심 게놈 부위에서) 편집할 수 있는, 예를 들어, 게놈 부위에 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합을 도입할 수 있는 유전자 편집 시스템이 본 명세서에 제공된다. 편집은 표적 핵산의 가닥 중 하나에서 발생할 수 있다. 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 적어도 하나의 단백질 구성요소 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 및 적어도 하나의 RNA 구성요소 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 단백질 구성요소는 RNA 구성요소에 의해 가이드되어 목적하는 부위에서 표적 핵산을 절단하는 활성 및 RNA 구성요소의 일부를 주형으로 사용하여 절단으로 인해 생성된 DNA 가닥의 자유 3' 말단에서 시작하여 새로운 DNA 서열을 합성하는 활성을 갖는다. 그런 다음, 새로 합성된 DNA 단편은, 예를 들어, 숙주 세포의 DNA 복구 메커니즘을 통해 표적 핵산에 혼입되어 표적 핵산의 유전적 편집을 유도할 수 있다.
본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템의 단백질 구성요소는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 변이형 Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스) 및 역전사효소(RT) 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스 및 RT 폴리펩타이드는 2개의 별도의 폴리펩타이드이다. 다른 예에서, CRISPR 뉴클레이스 및 RT 폴리펩타이드는 융합 폴리펩타이드의 일부이다.
본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템의 RNA 구성요소는 설계된 바와 같이 표적 핵산의 특정 부위에서 CRISPR 뉴클레이스 절단을 매개하는 가이드 RNA(gRNA)(본 명세서에서 RNA 가이드 또는 CRISPR RNA(crRNA)로도 기재됨) 및 RT 폴리펩타이드에 의한 역전사를 매개하고 역전사를 위한 주형 서열을 제공하는 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, gRNA 및 RT 공여체 RNA는 2개의 개별 RNA 분자이다. 다른 예에서, gRNA 및 RT 공여체 RNA는 단일 RNA 분자의 일부이다.
본 명세서에 나타낸 바와 같이 그리고 이론에 얽매이지 않고, 본 명세서에 기재된 유전자 편집 시스템은 해당 분야에 비해 여러 가지 장점을 제공한다. 예를 들어, Cas12i CRISPR 뉴클레이스와 같은 유형 V CRISPR 뉴클레이스로는 RNA-주형 편집은 입증되지 않았다. Cas9개의 뉴클레이스보다 작은 유형 V 뉴클레이스가 풍부하다. 예를 들어, Cas12i2는 1,054개의 아미노산 길이인 반면, S. 피오게네스(S. pyogenes) Cas9(SpCas9)는 1,368개의 아미노산 길이이고, S. 써모필루스(S. thermophilus) Cas9(StCas9)는 1,128개의 아미노산 길이이고, FnCpf1은 1,300개의 아미노산 길이이고, AsCpf1은 1,307개의 아미노산 길이이고, LbCpf1은 1,246개의 아미노산 길이이다. 추가적으로, 유형 V 뉴클레이스는 트랜스-활성화 CRISPR RNA(tracrRNA)가 필요하지 않은 RNA 가이드를 이용하므로 Cas9 RNA 가이드보다 작다. Cas12i 폴리펩타이드와 RNA 가이드 크기가 작을수록 전달에 유리하다. 추가적으로, 표적 가닥(비-PAM 가닥)과 같은 표적 유전자좌의 단일 가닥에 결합하는 단일 편집 주형 RNA를 이용하는 임의의 CRISPR 뉴클레이스로는 RNA-주형 편집이 입증되지 않았다. 본 명세서에 나타낸 바와 같이, Cas12i 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 편집 시스템도 SpCas9 폴리펩타이드를 포함하는 유전자 편집 시스템에 비해 감소된 표적외 활성을 보여준다. 전체가 참조에 의해 원용되어 있는 PCT/US2021/025257을 참조한다.
A. CRISPR 뉴클레이스
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 뉴클레이스 결합 서열에 결합할 수 있고/있거나 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 표적 서열에서 DNA를 절단한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 표적 서열을 특이적으로 인식하고/하거나 이에 결합하는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 DNA-결합 서열을 통해 표적 서열에 동원된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 표적 서열에서 DNA의 가닥 중 하나 또는 둘 다를 절단한다. 일부 실시형태에서, 하나 초과의 CRISPR 뉴클레이스가 표적 서열에 동원되고, 하나 이상의 CRISPR 뉴클레이스는 표적 서열에서 또는 그 근처에서 DNA의 가닥 중 하나 또는 둘 다를 절단한다. 이러한 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 뉴클레이스 활성을 보유하거나 또는 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 감소된 또는 제한된 뉴클레이스 활성을 보유할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 편집 주형 RNA의 적어도 하나의 뉴클레이스 결합 서열에 결합할 수 있으며 이에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체는 편집 주형 RNA의 적어도 하나의 DNA-결합 서열을 통해 표적 서열에 결합할 수 있으며 이에 결합한다. 이러한 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 뉴클레이스 결합 서열과 편집 주형 RNA의 DNA-결합 서열에 결합함으로써 표적 서열에 동원되거나 또는 이에 근접하게 된다. 추가의 이러한 실시형태에서, 역전사효소는 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 역전사 주형 서열을 DNA로 전사할 수 있으며 이를 전사한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드는 역전사 주형 서열을 표적 핵산의 비-PAM 가닥으로 전사한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드는 역전사 주형 서열을 표적 핵산의 PAM 가닥으로 전사한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드는 PBS에서 시작하여 5'에서 3'(예를 들어, PBS의 5' 또는 3' 말단)로 전사한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 비-PAM 가닥의 자유 3' 말단에 PBS를 혼성화한 후, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체는 비-PAM 가닥의 3' 말단으로부터 역전사 주형 서열을 전사한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산의 PAM 가닥의 자유 3' 말단에 PBS를 혼성화한 후, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체는 PAM 가닥의 3' 말단으로부터 역전사 주형 서열을 전사한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 RNA-가이드된 CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 DNA-표적화 뉴클레이스이다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 Cas9(예를 들어, Cas9 및 nCas9), Cas12a/Cpf1, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i 및 Cas12j/ CasPhi)이다. Cas 효소의 비제한적인 예는 Cas1, Cas1B, Cas2, Cas3, Cas4, Cas5, Cas5d, Cas5t, Cas5h, Cas5a, Cas6, Cas7, Cas8, Cas8a, Cas8b, Cas8c, Cas9(Csn1 또는 Csx12로도 알려져 있음), Cas10, Cas10d, Cas12a/Cpfl, Cas12b/C2c1, Cas12c/C2c3, Cas12d/CasY, Cas12e/CasX, Cas12g, Cas12h, Cas12i, Cas12j/CasΦ, Cpf1, Csy1, Csy2, Csy3, Csy4, Cse1, Cse2, Cse3, Cse4, Cse5e, Csc1, Csc2, Csa5, Csn1, Csn2, Csm1, Csm2, Csm3, Csm4, Csm5, Csm6, Cmr1, Cmr3, Cmr4, Cmr5, Cmr6, Csb1, Csb2, Csb3, Csxl7, Csxl4, Csx10, Csxl6, CsaX, Csx3, Csx1, Csx1S, Csx11, Csf1, Csf2, CsO, Csf4, Csd1, Csd2, Cst1, Cst2, Csh1, Csh2, Csa1, Csa2, Csa3, Csa4, Csa5, 유형 II CRISPR 뉴클레이스, 유형 V CRISPR 뉴클레이스, 유형 VI CRISPR 뉴클레이스, CARF, DinG, 이들의 상동체 또는 이들의 변형 또는 조작된 버전을 포함한다. 다른 CRISPR 뉴클레이스도 본 개시내용의 범위 내에 있지만, 본 개시내용에 구체적으로 나열되지는 않을 수도 있다. 예를 들어, 문헌[Makarova et al. "Classification and Nomenclature of CRISPR-Cas Systems: Where from Here?" CRISPRJ. 1(5):325-36 (2018)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 본 명세서에 언급된 특허 대상 및 목적에 대해 참조에 의해 원용되어 있는 WO2021055874, WO2020206036, WO2020191102, WO2020186213, WO2020028555, WO2020033601, WO2019126762, WO2019126774, WO2019071048, WO2019018423, WO2019005866, WO2018191388, WO2018170333, WO2018035388, WO2018035387, WO2017219027, WO2017189308, WO2017184768, WO2017106657, WO2016205749, WO2017070605, WO2016205764, WO2016205711, WO2016028682, WO2015089473, WO2014093595, WO2015089427, WO2014204725, WO2015070083, WO2014093655, WO2014093694, WO2014093712, WO2014093635, WO2021133829, WO2021007177, WO2020197934, WO2020181102, WO2020181101, WO2020041456, WO2020023529, WO2020005980, WO2019104058, WO2019089820, WO2019089808, WO2019089804, WO2019089796, WO2019036185, WO2018226855, WO2018213351, WO2018089664, WO2018064371, WO2018064352, WO2017106569, WO2017048969, WO2016196655, WO2016106239, WO2016036754, WO2015103153, WO2015089277, WO2014150624, WO2013176772, WO2021119563, WO2021118626, WO2020247883, WO2020247882, WO2020223634, WO2020142754, WO2020086475, WO2020028729, WO2019241452, WO2019173248, WO2018236548, WO2018183403, WO2017027423, WO2018106727, WO2018071672, WO2017096328, WO2017070598, WO2016201155, WO2014150624, WO2013098244, WO2021113522, WO2021050534, WO2021046442, WO2021041569, WO2021007563, WO2020252378, WO2020180699, WO2020018142, WO2019222555, WO2019178428, WO2019178427 또는 WO2019006471에 개시되어 있는 뉴클레이스이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 유형 V CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 유형 V 뉴클레이스)를 포함한다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스는 Cas12 CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스는 Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j(CasPhi) CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스는 Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j(CasPhi) CRISPR 뉴클레이스의 변이체(예를 들어, 기능적 변이체)이다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스는 야생형 유형 V 뉴클레이스 서열(예를 들어, Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j(CasPhi)의 야생형 아미노산 서열)과 적어도 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 유형 V 뉴클레이스는 Cas12i CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas12i CRISPR 뉴클레이스는 서열번호 1과 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 Cas12i2 CRISPR 뉴클레이스이거나 또는 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 의해 암호화된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스는 야생형 CRISPR 뉴클레이스의 변이체이되, 야생형은 서열번호 1과 같은 뉴클레오타이드 서열을 포함하거나 또는 서열번호 2와 같은 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 의해 암호화된다. 표 1을 참조한다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 유형 II 뉴클레이스는 Cas9 CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas9 CRISPR 뉴클레이스는 서열번호 120과 같은 아미노산 서열을 포함하는 SpCas9 CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas9 CRISPR 뉴클레이스는 닉케이스, 예를 들어, 서열번호 121과 같은 아미노산 서열을 포함하는 nSpCas9이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스는 상이한 종의 Cas9 CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas9 CRISPR 뉴클레이스는 서열번호 122와 같은 아미노산 서열을 포함하는 SaCas9 CRISPR 뉴클레이스이다. 표 1을 참조한다.
본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레이스를 암호화하는 핵산 서열은 참조 핵산 서열, 예를 들어, 서열번호 1과 실질적으로 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 참조 핵산 서열, 예를 들어, 야생형 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, 서열번호 1과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.5%의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함하는 핵산에 의해 암호화된다. 이러한 두 핵산 사이의 동일성 퍼센트는 최적으로 정렬된 두 핵산 서열을 검사하거나 또는 표준 매개변수를 사용하는 소프트웨어 프로그램 또는 알고리즘(예를 들어, BLAST, ALIGN, CLUSTAL)을 사용하여 수동으로 결정될 수 있다. 두 핵산 서열이 실질적으로 동일하다는 한 가지 지표는 핵산 분자가 엄격한 조건하에서(예를 들어, 중간 내지 높은 엄격성의 범위 내에서) 다른 것의 상보적 서열에 혼성화된다는 것이다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 참조 핵산 서열, 예를 들어, CRISPR 뉴클레이스를 암호화하는 핵산 서열, 예를 들어, 서열번호 1과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 이상의 서열 동일성을 갖지만 100%의 서열 동일성을 갖는 것은 아닌 핵산 서열에 의해 암호화된다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스는 서열번호 2와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스는 서열번호 2와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99%를 초과하지만 100%는 아닌 동일성을 갖는 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 발명은 하나 이상의 참조 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 폴리펩타이드와 특정 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 2의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98% 또는 심지어 적어도 99% 그러나 100%는 아닌 서열 동일성을 갖는 CRISPR 뉴클레이스를 설명한다. 상동성 또는 동일성은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 BLAST, ALIGN 또는 CLUSTAL과 같은 프로그램을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 관련 개시내용이 본 명세서에 언급된 특허 대상 및 목적에 대해 참조에 의해 원용되어 있는 WO/2021/202800에 기술되어 이는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드는 WO/2021/202800의 표 2에 나열되어 있는 아미노산 치환 중 하나 이상을 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 PCT/US2021/025257의 서열번호 3의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 PCT/US2021/025257의 서열번호 4의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 PCT/US2021/025257의 서열번호 5의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 PCT/US2021/025257의 서열번호 495의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 PCT/US2021/025257의 서열번호 496의 아미노산 서열과 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 참조에 의해 원용되어 있는 WO/2021/202800의 서열번호 3 내지 146 및 495 내지 512 중 어느 하나와 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드이다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 Cas12i 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 Cas12i1 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, Cas12i1 폴리펩타이드는 변이형 Cas12i1 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 변이형 Cas12i1 폴리펩타이드는 서열번호 8과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 변이형 Cas12i1 폴리펩타이드는 서열번호 8과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 하나 이상의 참조 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 Casi1 폴리펩타이드와 특정 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 8의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 상동성 또는 동일성은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 BLAST, ALIGN 또는 CLUSTAL과 같은 프로그램을 사용하는 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변이형 Cas12i1 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 8과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas12i1 폴리펩타이드는 서열번호 8과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 효소적 활성, 예를 들어, 뉴클레이스 또는 엔도뉴클레이스 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 변이형 Cas12i1 폴리펩타이드는, 임의의 이전에 기재된 정렬 방법을 사용하여 정렬될 때, CRISPR 뉴클레이스 및 서열번호 8 중 어느 하나의 아미노산 서열과 100개, 95개, 90개, 85개, 80개, 75개, 70개, 65개, 60개, 55개, 50개, 40개, 35개, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기(들)만큼 다른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas12i 폴리펩타이드는 Cas12i3 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 Cas12i3 폴리펩타이드는 서열번호 11과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 Cas12i3 폴리펩타이드는 서열번호 11과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas12i3 폴리펩타이드는 변이형 Cas12i3 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas12i3 폴리펩타이드는 하나 이상의 참조 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 폴리펩타이드와 특정 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 11의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 상동성 또는 동일성은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 BLAST, ALIGN 또는 CLUSTAL과 같은 프로그램을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변이형 Cas12i3 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 11과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas12i3 폴리펩타이드는 서열번호 11과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 효소적 활성, 예를 들어, 뉴클레이스 또는 엔도뉴클레이스 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 변이형 Cas12i3 폴리펩타이드는, 임의의 이전에 기재된 정렬 방법을 사용하여 정렬될 때, CRISPR 뉴클레이스 및 서열번호 11 중 어느 하나의 아미노산 서열과 100개, 95개, 90개, 85개, 80개, 75개, 70개, 65개, 60개, 55개, 50개, 40개, 35개, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기(들)만큼 다른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas12i 폴리펩타이드는 Cas12i4 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 Cas12i4 폴리펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 Cas12i4 폴리펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas12i4 폴리펩타이드는 변이형 Cas12i4 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas12i4 폴리펩타이드는 하나 이상의 참조 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 폴리펩타이드와 특정 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 상동성 또는 동일성은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 BLAST, ALIGN 또는 CLUSTAL과 같은 프로그램을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변이형 Cas12i4 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas12i4 폴리펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10과 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 효소적 활성, 예를 들어, 뉴클레이스 또는 엔도뉴클레이스 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 변이형 Cas12i4 폴리펩타이드는, 임의의 이전에 기재된 정렬 방법을 사용하여 정렬될 때, CRISPR 뉴클레이스 및 서열번호 9 또는 서열번호 10 중 어느 하나의 아미노산 서열과 100개, 95개, 90개, 85개, 80개, 75개, 70개, 65개, 60개, 55개, 50개, 40개, 35개, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기(들)만큼 다른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 유형 II CRISPR 뉴클레이스, 예를 들어, Cas9개의 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, Cas9개의 뉴클레이스는 S. 피오게네스 또는 S. 아우레우스(S. aureus)로부터의 Cas9 또는 이의 변이체이다. 예를 들어, 전체가 참조에 의해 원용되어 있는 U.S. 20190136248을 참조한다. 일부 실시형태에서, Cas9 폴리펩타이드는 닉케이스이다.
일부 실시형태에서, 본 발명의 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 120 내지 122 중 어느 하나와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 120 내지 122 중 어느 하나와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 폴리펩타이드 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, Cas9 폴리펩타이드는 변이형 Cas9 폴리펩타이드이다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas9 폴리펩타이드는 하나 이상의 참조 폴리펩타이드, 예를 들어, 야생형 폴리펩타이드와 특정 정도의 아미노산 서열 동일성, 예를 들어, 서열번호 120 내지 122 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 60%, 적어도 65%, 적어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 91%, 적어도 92%, 적어도 93%, 적어도 94%, 적어도 95%, 적어도 96%, 적어도 97%, 적어도 98%, 적어도 99% 또는 100%의 서열 동일성을 갖는다. 상동성 또는 동일성은, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같이 BLAST, ALIGN 또는 CLUSTAL과 같은 프로그램을 사용하여 아미노산 서열 정렬에 의해 결정될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 변이형 Cas9 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 서열번호 120 내지 122 중 어느 하나와 적어도 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 암호화한다. 일부 실시형태에서, 변이형 Cas9 폴리펩타이드는 서열번호 120 내지 122 중 어느 하나와 50%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 초과의 동일성을 갖는 서열을 갖는다.
일부 실시형태에서, 효소적 활성, 예를 들어, 뉴클레이스 또는 엔도뉴클레이스 활성을 갖는 본 명세서에 기재된 변이형 Cas9 폴리펩타이드는, 임의의 이전에 기재된 정렬 방법을 사용하여 정렬될 때, CRISPR 뉴클레이스 및 서열번호 120 또는 서열번호 121 중 어느 하나의 아미노산 서열과 100개, 95개, 90개, 85개, 80개, 75개, 70개, 65개, 60개, 55개, 50개, 40개, 35개, 30개, 25개, 20개, 19개, 18개, 17개, 16개, 15개, 14개, 13개, 12개, 11개, 10개, 9개, 8개, 7개, 6개, 5개, 4개, 3개, 2개 또는 1개의 아미노산 잔기(들)만큼 다른 아미노산 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스 또는 유형 II 뉴클레이스)는 야생형 폴리펩타이드의 하나 이상(예를 들어, 여러 개)의 아미노산에 변경을 포함하되, 적어도 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개, 51개, 52개, 53개, 54개, 55개, 56개, 57개, 58개, 59개, 60개, 61개, 62개, 63개, 64개, 65개, 66개, 67개, 68개, 69개, 70개, 71개, 72개, 73개, 74개, 75개, 76개, 77개, 78개, 79개, 80개, 81개, 82개, 83개, 84개, 85개, 86개, 87개, 88개, 89개, 90개, 91개, 92개, 93개, 94개, 95개, 96개, 97개, 98개, 99개, 100개, 101개, 102개, 103개, 104개, 105개, 106개, 107개, 108개, 109개, 110개, 111개, 112개, 113개, 114개, 115개, 116개, 117개, 118개, 119개, 120개, 121개, 122개, 123개, 124개, 125개, 126개, 127개, 128개, 129개, 130개, 131개, 132개, 133개, 134개, 135개, 136개, 137개, 138개, 139개, 140개, 141개, 142개, 143개, 144개, 145개, 146개, 147개, 148개, 149개, 150개, 151개, 152개, 153개, 154개, 155개, 156개, 157개, 158개, 159개, 160개, 161개, 162개, 162개, 164개, 164개, 165개, 166개, 167개, 168개, 169개, 170개, 171개, 172개, 173개, 174개, 175개, 176개, 177개, 178개, 179개, 180개, 181개, 182개, 183개, 184개, 185개, 186개, 187개, 188개, 189개, 190개, 191개, 193개, 194개, 195개, 196개, 197개, 198개, 199개, 200개 이상이 변경된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 CRISPR 뉴클레이스는 crRNA 처리 활성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 유형 V 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드)는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있는 변이체이다. 예를 들어, 유형 V 뉴클레이스가 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드인 일부 실시형태에서, 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드는 H485 또는 H486 치환을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성(예를 들어, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100%)을 갖는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드는 H485 또는 H486 돌연변이를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, H485 또는 H486 돌연변이를 포함하는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드는 감소된 crRNA 처리 활성을 포함하거나 또는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레이스를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열은 특정 숙주 세포 또는 유기체에서 사용하기 위해 코돈-최적화될 수 있다. 예를 들어, 핵산은 마우스, 래트, 토끼, 개, 가축 또는 비인간 영장류를 포함하는 임의의 비인간 진핵생물에 대해 코돈-최적화될 수 있다. 코돈 사용 표는, 예를 들어, www.kazusa.orjp/codon/에서 입수 가능한 "코돈 사용 데이터베이스"에서 쉽게 이용할 수 있으며, 이러한 표는 다양한 방식으로 적합화될 수 있다. 전체가 참조에 의해 본 명세서에 원용되어 있는 문헌[Nakamura et al. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)]을 참조한다. Gene Forge(Aptagen; 펜실베니아주 자코부스 소재)와 같은 특정 숙주 세포에서의 발현을 위해 특정 서열을 최적화하는 코돈을 위한 컴퓨터 알고리즘도 이용 가능하다.
본 명세서에 기재된 변화는 하나 이상의 아미노산 변화일 수 있지만, CRISPR 뉴클레이스에 대한 변화는 또한 아미노- 및/또는 카복실-말단 연장으로서 폴리펩타이드의 융합과 같은 구조적 또는 실질적인 특성일 수 있다. 예를 들어, CRISPR 뉴클레이스는 추가적인 펩타이드, 예를 들어, 하나 이상의 펩타이드를 포함할 수 있다. 추가적인 펩타이드의 예는 폴리히스티딘 태그(His-태그), Myc 및 FLAG와 같은 표지를 위한 에피토프 펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레이스는 형광 단백질(예를 들어, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein: GFP) 또는 황색 형광 단백질(yellow fluorescent protein: YFP))과 같은 검출 가능한 모이어티에 융합될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 CRISPR 뉴클레이스는 적어도 1개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상)의 핵 국재화 신호(nuclear localization signal: NLS)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 적어도 1개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상)의 핵외 수송 신호(nuclear export signal: NES)를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 적어도 1개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상)의 NLS 및 적어도 1개(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개 이상)의 NES를 포함한다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 적어도 RuvC 도메인을 포함하지만, 전체 CRISPR 뉴클레이스보다 적다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 야생형 CRISPR 뉴클레이스에 대해 절단된 CRISPR 뉴클레이스이다. 일부 실시형태에서, 절단된 CRISPR 뉴클레이스는 RuvC 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 전체 CRISPR 뉴클레이스의 적어도 하나의 기능적 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 적어도 2개의 RuvC 도메인 또는 적어도 2개의 RuvC 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 적어도 3개의 RuvC 도메인 또는 적어도 3개의 RuvC 모티프를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 적어도 하나의 촉매 활성이 없는(catalytically dead) RuvC 도메인 및 적어도 하나의 촉매적으로 활성인 RuvC 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 하나 이상의 유형 V 또는 유형 II 뉴클레이스로부터의 2개의 RuvC 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 적어도 RuvC 도메인 및 이량체화 도메인을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 CRISPR 뉴클레이스는 폴리머레이스에 융합된다. 일부 실시형태에서, 이전 실시형태 중 어느 하나에 기재된 바와 같은 CRISPR 뉴클레이스는 역전사효소 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 N-말단 역전사효소 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 C-말단 역전사효소 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 CRISPR 뉴클레이스 내의 분자내 위치에 역전사효소 폴리펩타이드를 포함한다(예를 들어, 역전사효소는 CRISPR 뉴클레이스의 루프 내에 있음).
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 CRISPR 뉴클레이스는 역전사효소 폴리펩타이드와 (예를 들어, 정전기적 상호작용을 통해) 상호작용한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스는 이량체화 도메인을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "이량체화 도메인"은 별도의 양립 가능한 폴리펩타이드 도메인(예를 들어, 제2 양립 가능한 이량체화 도메인)에 특이적으로 결합할 수 있는 폴리펩타이드 도메인을 지칭한다. 일부 실시형태에서, 이량체는 제1 이량체화 도메인과 제2 양립 가능한 이량체화 도메인 사이의 비공유 결합에 의해 형성된다. 일부 실시형태에서, 이량체화 도메인은 류신 지퍼, 나노바디 또는 항체이다. 일부 실시형태에서, 이량체화 도메인은 역전사효소 폴리펩타이드를 동원한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소 폴리펩타이드는 이중 코일 펩타이드(coiled-coil) 이종이량체를 통해 상호작용한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 CRISPR 뉴클레이스는 라이게이스(ligase), 인테그레이스(integrase) 및/또는 리콤비네이스(recombinase)와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 CRISPR 뉴클레이스는 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스에 융합된다. 일부 실시형태에서, 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스는 CRISPR 뉴클레이스의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스는 CRISPR 뉴클레이스에 내부적으로 융합된다. 일부 실시형태에서, 인테그레이스는 세린 인테그레이스이다. 일부 실시형태에서, 인테그레이스는 Bxb1, TP901 또는 PhiBT1 인테그레이스이다. 일부 실시형태에서, 리콤비네이스는 세린 리콤비네이스 또는 타이로신 리콤비네이스이다. 일부 실시형태에서, 리콤비네이스는 CRE 리콤비네이스이다. 일부 실시형태에서, 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스와 상호작용하거나 또는 이에 융합된 CRISPR 뉴클레이스는 추가로 역전사효소와 상호작용하거나 또는 이에 융합된다.
B. 역전사효소
다양한 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 조성물은 CRISPR 뉴클레이스에 대한 융합체로서 제공될 수 있는 폴리머레이스(예를 들어, DNA-의존적 DNA 폴리머레이스 또는 RNA-의존적 DNA 폴리머레이스) 또는 이들의 변이체를 포함한다. 폴리머레이스는 야생형 폴리머레이스, 기능적 단편, 변이체, 절단된 변이체 등일 수 있다. 폴리머레이스는 진핵생물, 원핵생물, 고세균 또는 바이러스 유기체로부터의 야생형 폴리머레이스를 포함할 수 있고/있거나 폴리머레이스는 유전 공학, 돌연변이 유발, 유도 진화-기반 과정에 의해 변형될 수 있다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 것들(예를 들어, 표 7 및 표 17에 나타낸 것들)과 같은 임의의 CRISPR 뉴클레이스-RT 융합 폴리펩타이드, 이들의 암호화 핵산, 이를 포함하는 벡터, 이를 제조하는 방법도 본 개시내용의 범위 내에 있다.
일부 실시형태에서, 폴리머레이스는 역전사효소이다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 임의의 자연 발생적 유기체 또는 바이러스로부터 얻거나 또는 상업적 또는 비상업적 공급원으로부터 얻은 임의의 야생형 역전사효소이다. 역전사효소 폴리펩타이드도 변이형 역전사효소 폴리펩타이드일 수 있다.
역전사효소 폴리펩타이드는 다수의 다양한 공급원으로부터 얻을 수 있다. 예를 들어, 유전자는 레트로바이러스에 감염된 진핵생물 세포로부터 또는 전체 레트로바이러스 게놈의 일부 또는 전체를 포함하는 플라스미드로부터 얻을 수 있다. 또한, 역전사효소 유전자를 포함하는 RNA는 레트로바이러스로부터 얻을 수 있다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 개별 성분으로 발현되거나 또는 그렇지 않으면 이로 제공되며, 즉, 이는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i) 폴리펩타이드와의 융합체 단백질이 아니다.
당업자는 라우스 육종 바이러스(Rous Sarcoma Virus: RSV) 역전사효소, 조류 골수아세포 백혈증 바이러스(Avian Myeloblastosis Virus: AMV) 역전사효소, 조류 적아세포증 바이러스(Avian Erythroblastosis Virus: AEV) 헬퍼 바이러스 MCAV 역전사효소, 조류 골수세포증 바이러스 MC29 헬퍼 바이러스 MCAV 역전사효소, 조류 세망내피증 바이러스(Reticuloendotheliosis Virus: REV-T) 헬퍼 바이러스 REV-A 역전사효소, 조류 육종 바이러스 UR2 헬퍼 바이러스 UR2AV 역전사효소, 조류 육종 바이러스 Y73 헬퍼 바이러스 YAV 역전사효소, 라우스 관련 바이러스(Rous Associated Virus: RAV) 역전사효소 및 골수아세포 백혈증 관련 바이러스(Myeloblastosis Associated Virus: MAV) 역전사효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus: MMLV) 역전사효소, 인간 면역결핍 바이러스(Human Immunodeficiency Virus: HIV) 역전사효소 및 조류 육종-백혈증 바이러스(avian Sarcoma-Leukosis Virus: ASLV) 역전사효소를 포함하지만 이에 제한되지 않는 역전사효소가 당업계에 공지되어 있으며 본 명세서에 기재된 조성물에 적합하게 사용될 수 있음을 인식할 것이다.
일부 실시형태에서, 역전사효소는 에우박테리움 렉탈레(Eubacterium rectale)로부터의 MMLV-RT, MarathonRT, 또는 RTX 역전사효소, 또는 MMLV-RT, MarathonRT 또는 RTX 역전사효소의 변이체이다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 표 2에 나타낸 서열, 이들의 변이체 또는 이들의 오쏘로그이다.
일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 CRISPR 뉴클레이스에 융합된다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 N-말단 CRISPR 뉴클레이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 C-말단 CRISPR 뉴클레이스를 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 역전사효소 폴리펩타이드(예를 들어, CRISPR 뉴클레이스) 내의 분자내 위치에 있고 역전사효소 폴리펩타이드의 루프 내에 있는 CRISPR 뉴클레이스를 포함한다.
일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 이량체화 도메인을 포함한다. 일부 실시형태에서, 이량체화 도메인은 류신 지퍼, 나노바디 또는 항체이다. 일부 실시형태에서, 이량체화 도메인은 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)를 동원한다.
일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 "오류 유발성(error-prone)" 역전사효소 변이체이다. 당업계에 공지되어 있고/있거나 이용 가능한 오류 유발성 역전사효소가 사용될 수 있다. 역전사효소는 자연적으로 임의의 교정 기능을 갖지 않는다는 것을 알 것이며; 따라서, 역전사효소의 오류율은 일반적으로 교정 활성을 포함하는 DNA 폴리머레이스보다 높다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 합성된 약 15,000개의 뉴클레오타이드에서 오류율이 1 미만인 경우 "오류 유발성"인 것으로 간주된다.
일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 RNase H 도메인에 돌연변이 또는 돌연변이들을 갖는다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 RNase H 도메인을 포함하지 않는다(예를 들어, RNase H 도메인은 역전사효소 폴리펩타이드로부터 제거되었음). 일부 실시형태에서, RNase H 도메인은 역전사효소 폴리펩타이드에서 절단된다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 RNA-의존적 DNA 폴리머레이스 도메인에 돌연변이 또는 돌연변이들을 갖는다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 내열성 특성이 변경된 변이체이다. 고온을 견디는 역전사효소의 능력은 cDNA 합성의 중요한 양태이다. 반응 온도가 상승하면 강력한 2차 구조 및/또는 높은 GC 함량을 갖는 RNA를 변성시키는 데 도움이 되어 역전사효소가 서열을 판독할 수 있게 한다. 결과적으로, 더 높은 온도에서 역전사를 수행하면 전장 cDNA 합성 및 더 높은 수율이 가능해진다. 야생형 M-MLV 역전사효소는 전형적으로 37℃ 내지 48℃ 범위의 최적 온도를 갖지만; 49℃, 50℃, 51℃, 52℃, 53℃, 54℃, 55℃, 56℃, 57℃, 58℃, 59℃, 60℃, 61℃, 62℃, 63℃, 64℃, 65℃, 66℃ 이상을 포함하여 48℃보다 더 높은 온도에서 역전사 활성을 허용하는 돌연변이가 도입될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 변이형 역전사효소 폴리펩타이드는 임의의 야생형 역전사효소, 돌연변이 역전사효소, 또는 역전사효소의 단편 또는 본 명세서에 개시 또는 상정되거나 또는 당업계에 공지된 다른 역전사효소 변이체를 포함하는 임의의 참조 역전사효소 폴리펩타이드와 적어도 약 20% 동일, 적어도 약 25% 동일, 적어도 약 30% 동일, 적어도 약 35% 동일, 적어도 약 40% 동일, 적어도 약 45% 동일, 적어도 약 50% 동일, 적어도 약 55% 동일, 적어도 약 60% 동일, 적어도 약 65% 동일, 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 75% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 85% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 적어도 약 96% 동일, 적어도 약 97% 동일, 적어도 약 98% 동일, 적어도 약 99% 동일, 적어도 약 99.5% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일할 수 있다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 변이체는 참조 역전사효소와 비교하여 1개, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 21개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개, 50개 또는 최대 100개, 또는 최대 200개, 또는 최대 300개, 또는 최대 400개 또는 최대 500개 이상의 아미노산 변화를 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 변이체는 참조 역전사효소의 단편을 포함하며, 단편은 참조 역전사효소의 상응하는 단편과 적어도 약 20% 동일, 적어도 약 25% 동일, 적어도 약 30% 동일, 적어도 약 35% 동일, 적어도 약 40% 동일, 적어도 약 45% 동일, 적어도 약 50% 동일, 적어도 약 55% 동일, 적어도 약 60% 동일, 적어도 약 65% 동일, 적어도 약 70% 동일, 적어도 약 75% 동일, 적어도 약 80% 동일, 적어도 약 85% 동일, 적어도 약 90% 동일, 적어도 약 95% 동일, 적어도 약 96% 동일, 적어도 약 97% 동일, 적어도 약 98% 동일, 적어도 약 99% 동일, 적어도 약 99.5% 동일하거나 또는 적어도 약 99.9% 동일하다.
오류 유발성 역전사효소, 내열성 역전사효소 및 진행성이 증가된 역전사효소를 비롯한 변이형 역전사효소는 돌연변이 유발 또는 진화적 절차를 비롯한 다양한 일상적인 전략에 의해 조작될 수 있다. 일부 경우에, 변이체는 단일 돌연변이를 도입함으로써 생산될 수 있다. 다른 경우에, 변이체는 하나 초과의 돌연변이가 필요할 수 있다. 하나 초과의 돌연변이를 포함하는 돌연변이의 경우, 특정 돌연변이에 의해 발생하는 다른 돌연변이와 분리하여 부위-지정 돌연변이 유발에 의해 확인된 돌연변이를 야생형 유전자에 도입함으로써 주어진 돌연변이의 효과가 평가될 수 있다. 그런 다음, 이렇게 생성된 단일 돌연변이의 스크리닝 검정은 해당 돌연변이만의 효과를 결정할 수 있을 것이다.
일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 역전사효소의 연장률 및/또는 효율을 개선하기 위해 도메인을 포함하거나 또는 이에 융합된다. 일부 실시형태에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 술폴로부스 솔파타리쿠스(Sulfolobus solfataricus)로부터의 Sso7d 폴리펩타이드와 같은 Sso7d 폴리펩타이드에 융합된다. 예를 들어, 문헌[Wang et al., Nucleic Acids Res. 32(3): 1197-207 (2004)]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드는 편집 주형 RNA의 적어도 하나의 뉴클레이스 결합 서열에 결합할 수 있으며 이에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드는 편집 주형 RNA의 적어도 하나의 DNA-결합 서열을 통해 표적 서열에 결합할 수 있으며 이에 결합한다. 이러한 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드는 편집 주형 RNA의 뉴클레이스 결합 서열과 DNA-결합 서열을 통한 CRISPR 뉴클레이스의 결합을 통해 표적 서열에 동원되거나 또는 이에 근접하게 된다.
일부 실시형태에서, 역전사효소는 역전사 주형 서열을 PBS의 5' 말단에서 시작하여 표적 핵산의 비-PAM 가닥으로 전사한다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 역전사 주형 서열을 PBS의 3' 말단에서 시작하여 표적 핵산의 비-PAM 가닥으로 전사한다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 역전사 주형 서열을 PBS의 5' 말단에서 시작하여 표적 핵산의 PAM 가닥으로 전사한다. 일부 실시형태에서, 역전사효소는 역전사 주형 서열을 PBS의 3' 말단에서 시작하여 표적 핵산의 PAM 가닥으로 전사한다. 일부 실시형태에서, PBS의 표적 핵산의 비-PAM 가닥으로의 결합 후, 역전사효소는 역전사 주형 서열을 비-PAM 가닥의 자유 3' 말단에서 전사한다. 일부 실시형태에서, PBS의 표적 핵산의 PAM 가닥으로의 혼성화 후, 역전사효소는 역전사 주형 서열을 PAM 가닥의 자유 3' 말단에서 전사한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 역전사효소는 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스와 상호작용한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 실시형태 중 어느 하나에서와 같은 역전사효소는 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스에 융합된다. 일부 실시형태에서, 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스는 역전사효소의 N-말단 또는 C-말단에 융합된다. 일부 실시형태에서, 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스는 역전사효소에 내부적으로 융합된다. 일부 실시형태에서, 인테그레이스는 세린 인테그레이스이다. 일부 실시형태에서, 인테그레이스는 Bxb1, TP901 또는 PhiBT1 인테그레이스이다. 일부 실시형태에서, 리콤비네이스는 세린 리콤비네이스 또는 타이로신 리콤비네이스이다. 일부 실시형태에서, 리콤비네이스는 CRE 리콤비네이스이다. 일부 실시형태에서, 라이게이스, 인테그레이스 및/또는 리콤비네이스와 상호작용하거나 또는 이에 융합된 역전사효소는 추가로 CRISPR 뉴클레이스와 상호작용하거나 또는 이에 융합된다.
C. 유전자 편집 RNA 분자
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템은 RNA 가이드 및 RNA 역전사효소(RT) 공여체(RT 공여체 RNA)를 포함하는 편집 주형 RNA(들)(유전자 편집 RNA)를 포함할 수 있다. 편집 주형 RNA(들)는 목적하는 게놈 부위와 같은 표적 핵산의 서열을 편집하는 데 도움을 준다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 RNA 가이드(예를 들어, 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열 포함)와 RT 공여체 RNA 모두를 포함하는 단일 RNA 분자일 수 있다. 다른 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 개별 RNA 분자로서 포함한다.
일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA 또는 이의 임의의 부분은 벡터에 암호화된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 Pol II 프로모터 또는 Pol III 프로모터를 포함한다.
i. RNA 가이드
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템에서, 편집 주형 RNA는 유전자 편집 시스템에도 포함된 CRISPR 뉴클레이스를 통해 표적 핵산의 절단을 매개하는 RNA 가이드를 포함한다. RNA 가이드(또는 gRNA)는 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열(스페이서)을 포함한다. 뉴클레이스 결합 서열은 결합을 위해 CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식될 수 있는 하나 이상의 결합 부위를 포함할 수 있다. 일부 경우에, gRNA는 뉴클레이스 결합 서열과 스페이서 서열을 모두 포함하는 단일 RNA 분자이다. 대안적으로, gRNA는 뉴클레이스 결합 서열 및 스페이서를 2개의 개별 RNA 분자로서 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA 가이드는 RNA 가이드의 5' 말단, RNA 가이드의 3' 말단 또는 RNA 가이드 내의 분자내 위치에 RNA 연장부를 포함한다. 다양한 실시형태에서, RNA 연장부는 적어도 5개의 뉴클레오타이드, 적어도 6개의 뉴클레오타이드, 적어도 7개의 뉴클레오타이드, 적어도 8개의 뉴클레오타이드, 적어도 9개의 뉴클레오타이드, 적어도 10개의 뉴클레오타이드, 적어도 11개의 뉴클레오타이드, 적어도 12개의 뉴클레오타이드, 적어도 13개의 뉴클레오타이드, 적어도 14개의 뉴클레오타이드, 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 16개의 뉴클레오타이드, 적어도 17개의 뉴클레오타이드, 적어도 18개의 뉴클레오타이드, 적어도 19개의 뉴클레오타이드, 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 21개의 뉴클레오타이드, 적어도 22개의 뉴클레오타이드, 적어도 23개의 뉴클레오타이드, 적어도 24개의 뉴클레오타이드, 적어도 25개의 뉴클레오타이드, 적어도 26개의 뉴클레오타이드, 적어도 27개의 뉴클레오타이드, 적어도 28개의 뉴클레오타이드, 적어도 29개의 뉴클레오타이드, 적어도 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 31개의 뉴클레오타이드, 적어도 32개의 뉴클레오타이드, 적어도 33개의 뉴클레오타이드, 적어도 34개의 뉴클레오타이드, 적어도 35개의 뉴클레오타이드, 적어도 36개의 뉴클레오타이드, 적어도 37개의 뉴클레오타이드, 적어도 38개의 뉴클레오타이드, 적어도 39개의 뉴클레오타이드, 적어도 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 41개의 뉴클레오타이드, 적어도 42개의 뉴클레오타이드, 적어도 43개의 뉴클레오타이드, 적어도 44개의 뉴클레오타이드, 적어도 45개의 뉴클레오타이드, 적어도 46개의 뉴클레오타이드, 적어도 47개의 뉴클레오타이드, 적어도 48개의 뉴클레오타이드, 적어도 49개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 50개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, RNA 연장부는 역전사 공여체 RNA("RT 공여체 RNA")이다(예를 들어, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA에 융합됨). 일부 실시형태에서, RT 공여체 RNA는 본 명세서에 기재된 바와 같은 프라이머 결합 부위(PBS) 및 역전사 주형 서열을 포함한다.
뉴클레이스 결합 서열
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물은 뉴클레이스 결합 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열이다(예를 들어, 뉴클레이스 결합 서열은 유형 V 뉴클레이스 또는 유형 II 뉴클레이스에 결합할 수 있음). 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 추가의 핵산 결합 서열(예를 들어, DNA 결합 서열)이다.
일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 RNA 가이드를 포함한다. RNA 가이드는 특이적 결합 친화도로 본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 유형 V 뉴클레이스 또는 유형 II 뉴클레이스) 중 어느 하나에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 표적 서열에 대한 특이적 결합 친화도를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 조성물은 2개 이상(예를 들어, 2개, 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개 이상)의 RNA 가이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 벡터에 암호화된다. 일부 실시형태에서, 벡터는 Pol II 프로모터 또는 Pol III 프로모터를 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 직접 반복 서열을 포함한다. 소정의 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 DNA-결합 서열(예를 들어, DNA-표적화 서열 또는 스페이서)에 연결된 직접 반복 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 직접 반복 서열 및 DNA-결합 서열 또는 직접 반복- DNA-결합 서열 -직접 반복 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열은 절단된 직접 반복 서열 및 처리된 또는 성숙 crRNA의 전형적인 DNA-결합 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 뉴클레이스 결합 서열(예를 들어, 직접 반복 서열)은 Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j(CasPhi) 폴리펩타이드에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 직접 반복 서열은 Cas9 폴리펩타이드에 결합할 수 있다.
뉴클레이스 결합 서열이 공개적으로 이용 가능한 CRISPR 뉴클레이스에 대한 직접 반복인 실시형태에서, 이러한 직접 반복 서열은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스에 결합할 수 있는 직접 반복 서열은 관련 개시내용이 본 명세서에 언급된 특허 대상 및 목적에 대해 참조에 의해 원용되어 있는 WO2021055874, WO2020206036, WO2020191102, WO2020186213, WO2020028555, WO2020033601, WO2019126762, WO2019126774, WO2019071048, WO2019018423, WO2019005866, WO2018191388, WO2018170333, WO2018035388, WO2018035387, WO2017219027, WO2017189308, WO2017184768, WO2017106657, WO2016205749, WO2017070605, WO2016205764, WO2016205711, WO2016028682, WO2015089473, WO2014093595, WO2015089427, WO2014204725, WO2015070083, WO2014093655, WO2014093694, WO2014093712, WO2014093635, WO2021133829, WO2021007177, WO2020197934, WO2020181102, WO2020181101, WO2020041456, WO2020023529, WO2020005980, WO2019104058, WO2019089820, WO2019089808, WO2019089804, WO2019089796, WO2019036185, WO2018226855, WO2018213351, WO2018089664, WO2018064371, WO2018064352, WO2017106569, WO2017048969, WO2016196655, WO2016106239, WO2016036754, WO2015103153, WO2015089277, WO2014150624, WO2013176772, WO2021119563, WO2021118626, WO2020247883, WO2020247882, WO2020223634, WO2020142754, WO2020086475, WO2020028729, WO2019241452, WO2019173248, WO2018236548, WO2018183403, WO2017027423, WO2018106727, WO2018071672, WO2017096328, WO2017070598, WO2016201155, WO2014150624, WO2013098244, WO2021113522, WO2021050534, WO2021046442, WO2021041569, WO2021007563, WO2020252378, WO2020180699, WO2020018142, WO2019222555, WO2019178428, WO2019178427 또는 WO2019006471에 개시되어 있는 임의의 것들이다.
CRISPR 뉴클레이스가 Cas12i 폴리펩타이드인 일부 실시형태에서, 직접 반복 서열은 서열번호 12 내지 24 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 포함한다. CRISPR 뉴클레이스가 Cas12i 폴리펩타이드인 일부 실시형태에서, 직접 반복 서열은 서열번호 12 내지 24 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 포함한다. CRISPR 뉴클레이스가 Cas12i 폴리펩타이드인 일부 실시형태에서, 직접 반복 서열은 서열번호 12 내지 24 중 어느 하나를 포함한다. 일부 실시형태에서, 직접 반복 서열은 서열번호 12 내지 24 중 어느 하나의 일부를 포함한다.
다른 유형 V CRISPR 뉴클레이스와 같은 다른 CRISPR 뉴클레이스에 대한 뉴클레이스 결합 서열은 당업계에 공지되어 있고/있거나 아래 표 4 내지 표 6에 제공되어 있다.
DNA-결합 서열
RNA 가이드는 또한 DNA-결합 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 DNA-표적화 서열(예를 들어, 스페이서)이다. 스페이서는 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 80개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 또는 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 19개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다. 예를 들어, 스페이서는 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 35개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 45개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 70개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 80개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 90개의 뉴클레오타이드, 약 7개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 35개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 40개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 45개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 60개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 70개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 80개의 뉴클레오타이드, 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 90개의 뉴클레오타이드 또는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이를 가질 수 있다.
일부 실시형태에서, RNA 가이드의 스페이서는 일반적으로 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 또는 15개 내지 35개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개, 24개, 25개, 26개, 27개, 28개, 29개, 30개, 31개, 32개, 33개, 34개, 35개, 36개, 37개, 38개, 39개, 40개, 41개, 42개, 43개, 44개, 45개, 46개, 47개, 48개, 49개 또는 50개의 뉴클레오타이드) 길이를 갖고 특정 표적 서열과 상보적이도록 설계될 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 18개 내지 22개의 뉴클레오타이드 길이를 갖도록 설계될 수 있다.
일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 표적 서열과 적어도 약 60%, 적어도 약 65%, 적어도 약 70%, 적어도 약 75%, 적어도 약 80%, 적어도 약 85%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 적어도 약 99% 또는 적어도 약 99.5%의 서열 동일성을 가지며, 염기-페어링을 통해 표적 서열의 상보적 영역에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 RNA 염기만을 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 DNA 염기를 포함한다(예를 들어, 스페이서는 적어도 하나의 티민을 포함함). 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 RNA 염기 및 DNA 염기를 포함한다(예를 들어, DNA-결합 서열은 적어도 하나의 티민 및 적어도 하나의 우라실을 포함함).
일부 경우에, 본 명세서에 개시된 RNA 가이드는 링커 서열, 5' 말단 및/또는 3' 말단 보호 단편(본 명세서의 개시내용 참조) 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에 개시된 임의의 RNA 가이드의 스페이서는 표적 서열에 특이적일 수 있으며, 즉, 염기-페어링을 통해 표적 서열의 상보적 영역에 결합할 수 있다. 일부 경우에, 표적 서열은, 예를 들어, 유전자 편집이 필요한 관심 게놈 부위 내에 있을 수 있다.
일부 실시형태에서, 표적 서열은 PAM 서열에 인접해 있다. PAM 서열은 당업계에 공지되어 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식될 수 있는 PAM 서열은 각각의 관련 개시내용이 본 명세서에 언급된 특허 대상 및 목적을 위해 원용되어 있는 WO2021055874, WO2020206036, WO2020191102, WO2020186213, WO2020028555, WO2020033601, WO2019126762, WO2019126774, WO2019071048, WO2019018423, WO2019005866, WO2018191388, WO2018170333, WO2018035388, WO2018035387, WO2017219027, WO2017189308, WO2017184768, WO2017106657, WO2016205749, WO2017070605, WO2016205764, WO2016205711, WO2016028682, WO2015089473, WO2014093595, WO2015089427, WO2014204725, WO2015070083, WO2014093655, WO2014093694, WO2014093712, WO2014093635, WO2021133829, WO2021007177, WO2020197934, WO2020181102, WO2020181101, WO2020041456, WO2020023529, WO2020005980, WO2019104058, WO2019089820, WO2019089808, WO2019089804, WO2019089796, WO2019036185, WO2018226855, WO2018213351, WO2018089664, WO2018064371, WO2018064352, WO2017106569, WO2017048969, WO2016196655, WO2016106239, WO2016036754, WO2015103153, WO2015089277, WO2014150624, WO2013176772, WO2021119563, WO2021118626, WO2020247883, WO2020247882, WO2020223634, WO2020142754, WO2020086475, WO2020028729, WO2019241452, WO2019173248, WO2018236548, WO2018183403, WO2017027423, WO2018106727, WO2018071672, WO2017096328, WO2017070598, WO2016201155, WO2014150624, WO2013098244, WO2021113522, WO2021050534, WO2021046442, WO2021041569, WO2021007563, WO2020252378, WO2020180699, WO2020018142, WO2019222555, WO2019178428, WO2019178427 또는 WO2019006471에 개시되어 있다.
유전자 편집 시스템이 Cas12i 폴리펩타이드를 포함하는 경우, PAM 서열은 5'-NTTN-3'(또는 5'-TTN-3')를 포함하되, N은 임의의 뉴클레오타이드(예를 들어, A, G, T 또는 C)이다. PAM 서열은 표적 서열의 상류에 있다. 다른 CRISPR 뉴클레이스와 회합된 PAM 서열은 서열 5'-TTY-3' 또는 5'-TTB-3'을 포함할 수 있되, Y는 C 또는 T이고, B는 G, T 또는 C이다. PAM 서열은 표적 서열에 바로 인접할 수 있거나, 예를 들어, 표적 서열의 소수(예를 들어, 1개, 2개, 3개, 4개 또는 5개)의 뉴클레오타이드 내에 있을 수 있다.
아래 표 4 내지 표 6은 당업계에 공지된 예시적인 유형 V CRISPR 뉴클레이스 및 이의 상응하는 뉴클레이스 결합 서열 및 PAM 서열을 제공한다. 이러한 서열을 통해 당업자는 또 다른 유형 V CRISPR 뉴클레이스를 사용하여 본 명세서에 기재된 바와 같은 편집 주형 RNA를 설계할 수 있다.
관련 개시내용이 본 명세서에 언급된 특허 대상 및 목적에 대해 참조에 의해 원용되어 있는 문헌[Zetsche et al., Cell 163:759-771 (2015)]을 참조한다.
아래 표 6은 당업계에 공지된 추가적인 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 대한 정보를 제공한다.
ii. RNA 역전사효소 공여체 또는 RT 공여체 RNA
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템의 편집 주형 RNA는 또한 RNA 역전사효소(RT) 공여체(RT 공여체 RNA)를 포함할 수 있다. RT 공여체 RNA는 (i) 프라이머 결합 부위(PBS) 및 (ii) 역전사 주형 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, RT 공여체 RNA는 (iii) 뉴클레오타이드 링커 서열, (iv) 5' 말단 및/또는 3' 말단 보호 단편(본 명세서의 개시내용 참조) 또는 이들의 조합을 추가로 포함할 수 있다.　일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 하나 이상의 RT 공여체 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 하나 이상의 PBS, 하나 이상의 역전사 주형 서열 및/또는 하나 이상의 뉴클레오타이드 링커 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 편집 주형 RNA는 하나 이상의 PBS를 포함하고, 제2 편집 주형 RNA는 하나 이상의 역전사 주형 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RT 공여체 RNA는 압타머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 압타머는 역전사효소 폴리펩타이드를 동원한다.
프라이머 결합 부위(PBS)
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 RT 공여체 RNA의 PBS는 염기-페어링을 통해 DNA 가닥에 결합할 수 있는 RNA 서열이다. DNA 가닥은 CRISPR 뉴클레이스에 의해 닉을 형성할 수 있거나 또는 절단될 수 있다. 일부 실시형태에서, PBS는 염기-페어링을 통해 DNA 가닥(PBS-표적화 부위)에 결합할 수 있는 RNA 서열을 포함한다. DNA 가닥은 자유 3' 자유 말단을 가질 수 있거나 또는 3' 자유 말단은 동일한 유전자 편집 시스템에 포함된 CRISPR 뉴클레이스에 의한 절단을 통해 생성될 수 있다. 일부 예에서, PBS-표적화 부위는 PAM 서열과 동일한 DNA 가닥(PAM 가닥)에 위치할 수 있다. 일부 예에서, PBS-표적화 부위는 PAM 가닥의 상보적 가닥(비-PAM 가닥)에 위치할 수 있다.
일부 실시형태에서, PBS는 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 5개의 뉴클레오타이드, 적어도 6개의 뉴클레오타이드, 적어도 7개의 뉴클레오타이드, 적어도 8개의 뉴클레오타이드, 적어도 9개의 뉴클레오타이드, 적어도 10개의 뉴클레오타이드, 적어도 11개의 뉴클레오타이드, 적어도 12개의 뉴클레오타이드, 적어도 13개의 뉴클레오타이드, 적어도 14개의 뉴클레오타이드, 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 16개의 뉴클레오타이드, 적어도 17개의 뉴클레오타이드, 적어도 18개의 뉴클레오타이드, 적어도 19개의 뉴클레오타이드, 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 70개의 뉴클레오타이드, 적어도 80개의 뉴클레오타이드, 적어도 90개의 뉴클레오타이드, 적어도 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 300개의 뉴클레오타이드, 적어도 400개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 약 3개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 8개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 13개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드 또는 그 사이의 임의의 길이)이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이(예를 들어, 약 3개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 8개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드, 13개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 또는 100개의 뉴클레오타이드 또는 그 사이의 임의의 길이)이다.
일부 실시형태에서, PBS는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 40개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 30개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 15개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 11개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 12개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 13개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 14개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 30개의 뉴클레오타이드 길이이다.
Cas12i 폴리펩타이드(예를 들어, 본 명세서에 개시된 것과 같은 Cas12i2 폴리펩타이드)를 포함하는 유전자 편집 시스템에서, RT 공여체 RNA의 PBS는 비-PAM 가닥의 영역(PBS-표적화 부위)에 결합할 수 있다. 일부 경우에, PBS-표적화 부위는 표적 서열의 상보적 영역의 상류에 위치할 수 있다. 예를 들어, PBS-표적화 부위는 상보적 영역의 상류에 있는 최대 20개의 뉴클레오타이드, 예를 들어, 최대 15개의 뉴클레오타이드, 최대 10개의 뉴클레오타이드 또는 최대 5개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 예에서, PBS-표적화 부위는 상보적 영역의 상류에 있는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 10개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 특정 예에서, PBS-표적화 부위는 상보적 영역의 상류에 있는 1개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 2개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 3개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 4개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 5개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 6개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 7개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 1개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 3개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 4개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 5개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 6개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 7개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 2개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 3개 내지 4개의 뉴클레오타이드, 3개 내지 5개의 뉴클레오타이드, 3개 내지 6개의 뉴클레오타이드, 3개 내지 7개의 뉴클레오타이드, 3개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 3개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 3개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 5개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 6개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 7개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 4개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 5개 내지 6개의 뉴클레오타이드, 5개 내지 7개의 뉴클레오타이드, 5개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 5개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 5개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 6개 내지 7개의 뉴클레오타이드, 6개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 6개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 6개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 7개 내지 8개의 뉴클레오타이드, 7개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 7개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 8개 내지 9개의 뉴클레오타이드, 8개 내지 10개의 뉴클레오타이드, 9개 내지 10개의 뉴클레오타이드 또는 10개의 뉴클레오타이드일 수 있다. 다른 경우에, PBS-표적화 부위는 상보적 영역과 중첩될 수 있다. 자유 3' 말단이 표적 서열 및 상보적 영역 내 또는 그 근처의 유전자 편집 시스템에서 Cas12i 폴리펩타이드에 의해 생성될 때, 상보적 영역의 상류 또는 이와 중첩되는 부위에서 비-PAM 가닥에 대한 PBS 결합은 비-PAM 가닥에서 생성된 자유 3' 말단에서 시작하여 유전자 편집 시스템에서 RT 폴리펩타이드에 의해 DNA 합성을 효율적으로 촉진할 수 있다. 예시적인 예시는 도 12a 및 도 12b에 제공되어 있다.
역전사 주형 서열
역전사 주형 서열(주형 서열)은 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템에서 RT 폴리펩타이드에 의해 매개되는 역전사를 위한 주형 역할을 한다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 적어도 하나의 암호화된 편집을 갖는 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 적어도 하나의 암호화된 편집을 갖는 이의 상보적 영역에 대한 서열 상동성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 5개의 뉴클레오타이드, 적어도 6개의 뉴클레오타이드, 적어도 7개의 뉴클레오타이드, 적어도 8개의 뉴클레오타이드, 적어도 9개의 뉴클레오타이드, 적어도 10개의 뉴클레오타이드, 적어도 11개의 뉴클레오타이드, 적어도 12개의 뉴클레오타이드, 적어도 13개의 뉴클레오타이드, 적어도 14개의 뉴클레오타이드, 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 16개의 뉴클레오타이드, 적어도 17개의 뉴클레오타이드, 적어도 18개의 뉴클레오타이드, 적어도 19개의 뉴클레오타이드, 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 70개의 뉴클레오타이드, 적어도 80개의 뉴클레오타이드, 적어도 90개의 뉴클레오타이드, 적어도 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 300개의 뉴클레오타이드, 적어도 400개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 또는 120개의 뉴클레오타이드 길이 또는 그 사이의 임의의 길이이다.
일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 25개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 26개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 27개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 28개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 29개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 30개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 31개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 32개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 33개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 34개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 35개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 36개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 37개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 38개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 39개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 40개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 41개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 42개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 43개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 44개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 45개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 46개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 47개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 48개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 49개의 뉴클레오타이드이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 50개의 뉴클레오타이드이다.
일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 표적 서열에 대해 적어도 하나의 암호화된 편집을 포함한다. 다른 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 표적 서열의 상보적 영역에 대해 적어도 하나의 암호화된 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 암호화된 편집은 적어도 하나의 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열의 편집은 표적 서열의 서열에 대한 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 적어도 하나의 LoxP 부위를 포함한다.
일부 실시형태에서, 편집은 G에서 T로의 치환, G에서 A로의 치환, G에서 C로의 치환, T에서 G로의 치환, T에서 A로의 치환, T에서 C로의 치환, C에서 G로의 치환, C에서 T로의 치환, C에서 A로의 치환, A에서 T로의 치환, A에서 G로의 치환 또는 A에서 C로의 치환과 같은 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 치환일 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열의 변화는 G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환할 수 있다.
일부 실시형태에서, 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 치환은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드 또는 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 치환은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드, 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드 내지 210개의 뉴클레오타이드, 210개의 뉴클레오타이드 내지 220개의 뉴클레오타이드, 220개의 뉴클레오타이드 내지 230개의 뉴클레오타이드, 230개의 뉴클레오타이드 내지 240개의 뉴클레오타이드, 240개의 뉴클레오타이드 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250개의 뉴클레오타이드 내지 260개의 뉴클레오타이드, 260개의 뉴클레오타이드 내지 270개의 뉴클레오타이드, 270개의 뉴클레오타이드 내지 280개의 뉴클레오타이드, 280개의 뉴클레오타이드 내지 290개의 뉴클레오타이드 또는 290개의 뉴클레오타이드 내지 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 치환은 최대 약 10,000개의 염기(10kb) 길이이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 치환은 1개의 염기, 약 10개의 염기, 약 20개의 염기, 약 30개의 염기, 약 40개의 염기, 약 50개의 염기, 약 60개의 염기, 약 70개의 염기, 약 80개의 염기, 약 90개의 염기, 약 100개의 염기, 약 200개의 염기, 약 300개의 염기, 약 400개의 염기, 약 500개의 염기, 약 600개의 염기, 약 700개의 염기, 약 800개의 염기, 약 900개의 염기, 약 1kb, 약 1.1kb, 약 1.2kb, 약 1.3kb, 약 1.4kb, 약 1.5kb, 약 1.6kb, 약 1.7kb, 약 1.8kb, 약 1.9kb, 약 2kb, 약 2.1kb, 약 2.2kb, 약 2.3kb, 약 2.4kb, 약 2.5kb, 약 2.6kb, 약 2.7kb, 약 2.8kb, 약 2.9kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb 또는 10kb 길이이다.
일부 실시형태에서, 편집은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이인 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 삽입을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 삽입은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드 또는 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 삽입은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드, 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드 내지 210개의 뉴클레오타이드, 210개의 뉴클레오타이드 내지 220개의 뉴클레오타이드, 220개의 뉴클레오타이드 내지 230개의 뉴클레오타이드, 230개의 뉴클레오타이드 내지 240개의 뉴클레오타이드, 240개의 뉴클레오타이드 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250개의 뉴클레오타이드 내지 260개의 뉴클레오타이드, 260개의 뉴클레오타이드 내지 270개의 뉴클레오타이드, 270개의 뉴클레오타이드 내지 280개의 뉴클레오타이드, 280개의 뉴클레오타이드 내지 290개의 뉴클레오타이드 또는 290개의 뉴클레오타이드 내지 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 삽입은 최대 약 10,000개의 염기(10kb) 길이이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 삽입은 1개의 염기, 약 10개의 염기, 약 20개의 염기, 약 30개의 염기, 약 40개의 염기, 약 50개의 염기, 약 60개의 염기, 약 70개의 염기, 약 80개의 염기, 약 90개의 염기, 약 100개의 염기, 약 200개의 염기, 약 300개의 염기, 약 400개의 염기, 약 500개의 염기, 약 600개의 염기, 약 700개의 염기, 약 800개의 염기, 약 900개의 염기, 약 1kb, 약 1.1kb, 약 1.2kb, 약 1.3kb, 약 1.4kb, 약 1.5kb, 약 1.6kb, 약 1.7kb, 약 1.8kb, 약 1.9kb, 약 2kb, 약 2.1kb, 약 2.2kb, 약 2.3kb, 약 2.4kb, 약 2.5kb, 약 2.6kb, 약 2.7kb, 약 2.8kb, 약 2.9kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb 또는 10kb 길이이다.
일부 실시형태에서, 편집은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이인 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 결실은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드 또는 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 단일 또는 다중-뉴클레오타이드 결실은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드, 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드 내지 210개의 뉴클레오타이드, 210개의 뉴클레오타이드 내지 220개의 뉴클레오타이드, 220개의 뉴클레오타이드 내지 230개의 뉴클레오타이드, 230개의 뉴클레오타이드 내지 240개의 뉴클레오타이드, 240개의 뉴클레오타이드 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250개의 뉴클레오타이드 내지 260개의 뉴클레오타이드, 260개의 뉴클레오타이드 내지 270개의 뉴클레오타이드, 270개의 뉴클레오타이드 내지 280개의 뉴클레오타이드, 280개의 뉴클레오타이드 내지 290개의 뉴클레오타이드 또는 290개의 뉴클레오타이드 내지 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 결실은 최대 약 10,000개의 염기(10kb) 길이이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 결실은 1개의 염기, 약 10개의 염기, 약 20개의 염기, 약 30개의 염기, 약 40개의 염기, 약 50개의 염기, 약 60개의 염기, 약 70개의 염기, 약 80개의 염기, 약 90개의 염기, 약 100개의 염기, 약 200개의 염기, 약 300개의 염기, 약 400개의 염기, 약 500개의 염기, 약 600개의 염기, 약 700개의 염기, 약 800개의 염기, 약 900개의 염기, 약 1kb, 약 1.1kb, 약 1.2kb, 약 1.3kb, 약 1.4kb, 약 1.5kb, 약 1.6kb, 약 1.7kb, 약 1.8kb, 약 1.9kb, 약 2kb, 약 2.1kb, 약 2.2kb, 약 2.3kb, 약 2.4kb, 약 2.5kb, 약 2.6kb, 약 2.7kb, 약 2.8kb, 약 2.9kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb 또는 10kb 길이이다.
일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 5개의 뉴클레오타이드 내지 약 10,000개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드, 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드 내지 210개의 뉴클레오타이드, 210개의 뉴클레오타이드 내지 220개의 뉴클레오타이드, 220개의 뉴클레오타이드 내지 230개의 뉴클레오타이드, 230개의 뉴클레오타이드 내지 240개의 뉴클레오타이드, 240개의 뉴클레오타이드 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250개의 뉴클레오타이드 내지 260개의 뉴클레오타이드, 260개의 뉴클레오타이드 내지 270개의 뉴클레오타이드, 270개의 뉴클레오타이드 내지 280개의 뉴클레오타이드, 280개의 뉴클레오타이드 내지 290개의 뉴클레오타이드 또는 290개의 뉴클레오타이드 내지 300개의 뉴클레오타이드 또는 약 1킬로베이스(kb), 약 1.1kb, 약 1.2kb, 약 1.3kb, 약 1.4kb, 약 1.5kb, 약 1.6kb, 약 1.7kb, 약 1.8kb, 약 1.9kb, 약 2kb, 약 2.1kb, 약 2.2kb, 약 2.3kb, 약 2.4kb, 약 2.5kb, 약 2.6kb, 약 2.7kb, 약 2.8kb, 약 2.9kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb 또는 10kb 길이인 적어도 하나의 암호화된 편집을 포함한다.
역전사 주형 서열은 본 명세서에 기재된 유전자 편집 시스템의 역전사효소에 의해 DNA로 전사될 수 있다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은, 5'에서 3'로, PAM 가닥의 DNA로 전사된다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은, 5'에서 3'로, 비-PAM 가닥의 DNA로 전사된다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은, 5'에서 3'로, PAM 가닥의 DNA로 전사된다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은, 5'에서 3'로, 비-PAM 가닥의 DNA로 전사된다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS의 5'이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS의 3'이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS로부터 3' 연장을 통해 PAM 가닥의 DNA로 전사된다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS로부터 3' 연장을 통해 비-PAM 가닥의 DNA로 전사된다.
iii. 추가적인 요소
일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 하나 이상의 추가적인 요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 편집 주형 RNA 또는 gRNA 및/또는 이의 RT 공여체 RNA는 RNA 분자의 한쪽 말단 또는 양쪽 말단에 하나 이상의 보호 단편을 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 편집 주형 RNA 또는 gRNA 및/또는 이의 RT 공여체 RNA는 RNA 분자 내부(예를 들어, 편집 주형 RNA의 서열 중 하나 이상 사이, 예를 들어, PBS와 역전사 주형 서열, 예를 들어, 링커 사이)에 추가적인 요소를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는, 예를 들어, RNA 가이드(뉴클레이스 결합 서열 또는 DNA-결합 서열) 또는 RT 공여체 RNA(PBS 또는 역전사 주형 서열)와 같은 편집 주형 RNA의 하나 이상의 서열 사이에 추가적인 요소를 포함한다.
일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 추가적인 요소, 예를 들어, 하나 이상의 말단에 직접 반복 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 직접 반복 서열은 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 유형 V 뉴클레이스, 예컨대, 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드, 또는 변이형 Cas12i2-역전사효소 융합 폴리펩타이드 또는 Cas12i4-역전사효소 융합 폴리펩타이드)를 동원할 수 있다.
일부 실시형태에서, 추가적인 요소 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 5개의 뉴클레오타이드, 적어도 6개의 뉴클레오타이드, 적어도 7개의 뉴클레오타이드, 적어도 8개의 뉴클레오타이드, 적어도 9개의 뉴클레오타이드, 적어도 10개의 뉴클레오타이드, 적어도 11개의 뉴클레오타이드, 적어도 12개의 뉴클레오타이드, 적어도 13개의 뉴클레오타이드, 적어도 14개의 뉴클레오타이드, 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 16개의 뉴클레오타이드, 적어도 17개의 뉴클레오타이드, 적어도 18개의 뉴클레오타이드, 적어도 19개의 뉴클레오타이드, 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 70개의 뉴클레오타이드, 적어도 80개의 뉴클레오타이드, 적어도 90개의 뉴클레오타이드, 적어도 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 300개의 뉴클레오타이드, 적어도 400개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다.
일부 예에서, 편집 주형 RNA는 선택적 뉴클레오타이드 링커를 포함할 수 있다. 이러한 선택적 뉴클레오타이드 링커 서열은 적어도 3개의 뉴클레오타이드, 적어도 4개의 뉴클레오타이드, 적어도 5개의 뉴클레오타이드, 적어도 6개의 뉴클레오타이드, 적어도 7개의 뉴클레오타이드, 적어도 8개의 뉴클레오타이드, 적어도 9개의 뉴클레오타이드, 적어도 10개의 뉴클레오타이드, 적어도 11개의 뉴클레오타이드, 적어도 12개의 뉴클레오타이드, 적어도 13개의 뉴클레오타이드, 적어도 14개의 뉴클레오타이드, 적어도 15개의 뉴클레오타이드, 적어도 16개의 뉴클레오타이드, 적어도 17개의 뉴클레오타이드, 적어도 18개의 뉴클레오타이드, 적어도 19개의 뉴클레오타이드, 적어도 20개의 뉴클레오타이드, 적어도 30개의 뉴클레오타이드, 적어도 40개의 뉴클레오타이드, 적어도 50개의 뉴클레오타이드, 적어도 60개의 뉴클레오타이드, 적어도 70개의 뉴클레오타이드, 적어도 80개의 뉴클레오타이드, 적어도 90개의 뉴클레오타이드, 적어도 100개의 뉴클레오타이드, 적어도 200개의 뉴클레오타이드, 적어도 300개의 뉴클레오타이드, 적어도 400개의 뉴클레오타이드 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 실시형태에서, 선택적 뉴클레오타이드 링커는 임의의 뉴클레이스 결합 서열, DNA-결합 서열, PBS 및/또는 역전사 주형 서열 사이에 있다.
일부 예에서, 편집 주형 RNA 또는 gRNA 및/또는 이의 RT 공여체 RNA의 5' 말단 및/또는 3' 말단은 엑소뉴클레이스 활성에 대한 RNA 분자의 저항성을 향상시킬 수 있는 보호 단편을 포함할 수 있다. 예를 들어, 도 11을 참조한다. 일부 경우에, 말단 보호 단편은 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조와 같은 2차 구조를 형성할 수 있는 뉴클레오타이드 서열을 포함할 수 있다. 다른 경우에, 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형은 지카-유사(Zika-like) 슈도노트, 뮤린 백혈병 바이러스 슈도노트(MLV-PK) 서열, 레드 클로버 괴사 모자이크 바이러스(red clover necrotic mosaic virus: RCNMV) 서열, 스위트 클로버 괴사 모자이크 바이러스(sweet clover necrotic mosaic virus: SCNMV) 서열, 카네이션 링스팟 바이러스(carnation ringspot virus: CRSV) 서열, preQ 서열 또는 RNA 박테리오파지 MS2 서열이다. 특정 예에서, 말단 보호 단편은 하나 이상의 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위(예를 들어, Cas12i2 폴리펩타이드와 같은 Cas12i 폴리펩타이드에 대한 결합 부위) 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동성을 공유하지 않는 하나 이상의 분절(예를 들어, 스페이서)을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 하나 이상의 분절은 인간 게놈의 임의의 서열과 85% 이하로 동일한 서열에 결합한다. 도 10, 도 11, 도 12a 및 도 12b를 참조한다. 이러한 말단 보호 단편은 표적외 유전자 편집을 유도하지 않고 엑소리보뉴클레이스 활성을 저해하기 위해 동일한 유전자 편집 시스템에 포함된 CRISPR 뉴클레이스를 동원할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 적어도 하나의 편집 주형 RNA(예를 들어, 유전자 편집 RNA) 또는 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일부 예에서, 적어도 하나의 편집 주형 RNA는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 유형 V CRISPR 뉴클레이스)에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 편집 주형 RNA는 핵산(예를 들어, DNA 또는 표적 핵산)에 추가로 결합할 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 편집 주형 RNA는 뉴클레이스 결합 서열(예를 들어, CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위) 및 DNA-결합 서열(예를 들어, 스페이서)을 포함한다. 일부 경우에, 적어도 하나의 편집 주형 RNA는 gRNA(뉴클레이스 결합 서열 및 스페이서 포함) 및 RT 공여체 RNA를 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA는 RT 공여체 RNA에 연결된 RNA 가이드를 포함한다. 예를 들어, 도 19b를 참조한다.
iv. 핵산의 변형
본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템의 임의의 RNA 구성요소, 예를 들어, 편집 주형 RNA, RNA 가이드, RT 공여체 RNA는 하나 이상의 변형을 포함할 수 있다.
예시적인 변형은 당, 핵염기, 뉴클레오사이드간 연결(예를 들어, 연결 포스페이트/포스포다이에스터 연결/포스포다이에스터 백본) 및 이들의 임의의 조합에 대한 임의의 변형을 포함할 수 있다. 본 명세서에 제공된 예시적인 변형 중 일부는 아래에 자세히 설명되어 있다.
RNA 가이드 또는 조성물의 구성요소를 암호화하는 임의의 핵산 서열은 당, 핵염기 또는 뉴클레오사이드간 연결(예를 들어, 연결 포스페이트/포스포다이에스터 연결/포스포다이에스터 백본)과 같은 임의의 유용한 변형을 포함할 수 있다. 피리미딘 핵염기의 하나 이상의 원자는 선택적으로 치환된 아미노, 선택적으로 치환된 티올, 선택적으로 치환된 알킬(예를 들어, 메틸 또는 에틸) 또는 할로(예를 들어, 클로로 또는 플루오로)로 대체되거나 또는 치환될 수 있다. 소정의 실시형태에서, 변형(예를 들어, 하나 이상의 변형)은 당 및 뉴클레오사이드간 연결 각각에 존재한다. 변형은 리보핵산(RNA)의 데옥시리보핵산(DNA), 트레오스 핵산(threose nucleic acid: TNA), 글리콜 핵산(glycol nucleic acid: GNA), 펩타이드 핵산(peptide nucleic acid: PNA), 잠금 핵산(locked nucleic acid: LNA) 또는 이의 하이브리드로의 변형일 수 있다. 추가적인 변형은 본 명세서에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 변형은 화학적 또는 세포 유도성 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포내 RNA 변형의 일부 비제한적인 예는 문헌[Lewis and Pan in "RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions" from Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18:202-210]에 기술되어 있다.
다양한 당 변형, 뉴클레오타이드 변형 및/또는 뉴클레오사이드간 연결(예를 들어, 백본 구조)이 서열의 다양한 위치에 존재할 수 있다. 당업자는 뉴클레오타이드 유사체 또는 다른 변형(들)이 서열의 기능이 실질적으로 감소되지 않는 서열의 임의의 위치(들)에 위치할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 서열은 (전체 뉴클레오타이드 함량과 관련하여 또는 하나 이상의 유형의 뉴클레오타이드, 즉, A, G, U 또는 C 중 임의의 하나 이상과 관련하여) 약 1% 내지 약 100% 또는 임의의 그 사이에 있는 백분율(예를 들어, 1% 내지 20%, 1% 내지 25%, 1% 내지 50%, 1% 내지 60%, 1% 내지 70%, 1% 내지 80%, 1% 내지 90%, 1% 내지 95%, 10% 내지 20%, 10% 내지 25%, 10% 내지 50%, 10% 내지 60%, 10% 내지 70%, 10% 내지 80%, 10% 내지 90%, 10% 내지 95%, 10% 내지 100%, 20% 내지 25%, 20% 내지 50%, 20% 내지 60%, 20% 내지 70%, 20% 내지 80%, 20% 내지 90%, 20% 내지 95%, 20% 내지 100%, 50% 내지 60%, 50% 내지 70%, 50% 내지 80%, 50% 내지 90%, 50% 내지 95%, 50% 내지 100%, 70% 내지 80%, 70% 내지 90%, 70% 내지 95%, 70% 내지 100%, 80% 내지 90%, 80% 내지 95%, 80% 내지 100%, 90% 내지 95%, 90% 내지 100% 및 95% 내지 100%)만큼 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 서열의 하나 이상의 리보뉴클레오타이드에서 당 변형(예를 들어, 2' 위치 또는 4' 위치에) 또는 당의 대체는 백본 변형뿐만 아니라 포스포다이에스터 연결의 변형 또는 대체를 포함할 수 있다. 서열의 특정 예는 변형된 백본을 포함하거나 또는 포스포다이에스터 연결의 변형 또는 대체를 포함하는 뉴클레오사이드간 변형과 같은 천연 뉴클레오사이드간 연결이 없는 서열을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 변형된 백본을 갖는 서열은 특히 백본에 인 원자가 없는 서열을 포함한다. 본 출원의 목적을 위해 그리고 때때로 당업계에서 언급되는 바와 같이, 뉴클레오사이드간 백본에 인 원자를 갖지 않는 변형된 RNA도 올리고뉴클레오사이드로 간주될 수 있다. 특정 실시형태에서, 서열은 뉴클레오사이드간 백본에 인 원자를 갖는 리보뉴클레오타이드를 포함할 것이다.
변형된 서열 백본은, 예를 들어, 포스포로티오에이트, 카이랄 포스포로티오에이트, 포스포로다이티오에이트, 포스포트라이에스터, 아미노알킬포스포트라이에스터, 메틸 및 다른 알킬 포스포네이트, 예컨대, 3'-알킬렌 포스포네이트 및 카이랄 포스포네이트, 포스피네이트, 포스포라미데이트, 예컨대, 3'-아미노 포스포라미데이트 및 아미노알킬포스포라미데이트, 티오노포스포라미데이트, 티오노알킬포스포네이트, 티오노알킬포스포트라이에스터 및 정상적인 3'-5' 연결을 갖는 보라노포스페이트, 이들의 2'-5' 연결된 유사체 및 뉴클레오사이드 단위의 인접한 쌍이 3'-5'에서 5'-3' 또는 2'-5'에서 5'-2'로 연결된 역전된 반전된 극성(inverted polarity)을 갖는 것들을 포함할 수 있다. 다양한 염, 혼합염 및 유리산 형태도 포함된다. 일부 실시형태에서, 서열은 음으로 또는 양으로 하전될 수 있다.
서열에 혼입될 수 있는 변형된 뉴클레오타이드는 뉴클레오사이드간 연결(예를 들어, 포스페이트 백본)에서 변형될 수 있다. 본 명세서에서, 폴리뉴클레오타이드 백본의 맥락에서, 어구 "포스페이트" 및 "포스포다이에스터"는 상호교환적으로 사용된다. 백본 포스페이트기는 하나 이상의 산소 원자를 다른 치환기로 대체함으로써 변형될 수 있다. 또한, 변형된 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드는 본 명세서에 기재된 바와 같이 변형되지 않은 포스페이트 모이어티를 또 다른 뉴클레오사이드간 연결로 대체하는 것을 포함할 수 있다. 변형된 포스페이트기의 예는 포스포로티오에이트, 포스포로셀레네이트, 보라노포스페이트, 보라노포스페이트 에스터, 하이드로겐 포스포네이트, 포스포라미데이트, 포스포로다이아미데이트, 알킬 또는 아릴 포스포네이트 및 포스포트라이에스터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 포스포로다이티오에이트는 비연결 산소가 모두 황으로 대체되어 있다. 포스페이트 링커는 또한 연결 산소를 질소(브리지된 포스포라미데이트), 황(브리지된 포스포로티오에이트) 및 탄소(브리지된 메틸렌-포스포네이트)로 대체하여 변형될 수 있다.
α-티오 치환된 포스페이트 모이어티는 비천연 포스포로티오에이트 백본 연결을 통해 RNA 및 DNA 중합체에 안정성을 부여하기 위해 제공된다. 포스포로티오에이트 DNA 및 RNA는 뉴클레이스 저항성이 증가하고 이후에 세포 환경에서 반감기가 길어진다.
특정 실시형태에서, 변형된 뉴클레오사이드는 알파-티오-뉴클레오사이드(예를 들어, 5'-O-(1-티오포스페이트)-아데노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-사이티딘(a-티오-사이티딘), 5'-O-(1-티오포스페이트)-구아노신, 5'-O-(1-티오포스페이트)-우리딘 또는 5'-O-(1-티오포스페이트)-슈도우리딘)을 포함한다.
인 원자를 포함하지 않는 뉴클레오사이드간 연결을 포함하여 본 발명에 따라 사용될 수 있는 다른 뉴클레오사이드간 연결이 본 명세서에 기재되어 있다.
일부 실시형태에서, 서열은 하나 이상의 세포독성 뉴클레오사이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 세포독성 뉴클레오사이드는 이작용성 변형과 같이 서열에 혼입될 수 있다. 세포독성 뉴클레오사이드는 아데노신 아라비노사이드, 5-아자사이티딘, 4'-티오-아라사이티딘, 사이클로펜텐일사이토신, 클라드리빈, 클로파라빈, 시타라빈, 사이토신 아라비노사이드, 1-(2-C-사이아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토퓨라노실)-사이토신, 데시타빈, 5-플루오로우라실, 플루다라빈, 플록스우리딘, 젬시타빈, 테가푸르와 우라실의 조합, 테가푸르((RS)-5-플루오로-1-(테트라하이드로퓨란-2-일)피리미딘-2,4(1H,3H)-다이온), 트록사시타빈, 테자시타빈, 2'-데옥시-2'-메틸리덴사이티딘(DMDC) 및 6-머캅토퓨린을 포함할 수 있지만 이에 제한되지 않는다. 추가적인 예는 플루다라빈 포스페이트, N4-베헤노일-1-베타-D-아라비노퓨라노실사이토신, N4-옥타데실-1-베타-D-아라비노퓨라노실사이토신, N4-팔미토일-1-(2-C-사이아노-2-데옥시-베타-D-아라비노-펜토퓨라노실) 사이토신 및 P-4055(시타라빈 5'-엘라이드산 에스터)를 포함한다.
일부 실시형태에서, 서열은 하나 이상의 전사 후 변형(예를 들어, 캐핑, 절단, 폴리아데닐화, 스플라이싱, 폴리-A 서열, 메틸화, 아실화, 인산화, 라이신 및 아르기닌 잔기의 메틸화, 티올기 및 타이로신 잔기의 아세틸화 및 나이트로실화 등)을 포함한다. 하나 이상의 전사 후 변형은 RNA에서 확인된 임의의 100개 이상의 다양한 뉴클레오사이드 변형과 같은 임의의 전사 후 변형일 수 있다(Rozenski, J, Crain, P, and McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999 update. Nucl Acids Res 27: 196-197). 일부 실시형태에서, 첫 번째 단리된 핵산은 메신저 RNA(mRNA)를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 피리딘-4-온 리보뉴클레오사이드, 5-아자-우리딘, 2-티오-5-아자-우리딘, 2-티오우리딘, 4-티오-슈도우리딘, 2-티오-슈도우리딘, 5-하이드록시우리딘, 3-메틸우리딘, 5-카복시메틸-우리딘, 1-카복시메틸-슈도우리딘, 5-프로핀일-우리딘, 1-프로핀일-슈도우리딘, 5-타우리노메틸우리딘, 1-타우리노메틸-슈도우리딘, 5-타우리노메틸-2-티오-우리딘, 1-타우리노메틸-4-티오-우리딘, 5-메틸-우리딘, 1-메틸-슈도우리딘, 4-티오-1-메틸-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-슈도우리딘, 1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 2-티오-1-메틸-1-데아자-슈도우리딘, 다이하이드로우리딘, 다이하이드로슈도우리딘, 2-티오-다이하이드로우리딘, 2-티오-다이하이드로슈도우리딘, 2-메톡시우리딘, 2-메톡시-4-티오-우리딘, 4-메톡시-슈도우리딘 및 4-메톡시-2-티오-슈도우리딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 5-아자-사이티딘, 슈도아이소사이티딘, 3-메틸-사이티딘, N4-아세틸사이티딘, 5-폼일사이티딘, N4-메틸사이티딘, 5-하이드록시메틸사이티딘, 1-메틸-슈도아이소사이티딘, 피롤로-사이티딘, 피롤로-슈도아이소사이티딘, 2-티오-사이티딘, 2-티오-5-메틸-사이티딘, 4-티오-슈도아이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-슈도아이소사이티딘, 4-티오-1-메틸-1-데아자-슈도아이소사이티딘, 1-메틸-1-데아자-슈도아이소사이티딘, 제불라린, 5-아자-제불라린, 5-메틸-제불라린, 5-아자-2-티오-제불라린, 2-티오-제불라린, 2-메톡시-사이티딘, 2-메톡시-5-메틸-사이티딘, 4-메톡시-슈도아이소사이티딘 및 4-메톡시-1-메틸-슈도아이소사이티딘으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 2-아미노퓨린, 2, 6-다이아미노퓨린, 7-데아자-아데닌, 7-데아자-8-아자-아데닌, 7-데아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2-아미노퓨린, 7-데아자-2,6-다이아미노퓨린, 7-데아자-8-아자-2,6-다이아미노퓨린, 1-메틸아데노신, N6-메틸아데노신, N6-아이소펜텐일아데노신, N6-(시스-하이드록시아이소펜텐일)아데노신, 2-메틸티오-N6-(시스-하이드록시아이소펜텐일) 아데노신, N6-글리신일카바모일아데노신, N6-트레오닐카바모일아데노신, 2-메틸티오-N6-트레오닐 카바모일아데노신, N6,N6-다이메틸아데노신, 7-메틸아데닌, 2-메틸티오-아데닌 및 2-메톡시-아데닌으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, mRNA는 이노신, 1-메틸-이노신, 와이오신, 와이뷰토신, 7-데아자-구아노신, 7-데아자-8-아자-구아노신, 6-티오-구아노신, 6-티오-7-데아자-구아노신, 6-티오-7-데아자-8-아자-구아노신, 7-메틸-구아노신, 6-티오-7-메틸-구아노신, 7-메틸이노신, 6-메톡시-구아노신, 1-메틸구아노신, N2-메틸구아노신, N2,N2-다이메틸구아노신, 8-옥소-구아노신, 7-메틸-8-옥소-구아노신, 1-메틸-6-티오-구아노신, N2-메틸-6-티오-구아노신 및 N2,N2-다이메틸-6-티오-구아노신으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 뉴클레오사이드를 포함한다.
서열은 분자의 전체 길이에 따라 균일하게 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있다. 예를 들어, 하나 이상 또는 모든 유형의 뉴클레오타이드(예를 들어, 자연 발생적 뉴클레오타이드, 퓨린 또는 피리미딘, 또는 A, G, U, C, I, pU 중 임의의 하나 이상 또는 모두)는 서열 또는 이의 주어진 미리 결정된 서열 영역에서 균일하게 변형될 수 있거나 또는 변형되지 않을 수 있다. 일부 실시형태에서, 서열은 슈도우리딘을 포함한다. 일부 실시형태에서, 서열은 서열을 바이러스 RNA에 비해 내인성으로 특성화하는 면역계에 도움이 될 수 있는 이노신을 포함한다. 이노신의 혼입은 또한 개선된 RNA 안정성/감소된 분해를 매개할 수 있다. 예를 들어, 전체가 참조에 의해 원용되어 있는 문헌[Yu, Z. et al. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as "self". Cell Res. 25, 1283-1284]을 참조한다.
일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA와 같은 본 명세서에 기재된 임의의 RNA 서열은 말단 변형(예를 들어, 5' 말단 변형 또는 3' 말단 변형)을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 말단 변형은 화학적 변형이다. 일부 실시형태에서, 말단 변형은 구조적 변형이다. 본 개시내용을 참조한다.
본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템이 CRISPR 뉴클레이스 및/또는 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산을 포함하는 경우, 이러한 핵산 분자는 적용 가능한 경우 본 명세서에 개시된 임의의 변형을 포함할 수 있다.
D. 예시적인 유전자 편집 시스템
본 명세서에 기재된 예시적인 유전자 편집 시스템은 단지 예시를 위한 것이다.
일부 실시형태에서, 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 1a 및 도 1b에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 설계에서, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA(PBS 및 역전사 주형 서열 포함), 본 명세서에 개시된 임의의 추가적인 요소 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 3' 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PBS는 약 3개 내지 약 24개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개의 뉴클레오타이드) 길이이다. 대안적으로 또는 이에 더하여, PBS는 PAM 가닥에 위치할 수 있는 상응하는 PBS-표적화 부위와 적어도 약 75%의 상보성을 가질 수 있다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개의 뉴클레오타이드) 길이이다. 일부 실시형태에서, 링커는 RNA 가이드의 DNA-결합 서열(스페이서)과 역전사 주형 서열 사이에 존재한다. 일부 예에서, 링커는 하나 이상의 헤어핀을 포함한다. 예를 들어, 헤어핀은 PBS와 DNA-결합 서열 사이의 어닐링을 감소시킬 수 있다.
일부 경우에, 예시적인 유전자 편집 시스템의 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)는 N-말단 또는 C-말단 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, N-말단 또는 C-말단 융합 파트너는 역전사효소 폴리펩타이드를 포함한다.
다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 2에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 설계에서, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA(PBS 및 역전사 주형 서열 포함), 추가적인 요소 중 하나 이상 또는 이들의 조합을 포함할 수 있는 5' 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개의 뉴클레오타이드) 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 24개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개, 20개, 21개, 22개, 23개 또는 24개의 뉴클레오타이드) 길이이다. 대안적으로 또는 이에 더하여, PBS는 PAM 가닥에 위치할 수 있는 상응하는 PBS-표적화 부위와 적어도 약 75%의 상보성을 갖는다. 일부 실시형태에서, 링커는 RNA 가이드의 DNA-결합 서열과 PBS 사이에 존재한다. 일부 예에서, 링커는 하나 이상의 헤어핀을 포함한다. 예를 들어, 헤어핀은 PBS와 DNA-결합 서열 사이의 어닐링을 감소시킬 수 있다.
일부 경우에, 예시적인 유전자 편집 시스템의 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)는 N-말단 또는 C-말단 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, N-말단 또는 C-말단 융합 파트너는 역전사효소 폴리펩타이드를 포함한다.
도 1a, 도 1b 및 도 2에 도시되어 있는 예시적인 유전자 편집 시스템은 표적 핵산(예를 들어, 관심 게놈 부위)의 PAM-가닥을 편집하는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 도 1a, 도 1b 및 도 2의 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하면, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)에 의한 절단 동안, PAM 가닥의 자유 3' 말단은 PBS와 염기쌍을 형성하고, 역전사 주형 서열을 주형으로 사용하여 연장되고, 상보적 게놈 가닥과의 염기-페어링으로 가닥을 다시 교환하여 편집을 혼입시킬 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 3에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템은 2개의 RNA 분자: 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열(스페이서)을 포함하는 RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 포함한다. RT 공여체 RNA는 PBS 및 역전사 주형 서열을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 역전사 주형 서열은 편집을 암호화하지 않는다. 다른 예에서, RT 공여체 RNA는 PBS 및 편집을 암호화하는 역전사 주형 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열 또는 이의 일부는 염기 페어링을 통해 표적 핵산에 결합할 수 있다.
일부 경우에, PBS는 최대 약 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, RT 공여체 RNA의 역전사 주형 서열은 5' 말단에 압타머를 포함한다. 일부 실시형태에서, 압타머는 역전사효소 폴리펩타이드를 동원한다. 일부 실시형태에서, RT 공여체 RNA의 PBS는 편집 주형 RNA의 임의의 다른 부분(예를 들어, 뉴클레이스 결합 서열 및/또는 DNA-결합 서열)에 상보적이지 않다.
도 3에 도시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 1개 또는 2개의 단백질 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 유전자 편집 시스템은 역전사효소 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 N-말단 또는 C-말단 융합 파트너를 갖는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)를 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스) 및 역전사효소 폴리펩타이드를 2개의 개별 폴리펩타이드로서 포함할 수 있다.
도 3에 도시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 표적 핵산(예를 들어, 관심 게놈 부위)의 PAM 가닥 또는 비-PAM 가닥을 편집하는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하면, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)가 표적 핵산으로부터 방출된 후, PAM 가닥 또는 비-PAM 가닥의 자유 3' 말단은 PBS와 염기쌍을 형성하고, 역전사 주형 서열을 주형으로 사용하여 연장되고, 상보적 게놈 가닥과의 혼성화로 가닥이 다시 교환되어 RT 공여체 RNA로부터 편집을 혼입시킬 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 표적 핵산의 PAM 원위 영역을 편집하는 데 사용될 수 있다.
또 다른 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 4에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템은 2개의 RNA 분자: RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 2개의 개별 RNA 분자로 포함할 수 있다. 예시적인 유전자 편집 시스템은 본 명세서에 개시된 바와 같은 1개 또는 2개의 단백질 구성요소를 포함할 수 있다. 예를 들어, 예시적인 유전자 편집 시스템은 역전사효소 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 N-말단 또는 C-말단 융합 파트너를 갖는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)를 포함할 수 있다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스) 및 역전사효소 폴리펩타이드는 서로 융합되지 않는다(2개의 별도의 폴리펩타이드임).
도 4에 도시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 PAM 가닥 또는 비-PAM 가닥을 편집하는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하면, PAM 가닥 또는 비-PAM 가닥의 자유 3' 말단은 동일한 유전자 편집 시스템에서 RT 공여체 RNA의 PBS와 염기쌍을 형성하고, 역전사 주형 서열을 주형으로 사용하여 연장되고, 상보적 게놈 가닥과의 혼성화로 가닥이 다시 교환되어 RT 공여체 RNA로부터 편집을 혼입시킬 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 5에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템에서, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA(역전사 주형 서열 및 PBS 포함)를 포함할 수 있는 3' 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 경우에, PBS는 표적 서열의 상보적 영역의 상류에 있는 비-PAM 가닥의 부위에 결합한다.
일부 예에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 3개, 5개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개 또는 100개의 뉴클레오타이드) 길이이다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열(스페이서)은 약 20개의 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 PAM 서열로부터 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 25개의 뉴클레오타이드가 혼입된 적어도 하나의 편집을 포함한다.
일부 예에서, 예시적인 유전자 편집 시스템은 5' 융합 또는 3' 융합 파트너를 포함하는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)를 포함할 수 있다. 5' 융합 또는 3' 융합 파트너는 역전사효소 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있다.
도 5에 도시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 표적 핵산(예를 들어, 관심 게놈 부위)의 비-PAM 가닥을 편집하는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하면, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)에 의한 절단 동안, 비-PAM 가닥의 자유 3' 말단은 PBS와 염기쌍을 형성하고, DNA-결합 서열을 주형으로 사용하여 연장될 수 있다. 비-PAM 가닥의 RT 연장은 상보적 게놈 가닥과의 염기-페어링으로 다시 교환되어 RT 공여체 RNA로부터 편집을 혼입시킨다.
일부 실시형태에서, 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 6a 및 도 6b에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템에서, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA(역전사 주형 서열 및 PBS 포함)를 포함할 수 있는 3' 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, PBS는 PAM 가닥의 표적 서열의 상보적 영역의 상류에 있는 비-PAM 가닥의 영역에 상보적이다. 일부 예에서, 헤어핀은 RNA 가이드의 DNA-결합 서열과 역전사 주형 서열 사이에 존재한다. 일부 실시형태에서, 헤어핀은 역전사 주형 서열 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 주형 서열 내 편집은 편집이 혼입되는 표적 핵산에 헤어핀을 생성할 수 있다.
일부 예에서, 예시적인 유전자 편집 시스템은 N-말단 또는 C-말단 융합 파트너를 포함하는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)를 포함할 수 있다. N-말단 또는 C-말단 융합 파트너는 역전사효소 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 7에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템에서, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA(PBS 및 역전사 주형 서열 포함)를 포함할 수 있는 5' 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 5개 내지 약 20개의 뉴클레오타이드(예를 들어, 약 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 11개, 12개, 13개, 14개, 15개, 16개, 17개, 18개, 19개 또는 20개의 뉴클레오타이드) 길이이다. 대안적으로 또는 이에 더하여, PBS는 비-PAM 가닥의 영역(상응하는 PBS-표적화 부위)과 적어도 약 75%의 상보성을 갖는다. 일부 경우에, 링커는 RNA 가이드의 뉴클레이스 결합 서열과 RT 공여체 RNA의 PBS 사이에 존재한다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 헤어핀은 RNA 가이드의 DNA-결합 서열과 RT 공여체 RNA의 역전사 주형 서열 사이에 존재할 수 있다. 일부 실시형태에서, 헤어핀은 역전사 주형 서열 내에 존재한다. 일부 실시형태에서, 주형 서열 내의 편집은 편집이 혼입되는 표적 핵산에서 헤어핀을 생성할 수 있다.
일부 경우에, 예시적인 유전자 편집 시스템의 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)는 역전사효소 폴리펩타이드를 포함할 수 있는 N-말단 또는 C-말단 융합 파트너를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있다(예를 들어, 본 명세서에 개시된 것).
도 6a, 도 6b 또는 도 7에 도시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 표적 핵산(예를 들어, 관심 게놈 부위)의 비-PAM 가닥을 편집하는 데 사용될 수 있다. 이론에 얽매이지 않고, 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하면, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)에 의한 절단 동안, 비-PAM 가닥의 자유 3' 말단은 PBS와 염기쌍을 형성하고, 역전사 주형 서열을 주형으로 연장될 수 있다. 비-PAM 가닥의 RT 연장은 상보적 게놈 가닥과의 염기쌍으로 다시 교환되어 RT 공여체 RNA로부터 적어도 하나의 편집을 혼입시킨다.
본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템, 예를 들어, 도 6a, 도 6b 및 도 7에 도시된 것들은 PAM 가닥의 표적 서열과 상보적인 비-PAM 가닥의 영역 내에 적어도 하나의 PAM-근위 편집을 혼입시키는 데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 예시적인 유전자 편집 시스템은 PAM 서열 및/또는 PAM 서열의 상류에 있는 서열을 (예를 들어, PAM 서열 및/또는 상류 서열과 상보적인 영역에 변이를 도입함으로써) 변형시키는 데 사용될 수 있다. 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템은 동일한 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)에 의한 생성된 변형된 유전적 유전자좌의 재표적화를 방지하는 데 사용될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 예시적인 유전자 편집 시스템은 도 10에 도시되어 있다. 이러한 예시적인 유전자 편집 시스템에서, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA(PBS 및 역전사 주형 서열 포함)를 포함할 수 있는 3' 융합 파트너를 포함할 수 있다. 대안적으로, RNA 가이드는 RT 공여체 RNA(역전사 주형 서열 및 PBS 포함)를 포함할 수 있는 5' 융합 파트너를 포함할 수 있다. PBS의 길이는 가변적일 수 있다. 예를 들어, PBS 길이는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 16개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 예에서, PBS는 표적 핵산(예를 들어, 관심 게놈 부위)의, 예를 들어, 표적 서열과 중첩되는 PAM 가닥 상의 영역에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 헤어핀은 RNA 가이드의 DNA-결합 서열과 RT 공여체 RNA의 역전사 주형 서열 사이에 존재한다. RNA 가이드-역전사 주형 서열의 한쪽 또는 양쪽 말단은 엑소뉴클레이스 또는 엔도뉴클레이스 활성을 방지하기 위해 보호 단편, 예를 들어, 본 명세서에 개시된 것들을 포함할 수 있다.
예시적인 유전자 편집 시스템은 N-말단 또는 C-말단 융합 파트너를 포함할 수 있는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)를 포함할 수 있다. 일부 예에서, N-말단 또는 C-말단 융합 파트너는 역전사효소 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스)는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있다. 일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스는 닉케이스이다. 일부 예에서, 편집은 도 10에 도시된 예시적인 유전자 편집 시스템을 사용하여 표적 핵산의 PAM 가닥으로 혼입된다.
RNA 가이드의 3' 말단 서열에 융합된 RT 공여체 RNA 서열 또는 RNA 가이드의 5' 말단 서열에 융합된 RT 공여체 RNA 서열을 포함하는 도 1 내지 도 7, 도 8a 내지 도 8c 및 도 10에 도시된 예시적인 편집 주형 RNA는 대신 RNA 가이드 서열의 내부 위치에 융합된 RT 공여체 RNA 서열을 포함할 수 있거나 또는 그 반대일 수 있다. 예를 들어, RT 공여체 RNA는 RNA 가이드, sgRNA 또는 RNA 가이드-tracrRNA(예를 들어, sgRNA)의 내부 위치에 융합될 수 있다.
(예를 들어, RT 공여체 RNA를 사용한 5' 연장 또는 3' 연장을 통해) 연장된 RNA 가이드 말단은 편집 혼입의 효율과 함께 역전사 주형 서열 농도를 감소시키는 엑소뉴클레이스 및/또는 엔도뉴클레이스 활성에 취약할 수 있다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체는 엑소뉴클레이스 활성을 저해하거나 또는 방지하기 위해 첨가된 2차 구조를 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 첨가된 2차 구조는 삼중 구조, 슈도노트, xrRNA, 원형 RNA, tRNA 또는 절단형 tRNA이다. 일부 실시형태에서, 첨가된 2차 구조는 지카-유사 슈도노트, 뮤린 백혈병 바이러스 슈도노트(MLV-PK) 서열, 레드 클로버 괴사 모자이크 바이러스(RCNMV) 서열, 스위트 클로버 괴사 모자이크 바이러스(SCNMV) 서열, 카네이션 링스팟 바이러스(CRSV) 서열, preQ 서열 또는 RNA 박테리오파지 MS2 서열이다. 일부 실시형태에서, 첨가된 2차 구조는 염기-적층 또는 3'-말단 염기 페어링을 통해 이루어진다. 다른 실시형태에서, 첨가된 2차 구조는 뉴클레이스 결합 서열 또는 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열이다. 도 10, 도 11, 도 12a 및 도 12b를 참조한다. 일부 실시형태에서, 첨가된 DNA-결합 서열은 비포유동물 표적에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 첨가된 DNA-결합 서열은 비인간 표적에 대해 지시된다. 일부 실시형태에서, 첨가된 DNA-결합 서열은 인간 게놈에서 발견되지 않는다. 일부 실시형태에서, 첨가된 DNA-결합 서열은 인간 게놈의 임의의 서열과 85% 이상 동일하다. 실시예 2를 참조한다.
이론에 얽매이지 않고, 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열의 첨가는 CRISPR 뉴클레이스 또는 CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체를 동원할 수 있다. 단백질-RNA 상호작용을 통해, 결합된 CRISPR 뉴클레이스는 내인성 엑소뉴클레이스 및 엔도뉴클레이스에 대한 저항성을 제공할 수 있다. 일부 실시형태에서, 추가적인 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열은 RNA-처리 활성이 결여되어 있는 CRISPR 뉴클레이스를 동원한다. 일부 실시형태에서, 2차 구조는 압타머(예를 들어, RNA 압타머)이며, 조성물은 압타머와 상호작용하는 단백질을 추가로 포함한다. 일부 실시형태에서, 압타머 및 압타머-상호작용 단백질을 포함하는 조성물은 내인성 엑소뉴클레이스 및/또는 엔도뉴클레이스 활성을 저해한다.
본 명세서에 개시된 바와 같은 추가적인 예시적인 유전자 편집 시스템은 단지 예시의 목적으로만 아래에 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 적어도 하나의 RNA 가이드(또는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되는 가이드 RNA) 및 적어도 하나의 RT 공여체 RNA를 포함한다. 일부 예에서, 적어도 하나의 RNA 가이드는 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열(스페이서)을 포함한다. RNA 가이드는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 유형 V CRISPR 뉴클레이스)에 결합할 수 있다. 일부 예에서, 적어도 하나의 RNA 가이드는 추가로, 예를 들어, 스페이서 영역을 통해 표적 핵산에 결합할 수 있다. 일부 예에서, RT 공여체 RNA는 적어도 하나의 프라이머 결합 부위(PBS) 및 적어도 하나의 역전사 주형 서열을 포함한다. PBS는 센스 가닥 또는 안티센스 가닥일 수 있는 표적 핵산의 한 가닥에 결합할 수 있다. PBS가 결합하는 영역은 본 명세서에서 PBS-표적화 부위로 기술된다. 적어도 하나의 역전사 주형 서열은 표적 핵산의 상응하는 서열에 대해 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변이(암호화된 편집)을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 적어도 하나의 암호화된 편집은 삽입, 치환 및/또는 결실이다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 적어도 하나의 RNA 가이드, 적어도 하나의 RT 공여체 RNA 및 적어도 하나의 다른 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 RNA 가이드는 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열을 포함한다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드는 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, 유형 V CRISPR 뉴클레이스)에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 RNA 가이드는 추가로 표적 핵산에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 RT 공여체 RNA의 PBS는 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 RT 공여체 RNA의 PBS는 표적 핵산의 PAM 가닥에 결합할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및 편집 주형 RNA 중 적어도 하나를 포함할 수 있으며, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 포함할 수 있다. 일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및 편집 주형 RNA 중 적어도 하나가 별도의 조성물로 제공된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA 중 적어도 하나가 별도의 조성물로 제공된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및 편집 주형 RNA 중 하나 이상이 별도의 조성물로 제공된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소를 포함하는 조성물이 편집 주형 RNA를 포함하는 조성물과 별도로 제공된다. 일부 실시형태에서, 적어도 하나의 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA 중 하나 이상이 별도의 조성물로 제공된다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소를 포함하는 조성물이 RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 포함하는 조성물과 별도로 제공된다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 제공된 유전자 편집 시스템은 유전자 편집이 필요한 게놈 부위일 수 있는 표적 핵산에 결합할 수 있다. 일부 실시형태에서, 편집 주형 RNA와 같은 조성물의 하나 이상의 구성요소는 표적 핵산에 결합한다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA와 같은 조성물의 하나 이상의 구성요소는 표적 핵산에 결합한다. 일부 실시형태에서, 표적 핵산은 DNA이다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 표적 핵산을 변형시키거나 또는 변형시킬 수 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소와 같은 조성물의 구성요소 중 하나 이상은 표적 핵산을 변형시킨다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 치환, 삽입 또는 결실을 표적 핵산에 도입한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 치환, 삽입 또는 결실을 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 도입할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 치환, 삽입 또는 결실을 표적 핵산의 PAM 가닥에 도입할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스, RT 폴리펩타이드 또는 둘 다의 단백질 구성요소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 단백질 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 핵산(예를 들어, 벡터 예컨대, 바이러스 벡터)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스와 RT 폴리펩타이드 모두를 암호화하는 하나의 벡터를 포함할 수 있다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 유전자 편집 RNA, 가이드 RNA 또는 둘 다의 RNA 구성요소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 유전자 편집 시스템은 RNA 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 핵산(벡터)을 포함할 수 있다. 예를 들어, 유전자 편집 시스템은 유전자 편집 RNA와 RNA 가이드 모두를 코딩하는 하나의 벡터(예를 들어, AAV 벡터와 같은 바이러스 벡터)를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스, RT 폴리펩타이드 또는 둘 다의 단백질 구성요소와 유전자 편집 RNA 및 RNA 가이드의 RNA 구성요소를 포함할 수 있다. 다른 예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스, RT 폴리펩타이드 또는 둘 다의 단백질 구성요소와 유전자 편집 RNA 및 RNA 가이드의 RNA 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 또 다른 예에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스, RT 폴리펩타이드 또는 둘 다의 단백질 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 핵산과 유전자 편집 RNA 및 RNA 가이드의 RNA 구성요소를 포함할 수 있다. 대안적으로, 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템은 CRISPR 뉴클레이스, RT 폴리펩타이드 또는 둘 다의 단백질 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 핵산과 유전자 편집 RNA 및 RNA 가이드의 RNA 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 포함할 수 있다. 일부 경우에, 유전자 편집 시스템은 유전자 편집 시스템의 여러 구성요소를 암호화하는 하나의 벡터를 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템은 유전자 편집 시스템의 단백질 및/또는 RNA 구성요소 또는 이들의 암호화 핵산 중 하나 이상을 포함하는 하나 이상의 지질 나노입자(LNP)를 포함한다. 다른 실시형태에서, 유전자 편집 시스템은 구성요소의 일부를 포함하는 하나 이상의 LNP 및 나머지 구성요소를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 포함할 수 있다.
II. 유전자 편집 시스템 구성요소의 제조
단백질 구성요소, RNA 구성요소 또는 이들의 암호화 핵산은 본 명세서에 개시된 방법 중 통상적인 방법에 의해 제조될 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스), 역전사효소 또는 CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체는 (a) 단백질을 생산할 수 있는 세균 세포 또는 포유동물 세포와 같은 숙주 세포를 배양하고, 이렇게 생산된 단백질을 단리하고, 선택적으로 단백질을 정제함으로써 제조될 수 있다. 이렇게 제조된 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 또는 융합체 단백질은 편집 주형 RNA와 복합체를 형성할 수 있다.
CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소는 또한 (b) 공지된 유전 공학 기법, 구체적으로, 세균으로부터 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소를 암호화하는 유전자를 단리하고, 재조합 발현 벡터를 구축한 다음, 숙주 세포에서 편집 주형 RNA와 복합체를 형성하는 재조합 단백질의 발현을 위해 편집 주형 RNA를 발현하는 적절한 숙주 세포에 벡터를 전달함으로써 제조될 수 있다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소는 (c) 시험관내에서 전사-번역 시스템과 커플링된 다음, 편집 주형 RNA와 복합체를 형성함으로써 제조될 수 있다. 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소의 제조에 사용될 수 있는 세균은 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소를 생산할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다. 세균의 일부 비제한적인 예는 본 명세서에 기재된 대장균 세포를 포함한다.
달리 명시하지 않는 한, 본 명세서에 제공된 모든 조성물, 복합체 및 폴리펩타이드는 해당 조성물 또는 복합체 또는 폴리펩타이드의 활성 수준을 기준으로 제조되었으며, 불순물, 예를 들어, 상업적으로 이용 가능한 공급원에 존재할 수 있는 잔류 용매 또는 부산물은 배제되어 있다. 효소적 성분의 중량은 총 활성 단백질을 기준으로 한다. 모든 백분율 및 비는 달리 명시하지 않는 한 중량 기준으로 계산된다. 모든 백분율 및 비는 달리 명시하지 않는 한 전체 조성물을 기준으로 계산된다. 예시된 조성물에서, 효소 수준은 전체 조성물의 중량을 기준으로 순수한 효소로 표시되며, 달리 명시하지 않는 한 성분은 전체 조성물의 중량을 기준으로 표시된다.
A. 벡터
본 개시내용은 본 명세서에 기재된 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 또는 이들의 융합 폴리펩타이드를 발현하기 위한 하나 이상의 벡터를 제공하거나 또는 본 명세서에 기재된 구성요소를 암호화하는 핵산이 벡터에 혼입될 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 벡터는 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 또는 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 본 개시내용은 또한 편집 주형 RNA 또는 이의 임의의 부분, 예를 들어, RNA 가이드 또는 RT 공여체 RNA를 암호화하는 하나 이상의 벡터를 제공한다. 일부 실시형태에서, 벡터는 Pol II 프로모터 또는 Pol III 프로모터를 포함한다.
천연 또는 합성 폴리뉴클레오타이드의 발현은 전형적으로 관심 유전자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드, 예를 들어, CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 또는 융합 폴리펩타이드 및/또는 편집 주형 RNA를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 프로모터에 작동 가능하게 연결시키고, 작제물을 발현 벡터에 혼입시킴으로써 달성된다. 발현 벡터는 본 발명의 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하며 진핵생물 세포 내에서의 복제 및 통합에 적합할 수 있는 한 특별히 제한되지 않는다.
전형적인 발현 벡터는 목적하는 폴리뉴클레오타이드의 발현에 유용한 전사 및 번역 종결자, 개시 서열 및 프로모터를 포함한다. 예를 들어, RNA 폴리머레이스에 대한 인식 서열을 운반하는 플라스미드 벡터(pSP64, pBluescript 등)가 사용될 수 있다. 렌티바이러스와 같은 레트로바이러스로부터 유래된 것들을 포함하는 벡터는 이식유전자의 장기적이고 안정적인 통합 및 이의 딸 세포에서의 증식을 허용하므로 장기간 유전자 전달을 달성하는 데 적합한 도구이다. 벡터의 예는 발현 벡터, 복제 벡터, 프로브 생성 벡터 및 시퀀싱 벡터를 포함한다. 발현 벡터는 바이러스 벡터의 형태로 세포에 제공될 수 있다.
바이러스 벡터 기술은 당업계에 잘 알려져 있으며, 다양한 바이러스학 및 분자생물학 매뉴얼에 기술되어 있다. 벡터로서 유용한 바이러스는 파지 바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스, 헤르페스 바이러스 및 렌티바이러스를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일반적으로, 적합한 벡터는 적어도 하나의 유기체에서 기능적인 복제 기점, 프로모터 서열, 편리한 제한 엔도뉴클레이스 부위 및 하나 이상의 선별 마커를 포함한다.
벡터의 종류는 특별히 제한되지 않으며, 숙주 세포에서 발현될 수 있는 벡터가 적절하게 선택될 수 있다. 보다 구체적으로는, 숙주 세포의 종류에 따라, 폴리뉴클레오타이드로부터 폴리펩타이드(들)의 발현을 보장하기 위한 프로모터 서열이 적절하게 선택되고, 발현 벡터의 제조를 위해 이 프로모터 서열 및 폴리뉴클레오타이드가 임의의 다양한 플라스미드 등에 삽입된다.
추가적인 프로모터 요소, 예를 들어, 강화 서열은 전사 개시의 빈도를 조절한다. 전형적으로, 이들은 시작 부위의 상류의 30bp 내지 110bp 영역에 위치하지만, 최근에는 다수의 프로모터가 시작 부위의 하류에도 기능적 요소를 포함하는 것으로 나타났다. 프로모터에 따라, 개별 요소는 전사를 활성화시키기 위해 협력적으로 또는 독립적으로 기능할 수 있는 것으로 보인다.
또한, 본 개시내용은 구성적 프로모터의 사용으로 제한되어서는 안 된다. 유도성 프로모터도 본 개시내용의 일부로서 상정된다. 유도성 프로모터의 사용은 발현이 요구될 때 작동 가능하게 연결된 폴리뉴클레오타이드 서열의 발현을 켜거나 또는 발현이 요구되지 않을 때 발현을 끌 수 있는 분자 스위치를 제공한다. 유도성 프로모터의 예는 메탈로티오닌 프로모터, 글루코코르티코이드 프로모터, 프로게스테론 프로모터 및 테트라사이클린 프로모터를 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
도입될 발현 벡터는 또한 바이러스 벡터를 통해 형질감염 또는 감염시키려는 세포 집단으로부터 발현 세포의 확인 및 선택을 용이하게 하기 위해 선별 마커 유전자 또는 리포터 유전자 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 다른 양태에서, 선별 마커는 별도의 DNA 조각에 운반되어 공동 형질감염 절차에 사용될 수 있다. 선별 마커 및 리포터 유전자는 모두 숙주 세포에서 발현 가능하도록 적절한 전사 제어 서열과 측접할 수 있다. 이러한 마커의 예는 진핵생물 세포 배양의 경우 다이하이드로폴레이트 리덕테이스 유전자 및 네오마이신 저항성 유전자; 및 대장균 및 다른 세균 배양의 경우 테트라사이클린 저항성 유전자 및 암피실린 저항성 유전자를 포함한다. 이러한 선별 마커를 사용함으로써, 본 발명의 폴리펩타이드(들)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 숙주 세포에 전달되어 반드시 발현되는지 여부를 확인할 수 있다.
재조합 발현 벡터의 제조 방법은 특별히 제한되지 않으며, 이의 예는 플라스미드, 파지 또는 코스미드를 사용하는 방법을 포함한다.
B. 발현 방법
본 개시내용은 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소를 번역하는 단계 및 본 명세서에 기재된 편집 주형 RNA를 발현하는 단계를 포함하는 단백질 발현 방법을 포함한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 숙주 세포는 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA를 발현시키는 데 사용된다. 숙주 세포는 특별히 제한되지 않으며, 바람직하게는 다양한 공지된 세포가 사용된다. 숙주 세포의 특정 예는 대장균과 같은 세균, 효모(출아 효모인 사카로마이세스 세레비시아에(Saccharomyces cerevisiae) 및 분열 효모인 스키조사카로마이세스 폼베(Schizosaccharomyces pombe)), 선충류(카에노랍디티스 엘레간스(Caenorhabditis elegans)), 제노푸스 라에비스(Xenopus laevis) 난모세포 및 동물 세포(예를 들어, CHO 세포, COS 세포 및 HEK293 세포)를 포함한다. 위에 기재된 발현 벡터를 숙주 세포에 전달하는 방법, 즉, 형질전환 방법은 특별히 제한되지 않으며, 전기천공법, 칼슘 포스페이트 방법, 리포솜 방법 및 DEAE 덱스트란 방법과 같은 공지된 방법이 사용될 수 있다.
숙주가 발현 벡터로 형질전환된 후, 숙주 세포는 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA의 생산을 위해 배양(cultured), 재배(cultivated) 또는 육종(bred)될 수 있다. CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA의 발현 후, 숙주 세포가 수집되고, CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA가 배양물 등으로부터 통상적인 방법(예를 들어, 여과, 원심분리, 세포 파괴, 겔 여과 크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피 등)에 따라 정제될 수 있다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소 발현을 위한 방법은 폴리펩타이드(들)의 적어도 5개의 아미노산, 적어도 10개의 아미노산, 적어도 15개의 아미노산, 적어도 20개의 아미노산, 적어도 50개의 아미노산, 적어도 100개의 아미노산, 적어도 150개의 아미노산, 적어도 200개의 아미노산, 적어도 250개의 아미노산, 적어도 300개의 아미노산, 적어도 400개의 아미노산, 적어도 500개의 아미노산, 적어도 600개의 아미노산, 적어도 700개의 아미노산, 적어도 800개의 아미노산, 적어도 900개의 아미노산 또는 적어도 1000개의 아미노산의 번역을 포함한다. 일부 실시형태에서, 단백질 발현을 위한 방법은 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소의 약 5개의 아미노산, 약 10개의 아미노산, 약 15개의 아미노산, 약 20개의 아미노산, 약 50개의 아미노산, 약 100개의 아미노산, 약 150개의 아미노산, 약 200개의 아미노산, 약 250개의 아미노산, 약 300개의 아미노산, 약 400개의 아미노산, 약 500개의 아미노산, 약 600개의 아미노산, 약 700개의 아미노산, 약 800개의 아미노산, 약 900개의 아미노산, 약 1000개의 아미노산 이상의 번역을 포함한다.
숙주 세포에서 성숙 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA의 생산 수준을 결정하기 위해 다양한 방법이 사용될 수 있다. 이러한 방법은, 예를 들어, 본 명세서의 다른 곳에 기재된 바와 같은 단백질 또는 표지 태그에 특이적인 다중클론 또는 단일클론 항체를 이용하는 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 예시적인 방법은 효소결합 면역흡착 검정(ELISA), 방사면역검정(MA), 형광 면역검정(FIA) 및 형광 활성화 세포 분류(FACS)를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 이들 및 다른 검정은 당업계에 잘 알려져 있다(예를 들어, 문헌[Maddox et al., J. Exp. Med. 158:1211 [1983]] 참조).
본 개시내용은 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA를 암호화하는 폴리리보뉴클레오타이드를 숙주 세포에 제공하는 단계(여기서, 폴리리보뉴클레오타이드는 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA를 암호화함), 세포에서 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA를 발현시키는 단계 및 세포로부터 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA를 얻는 단계를 포함하는, 세포에서의 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소 및/또는 편집 주형 RNA의 생체내 발현 방법을 제공한다.
III. 유전자 편집 방법
임의의 유전자 편집 시스템은 관심 유전자 부위, 예를 들어, 유전적 편집이 필요한 유전자 부위일 수 있는 표적 핵산을 유전적으로 변형(편집)시키기 위해, 예를 들어, 유전적 돌연변이를 고정시키기 위해, 보호 돌연변이를 도입하기 위해, 유전자 발현을 조절하기 위한 변형을 도입하기 위해 사용될 수 있다.
본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템 및 조성물 편집을 다양한 표적 서열에 편집하고 도입하는 데 적용 가능하다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 DNA 유전자좌와 같은 DNA 분자이다(본 명세서에서 표적 서열 또는 표적 적중(on-target) 서열로도 지칭됨). 일부 실시형태에서, 표적 서열은 RNA 유전자좌 또는 mRNA와 같은 RNA이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 단일-가닥(예를 들어, 단일-가닥 DNA)이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 이중-가닥(예를 들어, 이중-가닥 DNA)이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 단일-가닥 및 이중-가닥 영역을 모두 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 선형이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 원형이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 메틸화된 뉴클레오타이드, 손상된 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 유사체와 같은 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드를 포함한다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 변형되지 않는다. 일부 실시형태에서, 단일-가닥 표적 서열은 PAM 서열이 필요하지 않다.
표적 서열은 약 100bp, 200bp, 500bp, 1000bp, 2000bp, 5000bp, 10kb, 20kb, 50kb, 100kb, 200kb, 500kb, 1Mb 이상 중 적어도 어느 하나와 같은 임의의 길이일 수 있다. 표적 서열은 또한 임의의 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 적어도 약 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65% 이상의 GC 함량 중 어느 하나를 갖는 것과 같이 GC가 풍부하다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 적어도 약 70%, 80% 이상의 GC 함량을 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 GC가 풍부하지 않은 표적 서열에 있는 GC가 풍부한 단편이다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 GC가 풍부하지 않다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 하나 이상의 2차 구조 또는 더 높은 차수의 구조를 갖는다. 일부 실시형태에서, 표적 서열은 리보핵단백질에 의해 표적 서열에 접근할 수 없도록 하기 위해 염색질에서와 같은 응축된 상태가 아니다.
일부 실시형태에서, 표적 핵산은 세포의 게놈 부위이다. 일부 경우에, 유전적 편집이 일어나는 표적 핵산은 단백질-코딩 영역에 있을 수 있다. 대안적으로, 표적 핵산은 프로모터, 인핸서, 5' 또는 3' 비번역 영역과 같은 조절 영역에 있을 수 있다. 다른 경우에, 표적 핵산은 트랜스포존, miRNA, tRNA, 리보솜 RNA, 리보자임 또는 lincRNA와 같은 논코딩 유전자에 있을 수 있다.
A. 유전적 편집을 위한 예시적인 유전자
본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템은 표적 관심 유전자, 예를 들어, 질환(예를 들어, 유전자 질환)과 관련된 유전자를 편집하는 데 사용될 수 있다. 일부 실시형태에서, 표적 유전자는 대상체에서 면역반응에 관여하는 유전자일 수 있다. 예를 들어, 표적 유전자는 면역관문 유전자일 수 있다.
예시적인 표적 유전자는 BCL11A 인트론 적혈구 인핸서, CD3, 베타-2 마이크로글로불린(B2M), T 세포 수용체 알파 불변영역(T Cell Receptor Alpha Constant: TRAC), 예정 세포사 1(PDCD1), T-세포 수용체 알파, T-세포 수용체 베타, B-세포 림프종/백혈병 11A(BCL11A), 세포독성 T-림프구 항원 4(CTLA-4), 케모카인(C-C 모티프) 수용체 5(유전자/유사유전자)(CCR5), CXCR4 유전자, CD160 분자(CD160), 아데노신 A2a 수용체(ADORA), CD276, B7-H3, B7-H4, BTLA, 나이코틴아마이드 아데닌 다이뉴클레오타이드 포스페이트 NADPH 옥시데이스 아이소형 2(NOX2), T 세포 활성화의 V-도메인 Ig 억제인자(VISTA), 시알산-결합 면역글로불린-유형 렉틴 7(SIGLEC7), 시알산-결합 면역글로불린-유형 렉틴 9(SIGLEC9), SIGLEC10, T 세포 활성화 저해인자 1을 포함하는 V-세트 도메인(VTCN1), B 및 T 림프구 감쇠기(BTLA), 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스(IDO), 인돌아민 2,3-다이옥시게네이스 1(IDO1), 살해-세포 면역글로불린-유사 수용체(KIR), 살해 세포 면역글로불린-유사 수용체, 3개 도메인, 긴 세포질 꼬리, 1(KIR3DL1), 림프구-활성화 유전자 3(LAG3), T-세포 면역글로불린 도메인 및 뮤신 도메인 3(TIM3), A형 간염 바이러스 세포 수용체 2(HAVCR2), 자연 살해 세포 수용체 2B4(CD244), 하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼레이스 1(HPRT), Ig 및 ITIM 도메인을 갖는 T-세포 면역수용체(TIGIT), CD96 분자(CD96), 세포독성 및 조절 T-세포 분자(CRTAM), 백혈구 관련 면역글로불린 유사 수용체 1(LAIR1), 아데노-관련 바이러스 통합 부위 1(AAVS1), AAVS 2, AAVS3, AAVS4, AAVS5, AAVS6, AAVS7, AAVS8, 형질전환 성장 인자 베타 수용체 II(TGFBRII), 형질전환 성장 인자 베타 수용체 I(TGFBR1), SMAD 패밀리 구성원 2(SMAD2), SMAD 패밀리 구성원 3(SMAD3), SMAD 패밀리 구성원 4(SMAD4), SKI 전암 유전자(SKI), SKI-유사 전암 유전자(SKIL), egl-9 패밀리 저산소증-유도 인자 1(EGLN1), egl-9 패밀리 저산소증-유도 인자 2(EGLN2), egl-9 패밀리 저산소증-유도 인자 3(EGLN3), 단백질 포스파테이스 1 조절 서브유닛 12C(PPP1R12C), TGFB 유도 인자 호메오박스 1(TGIF1), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원, 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10b(TNFRSF10B), 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리 구성원 10a(TNFRSF10A), BY55, B7H5, 카스페이스 8(CASP8), 카스페이스 10(CASP10), 카스페이스 3(CASP3), 카스페이스 6(CASP6), 카스페이스 7(CASP7), 사멸 도메인을 통해 회합된 Fas(FADD), Fas 세포 표면 사멸 수용체(FAS), 인터류킨 10 수용체 서브유닛 알파(IL10RA), 인터류킨 10 수용체 서브유닛 베타(IL10RB), 헴 옥시게네이스 2(HMOX2), 인터류킨 6 수용체(IL6R), 인터류킨 6 신호 전달인자(IL6ST), c-src 타이로신 카이네이스(CSK), 글리코스핑고지질 마이크로도메인 1을 갖는 인단백질 막 앵커(PAG1), 구아닐레이트 사이클레이스 1, 가용성, 베타 3(GUCY1B3), 신호전달 역치 조절 막횡단 어댑터 1(SIT1), 포크헤드 박스 P3(FOXP3), PR 도메인 1(PRDM1), 염기성 류신 지퍼 전사 인자, ATF-유사(BATF), 구아닐레이트 사이클레이스 1, 가용성, 알파 2(GUCY1A2), 구아닐레이트 사이클레이스 1, 가용성, 알파 3(GUCY1A3), 구아닐레이트 사이클레이스 1, 가용성, 베타 2(GUCY1B2), 단백질의 프롤릴 하이드록실레이스 도메인(PHD1, PHD2, PHD3) 패밀리, CD27, CD28, CD40, CD122, CD137, OX40, GITR 및 ICOS를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 변형된 유전자는 예정사 리간드 1(PD-L1), 클래스 II 주요 조직적합성 복합체 전사촉진인자(CIITA), 시트라말릴-CoA 라이에이스(CLYBL), 트랜스티레틴(TTR), 락테이트 데하이드로게네이스-A(LDHA), 하이드록시산 옥시데이스-1(hydroxyacid oxidase 1: HAO1), 알라닌-글리옥실레이트 및 세린-피루베이트 아미노트랜스퍼레이스(AGXT), 글리옥실레이트 리덕테이스/하이드록시피루베이트 리덕테이스(GRHPR), 4-하이드록시-2-옥소글루타레이트 알돌레이스(HOGA), 폴리피리미딘 관 결합 단백질 1(PTBP1), 스타트민 2(STMN2) 또는 액틴 베타(ACTB)이다.
본 개시내용은 또한 본 명세서에 개시된 바와 같은 유전자 편집 시스템을 사용하여 본 명세서에 개시된 바와 같은 임의의 표적 유전자를 유전자 편집하는 방법을 제공한다.
B. 편집
일부 양태에서, 본 명세서에 기재된 유전자 편집 시스템을 사용하여 적어도 하나의 편집을 표적 핵산(예를 들어, 본 명세서에 개시된 임의의 표적 유전자와 같은 관심 게놈 부위)에 도입하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 일부 실시형태에서, 편집은 표적 핵산에 대한 치환, 삽입, 결실 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 편집은 G에서 T로의 치환, G에서 A로의 치환, G에서 C로의 치환, T에서 G로의 치환, T에서 A로의 치환, T에서 C로의 치환, C에서 G로의 치환, C에서 T로의 치환, C에서 A로의 치환, A에서 T로의 치환, A에서 G로의 치환 또는 A에서 C로의 치환과 같은 단일 뉴클레오타이드 치환일 수 있다. 일부 예에서, 편집은 G:C 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, G:C 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, G:C 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, T:A 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, T:A 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, T:A 염기쌍을 C:G 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 G:C 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, C:G 염기쌍을 A:T 염기쌍으로, A:T 염기쌍을 T:A 염기쌍으로, A:T 염기쌍을 G:C 염기쌍으로 또는 A:T 염기쌍을 C:G 염기쌍으로 전환할 수 있다.
일부 실시형태에서, 적어도 하나의 편집을 표적 핵산에 도입하기 위한 방법이 기술되되, 편집은 적어도 하나의 치환, 적어도 하나의 삽입 및/또는 적어도 하나의 결실이다. 일부 실시형태에서, 편집은 적어도 하나의 치환, 삽입 또는 결실을 포함한다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 적어도 8개, 적어도 9개, 적어도 10개, 적어도 11개, 적어도 12개, 적어도 13개, 적어도 14개, 적어도 15개, 적어도 16개, 적어도 17개, 적어도 18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 30개, 적어도 40개, 적어도 50개, 적어도 60개, 적어도 70개, 적어도 80개, 적어도 90개, 적어도 100개, 적어도 200개, 적어도 300개, 적어도 400개 또는 적어도 500개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 i1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드 또는 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 5개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드 내지 10개의 뉴클레오타이드, 10개의 뉴클레오타이드 내지 15개의 뉴클레오타이드, 15개의 뉴클레오타이드 내지 20개의 뉴클레오타이드, 20개의 뉴클레오타이드 내지 25개의 뉴클레오타이드, 25개의 뉴클레오타이드 내지 30개의 뉴클레오타이드, 30개의 뉴클레오타이드 내지 35개의 뉴클레오타이드, 35개의 뉴클레오타이드 내지 40개의 뉴클레오타이드, 40개의 뉴클레오타이드 내지 45개의 뉴클레오타이드, 45개의 뉴클레오타이드 내지 50개의 뉴클레오타이드, 50개의 뉴클레오타이드 내지 55개의 뉴클레오타이드, 55개의 뉴클레오타이드 내지 60개의 뉴클레오타이드, 60개의 뉴클레오타이드 내지 65개의 뉴클레오타이드, 65개의 뉴클레오타이드 내지 70개의 뉴클레오타이드, 70개의 뉴클레오타이드 내지 75개의 뉴클레오타이드, 75개의 뉴클레오타이드 내지 80개의 뉴클레오타이드, 80개의 뉴클레오타이드 내지 85개의 뉴클레오타이드, 85개의 뉴클레오타이드 내지 90개의 뉴클레오타이드, 90개의 뉴클레오타이드 내지 95개의 뉴클레오타이드, 95개의 뉴클레오타이드 내지 100개의 뉴클레오타이드, 100개의 뉴클레오타이드 내지 105개의 뉴클레오타이드, 105개의 뉴클레오타이드 내지 110개의 뉴클레오타이드, 110개의 뉴클레오타이드 내지 115개의 뉴클레오타이드, 115개의 뉴클레오타이드 내지 120개의 뉴클레오타이드, 120개의 뉴클레오타이드 내지 125개의 뉴클레오타이드, 125개의 뉴클레오타이드 내지 130개의 뉴클레오타이드, 130개의 뉴클레오타이드 내지 135개의 뉴클레오타이드, 135개의 뉴클레오타이드 내지 140개의 뉴클레오타이드, 140개의 뉴클레오타이드 내지 145개의 뉴클레오타이드, 145개의 뉴클레오타이드 내지 150개의 뉴클레오타이드, 150개의 뉴클레오타이드 내지 155개의 뉴클레오타이드, 155개의 뉴클레오타이드 내지 160개의 뉴클레오타이드, 160개의 뉴클레오타이드 내지 165개의 뉴클레오타이드, 165개의 뉴클레오타이드 내지 170개의 뉴클레오타이드, 170개의 뉴클레오타이드 내지 175개의 뉴클레오타이드, 175개의 뉴클레오타이드 내지 180개의 뉴클레오타이드, 180개의 뉴클레오타이드 내지 185개의 뉴클레오타이드, 185개의 뉴클레오타이드 내지 190개의 뉴클레오타이드, 190개의 뉴클레오타이드 내지 195개의 뉴클레오타이드, 195개의 뉴클레오타이드 내지 200개의 뉴클레오타이드, 200개의 뉴클레오타이드 내지 210개의 뉴클레오타이드, 210개의 뉴클레오타이드 내지 220개의 뉴클레오타이드, 220개의 뉴클레오타이드 내지 230개의 뉴클레오타이드, 230개의 뉴클레오타이드 내지 240개의 뉴클레오타이드, 240개의 뉴클레오타이드 내지 250개의 뉴클레오타이드, 250개의 뉴클레오타이드 내지 260개의 뉴클레오타이드, 260개의 뉴클레오타이드 내지 270개의 뉴클레오타이드, 270개의 뉴클레오타이드 내지 280개의 뉴클레오타이드, 280개의 뉴클레오타이드 내지 290개의 뉴클레오타이드 또는 290개의 뉴클레오타이드 내지 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 최대 약 10,000개의 염기쌍(10kb) 길이이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 치환, 삽입 또는 결실은 1개의 염기쌍, 약 10개의 염기쌍, 약 20개의 염기쌍, 약 30개의 염기쌍, 약 40개의 염기쌍, 약 50개의 염기쌍, 약 60개의 염기쌍, 약 70개의 염기쌍, 약 80개의 염기쌍, 약 90개의 염기쌍, 약 100개의 염기쌍, 약 200개의 염기쌍, 약 300개의 염기쌍, 약 400개의 염기쌍, 약 500개의 염기쌍, 약 600개의 염기쌍, 약 700개의 염기쌍, 약 800개의 염기쌍, 약 900개의 염기쌍, 약 1kb, 약 1.1kb, 약 1.2kb, 약 1.3kb, 약 1.4kb, 약 1.5kb, 약 1.6kb, 약 1.7kb, 약 1.8kb, 약 1.9kb, 약 2kb, 약 2.1kb, 약 2.2kb, 약 2.3kb, 약 2.4kb, 약 2.5kb, 약 2.6kb, 약 2.7kb, 약 2.8kb, 약 2.9kb, 3kb, 4kb, 5kb, 6kb, 7kb, 8kb, 9kb 또는 10kb 길이이다.
일부 실시형태에서, 삽입은 헤어핀이거나 또는 이를 포함한다. 예를 들어, 역전사효소는 표적 핵산에 혼입될 수 있는 헤어핀을 전사할 수 있다. 다른 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 헤어핀 구조를 포함하고, 역전사효소는 헤어핀에서 역전사 주형 서열의 전사를 중단시킨다.
일부 실시형태에서, 편집은 유형 II PAM 서열(예를 들어, SpCas9의 경우 5'-NGG-3') 또는 유형 V PAM 서열(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드의 경우 5'-NTTN-3')의 약 500개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열에 인접하여, 예를 들어, PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 500개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 약 400개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 400개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 약 300개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 300개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류 또는 하류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다.
일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 300개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 290개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 280개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 270개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 260개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 250개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 240개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 230개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 2020개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 210개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 190개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 180개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 170개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 160개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 150개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 140개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 130개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 120개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 110개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 90개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 80개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 70개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 60개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 40개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 9개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 8개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 7개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 6개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 4개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 3개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 2개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 1개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다.
일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 1개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 2개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 3개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 4개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 6개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 7개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 8개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 9개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 11개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 12개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 13개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 14개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 15개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 16개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 17개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 18개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 19개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 21개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 22개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 23개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 24개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 25개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 26개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 27개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 28개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 29개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 시작된다.
일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 300개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 290개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 280개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 270개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 260개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 250개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 240개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 230개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 2020개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 210개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 190개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 180개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 170개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 160개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 150개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 140개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 130개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 120개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 110개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 90개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 80개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 70개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 60개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 40개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 9개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 8개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 7개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 6개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 4개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 3개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 2개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 1개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다.
일부 실시형태에서, 편집은 PAM 서열에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 1개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 2개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 3개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 4개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 6개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 7개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 8개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 9개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 11개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 12개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 13개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 14개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 15개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 16개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 17개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 18개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 19개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 21개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 22개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 23개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 24개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 25개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 26개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 27개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 28개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 29개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다. 일부 실시형태에서, 편집은 PAM의 하류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 끝난다.
C. 비-PAM 가닥 편집
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 바와 같은 적합한 유전자 편집 시스템, 예를 들어, 도 5, 도 6a, 도 6b, 도 7, 도 8a, 도 12a 또는 도 12b에 도시된 것들을 사용하여 적어도 하나의 편집을 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 도입하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 적어도 하나의 편집은 유전자 편집 시스템에 포함된 역전사 주형 서열을 사용하여 처음에 비-PAM 가닥에 도입될 수 있다. 세포 DNA 복구 기구를 통해, 적어도 하나의 편집이 결국 표적 핵산의 양쪽 가닥에 도입될 것이다. 유전자 편집 시스템은 (a) CRISPR 뉴클레이스 결합 서열, (b) DNA-결합 서열 및 (c) RT 공여체 RNA를 포함하는 비-PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA를 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, RT 공여체 RNA는 PBS 및 역전사 주형 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, RT 공여체 RNA의 역전사 주형 서열의 5'에서 3' 전사를 통해 적어도 하나의 편집을 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 도입하기 위한 방법 및 유전자 편집 시스템 또는 조성물이 기술된다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열의 5'에서 3' 전사를 통해 적어도 하나의 편집을 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 도입하기 위한 방법 및 조성물이 기술된다.
일부 실시형태에서, RT 공여체 RNA(예를 들어, 편집 주형 RNA의 RT 공여체 RNA)의 PBS는 비-PAM 가닥(PBS-표적화 부위)의 영역에 결합한다. 역전사 주형 서열은 비-PAM 가닥에 혼입될 편집을 포함한다. 일부 예에서, 역전사 주형은 PAM-가닥과의 서열 유사성을 포함한다. 일부 예에서, 역전사 주형은 PAM 가닥의 서열에 대한 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 비-PAM 가닥은 염기-페어링을 통해 RT 공여체 RNA의 PBS에 결합하고, 역전사효소(예를 들어, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체)는 카피 역전사 주형 서열을 카피한다. 상보적 게놈 가닥과의 염기-페어링으로 다시 가닥을 교환한 후, 편집이 표적 핵산에 혼입된다.
일부 실시형태에서, 비-PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA는, 5'에서 3'로, 다음 구성요소: CRISPR 뉴클레이스 결합 서열, DNA-결합 서열, 역전사 주형 서열 및 PBS를 포함한다(예를 들어, 도 5, 도 6a, 도 6b, 도 8a 및 도 12a 참조). 일부 실시형태에서, 비-PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA는, 5'에서 3'로, 다음 구성요소: 역전사 주형 서열, PBS, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열(스페이서) 또는, 5'에서 3'로, 다음 구성요소: 역전사 주형 서열, PBS, 링커, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열을 포함한다(도 7 및 도 12b).
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 DNA-결합 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 DNA-결합 서열의 5' 연장부이다(도 5, 도 6a, 도 6b, 도 8a 및 도 12a). 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 DNA-결합 서열과 PBS에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 PBS의 3' 연장부이다(도 7 및 도 12b). 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 유형 II CRISPR 뉴클레이스에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 유형 V CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i1, Cas12i2, Cas12i3 또는 Cas12i4 폴리펩타이드와 같은 Cas12i 폴리펩타이드)에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 crRNA 처리 활성이 결여되어 있는 CRISPR 뉴클레이스에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 직접 반복 서열(예를 들어, Cas9 직접 반복 서열 또는 Cas12i 직접 반복 서열)이다.
일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열과 PBS에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열의 3' 연장부이다(도 5, 도 6a, 도 6b, 도 7, 도 8a, 도 12a 및 도 12b). 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 RNA 서열, DNA 서열 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열을 포함할 수 있다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 35개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다.
일부 실시형태에서, PBS는 역전사 주형 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, PBS는 역전사 주형 서열의 3' 연장부이다(도 5, 도 6a, 도 6b, 도 7, 도 8a, 도 12a 및 도 12b). 일부 실시형태에서, PBS는 역전사 주형 서열과 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개 또는 110개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열 및 PBS는 표적 핵산의 동일한 가닥(예를 들어, 비-PAM 가닥)에 결합한다.
일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS와 DNA-결합 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS의 5' 연장부이다(도 5, 도 6a, 도 6b, 도 8a 및 도 12a). 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 DNA-표적화 서열의 3' 연장부이다(도 5, 도 6a, 도 6b, 도 8a 및 도 12a). 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS의 5' 연장부이다(도 7 및 도 12b). 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개 또는 120개의 뉴클레오타이드 길이이다.
일부 실시형태에서, 비-PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA는 DNA-결합 서열과 PBS가 표적 핵산에 결합될 때 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 루프를 포함한다. 도 6a, 도 6b, 도 8a 및 도 12a를 참조한다. 일부 실시형태에서, 비-PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA는 PBS에 인접한 루프를 포함한다. 도 7 및 도 12b를 참조한다. 일부 실시형태에서, 루프는 역전사 주형 서열을 포함하며 PBS가 뒤따른다. 일부 실시형태에서, PBS는 표적 핵산의 비-PAM 가닥에 대한 상보성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프의 서열은 PAM 가닥과의 서열 유사성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 루프는 PAM 가닥의 서열에 대한 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 편집은 치환, 삽입 또는 결실이다. 일부 실시형태에서, 루프는 헤어핀을 포함한다.
D. PAM 가닥 편집
일부 실시형태에서, 도 1a, 도 1b, 도 2, 도 3, 도 4 또는 도 10에 도시된 것들과 같은 본 명세서에 개시된 적합한 유전자 편집 시스템을 사용하여 적어도 하나의 편집을 표적 핵산(예를 들어, 관심 게놈 부위)의 PAM 가닥에 도입하기 위한 방법이 본 명세서에 제공된다. 이러한 방법은 (a) CRISPR 뉴클레이스 결합 서열, (b) DNA-결합 서열, 및 (c) 및 RT 공여체 RNA를 포함할 수 있는 PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA의 사용을 포함할 수 있다(도 1a, 도 1b, 도 2 및 도 10). 일부 예에서, PAM 가닥을 표적으로 하는 조성물은 RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 포함한다(도 3 및 도 4). 일부 예에서, RT 공여체 RNA는 PBS 및 역전사 주형 서열을 포함한다.
일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열의 5'에서 3' 전사를 통해 적어도 하나의 편집을 표적 핵산의 PAM 가닥에 도입하기 위한 방법 및 조성물이 기술된다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열의 5'에서 3' 전사를 통해 적어도 하나의 편집을 표적 핵산의 PAM 가닥에 도입하기 위한 방법 및 조성물이 기술된다.
일부 경우에, RT 공여체 RNA(예를 들어, 편집 주형 RNA의 RT 공여체 RNA)의 PBS는 PAM 가닥에 결합한다. RT 공여체 RNA의 역전사 주형 서열은 PAM 가닥에 혼입될 편집을 포함한다. 일부 예에서, 역전사 주형은 비-PAM 가닥과의 서열 유사성을 포함한다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형은 비-PAM 가닥의 서열에 대한 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, PAM 가닥은 염기-페어링을 통해 RT 공여체 RNA의 PBS에 결합할 수 있고, 역전사효소(예를 들어, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체)는 역전사 주형 서열을 카피한다. 상보적 게놈 가닥과의 염기-페어링으로 다시 가닥을 교환한 후, 편집이 표적 핵산에 혼입된다.
일부 실시형태에서, PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA는, 5'에서 3'로, 다음 구성 요소: CRISPR 뉴클레이스 결합 서열, DNA-결합 서열, 역전사 주형 서열 및 PBS를 포함한다(도 1a, 도 1b 및 도 10). 일부 실시형태에서, PAM 가닥을 표적으로 하는 편집 주형 RNA는, 5'에서 3'로, 다음 구성요소: 역전사 주형 서열, PBS, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열 또는, 5'에서 3'로, 다음 구성요소: 역전사 주형 서열, PBS, 링커, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열을 포함한다(도 2).
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 DNA-결합 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열의 3' 연장부이다(도 1a, 도 1b, 도 2 및 도 10). 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 DNA-결합 서열과 PBS에 인접해 있다(도 2). 일부 실시형태에서 DNA-결합 서열은 PBS의 3' 연장부이다(도 2). 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 유형 II CRISPR 뉴클레이스에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 유형 V CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i1, Cas12i2, Cas12i3 또는 Cas12i4 폴리펩타이드와 같은 Cas12i 폴리펩타이드)에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 crRNA 처리 활성이 결여되어 있는 CRISPR 뉴클레이스에 결합한다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 직접 반복 서열(예를 들어, Cas9 직접 반복 서열 또는 Cas12i 직접 반복 서열)이다.
일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열의 3' 연장부이다(도 1a, 도 1b, 도 2 및 도 10). 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열과 역전사 주형 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 DNA-결합 서열의 3' 연장부이다(도 10). 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 RNA 서열, DNA 서열 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열이다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 35개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열은 스페이서 서열이다.
일부 실시형태에서, PBS는 역전사 주형 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, PBS는 역전사 주형 서열의 3' 연장부이다(도 1a, 도 2, 도 1b 및 도 10). 일부 실시형태에서, PBS는 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 PBS의 3' 연장부이다(도 2). 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, PBS는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개 또는 110개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, DNA-결합 서열 및 PBS는 표적 핵산의 상이한 가닥에 결합한다(예를 들어, DNA-결합 서열은 표적 가닥에 결합하고, PBS는 PAM 가닥에 결합함).
일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 DNA-결합 서열에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 DNA-결합 서열의 3' 연장부이다(도 1a, 도 1b 및 도 10). 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS에 인접해 있다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 PBS의 5' 연장부이다(도 1a, 도 1b, 도 2). 일부 실시형태에서, PBS는 역전사 주형 서열의 3' 연장부이다(도 10). 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 실시형태에서, 역전사 주형 서열은 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개 또는 120개의 뉴클레오타이드 길이이다.
E. 세포 내 유전자 편집
일부 양태에서, 본 명세서에 또한 개시된 바와 같은 적합한 유전자 편집 시스템을 사용하여 세포에서 관심 게놈 부위(예를 들어, 본 명세서에 개시된 바와 같은 표적 유전자)를 편집하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 이 방법을 수행하기 위해, 유전자 편집 시스템은 세포 집단에 전달되거나 또는 도입될 수 있다. 일부 경우에, 목적하는 유전자 편집을 포함하는 세포는 수집되고, 선택적으로 배양되고, 시험관내에서 확장될 수 있다.
본 명세서에 기재된 세포는 다양한 세포일 수 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 단리된 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 세포 배양물 또는 두 가지 이상의 세포 유형의 공동 배양물에 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 생체외에 있다. 일부 실시형태에서, 세포는 살아있는 유기체로부터 얻어지고, 세포 배양물에서 유지된다. 일부 실시형태에서, 세포는 단일-세포 유기체이다.
일부 실시형태에서, 세포는 원핵생물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 세균 세포이거나 또는 세균 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 고세균 세포이거나 또는 고세균 세포로부터 유래된다.
일부 실시형태에서, 세포는 진핵생물 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 식물 세포이거나 또는 식물 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 진균 세포이거나 또는 진균 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 동물 세포이거나 또는 동물 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 무척추동물 세포이거나 또는 무척추동물 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 척추동물 세포이거나 또는 척추동물 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포이거나 또는 포유동물 세포로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 인간 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 제브라 피쉬 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 영장류 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 설치류 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 합성적으로 만들어지며, 때로는 인공 세포라고도 불린다.
일부 실시형태에서, 세포는 세포주로부터 유래된다. 조직 배양을 위한 매우 다양한 세포주가 당업계에 공지되어 있다. 세포주의 예는 293T, MF7, K562, HeLa, CHO 및 이들의 형질전환 변이체를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 세포주는 당업자에게 공지된 다양한 공급원으로부터 입수 가능하다(예를 들어, 아메리칸 타입 컬처 컬렉션(American Type Culture Collection: ATCC)(버니지아주 머내서스 소재) 참조). 일부 실시형태에서, 세포는 불멸이거나 또는 불멸화된 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 전능성(totipotent) 줄기 세포(예를 들어, 전능성(omnipotent)), 만능성(pluripotent) 줄기 세포, 다능성(multipotent) 줄기 세포, 협능성(oligopotent) 줄기 세포 또는 단능성(unipotent) 줄기 세포와 같은 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 유도 만능성 줄기 세포(induced pluripotent stem cell: iPSC)이거나 또는 iPSC로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 중간엽 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 배아 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 조혈 줄기 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 분화된 세포이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 분화된 세포는 근육 세포(예를 들어, 근세포(myocyte)), 지방 세포(예를 들어, 지방세포(adipocyte)), 골세포(예를 들어, 골아세포(osteoblast), 골세포(osteocyte), 파골세포(osteoclast)), 혈액 세포(예를 들어, 단핵구, 림프구, 호중구, 호산구, 호염기구, 마크로파지, 적혈구 또는 혈소판), 신경 세포(예를 들어, 뉴런), 상피 세포, 면역세포(예를 들어, 림프구, 호중구, 단핵구 또는 마크로파지), 간 세포(liver cell 또는 hepatocyte), 섬유아세포 또는 성세포(sex cell)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 최종적으로 분화된 세포이다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 최종적으로 분화된 세포는 신경 세포, 지방세포, 심근세포, 골격근 세포, 표피 세포 또는 장 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 신경교세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 알파 세포, 베타 세포, 델타 세포 또는 장크롬친화성 세포를 포함하는 췌장 섬 세포이다. 일부 실시형태에서, 세포는 면역세포이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 T 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 B 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 자연 살해(Natural Killer: NK) 세포이다. 일부 실시형태에서, 면역세포는 종양 침윤 림프구(Tumor Infiltrating Lymphocyte: TIL)이다. 일부 실시형태에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포 또는 영장류 세포 또는 뮤린 세포이다. 일부 실시형태에서, 뮤린 세포는 야생형 마우스, 면역 반응 억제 마우스 또는 질환-특이적 마우스 모델로부터 유래된다. 일부 실시형태에서, 세포는 살아있는 조직, 기관 또는 유기체 내의 세포이다.
일부 실시형태에서, 세포는 1차 세포이다. 예를 들어, 1차 세포의 배양은 0회, 1회, 2회, 4회, 5회, 10회, 15회 이상 계대될 수 있다. 일부 실시형태에서, 1차 세포는 임의의 공지된 방법에 의해 개체로부터 수거된다. 예를 들어, 백혈구는 성분채집술, 백혈구성분채집술, 밀도 구배 분리 등에 의해 수거될 수 있다. 피부, 근육, 골수, 비장, 간, 췌장, 폐, 장, 위 등과 같은 조직으로부터의 세포는 생검에 의해 수거될 수 있다. 수거된 세포의 분산 또는 현탁을 위해 적절한 용액이 사용될 수 있다. 이러한 용액은 저농도의 허용 가능한 완충액과 함께 송아지 태아 혈청 또는 기타 자연 발생적 인자가 편리하게 보충된 일반적으로 균형 잡힌 염 용액(예를 들어, 일반 식염수, 인산 완충 식염수(PBS), 행크의 균형 잡힌 염 용액 등)일 수 있다. 완충액은 HEPES, 포스페이트 완충액, 락테이트 완충액 등을 포함할 수 있다. 세포는 즉시 사용될 수 있거나 또는 보관될 수 있다(예를 들어, 동결에 의해). 동결된 세포는 해동될 수 있고, 재사용할 수 있다. 세포는 DMSO, 혈청, 배지 완충액(예를 들어, 10% DMSO, 50% 혈청, 40% 완충 배지) 및/또는 동결 온도에서 세포를 보존하는 데 사용되는 몇몇 다른 이러한 일반적인 용액에서 동결될 수 있다.
본 명세서에 개시된 유전자 편집 시스템이 복수의 세포에 도입되는 실시형태에서, 세포의 적어도 약 0.5%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 1%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 2%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 3%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 4%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 5%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 10%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 20%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 30%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 40%가 목적하는 편집을 포함한다. 일부 실시형태에서, 세포의 적어도 약 50%가 목적하는 편집을 포함한다.
예를 들어, 본 명세서에 또한 개시된 임의의 유전자 편집 시스템을 사용하여 본 명세서에 개시된 방법에 의해 생산된 목적하는 유전적 편집을 보유한 세포도 본 개시내용의 범위 내에 있다. 일부 경우에, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및 편집 주형 RNA에 의해 변형된 세포는 생체분자를 제조하기 위한 발현 시스템으로서 유용할 수 있다. 예를 들어, 변형된 세포는 단백질(예를 들어, 사이토카인, 항체, 항체-기반 분자), 펩타이드, 지질, 탄수화물, 핵산, 아미노산 및 바이타민과 같은 생체분자를 생산하는 데 유용할 수 있다. 다른 실시형태에서, 변형된 세포는 렌티바이러스, 아데노바이러스, 아데노-관련 바이러스 및 종양 용해성 바이러스 벡터와 같은 바이러스 벡터의 생산에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 세포독성 연구에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 질환 모델로서 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 백신 생산에 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 치료에 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 변형된 세포는 수혈 및 이식과 같은 세포 요법에 유용할 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 및 편집 주형 RNA에 의해 변형된 세포는 변형된 게놈 서열을 포함하는 신규한 세포주를 확립하는 데 유용할 수 있다. 일부 실시형태에서, 본 개시내용의 변형된 세포는 변형된 줄기 세포의 결실을 포함하는 하나 이상의 세포 계통으로 분화되는 변형된 줄기 세포(예를 들어, 변형된 전능성/전능성 줄기 세포, 변형된 만능성 줄기 세포, 변형된 다능성 줄기 세포, 변형된 협능성 줄기 세포 또는 변형된 단능성 줄기 세포)이다. 본 개시내용은 본 개시내용의 변형된 세포를 포함하거나 또는 이로부터 생성된 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 균류)를 추가로 제공한다.
F. 세포로의 유전자 편집 시스템의 전달
일부 실시형태에서, 임의의 유전자 편집 시스템 또는 이의 구성요소는, 예를 들어, 담체 및/또는 중합체성 담체, 예를 들어, 리포솜 또는 지질 나노입자와 같은 담체를 포함하여 제형화될 수 있고, 공지된 방법에 의해 세포(예를 들어, 원핵생물, 진핵생물, 식물, 포유동물 등)에 전달될 수 있다. 이러한 방법은 형질감염(예를 들어, 지질-매개성, 양이온성 중합체, 칼슘 포스페이트, 덴드리머); 전기천공법 또는 막 파괴의 다른 방법(예를 들어, 뉴클레오펙션(nucleofection)), 바이러스 전달(예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, AAV), 미세주입, 미세입자 투사("유전자 총(gene gun)"), 퓨진(fugene), 직접 초음파 로딩(direct sonic loading), 세포 압착, 광학 형질감염, 원형질체 융합, 임페일펙션(impalefection), 마그네토펙션(magnetofection), 엑소솜-매개성 전달, 지질 나노입자-매개성 전달 및 이들의 임의의 조합을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
일부 실시형태에서, 방법은 하나 이상의 핵산(예를 들어, CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소, 편집 주형 RNA(예를 들어, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA) 등을 암호화하는 핵산), 이의 하나 이상의 전사체 및/또는 미리 형성된 리보핵단백질을 세포에 전달하는 단계를 포함한다. 예시적인 세포내 전달 방법은 바이러스 또는 바이러스-유사 작용제; 칼슘 포스페이트, 덴드리머, 리포솜 또는 양이온성 중합체(예를 들어, DEAE-덱스트란 또는 폴리에틸렌이민)를 사용하는 것과 같은 화학-기반 형질감염 방법; 미세주입, 전기천공법, 세포 압착, 초음파 천공, 광학 형질감염, 임페일펙션, 원형질체 융합, 세균 접합, 플라스미드 또는 트랜스포존의 전달과 같은 비화학적 방법; 유전자 총, 마그네토펙션 또는 자성 보조 형질감염, 입자 충격을 사용하는 것과 같은 입자-기반 방법; 및 뉴클레오펙션과 같은 하이브리드 방법을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 실시형태에서, 본 출원은 이러한 방법에 의해 생산된 세포 및 이러한 세포를 포함하거나 또는 이로부터 생산된 유기체(예컨대, 동물, 식물 또는 균류)를 추가로 제공한다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 DNA 복구 또는 DNA 복구 기구에 영향을 미치는 작용제(예를 들어, 화합물, 분자 또는 생체분자)와 함께 추가로 전달된다. 일부 실시형태에서, 본 발명의 조성물은 세포 주기에 영향을 미치는 작용제(예를 들어, 화합물, 분자 또는 생체분자)와 함께 추가로 전달된다.
일부 실시형태에서, CRISPR 뉴클레이스 또는 CRISPR 뉴클레이스와 역전사효소(예를 들어, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체)를 포함하는 제1 조성물이 세포에 전달된다. 일부 실시형태에서, RNA 가이드 또는 RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA(예를 들어, 편집 주형 RNA)를 포함하는 제2 조성물이 세포에 전달된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제2 조성물이 세포와 접촉되기 전에 세포와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제2 조성물이 세포와 접촉되는 것과 동시에 세포와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제2 조성물이 세포와 접촉된 후 세포와 접촉된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 제1 전달 방법에 의해 전달되고, 제2 조성물은 제2 전달 방법에 의해 전달된다. 일부 실시형태에서, 제1 전달 방법은 제2 전달 방법과 동일하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 조성물과 제2 조성물은 바이러스 전달을 통해 전달된다. 일부 실시형태에서, 제1 전달 방법은 제2 전달 방법과 상이하다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 제1 조성물은 바이러스 전달에 의해 전달되고, 제2 조성물은 지질 나노입자-매개성 전달에 의해 전달되고, 제2 조성물은 바이러스 전달에 의해 전달되거나 또는 제1 조성물은 지질 나노입자-매개성 전달에 의해 전달되고, 제2 조성물은 바이러스 전달에 의해 전달된다.
IV. 치료적 응용
본 명세서에 개시된 바와 같은 이러한 유전자 편집 시스템을 사용하여 생성된 임의의 유전자 편집 시스템 또는 변형된 세포는 유전자 편집 시스템에 의해 도입되거나 또는 변형된 세포에 의해 운반되는 유전자 편집으로부터 이익을 얻을 수 있는 질환을 치료하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 질환은 유전자 질환일 수 있으며, 유전자 편집은 유전자 질환과 관련된 유전자 돌연변이를 고친다. 대안적으로, 질환은 유전자의 비정상적인 발현과 관련이 있을 수 있으며, 유전자 편집은 이러한 비정상적인 발현을 구제한다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템을 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 환자)에게 투여하는 단계를 포함하는, 질환을 치료하는 방법이 본 명세서에 제공된다. 유전자 편집 시스템은 유전자 편집이 필요한 특정 조직 또는 특정 유형의 세포에 전달될 수 있다. 유전자 편집 시스템은 구성요소 중 하나 이상을 포함하는 LNP, 구성요소 중 하나 이상을 암호화하는 하나 이상의 벡터(예를 들어, 바이러스 벡터) 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 유전자 편집 시스템의 구성요소는 하나 이상의 약제학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있는 약제학적 조성물을 형성하도록 제형화될 수 있다.
일부 실시형태에서, 본 명세서에 개시된 임의의 유전자 편집 시스템을 사용하여 생산된 변형된 세포는 치료를 필요로 하는 대상체(예를 들어, 인간 환자)에게 투여될 수 있다. 변형된 세포는 본 명세서에 기재된 치환, 삽입 및/또는 결실을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 변형된 세포는 CRISPR 뉴클레이스, 역전사효소 폴리펩타이드 및 편집 주형 RNA(예를 들어, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA)에 의해 변형된 세포주를 포함할 수 있다. 일부 경우에, 변형된 세포는 다양한 유형의 유전자 편집을 갖는 세포를 포함하는 이종 집단일 수 있다. 대안적으로, 변형된 세포는 하나의 특정 유전자 편집을 포함하는 실질적으로 균질한 세포 집단(예를 들어, 전체 집단 중 적어도 80%의 세포)을 포함할 수 있다. 일부 예에서, 세포는 적합한 배지에 현탁될 수 있다.
일부 실시형태에서, 유전자 편집 시스템 또는 이의 구성요소 또는 변형된 세포를 포함하는 조성물이 본 명세서에 제공된다. 이러한 조성물은 약제학적 조성물일 수 있다. 유용한 약제학적 조성물은 경구, 직장, 질, 비경구, 국소, 폐, 비강내, 병변내, 협측, 안구, 정맥내, 기관내 또는 또 다른 투여 경로에 적합한 제형으로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 본 개시내용의 약제학적 조성물은 단일 단위 용량 또는 복수의 단일 단위 용량으로 대량으로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "단위 용량"은 미리 결정된 수의 세포를 포함하는 약제학적 조성물의 개별적인 양이다. 세포의 수는 일반적으로 대상체에게 투여될 세포의 투여량과 동일하거나 또는, 예를 들어, 이러한 투여량의 1/2 또는 1/3과 같은 투여량의 편리한 분율(fraction)과 동일하다.
비경구 투여에 적합한 약제학적 조성물의 제형은 멸균수 또는 멸균 등장성 식염수와 같은 약제학적으로 허용 가능한 담체와 조합된 활성제(예를 들어, 유전자 편집 시스템 또는 이의 구성요소 또는 변형된 세포)를 포함할 수 있다. 이러한 제형은 볼루스 투여 또는 연속 투여에 적합한 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 일부 주사용 제형은 보존제를 포함하는 앰풀 또는 다회 투여 용기와 같은 단위 투여 형태로 제조, 패키징 또는 판매될 수 있다. 비경구 투여를 위한 일부 제형은 현탁액, 용액, 유성 또는 수성 비히클 중 에멀션, 페이스트 및 이식형 지속 방출 또는 생분해성 제형을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 일부 제형은 현탁제, 안정화제 또는 분산제를 포함하지만 이에 제한되지 않는 하나 이상의 추가적인 성분을 추가로 포함할 수 있다.
약제학적 조성물은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁액 또는 용액의 형태일 수 있다. 이러한 현탁액 또는 용액은 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있고, 세포 이외에 본 명세서에 기재된 분산제, 습윤제 또는 현탁제와 같은 추가적인 성분을 포함할 수 있다. 이러한 멸균 주사용 제형은 물 또는 식염수와 같은 무독성의 비경구적으로 허용 가능한 희석제 또는 용매를 사용하여 제조될 수 있다. 다른 허용 가능한 희석제 및 용매는 링거 용액, 등장성 소듐 클로라이드 용액 및 합성 모노- 또는 다이-글리세리드와 같은 고정유를 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 유용한 기타 비경구적으로 투여 가능한 제형은 패키징된 형태로, 리포솜 제제로 또는 생분해성 중합체 시스템의 구성요소로서 세포를 포함할 수 있는 것들을 포함한다. 지속 방출 또는 이식을 위한 일부 조성물은 에멀션, 이온 교환 수지, 난용성 중합체 또는 난용성 염과 같은 약제학적으로 허용 가능한 중합체성 또는 소수성 물질을 포함할 수 있다.
V. 키트 및 이의 용도
본 개시내용은 또한, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 방법을 수행하기 위해 사용될 수 있는 키트 또는 시스템을 제공한다. 일부 실시형태에서, 키트 또는 시스템은 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스) 및 역전사효소를 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트 또는 시스템은 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스) 및 역전사효소를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하고, 선택적으로 폴리뉴클레오타이드는, 예를 들어, 본 명세서에 기재된 바와 같은 벡터 내에 포함된다. 일부 실시형태에서, 키트 또는 시스템은 유형 V 뉴클레이스-역전사효소 융합 폴리펩타이드(예를 들어, Cas12i2-RT 융합체 또는 Cas12i4-RT 융합체와 같은 Cas12i-역전사효소 융합 폴리펩타이드)를 포함한다. 키트 또는 시스템은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 역전사효소 및 편집 주형 RNA(예를 들어, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA)를 포함할 수 있다. 본 발명의 키트 또는 시스템의 RNA 가이드 및/또는 RT 공여체 RNA는 관심 서열을 표적화하도록 설계될 수 있다. CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스), 역전사효소 및 편집 주형 RNA(예를 들어, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA)는 키트 또는 시스템 내의 동일한 바이알 또는 다른 용기에 패키징될 수 있거나 또는 사용하기 전에 내용물이 혼합될 수 있는 별도의 바이알 또는 다른 용기에 패키징될 수 있다. 키트 또는 시스템은 선택적으로 편집 주형 RNA(예를 들어, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA)와 함께 CRISPR 뉴클레이스(예를 들어, Cas12i 폴리펩타이드와 같은 유형 V 뉴클레이스) 및 역전사효소의 사용을 위한 완충액 및/또는 지침을 추가적으로 포함할 수 있다.
일부 실시형태에서, 키트는 CRISPR 뉴클레이스 또는 CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소(예를 들어, CRISPR 뉴클레이스-역전사효소 융합체)를 포함하는 제1 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 키트는 RNA 가이드 또는 RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA(예를 들어, 편집 주형 RNA)를 포함하는 제2 조성물을 포함한다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 동일한 바이알 내에 패키징된다. 일부 실시형태에서, 제1 조성물 및 제2 조성물은 상이한 바이알 내에 패키징된다.
일부 실시형태에서, 키트는 연구 목적으로 유용할 수 있다. 예를 들어, 일부 실시형태에서, 키트는 유전자 기능을 연구하는 데 유용할 수 있다.
본 명세서에 인용된 모든 참조문헌 및 간행물은 참조에 의해 본 명세서에 원용된다.
추가적인 실시형태
본 개시내용의 범위 내에 있는 추가적인 실시형태도 아래에 제공된다.
실시형태 1: 다음을 포함하는 조성물:
(a) 선택적으로 Cas12 폴리펩타이드인, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산;
(b) 유형 V 뉴클레이스 결합 서열(예를 들어, 직접 반복 서열) 및 DNA-결합 서열(예를 들어, 스페이서 서열)을 포함하는, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 암호화하는 핵산;
(c) 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산; 및
(d) 프라이머 결합을 포함하는 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA).
실시형태 1에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스는 Cas12a(Cpf1), Cas12b(C2c1), Cas12c, Cas12d, Cas12e, Cas12f, Cas12h, Cas12i 또는 Cas12j(CasPhi) 폴리펩타이드일 수 있다. 일부 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드는 Cas12i 폴리펩타이드이며, 선택적으로 Cas12i1 폴리펩타이드 또는 변이형 Cas12i1 폴리펩타이드, Cas12i2 폴리펩타이드 또는 변이형 Cas12i2 폴리펩타이드, Cas12i3 폴리펩타이드 또는 변이형 Cas12i3 폴리펩타이드 또는 Cas12i4 폴리펩타이드 또는 변이형 Cas12i4 폴리펩타이드를 포함한다.
실시형태 2: 실시형태 1의 조성물은 다음 중 하나일 수 있는 Cas12i 폴리펩타이드를 포함할 수 있다:
(a) Cas12i1 폴리펩타이드는 서열번호 8과 적어도 80%의 동일성; 선택적으로 서열번호 8과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(b) Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성; 선택적으로 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고;
(c) Cas12i3 폴리펩타이드는 서열번호 11과 적어도 80%의 동일성; 선택적으로 서열번호 11과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
(d) Cas12i4 폴리펩타이드는 서열번호 9와 적어도 80%의 동일성 또는 서열번호 10과 적어도 80%의 동일성; 선택적으로 서열번호 9와 적어도 95%의 동일성 또는 서열번호 10과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다.
특정 예에서, 실시형태 2의 조성물은 다음 중 하나를 포함한다:
(a) Cas12i1 폴리펩타이드는 서열번호 8에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
(b) Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나에 제시된 아미노산 서열을 포함하고;
(c) Cas12i3 폴리펩타이드는 서열번호 11에 제시된 아미노산 서열을 포함하고; 그리고
(d) Cas12i4 폴리펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10에 제시된 아미노산 서열을 포함한다.
본 명세서에 개시된 실시형태 2의 임의의 조성물은 감소된 crRNA 처리 활성을 갖거나 또는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 예를 들어, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드는 Cas12i2 폴리펩타이드이되, Cas12i2 폴리펩타이드는 H485 또는 H486 위치에 치환을 포함한다. 일부 경우에, Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 포함하되, Cas12i2 폴리펩타이드는 H485 또는 H486 위치에 치환을 포함한다. 일부 예에서, Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 포함하되, Cas12i2 폴리펩타이드는 H485 또는 H486 위치에 치환을 포함한다.
본 명세서에 개시된 실시형태 2의 임의의 조성물은 에피토프 펩타이드, 핵 국재화 신호 및 핵외 수송 신호 중 적어도 하나를 포함하는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 포함할 수 있다.
일부 예에서, 실시형태 2의 조성물은 다음 중 하나를 포함한다:
(a) Cas12i1 폴리펩타이드는 서열번호 8과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 95%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나와 적어도 80%(예를 들어, 적어도 95%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 15 내지 17 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(c) Cas12i3 폴리펩타이드는 서열번호 11과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 95%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 18 내지 20 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 그리고
(d) Cas12i4 폴리펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 80%(예를 들어, 적어도 95%)의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
일부 예에서, 실시형태 2의 조성물 다음 중 하나를 포함한다:
(a) Cas12i1 폴리펩타이드는 서열번호 8과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 12 내지 14 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(b) Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2 내지 7 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 15 내지 17 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고;
(c) Cas12i3 폴리펩타이드는 서열번호 11과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 18 내지 20 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함하고; 그리고
(d) Cas12i4 폴리펩타이드는 서열번호 9 또는 서열번호 10과 적어도 95%의 동일성을 갖는 아미노산 서열을 포함하고, 직접 반복 서열은 서열번호 21 내지 24 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
실시형태 3: 본 명세서에 개시된 실시형태 1 또는 실시형태 2의 임의의 조성물의 스페이서 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 예에서, 스페이서 서열은 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 35개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 예에서, 스페이서 서열은 표적 핵산의 표적 가닥(예를 들어, 표적 서열의 상보적 서열)에 실질적으로 상보적이다. 일부 예에서, 표적 서열은 비표적 가닥의 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 인접해 있다.
실시형태 4: 실시형태 1, 2 또는 3의 임의의 조성물은 Cas12i 폴리펩타이드인 유형 V 뉴클레이스를 포함할 수 있고, PAM 서열은 5'-NTTN-3'으로 제시된 서열을 포함하되, N은 임의의 뉴클레오타이드이다.
실시형태 5: 임의의 이전 실시형태의 임의의 조성물에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 MMLV-RT, MMTV-RT, 마라톤-RT 또는 RTX 역전사효소를 포함한다.
실시형태 6: 임의의 실시형태 1 내지 5의 임의의 조성물에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드에 융합된다. 일부 예에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드의 N-말단에 융합된다. 다른 예에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드의 C-말단에 융합된다. 또 다른 예에서, 역전사효소 폴리펩타이드는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드의 루프 내에 삽입된다.
실시형태 7: 임의의 실시형태 1 내지 5의 임의의 조성물에서, 역전사효소 폴리펩타이드 및 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드는 류신 지퍼, 나노바디, 항체 또는 이중 코일 도메인을 통해 복합체를 형성한다.
실시형태 8: 임의의 실시형태 1 내지 7의 임의의 조성물에서, RT 공여체 RNA는 RNA 가이드에 융합될 수 있다. 일부 예에서, RT 공여체 RNA는 RNA 가이드의 5' 말단에 융합될 수 있다. 다른 예에서, RT 공여체 RNA는 RNA 가이드의 3' 말단에 융합될 수 있다. 일부 경우에, RNA 가이드의 스페이서 서열은 RT 공여체 RNA의 역전사 주형 서열에 인접해 있다. 대안적으로, RNA 가이드의 스페이서 서열은 RT 공여체 RNA의 PBS에 인접해 있다. 다른 경우에, RNA 가이드의 직접 반복 서열은 RT RNA 공여체의 역전사 주형 서열에 인접해 있다. 대안적으로, RNA 가이드의 직접 반복 서열은 RT 공여체 RNA의 PBS에 인접해 있다.
일부 예에서, RT 공여체 RNA-RNA 가이드 융합체 폴리뉴클레오타이드는 링커를 추가로 포함할 수 있다. 일부 경우에, 링커는 직접 반복 서열과 PBS 사이에 있다. 다른 경우에, 링커는 스페이서 서열과 역전사 주형 서열 사이에 있다. 링커는 약 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 일부 예에서, 링커는 헤어핀을 포함한다.
실시형태 9: 실시형태 1 내지 8 중 어느 하나의 임의의 조성물에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이일 수 있다. 예를 들어, PBS는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개 또는 110개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 경우에, PBS는 비표적 가닥(PAM 가닥)의 자유 3' 말단과 혼성화(염기-페어링을 통해 결합)한다. 다른 경우에, PBS는 표적 가닥(비-PAM 가닥)의 자유 3' 말단과 혼성화한다.
실시형태 10: 실시형태 1 내지 9 중 어느 하나의 임의의 조성물에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, 역전사 주형 서열은 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개 또는 120개의 뉴클레오타이드 길이이다.
실시형태 11: 실시형태 1 내지 10 중 어느 하나의 임의의 조성물에서, PBS는 표적 핵산의 표적 가닥 또는 비표적 가닥(이중-가닥)에 대한 실질적인 상보성을 갖는다. 예를 들어, PBS는 표적 핵산의 표적 가닥 또는 비표적 가닥과 적어도 약 75%의 상보성을 포함한다. 다른 예에서, PBS는 표적 핵산의 표적 가닥 또는 비표적 가닥과 적어도 약 85%의 상보성을 포함한다. 다른 예에서, PBS는 표적 핵산의 표적 가닥 또는 비표적 가닥과 적어도 약 95%의 상보성을 포함한다.
실시형태 12: 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나의 임의의 조성물에서, 역전사 주형 서열은 압타머를 포함한다. 일부 경우에, 압타머는 역전사효소 폴리펩타이드를 동원한다.
실시형태 13: 실시형태 1 내지 11 중 어느 하나의 임의의 조성물에서, 역전사 주형은, 예를 들어, 5' 말단 또는 3' 말단에 변형을 포함한다. 일부 예에서, 변형은 화학적 변형이다. 다른 예에서, 변형은 2차 구조를 포함하는 핵산 서열이다. 특정 예에서, 변형은 헤어핀, 슈도노트, 삼중 구조, 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA이다. 다른 특정 예에서, 변형은 뉴클레이스 결합 서열(예를 들어, 하나 이상의 직접 반복 서열) 또는 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열(스페이서)을 포함한다.
실시형태 1 내지 13 중 어느 하나의 임의의 조성물은 표적 가닥 또는 비표적 가닥에 편집을 도입할 수 있다. 일부 예에서, 편집은 치환, 삽입 또는 결실이다. 일부 경우에, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 치환이다. 일부 경우에, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 치환이다. 일부 경우에, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 치환이다. 다른 경우에, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 삽입, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 삽입, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 삽입이다. 일부 예에서, 삽입은 헤어핀을 포함한다. 또 다른 경우에, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 결실이다. 예를 들어, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 결실이다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열의 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 일례에서, 편집은 PAM 서열의 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 또 다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 또 다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다. 또 다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, 예를 들어, PAM 서열의 상류에 있는 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나거나 또는 PAM 서열의 하류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, 예를 들어, PAM 서열의 하류에 있는 약 25개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열을 제거하거나 또는 변경한다. 일부 예에서, 편집은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드에 의한 재표적화를 방지(예를 들어, 표적 서열에 대한 유형 V CRISPR 뉴클레이스의 결합을 방지)한다.
실시형태 14: 실시형태 1 내지 13의 임의의 조성물에서, 표적 서열은 세포에 존재한다.
실시형태 15: 실시형태 1 내지 14의 임의의 조성물은 세포로의 전달을 위해 제형화될 수 있다. 일부 예에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포이다. 일례에서, 세포는 간 세포(예를 들어, 간세포)이다.
일부 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 암호화하는 핵산, 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 RT 공여체 RNA는 단일 전달 비히클로 제형화된다.
다른 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 암호화하는 핵산, 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 RT 공여체 RNA는 2개 이상의 전달 비히클로 제형화된다.
또 다른 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 단일 전달 비히클로 제형화된다.
일부 예에서, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA는 단일 전달 비히클로 제형화된다. 일부 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 제1 전달 비히클로 제형화되고, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA는 제2 전달 비히클로 제형화된다.
실시형태 16: 실시형태 1 내지 15 중 어느 하나의 임의의 조성물에서, 적용 가능한 경우, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드, 역전사효소 폴리펩타이드, RNA 가이드 및/또는 RT 공여체 RNA는 하나 이상의 벡터, 예를 들어, 하나 이상의 발현 벡터에서 암호화된다.
실시형태 17: 임의의 실시형태 1 내지 16의 조성물의 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드, 역전사효소 폴리펩타이드, RNA 가이드 및/또는 RT 공여체 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터.
실시형태 18: 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 조성물 또는 실시형태 17의 벡터를 포함하는 세포. 일부 예에서, 세포는 포유동물 세포, 예를 들어, 인간 세포이다. 일례에서, 세포는 간 세포(예를 들어, 간세포)이다.
실시형태 19: 실시형태 17의 벡터를 발현시키는 방법.
실시형태 20: 실시형태 1 내지 17 중 어느 하나의 조성물을 생산하는 방법.
실시형태 21: 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 조성물을 전달하는 방법.
일부 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 암호화하는 핵산, 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 RT 공여체 RNA는 단일 전달 비히클로 전달된다.
다른 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산, RNA 가이드 또는 RNA 가이드를 암호화하는 핵산, 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 RT 공여체 RNA는 2개 이상의 전달 비히클로 전달된다.
또 다른 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 단일 전달 비히클로 전달된다.
일부 경우에, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA는 단일 전달 비히클로 전달된다.
특정 예에서, 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산은 제1 전달 비히클로 전달되고, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA는 제2 전달 비히클로 전달된다.
실시형태 22: 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 조성물을 표적 핵산에 결합시키는 방법. 일부 예에서, 표적 핵산은 세포, 예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포에 존재한다. 일례에서, 세포는 간 세포(예를 들어, 간세포)이다.
실시형태 23: 표적 핵산을 실시형태 1 내지 16 중 어느 하나의 조성물과 접촉시키는 단계를 포함하는, 편집을 표적 핵산에 도입하는 방법. 일부 예에서, 조성물은 편집을 표적 핵산의 표적 가닥 또는 비표적 가닥에 도입한다. 일부 경우에, 편집은 치환, 삽입 또는 결실이다.
특정 예에서, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 치환, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 치환 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 치환이다. 다른 특정 예에서, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 삽입, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 삽입이다. 일부 경우에, 삽입은 헤어핀을 포함한다. 또 다른 특정 예에서, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 결실, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 결실이다.
일부 경우에, 편집은 PAM 서열의 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 발생하고, 예를 들어, PAM 서열의 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 발생하고, PAM 서열의 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 발생하고, PAM 서열의 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 발생하거나 또는 PAM 서열의 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 발생한다.
일부 경우에, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 상류에 있는 예를 들어, PAM 서열의 상류에 있는 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나거나 PAM 서열의 상류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
대안적으로, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 25개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, 예를 들어, PAM 서열의 하류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나거나 또는 PAM 서열의 하류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열을 제거하거나 또는 변경한다.
실시형태 24: 편집 주형 RNA는,
(a) CRISPR 뉴클레이스 결합 서열;
(b) 표적 가닥 및 비표적 가닥을 포함하는 표적 핵산의 표적 가닥(예를 들어, 표적 서열의 상보적 서열)과 상보적인 DNA-결합 서열로서, 표적 서열은 비표적 가닥의 프로토스페이서 인접 모티프(PAM) 서열에 인접해 있는, 상기 DNA-결합 서열; 및
(c) 프라이머 결합 부위(PBS) 및 역전사 주형 서열을 포함하는 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA)로서, PBS는 표적 서열에 인접한 서열과 실질적으로 상보적이고, 역전사 주형 서열은 표적 핵산에 대해 적어도 하나의 암호화된 편집을 포함하는, 상기 역전사 공여체 RNA
를 포함하되, DNA-결합 서열과 PBS는 표적 핵산의 동일한 가닥에 결합한다.
실시형태 25: 실시형태 24의 편집 주형 RNA에서, DNA-결합 서열과 PBS는 표적 핵산의 표적 가닥(비-PAM 가닥)에 결합한다.
실시형태 26: 실시형태 24의 편집 주형 RNA에서, 적어도 하나의 암호화된 편집은 표적 핵산의 비표적 가닥(PAM 가닥)에 대한 것이다.
실시형태 27: 실시형태 24 내지 26 중 어느 하나의 편집 주형 RNA는 표적 핵산에 결합될 때 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 영역을 포함한다. 예를 들어, 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 영역은 DNA-결합 서열에 인접해 있다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 영역은 PBS에 인접해 있다. 일부 경우에, 짝을 이루지 않은 뉴클레오타이드의 영역은 역전사 주형 서열을 포함한다.
실시형태 28: 실시형태 24 내지 27 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열, PBS 및 역전사 주형 서열은 RNA 서열이다.
실시형태 29: 실시형태 24 내지 28 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 유형 II CRISPR 뉴클레이스에 결합한다.
실시형태 30: 실시형태 24 내지 28 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 결합한다. 일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 Cas12i 폴리펩타이드 또는 변이형 Cas12i 폴리펩타이드에 결합한다. 일부 경우에, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나와 적어도 80%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 결합한다. 일례에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드에 결합한다. 또 다른 예에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 서열번호 2 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드에 결합한다.
실시형태 31: 실시형태 24 내지 30 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 감소된 crRNA 처리 활성을 갖고 있거나 또는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있는 CRISPR 뉴클레이스에 결합한다.
실시형태 32: 실시형태 24 내지 31 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, 적용 가능한 경우, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 직접 반복 서열이다. 일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 Cas9 직접 반복 서열이다. 다른 예에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 Cas12i 직접 반복 서열이다. 일부 경우에, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 서열번호 12 내지 24 중 어느 하나와 적어도 90%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 예를 들어, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 서열번호 12 내지 24 중 어느 하나와 적어도 95%의 동일성을 갖는 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 일례에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 서열번호 12 내지 24 중 어느 하나에 제시된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다.
실시형태 33: 실시형태 24 내지 32 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, CRISPR 뉴클레이스 결합 서열은 DNA-결합 서열에 인접해 있다. 예를 들어, DNA-결합 서열은 CRISPR 뉴클레이스 결합 서열의 3' 연장부이다.
실시형태 34: 실시형태 24 내지 33 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, DNA-결합 서열은 RNA 서열, DNA 서열 또는 RNA/DNA 하이브리드 서열이다.
실시형태 35, 실시형태 24 내지 34 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, DNA-결합 서열(예를 들어, 스페이서 서열)은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 50개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다. 일부 예에서, DNA-결합 서열은 약 15개의 뉴클레오타이드 내지 약 35개의 뉴클레오타이드 길이를 포함한다.
실시형태 36, 실시형태 24 내지 35 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, DNA-결합 서열은 PBS에 인접해 있다. 일부 예에서, PBS는 DNA-결합 서열의 3' 연장부이다.
실시형태 37: 실시형태 24 내지 36 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, PBS는 약 3개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드 길이이다. 예를 들어, PBS는 약 3개, 4개, 5개, 6개, 7개, 8개, 9개, 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개 또는 110개의 뉴클레오타이드 길이이다.
실시형태 38: 실시형태 24 내지 37 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, PBS는 역전사 주형 서열에 인접해 있다. 일부 예에서, 역전사 주형 서열은 PBS의 3' 연장부이다.
실시형태 39: 실시형태 24 내지 38 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, 역전사 주형 서열은 약 10개의 뉴클레오타이드 내지 약 300개의 뉴클레오타이드 길이이다. 일부 예에서, 역전사 주형 서열은 약 10개, 15개, 20개, 25개, 30개, 35개, 40개, 45개, 50개, 55개, 60개, 65개, 70개, 75개, 80개, 85개, 90개, 95개, 100개, 105개, 110개, 115개 또는 120개의 뉴클레오타이드 길이이다.
실시형태 40: 실시형태 24 내지 39 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA는, 5'에서 3'로, 뉴클레이스 결합 서열, DNA-결합 서열, 역전사 주형 및 PBS를 포함할 수 있다.
실시형태 41: 실시형태 24 내지 39 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA는, 5'에서 3'로, 역전사 주형, PBS, 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열을 포함할 수 있다.
실시형태 42: 실시형태 24 내지 41 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, PBS의 3' 말단은 변형을 포함한다.
실시형태 43: 실시형태 24 내지 42 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA에서, 역전사 주형의 5' 말단은 변형을 포함한다.
실시형태 44: 실시형태 42 또는 43의 편집 주형 RNA에서, 변형은 화학적 변형이다.
실시형태 45: 실시형태 42 또는 43의 편집 주형 RNA에서, 변형은 2차 구조를 포함하는 핵산 서열이다. 예를 들어, 변형은 헤어핀, 슈도노트, 삼중 구조, xrRNA, tRNA 또는 절단형 tRNA이다.
실시형태 46: 실시형태 42 또는 43의 편집 주형 RNA에서, 변형은 뉴클레이스 결합 서열 또는 뉴클레이스 결합 서열 및 DNA-결합 서열을 포함한다.
실시형태 47: 실시형태 24 내지 47 중 어느 하나의 임의의 편집 주형 RNA는 치환, 삽입 또는 결실일 수 있는 편집을 유발할 수 있다. 일부 예에서, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 치환, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 치환 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 치환이다. 다른 예에서, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 삽입, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 삽입이다. 일부 경우에, 삽입은 헤어핀을 포함한다. 또 다른 예에서, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 결실, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 결실이다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열의 약 200개의 뉴클레오타이드 이내, 예를 들어, PAM 서열의 약 100개의 뉴클레오타이드 이내, PAM 서열의 약 50개의 뉴클레오타이드 이내, PAM 서열의 약 30개의 뉴클레오타이드 이내 또는 PAM 서열의 약 20개의 뉴클레오타이드 이내에 있다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, 예를 들어, PAM 서열의 상류에 있는 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나거나 또는 PAM 서열의 상류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다. 일례에서, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다. 또 다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 25개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열을 제거하거나 또는 변경한다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 편집은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드에 의한 재표적화를 방지한다(예를 들어, 표적 서열에 대한 유형 V CRISPR 뉴클레이스의 결합을 방지함).
실시형태 48: 실시형태 24 내지 47 중 어느 하나의 편집 주형 RNA는 세포, 예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포에 존재한다. 일례에서, 세포는 간 세포(예를 들어, 간세포)이다.
실시형태 49: 실시형태 24 내지 47 중 어느 하나의 편집 주형 RNA는 세포 예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포로의 전달을 위해 제형화된다. 일례에서, 세포는 간 세포(예를 들어, 간세포)이다. 일부 예에서, 편집 주형 RNA는 CRISPR 뉴클레이스 또는 CRISPR 뉴클레이스를 암호화하는 핵산과 함께 단일 전달 비히클로 제형화된다. 다른 예에서, 편집 주형 RNA는 CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 함께 단일 전달 비히클로 제형화된다.
실시형태 50: 실시형태 24 내지 49 중 어느 하나의 편집 주형 RNA는, 적용 가능한 경우, 벡터에 암호화된다.
실시형태 51: 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA를 암호화하는 서열을 포함하는 벡터.
실시형태 52: 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA를 포함하는 복합체. 일부 예에서, 복합체는 CRISPR 뉴클레이스를 포함한다. 다른 예에서, 복합체는 표적 서열 또는 표적 핵산을 포함한다. 또 다른 예에서, 복합체는 CRISPR 뉴클레이스 및 표적 서열 또는 표적 핵산을 포함한다.
일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스는 닉케이스이다. 다른 예에서, CRISPR 뉴클레이스는 DNA 이중체의 두 가닥을 모두 절단한다. 또 다른 예에서, CRISPR 뉴클레이스는 평활 절단(blunt cutting) 뉴클레이스이다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레이스는 점착 절단(staggered cutting) 뉴클레이스이다.
실시형태 53: 실시형태 24 내지 52 중 어느 하나의 편집 주형 RNA, 벡터 또는 복합체를 포함하는 세포. 일부 경우에, 세포는 인간 세포와 같은 포유동물 세포이다. 일례에서, 세포는 간 세포(예를 들어, 간세포)이다.
실시형태 54: 실시형태 31의 벡터를 발현시키는 방법.
실시형태 55: 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA를 생산하는 방법.
실시형태 56: 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA를 절단하는 방법. 일부 경우에, 편집 주형 RNA는 CRISPR 뉴클레이스 또는 CRISPR 뉴클레이스를 암호화하는 핵산과 함께 단일 전달 비히클로 제형화된다. 다른 예에서, 편집 주형 RNA는 CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산 및 역전사효소 폴리펩타이드 또는 역전사효소 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산과 함께 단일 전달 비히클로 제형화된다.
실시형태 57: 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA를 CRISPR 뉴클레이스와 결합시키는 방법.
실시형태 58: 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA를 표적 서열 또는 표적 핵산과 결합시키는 방법.
실시형태 59: 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA를 CRISPR 뉴클레이스 및 표적 서열 또는 표적 핵산과 결합시키는 방법.
실시형태 60: 표적 핵산을 실시형태 24 내지 50 중 어느 하나의 편집 주형 RNA 및 CRISPR 뉴클레이스와 접촉시키는 단계를 포함하는, 표적 핵산에 편집을 도입시키는 방법. 일부 경우에, CRISPR 뉴클레이스는 유형 II CRISPR 뉴클레이스이다. 다른 경우에, CRISPR은 유형 V CRISPR 뉴클레이스이다. 예를 들어, CRISPR 뉴클레이스는 Cas12i 폴리펩타이드 또는 변이형 Cas12i 폴리펩타이드이다. 특정 예에서, CRISPR 뉴클레이스는 임의의 서열번호 2 내지 11과 적어도 80%의 동일성, 예를 들어, 임의의 서열번호 2 내지 11과 적어도 95%의 동일성을 갖는 폴리펩타이드이다. 일례에서, CRISPR 뉴클레이스는 임의의 서열번호 2 내지 11의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드이다.
일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스는 감소된 crRNA 처리 활성을 포함하거나 또는 crRNA 처리 활성이 결여되어 있는 CRISPR 뉴클레이스이다.
일부 예에서, CRISPR 뉴클레이스는 닉케이스이다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레이스는 DNA 이중체의 두 가닥을 모두 절단한다. 일부 경우에, CRISPR 뉴클레이스는 평활 절단 뉴클레이스이다. 대안적으로, CRISPR 뉴클레이스는 점착 절단 뉴클레이스이다.
실시형태 61: 실시형태 60의 방법에서, 편집 주형 RNA는 편집을 표적 핵산의 표적 가닥에 도입한다. 일부 예에서, 편집은 치환, 삽입 또는 결실이다. 예를 들어, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 치환, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 치환 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 치환일 수 있다. 대안적으로, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 200개의 뉴클레오타이드의 삽입, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 삽입 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 삽입일 수 있다. 일부 경우에, 삽입은 헤어핀을 포함한다. 다른 예에서, 편집은 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 100개의 뉴클레오타이드의 결실, 예를 들어, 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 120개의 뉴클레오타이드의 결실 또는 1개의 뉴클레오타이드 내지 약 20개의 뉴클레오타이드의 결실일 수 있다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열의 약 200개의 뉴클레오타이드 이내, 예를 들어, PAM 서열의 약 100개의 뉴클레오타이드 이내, PAM 서열의 약 50개의 뉴클레오타이드 이내, PAM 서열의 약 30개의 뉴클레오타이드 이내 또는 PAM 서열의 약 20개의 뉴클레오타이드 이내에 있다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열의 상류에 있는 약 200개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, 예를 들어, PAM 서열의 상류에 있는 약 100개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 50개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 30개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 20개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나고, PAM 서열의 상류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝나거나 또는 PAM 서열의 상류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 5개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다. 일례에서, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 10개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다. 또 다른 예에서, 편집은 PAM 서열의 하류에 있는 약 25개의 뉴클레오타이드 내에서 시작되고/되거나 끝난다.
일부 예에서, 편집은 PAM 서열을 제거하거나 또는 변경한다. 대안적으로 또는 이에 더하여, 편집은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드에 의한 재표적화를 방지한다(예를 들어, 표적 서열에 대한 유형 V CRISPR 뉴클레이스의 결합을 방지함).
일부 예에서, 표적 핵산은 세포, 예를 들어, 인간 세포와 같은 포유동물 세포에 존재한다. 일례에서, 세포는 간 세포(예를 들어, 간세포)이다.
일반적인 기법
본 개시내용의 실시는 달리 명시하지 않는 한 당해 분야의 기술 내에 있는 분자생물학(재조합 기법 포함), 미생물학, 세포 생물학, 생화학 및 면역학의 통상적인 기법을 사용할 것이다. 이러한 기법은 문헌[Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook, et al., 1989) Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed. 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J. E. Cellis, ed., 1989) Academic Press; Animal Cell Culture (R. I. Freshney, ed. 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J. P. Mather and P. E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J. B. Griffiths, and D. G. Newell, eds. 1993-8) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D. M. Weir and C. C. Blackwell, eds.): Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J. M. Miller and M. P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel, et al. eds. 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis, et al., eds. 1994); Current Protocols in Immunology (J. E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C. A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practice approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J. D. Capra, eds. Harwood Academic Publishers, 1995); DNA Cloning: A practical Approach, Volumes I and II (D.N. Glover ed. 1985); Nucleic Acid Hybridization (B.D. Hames & S.J. Higgins eds.(1985); Transcription and Translation (B.D. Hames & S.J. Higgins, eds. (1984); Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed. (1986); Immobilized Cells and Enzymes (lRL Press, (1986); 및 B. Perbal, A practical Guide To Molecular Cloning (1984); F.M. Ausubel et al. (eds.)]과 같은 문헌에 자세히 설명되어 있다.
추가 설명 없이도, 당업자는 위의 설명에 기초하여 본 발명을 최대한 활용할 수 있다고 여겨진다. 따라서, 다음의 특정 실시형태는 단지 예시적인 것으로 해석되어야 하며, 어떤 식으로든 개시내용의 나머지 부분을 제한하지 않는 것으로 해석되어야 한다. 본 명세서에 인용된 모든 간행물은 본 명세서에 언급된 목적 또는 특허 대상에 참조에 의해 원용된다.
실시예
다음 실시예는 본 발명의 일부 실시형태를 추가로 설명하기 위해 제공되지만 본 발명의 범위를 제한하려는 의도는 아니며; 당업자에게 공지된 다른 절차, 방법론 또는 기법이 대안적으로 사용될 수 있다는 것이 이들의 예시적인 특성에 의해 이해될 것이다.
실시예 1 - 포유동물 세포에서 표적 가닥의 RNA-주형 편집
본 실시예는 포유동물 유전자의 표적 가닥 편집(예를 들어, 선택된 포유동물 유전자의 비-PAM 가닥에 결합하는 편집 주형 RNA를 사용)을 설명한다.
변이형 Cas12i2(서열번호 4)와 서열번호 29의 돌연변이 MMLV 역전사효소의 융합체를 pcda3.1 백본(Invitrogen)에 클로닝하였다. 변이형 Cas12i2에 대한 N-말단 및 C-말단 RT 융합체의 구성은 표 7에 나타나 있다. 변이형 Cas12i2와의 RT 융합체의 발현을 위한 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다(변이형 Cas12i2-RT 융합체 작업 용액).
표 8에 나타나 있고 도 8a에 도시된 바와 같은 다양한 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체 구성을 테스트하였다. 역전사 주형 서열 및 PBS를 RNA 가이드의 3' 말단에 융합시켰다. 치환, 삽입, 결실 또는 헤어핀을 AAVS1_T7 표적 또는 VEGFA_T5 표적에 도입하도록 역전사 주형 서열을 설계하였다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체의 서열은 표 9에 나타나 있으며, 부분적으로 도 8b에 도시되어 있다. 표 9 및 도 8b에서, "S"는 치환을 지칭하고, "I"는 삽입을 지칭하고, "D"는 결실을 지칭하고, "H"는 헤어핀을 지칭하며, PBS 길이는 괄호 안에 있다. 대조군으로 사용된 RNA 가이드의 서열만이 표 10에 나타나 있다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체 또는 RNA 가이드를 U6 프로모터가 있는 플라스미드 백본에 클로닝하고, 맥시 프렙(maxi-prep)하였다. 각각의 RNA 가이드를 발현하는 플라스미드/RT 공여체 RNA 플라스미드(또는 RNA 가이드)의 작업 용액을 물(편집 주형 RNA 작업 용액)에서 제조하였다.
형질감염 대략 16시간 전에, DMEM/10%FBS+Pen/Strep 중 25,000개의 HEK293T 세포를 w96-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 형질감염 당일, 세포는 70% 내지 90% 컨플루언트 상태였다. 형질감염될 각 웰에 Lipofectamine™ 2000(Themo Fisher)과 Opti-MEM™ 배지(Thermo Fisher)의 혼합물을 준비한 다음, 실온에서 5분 내지 20분 동안 인큐베이션하였다(용액 1). 인큐베이션 후, Lipofectamine™:OptiMEM™ 혼합물을 변이형 Cas12i2-RT 융합체 작업 용액, RNA 작업 용액 및 OptiMEM™ 배지를 포함하는 별도의 혼합물에 첨가하였다(용액 2). 용액 1과 용액 2의 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음, 실온에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액 1과 용액 2의 혼합물을 세포가 담긴 96 웰 플레이트의 각 웰에 적가하였다. 형질감염 72시간 후, 각 웰의 중앙에 TrypLE™(ThermoFisher)를 첨가하여 세포를 트립신 처리하고, 대략 5분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 성장 배지를 각 웰에 첨가하고, 혼합하여 세포를 재현탁시켰다. 그런 다음, 세포를 400g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. QuickExtract™ 완충액(Lucigen)을 원래 세포 현탁액 부피의 1/5 양으로 첨가하였다. 세포를 65℃에서 15분, 68℃에서 15분 및 98℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
2라운드의 PCR에 의해 차세대 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하였다. 1라운드(PCR1)를 사용하여 표적에 따라 특정 게놈 영역을 증폭시켰다. PCR1 산물을 칼럼 정제에 의해 정제하였다. 2라운드 PCR(PCR2)을 수행하여 Illumina 어댑터 및 인덱스를 추가하였다. 그런 다음, 반응물을 풀링하고, 칼럼 정제에 의해 정제하였다. 시퀀싱 실행은 150 주기의 NextSeq v2.5 중간 또는 고출력 키트로 수행하였다.
도 9a 및 도 9b는 AAVS1_T6에서 변이형 Cas12i2에 의한 활성을 보여주고, 도 9c 및 도 9d는 AAVS1_T7에서 변이형 Cas12i2에 의한 활성을 보여주고, 도 9e 및 도 9f는 EMX1_T6에서 변이형 Cas12i2에 의한 활성을 보여주고, 도 9g 및 도 9h는 VEGFA_T2에서 변이형 Cas12i2에 의한 활성을 보여주고, 도 9i 및 도 9j는 VEGFA_T5에서 변이형 Cas12i2에 의한 활성을 보여준다. NGS 리드의 백분율은 y-축에 표시되고, 총 편집은 밝은 회색 막대로 표시되고, 암호화된 편집은 어두운 회색 막대로 표시된다. 데이터는 2개의 생체 복제물의 평균이며, 이들 각각은 3개의 기술적 복제물을 갖고 있다. 도 9a, 도 9c, 도 9e, 도 9g 및 도 9i에 도시된 바와 같이, 변이형 Cas12i2 및 변이형 Cas12i2-RT 융합체는 AAVS1_T6, AAVS1_T7, EMX1_T6, VEGFA_T2 또는 VEGFA_T5를 표적으로 하는 RNA 가이드의 존재하에 활성 뉴클레이스였다.
도 9b, 도 9d, 도 9f, 도 9h 및 도 9j에 도시된 바와 같이, RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체 서열의 존재하에 변이형 Cas12i2-RT 융합체는 암호화된 치환, 삽입 및 결실을 AAVS1_T6, AAVS1_T7, EMX1_T6, VEGFA_T2 또는 VEGFA_T5에 도입시킬 수 있다. 13개, 30개 및 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이에서 활성이 관찰되었다. C-말단 MMLV RT 융합체에 의한 편집은 변이형 Cas12i2와 N-말단 MMLV RT 융합체에 의한 편집을 초과하였다. 변이형 Cas12i2를 사용한 편집은 약 1% 내지 5% 범위이다.
본 실시예는 편집 주형 RNA 및 Cas12i2-RT 융합체를 사용하여 특정 편집이 선택된 포유동물 게놈 부위에 혼입되었음을 보여준다.
실시예 2 - 말단 보호된 편집 주형 RNA를 사용한 포유동물 세포에서의 표적 가닥의 편집
본 실시예는 포유동물 유전자의 표적 가닥 편집(예를 들어, 선택된 포유동물 유전자의 비-PAM 가닥에 결합하는 편집 주형 RNA 사용)을 설명한다.
서열번호 4의 변이형 Cas12i2와 서열번호 25의 변이형 Cas12i2-RT 융합체를 각각 pcda3.1 백본(Invitrogen)에 클로닝하였다. 변이형 Cas12i2와의 RT 융합체의 발현을 위한 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다(변이형 Cas12i2-RT 융합체 작업 용액).
표 11에 나타나 있고 도 12a 및 도 12b에 도시된 바와 같은 다양한 RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체 구성을 테스트하였다. 역전사 주형 서열과 PBS를 RNA 가이드의 5' 말단 또는 3' 말단에 융합시켰다. 추가적인 DR-스페이서 서열을 5' 또는 3' 말단에 추가하였다. 말단 보호를 위해 사용된 스페이서 서열은 인간을 표적으로 하지 않았다(즉, 인간 게놈의 임의의 서열을 표적으로 하지 않았다). RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체의 서열은 표 12에 나타나 있고; RT 공여체에 암호화된 목적하는 편집은 소문자로 표시된다. 대조군으로 사용된 RNA 가이드만의 서열은 표 13에 나타나 있다. RNA 가이드-RT 공여체 RNA 융합체 또는 RNA 가이드를 U6 프로모터가 있는 플라스미드 백본에 클로닝하고, 맥시 프렙하였다. RNA 가이드/RT 공여체 RNA 플라스미드(또는 RNA 가이드)를 발현하는 각 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다(편집 주형 RNA 작업 용액).
형질감염 대략 16시간 전에, DMEM/10%FBS+Pen/Strep 중 25,000개의 HEK293T 세포를 w96-웰 플레이트의 각 웰에 플레이팅하였다. 형질감염 당일, 세포는 70% 내지 90% 컨플루언트하였다. 형질감염될 각 웰에 Lipofectamine™ 2000(Themo Fisher)과 Opti-MEM™ 배지(Thermo Fisher)의 혼합물을 준비한 다음, 실온에서 5분 내지 20분 동안 인큐베이션하였다(용액 1). 인큐베이션 후, Lipofectamine™:OptiMEM™ 혼합물을 변이형 Cas12i2-RT 융합체 작업 용액, RNA 작업 용액 및 OptiMEM™ 배지를 포함하는 별도의 혼합물에 첨가하였다(용액 2). 용액 1과 용액 2의 혼합물을 위아래로 피펫팅하여 혼합한 다음, 실온에서 25분 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 후, 용액 1과 용액 2의 혼합물을 세포가 담긴 96 웰 플레이트의 각 웰에 적가하였다. 형질감염 72시간 후, 각 웰의 중앙에 TrypLE™(ThermoFisher)를 첨가하여 세포를 트립신 처리하고, 대략 5분 동안 인큐베이션하였다. 그런 다음, 성장 배지를 각 웰에 첨가하고, 혼합하여 세포를 재현탁시켰다. 그런 다음, 세포를 400g에서 10분 동안 원심분리하고, 상청액을 버렸다. QuickExtract™ 완충액(Lucigen)을 원래 세포 현탁액 부피의 1/5 양으로 첨가하였다. 세포를 65℃에서 15분, 68℃에서 15분 및 98℃에서 10분 동안 인큐베이션하였다.
2라운드의 PCR에 의해 차세대 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하였다. 1라운드(PCR1)를 사용하여 표적에 따라 특정 게놈 영역을 증폭시켰다. PCR1 산물을 칼럼 정제에 의해 정제하였다. 2라운드 PCR(PCR2)을 수행하여 Illumina 어댑터 및 인덱스를 추가하였다. 그런 다음, 반응물을 풀링하고, 칼럼 정제에 의해 정제하였다. 시퀀싱 실행은 150 주기의 NextSeq v2.5(Illumina) 중간 또는 고출력 키트로 수행하였다.
도 13a는 AAVS1_T7에 대한 활성을 보여주고, 도 13b는 EMX1_T6에 대한 활성을 보여주고, 도 13c는 VEGFA_T2에 대한 활성을 보여주고, 도 13d는 VEGFA_T5에 대한 활성을 보여준다. NGS 리드의 백분율은 y-축에 표시된다. 데이터는 3개의 기술적 복제물의 평균이다.
도 13a, 도 13b, 도 13c 및 도 13d에 도시된 바와 같이, 서열번호 4의 변이형 Cas12i2 및 서열번호 25의 변이형 Cas12i2-RT 융합체는 AAVS1_T7, EMX1_T6, VEGFA_T2 또는 VEGFA_T5를 표적으로 하는 RNA 가이드의 존재하에 활성 뉴클레이스였다(gRNA 샘플 참조). 목적하는 편집은 RT(서열번호 25의 변이형 Cas12i2-RT 융합체)의 존재하에서만 관찰되었다. Indel과 암호화된 편집은 서열번호 25의 변이형 Cas12i2-RT 융합체를 사용한 테스트된 편집 주형 RNA 각각에 대해 관찰되었다. 말단 보호된 5' 연장 편집 주형 RNA(말단 보호 - 역전사 주형 서열 - PBS - 뉴클레이스 결합 서열 - DNA-결합 서열)는 말단 보호가 없는 5' 연장 편집 주형 RNA(역전사 주형 서열 - PBS - 뉴클레이스 결합 서열 - DNA-결합 서열)와 비교하여 목적하는 편집을 갖는 더 높은 수의 리드를 보여주었다.
본 실시예는 편집 주형 RNA와 Cas12i2-RT 융합체의 여러 구성을 사용하여 특정 편집이 선택된 포유동물 게놈 부위에 혼입되었음을 보여준다.
실시예 3 - Cas12i2에 대한 시험관내 절단 패턴의 결정
본 실시예에서, RNA 가이드를 사용하여 변이형 Cas12i2의 시험관내 절단 패턴을 결정하였다. 이중 가닥 DNA 표적에서 Cas12i2에 의해 생성된 절단 부위의 결정은 편집 주형 RNA의 PBS 구성요소의 설계를 가능하게 한다.
절단 패턴을 결정하기 위한 검정의 개략도가 도 14a 내지 도 14c에 도시되어 있다. 절단 부위 분석을 위해 표적 서열을 포함하는 올리고를 먼저 설계하였다. 올리고는 표적의 양쪽 말단에 12개의 뉴클레오타이드 측접 서열을 갖는 표적 서열, 내부 바코드 및 표적화 증폭을 허용하는 프라이밍 부위로 구성되었다(도 14a). 도 14b에 도시된 바와 같이, 모든 절단 산물은 두 부분으로 나누었으며, 절반은 5' 및 3' 오버행을 평활 말단화시키는 녹두 뉴클레이스(mung bean nuclease: MBN)로 처리하고(평활 말단화 처리), 나머지 절반의 반응물은 말단 복구시키고(NEBNext DNA 라이브러리 프렙의 일부, New England Biolabs), 5' 오버행은 필인시켰다(필인 처리). 그런 다음, 두 부분 모두에 NGS 라이브러리 준비 및 반-표적화 증폭을 적용하였다. 유형 V CRISPR 뉴클레이스는 회색 화살표로 표시된 바와 같이 5' 오버행이 있는 점착 절단을 생성하는 것으로 나타났다. 이러한 절단 부위는 임의의 5' 오버행을 채우기 위한 필인 처리로 포착되었다. 따라서, 이러한 산물의 5' 및 3' 시퀀싱은 표적 가닥 및 비표적 가닥의 절단 부위를 나타낸다. Cpf1에 대한 최근 연구에서는 특히 필인 방법으로 포착되지 않은 비표적 가닥에서 추가적인 절단 부위가 나타났다. 이러한 절단 부위를 포착하기 위해, 평활 말단화 방법을 사용하면 모든 5' 및 3' 오버행이 평활 말단화된다. 결과적으로, 평활 말단화 방법에서 5' 절단 산물은 비표적 가닥의 임의의 추가적인 절단 부위를 나타내고, 3' 절단 산물은 표적 가닥의 추가적인 절단 부위를 나타낸다. NEBNext 어댑터 결찰 후 반-표적 증폭은 5' 및 3' 절단 산물의 특정 증폭을 가능하게 하였으며; 증폭된 산물을 풀링하고 NGS로 분석하였다(도 14c).
IR800 및 IR700 표지된 정방향 및 역방향 프라이머를 각각 사용하는 PCR 증폭에 의해 DNA 기질을 생성하여 IR800 표지된 표적 가닥 및 IR700 표지된 비표적 가닥을 갖는 dsDNA 표적을 생성하였다. PCR 산물을 CleanNGS SPRI 비드를 1.8x의 비드 대 PCR 산물의 비로 사용하여 세척하였다. 정제된 Cas12i2를 crRNA와 함께 사전 인큐베이션하여 NEBuffer 3(10mM Tris-HCl(pH 7.9), 150mM NaCl, 10mM MgCl2, 1mM DTT)에서 37℃에서 10분 동안 RNP를 형성시켰다. NEBuffer 3에 연속 희석된 RNP와 혼합된 dsDNA 기질을 포함하는 시험관내 절단 반응을 37℃에서 1시간 동안 수행하였다. EDTA로 반응을 중지시켰다. 반응물을 RNase 칵테일(37℃에서 15분)로 처리한 후, 프로테이네이스 K 처리(37℃에서 15분)하였다. 반응물을 15% TBE-Urea 겔을 사용하여 변성 겔 전기영동으로 분석하고, Odyssey CLx(LI-COR) 영상 장치에서 이미지화하였다. DNA 기질 및 RNA 가이드 서열은 표 14에 나타나 있으며; 표적 서열은 굵게 표시되어 있다.
절단 위치를 결정하기 위한 시험관내 절단 단편 분석을 위해, 반응 산물을 SPRI 비드와 아이소프로필 알코올(IPA SPRI)을 사용하여 정제하였다. 정제된 반응물을 두 부분으로 나누었다. 절반은 녹두 뉴클레이스(New England Biolabs)로 30℃에서 30분 동안 처리하여 5' 및 3' 오버행을 모두 제거하여 평활 말단을 생성한 후 IPA SPRI로 정제하였다. 그런 다음, 제조업체의 지침에 따라 NEBNext Ultra-II DNA 라이브러리 프렙 키트(New England Biolabs)를 사용하여 시퀀싱하기 위해 녹두 뉴클레이스 처리된 반쪽과 처리되지 않은 반쪽 모두를 준비하였다. 반-표적 증폭을 사용하여 각 샘플에 대해 5' 및 3' 절단 산물을 별도로 증폭하였다. 시퀀싱 전에 모든 앰플리콘을 풀링하고 겔을 추출하였다. 각 샘플에 대해, 녹두 뉴클레이스 및 비녹두 뉴클레이스 처리된 샘플의 5' 및 3' 절단 산물에 대해 얻은 리드 길이를 히스토그램으로 플로팅하고 표적 서열에 매핑하였다.
전체 절단 패턴을 얻기 위해, 4개의 히스토그램 모두로부터 얻은 데이터를 취하여 도 15a 내지 도 15e 및 도 16에 도시된 바와 같이 R-루프 다이어그램에 시각화하였다. 도 15b 내지 도 15e는 AAVS1_T2에 대한 5' 및 3' 절단 산물의 반-표적 증폭으로부터 얻은 리드 길이의 히스토그램을 보여준다. 도 15b 및 도 15d는 각각 필인 및 평활 말단화 처리에 대한 5' 절단 산물의 리드 길이 히스토그램을 보여준다. 도 15c 및 도 15e는 각각 필인 및 평활 말단화 처리에 대한 3' 절단 산물의 리드 길이 히스토그램을 보여준다. 각각의 리드 길이 히스토그램을 x-축에 표시된 표적 서열에 매핑하였다. PAM 서열(5'-NTTT-3')도 표시되어 있다. 히스토그램으로부터 얻은 절단 부위는 도 15a의 R-루프 다이어그램에서 삼각형으로 표시된다. 도 16은 Cas12i2(서열번호 2) 또는 변이형 Cas12i2(서열번호 4)를 포함하는 RNP에 대한 AAVS1_T2 및 EMX1_T6의 절단 부위를 비교한 것이다. 기준 막대(오른쪽)는 시퀀싱 리드의 수로 측정된 경우 절단 빈도를 나타낸다.
모든 표적에 대해, 표적 가닥 및 비표적 가닥 모두에서 다양한 빈도의 다중 절단 부위가 관찰되었다. 비표적 가닥에서, 스페이서 영역(즉, RNA 가이드 결합 영역) 내뿐만 아니라 스페이서 영역의 외부에서 검출된 여러 절단 부위에서 광범위한 절단 프로파일이 관찰되었다. 이는 Cas12i2 결합 시, 이중-가닥 DNA가 스페이서 영역(즉, RNA 가이드 결합 영역)으로부터 여러 염기쌍을 풀고 단일 가닥 DNA로 존재하여 절단을 위해 Cas12i2에 접근할 수 있음을 나타낸다. 표적 가닥의 절단 부위는 스페이서 영역의 외부(즉, RNA 가이드 결합 영역의 외부)에서 일관되게 관찰되었다. AAVS1_T2의 경우, 표적 가닥 절단 부위는 PAM 서열의 22개 내지 24개의 뉴클레오타이드 위치에서 관찰되었다. VEGFA_T5 및 EMX1_T6의 경우, 표적 가닥 절단 부위는 PAM 서열의 22개 내지 23개의 뉴클레오타이드 위치에서 관찰되었다. 따라서, 이는 표적 가닥을 표적으로 하도록 설계된 편집 주형 RNA가 PAM 서열의 22개 내지 24개의 뉴클레오타이드에서 시작하는 PBS를 포함해야 함을 보여준다.
실시예 4 - 다양한 PBS 및 역전사 주형 서열 길이를 갖는 편집 주형 RNA를 사용한 포유동물 세포에서의 표적 가닥의 편집
본 실시예는 3개 내지 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이 및 14개 내지 54개의 뉴클레오타이드의 역전사 주형 서열 길이를 갖는 편집 주형 RNA를 사용한 포유동물 유전자의 표적 가닥 편집을 설명한다.
서열번호 25의 변이형 Cas12i2-RT 융합체를 포함하는 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다(변이형 Cas12i2-RT 융합체 작업 용액). 편집 주형 RNA 서열은 표 15에 나타나 있다. 첫 번째 조건의 세트에서, 역전사 주형 서열은 34개의 뉴클레오타이드 길이였고, PBS는 3개, 8개, 13개, 30개 또는 60개의 뉴클레오타이드 길이였다. 두 번째 조건의 세트에서, PBS는 13개의 뉴클레오타이드 길이였고, 역전사 주형 서열은 14개, 24개, 34개, 44개 또는 54개의 뉴클레오타이드 길이였다. 각각의 편집 주형 RNA를 U6 프로모터가 있는 플라스미드 백본에 클로닝하고, 맥시 프렙하였다. 각각의 편집 주형 RNA를 발현하는 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다(편집 주형 RNA 작업 용액).
세포를 실시예 2에 기술된 바와 같이 형질감염시키고 분석하였다. 도 17a는 AAVS1_T7의 경우 서열번호 25의 Cas12i2-RT와 서열번호 183 내지 187의 편집 주형 RNA, EMX1_T6의 경우 서열번호 25의 Cas12i2-RT와 서열번호 193 내지 197의 편집 주형 RNA 및 VEGFA_T5의 경우 서열번호 25의 Cas12i2-RT와 서열번호 203 내지 207의 편집 주형 RNA의 활성을 보여준다. 도 17b는 AAVS1_T7의 경우 서열번호 25의 Cas12i2-RT와 서열번호 188 내지 192의 편집 주형 RNA, EMX1_T6의 경우 서열번호 25의 Cas12i2-RT와 서열번호 198 내지 202의 편집 주형 RNA 및 VEGFA_T5의 경우 서열번호 25의 Cas12i2-RT와 서열번호 208 내지 212의 편집 주형 RNA의 활성을 보여준다. 암호화된 편집 대 총 indel의 비는 도 17a 및 도 17b의 y-축에 나타나 있다.
도 17a에 도시된 바와 같이, 테스트된 각각의 PBS 길이로 인해 암호화된 편집이 선택된 표적 부위로 혼입되었다. 13개, 30개 및 60개의 뉴클레오타이드의 PBS 길이를 사용하면 암호화된 편집 대 총 indel의 비가 가장 높아졌다. 도 17b에 도시된 바와 같이, 24개, 34개, 44개 및 54개의 뉴클레오타이드의 테스트된 역전사 주형 서열 길이로 인해 암호화된 편집이 존재하게 되었다. EMX1_T6의 경우, 암호화된 편집은 13개의 뉴클레오타이드 길이의 PBS 및 34개 또는 44개의 뉴클레오타이드 길이의 역전사 주형 서열을 갖는 편집 주형 RNA를 사용한 총 편집의 약 30%를 차지하였다. 따라서, 본 실시예는 다양한 PBS 및 역전사 주형 서열 길이를 갖는 편집 주형 RNA가 포유동물 세포에서 암호화된 편집을 표적 서열에 도입시킴을 보여준다.
실시예 5 - U2OS 세포에서의 표적 가닥의 RNA-주형 편집
본 실시예는 U2OS 세포에서의 포유동물 유전자의 표적 가닥 편집을 설명한다.
서열번호 25의 변이형 Cas12i2-RT 융합체를 포함하는 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다. 각각의 편집 주형 RNA를 U6 프로모터가 있는 플라스미드 백본에 클로닝하고 맥시 프렙하였다. 각각의 편집 주형 RNA를 포함하는 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다. 편집 주형 RNA 서열은 표 16에 나타나 있다. 추가적인 DR-스페이서 서열을 3' 말단에 추가하였으며, 추가적인 스페이서 서열은 인간을 표적으로 하지 않았다(즉, 이는 인간 게놈의 임의의 서열을 표적으로 하지 않았다). RT 공여체에 암호화된 목적하는 편집은 표 16에 소문자로 표시되어 있다.
U2OS 세포는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션에서 공급받았으며, 10% FBS(Corning) 및 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(HyClone™)이 보충된 McCoy's-5A 배지(Thermo Fisher)에서 90% 미만의 컨플루언시를 유지하였다. 세포를 트립신 처리하고, 재현탁시키고, TrypLE™ Express(Thermo Fisher)를 사용하여 계수하였다. 800ng의 Cas12i2-RT 융합체 플라스미드와 200ng의 각각의 편집 주형 RNA 플라스미드의 혼합물을 사용하여 제조업체의 사전 설정된 DN-100 프로그램에 따라 SF 세포주 뉴클레오펙터 키트(Lonza)를 사용하여 400,000개 세포의 집단을 뉴클레오펙션시켰다. 그런 다음, 세포를 재현탁시키고, 미리 예열된 성장 배지가 담긴 96-웰 플레이트(40,000개 세포/웰)에 다시 플레이팅하였다. 뉴클레오펙션된 세포를 72시간 동안 배양하고 수거하였다.
실시예 2에 기술된 바와 같이 NGS로 편집을 분석하였다. 도 18에 도시된 바와 같이, 각각의 역전사 주형 서열에 의해 암호화된 편집은 NGS 리드의 약 5% 내지 8%에서 확인되었다. 암호화된 편집은 AAVS1_T7의 경우 총 indel의 대략 20%, EMX1_T6의 경우 총 indel의 대략 10%를 차지하였다. 따라서, 본 실시예 및 이전 실시예는 암호화된 편집이 여러 세포주의 유전자에 도입될 수 있음을 보여준다.
실시예 6 - Cas12i2-RT 융합체를 사용한 표적 가닥의 RNA-주형 편집
본 실시예는 MMLV RT(서열번호 29), RNase H 도메인(서열번호 224)이 결여되어 있는 서열번호 29의 MMLV RT의 변이체 또는 마라톤 RT(서열번호 232)에 융합된 Cas12i2 변이체를 사용한 포유동물 유전자의 표적 가닥 편집을 설명한다.
표 14의 Cas12i2-RT 융합체 서열을 pcDNA3.1 백본(Invitrogen)에 클로닝하였다. C-말단 RT 융합체는 Cas12i2의 N-말단에 있는 His 태그와 Cas12i2의 C-말단에 있는 이분형 뉴클레오플라스민 NLS(npNLS)로 구성되었다. npNLS 바로 뒤에는 GS-XTEN-GS 링커가 있었다. RT의 C-말단에는 이분형 SV40 NLS 태그가 있었다. N-말단 RT 융합체는 N-말단에 있는 이분형 SV40 NLS 태그와 RT의 C-말단에 있는 GS-XTEN-GS 링커에 이어서 Cas12i2로 구성되었다. Cas12i2의 C-말단에는 이분형 뉴클레오플라스민 NLS(bpNLS)가 있었다. Cas12i2-RT 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다.
표적 및 상응하는 편집 주형 RNA 서열은 표 18에 나타나 있다. RT 주형은 40개의 뉴클레오타이드 길이였고, PBS는 13개의 뉴클레오타이드 길이였다. 암호화된 편집은 PAM 서열을 제거하기 위한 4개의 뉴클레오타이드 치환뿐만 아니라 단일 염기 치환이었다. 편집 주형 RNA를 추가적인 직접 반복 서열과 비표적화 스페이서 서열로 추가로 말단 보호시켰다. 편집 주형 RNA를 U6 프로모터가 있는 플라스미드 백본에 클로닝하고, 맥시 프렙하고, 각각의 편집 주형 RNA 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다.
HEK293T 세포는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션에서 공급받았으며, D10 배지: 10% FBS(Corning) 및 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(HyClone™)이 보충된 DMEM(Thermo Fisher) + GlutaMAX™(Thermo Fisher) 및 피루베이트(Thermo Fisher)에서 90% 미만의 컨플루언시를 유지하였다. 형질도입 전에, HEK293T 세포를 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트에 웰당 25,000개의 세포로 플레이팅하였다. 15시간 내지 18시간 후, 세포를 형질감염시켰다. 각각의 Cas12i2-RT 융합체 플라스미드와 편집 주형 RNA 플라스미드를 Opti-MEM™ 배지(Thermo Fisher)에 희석한 다음, Opti-MEM™에 희석된 Lipofectamine™ 2000(Themo Fisher)과 혼합하였다. Lipofectamine™ 2000 용액을 웰에 적가하고, 형질감염된 세포를 72시간 동안 배양한 후 수거하였다.
2라운드의 PCR에 의해 차세대 시퀀싱을 위한 샘플을 준비하였다. 1라운드(PCR1)를 사용하여 표적에 따라 특정 게놈 영역을 증폭시켰다. PCR1 산물을 칼럼 정제에 의해 정제하였다. 2라운드 PCR(PCR2)을 수행하여 Illumina 어댑터 및 인덱스를 추가하였다. 그런 다음, 반응물을 풀링하고, 칼럼 정제에 의해 정제하였다. 시퀀싱 실행은 150 주기의 NextSeq v2.5 중간 또는 고출력 키트로 수행하였다.
도 20a, 도 20b 및 도 20c는 각각 AAVS1_T7, EMX1_T6 및 VEGFA_T5에 대한 표 19의 Cas12i2-RT 융합체에 의한 활성을 보여준다. Indel 편집(표적 서열 내 또는 이에 인접하여 삽입 또는 결실을 포함하는 총 NGS 리드의 백분율) 및 정밀 편집(편집 주형 RNA에 의해 암호화된 편집을 포함하는 총 NGS 리드의 백분율)이 y-축에 표시되어 있다. Indel 편집은 흰색 막대로 표시되고, 암호화된 편집은 회색 막대로 표시된다. 표시된 데이터는 2개의 생체 복제물의 평균이다. 도 20a, 도 20b 및 도 20c에 도시된 바와 같이, Cas12i2-RT 융합체는 편집 주형 RNA의 존재하에 활성 뉴클레이스였다. 또한, Cas12i2-RT 융합체 각각은 편집 주형 RNA에 의해 암호화된 편집을 표적 서열에 도입하였다. 서열번호 220의 Cas12i2-RT 융합체로 편집된 3개의 표적 각각에 대해, NGS 리드의 대략 15%가 편집 주형 RNA에 의해 암호화된 편집으로 구성되었다. 따라서, MMLV의 RNase H 도메인의 결실은 포유동물 게놈에 indel 및 정확한 편집을 도입하는 Cas12i2-RT 융합체의 능력에 유의미한 영향을 미치는 것으로 보이지 않는다. 또한, 마라톤 RT를 포함하는 Cas12i2-RT 융합체는 암호화된 편집을 표적 서열에 도입할 수 있었다(도 20a, 도 20b 및 도 20c).
따라서, 본 실시예는 암호화된 편집이 여러 RT 서열 및 Cas12i2-RT 융합체를 사용하여 포유동물 유전자의 표적 가닥에 혼입될 수 있음을 보여준다.
실시예 7 - 화학적으로 변형된 편집 주형 RNA를 사용한 RNA-주형 편집
본 실시예는 서열번호 219의 플라스미드-암호화된 Cas12i2-RT 융합체 및 말단 포스포로티오에이트 백본 연결 및/또는 2'O-메틸 뉴클레오타이드를 포함하는 편집 주형 RNA를 사용한 포유동물 유전자인 VEGFA의 표적 가닥 편집을 설명한다. 표적 서열은 TTAAACTCTCCATGGACCAG(서열번호 38)였다.
서열번호 4의 변이형 Cas12i2 및 서열번호 219의 Cas12i2-RT 융합체를 pcDNA3.1 백본(Invitrogen)에 개별적으로 클로닝하였다. RNA 가이드 및 편집 주형 RNA 서열을 IDT에 의해 합성하였다. HEK293T 세포는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션에서 공급받았으며, D10 배지: 10% FBS(Corning) 및 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(HyClone™)이 보충된 DMEM(Thermo Fisher) + GlutaMAX™(Thermo Fisher) 및 피루베이트(Thermo Fisher)에서 90% 미만의 컨플루언시를 유지하였다. 형질도입 전에, HEK293T 세포를 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트에 D10 중 웰당 25,000개의 세포로 플레이팅하였다. 15시간 내지 18시간 후, 세포를 TransIT-X2®(Mirus Bio)로 형질감염시켰다. 그런 다음, DNA + 형질감염 시약 용액을 세포의 웰에 적가하였다. 100ng의 Cas12i2 또는 Cas12i2-RT 플라스미드 DNA와 9몰의 합성된 RNA 가이드(IDT)의 혼합물을 Opti-MEM™ 배지(Thermo Fisher)에 희석한 다음, 제조업체의 지침에 따라 Opti-Opti-MEM™에 희석된 Lipofectamine™ 2000과 혼합하였다. 형질감염된 세포를 72시간 동안 배양한 후 수거하였다.
편집을 이전 실시예에 기술된 바와 같이 NGS로 분석하였다. 도 21에 도시된 바와 같이, VEGFA-T5 표적 부위에서 암호화된 편집을 각각의 편집 주형 RNA 및 서열번호 219의 Cas12i2-RT 융합체로 검출하였다. 대조군(gRNA 및 편집 주형 RNA + Cas12i2) 샘플에서 암호화된 편집은 검출되지 않았다. 변형되지 않은 편집 주형 RNA와 비교하여 변형된 편집 주형 RNA을 사용하여 더 높은 비율의 NGS 리드에서 암호화된 편집이 검출되었다. PS-2'-O-Me 변형을 사용하면 암호화된 편집을 포함하는 NGS 리드의 백분율이 가장 높아졌다.
따라서, 본 실시예는 관심 게놈 부위가 화학적으로 변형된 편집 주형 RNA 및 Cas12i2-RT 융합체에 의해 편집될 수 있음을 보여준다.
실시예 8 - Cas12i4-RT 융합체를 사용한 RNA-주형 편집
본 실시예는 MMLV RT(서열번호 29)에 융합된 Cas12i4 변이체를 사용한 AAVS1의 표적 가닥 편집을 설명한다.
표 20의 Cas12i4-RT 융합체 서열을 pcDNA3.1 백본(Invitrogen)에 클로닝하였다. C-말단 RT 융합체는 Cas12i4의 N-말단에 있는 His 태그와 Cas12i4의 C-말단에 있는 뉴클레오플라스민 NLS로 구성되었다. NLS의 바로 뒤에는 Flex XTEN 링커가 있었다. RT의 C-말단에는 이분형 SV40 NLS 태그가 있었다. N-말단 RT 융합체는 N-말단에 있는 이분형 SV40 NLS 태그와 RT의 C-말단에 있는 Flex XTEN 링커에 이어서 Cas12i4로 구성되었다. Cas12i4의 C-말단에는 뉴클레오플라스민 NLS가 있었다. Cas12i4-RT 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다.
표적, RNA 가이드 및 편집 주형 RNA 서열은 표 21에 나타나 있다. RT 주형은 46개의 뉴클레오타이드 길이였고, PBS는 13개의 뉴클레오타이드 길이였다. 암호화된 편집은 PAM 서열을 제거하기 위한 4개의 뉴클레오타이드 치환뿐만 아니라 단일 염기 치환이었다. 편집 주형 RNA 및 RNA 가이드를 U6 프로모터가 있는 플라스미드 백본에 개별적으로 클로닝하고, 맥시 프렙하고, 각각의 RNA 가이드 또는 편집 주형 RNA 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다.
HEK293T 세포를 실시예 6에 기술된 바와 같이 형질감염시키고 수거하였다. 이전 실시예에 기술된 바와 같이 NGS를 수행하였다. 도 22에 도시된 바와 같이, AAVS1_T7 표적 부위에서 암호화된 편집을 편집 주형 RNA, 및 Cas12i4-RT 융합체 중 하나로 검출하였다. 대조군(gRNA 및 편집 주형 RNA + Cas12i4) 샘플에서 암호화된 편집은 검출되지 않았다. 변이형 Cas12i4에 대한 MMLV의 N-말단 융합체와 비교하여 변이형 Cas12i4에 대한 MMLV의 C-말단 융합체를 사용하여 더 높은 비율의 NGS 리드에서 암호화된 편집이 검출되었다.
따라서, 본 실시예는 관심 게놈 부위가 편집 주형 RNA 및 Cas12i4-RT 융합체에 의해 편집될 수 있음을 보여준다.
실시예 9 - Cas12i2-RT 융합체, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 사용한 RNA-주형 편집
본 실시예는 Cas12i2-RT 융합체, RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 사용한 포유동물 유전자의 표적 가닥 편집을 설명한다.
서열번호 219의 Cas12i2-RT 융합체를 pcDNA3.1 백본(Invitrogen)에 클로닝하였다. Cas12i2-RT 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다. 표 22의 RNA 가이드 및 RT 공여체 RNA를 U6 프로모터가 있는 플라스미드 백본에 개별적으로 클로닝하고, 맥시 프렙하고, 각각의 RNA 가이드 또는 RT 공여체 RNA 플라스미드의 작업 용액을 물에서 제조하였다. RT 공여체 RNA는, 5'에서 3'의 순서로, 다음의 구성요소: 직접 반복 - 비표적화 스페이서 - RT 주형 - PBS - 직접 반복 - 비표적화 스페이서로 구성되었다. 직접 반복 및 RT 주형과 PBS에 측접하는 스페이서 서열은 말단 보호 역할을 하였다.
HEK293T 세포는 아메리칸 타입 컬처 컬렉션에서 공급받았으며, D10 배지: 10% FBS(Corning) 및 100 U/㎖ 페니실린-스트렙토마이신(HyClone™)이 보충된 DMEM(Thermo Fisher) + GlutaMAX™(Thermo Fisher) 및 피루베이트(Thermo Fisher)에서 90% 미만의 컨플루언시를 유지하였다. 형질도입 전에, HEK293T 세포를 조직 배양 처리된 96-웰 플레이트에 웰당 25,000개의 세포로 플레이팅하였다. 15시간 내지 18시간 후, 세포를 형질감염시켰다. 각각의 Cas12i2-RT 융합체 플라스미드, RNA 가이드 플라스미드 및 RT 공여체 RNA 플라스미드를 Opti-Opti-MEM™ 배지(Thermo Fisher)로 희석한 다음, Opti-Opti-MEM™에 희석된 Lipofectamine™ 2000(Themo Fisher)과 혼합하였다. Lipofectamine™ 2000 용액을 웰에 적가하고, 형질감염된 세포를 72시간 동안 배양하여 수거하였다.
이전 실시예에 기술된 바와 같이 NGS를 추가로 수행하였다. 도 23에 도시된 바와 같이, Cas12i2-RT 융합체, 각각의 RNA 가이드 및 각각의 RT 공여체 RNA를 사용한 형질감염 후 각각의 표적 부위에서 암호화된 편집이 검출되었다. 대조군(Cas12i2) 샘플에서 암호화된 편집은 검출되지 않았다. 따라서, 본 실시예는 선택된 게놈 부위가 Cas12i2-RT 융합체와 2개의 RNA 구성요소, RNA 가이드와 RT 공여체 RNA에 의해 편집될 수 있음을 보여준다. 암호화된 편집을 관심 게놈 부위에 혼입시키기 위해 RNA 가이드와 RT 공여체 RNA를 융합시킬 필요는 없다.
기타 실시형태
본 명세서에 개시된 모든 특징은 임의의 조합으로 결합될 수 있다. 본 명세서에 개시된 각 특징은 동일하거나, 동등하거나 또는 유사한 목적을 제공하는 대체 특징으로 대체될 수 있다. 따라서, 달리 명시적으로 언급되지 않는 한, 개시된 각 특징은 등가 또는 유사한 특징의 일반적인 시리즈의 예일 뿐이다.
상기 설명으로부터, 당업자는 본 발명의 본질적인 특징을 쉽게 확인할 수 있으며, 이의 사상과 범위를 벗어나지 않고 본 발명을 다양한 용도와 조건에 적합화시키기 위해 다양한 변경 및 수정을 가할 수 있다. 따라서, 다른 실시형태도 청구범위 내에 있다.
등가물
여러 가지 본 발명의 실시형태가 본 명세서에 기술되고 예시되었지만, 당업자라면 기능을 수행하고/하거나 본 명세서에 기재된 결과 및/또는 하나 이상의 이점을 얻기 위한 다양한 다른 수단 및/또는 구조를 쉽게 구상할 수 있을 것이며, 이러한 변형 및/또는 수정 각각은 본 명세서에 기재된 본 발명의 실시형태의 범위 내에 있는 것으로 간주된다.
보다 일반적으로, 당업자라면 본 명세서에 기술된 모든 매개변수, 치수, 물질 및 구성이 예시적임을 의미하며 실제 매개변수, 치수, 물질 및/또는 구성은 본 발명의 교시가 사용되는 특정 응용 분야 또는 응용 분야들에 따라 달라질 것이라는 점을 쉽게 이해할 수 있을 것이다. 당업자는 단지 일상적인 실험을 사용하여 본 명세서에 기술된 특정 발명의 실시형태에 대한 많은 등가물을 인식하거나 확인할 수 있을 것이다. 따라서, 전술한 실시형태는 단지 예로서 제시된 것이며, 첨부된 청구범위 및 그 등가물의 범위 내에서, 본 발명의 실시형태는 구체적으로 설명되고 청구된 것과 다르게 실시될 수 있다는 것이 이해되어야 한다. 본 개시내용의 독창적인 실시형태는 본 명세서에 기술된 각각의 개별적인 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법에 관한 것이다. 또한, 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법이 상호 모순되지 않는 경우, 두 개 이상의 이러한 특징, 시스템, 물품, 물질, 키트 및/또는 방법의 조합은 본 개시내용의 범위 내에 포함된다.
본 명세서에 정의되고 사용되는 모든 정의는 사전적 정의, 참조에 의해 원용되어 있는 문서의 정의 및/또는 정의된 용어의 일반적인 의미를 제어하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서에 개시된 모든 참고문헌, 특허 및 특허 출원은 각각 인용된 특허 대상과 관련하여 참조에 의해 인용되며, 일부 경우에는 문서 전체를 포괄할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 "단수형"은 달리 명확하게 나타내지 않는 한 "적어도 하나"를 의미하는 것으로 이해되어야 한다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 어구 "및/또는"은 결합된 요소 중 "둘 중 하나 또는 둘 다", 즉, 일부 경우에는 결합적으로 존재하고 다른 경우에는 분리적으로 존재하는 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 한다. "및/또는"으로 나열된 여러 요소는 동일한 방식, 즉, 이렇게 결합된 요소 중 "하나 이상"으로 해석되어야 한다. "및/또는" 절에 의해 구체적으로 식별되는 요소 외에 구체적으로 식별되는 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이, 다른 요소가 선택적으로 존재할 수 있다. 따라서, 비제한적인 예로서, "포함하는"과 같은 개방형 언어와 함께 사용될 때 "A 및/또는 B"에 대한 언급은 일 실시형태에서는 A만(선택적으로 B 이외의 요소를 포함); 또 다른 실시형태에서는 B만(선택적으로 A 이외의 요소를 포함); 또 다른 실시형태에서는 A와 B 모두(선택적으로 다른 요소를 포함); 등을 지칭할 수 있다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, "또는"은 위에서 정의된 바와 같이 "및/또는"과 동일한 의미를 갖는 것으로 이해되어야 한다. 예를 들어, 목록에서 항목을 분리할 때, "또는" 또는 "및/또는"은 포괄적인 것으로 해석되어야 하며, 즉, 요소의 수 또는 목록 중 적어도 하나뿐만 아니라 하나 초과를 포함하고 선택적으로 추가적인 미등록 항목을 포함하는 것으로 해석되어야 한다. "~ 중 하나만" 또는 "~중 정확히 하나" 또는 청구범위에서 사용되는 경우 "~로 이루어진"과 같이 반대로 명확하게 표시된 용어만이 숫자 또는 요소의 목록 중 정확히 하나의 요소를 포함하는 것을 의미할 것이다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용되는 용어 "또는"은 "둘 중 하나", "~ 중 하나", "~ 중 하나만" 또는 "~ 중 정확히 하나"와 같은 배타적인 용어가 앞에 올 경우 배타적인 대안(즉, "둘 중 하나 또는 둘 다 아닌")을 나타내는 것으로만 해석되어야 한다. 청구범위에서 사용되는 경우 "~로 본질적으로 이루어지는"은 특허법 분야에서 사용되는 바와 같은 일반적인 의미를 가질 것이다.
본 명세서 및 청구범위에 사용되는 바와 같이, 하나 이상의 요소의 목록과 관련하여 어구 "적어도 하나"는 요소의 목록의 요소 중 임의의 중 하나 이상으로부터 선택된 적어도 하나의 요소를 의미하는 것으로 이해되어야 하지만, 요소의 목록 내에 구체적으로 나열된 각각의 모든 요소 중 적어도 하나를 반드시 포함할 필요는 없으며 요소의 목록에 있는 요소의 임의의 조합을 제외하지 않는다. 이 정의는 또한 구체적으로 식별된 요소와 관련이 있는지 여부에 관계없이 "적어도 하나"라는 어구가 참조하는 요소의 목록 내에서 특별히 식별된 요소 이외의 요소가 선택적으로 존재할 수 있음을 허용한다. 따라서, 비제한적인 예로서, "A와 B 중 적어도 하나"(또는 동등하게는 "A 또는 B 중 적어도 하나" 또는 동등하게는 "A 및/또는 B 중 적어도 하나")는 일 실시형태에서는 B가 존재하지 않는 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A(그리고 선택적으로 B 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서는 A가 존재하지 않는 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B(그리고 선택적으로 A 이외의 요소를 포함함); 또 다른 실시형태에서는 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 A 및 선택적으로 하나 초과를 포함하는 적어도 하나의 B(그리고 선택적으로 다른 요소를 포함함); 등을 지칭할 수 있다.
또한, 명확하게 반대로 나타내지 않는 한, 하나 초과의 단계 또는 행위를 포함하는 본 명세서에 청구된 임의의 방법에서, 방법의 단계 또는 행위의 순서가 반드시 방법의 단계 또는 행위가 언급되는 순서로 제한되는 것은 아니라는 점을 이해하여야 한다.
SEQUENCE LISTING <110> Arbor Biotechnologies, Inc. <120> GENE EDITING SYSTEMS COMPRISING A CRISPR NUCLEASE AND USES THEREOF <130> 116928-0042-0001WO00 <140> PCT/US2022/031821 <141> 2022-06-01 <150> US 63/299,695 <151> 2022-01-14 <150> US 63/272,937 <151> 2021-10-28 <150> US 63/236,047 <151> 2021-08-23 <150> US 63/195,621 <151> 2021-06-01 <160> 259 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 3162 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 atgagcagcg cgatcaaaag ctacaagagc gttctgcgtc cgaacgagcg taagaaccaa 60 ctgctgaaaa gcaccattca gtgcctggaa gacggtagcg cgttcttttt caagatgctg 120 caaggcctgt ttggtggcat caccccggag attgttcgtt tcagcaccga acaggagaaa 180 cagcaacagg atatcgcgct gtggtgcgcg gttaactggt tccgtccggt gagccaagac 240 agcctgaccc acaccattgc gagcgataac ctggtggaga agtttgagga atactatggt 300 ggcaccgcga gcgacgcgat caaacagtac ttcagcgcga gcattggcga aagctactat 360 tggaacgact gccgtcaaca gtactatgat ctgtgccgtg agctgggtgt tgaggtgagc 420 gacctgaccc atgatctgga gatcctgtgc cgtgaaaagt 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cgggggaagu gguuggucag caucagcuac uuugggaagu 60 gguugcgagg cauggauuau agccgaaggc cccagcuuug ccuuguucua gcaguuccac 120 uccugggcag cccgaga 137 <210> 55 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 55 agaaauccgu cuuucauuga cgggggaagu gguuggucag caucagcuac uuugggaagu 60 gguugcgagg cauggauuau agccgaaggc cccagcuuug ccuuguu 107 <210> 56 <211> 107 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 56 agaaauccgu cuuucauuga cgggggaagu gguuggucag caugcacccc cauaaggggg 60 cagcuacuuu gggaaguggu ugcgaggcau ggauuauagc cgaaggc 107 <210> 57 <211> 90 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 57 agaaauccgu cuuucauuga cgggggaagu gguuggucag caucagcuac uuugggaagu 60 gguugcgagg cauggauuau agccgaaggc 90 <210> 58 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 58 agaaauccgu cuuucauuga cgggggaagu gguuggucag caucagcuac uuugggaagu 60 gguugagcgg ucagcaugga uuauagccga aggc 94 <210> 59 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence 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Synthetic <400> 84 agaaauccgu cuuucauuga cggaauccuc caccagucau gguagauacc uuuaauccuc 60 caccacgagu ggugacaacc ccaagcagcc 90 <210> 85 <211> 94 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 85 agaaauccgu cuuucauuga cggaauccuc caccagucau gguagauacc uuuaauccuc 60 caccaagcgg ucauggugac aaccccaagc agcc 94 <210> 86 <211> 86 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 86 agaaauccgu cuuucauuga cggaauccuc caccagucau gguagauacc uuuaauccuc 60 caccauggug acaaccccaa gcagcc 86 <210> 87 <211> 90 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 87 agaaauccgu cuuucauuga cgggggaagu gguuggucag caucagcuac uuugggaagu 60 gguugcgagg cauggauuau agccgaaggc 90 <210> 88 <211> 96 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 88 ugggaagugg uuggucagca gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc 60 cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgc 96 <210> 89 <211> 29 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 89 ggcuauaauc caugcaagug 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Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Val Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Lys Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Phe Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Arg Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Arg 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Gly Thr 770 <210> 235 <211> 774 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 235 Met Ile Leu Asp Thr Asp Tyr Ile Thr Glu Asp Gly Lys Pro Val Ile 1 5 10 15 Arg Ile Phe Lys Lys Glu Asn Gly Glu Phe Lys Ile Glu Tyr Asp Arg 20 25 30 Thr Phe Glu Pro Tyr Leu Tyr Ala Leu Leu Lys Asp Asp Ser Ala Ile 35 40 45 Glu Glu Val Lys Lys Ile Thr Ala Glu Arg His Ser Thr Val Val Thr 50 55 60 Val Lys Arg Val Glu Lys Val Gln Lys Lys Phe Leu Gly Arg Ser Val 65 70 75 80 Glu Val Trp Lys Leu Tyr Phe Thr His Pro Gln Asp Val Pro Ala Ile 85 90 95 Met Asp Lys Ile Arg Glu His Pro Ala Val Ile Asp Ile Tyr Glu Tyr 100 105 110 Asp Ile Pro Phe Ala Ile Arg Tyr Leu Ile Asp Lys Gly Leu Val Pro 115 120 125 Met Glu Gly Asp Glu Glu Leu Lys Leu Leu Ala Leu Asp Ile Gly Thr 130 135 140 Pro Cys His Glu Gly Glu Val Phe Ala Glu Gly Pro Ile Leu Met Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Ala Asp Glu Glu Gly Thr Arg Val Ile Thr Trp Arg Asn Val 165 170 175 Asp Leu Pro Tyr Val Asp Val Leu Ser Thr Glu Arg Glu Met Ile Gln 180 185 190 Arg Phe Leu Arg Val Val Lys Glu Lys Asp Pro Asp Val Leu Ile Thr 195 200 205 Tyr Asn Gly Asp Asn Phe Asp Phe Ala Tyr Leu Lys Lys Arg Cys Glu 210 215 220 Lys Leu Gly Ile Asn Phe Thr Leu Gly Arg Glu Gly Ser Glu Pro Lys 225 230 235 240 Ile Gln Arg Met Gly Asp Arg Phe Ala Val Glu Val Lys Gly Arg Ile 245 250 255 His Phe Asp Leu Tyr Pro Val Ile Arg Arg Thr Val Asn Leu Pro Ile 260 265 270 Tyr Thr Leu Glu Ala Val Tyr Glu Ala Val Phe Gly Gln Pro Lys Glu 275 280 285 Lys Val Tyr Ala Glu Glu Ile Thr Thr Ala Trp Glu Thr Gly Glu Asn 290 295 300 Leu Glu Arg Val Ala Arg Tyr Ser Met Glu Asp Ala Lys Val Thr Tyr 305 310 315 320 Glu Leu Gly Lys Glu Phe Met Pro Met Glu Ala Gln Leu Ser Arg Leu 325 330 335 Ile Gly Gln Ser Leu Trp Asp Val Ser Arg Ser Ser Thr Gly Asn Leu 340 345 350 Val Glu Trp Phe Leu Leu Arg Lys Ala Tyr Glu Arg Asn Glu Leu Ala 355 360 365 Pro Asn Lys Pro Asp Glu Lys Glu Leu Ala Arg Arg His Gln Ser His 370 375 380 Glu Gly Gly Tyr Ile Lys Glu Pro Glu Arg Gly Leu Trp Glu Asn Ile 385 390 395 400 Val Tyr Leu Asp Phe Arg Ser Leu Tyr Pro Ser Ile Ile Ile Thr His 405 410 415 Asn Val Ser Pro Asp Thr Leu Asn Arg Glu Gly Cys Lys Glu Tyr Asp 420 425 430 Val Ala Pro Gln Val Gly His Arg Phe Cys Lys Asp Phe Pro Gly Phe 435 440 445 Ile Pro Ser Leu Leu Gly Asp Leu Leu Glu Glu Arg Gln Lys Ile Lys 450 455 460 Lys Arg Met Lys Ala Thr Ile Asp Pro Ile Glu Arg Lys Leu Leu Asp 465 470 475 480 Tyr Arg Gln Arg Ala Ile Lys Ile Leu Ala Asn Ser Leu Tyr Gly Tyr 485 490 495 Tyr Gly Tyr Ala Arg Ala Arg Trp Tyr Cys Lys Glu Cys Ala Glu Ser 500 505 510 Val Ile Ala Trp Gly Arg Glu Tyr Ile Thr Met Thr Ile Lys Glu Ile 515 520 525 Glu Glu Lys Tyr Gly Phe Lys Leu Ile Tyr Ser Asp Thr Asp Gly Phe 530 535 540 Phe Ala Thr Ile Pro Gly Ala Glu Ala Glu Thr Val Lys Lys Lys Ala 545 550 555 560 Met Glu Phe Leu Lys Tyr Ile Asn Ala Lys Leu Pro Gly Ala Leu Glu 565 570 575 Leu Glu Tyr Glu Gly Phe Tyr Lys Arg Gly Leu Phe Val Thr Lys Lys 580 585 590 Lys Tyr Ala Val Ile Asp Glu Glu Gly Lys Ile Thr Thr Arg Gly Leu 595 600 605 Glu Ile Val Arg Arg Asp Trp Ser Glu Ile Ala Lys Glu Thr Gln Ala 610 615 620 Arg Val Leu Glu Ala Leu Leu Lys Asp Gly Asp Val Glu Lys Ala Val 625 630 635 640 Arg Ile Val Lys Glu Val Thr Glu Lys Leu Ser Lys Tyr Glu Val Pro 645 650 655 Pro Glu Lys Leu Val Ile His Lys Gln Ile Thr Arg Asp Leu Lys Asp 660 665 670 Tyr Lys Ala Thr Gly Pro His Val Ala Val Ala Lys Arg Leu Ala Ala 675 680 685 Arg Gly Val Lys Ile Arg Pro Gly Thr Val Ile Ser Tyr Ile Val Leu 690 695 700 Lys Gly Ser Gly Arg Ile Val Asp Arg Ala Ile Pro Phe Asp Glu Phe 705 710 715 720 Asp Pro Thr Lys His Lys Tyr Asp Ala Glu Tyr Tyr Ile Glu Asn Gln 725 730 735 Val Leu Pro Ala Val Glu Arg Ile Leu Arg Ala Tyr Gly Tyr Arg Lys 740 745 750 Glu Asp Leu Trp Tyr Gln Lys Thr Arg Gln Val Gly Leu Ser Ala Arg 755 760 765 Leu Lys Pro Lys Gly Thr 770 <210> 236 <211> 683 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 236 Met Asp His Leu Leu Leu Lys Thr Gln Thr Gln Thr Glu Gln Val Met 1 5 10 15 Asn Val Thr Asn Pro Asn Ser Ile Tyr Ile Lys Gly Arg Leu Tyr Phe 20 25 30 Lys Gly Tyr Lys Lys Ile Glu Leu His Cys Phe Val Asp Thr Gly Ala 35 40 45 Ser Leu Cys Ile Ala Ser Lys Phe Val Ile Pro Glu Glu His Trp Val 50 55 60 Asn Ala Glu Arg Pro Ile Met Val Lys Ile Ala Asp Gly Ser Ser Ile 65 70 75 80 Thr Ile Ser Lys Val Cys Lys Asp Ile Asp Leu Ile Ile Ala Gly Glu 85 90 95 Ile Phe Arg Ile Pro Thr Val Tyr Gln Gln Glu Ser Gly Ile Asp Phe 100 105 110 Ile Ile Gly Asn Asn Phe Cys Gln Leu Tyr Glu Pro Phe Ile Gln Phe 115 120 125 Thr Asp Arg Val Ile Phe Thr Lys Asn Lys Ser Tyr Pro Val His Ile 130 135 140 Ala Lys Leu Thr Arg Ala Val Arg Val Gly Thr Glu Gly Phe Leu Glu 145 150 155 160 Ser Met Lys Lys Arg Ser Lys Thr Gln Gln Pro Glu Pro Val Asn Ile 165 170 175 Ser Thr Asn Lys Ile Glu Asn Pro Leu Glu Glu Ile Ala Ile Leu Ser 180 185 190 Glu Gly Arg Arg Leu Ser Glu Glu Lys Leu Phe Ile Thr Gln Gln Arg 195 200 205 Met Gln Lys Ile Glu Glu Leu Leu Glu Lys Val Cys Ser Glu Asn Pro 210 215 220 Leu Asp Pro Asn Lys Thr Lys Gln Trp Met Lys Ala Ser Ile Lys Leu 225 230 235 240 Ser Asp Pro Ser Lys Ala Ile Lys Val Lys Pro Met Lys Tyr Ser Pro 245 250 255 Met Asp Arg Glu Glu Phe Asp Lys Gln Ile Lys Glu Leu Leu Asp Leu 260 265 270 Lys Val Ile Lys Pro Ser Lys Ser Pro His Met Ala Pro Ala Phe Leu 275 280 285 Val Asn Asn Glu Ala Glu Lys Arg Arg Gly Lys Lys Arg Met Val Val 290 295 300 Asn Tyr Lys Ala Met Asn Lys Ala Thr Val Gly Asp Ala Tyr Asn Leu 305 310 315 320 Pro Asn Lys Asp Glu Leu Leu Thr Leu Ile Arg Gly Lys Lys Ile Phe 325 330 335 Ser Ser Phe Asp Cys Lys Ser Gly Phe Trp Gln Val Leu Leu Asp Gln 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Arg Met Arg Thr Ile Tyr Gln Pro Ser Arg Glu 65 70 75 80 Leu Lys Ala Leu Gln Gly Trp Val Leu Arg Asn Ile Leu Asp Lys Leu 85 90 95 Ser Ser Ser Pro Phe Ser Ile Gly Phe Glu Lys His Gln Ser Ile Leu 100 105 110 Asn Asn Ala Thr Pro His Ile Gly Ala Asn Phe Ile Leu Asn Ile Asp 115 120 125 Leu Glu Asp Phe Phe Pro Ser Leu Thr Ala Asn Lys Val Phe Gly Val 130 135 140 Phe His Ser Leu Gly Tyr Asn Arg Leu Ile Ser Ser Val Leu Thr Lys 145 150 155 160 Ile Cys Cys Tyr Lys Asn Leu Leu Pro Gln Gly Ala Pro Ser Ser Pro 165 170 175 Lys Leu Ala Asn Leu Ile Cys Ser Lys Leu Asp Tyr Arg Ile Gln Gly 180 185 190 Tyr Ala Gly Ser Arg Gly Leu Ile Tyr Thr Arg Tyr Ala Asp Asp Leu 195 200 205 Thr Leu Ser Ala Gln Ser Met Lys Lys Val Val Lys Ala Arg Asp Phe 210 215 220 Leu Phe Ser Ile Ile Pro Ser Glu Gly Leu Val Ile Asn Ser Lys Lys 225 230 235 240 Thr Cys Ile Ser Gly Pro Arg Ser Gln Arg Lys Val Thr Gly Leu Val 245 250 255 Ile Ser Gln Glu Lys Val Gly Ile Gly Arg Glu Lys Tyr Lys Glu Ile 260 265 270 Arg Ala Lys Ile His His Ile Phe Cys Gly Lys Ser Ser Glu Ile Glu 275 280 285 His Val Arg Gly Trp Leu Ser Phe Ile Leu Ser Val Asp Ser Lys Ser 290 295 300 His Arg Arg Leu Ile Thr Tyr Ile Ser Lys Leu Glu Lys Lys Tyr Gly 305 310 315 320 Lys Asn Pro Leu Asn Lys Ala Lys Thr 325 <210> 238 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 238 Met Glu Lys Glu Gly Gln Leu Glu Glu Ala Pro Pro Thr Asn Pro Tyr 1 5 10 15 Asn Thr Pro Thr Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Lys Asn Lys Trp Arg 20 25 30 Met Leu Ile Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Val Thr Gln Asp Phe Thr 35 40 45 Glu Ile Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Ala Lys Lys Arg 50 55 60 Arg Ile Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Ile Pro Leu 65 70 75 80 His Glu Asp Phe Arg Pro Tyr Thr Ala Phe Thr Leu Pro Ser Val Asn 85 90 95 Asn Ala Glu Pro Gly Lys Arg Tyr Ile Tyr Lys Val Leu Pro Gln Gly 100 105 110 Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln His Thr Met Arg Gln Val Leu 115 120 125 Glu Pro Phe Arg Lys Ala Asn Lys Asp Val Ile Ile Ile Gln Tyr Met 130 135 140 Asp Asp Ile Leu Ile Ala Ser Asp Arg Thr Asp Leu Glu His Asp Arg 145 150 155 160 Val Val Leu Gln Leu Lys Glu Leu Leu Asn Gly Leu Gly Phe Ser Thr 165 170 175 Pro Asp Glu Lys Phe Gln Lys Asp Pro Pro Ile His Trp Met Gly Tyr 180 185 190 Glu Leu Trp Pro Thr Lys Trp Lys Leu Gln Lys Ile Gln Leu Pro Gln 195 200 205 Lys Glu Ile Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Val Leu 210 215 220 Asn Trp Ala Ala Gln Leu Tyr Pro Gly Ile Lys 225 230 235 <210> 239 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 239 Met Glu Glu Glu Gly Lys Ile Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr 1 5 10 15 Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg 20 25 30 Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp 35 40 45 Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys 50 55 60 Ser Val Thr Val Leu Asp Val Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu 65 70 75 80 Asp Glu Ser Phe Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Asn 85 90 95 Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly 100 105 110 Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu 115 120 125 Glu Pro Phe Arg Ile Lys Asn Pro Glu Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met 130 135 140 Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Thr 145 150 155 160 Lys Ile Glu Glu Leu Arg Ala His Leu Leu Ser Trp Gly Phe Thr Thr 165 170 175 Pro Asp Lys Lys His Gln Lys Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr 180 185 190 Glu Leu His Pro Asp Arg Trp Thr Val Gln Pro Ile Asp Leu Pro Glu 195 200 205 Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu 210 215 220 Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr Ala Gly Ile Lys 225 230 235 <210> 240 <211> 441 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 240 Met Pro Ile Ser Pro Ile Glu Thr Val Pro Val Lys Leu Lys Pro Gly 1 5 10 15 Met Asp Gly Pro Lys Val Lys Gln Trp Pro Leu Thr Glu Glu Lys Ile 20 25 30 Lys Ala Leu Val Glu Ile Cys Thr Glu Met Glu Lys Glu Gly Lys Ile 35 40 45 Ser Lys Ile Gly Pro Glu Asn Pro Tyr Asn Thr Pro Val Phe Ala Ile 50 55 60 Lys Lys Lys Asp Ser Thr Lys Trp Arg Lys Leu Val Asp Phe Arg Glu 65 70 75 80 Leu Asn Lys Arg Thr Gln Asp Phe Trp Glu Val Gln Leu Gly Ile Pro 85 90 95 His Pro Ala Gly Leu Lys Lys Lys Lys Ser Val Thr Val Leu Asp Val 100 105 110 Gly Asp Ala Tyr Phe Ser Val Pro Leu Asp Glu Asp Phe Arg Lys Tyr 115 120 125 Thr Ala Phe Thr Ile Pro Ser Ile Asn Asn Glu Thr Pro Gly Ile Arg 130 135 140 Tyr Gln Tyr Asn Val Leu Pro Gln Gly Trp Lys Gly Ser Pro Ala Ile 145 150 155 160 Phe Gln Ser Ser Met Thr Lys Ile Leu Glu Pro Phe Arg Lys Gln Asn 165 170 175 Pro Asp Ile Val Ile Tyr Gln Tyr Met Asp Asp Leu Tyr Val Gly Ser 180 185 190 Asp Leu Glu Ile Gly Gln His Arg Thr Lys Ile Glu Glu Leu Arg Gln 195 200 205 His Leu Leu Arg Trp Gly Leu Thr Thr Pro Asp Lys Lys His Gln Lys 210 215 220 Glu Pro Pro Phe Leu Trp Met Gly Tyr Glu Leu His Pro Asp Lys Trp 225 230 235 240 Thr Val Gln Pro Ile Val Leu Pro Glu Lys Asp Ser Trp Thr Val Asn 245 250 255 Asp Ile Gln Lys Leu Val Gly Lys Leu Asn Trp Ala Ser Gln Ile Tyr 260 265 270 Pro Gly Ile Lys Val Arg Gln Leu Cys Lys Leu Leu Arg Gly Thr Lys 275 280 285 Ala Leu Thr Glu Val Ile Pro Leu Thr Glu Glu Ala Glu Leu Glu Leu 290 295 300 Ala Glu Asn Arg Glu Ile Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val Tyr Tyr 305 310 315 320 Asp Pro Ser Lys Asp Leu Ile Ala Glu Ile Gln Lys Gln Gly Gln Gly 325 330 335 Gln Trp Thr Tyr Gln Ile Tyr Gln Glu Pro Phe Lys Asn Leu Lys Thr 340 345 350 Gly Lys Tyr Ala Arg Met Arg Gly Ala His Thr Asn Asp Val Lys Gln 355 360 365 Leu Thr Glu Ala Val Gln Lys Ile Thr Thr Glu Ser Ile Val Ile Trp 370 375 380 Gly Lys Thr Pro Lys Phe Lys Leu Pro Ile Gln Lys Glu Thr Trp Glu 385 390 395 400 Thr Trp Trp Thr Glu Tyr Trp Gln Ala Thr Trp Ile Pro Glu Trp Glu 405 410 415 Phe Val Asn Thr Pro Pro Leu Val Lys Leu Trp Tyr Gln Leu Glu Lys 420 425 430 Glu Pro Ile Val Gly Ala Glu Thr Phe 435 440 <210> 241 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 241 aauagcggcc cuaagaaauc cgucuuucau ugacgg 36 <210> 242 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 242 auuggaacug gcgagaaauc cgucuuucau ugacgg 36 <210> 243 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 243 ccagcaacac cuaagaaauc cgucuuucau ugacgg 36 <210> 244 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 244 cggcgcucga auaggaaauc cgucuuucau ugacgg 36 <210> 245 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 245 guggcaacac cuaagaaauc cgucuuucau ugacgg 36 <210> 246 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 246 guugcaacac cuaagaaauc cgucuuucau ugacgg 36 <210> 247 <211> 36 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 247 guugcaaugc cuaagaaauc cgucuuucau ugacgg 36 <210> 248 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 248 gggaagtggt tggtcagcat 20 <210> 249 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 249 gggaagtggt tgcgaggcat 20 <210> 250 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 250 gggaagtggt tgagcggtca 20 <210> 251 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 251 gggaagtggt tggcat 16 <210> 252 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 252 gagccagtgt tgctagtcaa 20 <210> 253 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 253 gagccagtgt tgcgagtcaa 20 <210> 254 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 254 gagccagtgt tgagcgctag 20 <210> 255 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 255 gagccagtgt tgtcaa 16 <210> 256 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 256 ttaaactctc catggaccag 20 <210> 257 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 257 ttaaactctc cacgagccag 20 <210> 258 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 258 ttaaactctc caagcgtgga 20 <210> 259 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 259 ttaaactctc caccag 16

Claims (88)

  1. 유전자 편집 시스템으로서,
    (a) 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 또는 상기 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산;
    (b) 역전사효소(reverse transcriptase: RT) 폴리펩타이드 또는 상기 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산;
    (c) 가이드 RNA(gRNA) 또는 상기 gRNA를 암호화하는 제3 핵산으로서, 상기 gRNA는 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위(CRISPR 뉴클레이스 결합 부위) 및 관심 게놈 부위 내의 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열, 프로토스페이서 인접 모티프(protospacer adjacent motif: PAM)에 인접한 표적 서열을 포함하는, 상기 가이드 RNA(gRNA) 또는 상기 gRNA를 암호화하는 제3 핵산; 및
    (d) 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 상기 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산으로서, 상기 RT 공여체 RNA는 프라이머 결합 부위(primer binding site: PBS) 및 주형 서열을 포함하는, 상기 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 상기 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산
    을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 상기 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드는 Cas12 폴리펩타이드인, 유전자 편집 시스템.
  3. 제2항에 있어서, 상기 Cas12 폴리펩타이드는 Cas12i 폴리펩타이드이고, 선택적으로 Cas12i2 폴리펩타이드인, 유전자 편집 시스템.
  4. 제3항에 있어서, 상기 Cas12i 폴리펩타이드는 서열번호 2와 적어도 95% 동일한 아미노산 서열을 포함하는 Cas12i2 폴리펩타이드인, 유전자 편집 시스템.
  5. 제4항에 있어서, 상기 Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 2의 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035 및/또는 S1046 위치에 하나 이상의 돌연변이를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  6. 제5항에 있어서, 상기 하나 이상의 돌연변이는 선택적으로 D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R, S1046G 또는 이들의 조합인 아미노산 치환인, 유전자 편집 시스템.
  7. 제5항에 있어서, 상기 Cas12i2 폴리펩타이드는,
    (i) 선택적으로 D581R, D911R, I926R 및 V1030G의 아미노산 치환인 D581, D911, I926 및 V1030 위치에서의 돌연변이;
    (ii) 선택적으로 D581R, I926R 및 V1030G의 아미노산 치환인 D581, I926 및 V1030 위치에서의 돌연변이;
    (iii) 선택적으로 D581R, I926R, V1030G 및 S1046G의 아미노산 치환인 D581, I926, V1030 및 S1046 위치에서의 돌연변이;
    (iv) 선택적으로 D581R, G624R, F626R, I926R, V1030G, E1035R 및 S1046G의 아미노산 치환인 D581, G624, F626, I926, V1030, E1035 및 S1046 위치에서의 돌연변이; 또는
    (v) 선택적으로 D581R, G624R, F626R, P868T, I926R, V1030G, E1035R 및 S1046G의 아미노산 치환인 D581, G624, F626, P868, I926, V1030, E1035 및 S1046 위치에서의 돌연변이
    를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  8. 제7항에 있어서, 상기 Cas12i2 폴리펩타이드는 서열번호 3 내지 7 중 어느 하나, 선택적으로 서열번호 4 또는 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  9. 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 Cas12i 폴리펩타이드는 감소된 crRNA 처리 활성을 갖되, 선택적으로 상기 Cas12i 폴리펩타이드는 서열번호 2의 H485 위치 및/또는 H486 위치에 돌연변이를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드를 암호화하는 제1 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  12. 제11항에 있어서, 상기 제1 핵산은, 선택적으로 제1 바이러스 벡터인 제1 벡터에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  13. 제11항에 있어서, 상기 제1 핵산은 제1 메신저 RNA(mRNA)인, 유전자 편집 시스템.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 RT 폴리펩타이드는 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(Moloney Murine Leukemia Virus: MMLV)-RT, 마우스 유방 종양 바이러스(mouse mammary tumor virus: MMTV)-RT, 마라톤-RT 또는 RTx-RT인, 유전자 편집 시스템.
  15. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 RT 폴리펩타이드를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  16. 제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 RT 폴리펩타이드를 암호화하는 제2 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  17. 제16항에 있어서, 상기 제2 핵산은, 선택적으로 제2 바이러스 벡터인 제2 벡터에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  18. 제17항에 있어서, 상기 제2 벡터는 상기 제1 벡터와 동일한, 유전자 편집 시스템.
  19. 제16항에 있어서, 상기 제2 핵산은 제2 mRNA인, 유전자 편집 시스템.
  20. 제17항에 있어서, 상기 제1 mRNA 및 상기 제2 mRNA는 단일 RNA 분자에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  21. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유전자 편집 시스템은 상기 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드와 상기 RT 폴리펩타이드를 포함하는 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  22. 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드와 상기 RT 폴리펩타이드는 별도의 폴리펩타이드인, 유전자 편집 시스템.
  23. 제1항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 스페이서 서열은 20개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이, 선택적으로 20개의 뉴클레오타이드 길이인, 유전자 편집 시스템.
  24. 제3항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PAM은, 선택적으로 상기 표적 서열의 5'에 위치하는 5'-TTN-3'의 모티프를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  25. 제3항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 하나 이상의 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위는 직접 반복 서열(들)인, 유전자 편집 시스템.
  26. 제25항에 있어서, 각각의 직접 반복 서열은 23개 내지 36개의 뉴클레오타이드 길이, 선택적으로 23개의 뉴클레오타이드 길이인, 유전자 편집 시스템.
  27. 제26항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 적어도 23개의 뉴클레오타이드 길이인 서열번호 15 내지 17 및 241 내지 247 중 어느 하나 또는 이의 단편과 적어도 90% 동일한, 유전자 편집 시스템.
  28. 제27항에 있어서, 상기 직접 반복 서열은 적어도 23개의 뉴클레오타이드 길이인 서열번호 15 내지 17 및 241 내지 247 중 어느 하나 또는 이의 단편이고; 선택적으로 상기 직접 반복 서열은 서열번호 17인, 유전자 편집 시스템.
  29. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 gRNA를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  30. 제1항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 gRNA를 암호화하는 상기 제3 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  31. 제30항에 있어서, 상기 제3 핵산은, 선택적으로 바이러스 벡터인 제3 벡터에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  32. 제31항에 있어서, 상기 제3 벡터는 상기 제1 벡터 및/또는 상기 제2 벡터와 동일한, 유전자 편집 시스템.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PBS는 5개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이, 선택적으로 10개 내지 60개의 뉴클레오타이드 길이, 바람직하게는 10개 내지 30개의 뉴클레오타이드 길이인, 유전자 편집 시스템.
  34. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PBS는 상기 표적 서열의 상보적 영역에 인접한 PBS-표적화 부위에 결합하고, 상기 PBS-표적화 부위는 상기 표적 서열의 상보적 영역의 상류에 있는, 유전자 편집 시스템.
  35. 제34항에 있어서, 상기 PBS-표적화 부위는 상기 표적 서열의 상보적 영역의 상류에 있는 3개 내지 10개의 뉴클레오타이드인, 유전자 편집 시스템.
  36. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PBS-표적화 부위는 상기 표적 서열의 상보적 영역과 중첩되는, 유전자 편집 시스템.
  37. 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 PBS-표적화 부위는 상기 표적 서열에 인접하거나 또는 이와 중첩되는, 유전자 편집 시스템.
  38. 제1항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 서열은 5개 내지 100개의 뉴클레오타이드 길이, 선택적으로 30개 내지 50개의 뉴클레오타이드 길이인, 유전자 편집 시스템.
  39. 제1항 내지 제38항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 주형 서열은 상기 관심 게놈 부위와 상동성이고, 상기 관심 게놈 부위에 대해 하나 이상의 뉴클레오타이드 변이를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  40. 제39항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변이는 상기 표적 서열 내에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  41. 제39항 또는 제40항에 있어서, 상기 적어도 하나의 뉴클레오타이드 변이는 PAM에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  42. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 RT 공여체 RNA를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  43. 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 상기 RT 공여체 RNA를 암호화하는 상기 제4 핵산을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  44. 제43항에 있어서, 상기 제4 핵산은, 선택적으로 제4 바이러스 벡터인 제4 벡터에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  45. 제44항에 있어서, 상기 4 벡터는 상기 제1 벡터, 상기 제2 벡터 및/또는 상기 제3 벡터와 동일한, 유전자 편집 시스템.
  46. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 및 상기 RT 공여체 RNA는, 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 상기 스페이서 서열, 상기 PBS 및 상기 주형 서열을 포함하는 단일 RNA 분자에 위치하는, 유전자 편집 시스템.
  47. 제46항에 있어서, 상기 단일 RNA 분자는 상기 gRNA와 상기 RT 공여체 RNA 사이에 링커를 추가로 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  48. 제47항에 있어서, 상기 링커는 헤어핀을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  49. 제46항 내지 제48항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 RNA 분자는, 5'에서 3'로,
    (i) 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 상기 스페이서 서열, 상기 주형 서열 및 상기 PBS;
    (ii) 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 상기 스페이서 서열, 상기 링커, 상기 주형 서열 및 상기 PBS;
    (iii) 상기 주형 서열, 상기 PBS, 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 상기 스페이서 서열; 또는
    (iv) 상기 주형 서열, 상기 PBS, 상기 링커, 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 상기 스페이서 서열
    을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  50. 제46항 내지 제49항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 단일 RNA 분자는 5' 말단 보호 단편, 3' 말단 보호 단편 또는 둘 다를 추가로 포함하며, 상기 5' 말단 보호 단편 및 상기 3' 말단 보호 단편 각각은, 선택적으로 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조인 2차 구조를 형성하는, 유전자 편집 시스템.
  51. 제50항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA인, 유전자 편집 시스템.
  52. 제50항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동이 아닌 하나 이상의 분절을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  53. 제1항 내지 제45항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 gRNA 및 상기 RT 공여체 RNA는 2개의 개별 RNA 분자인, 유전자 편집 시스템.
  54. 제53항에 있어서, 상기 gRNA, RT 공여체 RNA 또는 둘 다는 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편을 추가로 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  55. 제54항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은, 선택적으로 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조인 2차 구조를 형성하거나 또는 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA인, 유전자 편집 시스템.
  56. 제54항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동이 아닌 하나 이상의 분절을 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  57. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 요소 (a), (b), (c), (d) 또는 이들의 임의의 조합을 포함하는 하나 이상의 지질 나노입자(LNP)를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  58. 제1항 내지 제57항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 (i) (a) 내지 (d) 중 최대 3개의 요소를 집합적으로 포함하는 하나 이상의 지질 나노입자(LNP) 및 (ii) 하나 이상의 벡터를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  59. 제58항에 있어서, 상기 하나 이상의 벡터는, 선택적으로 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터인 하나 이상의 바이러스 벡터인, 유전자 편집 시스템.
  60. 제1항 내지 제56항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 시스템은 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드, RT 폴리펩타이드, gRNA 및 RT 공여체 RNA를 포함하는, 유전자 편집 시스템.
  61. 제60항에 있어서, 상기 유형 V CRISPR 뉴클레이스 폴리펩타이드 및/또는 상기 RT 폴리펩타이드는 상기 gRNA 및/또는 상기 RT 공여체 RNA와 복합체를 형성하는, 유전자 편집 시스템.
  62. 제1항 내지 제61항 중 어느 하나의 시스템을 포함하는 약제학적 조성물.
  63. 제1항 내지 제61항 중 어느 하나에 제시된 시스템의 (a) 내지 (d)의 요소를 포함하는 키트.
  64. 세포를 유전자 편집하는 방법으로서, 숙주 세포와 제1항 내지 제61항 중 어느 하나의 유전자 편집 시스템 또는 제62항의 약제학적 조성물을 접촉시켜 상기 숙주 세포를 유전자 편집하는 접촉 단계를 포함하는, 방법.
  65. 제64항에 있어서, 상기 숙주 세포는 시험관내에서 배양된, 방법.
  66. 제65항에 있어서, 상기 접촉 단계는 상기 유전자 편집 시스템을 상기 숙주 세포를 포함하는 대상체에게 투여함으로써 수행되는, 방법.
  67. 제1항 내지 제61항 중 어느 하나의 유전자 편집 시스템에 의해 생산되는 유전자 변형된 세포의 집단.
  68. 제67항에 있어서, 상기 유전자 편집 시스템에 의해 편집될 수 없는 유전자 변형된 세포를 포함하는, 유전자 변형된 세포의 집단.
  69. 제68항에 있어서, 상기 유전자 변형된 세포는 상기 PAM, 상기 표적 서열 또는 둘 다에 하나 이상의 변형을 포함하는, 유전자 변형된 세포의 집단.
  70. 유전자 편집 RNA 분자로서,
    (i) 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위(CRISPR 뉴클레이스 결합 부위);
    (ii) 유전자 부위 내의 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열로서, 상기 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한, 상기 스페이서 서열;
    (iii) 프라이머 결합 부위(PBS); 및
    (iv) 주형 서열
    을 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자.
  71. 제70항에 있어서, 하나 이상의 링커를 추가로 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자.
  72. 제70항 또는 제71항에 있어서, 상기 RNA 분자는, 5'에서 3'로,
    (i) 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 상기 스페이서 서열, 상기 주형 서열 및 상기 PBS;
    (ii) 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위, 상기 스페이서 서열, 상기 링커, 상기 주형 서열 및 상기 PBS;
    (iii) 상기 주형 서열, 상기 PBS, 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 상기 스페이서 서열; 또는
    (iv) 상기 주형 서열, 상기 PBS, 상기 링커, 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 및 상기 스페이서 서열
    을 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자.
  73. 제70항 내지 제72항 중 어느 한 항에 있어서, 5' 말단 보호 단편, 3' 말단 보호 단편 또는 둘 다를 추가로 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자.
  74. 제73항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은, 선택적으로 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조인 2차 구조를 형성하거나 또는 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA인, 유전자 편집 RNA 분자.
  75. 제73항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동이 아닌 하나 이상의 분절을 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자.
  76. 유전자 편집 RNA 분자 세트로서,
    (i) 유형 V CRISPR 뉴클레이스에 의해 인식 가능한 하나 이상의 결합 부위(CRISPR 뉴클레이스 결합 부위) 및 유전자 부위 내의 표적 서열에 특이적인 스페이서 서열을 포함하는 가이드 RNA로서, 상기 표적 서열은 프로토스페이서 인접 모티프(PAM)에 인접한, 상기 가이드 RNA; 및
    (ii) 역전사 공여체 RNA(RT 공여체 RNA) 또는 상기 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산으로서, 상기 RT 공여체 RNA는 프라이머 결합 부위(PBS) 및 주형 서열을 포함하는, 상기 RT 공여체 RNA 또는 상기 RT 공여체 RNA를 암호화하는 제4 핵산
    을 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자 세트.
  77. 제76항에 있어서, 상기 gRNA, 상기 RT 공여체 RNA 또는 둘 다는 5' 말단 보호 단편 및/또는 3' 말단 보호 단편을 추가로 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자 세트.
  78. 제77항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은, 선택적으로 헤어핀, 슈도노트 또는 삼중 구조인 2차 구조를 포함하거나 또는 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 엑소리보뉴클레이스-저항성 RNA(xrRNA), 전달 RNA(tRNA) 또는 절단형 tRNA인, 유전자 편집 RNA 분자 세트.
  79. 제77항에 있어서, 상기 5' 말단 보호 단편 및/또는 상기 3' 말단 보호 단편은 상기 CRISPR 뉴클레이스 결합 부위 중 하나 이상 및 선택적으로 임의의 인간 서열과 상동이 아닌 하나 이상의 분절을 포함하는, 유전자 편집 RNA 분자 세트.
  80. 제70항 내지 제79항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 상기 유형 V CRISPR 뉴클레이스 결합 부위는 제25항 내지 제28항 중 어느 한 항에 제시되어 있고;
    (ii) 상기 스페이서 서열은 제23항 또는 제24항에 제시되어 있고;
    (iii) 상기 PBS는 제33항 내지 제37항 중 어느 한 항에 제시되어 있고; 그리고/또는
    (iv) 상기 주형 서열은 제38항 내지 제41항 중 어느 한 항에 제시되어 있는, 유전자 편집 RNA 분자 또는 유전자 편집 RNA 분자 세트.
  81. DNA 분자 또는 DNA 분자 세트로서, 제70항 내지 제80항 중 어느 한 항에 제시된 유전자 편집 RNA 분자 또는 유전자 편집 RNA 분자 세트를 암호화하는, DNA 분자 또는 DNA 분자 세트.
  82. 제81항에 있어서, 벡터 또는 벡터 세트에 포함되어 있으며, 선택적으로 상기 벡터 또는 벡터 세트는 바이러스 벡터인, DNA 분자 또는 DNA 분자 세트.
  83. CRISPR 뉴클레이스 및 역전사효소를 포함하는 융합 폴리펩타이드.
  84. 제83항에 있어서, 상기 CRISPR 뉴클레이스는 유형 V CRISPR 뉴클레이스이고, 선택적으로 Cas12i 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  85. 제84항에 있어서, 상기 Cas12i 폴리펩타이드는 선택적으로 제4항 내지 제9항 중 어느 한 항에 제시되어 있는 Cas12i2 폴리펩타이드인, 융합 폴리펩타이드.
  86. 제85항에 있어서, 서열번호 25 내지 26 및 219 내지 223 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는, 융합 폴리펩타이드.
  87. 제83항 내지 제86항 중 어느 한 항의 융합 폴리펩타이드를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 핵산.
  88. 제87항에 있어서, 벡터, 선택적으로 발현 벡터인, 핵산.
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