TW202321447A

TW202321447A - 包含crispr核酸酶之組成物及其用途

Info

Publication number: TW202321447A
Application number: TW111134168A
Authority: TW
Inventors: 少榮仲; 昆丁諾曼威瑟斯; 羅伊齊布雷; 諾雅麥可杰奇莫; 安東尼詹姆士葛瑞提; 勞倫Ｅ雅方司
Original assignee: 美商阿伯生物技術公司
Priority date: 2021-09-08
Filing date: 2022-09-08
Publication date: 2023-06-01
Also published as: WO2023039472A2; WO2023039472A3; US20230235304A1; CA3230609A1; EP4399310A2; AU2022344256A1

Abstract

本發明係關於變異多肽、製備該等變異多肽之方法、用於表徵該等變異多肽之方法、包含該等變異多肽之組成物及細胞、以及使用該等變異多肽之方法。本發明進一步關於包含該等變異多肽之複合物、產生該等複合物之方法、用於表徵該等複合物之方法、包含該等複合物之細胞、及使用該等複合物之方法。

Description

包含CRISPR核酸酶之組成物及其用途

成簇規律間隔短回文重複序列(CRISPR)及CRISPR相關(Cas)基因統稱為CRISPR-Cas或CRISPR/Cas系統，係古菌(archaea)及細菌中保護特定物種抵禦外來基因元件之適應性免疫系統。

在上述背景下，本發明提供優於先前技術之某些優點及進展。

儘管本文所揭示之此發明不限於特定優點或功能，但本發明提供變異多肽及/或包含變異多肽之組成物，其中變異多肽相對於親本多肽包含改變，其中親本多肽包含SEQ ID NO: 3，其中該變異多肽能夠結合至引導RNA及目標核酸，且其中該變異多肽或包含該變異多肽之複合物相對於該親本多肽或包含該親本多肽之複合物展現增強的酶活性、增強的結合活性、增強的結合特異性及/或增強的穩定性。

在一些實施例中，本發明之變異多肽包含與SEQ ID NO: 3具有50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%但非100%一致性之多肽序列。

在一個態樣中，本發明提供一種變異多肽，其中該變異多肽包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之改變，其中該改變包含D509R、S511R、I521R、D535G、Q514G、L516R、L516G、E198R、S527R、D509K、D509G、L580G、V359R、D535K、Y381R、R354G、M380K、M380R、V383R、L580R、E367R、I521K、E367G、E507R、I521G、W350R、D535R、R528K、S527K、L385G、W350G、L516K、Y381G、H532R、D129R、P615R、G578R、M380G、V595G、R531G、D129G、R531K、D158G、N476G、G578K、A512R、P618R、V595R、V595K、V383G、A597G、Y381K、P618G、E198K、T288R、E507K、L385R、C538G、P615G、D386R、S511K、C371G、K136G、N220R、S78K、K141G、K240R、D277R、T165R或K374R，其中該變異多肽包含與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少90%一致性。

在一個態樣中，本發明提供一種變異多肽，其中該變異多肽包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之改變，其中該改變包含D509R、S511R、I521R、D535G、Q514G、L516R、L516G、E198R、S527R、D509K、D509G、L580G、V359R、D535K、Y381R、R354G、M380K、M380R、V383R、L580R、E367R、I521K、E367G、E507R、I521G、W350R、D535R、R528K、S527K、L385G、W350G、L516K、Y381G、H532R、D129R、P615R、G578R、M380G、V595G、R531G、D129G、R531K、D158G、N476G、G578K、A512R、P618R、V595R、V595K、V383G、A597G、Y381K、P618G、E198K、T288R、E507K、L385R、C538G、P615G、D386R、S511K或C371G、K136G、N220R、S78K、K141G、K240R、D277R、T165R或K374R，且其中該變異多肽與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之差異為1-20個胺基酸殘基。

在一些實施例中，變異多肽與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之差異為1至50個胺基酸殘基(例如1至45、1至35、1至25、1至15及10以及1至5個，5至50、5至40、5至30、5至20、5至10、10至50、10至40、10至30、10至20、10至15、15至50、15至40、15至30、15至20、20至50、20至40、20至30、20至35、25至50、25至40、25至30、30至50、30至40、30至35或40至50個胺基酸殘基)。在一些實施例中，變異多肽與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之差異為50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基。

在一些實施例中，變異多肽進一步包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的第二改變。在某些實施例中， i) 該改變包含L580G且第二改變包含L385G； ii) 該改變包含D509R且該第二改變包含M380R； iii) 該改變包含L580G且該第二改變包含A512R； iv) 該改變包含S527R且該第二改變包含C538G； v) 該改變包含D129R且該第二改變包含P618R；或 vi) 該改變包含Q514G且該第二改變包含A512R。

在一些實施例中，變異多肽進一步包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的第三改變。在一些實施例中， i) 該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含I521R； ii) 該改變包含L516R，該第二改變包含Q514G，且該第三改變包含I521R； iii) 該改變包含D509R，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含I521R； iv) 該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含Q514G； v) 該改變包含D535G，該第二改變包含Q514G，且該第三改變包含I521R； vi) 該改變包含K136G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含M380R vii) 該改變包含S78K，該第二改變包含E198R，且該第三改變包含R354G； viii) 該改變包含K141G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含M380R； ix) 該改變包含K141G，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含M380R；及， x) 該改變包含K141G，該第二改變包含D277R，且該第三改變包含M380R。

在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含Q514G，且該第三改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含Q514G。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含Q514G，且該第三改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含D535G，且該第三改變包含L516R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含Q514G。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含Q514G，且該第三改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含D535G，且該第三改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含D535G，且該第三改變包含Q514G。在一些實施例中，該改變包含K136G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含S78K，該第二改變包含E198R，且該第三改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含K141G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含K141G，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含K141G，該第二改變包含D277R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含K136G，該第二改變包含D277R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含S78K，該第二改變包含E198R，且該第三改變包含L385R。在一些實施例中，該改變包含S78K，該第二改變包含E198R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含K136G，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含T165R，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含S78K，該第二改變包含E198R，且該第三改變包含K374R。在一些實施例中，該改變包含T165R，該第二改變包含D277R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含T165R，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含K141G，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含L385R。在一些實施例中，該改變包含K136G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含L385R。在一些實施例中，該改變包含K141G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含L385R。在一些實施例中，該改變包含K141G，該第二改變包含D277R，且該第三改變包含L385R。在一些實施例中，該改變包含K136G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含K374R。在一些實施例中，該改變包含K136G，該第二改變包含D277R，且該第三改變包含L385R。在一些實施例中，該改變包含K136G，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含L385R。在一些實施例中，該改變包含T165R，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含L385R。

在某些實施例中，變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸進一步包含第四改變。在一些實施例中，該改變包含Q514G，該第二改變包含I521R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含I521R，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含Q514G，該第二改變包含I521R，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，該第三改變包含I521R，且該第四改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含I521R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含I521R，該第二改變包含S527R，該第三改變包含E198R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含S511R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含I521R，該第二改變包含S527R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含Q514G，該第二改變包含S527R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含I521R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含L516R，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含I521R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含S527R，該第二改變包含L580G，該第三改變包含E198R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含S527R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含I521R，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含I521R，且該第四改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含Q514G，該第二改變包含L580G，該第三改變包含E198R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含L516R，該第三改變包含I521R，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含I521R，且該第四改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含D535G，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含I521R，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含I521R，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含I521R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含S527R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含S527R，該第二改變包含L580G，該第三改變包含E198R，且該第四改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含Q514G，該第二改變包含I521R，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含E198R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含I521R，該第二改變包含S527R，該第三改變包含E198R，且該第四改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含I521R，該第二改變包含S527R，該第三改變包含R354G，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含I521R，該第二改變包含L580G，該第三改變包含E198R，且該第四改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含L516R，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含D535G，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含Q514G，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含L580G，該第二改變包含L385G，該第三改變包含S511R，且該第四改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含L580G，該第二改變包含L385G，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含D129R，該第二改變包含P618R，該第三改變包含S511R，且該第四改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含L580G，該第二改變包含L385G，該第三改變包含G578R，且該第四改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含D129R，該第二改變包含P618R，該第三改變包含R354G，且該第四改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含D129R，該第二改變包含P618R，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含D129R，該第二改變包含P618R，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含L580G，該第二改變包含L385G，該第三改變包含Q514G，且該第四改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含L580G，該第二改變包含L385G，該第三改變包含A512R，且該第四改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含D129R，該第二改變包含P618R，該第三改變包含D158G，且該第四改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含L580G，該第二改變包含L385G，該第三改變包含S527R，且該第四改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含D129R，該第二改變包含P618R，該第三改變包含V359R，且該第四改變包含A512R。

在某些實施例中，變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸進一步包含第五改變。在一些實施例中，該改變包含D509R，該第二改變包含D535G，該第三改變包含L516R，該第四改變包含Q514G，且該第五改變包含I521R。

在某些實施例中，變異多肽進一步包含第六改變，且視情況進一步包含第七、第八、第九及第十改變。

在一些實施例中，第二改變包含取代、插入或缺失。

在某些實施例中，第三改變包含取代、插入或缺失。

在一些實施例中，第四改變包含取代、插入或缺失。

在一些實施例中，第五改變包含取代、插入或缺失。

在一些實施例中，第六，視情況第七、視情況第八、視情況第九或視情況第十改變各自獨立地包含取代、插入或缺失。

在一些實施例中，變異多肽包含表6之改變。在一些實施例中，變異多肽包含表7之改變。在一些實施例中，變異多肽包含表8之改變。在一些實施例中，變異多肽包含表9之改變。在一些實施例中，變異多肽包含表7之任何細胞之兩個改變。在一些實施例中，變異多肽包含表8之任何細胞之複數個改變。在一些實施例中，變異多肽包含表9之任何細胞之複數個改變。

在一些實施例中，變異多肽或包含變異多肽之複合物相對於SEQ ID NO 3之多肽展現增強的酶活性及/或增強的穩定性。

在一些實施例中，變異多肽或包含變異多肽之複合物包含相對於SEQ ID NO: 3之多肽增強至少1.5倍、2倍、2.5倍或3倍的酶活性，例如藉由插入/缺失活性所量測，例如如實例9及10中所述。

在一些實施例中，增強的酶活性為增強的核酸酶活性。

在一些實施例中，變異多肽相對於親本多肽展現增強的與引導RNA之結合活性。

在一些實施例中，變異多肽相對於親本多肽展現增強的與引導RNA之結合特異性。

在一些實施例中，變異多肽與引導RNA形成變異二元複合物，且變異二元複合物展現以下特徵中之一或多者： (i) 相對於親本二元複合物，增強的與目標核酸之結合活性(例如中靶(on-target)結合活性)； (ii) 相對於親本二元複合物，增強的與目標核酸之結合特異性(例如中靶結合特異性)； (iii) 相對於親本二元複合物，增強的穩定性；及/或 (iv) 相對於親本二元複合物，減少的自目標核酸之解離，及/或減少的與非目標核酸之脫靶結合。

在一些實施例中，變異多肽與引導RNA形成變異二元複合物，且變異二元複合物相對於親本二元複合物展現增強的與目標核酸之結合活性(例如中靶結合活性)。

在一些實施例中，變異多肽與引導RNA形成變異二元複合物，且變異二元複合物相對於親本二元複合物展現增強的與目標核酸之結合特異性(例如中靶結合特異性)。

在一些實施例中，變異多肽與引導RNA形成變異二元複合物，且變異二元複合物相對於親本二元複合物展現增強的穩定性。

在一些實施例中，變異二元複合物與目標核酸形成變異三元複合物，且變異三元複合物相對於親本三元複合物展現增加的穩定性。

在一些實施例中，變異多肽相對於親本多肽進一步展現增強之二元複合物形成、增強之蛋白質-RNA相互作用及/或減少之自引導RNA之解離。

在一些實施例中，變異二元複合物相對於親本二元複合物進一步展現減少的自目標核酸之解離及/或減少的與非目標核酸之脫靶結合。

在一些實施例中，增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性在例如20℃至65℃之溫度範圍內發生。

在一些實施例中，增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性在一系列培育時間內發生。

在一些實施例中，增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中發生。

在一些實施例中，當變異多肽、變異二元複合物或變異三元複合物之T _m值比親本多肽、親本二元複合物或親本三元複合物之T _m值大至少8℃時，發生增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性。

在其他實施例中，改變包含相對於具有SEQ ID NO: 3中所闡述之序列之親本多肽的胺基酸序列改變，其中相比於具有SEQ ID NO: 3中所闡述之序列的親本多肽，該改變包含一或多個(例如一個、兩個、三個、四個、五個或更多個)取代、插入、缺失及/或添加。

在一些實施例中，該改變包含相對於SEQ ID NO: 3中所闡述之親本多肽序列的胺基酸序列改變，其中該改變包含表2中所列出之胺基酸取代中之一或多者。

在一些實施例中，改變包含精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸或甘胺酸取代。

在一些實施例中，變異多肽包含RuvC域或分離RuvC域。

在一些實施例中，變異多肽包含一或多個催化殘基(例如天冬胺酸或麩胺酸)。在一些實施例中，一或多個催化殘基包含D345、E506及D594。

在一些實施例中，變異多肽具有降低之核酸酶活性或為核酸酶死亡多肽。

在某些實施例中，第二改變包含多肽域之插入，其中視情況，插入位於SEQ ID NO: 3之序列之N端、C端或其內部。

在一些實施例中，變異多肽進一步包含肽標籤、螢光蛋白、鹼基編輯域、DNA甲基化域、組蛋白殘基修飾域、定位因子、轉錄修飾因子、光閘控控制因子、化學誘導因子或染色質可視化因子。

在一個態樣中，本發明提供一種系統，其包含本文所描述之變異多肽或編碼變異多肽之第一核酸及引導RNA或編碼引導RNA之第二核酸，其中引導RNA包含正向重複序列及間隔序列。

在一些實施例中，包含變異多肽之組成物或複合物進一步包含引導RNA，且引導RNA包含正向重複序列及間隔序列。

在一些實施例中，正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%序列一致性之核苷酸序列。

在一些實施例中，正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少95%序列一致性之核苷酸序列。

在一些實施例中，正向重複序列包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6之核苷酸序列。

在一些實施例中，間隔序列之長度包含15至35個核苷酸。

在某些實施例中，第一核酸位於第一載體中，且編碼引導RNA之第二核酸位於載體(例如第一載體或第二載體)中，視情況其中第一及/或第二載體為病毒載體。

在一些實施例中，引導RNA包含SEQ ID NO: 9、11、13、15、17、19、21及23中之任一者。

在一些實施例中，目標核酸包含與間隔序列中之核苷酸序列互補的序列。

在一些實施例中，目標核酸與原間隔序列相鄰模體(PAM)序列相鄰，其中該PAM序列包含闡述為5'-NTN-3'、5'-HTN-3'或5'-TNA-3'的核苷酸序列，其中N為任何核苷酸且H為A或C或T。在一些實施例中，PAM序列包含闡述為5'-CTG-3'或5'-CTC-3'之核苷酸序列。

在一些實施例中，目標核酸係單股DNA或雙股DNA。在一些實施例中，目標核酸係雙股DNA。

在一個態樣中，本發明提供一種核酸，其編碼本文所描述之變異多肽。

在一些實施例中，編碼變異多肽之核酸經密碼子最佳化以在細胞中表現。

在某些實施例中，編碼核酸進一步包含編碼引導RNA之序列。

在一些實施例中，編碼變異多肽之核酸係以可操作方式連接至啟動子。

在某些實施例中，核酸包含RNA (例如mRNA)。

在一些實施例中，編碼變異多肽之核酸係在載體中。

在一些實施例中，載體包含反轉錄病毒載體、慢病毒載體、噬菌體載體、腺病毒載體、腺相關載體或單純疱疹載體。

在某些實施例中，病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。

在一個態樣中，本發明提供一種組成物，其包含本文所描述之變異多肽、系統、核酸或載體。在一些實施例中，組成物存在於包含奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡或基因槍之遞送組成物中。

在一個態樣中，本發明提供一種細胞，其包含本文所描述之變異多肽、系統、核酸或載體。

在一些實施例中，細胞包含本文所揭示之變異多肽及/或組成物。

在一些實施例中，細胞為真核細胞或原核細胞。在一些實施例中，細胞為真核細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞或植物細胞。在一些實施例中，細胞為人類細胞。

本發明進一步提供一種製備本文所揭示之變異多肽之方法，該方法包含(i)將一或多個核苷酸取代引入至包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核酸中以產生編碼該變異多肽之變異核酸，及(ii)由該變異核酸表現該變異多肽。

本發明進一步提供一種形成本文所揭示之變異二元複合物之方法，該方法包含使本文所揭示之變異多肽與本文所揭示之引導RNA接觸。

在一個態樣中，本發明提供一種產生變異多肽之方法，該方法包含(i)產生編碼該變異多肽之核酸序列，及(ii)將該核酸序列引入至能夠表現該核酸序列之適當宿主細胞中，及(iii)使該宿主細胞表現該變異多肽。

在一個態樣中，本發明提供一種產生變異多肽之方法，該方法包含(i)將一或多個核苷酸取代引入至包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核酸中以產生編碼該變異多肽之變異核酸，及(ii)由該變異核酸表現該變異多肽。

本發明進一步提供一種形成變異三元複合物之方法，該方法包含使本文所揭示之變異多肽與本文所揭示之引導RNA及本文所揭示之目標核酸接觸。

在一個態樣中，本發明提供一種將變異多肽遞送至細胞之方法，該方法包含向細胞中引入本文所描述之變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及視情況引入引導RNA或編碼引導RNA之核酸，其中該引入視情況包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。

在一個態樣中，本發明提供一種用於修飾細胞中之目標DNA分子之方法，該方法包含向細胞中引入本文所描述之變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及引入引導RNA或編碼引導RNA之核酸，其中該引入視情況包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。在一些實施例中，向細胞中引入之步驟包含轉染或轉導細胞。在某些實施例中，向細胞中引入之步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。在一些實施例中，編碼變異多肽之核酸包含RNA (例如mRNA)。

在一個態樣中，本發明提供一種用於修飾目標DNA分子之方法，該方法包含使目標DNA分子與變異多肽及引導RNA接觸。在一些實施例中，目標DNA分子係在活體外或在細胞中。在某些實施例中，細胞為活體外、離體或活體內細胞。在一些實施例中，細胞係選自原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。

本發明進一步提供遞送本文所揭示之變異多肽或組成物或變異二元複合物之方法，該方法包含向細胞中引入變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及視情況引入本文所描述之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，或引入本文所描述之變異二元複合物，其中該引入包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。在一些實施例中，向細胞中引入之步驟包含轉染或轉導細胞。在一些實施例中，引入步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。

本發明又進一步提供一種包含變異多肽之組成物或包含變異多肽及引導RNA之複合物，其中變異多肽包含相對於親本多肽之改變，其中該親本多肽包含SEQ ID NO: 3，其中變異多肽能夠結合至引導RNA及目標核酸，且其中變異多肽或複合物相對於親本多肽或包含親本多肽及引導RNA之複合物展現增強的酶活性、增強的結合活性、增強的結合特異性及/或增強的穩定性。

在一些實施例中，增強的酶活性為增強的核酸酶活性。

在一些實施例中，改變包含E38R、T60R、D89R、S223R、P353G、L354G、L360G、K368G、E566R及/或D730R取代。

在一些實施例中，變異多肽包含RuvC域或分離RuvC域。

在一些實施例中，引導RNA包含正向重複序列及間隔序列。

在一些實施例中，間隔序列之長度包含15至35個核苷酸。

在一些實施例中，目標核酸與PAM序列相鄰，其中該目標核酸與原間隔序列相鄰模體(PAM)序列相鄰，其中該PAM序列包含闡述為5'-NTN-3'、5'-HTN-3'或5'-TNA-3'的核苷酸序列，其中N為任何核苷酸且H為A或C或T。在一些實施例中，PAM序列包含闡述為5'-CTG-3'或5'-CTC-3'之核苷酸序列。

在一些實施例中，目標核酸係單股DNA或雙股DNA。

在一些實施例中，編碼變異多肽之核酸係在載體中。

在一些實施例中，組成物或複合物存在於包含奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡或基因槍之遞送組成物中。

本發明進一步提供一種引導RNA或編碼引導RNA之核酸，該引導RNA包含正向重複序列，該正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4、5或6中之任一者至少90%一致性。在一些實施例中，引導RNA或編碼引導RNA之核酸包含鄰近於5'-CTG-3'或5'-CTC-3'原間隔序列相鄰模體結合的間隔序列。在一些實施例中，包含與SEQ ID NO: 4-6中之任一者具有至少90%序列一致性之核苷酸序列的引導RNA結合CRISPR核酸酶，例如根據SEQ ID NO: 3之CRISPR核酸酶。

本發明進一步提供包含引導RNA之組成物，其中該組成物進一步包含CRISPR核酸酶。在一些實施例中，CRISPR核酸酶包含與SEQ ID NO: 3至少80%一致性(例如至少80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)。在一些實施例中，CRISPR核酸酶包含與SEQ ID NO: 3至少95%一致性(例如至少95%、96%、97%、98%、99%或100%一致性)。在一些實施例中，CRISPR核酸酶包含SEQ ID NO: 3。

本發明進一步提供包含本文所揭示之變異多肽及/或複合物之細胞。在一些實施例中，細胞為真核細胞或原核細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞或植物細胞。在一些實施例中，細胞為人類細胞。

本發明進一步提供一種形成變異二元複合物之方法，該方法包含使本文所揭示之變異多肽與本文所揭示之引導RNA接觸。

本發明進一步提供一種將本文所揭示之變異多肽或組成物或變異二元複合物遞送至細胞之方法，該方法包含向細胞中引入本文所揭示之變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及視情況引入本文所描述之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，或引入本文所描述之變異二元複合物，其中該引入包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。在一些實施例中，向細胞中引入之步驟包含轉染或轉導細胞。在一些實施例中，引入步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。在一些實施例中，細胞係選自原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。在一些實施例中，細胞為活體外、離體或活體內細胞。

本發明進一步提供一種用於修飾細胞中之目標DNA分子之方法，該方法包含向細胞中引入本文所揭示之變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及引入本文所描述之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，或引入本文所描述之變異二元複合物，其中該引入包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。在一些實施例中，向細胞中引入之步驟包含轉染或轉導細胞。在一些實施例中，引入步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。在一些實施例中，細胞係選自原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。在一些實施例中，細胞為活體外、離體或活體內細胞。

本發明進一步提供一種用於修飾目標DNA分子之方法，該方法包含使目標DNA分子與本文所揭示之變異多肽及本文所揭示之引導RNA接觸。在一些實施例中，目標DNA分子係在活體外或在細胞中。在一些實施例中，細胞為活體外、離體或活體內細胞。在一些實施例中，細胞係選自原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。

在一些態樣中，本發明提供一種修飾細胞中之目標核酸之方法，其中該方法包含(i)向細胞中引入包含根據SEQ ID NO: 3之胺基酸序列或與其具有至少70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列的多肽或編碼該多肽之核酸，及(ii)將引導RNA(例如如本文中所描述)或編碼引導RNA之核酸引入至細胞中，其中目標核酸與原間隔序列相鄰模體(PAM)序列相鄰，其中該PAM序列包含闡述為5'-CTG-3'或5'-CTC-3'之核苷酸序列。在一些實施例中，多肽包含根據SEQ ID NO: 3-7中之任一者之胺基酸序列。引入視情況包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。在一些實施例中，向細胞中引入之步驟包含轉染或轉導細胞。在某些實施例中，向細胞中引入之步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。在一些實施例中，編碼多肽之核酸包含RNA (例如mRNA)。在一些實施例中，該方法在與5'-CTG-3'或5'-CTC-3'原間隔序列相鄰模體相鄰的位置處修飾目標DNA。在一些實施例中，修飾包含切割或裂解目標核酸。

在一些態樣中，本發明提供一種引導RNA或編碼該引導RNA之核酸，其中該引導RNA包含正向重複序列及間隔序列，且其中該正向重複序列包含SEQ ID NO: 4-6中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列，其中緊接該正向重複序列之3'的核苷酸係選自C、T或G。在一些態樣中，本發明提供一種引導RNA或編碼該引導RNA之核酸，其中該引導RNA包含正向重複序列及間隔序列，且其中該正向重複序列包含SEQ ID NO: 4-6中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列，其中緊接該正向重複序列之3'的核苷酸不為A。在一些態樣中，本發明提供一種引導RNA或編碼該引導RNA之核酸，其中該引導RNA包含正向重複序列及間隔序列，且其中該正向重複序列包含SEQ ID NO: 5或6之核苷酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列。在一些態樣中，本發明提供一種引導RNA或編碼該引導RNA之核酸，其中該引導RNA包含正向重複序列及間隔序列，且其中該正向重複序列由SEQ ID NO: 4-6中之任一者之核苷酸序列或其上具有1、2、3或4個取代之序列組成。在一些實施例中，間隔子對於正向重複序列而言為異源的。

相關申請案之交叉參考本申請案主張2021年9月8日申請之美國臨時申請案第63/241,821號及2022年1月5日申請之美國臨時申請案第63/296,741號之益處。前述申請案之內容以全文引用之方式併入本文中。

定義將關於特定實施例及參考某些圖式描述本發明，但本發明不限於此，而僅受申請專利範圍限制。除非另外指明，否則如下文所闡述之術語一般應按其常識來理解。

除非另外定義，否則本文所使用之科學及技術術語具有一般技術者通常所瞭解之含義。在存在任何潛在歧義的情況下，本文提供的定義優先於任何字典或外部定義。除非上下文另外需要，否則單數術語應包括複數且複數術語應包括單數。除非另外說明，否則「或」之使用意謂「及/或」。術語「包括(including)」以及其他形式(諸如「包括(includes)」及「包括(included)」)之使用不具限制性。

通常，本文所述之與細胞及組織培養、分子生物學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及雜交結合使用之命名法為此項技術中熟知及常用的。除非另外指明，否則本文中所提供之方法及技術係通常根據此項技術中熟知之習知方法且如本說明書通篇所引用及論述之各種一般及更特定文獻中所描述來進行。酶促反應及純化技術係根據製造商之說明書如此項技術中通常所實現或如本文所描述來進行。結合本文所描述之分析化學、合成有機化學及藥物與醫藥化學使用之命名法以及其實驗室程序及技術為此項技術中熟知且常用之命名法以及實驗室程序及技術。使用標準技術進行化學合成、化學分析、醫藥製備、調配及遞送以及患者治療。

下文定義選擇術語以使得本發明可更容易得到理解。

本文使用冠詞「一(a/an)」指代冠詞之一個或超過一個(亦即，至少一個)之文法對象。借助於實例，「一元件」意謂一個元件或一個以上元件。

當提及可量測值，諸如量、時距及其類似者時，如本文所用，「約」意欲涵蓋自規定值之±20%或±10%、更佳±5%、甚至更佳±1%且再更佳±0.1%之變化，此係由於此類變化適合於進行所揭示之方法。

如本文所用，術語「複合物」係指兩種或更多種分子成組。在一些實施例中，複合物包含彼此相互作用(例如彼此結合、彼此接觸、彼此黏著)之多肽及核酸分子。

如本文所用，術語「二元複合物」係指兩種分子(例如多肽及核酸分子)成組。在一些實施例中，二元複合物係指多肽及靶向部分(例如引導RNA)成組。在一些實施例中，二元複合物係指核糖核蛋白(RNP)。如本文所用，術語「變異二元複合物」係指變異多肽及引導RNA成組。如本文所用，術語「親本二元複合物」係指親本多肽及引導RNA或參考多肽及引導RNA成組。

如本文所用，術語「三元複合物」係指三種分子(例如多肽及兩種核酸分子)成組。在一些實施例中，「三元複合物」係指多肽、RNA分子及DNA分子成組。在一些實施例中，三元複合物係指多肽、靶向部分(例如引導RNA)及目標核酸(例如目標DNA分子)成組。在一些實施例中，「三元複合物」係指二元複合物(例如核糖核蛋白)與第三分子(例如目標核酸)成組。

如本文所用，術語「域」係指多肽之獨特功能及/或結構單元。在一些實施例中，域可包含保守胺基酸序列。

如本文所用，術語「親本」、「親本多肽」及「親本序列」係指發生改變而產生本發明之變異多肽的原始多肽(例如參考或起始多肽)。

如本文所用，術語「原間隔序列相鄰模體」或「PAM」係指與目標序列相鄰的DNA序列，該目標序列與包含效應子(例如CRISPR核酸酶)及引導RNA之複合物結合。在一些實施例中，PAM為酶活性所需。如本文所用，術語「相鄰」包括複合物之引導RNA與緊鄰PAM之目標序列特異性結合、相互作用或締合的情況。在此類情況下，目標序列與PAM之間無核苷酸。術語「相鄰」亦包括引導RNA所結合之目標序列與PAM之間存在少量(例如1、2、3、4或5個)核苷酸的實例。在雙股DNA分子中，含有PAM模體之股稱為「PAM股」且互補股稱為「非PAM股」。引導RNA結合至非PAM股中與本文所揭示之目標序列互補的位點。在一些實施例中，PAM股為編碼(例如，有義)股。在其他實施例中，PAM股係非編碼的(例如反義股)。因為引導RNA經由鹼基配對結合非PAM股，所以非PAM股亦稱為目標股(TS)，而PAM股亦稱為非目標股(NTS)。

如本文所用，術語「參考組成物」、「參考分子」、「參考序列」及「參考」係指對照，諸如陰性對照或親本(例如親本序列、親本蛋白質或野生型蛋白質)。舉例而言，參考分子係指變異多肽進行比較之多肽。同樣，參考引導RNA係指經修飾之引導RNA進行比較之靶向部分。變異或經修飾之分子可基於序列(例如變異或經修飾之分子可與參考分子具有X%序列一致性或同源性)、熱穩定性或活性(例如變異或經修飾之分子可具有參考分子之活性之X%)與參考分子進行比較。例如，變異或經修飾之分子可表徵為具有不超過10%之參考多肽之活性，或可表徵為具有大至少10%之參考多肽之活性。參考多肽之實例包括天然存在之未修飾之多肽，例如來自古菌或細菌物種之天然存在之多肽。在某些實施例中，參考多肽為與進行比較之變異多肽具有最接近序列一致性或同源性的天然存在之多肽。在某些實施例中，參考多肽為發生突變而獲得變異多肽的具有天然存在或已知序列之親本分子。

如本文所用，術語「引導RNA」或「引導RNA序列」係指有助於本文所述之多肽靶向目標核酸之任何RNA分子。例如，引導RNA可為識別(例如結合於)目標核酸之分子。引導RNA可經設計以與特定核酸序列互補。引導RNA包含DNA靶向序列(在本文中亦稱為間隔序列)及促進引導RNA與本發明之多肽結合之正向重複(DR)序列。術語CRISPR RNA (crRNA)、前體crRNA及成熟crRNA在本文中亦用於指引導RNA。在一些情況下，引導RNA可為包含一或多個去氧核糖核苷酸之經修飾RNA分子，該一或多個去氧核糖核苷酸例如包含於引導RNA中之DNA結合序列中，結合目標核酸之非PAM股。在一些實例中，DNA結合序列可含有DNA序列或DNA/RNA雜交序列。

如本文所用，術語「實質上一致」係指與參考序列具有一定程度一致性的序列、聚核苷酸或多肽。

如本文所用，術語「目標核酸」、「目標序列」及「目標受質」係指引導RNA特異性結合之核酸。在一些實施例中，引導RNA之DNA靶向序列(亦即間隔序列)結合至目標核酸。在一些實施例中，目標序列為與PAM模體(在PAM股上)相鄰之DNA區段。目標序列之互補區位於非PAM股上。目標序列可緊鄰PAM模體。替代地，目標序列及PAM可藉由較小序列區段(例如至多5個核苷酸，例如至多4、3、2或1個核苷酸)分開。視此項技術中已知的識別PAM模體之CRISPR核酸酶而定，目標序列可位於PAM模體之3'端或PAM模體之5'端處。舉例而言，目標序列位於Cas12i多肽(例如Cas12i2多肽，諸如本文所揭示之彼等多肽)之PAM模體之3'端處。當然，應理解，DNA通常為雙股，且引導RNA將結合至與其互補之兩股中之一者。DNA中引導RNA結合之位置可方便地藉由提供引導RNA所結合之股(非PAM股)的序列或引導RNA不結合之股(PAM股)的序列來描述。因此，正如自本申請案之上下文顯而易見，目標核酸序列可藉由提供由本文所述之引導RNA靶向之雙股DNA之任一股的核酸序列來描述。

如本文所用，術語「變異多肽」、「變異效應多肽」及「變異CRISPR核酸酶多肽」係指與親本多肽相比在一或多個殘基位置處包含改變，例如但不限於取代、插入、缺失、添加及/或融合的多肽。除非另外規定，否則本文所提供之經鑑別的改變之位置係相對於SEQ ID NO: 3編號。舉例而言，D509R之改變指示第509個胺基酸相對於SEQ ID NO: 3之改變，即使變異多肽包含N端、C端或內部之融合或截短，例如使得改變不在融合多肽或截短多肽中相對於N端之位置509處。SEQ ID NO: 3之胺基酸位置進一步描述於表2中。如本文所用，術語「變異多肽」、「變異效應多肽」及「變異CRISPR核酸酶多肽」係指相比於SEQ ID NO: 3之多肽包含改變的多肽。

組成物在一些態樣中，本發明提供SEQ ID NO: 3之效應子(例如CRISPR核酸酶)之新穎變異體、包含變異體之組成物，及其製備方法及用途。在其他態樣中，本發明進一步提供包含SEQ ID NO: 3之效應子(例如CRISPR核酸酶)之變異體的複合物及組成物、其製備方法及用途。在一些態樣中，本文描述包含具有一或多個特徵之複合物的組成物。在一些態樣中，描述一種遞送包含複合物之組成物的方法。

在一些實施例中，本發明之組成物包括相對於親本多肽展現增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性的變異多肽。在一些實施例中，本發明之組成物包括複合物，該複合物包含相對於親本複合物展現增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性的變異多肽。在一些實施例中，變異多肽包含相對於親本多肽之改變，其中親本多肽包含SEQ ID NO: 3，且其中變異多肽能夠結合至引導RNA及目標核酸。

在一些實施例中，本發明之組成物包括變異多肽及引導RNA。在一些實施例中，本發明之組成物包括包含變異多肽及引導RNA之變異二元複合物。

在組成物之一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽與引導RNA增加複合物形成(例如增加二元複合物形成)。在組成物之一些實施例中，變異多肽與引導RNA相比於親本多肽與引導RNA具有更大的結合親和力。在組成物之一些實施例中，變異多肽與引導RNA相比於親本多肽與引導RNA具有更強的蛋白質-RNA相互作用(例如離子相互作用)。在組成物之一些實施例中，變異二元複合物比親本二元複合物穩定。

在一些實施例中，本發明之組成物包括變異多肽、引導RNA及目標核酸。在一些實施例中，本發明之組成物包括包含變異多肽、引導RNA及目標核酸的變異三元複合物。

在組成物之一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽與引導RNA及目標核酸增加複合物形成(例如增加三元複合物形成)。在組成物之一些實施例中，與親本多肽及引導RNA(例如親本二元複合物)相比，變異多肽及引導RNA(例如變異二元複合物)對目標核酸具有更大結合親和力。在組成物之一些實施例中，變異三元複合物比親本三元複合物穩定。

在一些實施例中，本發明之組成物包括本文所描述之變異多肽。

變異多肽在一個實施例中，變異多肽(例如變異CRISPR核酸酶多肽)為經分離或經純化之多肽。

在一些實施例中，本發明之變異多肽為親本多肽(例如親本CRISPR核酸酶)之變異體，其中親本係由包含諸如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核苷酸序列或包含諸如SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的聚核苷酸編碼。參見表1。表 1.對應於SEQ ID NO: 1-3之序列.

序列識別符	序列
SEQ ID NO: 1	ATGGGTGCGGCTCGTCGCCGTAACCCGAAGGTTGCAGCGGCGCGTAAGGGCAAGCCGCCGCCGAAAGCAACCGGTAACTGCCGTAATTACCGCTATGGTGCGCACGAACCGATCGCGAATCTGGACAAGGTGCTGGACGAGATGCGTGGCGCGCATGACCTGCGCAACGTTTTGACCTGTATCAATCGTGCGCGCTCCGAGATGATTACGGCTGCACTGGGTGAACACCAGTCTTACAAGAAGGCGACCGCAGACCTGGCGGCATTGCATCAGCGCCGTGATAAGCTGGAAGCGCAAATCCGTCAGCAGAACAGCGCGAGCCGTAAACGTCTGGGTCGTCACAGCCCGCTGAGCAGCGAGCTGGACACCGTTCGTAAGCGCATTGATGAGGGTCGTACGGCGCTGAAGAAGCTGCGCCGTAAGCTGCTGAAGAAGGACCCGGCCCTGAAAGCGGTGGTTGAGGCTGCAGACGATATGGCGAAACGTGAAACCACCCGTGCGGAAGATGCATGCGGCCTGTATTGGTGTACCCGTAACGAACAGACGGGCAAGCGTGCGAAACTGCGCCGTTTCAAGAAATGGCGTGACAGCGAGGCGACCATCAGCGTGCAAATTCCGGGTGGCCTGACCGTTGAGCAGCTGCTGGGTGGTGAGAACAATCAAGCACGTCTGGAGCTGCGTCCGGAAGGCGTGTGGGTTCAGGGTGCGCGTAAACGTAAAGTGGAACCGGCAGAAGCGGCACGTAACAAGCTGCGTCTGGACGAAGATGGCTACCCGATGCGTAAACTGGGCACCGCGATTCTGCACCTGCGTTGCATGAGCGACGAGGATGGCAAGCCGATCTGGGCGGAAGTTCCGATTACCTATCATCGTGAGATCCCGGCTGATGCAAAGATTAAACGTTGTTACCTGCACCGTTTCCGCGTGGGTAATCGTTATCATTGGTCCGTTCGTTTTAGCCTGGAGCGCGGTAAGAAAGGCGACGATAGCTGGCTGCACCCGCGTGTGGCAACCACCGGCACCGCTGCAATCGACATTGGTTGGCGTTGGTTTCCGGATCGTCTGCGTGTTGCGGTGTGGGCAGGTAGCGACGGCGCGGAGGGTGAACTGTGCTTGCCGAAATGGTGGCTGGATGAAATGTACAGCGTGCGTCTGGACCAGCGTGAGCGCGATGTTCTGTTCAACGAAATCGTGAGCCTGGTTTTGCCGTGGTTTCGTAGCCGTCGTGGTGAGCTGTCTGACTATGTCGTGCAAGCGATTAAGACCATGCATTCTTGGCGTGATAAAGGCCGCCTGGCGGCATTGAGCATGCGTTGGCGTGATGATCTGGCTGCGGACCCGGGTGCTAACCCGGCACATGTGGCCATGAGCATCCGTCTGGAGGAATGGCGTAAGCGCGACAAACATATTTGGTGCGAGGAAGTTAACCTGCGTAGCCAGTTGCAAGGCAGCCGTAAGGATCTGTATCGCCGTTTCGCGGCAATGCTGACCAGCCGTTATGGTCGCATCGTTGTCGAGGAATTTGATCTGAGCGCAGTGCAGAAGCTGCCGCCGGCTAGCATTGACGATGGCACCTACAGCCGTGTGAAGCGCCACAAAGGTGATGCTGCATGCAGCCATCTGGTTGGTGCGCTGAAGGACGCCGCGCGTCAACTGGATAAGAAAAACCCGAAGTGGACCACGAAACGTTGCCACGTTTGTGGCAAGACCGAGCGTAAATGGGAAAATCCGGGCGAGCTGGAACACACCTGCAAACATTGTGGTGTCCTGTGGGACCGTGATGTGAACGCTGCACGCAATATCCTGGCCGCGAGCGGCGTTGCGGTTGACTGGACCCGTCCGCCGCTGGCACCGGCTGCACGTATGACCTATCCGCAGGTTGAGAACCGTGAAATGCGCCGTAGCCGCCGTCGCAAAGAGGCGCTGGAAACCACCCGTGCGTCCGGTGATCGCCAAACCGCG
SEQ ID NO: 2	ATGGGCGCCGCTCGGAGAAGGAACCCTAAGGTGGCAGCAGCTCGTAAGGGCAAGCCACCTCCAAAAGCCACCGGCAACTGCCGGAATTACAGATATGGGGCACACGAACCAATCGCCAATCTGGACAAGGTCCTCGATGAGATGCGAGGGGCACATGACCTGCGCAACGTGCTGACTTGTATCAATCGGGCTAGATCCGAGATGATTACCGCAGCCCTGGGAGAACACCAGTCTTACAAGAAAGCTACAGCAGACCTGGCCGCCCTGCATCAGCGCCGAGATAAGCTGGAGGCACAGATCAGGCAGCAGAACTCTGCCAGTAGGAAACGCCTGGGACGCCACAGCCCACTGAGCTCCGAACTCGACACAGTGCGAAAACGTATTGATGAGGGCAGAACTGCCCTGAAGAAACTGCGGCGGAAGCTGCTGAAGAAGGACCCCGCACTGAAAGCAGTGGTCGAGGCAGCTGACGATATGGCCAAAAGGGAGACCACACGCGCTGAAGATGCATGCGGTCTGTATTGGTGTACTAGGAATGAACAGACCGGCAAGCGCGCCAAACTGAGAAGGTTCAAGAAATGGAGGGACTCCGAGGCTACCATCTCTGTCCAGATTCCCGGCGGGCTGACAGTTGAGCAGCTGCTCGGAGGTGAAAACAATCAGGCACGACTGGAGCTCCGTCCTGAAGGGGTGTGGGTCCAGGGAGCTCGGAAGAGAAAAGTGGAGCCAGCAGAAGCAGCCAGAAACAAGCTGCGGCTGGACGAGGATGGTTACCCTATGAGGAAACTGGGCACTGCCATCCTGCACCTGCGCTGCATGTCCGACGAGGATGGCAAGCCTATCTGGGCCGAAGTGCCAATTACCTATCATCGGGAGATCCCCGCCGATGCTAAGATCAAGCGGTGCTACCTGCACAGGTTCCGCGTGGGGAATAGGTATCATTGGTCAGTCCGGTTTAGCCTGGAGAGAGGCAAGAAAGGGGACGATAGCTGGCTGCACCCCCGGGTGGCAACTACCGGTACCGCTGCAATCGACATTGGATGGAGATGGTTTCCTGATCGACTGCGTGTTGCCGTGTGGGCTGGATCCGACGGTGCAGAGGGTGAACTGTGCCTCCCCAAGTGGTGGCTGGATGAGATGTACAGCGTGCGGCTGGACCAGCGGGAGAGAGATGTGCTGTTCAACGAAATCGTGAGTCTGGTGCTGCCTTGGTTTCGCAGCCGCCGAGGCGAGCTGTCCGACTATGTTGTGCAGGCCATTAAGACAATGCATTCATGGCGCGATAAAGGGCGACTGGCCGCCCTGAGCATGAGGTGGCGCGACGATCTGGCAGCAGACCCAGGAGCAAACCCAGCACACGTGGCTATGTCTATCAGACTGGAGGAATGGCGAAAGCGTGACAAACATATTTGGTGCGAGGAAGTCAATCTGCGGAGTCAGCTCCAGGGCAGCCGGAAGGACCTGTACCGGCGGTTCGCTGCAATGCTGACAAGTAGGTACGGGCGCATCGTCGTTGAGGAATTTGACCTGTCAGCCGTGCAGAAACTCCCGCCCGCTTCTATTGACGATGGCACTTACAGTCGAGTGAAGCGTCACAAAGGAGATGCCGCTTGTTCTCATCTGGTCGGCGCCCTGAAGGACGCAGCACGTCAGCTGGATAAGAAAAACCCAAAGTGGACAACTAAACGGTGCCACGTGTGCGGCAAGACCGAGAGAAAATGGGAAAATCCCGGGGAGCTGGAGCACACATGCAAGCATTGTGGCGTGCTGTGGGACCGGGATGTGAACGCTGCAAGAAATATCCTGGCAGCTAGCGGTGTCGCAGTTGACTGGACAAGGCCTCCACTGGCTCCAGCAGCACGTATGACTTATCCCCAGGTGGAGAATAGAGAAATGCGGCGGAGCCGGCGGCGGAAGGAGGCTCTGGAAACCACAAGGGCATCCGGCGATCGCCAGACCGCC
SEQ ID NO: 3	MGAARRRNPKVAAARKGKPPPKATGNCRNYRYGAHEPIANLDKVLDEMRGAHDLRNVLTCINRARSEMITAALGEHQSYKKATADLAALHQRRDKLEAQIRQQNSASRKRLGRHSPLSSELDTVRKRIDEGRTALKKLRRKLLKKDPALKAVVEAADDMAKRETTRAEDACGLYWCTRNEQTGKRAKLRRFKKWRDSEATISVQIPGGLTVEQLLGGENNQARLELRPEGVWVQGARKRKVEPAEAARNKLRLDEDGYPMRKLGTAILHLRCMSDEDGKPIWAEVPITYHREIPADAKIKRCYLHRFRVGNRYHWSVRFSLERGKKGDDSWLHPRVATTGTAAIDIGWRWFPDRLRVAVWAGSDGAEGELCLPKWWLDEMYSVRLDQRERDVLFNEIVSLVLPWFRSRRGELSDYVVQAIKTMHSWRDKGRLAALSMRWRDDLAADPGANPAHVAMSIRLEEWRKRDKHIWCEEVNLRSQLQGSRKDLYRRFAAMLTSRYGRIVVEEFDLSAVQKLPPASIDDGTYSRVKRHKGDAACSHLVGALKDAARQLDKKNPKWTTKRCHVCGKTERKWENPGELEHTCKHCGVLWDRDVNAARNILAASGVAVDWTRPPLAPAARMTYPQVENREMRRSRRRKEALETTRASGDRQTA

編碼本文所描述之親本多肽的核酸序列可與參考核酸序列，例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2實質上一致。在一些實施例中，變異多肽由包含與參考核酸序列，例如編碼親本多肽之核酸序列，例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%序列一致性之序列的核酸編碼。兩個此類核酸之間的一致性百分比可藉由檢查兩個最佳比對之核酸序列或藉由使用軟體程式或演算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)使用標準參數手動確定。兩個核酸序列實質上一致之一個指示為該等核酸分子在嚴格條件(例如在中等至高嚴格度之範圍內)下與另一者之互補序列雜交。

在一些實施例中，變異多肽由與參考核酸序列，例如編碼親本多肽之核酸序列，例如SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更大的序列一致性但非100%序列一致性的核酸序列編碼。

在一些實施例中，本發明之變異多肽包含與SEQ ID NO: 3具有50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%但非100%一致性之多肽序列。在一些實施例中，本發明之變異多肽包含與SEQ ID NO: 3具有大於50%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%但非100%一致性的多肽序列。

在一些實施例中，本發明描述一種變異多肽，其與一或多種參考多肽，例如親本多肽具有特定胺基酸序列一致性程度，例如與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列具有至少60%、至少65%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或甚至至少99%但非100%序列一致性。同源性或一致性可如本文所述，藉由胺基酸序列比對，例如使用諸如BLAST、ALIGN或CLUSTAL之程式來測定。

亦提供一種本發明之變異多肽，其具有酶活性，例如核酸酶或核酸內切酶活性，且包含當使用任一前述比對方法進行比對時，與親本多肽及SEQ ID NO: 3中之任一者之胺基酸序列之差異為50、40、35、30、25、20、19、18、17、16、15、14、13、12、11、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1個胺基酸殘基的胺基酸序列。

在一些實施例中，變異多肽包含在親本多肽之一或多個(例如若干個)胺基酸處之改變，其中至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、162、164、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、193、194、195、196、197、198、199、200個或更多個胺基酸經改變。

相對於參考序列，改變可包含肽或多肽中之一個胺基酸或多個胺基酸，或一個核苷酸或多個核苷酸中之一個核苷酸或多個核苷酸的取代、插入、缺失、添加或融合。在如何製成包含改變之序列方面不暗示具體過程。舉例而言，包含改變之序列可直接由個別核苷酸合成。在其他實施例中，藉由提供且隨後改變參考序列來進行改變。

取代可包含相對於參考序列用不同的一個胺基酸或多個胺基酸置換一個胺基酸或多個胺基酸或用不同的一個核苷酸或多個核苷酸置換一個核苷酸或多個核苷酸。在如何製成包含取代之序列方面不暗示具體過程。舉例而言，包含取代之序列可直接由個別胺基酸或核苷酸合成。在其他實施例中，取代係藉由提供且隨後改變參考序列來進行。核酸序列可在生物體之基因體中。核酸序列可在細胞中。核酸序列可為DNA序列。本文所描述之核苷酸之取代係指至多若干個千鹼基之取代。

在一些實施例中，變異多肽包含表2中所列之胺基酸取代中之一或多者。表 2.SEQ ID NO: 3之變異體中之單一胺基酸取代.

表 2
位置	野生型殘基	取代
1	M
2	G	R, A, K, Q, N, H
3	A	R, G, K, Q, N, H
4	A	R, G, K, Q, N, H
5	R	G, A, K, Q, N, H
6	R	G, A, K, Q, N, H
7	R	G, A, K, Q, N, H
8	N	R, G, A, K, Q, H
9	P	R, G, A, K, Q, N, H
10	K	R, G, A, Q, N, H
11	V	R, G, A, K, Q, N, H
12	A	R, G, K, Q, N, H
13	A	R, G, K, Q, N, H
14	A	R, G, K, Q, N, H
15	R	G, A, K, Q, N, H
16	K	R, G, A, Q, N, H
17	G	R, A, K, Q, N, H
18	K	R, G, A, Q, N, H
19	P	R, G, A, K, Q, N, H
20	P	R, G, A, K, Q, N, H
21	P	R, G, A, K, Q, N, H
22	K	R, G, A, Q, N, H
23	A	R, G, K, Q, N, H
24	T	R, G, A, K, Q, N, H
25	G	R, A, K, Q, N, H
26	N	R, G, A, K, Q, H
27	C	R, G, A, K, Q, N, H
28	R	G, A, K, Q, N, H
29	N	R, G, A, K, Q, H
30	Y	R, G, A, K, Q, N, H
31	R	G, A, K, Q, N, H
32	Y	R, G, A, K, Q, N, H
33	G	R, A, K, Q, N, H
34	A	R, G, K, Q, N, H
35	H	R, G, A, K, Q, N
36	E	R, G, A, K, Q, N, H
37	P	R, G, A, K, Q, N, H
38	I	R, G, A, K, Q, N, H
39	A	R, G, K, Q, N, H
40	N	R, G, A, K, Q, H
41	L	R, G, A, K, Q, N, H
42	D	R, G, A, K, Q, N, H
43	K	R, G, A, Q, N, H
44	V	R, G, A, K, Q, N, H
45	L	R, G, A, K, Q, N, H
46	D	R, G, A, K, Q, N, H
47	E	R, G, A, K, Q, N, H
48	M	R, G, A, K, Q, N, H
49	F	R, G, A, K, Q, N, H
50	G	R, A, K, Q, N, H
51	A	R, G, K, Q, N, H
52	H	R, G, A, K, Q, N
53	D	R, G, A, K, Q, N, H
54	L	R, G, A, K, Q, N, H
55	R	G, A, K, Q, N, H
56	N	R, G, A, K, Q, H
57	V	R, G, A, K, Q, N, H
58	L	R, G, A, K, Q, N, H
59	T	R, G, A, K, Q, N, H
60	C	R, G, A, K, Q, N, H
61	I	R, G, A, K, Q, N, H
62	N	R, G, A, K, Q, H
63	R	G, A, K, Q, N, H
64	A	R, G, K, Q, N, H
65	R	G, A, K, Q, N, H
66	S	R, G, A, K, Q, N, H
67	E	R, G, A, K, Q, N, H
68	M	R, G, A, K, Q, N, H
69	I	R, G, A, K, Q, N, H
70	T	R, G, A, K, Q, N, H
71	A	R, G, K, Q, N, H
72	A	R, G, K, Q, N, H
73	L	R, G, A, K, Q, N, H
74	G	R, A, K, Q, N, H
75	E	R, G, A, K, Q, N, H
76	H	R, G, A, K, Q, N
77	Q	R, G, A, K, N, H
78	S	R, G, A, K, Q, N, H
79	Y	R, G, A, K, Q, N, H
80	K	R, G, A, Q, N, H
81	K	R, G, A, Q, N, H
82	A	R, G, K, Q, N, H
83	T	R, G, A, K, Q, N, H
84	A	R, G, K, Q, N, H
85	D	R, G, A, K, Q, N, H
86	L	R, G, A, K, Q, N, H
87	A	R, G, K, Q, N, H
88	A	R, G, K, Q, N, H
89	L	R, G, A, K, Q, N, H
90	H	R, G, A, K, Q, N
91	Q	R, G, A, K, N, H
92	R	G, A, K, Q, N, H
93	R	G, A, K, Q, N, H
94	D	R, G, A, K, Q, N, H
95	K	R, G, A, Q, N, H
96	L	R, G, A, K, Q, N, H
97	E	R, G, A, K, Q, N, H
98	A	R, G, K, Q, N, H
99	Q	R, G, A, K, N, H
100	I	R, G, A, K, Q, N, H
101	R	G, A, K, Q, N, H
102	Q	R, G, A, K, N, H
103	Q	R, G, A, K, N, H
104	N	R, G, A, K, Q, H
105	S	R, G, A, K, Q, N, H
106	A	R, G, K, Q, N, H
107	S	R, G, A, K, Q, N, H
108	R	G, A, K, Q, N, H
109	K	R, G, A, Q, N, H
110	R	G, A, K, Q, N, H
111	L	R, G, A, K, Q, N, H
112	G	R, A, K, Q, N, H
113	R	G, A, K, Q, N, H
114	H	R, G, A, K, Q, N
115	S	R, G, A, K, Q, N, H
116	P	R, G, A, K, Q, N, H
117	L	R, G, A, K, Q, N, H
118	S	R, G, A, K, Q, N, H
119	S	R, G, A, K, Q, N, H
120	E	R, G, A, K, Q, N, H
121	L	R, G, A, K, Q, N, H
122	D	R, G, A, K, Q, N, H
123	T	R, G, A, K, Q, N, H
124	V	R, G, A, K, Q, N, H
125	R	G, A, K, Q, N, H
126	K	R, G, A, Q, N, H
127	R	G, A, K, Q, N, H
128	I	R, G, A, K, Q, N, H
129	D	R, G, A, K, Q, N, H
130	E	R, G, A, K, Q, N, H
131	G	R, A, K, Q, N, H
132	R	G, A, K, Q, N, H
133	T	R, G, A, K, Q, N, H
134	A	R, G, K, Q, N, H
135	L	R, G, A, K, Q, N, H
136	K	R, G, A, Q, N, H
137	K	R, G, A, Q, N, H
138	L	R, G, A, K, Q, N, H
139	R	G, A, K, Q, N, H
140	R	G, A, K, Q, N, H
141	K	R, G, A, Q, N, H
142	L	R, G, A, K, Q, N, H
143	L	R, G, A, K, Q, N, H
144	K	R, G, A, Q, N, H
145	K	R, G, A, Q, N, H
146	D	R, G, A, K, Q, N, H
147	P	R, G, A, K, Q, N, H
148	A	R, G, K, Q, N, H
149	L	R, G, A, K, Q, N, H
150	K	R, G, A, Q, N, H
151	A	R, G, K, Q, N, H
152	V	R, G, A, K, Q, N, H
153	V	R, G, A, K, Q, N, H
154	E	R, G, A, K, Q, N, H
155	A	R, G, K, Q, N, H
156	A	R, G, K, Q, N, H
157	D	R, G, A, K, Q, N, H
158	D	R, G, A, K, Q, N, H
159	M	R, G, A, K, Q, N, H
160	A	R, G, K, Q, N, H
161	K	R, G, A, Q, N, H
162	R	G, A, K, Q, N, H
163	E	R, G, A, K, Q, N, H
164	T	R, G, A, K, Q, N, H
165	T	R, G, A, K, Q, N, H
166	R	G, A, K, Q, N, H
167	A	R, G, K, Q, N, H
168	E	R, G, A, K, Q, N, H
169	D	R, G, A, K, Q, N, H
170	A	R, G, K, Q, N, H
171	C	R, G, A, K, Q, N, H
172	G	R, A, K, Q, N, H
173	L	R, G, A, K, Q, N, H
174	Y	R, G, A, K, Q, N, H
175	W	R, G, A, K, Q, N, H
176	C	R, G, A, K, Q, N, H
177	T	R, G, A, K, Q, N, H
178	R	G, A, K, Q, N, H
179	N	R, G, A, K, Q, H
180	E	R, G, A, K, Q, N, H
181	Q	R, G, A, K, N, H
182	T	R, G, A, K, Q, N, H
183	G	R, A, K, Q, N, H
184	K	R, G, A, Q, N, H
185	R	G, A, K, Q, N, H
186	A	R, G, K, Q, N, H
187	K	R, G, A, Q, N, H
188	L	R, G, A, K, Q, N, H
189	R	G, A, K, Q, N, H
190	R	G, A, K, Q, N, H
191	F	R, G, A, K, Q, N, H
192	K	R, G, A, Q, N, H
193	K	R, G, A, Q, N, H
194	W	R, G, A, K, Q, N, H
195	R	G, A, K, Q, N, H
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579	E	R, G, A, K, Q, N, H
580	L	R, G, A, K, Q, N, H
581	E	R, G, A, K, Q, N, H
582	H	R, G, A, K, Q, N
583	T	R, G, A, K, Q, N, H
584	C	R, G, A, K, Q, N, H
585	K	R, G, A, Q, N, H
586	H	R, G, A, K, Q, N
587	C	R, G, A, K, Q, N, H
588	G	R, A, K, Q, N, H
589	V	R, G, A, K, Q, N, H
590	L	R, G, A, K, Q, N, H
591	W	R, G, A, K, Q, N, H
592	D	R, G, A, K, Q, N, H
593	R	G, A, K, Q, N, H
594	D	R, G, A, K, Q, N, H
595	V	R, G, A, K, Q, N, H
596	N	R, G, A, K, Q, H
597	A	R, G, K, Q, N, H
598	A	R, G, K, Q, N, H
599	R	G, A, K, Q, N, H
600	N	R, G, A, K, Q, H
601	I	R, G, A, K, Q, N, H
602	L	R, G, A, K, Q, N, H
603	A	R, G, K, Q, N, H
604	A	R, G, K, Q, N, H
605	S	R, G, A, K, Q, N, H
606	G	R, A, K, Q, N, H
607	V	R, G, A, K, Q, N, H
608	A	R, G, K, Q, N, H
609	V	R, G, A, K, Q, N, H
610	D	R, G, A, K, Q, N, H
611	W	R, G, A, K, Q, N, H
612	T	R, G, A, K, Q, N, H
613	R	G, A, K, Q, N, H
614	P	R, G, A, K, Q, N, H
615	P	R, G, A, K, Q, N, H
616	L	R, G, A, K, Q, N, H
617	A	R, G, K, Q, N, H
618	P	R, G, A, K, Q, N, H
619	A	R, G, K, Q, N, H
620	A	R, G, K, Q, N, H
621	R	G, A, K, Q, N, H
622	M	R, G, A, K, Q, N, H
623	T	R, G, A, K, Q, N, H
624	Y	R, G, A, K, Q, N, H
625	P	R, G, A, K, Q, N, H
626	Q	R, G, A, K, N, H
627	V	R, G, A, K, Q, N, H
628	E	R, G, A, K, Q, N, H
629	N	R, G, A, K, Q, H
630	R	G, A, K, Q, N, H
631	E	R, G, A, K, Q, N, H
632	M	R, G, A, K, Q, N, H
633	R	G, A, K, Q, N, H
634	R	G, A, K, Q, N, H
635	S	R, G, A, K, Q, N, H
636	R	G, A, K, Q, N, H
637	R	G, A, K, Q, N, H
638	R	G, A, K, Q, N, H
639	K	R, G, A, Q, N, H
640	E	R, G, A, K, Q, N, H
641	A	R, G, K, Q, N, H
642	L	R, G, A, K, Q, N, H
643	E	R, G, A, K, Q, N, H
644	T	R, G, A, K, Q, N, H
645	T	R, G, A, K, Q, N, H
646	R	G, A, K, Q, N, H
647	A	R, G, K, Q, N, H
648	S	R, G, A, K, Q, N, H
649	G	R, A, K, Q, N, H
650	D	R, G, A, K, Q, N, H
651	R	G, A, K, Q, N, H
652	Q	R, G, A, K, N, H
653	T	R, G, A, K, Q, N, H
654	A	R, G, K, Q, N, H

本文中所描述之一些有益改變落在位於SEQ ID NO: 3之核酸酶多肽之大致殘基500-580處之熱點內，該序列接近將TS間隔螺旋與ssDNA NTS分開之RuvC『蓋(lid)』。不希望受理論束縛，在一些實施例中，本文所描述之取代對於酶功能具有以下一或多個益處：使ssDNA NTS進入活性位點凹槽穩定；移除與TS間隔螺旋之H鍵相互作用；添加與TS間隔螺旋之有利電荷相互作用；及移除自間隔螺旋開始的與ssDNA TS之電荷排斥。

在一些實施例中，變異多肽包含D509R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含S511R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含Q514G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含E198R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含S527R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含V359R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含Y381R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含R354G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含M380K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含M380R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含V383R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含E367R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含E367G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含E507R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含W350R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含R528K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含S527K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含L385G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含W350G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含Y381G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含H532R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含P615R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含G578R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含M380G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含V595G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含R531G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含R531K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D158G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含N476G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含G578K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含A512R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含P618R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含V595R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含V595K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含V383G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含A597G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含Y381K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含P618G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含E198K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含T288R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含E507K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含L385R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含C538G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含P615G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D386R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含S511K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含C371G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含N220R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含S78K胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含K141G胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含K240R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含D277R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含T165R胺基酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含K374R胺基酸取代。

在一些實施例中，變異多肽進一步包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的第二改變。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含A512R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含E367R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含V359R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含A512R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含A512R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含Q514G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含A512R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含N476G且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含D535G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含E367R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含E367R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含N476G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含L516R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含A512R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含V595G且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含N476G且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含Q514G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含E367R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含E367R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含E367R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含L516R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含R531G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含N476G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含L580G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含V359R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含D535G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含E367R。在一些實施例中，該改變包含A512R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含Q514G。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含E367R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含L385G且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含V359R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含V595G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含N476G且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含E367R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含I521R。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含A597G且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含E367R。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含E198R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含D129R。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含L516R。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含R531G且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含N476G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含Y381R。在一些實施例中，該改變包含D158G且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含P618R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含P618R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含N476G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含Q514G。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含W350R。在一些實施例中，該改變包含S527R且該第二改變包含V359R。在一些實施例中，該改變包含T288R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含A512R。在一些實施例中，該改變包含V595G且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含M380R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含R531G。在一些實施例中，該改變包含D535G且該第二改變包含L516R。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含V595G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含R354G。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含S527R。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含Y381R且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含D129R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含L516R且該第二改變包含R531G。在一些實施例中，該改變包含D386R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含C371G。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含V383R且該第二改變包含W350R。在一些實施例中，該改變包含P615R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含R354G且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含G578R且該第二改變包含R531G。在一些實施例中，該改變包含E367R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含I521R且該第二改變包含W350R。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含G578R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含E367R。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含C538G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含A597G且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含P615R。在一些實施例中，該改變包含V359R且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含M380R且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含H532R且該第二改變包含P618R。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含L580G且該第二改變包含H532R。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含T288R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含E507R。在一些實施例中，該改變包含P618R且該第二改變包含D386R。在一些實施例中，該改變包含E507R且該第二改變包含W350R。在一些實施例中，該改變包含A597G且該第二改變包含C538G。在一些實施例中，該改變包含S511R且該第二改變包含L516R。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含L385G。在一些實施例中，該改變包含W350R且該第二改變包含D158G。在一些實施例中，該改變包含P618R且該第二改變包含A597G。在一些實施例中，該改變包含Q514G且該第二改變包含V595G。在一些實施例中，該改變包含E198R且該第二改變包含W350R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含V383R。在一些實施例中，該改變包含D509R且該第二改變包含R354G。

在一些實施例中，變異多肽包含D535G、L516R及I521R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、L516R及I521R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、L516R及Q514G取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、Q514G及I521R取代。在一些實施例中，變異多肽包含Q514G、I521R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、Q514G、I521R及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、L516R、Q514G及I521R取代。在一些實施例中，變異多肽包含Q514G、I521R、S527R及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、D535G、L516R、Q514G及I521R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、L516R、I521R及S527R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、I521R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、D535G及L516R取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521R、S527R、E198R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、L516R及Q514G取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、Q514G及I521R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、L516R、Q514G及S511R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、L516R、Q514G及S527R取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521R、S527R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、L516R、S527R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含Q514G、S527R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R、Q514G、I521R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、L516R、Q514G及S527R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、I521R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含S527R、L580G、E198R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R、S527R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、Q514G、I521R及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、Q514G、I521R及S527R取代。在一些實施例中，變異多肽包含Q514G、L580G、E198R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、L516R、I521R及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R、Q514G、I521R及L580G取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、D535G、Q514G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R、I521R、S527R及L580G取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、I521R、S527R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R、I521R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、D535G及I521R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、S527R、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、D535G及Q514G取代。在一些實施例中，變異多肽包含S527R、L580G、E198R及R354G取代。在一些實施例中，變異多肽包含Q514G、I521R、S527R及L580G取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、Q514G、E198R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R、Q514G、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521R、S527R、E198R及R354G取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521R、S527R、R354G及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含I521R、L580G、E198R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L516R、Q514G、S527R及L580G取代。在一些實施例中，變異多肽包含D535G、Q514G、S527R及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D509R、Q514G、L580G及E198R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G、N220R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含S78K、E198R及R354G取代。在一些實施例中，變異多肽包含K141G、N220R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K141G、K240R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K141G、D277R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G、D277R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含S78K、E198R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580G、L385G、S511R及A512R取代。在一些實施例中，變異多肽包含S78K、E198R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G、K240R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含T165R、N220R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580G、L385G、Q514G及A512R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129R、P618R、S511R及A512R取代。在一些實施例中，變異多肽包含S78K、E198R及K374R取代。在一些實施例中，變異多肽包含T165R、D277R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580G、L385G、G578R及D158G取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129R、P618R、R354G及A512R取代。在一些實施例中，變異多肽包含T165R、K240R及M380R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K141G、K240R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G、N220R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129R、P618R、Q514G及A512R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129R、P618R、S527R及L385G取代。在一些實施例中，變異多肽包含K141G、N220R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580G、L385G、Q514G及N476G取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580G、L385G、A512R及P618R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K141G、D277R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129R、P618R、D158G及A512R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G、N220R及K374R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G、D277R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含K136G、K240R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含L580G、L385G、S527R及C538G取代。在一些實施例中，變異多肽包含T165R、K240R及L385R取代。在一些實施例中，變異多肽包含D129R、P618R、V359R及A512R取代。

在一些實施例中，變異多肽包含增加變異多肽與引導RNA之相互作用的改變。在一些實施例中，增加與引導RNA之相互作用的改變係精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺或組胺酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含增加變異多肽與目標核酸之相互作用的改變。在一些實施例中，增加與目標核酸之相互作用的改變係精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺或組胺酸取代。在一些實施例中，變異多肽包含丙胺酸取代。在一些實施例中，丙胺酸取代不影響變異多肽主鏈之幾何結構。在一些實施例中，變異多肽包含甘胺酸取代基。在一些實施例中，甘胺酸取代改變變異多肽主鏈之拉馬錢德蘭鍵(Ramachandran bond)角度。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一個RuvC模體或RuvC域。如本文所用，「生物活性部分」為(例如完全、部分、最小)保留親本多肽之至少一個功能之部分(例如「最小」或「核心」域)。在一些實施例中，變異多肽保留與親本多肽之活性至少一樣的酶活性。因此，在一些實施例中，變異多肽具有大於親本多肽之酶活性。

在一些實施例中，變異多肽具有降低之核酸酶活性或為核酸酶死亡多肽。如本文所用，本文所揭示之多肽的催化殘基包含D345、E506及D594。在一些實施例中，相對於親本多肽，在D345及/或E506及/或D594 (例如，D345A及/或E506A及/或D594A)處包含取代之變異多肽展現降低之核酸酶活性或無核酸酶活性。在一些實施例中，殘基R593促成核酸酶活性。在一些實施例中，在R593處之取代改變核酸酶活性，例如使核酸酶活性降低。

在一些實施例中，本發明之變異多肽具有等效於或大於親本多肽之酶活性。在一些實施例中，本發明之變異多肽在約20℃至約90℃範圍內之溫度下具有酶活性。在一些實施例中，本發明之變異多肽在約20℃至約25℃之溫度下或在約37℃之溫度下具有酶活性。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個增強對RNA之親和力(例如RNA親和力)的改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的RNA親和力。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的RNA親和力。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現增強的RNA親和力。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現增強之RNA親和力。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個增強與引導RNA之複合物形成(例如二元複合物形成)的改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的二元複合物形成。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的二元複合物形成。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現增強之二元複合物形成。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現增強的二元複合物形成。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個增強與引導RNA之結合活性的改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的引導RNA結合活性。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的引導RNA結合活性。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現增強的引導RNA結合活性。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現增強的引導RNA結合活性。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個增強與引導RNA之結合特異性的改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的引導RNA結合特異性。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的引導RNA結合特異性。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現增強的引導RNA結合特異性。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現增強的引導RNA結合特異性。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個增強蛋白酶-RNA相互作用之改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的蛋白質-RNA相互作用。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的蛋白酶-RNA相互作用。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現增強的蛋白質-RNA相互作用。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現增強的蛋白質-RNA相互作用。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個增強蛋白質穩定性之改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的蛋白質穩定性。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的蛋白質穩定性。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現增強的蛋白質穩定性。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現增強的蛋白質穩定性。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個減少的自引導RNA之解離(例如二元複合物解離)的改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現減少的自引導RNA之解離。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現減少的自引導RNA之解離。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現減少的自引導RNA之解離。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現減少的自引導RNA之解離。在一些實施例中，在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者之培育期內，相比於親本多肽，變異多肽展現減少的自引導RNA之解離。在一些實施例中，變異CRISPR核酸酶核糖核蛋白(RNP)複合物不將引導RNA交換成不同RNA。

在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包含至少一個增強與引導RNA及目標核酸之三元複合物形成的改變。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的三元複合物形成。在一些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的三元複合物形成。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本多肽，變異多肽展現增強的三元複合物形成。在一個實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異多肽展現增強的三元複合物形成。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一個改變，使得包含變異多肽之二元複合物(例如變異二元複合物)相比於親本二元複合物展現增強的對目標核酸之結合親和力。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的對目標核酸之結合親和力。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的對目標核酸之結合親和力。在一些實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現增強的對目標核酸之結合親和力。在一個實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少8℃時，變異二元複合物展現增強的對目標核酸之結合親和力。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一個改變，使得包含變異多肽之二元複合物(例如變異二元複合物)相比於親本二元複合物展現增強的中靶結合活性。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的中靶結合活性。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的中靶結合活性。在一些實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現增強的中靶結合活性。在一個實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少8℃時，變異二元複合物展現增強的中靶結合活性。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一個改變，使得包含變異多肽之二元複合物(例如變異二元複合物)相比於親本二元複合物展現增強的中靶結合特異性。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的中靶結合特異性。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的中靶結合特異性。在一些實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現增強的中靶結合特異性。在一個實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少8℃時，變異二元複合物展現增強的中靶結合特異性。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一個改變，使得包含變異多肽之二元複合物(例如變異二元複合物)相比於親本二元複合物展現減少的對非目標核酸之脫靶結合。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現對非目標核酸之減少的與非目標核酸之脫靶結合。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現減少的對非目標核酸之脫靶結合。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現減少的與非目標核酸之脫靶結合。在一個實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異二元複合物展現減少的對非目標核酸之脫靶結合。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一個改變，使得包含變異多肽之二元複合物(例如變異二元複合物)相比於親本二元複合物展現減少的自目標核酸之解離。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現減少的自目標核酸之解離。在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現減少的對目標核酸之解離。在一些實施例中，當變異多肽之T _m值比親本多肽之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現減少的自目標核酸之解離。在一個實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本多肽之T _m值大至少8℃時，變異二元複合物展現減少的對目標核酸之解離。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一個改變，使得包含變異多肽之三元複合物(例如變異三元複合物)相比於親本三元複合物展現增強的穩定性。在一些實施例中，相比於親本三元複合物，變異三元複合物在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下展現增強的穩定性。在一些實施例中，相比於親本三元複合物，變異三元複合物在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現增強的穩定性。在一些實施例中，當變異三元複合物之T _m值比親本三元複合物之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現增強的穩定性。在一個實施例中，當變異三元複合物之T _m值比親本三元複合物之T _m值大至少8℃時，變異三元複合物展現增強的穩定性。

雖然本文所述之變化可為一或多個胺基酸變化，但變異多肽之變化亦可為實質性的，諸如作為胺基及/或羧基端延伸之多肽融合。舉例而言，變異多肽可含有額外肽，例如一或多種肽。額外肽之實例可包括用於進行標記之抗原決定基肽，諸如聚組胺酸標籤(His標籤)、Myc及FLAG。在一些實施例中，本文所述之變異多肽可與諸如螢光蛋白(例如綠色螢光蛋白(GFP)或黃色螢光蛋白(YFP))之可偵測部分融合。

在一些實施例中，變異多肽包含至少一種(例如兩種、三種、四種、五種、六種或更多種)核定位信號(NLS)。在一些實施例中，變異多肽包含至少一種(例如兩種、三種、四種、五種、六種或更多種)核輸出信號(NES)。在一些實施例中，變異多肽包含至少一種(例如兩種、三種、四種、五種、六種或更多種) NLS及至少一種(例如兩種、三種、四種、五種、六種或更多種) NES。

在一些實施例中，本文所述之變異多肽可為自身不活化的。參見，Epstein等人，「Engineering a Self-Inactivating CRISPR System for AAV Vectors」, Mol. Ther., 24 (2016): S50，其以全文引用之方式併入本文中。

在一些實施例中，編碼本文所述之變異多肽之核苷酸序列可經密碼子最佳化以用於特定宿主細胞或生物體中。例如，核酸可經密碼子優化以用於任何非人類真核生物，包括小鼠、大鼠、兔、狗、家畜或非人類靈長類動物。密碼子使用表可容易獲得，例如可在www.kazusa.orjp/codon/獲得的「密碼子使用資料庫」，且此等表可以多種方式調適。參見Nakamura等人. Nucl. Acids Res. 28:292 (2000)，其以全文引用的方式併入本文中。亦可利用電腦演算法(諸如Gene Forge (Aptagen; Jacobus, PA))，對特定序列進行密碼子優化，以在特定宿主細胞中表現。

引導RNA 在一些實施例中，如本文中所描述之組成物或複合物包含結合目標核酸且與變異多肽相互作用的靶向部分(例如引導RNA、反義、寡核苷酸、肽寡核苷酸結合物)。靶向部分可結合目標核酸(例如以特異性結合親和力結合目標核酸)。

在一些實施例中，靶向部分包含或為引導RNA。在一些實施例中，引導RNA將本文所述之變異多肽引導至特定核酸序列。閱讀以下的特定種類之引導RNA之實例的熟習此項技術者將理解，在一些實施例中，引導RNA具有特異性。亦即，在一些實施例中，引導RNA特異性地與一或多個目標核酸序列(例如特異性DNA或基因體DNA序列)締合且不與非目標核酸序列(例如非特異性DNA或隨機序列)締合。

在一些實施例中，如本文所述之組成物包含與本文所述之變異多肽締合且將變異多肽引導至目標核酸序列(例如DNA)的引導RNA。在一些實施例中，引導RNA可與本文所描述之多肽(例如具有SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之多肽或其變異體)締合。在一些實施例中，引導RNA將多肽引導至目標核酸序列(例如DNA)。

引導RNA可靶向(例如締合、針對、接觸或結合)目標序列之一或多個核苷酸，例如位點特異性序列或位點特異性目標。在一些實施例中，變異核糖核蛋白(例如變異CRISPR核酸酶多肽加引導RNA)在結合於與引導RNA中靶向DNA之序列(例如序列特異性受質或目標核酸)互補的目標核酸後活化。

在一些實施例中，間隔子或間隔序列為引導RNA中作為目標序列(DNA序列)之RNA等效物之一部分。通常，間隔子含有能夠經由與目標序列(PAM股中)互補之位點處的鹼基配對而與非PAM股結合之序列。在一些情況下，當出於此比較之目的考慮T等效於U時，間隔子可與目標序列至少75%一致(例如至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%)。在一些情況下，出於此比較之目的，當考慮T等效於U時，間隔子可與目標序列100%一致。

在一些情況下，當第一聚核苷酸(例如引導RNA之間隔序列)與第二聚核苷酸(例如目標序列之互補序列)具有一定互補水準時，聚核苷酸與另一聚核苷酸互補，使得第一及第二聚核苷酸可經由鹼基配對形成雙股複合物，以允許效應多肽與第一聚核苷酸複合以對第二聚核苷酸起作用(例如裂解)。在一些實施例中，第一聚核苷酸可與第二聚核苷酸實質上互補。在一些實施例中，第一聚核苷酸與第二聚核苷酸具有至少約80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%互補性。在一些實施例中，第一聚核苷酸與第二聚核苷酸完全互補，亦即與第二聚核苷酸100%互補。

在一些實施例中，引導RNA包含長度為約11個核苷酸至約100個核苷酸之間隔子。舉例而言，靶向DNA之區段之長度可為約11個核苷酸至約80個核苷酸、約11個核苷酸至約50個核苷酸、約11個核苷酸至約40個核苷酸、約11個核苷酸至約30個核苷酸、約11個核苷酸至約25個核苷酸、約11個核苷酸至約20個核苷酸或約11個核苷酸至約19個核苷酸。例如，間隔子之長度可為約19個核苷酸至約20個核苷酸、約19個核苷酸至約25個核苷酸、約19個核苷酸至約30個核苷酸、約19個核苷酸至約35個核苷酸、約19個核苷酸至約40個核苷酸、約19個核苷酸至約45個核苷酸、約19個核苷酸至約50個核苷酸、約19個核苷酸至約60個核苷酸、約19個核苷酸至約70個核苷酸、約19個核苷酸至約80個核苷酸、約19個核苷酸至約90個核苷酸、約19個核苷酸至約100個核苷酸、約20個核苷酸至約25個核苷酸、約20個核苷酸至約30個核苷酸、約20個核苷酸至約35個核苷酸、約20個核苷酸至約40個核苷酸、約20個核苷酸至約45個核苷酸、約20個核苷酸至約50個核苷酸、約20個核苷酸至約60個核苷酸、約20個核苷酸至約70個核苷酸、約20個核苷酸至約80個核苷酸、約20個核苷酸至約90個核苷酸或約20個核苷酸至約100個核苷酸。

在一些實施例中，引導RNA之間隔子的長度一般可經設計介於11至50個核苷酸(例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸)之間且與特定目標核酸序列互補。在一些特定實施例中，引導RNA可經設計以與例如基因體之基因座的特定DNA股互補。在一些實施例中，DNA靶向序列經設計以與例如基因體之基因座的特異性DNA股互補。

引導RNA可與參考核酸序列之互補股實質上一致。在一些實施例中，引導RNA包含與參考核酸序列(例如目標核酸)之互補股具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%序列一致性之序列。兩個此類核酸之間的一致性百分比可藉由檢查兩個最佳比對之核酸序列或藉由使用軟體程式或演算法(例如BLAST、ALIGN、CLUSTAL)使用標準參數手動確定。

在一些實施例中，引導RNA與目標核酸之互補股具有至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少約85%、至少約90%、至少約91%、至少約92%、至少約93%、至少約94%、至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或至少約99.5%序列一致性。

在一些實施例中，引導RNA包含長度介於11至50個核苷酸(例如11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35個核苷酸)之間且與目標核酸互補至少80%、至少90%、至少95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%互補之間隔子。在一些實施例中，引導RNA包含與目標DNA序列至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補之序列。在一些實施例中，引導RNA包含與目標基因體序列至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補之序列。在一些實施例中，引導RNA包含長度至多50個且與目標核酸至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補的序列，例如RNA序列。在一些實施例中，引導RNA包含與目標DNA序列至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補之序列。在一些實施例中，引導RNA包含與目標基因體序列至少80%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%互補之序列。

在某些實施例中，引導RNA包括連接至DNA靶向序列之正向重複序列、基本上由其組成或包含其。在一些實施例中，引導RNA包括正向重複序列及DNA靶向序列或正向重複-DNA靶向序列-正向重複序列。在一些實施例中，引導RNA包括截短之正向重複序列及DNA靶向序列，其為經加工或成熟crRNA典型的。在一些實施例中，本文所描述之變異多肽與引導RNA形成複合物，且引導RNA引導複合物同與引導RNA之至少一部分互補之位點特異性目標核酸締合。

在一些實施例中，正向重複序列與表3中所列之序列或表3中所列之序列之一部分至少90%一致。在一些實施例中，正向重複序列與表3中所列之序列或表3中所列之序列之一部分至少95% (例如至少97%、至少99%或至少100%)一致。在一些實施例中，正向重複序列與表3中所列之序列或表3中所列之序列之一部分一致。在一些實施例中，正向重複序列包含SEQ ID NO: 4-6中之任一者中所闡述之核苷酸序列。表 3.正向重複序列.

序列識別符	正向重複序列
SEQ ID NO: 4	CUCGCGGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGAC
SEQ ID NO: 5	CUCGCGGUCCCAUCGGAACGGGUUUGUGGUUCCGAC
SEQ ID NO: 6	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGAC

在一些實施例中，正向重複序列包含與UGUGGUUCCGAC (SEQ ID NO: 7)具有至少90%一致性之序列。在一些實施例中，正向重複序列包含SEQ ID NO: 7中所闡述之序列。

在一些實施例中，對應於本發明之變異多肽之PAM包括5'-NTN-3'、5'-HTN-3'或5'-TNA-3'。如本文所用，N可各自為任何核苷酸(例如，A、G、T或C)或其子集(例如，R (A或G)、Y (C或T)、K (G或T)、B (G、T或C)、H (A、C或T)。在一些實施例中，PAM包含5'-CTG-3'。在一些實施例中，PAM包含5'-CTC-3'。在一些實施例中，包含本發明之變異多肽的二元複合物結合至與5'-NTN-3'、5'-HTN-3'或5'-TNA-3'序列相鄰的目標核酸。在一些實施例中，包含本發明之變異多肽的二元複合物結合至與5'-CTG-3'或5'-CTC-3'序列相鄰的目標核酸。

在一些實施例中，本文所述之組成物或複合物包括一或多種(例如兩種、三種、四種、五種、六種、七種、八種或更多種)引導RNA，例如複數種引導RNA。

在一些實施例中，引導RNA具有類似於例如國際公開案第WO 2014/093622號及第WO 2015/070083號之引導RNA的架構，該等公開案中之每一者的全部內容以引用的方式併入本文中。

除非另外指出，否則本文提供之所有組成物及複合物及多肽係參考該組成物或複合物或多肽之活性水準製成，且不包括可存在於市售來源中的雜質，例如殘餘溶劑或副產物。酶促組分重量係以總活性蛋白質計。除非另外指示，否則所有百分比及比率以重量計算。除非另有指示，否則所有百分比及比率係基於全部組成物計算。在例示組成物中，以總組成物之重量計，酶含量由純酶表示，且除非另外說明，否則成分以總組成物之重量計來表示。

修飾引導RNA或編碼變異多肽之任一核酸序列可包括相對於參考序列，尤其親本多核糖核苷酸之一或多個共價修飾，此包括在本發明之範疇內。

例示性修飾可包括對糖、核鹼基、核苷間鍵聯(例如連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)之任何修飾，及其任何組合。以下詳細描述本文提供之一些例示性修飾。

引導RNA或編碼變異多肽之組分的任一核酸序列可包括諸如對糖、核鹼基或核苷間鍵聯(例如連接磷酸酯/磷酸二酯鍵/磷酸二酯主鏈)之任何適用修飾。嘧啶核鹼基之一或多個原子可經視情況經取代之胺基、視情況經取代之硫醇、視情況經取代之烷基(例如甲基或乙基)或鹵基(例如氯或氟)置換或取代。在某些實施例中，修飾(例如一或多個修飾)存在於糖及核苷間鍵聯中之每一者中。修飾可為核糖核酸(RNA)修飾成去氧核糖核酸(DNA)、蘇糖核酸(TNA)、二醇核酸(GNA)、肽核酸(PNA)、鎖核酸(LNA)或其雜交物。本文描述了額外修飾。

在一些實施例中，修飾可包括化學或細胞誘導之修飾。舉例而言，細胞內RNA修飾之一些非限制性實例由Lewis及Pan在「RNA modifications and structures cooperate to guide RNA-protein interactions」, Nat Reviews Mol Cell Biol, 2017, 18:202-210中描述。

不同糖修飾、核苷酸修飾及/或核苷間鍵聯(例如主鏈結構)可存在於序列中之多個位置。一般技術者將瞭解，核苷酸類似物或其他修飾可位於序列之任何位置，使得實質上不減少序列之功能。序列可包括約1%至約100%經修飾之核苷酸(相對於核苷酸總含量或相對於核苷酸之一或多種類型，亦即A、G、U或C中之任一或多者)或任何中間百分比(例如1%至20%、1%至25%、1%至50%、1%至60%、1%至70%、1%至80%、1%至90%、1%至95%、10%至20%、10%至25%、10%至50%、10%至60%、10%至70%、10%至80%、10%至90%、10%至95%、10%至100%、20%至25%、20%至50%、20%至60%、20%至70%、20%至80%、20%至90%、20%至95%、20%至100%、50%至60%、50%至70%、50%至80%、50%至90%、50%至95%、50%至100%、70%至80%、70%至90%、70%至95%、70%至100%、80%至90%、80%至95%、80%至100%、90%至95%、90%至100%及95%至100%)。

在一些實施例中，序列之一或多個核糖核苷酸的糖修飾(例如在2'位置或4'位置處)或糖置換以及主鏈修飾可包括磷酸二酯鍵之修飾或置換。序列之特定實例包括但不限於包括經修飾之主鏈或無天然核苷間鍵聯(諸如核苷間修飾)，包括磷酸二酯鍵之修飾或置換的序列。具有經修飾主鏈之序列尤其包括主鏈中不具有磷原子者。出於本申請案之目的，且如此項技術中有時提及，在核苷間主鏈中不具有磷原子之經修飾之RNA亦可視為寡核苷。在特定實施例中，序列將包括在其核苷間主鏈中具有磷原子之核糖核苷酸。

經修飾之序列主鏈可包括例如硫代磷酸酯；對掌性硫代磷酸酯；二硫代磷酸酯；磷酸三酯；胺基烷基磷酸三酯；甲基及其他烷基膦酸酯，諸如3'-伸烷基膦酸酯及對掌性膦酸酯；亞膦酸酯；胺基磷酸酯，諸如具有正常3'-5'鍵聯之3'-胺基胺基磷酸酯及胺基烷基胺基磷酸酯、硫代胺基磷酸酯、硫羰基烷基膦酸酯、硫羰基烷基磷酸三酯及硼烷磷酸酯、其2'-5'連接之類似物及具有反向極性之胺基磷酸酯，其中相鄰的核苷單元對以3'-5'至5'-3'或2'-5'至5'-2'連接。亦包括各種鹽、混合鹽及游離酸形式。在一些實施例中，序列可帶負電或帶正電。

可併入序列中之經修飾之核苷酸可在核苷間鍵聯(例如磷酸酯主鏈)上進行修飾。在本文中，在聚核苷酸主鏈之上下文中，片語「磷酸酯」及「磷酸二酯」可互換使用。主鏈磷酸酯基團可藉由用不同的取代基置換一或多個氧原子來修飾。此外，經修飾之核苷及核苷酸可包括用如本文所述之另一核苷間鍵聯全盤置換未經修飾之磷酸酯部分。經修飾之磷酸酯基團之實例包括但不限於硫代磷酸酯、硒代磷酸酯、硼烷磷酸酯(boranophosphate)、硼烷磷酸酯(boranophosphate ester)、氫膦酸酯、胺基磷酸酯、二胺基磷酸酯、烷基或芳基膦酸酯及磷酸三酯。二硫代磷酸酯之兩個非連接氧均經硫置換。磷酸酯連接子亦可藉由用氮(橋接胺基磷酸酯)、硫(橋接硫代磷酸酯)及碳(橋接亞甲基-膦酸酯)置換連接氧而修飾。

提供經α-硫基取代之磷酸酯部分以經由非天然硫代磷酸酯主鏈鍵聯賦予RNA及DNA聚合物穩定性。硫代磷酸酯DNA及RNA具有增加的核酸酶抗性，隨後在細胞環境中具有更長的半衰期。

在特定實施例中，經修飾之核苷包括α-硫基-核苷(例如5'- O-(1-硫代磷酸酯)-腺苷、5'- O-(1-硫代磷酸酯)-胞苷(a-硫基-胞苷)、5'- O-(1-硫代磷酸酯)-鳥苷、5'- O-(1-硫代磷酸酯)-尿苷或5'- O-(1-硫代磷酸酯)-假尿苷)。

本文中描述可根據本發明採用的其他核苷間鍵聯，包括不含磷原子之核苷間鍵聯。

在一些實施例中，序列可包括一或多種細胞毒性核苷。例如，細胞毒性核苷可併入至序列中，諸如雙官能修飾。細胞毒性核苷可包括但不限於阿糖腺苷、5-氮雜胞苷、4'-硫基-阿糖胞苷、環戊烯基胞嘧啶、克拉屈濱(cladribine)、氯法拉濱(clofarabine)、阿糖胞苷(cytarabine)、阿拉伯糖苷胞嘧啶、1-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊醣基)-胞嘧啶、地西他濱(decitabine)、5-氟尿嘧啶、氟達拉賓(fludarabine)、氟尿苷(floxuridine)、吉西他濱(gemcitabine)、喃氟啶(tegafur)與尿嘧啶之組合、喃氟啶((RS)-5-氟-1-(四氫呋喃-2-基)嘧啶-2,4(1H,3H)-二酮)、曲沙他濱(troxacitabine)、替紮他濱(tezacitabine)、2'-去氧-2'-亞甲基胞嘧啶核苷(DMDC)及6-巰基嘌呤。額外實例包括磷酸氟達拉濱(fludarabine phosphate)、N4-二十二烷醯基-1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶、N4-十八烷基-1-β-D-阿糖呋喃胞嘧啶、N4-棕櫚醯基-1-(2-C-氰基-2-去氧-β-D-阿拉伯-呋喃戊醣基)胞嘧啶及P-4055 (阿糖胞苷5'-反油酸酯)。

在一些實施例中，序列包括一或多種轉錄後修飾(例如加帽、裂解、多腺苷酸化、剪接、多A序列、甲基化、醯化、磷酸化、離胺酸及精胺酸殘基之甲基化、乙醯化及硫醇基及酪胺酸殘基之亞硝基化等)。一或多個轉錄後修飾可為任何轉錄後修飾，諸如已在RNA中鑑別到之超過一百個不同的核苷修飾中之任一者(Rozenski, J, Crain, P及McCloskey, J. (1999). The RNA Modification Database: 1999年更新. Nucl Acids Res 27: 196-197)。在一些實施例中，第一分離核酸包含信使RNA (mRNA)。在一些實施例中，mRNA包含至少一個選自由以下組成之群的核苷：吡啶-4-酮核苷、5-氮雜-尿苷、2-硫基-5-氮雜-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫基-假尿苷、2-硫基-假尿苷、5-羥基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧基甲基-尿苷、1-羧基甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫基-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫基-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基-假尿苷、4-硫基-1-甲基-假尿苷、2-硫基-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-去氮-假尿苷、2-硫基-1-甲基-1-去氮-假尿苷、二氫尿苷、二氫假尿苷、2-硫基-二氫尿苷、2-硫基-二氫假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫基-尿苷、4-甲氧基-假尿苷及4-甲氧基-2-硫基-假尿苷。在一些實施例中，mRNA包含至少一種選自由以下組成之群的核苷：5-氮雜-胞苷、假異胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙醯基胞苷、5-甲醯基胞苷、N4-甲基胞啶、5-羥甲基胞苷、1-甲基-假異胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假異胞苷、2-硫基-胞苷、2-硫基-5-甲基-胞苷、4-硫基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-假異胞苷、4-硫基-1-甲基-1-去氮-假異胞苷、1-甲基-1-去氮-假異胞苷、澤布拉恩(zebularine)、5-氮雜-澤布拉恩、5-甲基-澤布拉恩、5-氮雜-2-硫基-澤布拉恩、2-硫基-澤布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假異胞苷及4-甲氧基-1-甲基-假異胞苷。在一些實施例中，mRNA包含至少一種選自由以下組成之群的核苷：2-胺基嘌呤、2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-腺嘌呤、7-去氮-8-氮雜-腺嘌呤、7-去氮-2-胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2-胺基嘌呤、7-去氮-2,6-二胺基嘌呤、7-去氮-8-氮雜-2,6-二胺基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-異戊烯基腺苷、N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(順式-羥基異戊烯基)腺苷、N6-甘胺醯基胺甲醯基腺苷、N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、2-甲硫基-N6-蘇胺醯基胺甲醯基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤及2-甲氧基-腺嘌呤。在一些實施例中，mRNA包含至少一種選自由以下組成之群的核苷：肌苷、1-甲基-肌苷、懷俄苷(wyosine)、懷俄丁苷(wybutosine)、7-去氮-鳥苷、7-去氮-8-氮雜-鳥苷、6-硫基-鳥苷、6-硫基-7-去氮-鳥苷、6-硫基-7-去氮-8-氮雜-鳥苷、7-甲基-鳥苷、6-硫基-7-甲基-鳥苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鳥苷、1-甲基鳥苷、N2-甲基鳥苷、N2,N2-二甲基鳥苷、8-側氧基-鳥苷、7-甲基-8-側氧基-鳥苷、1-甲基-6-硫基-鳥苷、N2-甲基-6-硫基-鳥苷及N2,N2-二甲基-6-硫基-鳥苷。

序列可沿分子之整個長度均勻修飾或可不均勻修飾。例如，一或多種或所有類型之核苷酸(例如天然存在之核苷酸、嘌呤或嘧啶，或A、G、U、C、I、pU中之任一或多個或所有)可在序列中或在其給定預定序列區中均勻修飾或可不均勻修飾。在一些實施例中，序列包括假尿苷。在一些實施例中，序列包括肌苷，其可幫助免疫系統將序列表徵為內源性RNA與病毒RNA。肌苷之併入亦可介導改善之RNA穩定性/減少之降解。參見例如Yu, Z.等人. (2015) RNA editing by ADAR1 marks dsRNA as “self”. Cell Res. 25, 1283-1284，其以全文引用之方式併入。

目標核酸本文所揭示之方法適用於多種目標核酸。在一些實施例中，目標核酸為DNA，諸如DNA基因座。在一些實施例中，目標核酸為RNA，諸如RNA基因座或mRNA。在一些實施例中，目標核酸為單股(例如單股DNA)。在一些實施例中，目標核酸係雙股的(例如雙股DNA)。在一些實施例中，目標核酸包含單股及雙股區域。在一些實施例中，目標核酸為線性的。在一些實施例中，目標核酸為圓形。在一些實施例中，目標核酸包含一或多種經修飾之核苷酸，諸如甲基化核苷酸、受損核苷酸或核苷酸類似物。在一些實施例中，目標核酸未經修飾。

目標核酸可具有任何長度，諸如約以下中之至少任一者：100 bp、200 bp、500 bp、1000 bp、2000 bp、5000 bp、10 kb、20 kb、50 kb、100 kb、200 kb、500 kb、1 Mb或更長。目標核酸亦可包含任何序列。在一些實施例中，目標核酸富含GC，諸如具有至少約40%、45%、50%、55%、60%、65%或更高比率中之任一者的GC含量。在一些實施例中，目標核酸之GC含量為至少約70%、80%或更高。在一些實施例中，目標核酸為不富含GC之目標核酸中之富含GC之片段。在一些實施例中，目標核酸不富含GC。在一些實施例中，目標核酸具有一或多個二級結構或更高級結構。在一些實施例中，目標核酸不呈縮合狀態，諸如染色質，致使變異多肽/引導RNA複合物無法接近目標核酸。

在一些實施例中，目標核酸存在於細胞中。在一些實施例中，該目標核酸係存在於該細胞之細胞核中。在一些實施例中，目標核酸對於細胞而言為內源性的。在一些實施例中，目標核酸為基因體DNA。在一些實施例中，目標核酸為染色體DNA。在一個實施例中，目標核酸為染色體外核酸。在一些實施例中，目標核酸為蛋白質編碼基因或其功能區域，諸如編碼區；或調節元件，諸如啟動子、強化子、5'或3'未轉譯區等。在一些實施例中，目標核酸為非編碼基因，諸如轉座子、miRNA、tRNA、核糖體RNA、核糖核酸酶或lincRNA。在一些實施例中，目標核酸為質體。

在一些實施例中，目標核酸對於細胞而言為外源性的。在一些實施例中，目標核酸為病毒核酸，諸如病毒DNA或病毒RNA。在一些實施例中，目標核酸為水平轉移質體。在一些實施例中，目標核酸整合於細胞之基因體中。在一些實施例中，目標核酸不整合於細胞之基因體中。在一些實施例中，目標核酸為細胞中之質體。在一些實施例中，目標核酸存在於染色體外陣列中。

在一些實施例中，目標核酸為經分離核酸，諸如經分離DNA或經分離RNA。在一些實施例中，目標核酸存在於無細胞環境中。在一些實施例中，目標核酸為經分離載體，諸如質體。在一些實施例中，目標核酸係超純質體。

目標核酸為與引導RNA雜交之目標核酸之區段。在一些實施例中，目標核酸僅具有目標核酸之一個複本。在一些實施例中，目標核酸具有超過一個複本，諸如至少約2、3、4、5、10、100或更多個目標核酸複本中之任一者。例如，變異核糖核蛋白可靶向在病毒核酸或細菌之基因體中包含重複序列之目標核酸。

在一些實施例中，目標核酸存在於目標核酸之可容易接近區域中。在一些實施例中，目標核酸處於目標基因之外顯子中。在一些實施例中，目標核酸係跨目標基因之外顯子-內含子接合點。在一些實施例中，目標核酸係存在於非編碼區中，諸如基因之調節區中。在一些實施例中，其中目標核酸對於細胞而言為外源性的，目標核酸包含在細胞基因體中未發現之序列。

適合DNA/RNA結合條件包括細胞中通常存在之生理條件。其他適合DNA/RNA結合條件(例如無細胞系統中之條件)係此項技術中已知的；參見例如Sambrook, 見上文。與引導RNA互補及雜交的目標核酸之股稱為「互補股」，且與「互補股」互補(且因此不與引導RNA互補)之目標核酸之股稱為「非互補股(noncomplementary strand)」或「非互補股(non-complementary strand)」。

在一些實施例中，目標核酸包含SEQ ID NO: 8、10、12、14、16、18、20及22中之任一者之核苷酸序列。

二元複合物在一些實施例中，本文所述之二元複合物包含與至少一種引導RNA締合之變異多肽，其中各引導RNA靶向諸如DNA之目標核酸。在一些實施例中，變異多肽/引導RNA複合物(例如變異二元複合物)包含可切割或裂解目標核酸的酶活性，諸如核酸酶活性。變異多肽及引導RNA單獨或在一起不會天然存在。相比於親本多肽與引導RNA，變異多肽與引導RNA之間的複合物形成可增強兩者之間的穩定性及/或蛋白質-RNA相互作用。

一般而言，變異多肽與靶向部分(例如引導RNA)以約1:1之莫耳比彼此結合以形成變異二元複合物。變異多肽與靶向部分(例如引導RNA)結合形成變異二元複合物被稱為將引導RNA裝載至多肽。

在一些實施例中，二元複合物遵循一個引導規則，亦即，在複合物中變異多肽不自結合引導RNA解離，或不與游離非結合RNA之交換引導RNA。在一些實施例中，三元複合物遵循一個二元複合物規則，亦即，變異二元複合物不自結合目標核酸(例如目標DNA基質)解離或不與游離非結合核酸交換目標核酸。

二元複合物之功能性在一些態樣中，變異二元複合物包含具有至少一個改變或突變之變異多肽，使得增強酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些態樣中，變異二元複合物包含具有至少一個改變或突變之變異多肽，且變異二元複合物減少與非目標核酸結合之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離、自目標核酸之解離中之至少一者。

在一些態樣中，變異多肽與靶向部分(例如引導RNA)形成變異二元複合物，且變異二元複合物相比於親本二元複合物展現增加的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，變異二元複合物包含具有至少一個改變或突變之變異多肽，使得變異二元複合物之酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者比親本二元複合物之酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者增加至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在約20℃至約65℃範圍內，例如約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下，展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在pH在約7.3至約8.6 (例如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6，或介於此等值之任何組合之間的數值範圍內)之緩衝液中，展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。在一個實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少8℃時，變異二元複合物展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，在約37℃下，在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者之培育期內，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現增加的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。在一些實施例中，在一系列培育時間內，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現增加的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些態樣中，變異多肽與靶向部分(例如引導RNA)形成變異二元複合物，且變異二元複合物相比於親本二元複合物展現減少的與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離中之至少一者。在一些實施例中，相比於親本二元複合物之與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離，變異二元複合物展現減少的與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離中之至少一者，可減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

在一些實施例中，相比於親本二元複合物之與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離，變異二元複合物展現減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離中之至少一者。

在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在約20℃至約65℃範圍內，例如約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下，展現減少的與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離中之至少一者。

在一些實施例中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物在pH在約7.3至約8.6 (例如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6，或介於此等值之任何組合之間的數值範圍內)的緩衝液中，展現減少的與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離中之至少一者。

在一些實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現減少的與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離中之至少一者。在一個實施例中，當變異二元複合物之T _m值比親本二元複合物之T _m值大至少8℃時，變異二元複合物展現減少的與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性、二元複合物解離及/或自目標核酸之解離中之至少一者。

在一些實施例中，在約37℃下，在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者之培育期內，相比於由親本多肽及引導RNA形成之複合物，變異二元複合物展現減少的複合物(變異二元複合物或變異三元複合物)解離及/或自目標基因座之解離中之至少一者。在一些實施例中，在一系列培育時間內，相比於由親本多肽及引導RNA形成之複合物，變異二元複合物展現減少的複合物(變異二元複合物或變異三元複合物)解離及/或自目標基因座之解離中之至少一者。

在一些實施例中，在約37℃下，在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者之培育期內，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現減少的複合物(變異二元複合物或變異三元複合物)解離及/或自目標基因座之解離中之至少一者。在一些實施例中，在一系列培育時間內，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現減少的複合物(變異二元複合物或變異三元複合物)解離及/或自目標基因座之解離中之至少一者。

三元複合物在一些實施例中，本文所述之三元複合物包含與至少一個引導RNA締合之變異多肽(亦即形成變異二元複合物)，其中各引導RNA靶向諸如DNA之目標核酸且與之締合(亦即形成變異三元複合物)。在一些實施例中，變異多肽/引導RNA複合物(例如變異二元複合物)包含可切割或裂解變異三元複合物之目標核酸的酶活性，諸如核酸酶活性。在一些實施例中，變異三元複合物包含酶活性，諸如核酸酶活性。變異多肽、引導RNA及目標核酸單獨或在一起不會天然存在。

一般而言，變異二元複合物，例如變異多肽及靶向部分以約1:1之莫耳比結合至目標核酸以形成變異三元複合物。變異二元複合物與目標核酸，例如目標DNA受質結合形成變異三元複合物被稱為將變異二元複合物裝載至目標核酸。

一般而言，變異多肽、靶向部分(例如引導RNA)及目標核酸以約1:1:1之莫耳比彼此締合以形成變異三元複合物。

在一些實施例中，目標核酸包括變異二元複合物或複數種變異二元複合物之一或多個目標基因座。在一些實施例中，目標核酸包括變異二元複合物或複數種變異二元複合物之一或多個非目標基因座。

三元複合物之功能性在一些態樣中，變異三元複合物包含具有至少一個改變或突變之變異多肽且變異三元複合物具有增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些態樣中，變異三元複合物包含具有至少一個改變或突變之變異多肽且變異三元複合物具有減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。

在一些態樣中，變異二元複合物與目標核酸(例如DNA)形成變異三元複合物，且變異三元複合物相比於親本二元複合物展現增加的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，變異三元複合物展現比親本二元複合物之酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性大至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%的變異三元複合物之酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，相比於親本三元複合物，變異三元複合物在約20℃至約65℃範圍內，例如約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下，展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，相比於親本三元複合物，變異三元複合物在pH在約7.3至約8.6 (例如7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6，或介於此等值之任何組合之間的數值範圍內)之緩衝液中，展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，當變異三元複合物之T _m值比親本三元複合物之T _m值大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。在一個實施例中，當變異三元複合物之T _m值比親本三元複合物之T _m值大至少8℃時，變異三元複合物展現增強的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些實施例中，在約37℃下，在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者之培育期內，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現增加的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。在一些實施例中，在一系列培育時間內，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現增加的酶活性、目標核酸複合物形成、目標核酸結合活性、目標核酸親和力、目標核酸結合特異性、蛋白酶-核酸相互作用、三元複合物形成、中靶結合活性、中靶結合特異性及/或穩定性中之至少一者。

在一些態樣中，變異二元複合物與目標核酸(例如DNA)形成變異三元複合物，且相比於親本二元複合物，變異三元複合物展現減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。

在一些實施例中，相比於親本二元複合物之自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離，變異三元複合物展現減少的變異三元複合物之自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者，可減少至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

在一些實施例中，相比於親本三元複合物，變異三元複合物在約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃或65℃中之任一者之溫度下，展現減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。

在一些實施例中，在一系列溫度(約20℃至約65℃)下，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。在一些實施例中，在約37℃下，在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者之培育期內，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。在一些實施例中，在一系列培育時間內，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。

在一些實施例中，變異三元複合物在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中展現比親本三元複合物減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。在一個實施例中，變異三元複合物在pH為約7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8.0、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5或8.6下展現比親本三元複合物減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。

在一些實施例中，當變異三元複合物之T _m值比參考分子之T _m值或參考值之T _m，例如親本三元複合物之T _m大至少1℃、2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃、9℃、10℃、11℃、12℃、13℃、14℃、15℃、16℃、17℃、18℃、19℃或20℃時，變異三元複合物展現減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。在一個實施例中，當變異三元複合物之T _m值比參考分子之T _m值或參考值之T _m，例如親本三元複合物之T _m大至少8℃時，變異三元複合物展現減少的自目標基因座之解離、與非目標核酸之脫靶結合、目標核酸之非目標基因座處之活性及/或三元複合物解離中之至少一者。

在一些實施例中，在約37℃下，在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者之培育期內，相比於親本三元複合物，變異三元複合物展現增加之穩定性。在一些實施例中，在一系列培育時間內，變異三元複合物相比於親本三元複合物展現增加之穩定性。

在一些態樣中，相比於親本二元複合物，變異二元複合物展現在目標核酸之非目標基因座處降低之活性。在一些實施例中，對距中靶基因座序列之特定萊文斯坦距離(Levenshtein distance) (例如1、2、3或4之編輯距離)之PAM相鄰序列評定非目標活性。在一些實施例中，非目標基因座處變異二元複合物之活性可比非目標基因座處親本二元複合物之活性小至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或100%。

製備在一些實施例中，本發明之變異多肽可藉由以下來製備：(a)培養細菌，產生本發明之變異多肽，分離變異多肽，視情況純化變異多肽，且使變異多肽與引導RNA複合。變異多肽亦可藉由(b)已知之基因工程改造技術來製備，具體而言，自細菌分離編碼本發明之變異多肽之基因，構築重組表現載體，且接著將載體轉移至表現引導RNA之適當宿主細胞中以在宿主細胞中表現與引導RNA形成複合物之重組蛋白。或者，變異多肽可藉由(c)活體外偶合轉錄-轉譯系統製備且接著與引導RNA形成複合物。可用於製備本發明之變異多肽的細菌不受特別限制，只要其可產生本發明之變異多肽即可。細菌之一些非限制性實例包括本文所述之大腸桿菌細胞。

載體本發明提供一種用於表現本文所描述之變異多肽之載體或編碼本文所描述之變異多肽之核酸可併入至載體中。在一些實施例中，本發明之載體包括編碼變異多肽之核苷酸序列。

本發明亦提供可用於製備變異多肽的載體或包含如本文所描述變異多肽之組成物。在一些實施例中，本發明包括細胞中之本文所述之組成物或載體。在一些實施例中，本發明包括一種在細胞中表現包含變異多肽之組成物或編碼變異多肽之載體或核酸的方法。該方法可包含提供組成物，例如載體或核酸且遞送組成物至細胞之步驟。

天然或合成聚核苷酸之表現通常藉由將編碼所關注之基因之聚核苷酸，例如編碼變異多肽之核苷酸序列以可操作方式連接至啟動子且將構築體併入至表現載體中來達成。表現載體不受特別限制，只要其包括編碼本發明之變異多肽的聚核苷酸且可適用於真核細胞中之複製及整合。

典型表現載體可包括適用於表現所需聚核苷酸之轉錄及轉譯終止子、起始序列及啟動子。例如，可使用攜帶RNA聚合酶(pSP64、pBluescript等)之識別序列的質體載體。包括彼等來源於反轉錄病毒(諸如慢病毒)之載體為適於達成長期基因轉移之工具，此係因為其允許長期穩定整合轉殖基因及其在子細胞中之繁殖。載體之實例包括表現載體、複製載體、探針產生載體及定序載體。表現載體可呈病毒載體形式提供至細胞。

病毒載體技術係此項技術中熟知的且描述於多個病毒學及分子生物學手冊中。適用作載體之病毒包括但不限於噬菌體病毒、反轉錄病毒、腺病毒、腺相關病毒、疱疹病毒及慢病毒。一般而言，適合載體含有在至少一種生物體中發揮功能之複製起點、啟動子序列、適宜限制性核酸內切酶位點及一或多種可選擇標記物。

載體種類不受特別限制，且宜選擇可在宿主細胞中表現之載體。更特定而言，視宿主細胞之種類而定，宜選擇確保變異多肽自聚核苷酸表現之啟動子序列，且將此啟動子序列及聚核苷酸插入至各種質體等中之任一者中以製備表現載體。

額外啟動子元件(例如，強化序列)調控轉錄起始頻率。通常，此等元件位於起始位點上游30-110 bp區中，但多個啟動子最近已展示含有亦位於起始位點下游之功能元件。視啟動子而定，個別要素似乎可合作地或獨立地起活化轉錄功能。

此外，本發明不應限於使用組成性啟動子。亦考慮誘導性啟動子作為本發明之一部分。誘導性啟動子之使用提供分子開關，該分子開關能夠在需要其以可操作方式連接之聚核苷酸序列之表現時打開此類表現或在不需要表現時關閉表現。誘導性啟動子之實例包括但不限於金屬硫蛋白啟動子、糖皮質激素啟動子、孕酮啟動子及四環素啟動子。

待引入之表現載體亦可含有可選標記基因或報導基因或兩者以有助於自設法經由病毒載體轉染或感染之細胞群體鑑別及選擇表現細胞。在其他態樣中，可選標記物可攜載於單獨的DNA段上且用於共轉染程序。可選標記物與報導基因均可側接適當的轉錄控制序列以能夠在宿主細胞中表現。此類標記物之實例包括用於真核細胞培養之二氫葉酸還原酶基因及新黴素抗性基因；及用於大腸桿菌及其他細菌培養之四環素抗性基因及安比西林(ampicillin)抗性基因。藉由使用此類選擇標記物，可確認編碼本發明之變異多肽的聚核苷酸是否已轉移至宿主細胞中且隨後經表現而不出錯。

用於重組表現載體之製備方法不受特別限制，且其實例包括使用質體、噬菌體或黏質體之方法。

表現方法本發明包括一種用於蛋白質表現之方法，其包含轉譯本文所述之變異多肽。

在一些實施例中，本文所描述之宿主細胞用於表現變異多肽。宿主細胞不受特別限制，且可較佳使用各種已知細胞。宿主細胞之特定實例包括細菌，諸如大腸桿菌、酵母(出芽酵母、釀酒酵母( Saccharomyces cerevisiae)及裂變酵母、粟酒裂殖酵母( Schizosaccharomyces pombe))、線蟲(秀麗隱桿線蟲( Caenorhabditis elegans))、非洲爪蟾( Xenopus laevis)卵母細胞及動物細胞(例如CHO細胞、COS細胞及HEK293細胞)。用於將上述表現載體轉移至宿主細胞中之方法，亦即轉型方法，不受特別限制，且可使用諸如電穿孔、磷酸鈣法、脂質體法及DEAE聚葡萄糖法之已知方法。

在用表現載體轉型宿主之後，可培養、培植或培育宿主細胞以產生變異多肽。在表現變異多肽之後，可收集宿主細胞且根據習知方法(例如過濾、離心、細胞破壞、凝膠過濾層析、離子交換層析等)自培養物純化變異多肽等。

在一些實施例中，用於表現變異多肽之方法包含轉譯變異多肽之至少5個胺基酸、至少10個胺基酸、至少15個胺基酸、至少20個胺基酸、至少50個胺基酸、至少100個胺基酸、至少150個胺基酸、至少200個胺基酸、至少250個胺基酸、至少300個胺基酸、至少400個胺基酸、至少500個胺基酸、至少600個胺基酸、至少700個胺基酸、至少800個胺基酸、至少900個胺基酸或至少1000個胺基酸。在一些實施例中，用於表現蛋白質之方法包含轉譯變異多肽之約5個胺基酸、約10個胺基酸、約15個胺基酸、約20個胺基酸、約50個胺基酸、約100個胺基酸、約150個胺基酸、約200個胺基酸、約250個胺基酸、約300個胺基酸、約400個胺基酸、約500個胺基酸、約600個胺基酸、約700個胺基酸、約800個胺基酸、約900個胺基酸、約1000個胺基酸或更多。

可使用多種方法測定宿主細胞中成熟變異多肽之產生含量。此類方法包括但不限於例如利用對變異多肽具有特異性之多株或單株抗體或如本文別處所述之標記標籤的方法。例示性方法包括但不限於酶聯免疫吸附分析(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、螢光免疫分析(FIA)及螢光激活細胞分選(FACS)。此等及其他分析法為此項技術中所熟知(參見例如Maddox等人, J. Exp. Med. 158:1211 [1983])。

本發明提供在細胞中活體內表現變異多肽之方法，其包含將編碼變異多肽之聚核糖核苷酸提供至其中聚核糖核苷酸編碼變異多肽之宿主細胞，在細胞中表現變異多肽，且自細胞獲得變異多肽。

改變或突變之引入可藉由此項技術中已知之合成方法來產生編碼變異多肽之核酸序列或變異多肽。使用編碼親本多肽之核酸序列本身作為構架，可一次插入改變或突變一或多個以改變編碼親本多肽之核酸序列。同樣道理，可藉由在親本多肽以合成方式合成時將變化引入至多肽序列中來改變或突變。此可藉由此項技術中熟知之方法實現。

可使用熟習此項技術者已知之任何方法產生親本多肽序列及將改變或突變引入至親本多肽序列中。特定言之，在一些實施例中，用於PCR之寡核苷酸引子可用於快速合成DNA模板，包括編碼變異多肽之核酸序列中之一或多個改變或突變。位點特異性突變誘發亦可用作經由潛在DNA之特定突變誘發，可用於製備個別肽或生物學上功能等效蛋白質或肽的技術。該技術進一步提供藉由引入一或多種核苷酸序列變化至DNA中，併入前述考慮因素中之一或多者，製備及測試變異體之預備能力。位點特異性突變誘發允許經由使用編碼所需突變之DNA序列的特定寡核苷酸序列以及足夠數目之相鄰核苷酸產生變異體，以提供具有足夠尺寸及序列複雜性之引子序列，從而在所穿過之缺失接合處之兩側上形成穩定雙螺旋體。通常，長度為約17至25個核苷酸之引子為較佳，其中序列之接合處之兩側上的約5至10個殘基改變。

可以與將改變或突變引入至親本多肽中類似之方式來引入結構變化，諸如多肽融合為及/或羧基端延伸。額外肽可藉由編碼額外肽之適當核酸序列包括至編碼親本多肽或變異多肽之核酸序列而添加至親本多肽或變異多肽。視情況，額外肽可經由合成多肽產生而直接附加至變異多肽。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽的方法，該變異多肽相比於親本多肽與目標核酸之兩個或更多個基因座(例如2、3、4、5、6、7、8、9或更多個)具有增加之中靶結合。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生複數種變異多肽(例如具有相同胺基酸序列之獨立變異多肽)的方法，該等變異多肽在與複數種不同引導RNA個別複合時，相比於複數種親本多肽及引導RNA，具有增加的與目標核酸之兩個或更多個基因座之中靶結合。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽的方法，該變異多肽相比於親本多肽具有增加的與目標核酸之兩個或更多個目標基因座之中靶三元複合物形成。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生複數種變異多肽(例如具有相同胺基酸序列之獨立變異多肽)的方法，該等變異多肽在與複數種不同引導RNA個別複合時，相比於複數種親本多肽及引導RNA，具有增加的與目標核酸之兩個或更多個基因座之三元複合物形成。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽之方法，該變異多肽相比於親本多肽，展現靶向增加數目之目標核酸或目標基因座。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生複數種變異多肽(例如具有相同胺基酸序列之獨立變異多肽)之方法，該等變異多肽在與複數種不同引導RNA個別複合時，相比於複數種親本多肽及引導RNA，展現靶向增加數目之目標核酸或目標基因座。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以增強變異多肽之穩定性的方法。變異多肽之穩定性可藉由以下技術測定或可包括不限於以下技術：熱變性分析、熱漂移分析、差示掃描熱量測定法(DSC)、差示掃描螢光測定法(DSF)、等溫滴定量熱法(ITC)、脈衝追蹤法、漂白追蹤法、環己醯亞胺追蹤法、圓二色譜(CD)光譜法、結晶及基於螢光之活性分析。

針對功能性之不同選擇在一態樣中，本發明提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以增強二元複合物形成、引導RNA結合活性及/或引導RNA結合特異性之方法。

在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以增強三元複合物形成、中靶結合親和力、中靶結合活性、中靶結合及/或中靶結合特異性之方法。在一態樣中，本發明亦提供用於將改變或突變引入至親本多肽序列中以增強二元複合物(例如核糖核蛋白)之中靶結合親和力(例如與目標相互作用之親和力或所花費之時間)、中靶結合活性(例如與目標相互作用時之核酸酶活性)、中靶結合(例如與目標之相互作用之強度)及/或中靶結合特異性(例如對特定目標之偏好)之方法。

在一些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列以產生具有增加之中靶結合及/或活性的變異多肽。此外，在此類實施例中，與親本多肽相比，變異多肽中之脫靶結合及/或活性可減少。此外，關於中靶結合與脫靶結合之特異性可增加或減少。

在一些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽，該變異多肽在與引導RNA複合時具有增加之中靶結合。此外，在此類實施例中，在包含變異多肽及引導RNA之複合物中脫靶結合可減少。此外，關於中靶結合/活性與脫靶結合/活性之特異性可增加或減少。

在某些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生增強穩定性及/或蛋白質-RNA相互作用之變異多肽。在某些實施例中，相比於親本多肽，變異多肽包括至少一個促進變異多肽之穩定性及/或RNA相互作用以及酶活性的改變。

在某些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽，該變異多肽(a)缺乏酶活性，但(b)保留增強之穩定性及/或蛋白酶-RNA相互作用。在某些實施例中，變異多肽包括至少一個改變，使得該變異多肽相比於親本多肽，促進變異多肽之穩定性及/或RNA相互作用，但不促進酶活性。

在某些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽，該變異多肽(a)增強酶活性，及(b)增強二元複合物形成、引導RNA結合活性及/或引導RNA結合特異性。在某些實施例中，變異多肽包括至少一個改變，使得該變異多肽相比於親本多肽，促進變異多肽之引導RNA複合物形成、引導RNA結合活性及/或引導RNA結合特異性以及酶促活性。

在某些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽，該變異多肽(a)缺乏酶活性，但(b)保留增強之二元複合物形成、引導RNA結合活性及/或引導RNA結合特異性。在某些實施例中，變異多肽包括至少一個改變，使得該變異多肽相比於親本多肽，促進變異多肽之二元複合物形成、引導RNA結合活性及/或引導RNA結合特異性，但不促進酶活性。

在某些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽，該變異多肽(a)增強酶活性，及(b)增強中靶三元複合物形成、中靶結合親和力、中靶結合活性及/或中靶結合特異性。在某些實施例中，變異多肽包括至少一個改變，使得該變異多肽相比於親本多肽，促進變異多肽之中靶三元複合物形成、中靶結合親和力、中靶結合活性及/或中靶結合特異性以及酶活性。

在某些實施例中，將改變或突變引入至親本多肽序列中以產生變異多肽，該變異多肽(a)缺乏酶活性，但(b)保留增強之中靶三元複合物形成、中靶結合親和力、中靶結合活性及/或中靶結合特異性。在某些實施例中，變異多肽包括至少一個改變，使得該變異多肽相比於親本多肽，促進變異多肽之中靶三元複合物形成、中靶結合親和力、中靶結合活性及/或中靶結合特異性，但不促進酶活性。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)增強之RNA親和力。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)增強之RNA親和力。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)增強之RNA親和力。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)增強之二元複合物形成。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)增強之二元複合物形成。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)增強之二元複合物形成。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)增強之引導RNA結合活性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)增強之引導RNA結合活性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)增強之引導RNA結合活性。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)增強之引導RNA結合特異性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)增強之引導RNA結合特異性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)增強之引導RNA結合特異性。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)增強之蛋白質-RNA相互作用。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)增強之蛋白質-RNA相互作用。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)增強之蛋白質-RNA相互作用。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)增強之蛋白質穩定性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)增強之蛋白質穩定性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)增強之蛋白質穩定性。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)減少之自引導RNA之解離。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)減少之自引導RNA之解離。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)減少之自引導RNA之解離。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)降低之酶活性及(b)增強之三元複合物形成。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)增加之酶活性及(b)增強之三元複合物形成。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽相對於SEQ ID NO: 3之親本多肽展現(a)保留之酶活性及(b)增強之三元複合物形成。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)降低之酶活性及(b)增強的對目標核酸之結合親和力。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)增加之酶活性及(b)增強的對目標核酸之結合親和力。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)保留之酶活性及(b)增強的對目標核酸之結合親和力。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)降低之酶活性及(b)增強的中靶結合活性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)增加之酶活性及(b)增強的中靶結合活性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)保留之酶活性及(b)增強的中靶結合活性。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)降低之酶活性及(b)增強的中靶結合特異性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)增加之酶活性及(b)增強的中靶結合特異性。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)保留之酶活性及(b)增強的中靶結合特異性。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)降低之酶活性及(b)減少的對非目標核酸之脫靶結合。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)增加之酶活性及(b)減少的對非目標核酸之脫靶結合。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)保留之酶活性及(b)減少的對非目標核酸之脫靶結合。

在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)降低之酶活性及(b)減少的自目標核酸之解離。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)增加之酶活性及(b)減少的自目標核酸之解離。在一些實施例中，將至少一個改變引入至SEQ ID NO: 3之親本多肽中以產生變異多肽，該變異多肽形成變異二元複合物，其相對於包含SEQ ID NO: 3之多肽的親本二元複合物展現(a)保留之酶活性及(b)減少的自目標核酸之解離。

變異二元複合一般而言，變異多肽及引導RNA以約1:1之莫耳比彼此結合以形成變異二元複合物。變異多肽及引導RNA單獨或在一起不會天然存在。

在一些實施例中，變異多肽可在宿主細胞中過度表現且如本文所述進行純化，隨後與引導RNA複合(例如在試管中)以形成變異核糖核蛋白(RNP) (例如變異二元複合物)。

在一些實施例中，在一系列培育時間內，變異二元複合物展現增加的對目標核酸之結合親和力、增加的中靶結合活性、增加的中靶結合特異性、增加的與目標核酸之三元複合物形成及/或增加的穩定性。在一些實施例中，在一系列培育時間內，變異二元複合物展現減少的與非目標核酸之脫靶結合及/或減少的自目標核酸之解離。在一些實施例中，在一系列培育時間內，變異二元複合物展現增加之目標核酸複合物形成、目標核酸活性及/或目標核酸特異性。

在一些實施例中，二元複合物之複合在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃或55℃中之任一者的溫度下發生。在一些實施例中，在約37℃下在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者的培育時期內變異多肽不自引導RNA解離或結合於游離RNA。在一些實施例中，在二元複合物形成之後，變異核糖核蛋白複合物不將引導RNA交換成不同RNA。

在一些實施例中，變異多肽及引導RNA於二元複合緩衝液中複合。在一些實施例中，變異多肽儲存於替換為二元複合緩衝液之緩衝液中以與引導RNA形成複合物。在一些實施例中，變異多肽儲存於二元複合緩衝液中。

在一些實施例中，二元複合緩衝液之pH在約7.3至8.6範圍內。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約7.3。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約7.4。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約7.5。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約7.6。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約7.7。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約7.8。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約7.9。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約8.0。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約8.1。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約8.2。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約8.3。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約8.4。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約8.5。在一個實施例中，二元複合緩衝液之pH為約8.6。

變異多肽之熱穩定性可在諸如添加引導RNA，例如結合引導RNA之有利條件下增加。

在一些實施例中，變異多肽可在如本文所述進行純化之前在宿主細胞中過度表現且與引導RNA複合。在一些實施例中，將編碼變異多肽之mRNA或DNA引入至細胞中，使得變異多肽在細胞中表現。亦將引導變異多肽至期望目標核酸之引導RNA引入至細胞中，無論與單個mRNA或DNA構築體同時、分開或依次，使得在細胞中形成所需核糖核蛋白複合物。

評定變異二元複合物穩定性及功能性在某些實施例中，本文提供用於鑑別最佳變異多肽/引導RNA複合物(在本文中稱為變異二元複合物)之方法，其包括(a)將變異多肽及引導RNA組合在樣品中以形成變異二元複合物；(b)量測變異二元複合物之值；及(c)若變異二元複合物之值大於參考分子之值，則確定變異二元複合物優於參考分子。在一些實施例中，值可包括但不限於穩定性量測值(例如T _m值、熱穩定性)、二元複合物形成速率、引導RNA結合特異性及/或複合物活性。

在一些實施例中，藉由以下步驟鑑定最佳變異多肽/引導RNA複合物(亦即變異二元複合物)：(a)在樣品中組合變異多肽與引導RNA以形成變異二元複合物；(b)偵測變異二元複合物之T _m值；及(c)若變異二元複合物之T _m值大於參考分子之T _m值或參考值T _m至少8℃，則確定變異二元複合物穩定。

涉及量測變異多肽/引導RNA複合物(亦即，變異二元複合物)之熱穩定性之步驟的方法可包括不限於測定變異二元複合物之穩定性之方法、測定促進穩定變異二元複合物之條件之方法、篩選穩定變異二元複合物之方法及用於鑑別最佳RNA以形成穩定變異二元複合物之方法。在某些實施例中，可量測變異二元複合物之熱穩定性值。

另外，在某些實施例中，亦可量測參考分子之熱穩定性值。在某些實施例中，若如本文所述，所量測之變異二元複合物之熱穩定性值大於所量測之參考分子之熱穩定性值或熱穩定性參考值(在相同實驗條件下量測)，則可確定變異二元複合物穩定。在某些實施例中，參考分子可為不存在引導RNA之變異多肽。

在某些實施例中，所量測之熱穩定性值可為變性溫度值。在此等實施例中，熱穩定性參考值為變性溫度參考值。在某些實施例中，經量測之熱穩定性值可為T _m值。在此等實施例中，熱穩定性參考值可為T _m參考值。在某些實施例中，熱穩定性值可使用熱偏移分析量測。在某些實施例中，用於量測熱穩定性之分析可涉及本文所述之技術，包括但不限於：熱變性分析、熱漂移分析、差示掃描熱量測定法(DSC)、差示掃描螢光測定法(DSF)、等溫滴定量熱法(ITC)、脈衝追蹤法、漂白追蹤法、環己醯亞胺追蹤法、圓二色譜(CD)光譜法、結晶及基於螢光之活性分析。

在某些實施例中，若變異多肽/引導RNA複合物形成之速率、引導RNA結合特異性及/或變異二元複合物之複合物活性大於參考分子之值或參考值(例如親本多肽/引導RNA複合物(在本文中稱為親本二元複合物)之值)，則可鑑別變異二元複合物。舉例而言，在某些實施例中，若變異多肽/引導RNA複合物形成速率、引導RNA結合特異性及/或變異二元複合物之複合物活性之值比參考分子或參考值(例如親本二元複合物之值)大至少X%，則可鑑別變異二元複合物。在某些實施例中，本文所述之方法可進一步包含包括量測如本文所述之變異二元複合物之活性的步驟。

變異三元複合在一些實施例中，如本文所描述之變異多肽、引導RNA及目標核酸形成變異三元複合物(例如在試管或細胞中)。一般而言，變異多肽、引導RNA及目標核酸以約1:1:1之莫耳比彼此締合以形成變異三元複合物。變異多肽、引導RNA及目標核酸單獨或在一起不會天然存在。

在一些實施例中，如本文所述之變異二元複合物(例如變異多肽與引導RNA之複合物)進一步與目標核酸(例如在試管或細胞中)複合以形成變異三元複合物。

在一些實施例中，三元複合物之複合在低於約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、50℃或55℃中之任一者之溫度下發生。在一些實施例中，在約37℃下在至少約10分鐘、15分鐘、20分鐘、25分鐘、30分鐘、35分鐘、40分鐘、45分鐘、50分鐘、55分鐘、1小時、2小時、3小時、4小時或更多小時中之任一者的培育時期內變異二元複合物不自目標核酸解離或結合於游離核酸(例如游離DNA)。在一些實施例中，在三元複合物形成之後，變異二元複合物不將目標核酸交換成不同核酸。

在一些實施例中，變異多肽、引導RNA及目標核酸於三元複合緩衝液中複合。在一些實施例中，變異多肽儲存於替換為三元複合緩衝液之緩衝液中以與引導RNA及目標核酸形成複合物。在一些實施例中，變異多肽儲存於三元複合緩衝液中。

在一些實施例中，變異二元複合物及目標核酸於三元複合緩衝液中複合。在一些實施例中，變異二元複合物儲存於替換為三元複合緩衝液之緩衝液中以與目標核酸形成複合物。在一些實施例中，變異二元複合物儲存於三元複合緩衝液中。

在一些實施例中，三元複合緩衝液具有在約7.3至8.6範圍內之pH。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約7.3。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約7.4。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約7.5。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約7.6。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約7.7。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約7.8。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約7.9。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約8.0。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約8.1。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約8.2。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約8.3。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約8.4。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約8.5。在一個實施例中，三元複合緩衝液之pH為約8.6。

變異多肽之熱穩定性可在諸如添加引導RNA及目標核酸之有利條件下增加。

評定變異三元複合物穩定性及功能性在某些實施例中，本文提供用於鑑別最佳變異三元複合物之方法，其包括(a)將變異多肽、引導RNA及目標核酸組合在樣品中以形成變異三元複合物；(b)量測變異三元複合物之值；及(c)若變異三元複合物之值大於參考分子之值，則確定變異三元複合物優於參考分子。在一些實施例中，值可包括但不限於穩定性量測值(例如T _m值、熱穩定性)、三元複合物形成速率、DNA結合親和力量測值、DNA結合特異性量測值及/或複合物活性量測值(例如核酸酶活性量測值)。

在一些實施例中，最佳變異三元複合物藉由以下步驟來鑑別：(a)將變異多肽、引導RNA及目標核酸組合在樣品中以形成變異三元複合物；(b)偵測變異三元複合物之T _m值；及(c)若變異三元複合物之T _m值比參考分子之T _m值或T _m參考值大至少8℃，則確定變異三元複合物穩定。

涉及量測變異三元複合物之熱穩定性之步驟的方法可包括不限於測定變異三元複合物之穩定性之方法、測定促進穩定變異三元複合物之條件之方法、篩選穩定變異三元複合物之方法及用於鑑別最佳二元複合物以形成穩定變異三元複合物之方法。在某些實施例中，可量測變異三元複合物之熱穩定性值。

另外，在某些實施例中，亦可量測參考分子之熱穩定性值。在某些實施例中，若如本文所述，所量測之變異三元複合物之熱穩定性值大於所量測之參考分子之熱穩定性值或熱穩定性參考值(在相同實驗條件下量測)，則可確定變異三元複合物穩定。在某些實施例中，參考分子可為不存在引導RNA及/或目標核酸之變異多肽。

在某些實施例中，所量測之熱穩定性值可為變性溫度值。在此等實施例中，熱穩定性參考值為變性溫度參考值。在某些實施例中，經量測之熱穩定性值可為T _m值。在此等實施例中，熱穩定性參考值可為T _m參考值。在某些實施例中，熱穩定性值可使用熱偏移分析量測。在某些實施例中，用於量測熱穩定性之分析可涉及本文所述之技術，包括但不限於差示掃描螢光測定法(DSF)、差示掃描熱量測定法(DSC)或等溫滴定量熱法(ITC)。

在某些實施例中，若變異三元複合物之三元複合物形成之速率、DNA結合親和力、DNA結合特異性及/或複合物活性(例如核酸酶活性)大於參考分子之值或參考值(例如親本三元複合物之值)，則可鑑別變異三元複合物。例如，在某些實施例中，若變異三元複合物之三元複合物形成之速率、DNA結合親和力、DNA結合特異性及/或複合物活性之值比參考分子之值或參考值(例如親本三元複合物之值)大至少X%，則可鑑別變異三元複合物。在某些實施例中，本文所述之方法可進一步包含包括量測如本文所述之變異三元複合物之活性的步驟。

在一個態樣中，提供一種修飾目標DNA分子之方法，該方法包含使目標DNA分子與本文所揭示之變異多肽及本文所揭示之引導RNA接觸。在一些實施例中，目標DNA分子係在活體外。在一些實施例中，目標DNA分子係在細胞中。在某些實施例中，細胞為活體外、離體或活體內細胞。在一些實施例中，細胞係選自原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。

遞送可調配本文所述之組成物或複合物，例如包括載劑，諸如載劑及/或聚合物載劑，例如脂質體，且藉由已知方法遞送至細胞(例如原核、真核、植物、哺乳動物等)。此類方法包括但不限於轉染(例如脂質介導、陽離子聚合物、磷酸鈣、樹枝狀聚合物)；電穿孔或破壞膜之其他方法(例如核轉染)、病毒遞送(例如慢病毒、反轉錄病毒、腺病毒、AAV)、顯微注射、微彈轟擊(「基因槍」)、fugene、直接音波裝載、細胞擠壓、光學轉染、原生質體融合、刺穿感染、磁轉染、胞外體介導之輸送、脂質奈米粒子介導之輸送及其任何組合。

在一些實施例中，該方法包含向細胞遞送一或多種核酸(例如編碼變異多肽、引導RNA、供體DNA等之核酸)、其一或多種轉錄物及/或預形成之變異多肽/引導RNA複合物(亦即變異二元複合物)。例示性細胞內遞送方法包括但不限於：病毒或病毒樣試劑；基於化學物質之轉染方法，諸如使用磷酸鈣、樹枝狀聚合物、脂質體或陽離子聚合物(例如DEAE-聚葡萄糖或聚乙烯亞胺)之彼等轉染方法；非化學方法，諸如顯微注射、電穿孔、細胞擠壓、聲致穿孔、光學轉染、刺穿感染、原生質體融合、細菌結合、遞送質體或轉座子；基於粒子之方法，諸如使用基因槍、磁轉染或磁體輔助之轉染、粒子轟擊；及雜交法，諸如核轉染。在一些實施例中，本申請案進一步提供藉由此類方法產生之細胞，及包含此類細胞或由此類細胞產生之生物體(諸如動物、植物或真菌)。

細胞本文所述之多肽、組成物或複合物可遞送至多種細胞。在一些實施例中，細胞為分離細胞。在一些實施例中，細胞在細胞培養物中。在一些實施例中，細胞為活體外細胞。在一些實施例中，自活有機體獲得細胞，且維持於細胞培養物中。在一些實施例中，細胞為單細胞生物體。

在一些實施例中，細胞為原核細胞。在一些實施例中，細胞為細菌細胞或來源於細菌細胞。在一些實施例中，細菌細胞並不與親本多肽所源自之細菌物種相關。在一些實施例中，細胞為古菌細胞或來源於古菌細胞。在一些實施例中，細胞為真核細胞。在一些實施例中，細胞為植物細胞或來源於植物細胞。在一些實施例中，細胞為真菌細胞或來源於真菌細胞。在一些實施例中，細胞為動物細胞或來源於動物細胞。在一些實施例中，細胞為無脊椎動物細胞或來源於無脊椎動物細胞。在一些實施例中，細胞為脊椎動物細胞或來源於脊椎動物細胞。在一些實施例中，細胞為哺乳動物細胞或來源於哺乳動物細胞。在一些實施例中，細胞為人類細胞。在一些實施例中，細胞為斑馬魚細胞。在一些實施例中，細胞為嚙齒動物細胞。在一些實施例中，細胞以合成方式製成，有時稱為人工細胞。

在一些實施例中，細胞來源於細胞株。用於組織培養之各種細胞株係此項技術中已知的。細胞株之實例包括但不限於293T、MF7、K562、HeLa及其轉殖基因種類。細胞株可自熟習此項技術者已知之多種來源(參見例如美國菌種保存中心(ATCC) (Manassas, Va.))獲得。在一些實施例中，用本文所述之一或多種核酸(諸如編碼Ago之載體及gDNA)或Ago-gDNA複合物轉染的細胞用於建立包含一或多種載體來源之序列的新細胞株以建立包含對目標核酸之修飾的新細胞株。在一些實施例中，使用經一或多種本文所述之核酸(諸如編碼變異多肽之載體及引導RNA)或變異多肽/引導RNA複合物(亦即變異二元複合物)的短暫或非短暫轉染之細胞或來源於此類細胞之細胞株評定一或多種測試化合物。

在一些實施例中，該方法包含將一或多種核酸引入至宿主細胞中，該一或多種核酸包含編碼靶向DNA之RNA(例如引導RNA)及/或變異多肽的核苷酸序列。在一個實施例中，包含目標DNA之細胞為活體外、活體內或離體的。在其他實施例中，包含編碼靶向DNA之RNA (例如引導RNA)及/或變異多肽之核苷酸序列的核酸包括重組表現載體，例如包括但不限於腺相關病毒構築體、重組腺病毒構築體、重組慢病毒構築體、重組反轉錄病毒構築體及其類似物。

在一些實施例中，細胞為初級細胞。舉例而言，初級細胞培養物可繼代0次、1次、2次、4次、5次、10次、15次或更多次。在一些實施例中，藉由任何已知方法自個體收集初級細胞。舉例而言，可藉由血球分離術、白血球分離術、密度梯度分離等收穫白血球。可藉由生檢收穫來自諸如皮膚、肌肉、骨髓、脾臟、肝臟、胰臟、肺、腸、胃等組織之細胞。適當溶液可用於分散或懸浮所收穫之細胞。此類溶液通常可為平衡鹽溶液(例如生理食鹽水、磷酸鹽緩衝鹽水(PBS)、漢克氏平衡鹽溶液(Hank's balanced salt solution)等)，宜補充胎牛血清或其他天然存在之因子，以及低濃度的可接受之緩衝液。緩衝液可包括HEPES、磷酸鹽緩衝液、乳酸鹽緩衝液等。細胞可立即使用，或其可儲存(例如藉由冷凍)。冷凍細胞可融化且能夠再使用。細胞可冷凍在DMSO、血清、培養基緩衝液(例如10% DMSO、50%血清、40%緩衝培養基)及/或用於在冷凍溫度下保存細胞之一些其他此類常用溶液中。

在一些實施例中，變異多肽具有誘導目標核酸(例如基因體DNA)中之雙股斷裂或單股斷裂的核酸酶活性。雙股斷裂可刺激細胞內源性DNA修復路徑，包括同源定向重組(HDR)、非同源末端接合(NHEJ)或替代非同源末端接合(A-NHEJ)。NHEJ可修復裂解之目標核酸而不需要同源模板。此可引起一或多種核苷酸缺失或插入至目標核酸中。HDR可在同源模板(諸如供體DNA)下發生。同源模板可包含與側接目標核酸裂解位點之序列同源的序列。在一些情況下，HDR可將外源性聚核苷酸序列插入至裂解之目標核酸中。由NHEJ及/或HDR進行之對目標DNA之修飾可引起例如突變、缺失、改變、整合、基因校正、基因替代、基因標記、轉殖基因嵌入、基因破壞及/或基因剔除。

在一些實施例中，細胞培養經同步以增強方法之效率。在一些實施例中，S及G2期之細胞用於HDR介導之基因編輯。在一些實施例中，細胞可在任何細胞週期經歷該方法。在一些實施例中，細胞過度塗鋪顯著降低該方法之功效。在一些實施例中，該方法在不超過約40%、45%、50%、55%、60%、65%或70%匯合中之任一者下施加至細胞培養物。

在一些實施例中，細胞中變異多肽/引導RNA複合物(亦即，變異二元複合物)與目標核酸之結合募集除DNA修復路徑外之一或多種內源性細胞分子或路徑以修飾目標核酸。在一些實施例中，變異二元複合物之結合阻斷一或多種內源性細胞分子或路徑接近目標核酸，由此修飾目標核酸。舉例而言，變異二元複合物之結合可阻斷內源性轉錄或轉譯機制，從而減少目標核酸之表現。

在一些實施例中，提供一種修飾細胞中之目標DNA分子的方法。該方法包含使細胞內部之目標DNA分子與以下接觸：本文所描述之變異多肽；及以5'至3'次序包含第一核苷酸區段的靶向單分子DNA之RNA，該區段與目標DNA分子之目標序列雜交；核苷酸連接子；及與第一核苷酸區段雜交以形成雙股RNA雙螺旋體之第二核苷酸區段。變異多肽與細胞內部之靶向單分子DNA之RNA形成複合物且目標DNA分子經修飾。

在一個態樣中，提供一種修飾細胞中之目標DNA分子的方法。該方法包含向細胞中引入本文所揭示之變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及引入本文所描述之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，或引入本文所描述之變異二元複合物，其中該引入包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。在一些實施例中，向細胞中引入之步驟包含轉染或轉導細胞。在一些實施例中，引入步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。在一些實施例中，細胞係選自原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。在一些實施例中，細胞為活體外、離體或活體內細胞。

套組本發明亦提供可用於例如進行本文所描述之方法的套組。在一些實施例中，套組包括本發明之變異多肽，例如包含表2之至少一個胺基酸取代之變異體。在一些實施例中，套組包括編碼此類變異多肽之聚核苷酸，且視情況聚核苷酸包含在例如如本文所述之載體內。套組亦可視情況包括例如如本文所述之引導RNA。本發明之套組之引導RNA可經設計以靶向相關序列，如此項技術中已知。CRISPR核酸酶變異體及引導RNA可包裝在套組內之相同小瓶或其他容器內，或可包裝在獨立小瓶或其他容器中，其內含物可在使用之前混合。套組可另外包括視情況緩衝液及/或CRISPR核酸酶變異體及/或引導RNA之使用說明書。

本文中引用之所有參考文獻及公開案均以引用之方式併入本文中。

實例以下實例係為了進一步說明本發明之一些實施例而提供，但不希望其限制本發明之範疇；應瞭解，根據其例示性性質，可替代地使用熟習此項技術者已知之其他程序、方法或技術。

實例1-變異構築體之工程改造在此實例中，產生變異構築體。

使用自IDT訂購之突變誘發正向及突變誘發反向引子，經由兩個PCR步驟構築包含單個突變之DNA模板。在第一步驟中，在384盤中進行兩組PCR反應以產生兩個片段。兩個PCR片段之重疊區域含有所需單個突變且允許經由第二PCR組裝整個DNA模板。在第二步驟中，來自第一步驟之經純化之片段用作重疊PCR (OL PCR)之模板且黏接至載體主鏈之Fw及Rv寡核苷酸用作OL PCR引子。所得線性DNA模板含有T7啟動子、T7終止子及CRISPR核酸酶之開放閱讀框架。

此等線性DNA模板直接用於無細胞轉錄及轉譯系統以表現含有單個突變之CRISPR核酸酶變異體。變異構築體進一步個別轉移至短暫轉染載體中。另外，包含組合突變之DNA模板藉由PCR製備且隨後轉移至短暫轉染載體中。

實例2-用於偵測變異二元複合物之螢光偏振分析在此實例中，經由螢光偏振分析法評定CRISPR核酸酶多肽與引導RNA形成二元複合物之能力。

藉由IDT合成線性ssDNA片段，該等片段包含正向重複序列上游之T7 RNA聚合酶啟動子序列之反向互補序列及期望之20 bp引導RNA目標。接著藉由將通用T7正向寡核苷酸黏接(以5℃/分鐘95-4℃)至反向互補序列ssDNA來產生線性dsDNA活體外轉錄(IVT)模板，且在25℃下用克列諾片段(Klenow fragment) (New England Biolabs®)填充15分鐘。接著在37℃下使用HiScribe T7高產率RNA合成套組(New England Biolabs®)將所得IVT模板轉錄至引導RNA中，歷時4小時。在轉錄之後，使用RNA清潔及濃縮套組(Zymo)純化各引導RNA且儲存在-20℃下直至使用。

接著用6-羧基螢光素(6-FAM) (IDT)標記引導RNA。用增加濃度之經標記引導RNA(7.5-250 nM)滴定含25 nM CRISPR核酸酶多肽(野生型或變異多肽)之1×分析緩衝液(20 mM Tris-HCl (pH 7.5)、150 mM KCl、5 mM MgCl ₂、1 mM DTT)。將複合物在37℃下培育30分鐘，隨後使用微量盤式讀取器(Infinite® 200 Pro, Tecan)量測螢光偏振。

亦研究在不同溫度下之二元複合物形成。如上所述之進一步結合實驗在25℃、50℃、60℃及70℃下等溫進行。

在滴定CRISPR核酸酶多肽(野生型或變異多肽)與遞增濃度之引導RNA之後二元複合物之形成(或在滴定引導RNA與遞增濃度之CRISPR核酸酶多肽之後二元複合物之形成)引起螢光偏振信號之變化，單位為毫偏值(millipolarization，mP)。藉由在一定引導RNA濃度範圍內繪製螢光偏振信號之變化來產生結合曲線。

此實例指示如何確定及比較CRISPR核酸酶多肽(野生型或變異多肽)與引導RNA之結合親和力。

實例3-用於偵測變異二元複合物之RNA電泳遷移率變化分析此實例描述使用RNA電泳遷移率變化分析(EMSA)測定CRISPR核酸酶多肽(野生型或變異)與引導RNA結合之能力。

如先前在Yan等人, 2018中所詳述，使用5' EndTag標記套組(Vector® Labs)及IRDye® 800CW順丁烯二醯亞胺(LI-COR® Biosciences)，用5' IRDye® 800CW標記來自IDT ^TM之合成引導RNA。在標記之後，清潔引導RNA且經由苯酚氯仿萃取進行濃縮。濃度藉由Nanodrop ^TM定量。

對於RNA結合分析，將CRISPR核酸酶多肽(野生型或變異多肽)在1×結合緩衝液(50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl ₂、1 mM DTT，pH 7.9)中稀釋至2.5 μM。接著將多肽在1X結合緩衝液中自2.5 μM連續稀釋至37.5 μM。再次將多肽在1X結合緩衝液加50 nM IR800標記之引導RNA中1:10稀釋且充分混合。此等反應物可進一步包括0.5-5 μg tRNA，其充當競爭性抑制劑以減少多肽與RNA之非特異性結合且藉此促進準確的特異性結合測定。將反應在37℃下培育1小時。將1 μL 100X溴酚藍添加至反應物中以實現染料前沿可視化，接著將整個反應物裝載至6% DNA阻滯凝膠(ThermoFisher®)上，在80V下操作90分鐘。凝膠在Licor® Odyssey® CLx上成像。

此分析依賴於RNA遷移穿過凝膠之速率由其尺寸決定的原理。僅RNA之樣品能夠遷移特定距離。然而，若RNA結合於多肽，則出現代表較大之較少移動之RNA複合物的條帶，其在凝膠上「上移」。

因此，量測兩個條帶之強度：1)僅RNA之條帶及2)結合多肽之「上移」RNA條帶。若所有RNA均結合於多肽，則僅觀測到上移條帶。隨著多肽之濃度降低，上移條帶之強度降低，同時僅RNA之條帶之強度增加。在比較RNA與CRISPR核酸酶多肽(野生型或變異多肽)之結合親和力時，較高多肽/RNA親和力之特徵在於在較低濃度之多肽下的更特異性結合。

此實例指示可如何確定及比較野生型CRISPR核酸酶多肽與引導RNA之結合親和力及變異多肽與引導RNA之結合親和力。

實例4-變異二元複合物之活體外裂解分析此實例描述用於製備CRISPR核酸酶RNP及測定CRISPR核酸酶(野生型或變異) RNP之活體外生化活性的方法。

使CRISPR核酸酶載體轉型至大腸桿菌BL21 (DE3) (New England BioLabs®)中且在T7啟動子下表現。經轉型細胞最初在5 mL Luria Broth (Teknova) + 50 μg/mL康黴素(kanamycin)中生長隔夜，接著接種至1 L Terrific Broth培養基(Teknova) + 50 μg/mL康黴素中。細胞在37℃下生長直至OD ₆₀₀為0.6-0.8，接著用0.5 mM IPTG誘導蛋白質表現。將培養物隨後在18℃下再生長14-18小時。收穫培養物且經由離心粒化，隨後再懸浮於每5 g細胞集結粒1 mL提取緩衝液(50 mM HEPES pH 7.5、500 mM NaCl、5%甘油、0.5 mM TCEP)中。細胞經由細胞破碎機(Constant System Limited)溶解，接著在4℃下在20,000×g下離心20分鐘以使溶解產物澄清。將0.2%聚乙烯亞胺(PEI)添加至澄清溶解產物且在4℃下在恆定底蓋翻轉下培育20分鐘。此外，溶解產物隨後在20,000×g下離心10分鐘。經由離子交換層析法純化溶解產物。在純化之後，溶離份在SDS-PAGE凝膠上操作，且彙集含有適當尺寸之蛋白質的溶離份且使用30kD Amicon Ultra15離心單元濃縮。蛋白質緩衝液更換成12.5 mM HEPES pH 7.0、120 mM NaCl、0.5 mM TCEP及50%甘油。濃度隨後使用Nanodrop ^TM(ThermoFisher®)量測，且蛋白質儲存在-20℃下。

使用2:1比率之合成crRNA (Integrated DNA Technologies)與蛋白質製備RNP。RNP在37℃下在1×NEB2緩衝液(50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl ₂、1 mM DTT，pH 7.9)中複合30分鐘。在複合之後，使用1X NEB2作為稀釋緩衝液稀釋RNP。Apo反應(無引導RNA之蛋白質)以相同方式製備，用H ₂O補足crRNA體積。

將目標dsDNA受質(Integrated DNA Technologies)以20 nM添加至RNP及apo樣品中。反應物經充分混合，接著在37℃下培育1小時，接著用1 μL 20 mg/mL蛋白酶K (ThermoFisher®)淬滅。將反應物在50℃下再培育15分鐘，接著將整個反應物在2%瓊脂糖E-凝膠(ThermoFisher®)上操作。凝膠藉由溴化乙錠在Gel Doc EZ凝膠影像器(Bio-Rad®)上可視化。

量測兩種類型條帶之強度：1)全長(未裂解) DNA條帶及2)一或多個下移裂解DNA條帶。非活性RNP之特徵在於全長DNA條帶。活性RNP產生一或多個下移裂解DNA條帶。隨著活性RNP之濃度降低，全長條帶之強度增加，且裂解條帶之強度降低。在比較多個RNP之活性時，活性比另一者高之RNP之特徵在於在更低RNP濃度下更密集之裂解條帶。

此實例之方法允許比較野生型或變異CRISPR核酸酶RNP (二元複合物)對目標DNA之活體外裂解活性。

實例5-變異多肽及變異二元複合物之活體外穩定性分析在此實例中，評定變異RNP之穩定性。

對於加速穩定性研究，以與實例4中所描述相同之方式產生RNP (5 μM)，且隨後將樣品儲存在25℃下48小時。

對RNP樣品進行活體外裂解分析(如實例4中所描述)。此等結果與實例4之結果相比較，以確定儲存在25℃下48小時之變異RNP保留生化活性的程度。

亦在25℃下培育Apo多肽(無引導RNA)48小時。使用實例3中所描述之方法對apo樣品進行RNA EMSA分析。此等結果與實例3之結果相比較，以確定變異CRISPR核酸酶能夠與引導RNA形成二元複合物之程度。

使用實例4中所描述之方法，在25℃下培育48小時之Apo樣品亦與引導RNA複合形成RNP。接著根據實例4之方法進行活體外裂解分析。將分析結果與實例4之結果相比較，以評定用在25℃下培育之蛋白質形成之變異RNP的活性程度。

此實例之方法允許比較野生型及變異多肽以及野生型及變異RNP (二元複合物)之穩定性。展現與引導RNA之特異性結合大於另一CRISPR核酸酶多肽與引導RNA之特異性結合的CRISPR核酸酶多肽表明更穩定之多肽。展現目標DNA之活體外裂解比另一CRISPR核酸酶多肽之裂解更穩固的CRISPR核酸酶RNP表明更穩定之二元複合物。

實例6-用於偵測變異三元複合物之DNA電泳遷移率變化分析此實例描述使用DNA EMSA確定引導RNA、CRISPR核酸酶多肽(野生型或變異多肽)及目標DNA受質形成三元複合物之能力。

使CRISPR核酸酶載體轉型至大腸桿菌BL21 (DE3) (New England BioLabs®)中且在T7啟動子下表現。經轉型細胞最初在5 mL Luria Broth (Teknova) + 50 μg/mL康黴素中生長隔夜，接著接種至1 L Terrific Broth培養基(Teknova) + 50 μg/mL康黴素中。細胞在37℃下生長直至OD ₆₀₀為0.6-0.8，接著用0.5 mM IPTG誘導蛋白質表現。將培養物隨後在18℃下再生長14-18小時。收穫培養物且經由離心粒化，隨後再懸浮於每5 g細胞集結粒1 mL提取緩衝液(50 mM HEPES pH 7.5、500 mM NaCl、5%甘油、0.5 mM TCEP)中。細胞經由細胞破碎機(Constant System Limited)溶解，接著在4℃下在20,000×g下離心20分鐘以使溶解產物澄清。將0.2%聚乙烯亞胺(PEI)添加至澄清溶解產物且在4℃下在恆定底蓋翻轉下培育20分鐘。此外，溶解產物隨後在20,000×g下離心10分鐘。經由離子交換層析法純化溶解產物。在純化之後，溶離份在SDS-PAGE凝膠上操作，且彙集含有適當尺寸之蛋白質的溶離份且使用30kD Amicon Ultra15離心單元濃縮。蛋白質緩衝液更換成12.5 mM HEPES pH 7.0、120 mM NaCl、0.5 mM TCEP及50%甘油。接著使用Nanodrop ^TM(ThermoFisher®)量測濃度且將蛋白質儲存在-20℃下。

使用2:1比率之合成引導RNA(Integrated DNA Technologies)與多肽製備RNP。選擇與本文所揭示之PAM序列相鄰之目標，且使用如本文所述之正向重複序列設計引導RNA。RNP在37℃下在1×NEB2緩衝液(50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、10 mM MgCl ₂、1 mM DTT，pH 7.9)中複合30分鐘。在複合之後，使用1X NEB2作為稀釋緩衝液，自5 μM至37.5 μM進行5點1:2連續稀釋。Apo反應(無引導RNA之多肽)以相同方式製備，用H ₂O補足引導RNA體積。

藉由PCR自寡核苷酸(Integrated DNA Technologies)來產生dsDNA目標受質。在PCR之前，正向引子之5'末端用IR800染料標記，如Yan等人, 2018中所述。隨後使用Amplitaq Gold (ThermoFisher®)，用IR800標記之正向引子及未標記反向引子擴增dsDNA受質。所得dsDNA經DNA清潔及Concentrator®-5套組(Zymo Research)純化且藉由Nanodrop ^TM(ThermoFisher®)定量。

將RNP樣品及Apo(對照)樣品在1X結合緩衝液(50 mM NaCl、10 mM Tris-HCl、1 mM TCEP、10%甘油、2 mM EDTA，pH 8.0)加20 nM IR800標記之目標DNA受質中1:10稀釋且充分混合。反應物在37℃下培育1小時。將溴酚藍添加至反應物中以進行染料前端目測，接著將整個反應物裝載至6% DNA阻滯凝膠(ThermoFisher Scientific™)上，在80V下操作90分鐘。凝膠在Licor® Odyssey® CLx上成像。

在此分析中，DNA遷移穿過凝膠之速率由其尺寸決定。僅DNA之樣品能夠遷移特定距離。然而，若RNP結合於DNA，則出現代表較大之較少移動之DNA複合物的譜帶，其在凝膠上「上移」。

此實例展示變異RNP (變異二元複合物)對DNA目標之親和力(以產生三元複合物)如何與野生型RNP (野生型二元複合物)對DNA目標之親和力相比。

實例7-使用5'-CTG-3' PAM序列編輯哺乳動物目標此實例描述對與5'-CTG-3' PAM序列相鄰之多個目標序列的插入/缺失評定。

將SEQ ID NO: 3之CRISPR核酸酶選殖至pcda3.1主鏈(Invitrogen ^TM)中。在U6啟動子下將各自包含SEQ ID NO: 6之正向重複序列之引導RNA選殖至pUC19主鏈(New England Biolabs®)中。接著最大製備質體且稀釋。引導RNA(亦即SEQ ID NO: 9、11、13、15、17、19、21及23之crRNA序列)及目標序列(亦即SEQ ID NO: 8、10、12、14、16、18、20及22)展示於表4中。表4.哺乳動物目標及對應crRNA.

目標識別符	目標序列	crRNA序列
AAVS1_T3	GTGAACACCTAGGACGCACCATTCT (SEQ ID NO: 8)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACGUGAACACCUAGGACGCACCAUUCU (SEQ ID NO: 9)
AAVS1_T5	GCCCTGGCTTTGGCAGCCTGTGCTG (SEQ ID NO: 10)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACGCCCUGGCUUUGGCAGCCUGUGCUG (SEQ ID NO: 11)
EMX1_T6	TGCCTGAAGTCGCCATCCAAAGCTT (SEQ ID NO: 12)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACUGCCUGAAGUCGCCAUCCAAAGCUU (SEQ ID NO: 13)
EMX1_T7	AATAGTCCCTTGCTAAAGAAACATG (SEQ ID NO: 14)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACAAUAGUCCCUUGCUAAAGAAACAUG (SEQ ID NO: 15)
VEGFA_T3	TGCTTTGTTGACATTGTCCACACCT (SEQ ID NO: 16)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACUGCUUUGUUGACAUUGUCCACACCU (SEQ ID NO: 17)
VEGFA_T5	AGTGCCCCCCCTTCTTGGGGGCTTT (SEQ ID NO: 18)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACAGUGCCCCCCCUUCUUGGGGGCUUU (SEQ ID NO: 19)
VEGFA_T6	TACCTCTTTCCTTTGCCCATACTGG (SEQ ID NO: 20)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACUACCUCUUUCCUUUGCCCAUACUGG (SEQ ID NO: 21)
VEGFA_T7	TGCCCATTGGTGGTCTGGATAAAAG (SEQ ID NO: 22)	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACUGCCCAUUGGUGGUCUGGAUAAAAG (SEQ ID NO: 23)

在轉染之前大致16小時，將含25,000個HEK293T細胞之DMEM/10% FBS+Pen/Strep塗鋪至96孔盤之各孔中。在轉染當天，細胞70-90%匯合。對於待轉染之各孔，製備GeneJuice ^®轉染劑(Millipore Sigma)及OptiMEM ^TM(ThermoFisher®)之混合物，且隨後在室溫下培育5分鐘(溶液1)。培育之後，將GeneJuice ^®:OptiMEM ^TM混合物添加至稀釋於OptiMEM ^TM中的包含CRISPR核酸酶質體及引導質體之單獨溶液(溶液2)。在陰性對照之情況下，crRNA不包括於溶液2中。藉由上下移液來混合溶液1及溶液2混合物，且隨後在室溫下培育5分鐘。在培育之後，將溶液1及溶液2逐滴添加至含有細胞之96孔盤的各孔中。轉染72小時後，藉由將TrypLE ^TM(ThermoFisher®)添加至各孔中心使細胞胰蛋白酶化且培育大致5分鐘。隨後將D10培養基添加至各孔且混合以使細胞再懸浮。將細胞轉移至96孔PCR盤中且短暫離心10分鐘。離心之後，丟棄上清液，且使集結粒再懸浮於20 μL QuickExtract ^TM萃取試劑(Biosearch ^TMTechnologies)中。再懸浮之細胞溶液在熱循環器中在65℃下培育15分鐘，在68℃下培育15分鐘，且在98℃下培育10分鐘。

藉由兩輪PCR製備下一代定序(NGS)的樣品。第一輪(PCR1)用於擴增特定基因體區域，視目標而定。PCR1產物藉由管柱純化來純化。進行第2輪PCR (PCR2)以添加Illumina轉接子及索引。隨後彙集反應物且藉由管柱純化來純化。用150次循環NextSeq ^TMv2.5 mid或高輸出套組進行定序操作。將經編輯目標定義為展示後台上插入/缺失水準(在此分析中＞0.5%)的目標。

圖 1展示包含插入/缺失之NGS讀段之百分比(原始插入/缺失%)。跨越八個不同目標之插入/缺失百分比為10.6%。此實例證實SEQ ID NO: 3之CRISPR核酸酶及包含SEQ ID NO: 6之正向重複序列的引導RNA在與5'-CTG-3' PAM序列相鄰的目標序列中產生插入/缺失。

實例8-CRISPR核糖核酸酶變異體靶向哺乳動物基因此實例描述使用藉由短暫轉染引入至哺乳動物細胞中之野生型及變異效應子(例如CRISPR核酸酶變異體)對在多個目標上之插入/缺失評定。

將CRISPR核酸酶選殖至pcda3.1主鏈(Invitrogen ^TM)中。接著最大製備質體且稀釋至1 μg/μL。選擇與本文所揭示之PAM序列相鄰之目標，且使用如本文所述之正向重複序列設計引導RNA。對於引導RNA製備，編碼crRNA之dsDNA片段係藉由含有目標序列骨架及U6啟動子之多聚體衍生。使多聚體再懸浮於pH為7.5之10 mM Tris•HCl中，達到100 μM之最終儲備濃度。隨後再使用10 mM Tris•HCl將工作儲備液稀釋至10 μM以充當用於PCR反應之模板。在50 μL反應物中用以下組分進行crRNA之擴增：0.02 μl前述模板、2.5 μl正向引子、2.5 μl反向引子、25 μl HiFi聚合酶(New England Biolabs®)及20 μl水。循環條件為：1× (在98℃下30秒)、30× (在98℃下10秒，在67℃下15秒)、1× (在72℃下2分鐘)。用1.8×SPRI處理清潔PCR產物且正規化至25 ng/μL。

在轉染之前大致16小時，將含100 μl 25,000個HEK293T細胞之DMEM/10% FBS+Pen/Strep塗鋪於96孔盤之各孔中。在轉染當天，細胞匯合為70-90%。對於待轉染之各孔，製備0.5 μl Lipofectamine ^TM2000及9.5 μl OptiMEM ^TM之混合物且隨後在室溫下培育5-20分鐘(溶液1)。在培育之後，將lipofectamine ^TM:OptiMEM ^TM混合物添加至含有182 ng CRISPR核酸酶質體及14 ng crRNA及至多10 μL之水的獨立混合物(溶液2)。藉由上下移液混合溶液1及溶液2混合物，且隨後在室溫下培育25分鐘。在培育之後，將20 μL溶液1及溶液2混合物逐滴添加至含有細胞之96孔盤之各孔中。轉染72小時後，藉由添加10 μL TrypLE ^TM至各孔中心使細胞胰蛋白酶化且培育大致5分鐘。隨後將100 μL D10培養基添加至各孔並混合以使細胞再懸浮。細胞接著在500 g下短暫離心10分鐘，且丟棄上清液。將QuickExtract ^TM緩衝液添加至原始細胞懸浮液體積量的1/5。細胞在65℃下培育15分鐘，在68℃下培育15分鐘，且在98℃下培育10分鐘。

藉由兩輪PCR來製備用於下一代定序之樣品。第一輪(PCR1)用以擴增特定基因體區域，視目標而定。PCR1產物藉由管柱純化來純化。進行第2輪PCR (PCR2)來添加Illumina轉接子及索引。隨後合併反應物且藉由管柱層析純化來純化。用150次循環NextSeq ^TMv2.5 mid或高輸出套組進行定序操作。

經編輯目標被定義為展示後台上插入/缺失水準(在此分析中＞0.5%)的目標。跨越相同目標組，比較由野生型CRISPR核酸酶及變異CRISPR核酸酶誘導之插入/缺失以鑑別核酸酶活性比野生CRISPR核酸酶更大的變異CRISPR核酸酶。

實例9-變異多肽靶向哺乳動物基因此實例描述使用藉由短暫轉染引入至哺乳動物細胞中之變異體對在多個目標上之插入/缺失評定。

將SEQ ID NO: 3之變異體(表6-8)選殖至pcDNA3.1主鏈(Invitrogen ^®)中。將引導RNA選殖至pUC19主鏈(New England Biolabs ^®)中。接著最大製備質體且稀釋。crRNA、目標及PAM序列列於表5中。表 5.哺乳動物目標及對應crRNA.

目標	crRNA序列	目標序列	PAM序列
AAVS1	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACGGAGGGAUACAUUGGUGGGG (SEQ ID NO: 24)	GGAGGGATACATTGGTGGGG (SEQ ID NO: 27)	5'-GCTG-3'
VEGFA	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACAGGCCACAGGGACCCAACUG (SEQ ID NO: 25)	AGGCCACAGGGACCCAACTG (SEQ ID NO: 28)	5'-TCTC-3'
EMX1	GGUCCCAUCGGAACGGGUUGUGGUUCCGACCGGCCAGUUUUUCCGUACGG (SEQ ID NO: 26)	CGGCCAGTTTTTCCGTACGG (SEQ ID NO: 29)	5'-GCTC-3'

在轉染之前大致16小時，將含25,000個HEK293T細胞之DMEM/10% FBS+Pen/Strep (D10培養基)塗鋪至96孔盤之各孔中。在轉染當天，細胞70-90%匯合。對於待轉染之各孔，製備Lipofectamine ^TM2000 (Invitrogen ^®)及Opti-MEM ^TM(Gibco ^TM)之混合物且在室溫下培育5分鐘(溶液1)。在培育之後，將Lipofectamine 2000 ^TM:Opti-MEM ^TM混合物添加至含有核酸酶質體、引導RNA質體及Opti-MEM ^TM之獨立混合物(溶液2)。在陰性對照之情況下，引導RNA質體不包括於溶液2中。藉由上下吸液混合溶液1及2，隨後在室溫下培育25分鐘。在培育之後，將溶液1及2混合物逐滴添加至含有細胞之96孔盤之各孔中。在轉染後大致72小時，藉由將TrypLE ^TM(Gibco ^TM)添加至各孔中心使細胞胰蛋白酶化且在37℃下培育大致5分鐘。隨後將D10培養基添加至各孔且混合以使細胞再懸浮。將再懸浮細胞在500 g下離心10分鐘以獲得集結粒，且棄去上清液。隨後將細胞集結粒再懸浮於QuickExtract ^TM緩衝液(Lucigen ^®)中，且將細胞在65℃下培育15分鐘，在68℃下培育15分鐘，且在98℃下培育10分鐘。

藉由兩輪PCR製備下一代定序的樣品。第一輪(PCR1)用於擴增特定基因體區域，視目標而定。進行第2輪PCR (PCR2)以添加Illumina銜接子及索引。隨後彙集反應物且藉由管柱純化來純化。使用150次循環NextSeq 500/550 Mid或高輸出v2.5套組(Illumina ^®)進行定序操作。表 6.相對於WT之例示性單一改變增加插入/缺失(跨越3個目標求平均值 )

插入 / 缺失 ( 倍數增加 )	突變	插入 / 缺失 ( 倍數增加 )	突變
3.913	D509R	2.497	L516K
3.712	S511R	2.461	Y381G
3.572	I521R	2.450	H532R
3.568	D535G	2.438	D129R
3.532	Q514G	2.390	P615R
3.460	L516R	2.373	G578R
3.364	L516G	2.353	M380G
3.287	E198R	2.292	V595G
3.174	S527R	2.272	R531G
3.133	D509K	2.261	D129G
3.045	D509G	2.230	R531K
3.042	L580G	2.219	D158G
2.998	V359R	2.192	N476G
2.952	D535K	2.183	G578K
2.936	Y381R	2.170	A512R
2.906	R354G	2.165	P618R
2.883	M380K	2.164	V595R
2.819	M380R	2.163	V595K
2.788	V383R	2.140	V383G
2.726	L580R	2.131	A597G
2.714	E367R	2.130	Y381K
2.714	I521K	2.129	P618G
2.658	E367G	2.087	E198K
2.657	E507R	2.087	T288R
2.653	I521G	2.079	E507K
2.649	W350R	2.065	L385R
2.580	D535R	2.057	C538G
2.557	R528K	2.035	P615G
2.554	S527K	2.013	D386R
2.540	L385G	2.012	S511K
2.505	W350G	2.000	C371G

表 7.對於WT之例示性雙重改變增加插入/缺失(跨越3個目標求平均值)

插入 / 缺失 ( 倍數增加 )	突變	插入 / 缺失 ( 倍數增加 )	突變	插入 / 缺失 ( 倍數增加 )	突變
3.902	L580G,L385G	2.942	D509R,L385G	2.533	I521R,D386R
3.751	L580G,A512R	2.939	I521R,P618R	2.532	Y381R,D129R
3.703	S527R,C538G	2.935	S511R,V383R	2.524	V383R,N476G
3.697	D129R,P618R	2.932	L385G,A512R	2.518	M380R,P615R
3.665	Q514G,A512R	2.924	D509R,P618R	2.512	E507R,A597G
3.633	S527R,L385G	2.921	Y381R,L385G	2.511	S527R,E507R
3.632	G578R,D158G	2.921	E367R,L385G	2.509	I521R,D129R
3.610	S511R,P618R	2.919	Q514G,D129R	2.507	Q514G,V359R
3.589	D158G,A512R	2.918	E198R,E367R	2.504	Y381R,A597G
3.582	R354G,A512R	2.918	D129R,C371G	2.498	S511R,D535G
3.580	A512R,P618R	2.916	S527R,D386R	2.497	L580G,D158G
3.567	V359R,A512R	2.915	Q514G,E507R	2.496	D509R,D158G
3.548	E367R,A512R	2.915	V359R,L385G	2.493	E198R,D129R
3.520	Q514G,N476G	2.914	M380R,L385G	2.492	L385G,V595G
3.504	S511R,A512R	2.914	Q514G,R354G	2.483	P615R,T288R
3.496	E198R,R354G	2.911	E198R,Y381R	2.479	M380R,P618R
3.475	Q514G,C538G	2.911	M380R,D129R	2.476	V383R,C371G
3.468	S527R,T288R	2.906	L580G,D129R	2.472	D509R,N476G
3.451	R354G,D158G	2.905	D129R,G578R	2.460	M380R,T288R
3.439	R354G,L385G	2.895	S511R,A597G	2.459	S511R,S527R
3.437	G578R,A512R	2.895	D535G,D158G	2.454	D158G,T288R
3.425	R354G,E507R	2.894	N476G,A512R	2.447	Q514G,S527R
3.424	S527R,G578R	2.893	Q514G,L516R	2.446	L516R,Y381R
3.422	S511R,C538G	2.892	E507R,P618R	2.443	R354G,E367R
3.417	I521R,V383R	2.888	V383R,D129R	2.440	A512R,T288R
3.402	S511R,I521R	2.887	L385G,C538G	2.437	V359R,D386R
3.401	L385G,G578R	2.880	I521R,D158G	2.435	S527R,V595G
3.393	L580G,N476G	2.875	L516R,L580G	2.425	D509R,A512R
3.383	Q514G,T288R	2.872	S527R,D158G	2.424	D535G,Q514G
3.377	D535G,A512R	2.871	H532R,A512R	2.424	W350R,N476G
3.347	D509R,M380R	2.869	I521R,R354G	2.422	S511R,D129R
3.347	S527R,C371G	2.867	I521R,Y381R	2.413	V359R,P615R
3.339	Q514G,D158G	2.866	D129R,P615R	2.413	I521R,P615R
3.336	E198R,C538G	2.853	V359R,E507R	2.408	M380R,A597G
3.332	S511R,L385G	2.853	E507R,G578R	2.408	E367R,D386R
3.317	S527R,N476G	2.847	L516R,P618R	2.404	M380R,D386R
3.316	L516R,A512R	2.846	R354G,M380R	2.400	L516R,S527R
3.302	S511R,C371G	2.842	R354G,D386R	2.396	L385G,D386R
3.295	L516R,C538G	2.835	I521R,G578R	2.395	V383R,T288R
3.290	E198R,C371G	2.833	Y381R,A512R	2.392	V359R,M380R
3.272	Q514G,V383R	2.826	A512R,D386R	2.388	L385G,H532R
3.250	L516R,N476G	2.822	M380R,G578R	2.388	S511R,V359R
3.249	D509R,T288R	2.815	Y381R,E507R	2.381	R354G,P615R
3.247	D509R,G578R	2.815	L580G,E507R	2.379	L516R,A597G
3.245	D158G,C371G	2.813	V359R,Y381R	2.379	E507R,D386R
3.242	I521R,N476G	2.811	P615R,N476G	2.377	I521R,A597G
3.239	E198R,M380R	2.808	D158G,N476G	2.370	V595G,D386R
3.238	D129R,N476G	2.797	Y381R,P615R	2.370	N476G,P618R
3.227	M380R,A512R	2.795	V595G,A512R	2.365	E367R,D129R
3.223	R354G,D129R	2.791	V383R,D158G	2.363	D535G,M380R
3.223	S527R,L580G	2.791	E507R,D158G	2.361	S527R,H532R
3.222	R354G,N476G	2.790	V383R,C538G	2.356	D509R,I521R
3.217	Q514G,P618R	2.789	V383R,E507R	2.356	E198R,V595G
3.213	V383R,L385G	2.787	E198R,D386R	2.355	E198R,D158G
3.209	E198R,V359R	2.783	D129R,D386R	2.352	D509R,A597G
3.198	D535G,N476G	2.783	M380R,D158G	2.351	A597G,T288R
3.196	Q514G,L385G	2.778	E198R,P618R	2.346	D509R,D129R
3.191	S511R,N476G	2.765	Q514G,E198R	2.345	P615R,A597G
3.189	D158G,A597G	2.763	I521R,S527R	2.338	S511R,E367R
3.189	L516R,G578R	2.762	E198R,A512R	2.337	L516R,E198R
3.189	E198R,L580G	2.761	L385G,C371G	2.333	D535G,A597G
3.186	E198R,L385G	2.761	H532R,C538G	2.332	H532R,D158G
3.184	L580G,V383R	2.760	N476G,C371G	2.328	H532R,D129R
3.180	I521R,C371G	2.759	Y381R,N476G	2.325	D535G,Y381R
3.179	V359R,R354G	2.758	M380R,V383R	2.317	E507R,T288R
3.178	Y381R,G578R	2.752	H532R,T288R	2.314	H532R,G578R
3.178	E198R,V383R	2.751	Q514G,D386R	2.313	D509R,L516R
3.157	L580G,D386R	2.750	R354G,T288R	2.310	G578R,A597G
3.156	L385G,P615R	2.750	Y381R,D158G	2.308	L580G,A597G
3.153	V383R,G578R	2.733	M380R,E507R	2.308	R531G,C371G
3.150	D535G,T288R	2.725	P615R,C371G	2.300	D535G,C371G
3.146	Y381R,P618R	2.722	S527R,D129R	2.297	E507R,N476G
3.143	A512R,A597G	2.721	M380R,C538G	2.296	L516R,H532R
3.141	Q514G,L580G	2.720	L580G,R354G	2.291	V383R,A597G
3.139	S527R,P615R	2.719	L385G,T288R	2.289	G578R,V595G
3.134	E198R,P615R	2.714	L580G,G578R	2.285	D509R,Y381R
3.129	I521R,T288R	2.713	E507R,L385G	2.282	D158G,P618R
3.125	Y381R,C538G	2.711	E507R,P615R	2.280	P618R,C538G
3.122	S527R,A512R	2.710	E198R,E507R	2.276	P618R,C371G
3.121	Y381R,C371G	2.708	S511R,D158G	2.269	N476G,D386R
3.121	I521R,L385G	2.708	G578R,P618R	2.269	V359R,P618R
3.118	L516R,T288R	2.705	D509R,P615R	2.265	D509R,Q514G
3.117	L516R,D158G	2.692	D158G,D386R	2.262	H532R,D386R
3.113	S527R,P618R	2.691	I521R,Q514G	2.261	L580G,W350R
3.112	S527R,R354G	2.690	D535G,D386R	2.242	S527R,V359R
3.105	Y381R,V383R	2.690	P615R,D386R	2.241	T288R,C371G
3.104	A512R,C371G	2.688	D535G,G578R	2.241	I521R,H532R
3.098	S511R,T288R	2.683	D535G,S527R	2.239	W350R,A512R
3.098	S511R,Q514G	2.681	Y381R,D386R	2.232	V595G,D158G
3.096	L516R,V383R	2.678	D129R,D158G	2.232	Y381R,M380R
3.091	A512R,C538G	2.676	Q514G,G578R	2.230	M380R,R531G
3.088	I521R,M380R	2.675	L516R,D129R	2.230	D535G,L516R
3.088	D535G,C538G	2.673	L385G,D129R	2.227	M380R,C371G
3.084	E198R,T288R	2.671	L385G,D158G	2.215	V595G,C538G
3.083	Q514G,M380R	2.664	E198R,H532R	2.209	L516R,R354G
3.082	S527R,V383R	2.655	Q514G,C371G	2.206	D129R,V595G
3.081	L580G,Y381R	2.652	G578R,D386R	2.199	D509R,S527R
3.077	S511R,G578R	2.651	R354G,A597G	2.187	V383R,P615R
3.074	Y381R,R354G	2.646	Q514G,A597G	2.186	Y381R,H532R
3.071	L516R,L385G	2.644	E367R,E507R	2.179	D129R,A597G
3.059	D535G,E198R	2.637	L580G,C371G	2.176	L516R,R531G
3.058	S527R,M380R	2.634	E367R,G578R	2.165	D386R,C371G
3.057	L580G,M380R	2.630	L516R,M380R	2.165	H532R,C371G
3.051	N476G,A597G	2.627	H532R,N476G	2.164	W350R,C538G
3.048	I521R,C538G	2.623	V359R,D129R	2.163	V383R,W350R
3.047	R354G,G578R	2.620	S511R,P615R	2.155	P615R,P618R
3.044	S511R,D386R	2.618	Q514G,Y381R	2.147	S511R,H532R
3.034	P615R,C538G	2.613	M380R,N476G	2.143	R354G,P618R
3.034	L580G,T288R	2.613	Q514G,P615R	2.142	G578R,R531G
3.033	E507R,C538G	2.613	D158G,C538G	2.137	E367R,D158G
3.030	E198R,A597G	2.610	Y381R,E367R	2.135	V359R,A597G
3.027	P615R,G578R	2.609	I521R,E507R	2.130	L580G,P618R
3.022	S511R,R354G	2.608	I521R,L516R	2.126	I521R,W350R
3.021	D509R,D386R	2.607	L385G,N476G	2.114	W350R,G578R
3.019	S511R,L580G	2.606	E198R,N476G	2.111	Q514G,E367R
3.014	E198R,S527R	2.605	R531G,T288R	2.111	S511R,V595G
3.012	V359R,G578R	2.603	Y381R,T288R	2.109	C538G,D386R
3.005	I521R,A512R	2.595	Y381R,V595G	2.107	A597G,D386R
3.001	D509R,C538G	2.592	P615R,D158G	2.104	H532R,P615R
3.001	L385G,P618R	2.592	D509R,E198R	2.099	V359R,V595G
2.997	P615R,A512R	2.591	E507R,V595G	2.094	M380R,H532R
2.990	V383R,A512R	2.582	L580G,P615R	2.093	W350R,P618R
2.985	L580G,C538G	2.582	D509R,L580G	2.085	H532R,P618R
2.984	G578R,C538G	2.580	V359R,D158G	2.080	Q514G,H532R
2.981	D535G,L385G	2.578	S527R,Y381R	2.062	L580G,H532R
2.980	L516R,D386R	2.577	D509R,C371G	2.061	W350R,T288R
2.978	L516R,E507R	2.573	E198R,G578R	2.059	D509R,E507R
2.975	S511R,Y381R	2.565	D535G,D129R	2.057	P618R,D386R
2.972	G578R,N476G	2.561	L516R,P615R	2.057	E507R,W350R
2.966	E507R,C371G	2.557	D129R,T288R	2.044	A597G,C538G
2.966	G578R,T288R	2.556	R354G,V383R	2.039	S511R,L516R
2.963	L385G,A597G	2.555	E507R,D129R	2.035	W350R,L385G
2.963	I521R,D535G	2.553	E507R,A512R	2.034	W350R,D158G
2.955	S527R,A597G	2.551	N476G,C538G	2.033	P618R,A597G
2.950	I521R,E198R	2.546	I521R,L580G	2.031	Q514G,V595G
2.949	S511R,E198R	2.542	L516R,C371G	2.026	E198R,W350R
2.949	S511R,M380R	2.539	D535G,L580G	2.019	D509R,V383R
2.945	S511R,E507R	2.539	D535G,E507R	2.008	D509R,R354G
2.945	D129R,A512R	2.537	D129R,C538G
2.942	G578R,C371G	2.534	R354G,C538G

表 8.相對於WT之例示性改變增加插入/缺失(跨越3個目標求平均值)

相對於WT之插入/缺失	突變
3.589	D535G,L516R,I521R
3.572	L516R,Q514G,I521R
3.396	D509R,L516R,I521R
3.255	D535G,L516R,Q514G
3.050	D535G,Q514G,I521R
2.907	Q514G,I521R,L580G,E198R
2.871	D535G,Q514G,I521R,E198R
2.798	D535G,L516R,Q514G,I521R
2.760	Q514G,I521R,S527R,E198R
2.741	D509R,D535G,L516R,Q514G,I521R
2.707	D535G,L516R,I521R,S527R
2.707	D535G,I521R,L580G,E198R
2.687	D509R,D535G,L516R
2.683	I521R,S527R,E198R,M380R
2.665	D509R,L516R,Q514G
2.653	D509R,Q514G,I521R
2.650	D535G,L516R,Q514G,S511R
2.540	D535G,L516R,Q514G,S527R
2.516	I521R,S527R,L580G,E198R
2.514	D535G,L516R,S527R,M380R
2.512	Q514G,S527R,L580G,E198R
2.445	L516R,Q514G,I521R,M380R
2.430	D509R,L516R,Q514G,S527R
2.418	D509R,I521R,L580G,E198R
2.366	S527R,L580G,E198R,M380R
2.357	L516R,S527R,L580G,E198R
2.346	D509R,Q514G,I521R,E198R
2.330	D535G,Q514G,I521R,S527R
2.311	Q514G,L580G,E198R,M380R
2.308	D509R,L516R,I521R,E198R
2.308	L516R,Q514G,I521R,L580G
2.269	D509R,D535G,Q514G,E198R
2.253	L516R,I521R,S527R,L580G
2.239	D535G,I521R,S527R,M380R
2.230	L516R,I521R,L580G,E198R
2.206	D509R,D535G,I521R
2.206	D535G,S527R,L580G,E198R
2.141	D509R,D535G,Q514G
2.119	S527R,L580G,E198R,R354G
2.116	Q514G,I521R,S527R,L580G
2.105	D535G,Q514G,E198R,M380R
2.100	L516R,Q514G,L580G,E198R
2.091	I521R,S527R,E198R,R354G
2.064	I521R,S527R,R354G,M380R
2.061	I521R,L580G,E198R,M380R
2.054	L516R,Q514G,S527R,L580G
2.016	D535G,Q514G,S527R,E198R
2.015	D509R,Q514G,L580G,E198R

如表6-8中所示，包含諸如D509R之單胺基酸取代或諸如L580G及L385G之兩個至五個胺基酸取代的多個變異體引起插入/缺失活性增加至少2倍。

實例10-變異多肽靶向哺乳動物基因此實例描述使用藉由短暫轉染引入哺乳動物細胞中之變異多肽，對多個目標之插入/缺失評定。

使用實例9中所述之分析及三個目標，分析SEQ ID NO: 3之其他組合變異體。使得插入/缺失活性增加至少2倍的組合突變，諸如K136G、N220R及M380R，展示於表9中。表 9.相對於WT之例示性改變增加插入/缺失(跨越3個目標求平均值)

相對於WT之插入/缺失	突變
4.535	K136G,N220R,M380R
4.138	S78K,E198R,R354G
4.001	K141G,N220R,M380R
4.001	K141G,K240R,M380R
3.727	K141G,D277R,M380R
3.411	K136G,D277R,M380R
3.347	S78K,E198R,L385R
3.330	L580G,L385G,S511R,A512R
3.266	S78K,E198R,M380R
3.193	K136G,K240R,M380R
3.107	T165R,N220R,M380R
3.088	L580G,L385G,Q514G,A512R
3.056	D129R,P618R,S511R,A512R
2.928	S78K,E198R,K374R
2.865	T165R,D277R,M380R
2.827	L580G,L385G,G578R,D158G
2.786	D129R,P618R,R354G,A512R
2.775	T165R,K240R,M380R
2.764	K141G,K240R,L385R
2.755	K136G,N220R,L385R
2.743	D129R,P618R,Q514G,A512R
2.718	D129R,P618R,S527R,L385G
2.637	K141G,N220R,L385R
2.533	L580G,L385G,Q514G,N476G
2.519	L580G,L385G,A512R,P618R
2.360	K141G,D277R,L385R
2.316	D129R,P618R,D158G,A512R
2.265	K136G,N220R,K374R
2.259	K136G,D277R,L385R
2.193	K136G,K240R,L385R
2.148	L580G,L385G,S527R,C538G
2.138	T165R,K240R,L385R
2.114	D129R,P618R,V359R,A512R

所列舉實施例提供以下所列舉之實施例，其編號不應解釋為表示重要級。

實施例1提供一種變異多肽或包含變異多肽之組成物，其中變異多肽包含相對於親本多肽之改變，其中親本多肽包含SEQ ID NO: 3，其中變異多肽能夠結合至引導RNA及目標核酸，且其中變異多肽或包含變異多肽之複合物相對於親本多肽或包含親本多肽之複合物展現增強的酶活性、增強的結合活性、增強的結合特異性及/或增強的穩定性。

實施例2提供如實施例1之變異多肽或組成物，其中增強的酶活性為增強的核酸酶活性。

實施例3提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異多肽相對於親本多肽展現增強的與引導RNA之結合活性。

實施例4提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異多肽相對於親本多肽展現增強的與引導RNA之結合特異性。

實施例5提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異多肽與引導RNA形成變異二元複合物，且變異二元複合物展現以下特徵中之一或多者： (i) 相對於親本二元複合物，增強的與目標核酸之結合活性(例如中靶結合活性)； (ii) 相對於親本二元複合物，增強的與目標核酸之結合特異性(例如中靶結合特異性)； (iii) 相對於親本二元複合物，增強的穩定性；及/或 (iv) 相對於親本二元複合物，減少的自目標核酸之解離，及/或減少的與非目標核酸之脫靶結合。

實施例6提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異二元複合物與目標核酸形成變異三元複合物，且變異三元複合物相對於親本三元複合物展現增加的穩定性。

實施例7提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異多肽相對於親本多肽進一步展現增強之二元複合物形成、增強之蛋白質-RNA相互作用及/或減少之自引導RNA之解離。

實施例8提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性在例如20℃至65℃之溫度範圍內發生。

實施例9提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性在一系列培育時間內發生。

實施例10提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性在pH在約7.3至約8.6範圍內之緩衝液中發生。

實施例11提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中當變異多肽、變異二元複合物或變異三元複合物之T _m值比親本多肽、親本二元複合物或親本三元複合物之T _m值大至少8℃時，發生增強之酶活性、增強之結合活性、增強之結合特異性及/或增強之穩定性。

實施例12提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中改變為表2中所列之至少一個胺基酸取代。

實施例13提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中改變為精胺酸、離胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、丙胺酸或甘胺酸取代。

實施例14提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異多肽包含RuvC域或分離RuvC域。

實施例15提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異多肽包含一或多個催化殘基(例如天冬胺酸或麩胺酸)。

實施例16提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中一或多種催化性殘基包含D345及E506。

實施例17提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中引導RNA包含正向重複序列及間隔序列。

實施例18提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%序列一致性之核苷酸序列。

實施例19提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少95%序列一致性之核苷酸序列。

實施例20提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中正向重複序列包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。

實施例21提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中間隔序列之長度包含15至35個核苷酸。

實施例22提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中引導RNA包含SEQ ID NO: 9、11、13、15、17、19、21及23中之任一者。

實施例23提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中目標核酸包含與間隔序列中之核苷酸序列互補的序列。

實施例24提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中目標核酸與原間隔序列相鄰模體(PAM)序列相鄰，其中目標核酸與原間隔序列相鄰模體(PAM)序列相鄰，其中PAM序列包含闡述為5'-NTN-3'、5'-HTN-3'或5'-TNA-3'的核苷酸序列，其中N為任何核苷酸且H為A或C或T。

實施例25提供如實施例24之變異多肽或組成物，其中PAM序列包含闡述為5'-CTG-3'之核苷酸序列。

實施例26提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中目標核酸為單股DNA或雙股DNA。

實施例27提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中變異多肽進一步包含肽標籤、螢光蛋白、鹼基編輯域、DNA甲基化域、組蛋白殘基修飾域、定位因子、轉錄修飾因子、光閘控控制因子、化學誘導因子或染色質可視化因子。

實施例28提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中編碼變異多肽之核酸經密碼子最佳化以用於在細胞中表現。

實施例29提供如實施例28之變異多肽或組成物，其中編碼變異多肽之核酸係以可操作方式連接至啟動子。

實施例30提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中編碼變異多肽之核酸係在載體中。

實施例31提供如實施例31之變異多肽或組成物，其中載體包含反轉錄病毒載體、慢病毒載體、噬菌體載體、腺病毒載體、腺相關載體或單純疱疹載體。

實施例32提供如任何前述實施例之變異多肽或組成物，其中組成物存在於包含奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡或基因槍的遞送組成物中。

實施例33提供一種細胞，其包含如任何前述實施例之變異多肽或組成物。

實施例34提供如實施例33之細胞，其中細胞為真核細胞或原核細胞。

實施例35提供如任何前述實施例之細胞，其中細胞為哺乳動物細胞或植物細胞。

實施例36提供如任何前述實施例之細胞，其中細胞為人類細胞。

實施例37提供一種引導RNA或編碼引導RNA之核酸，其中引導RNA包含正向重複序列及間隔序列，且其中正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4-6中之任一者具有至少90%一致性之核苷酸序列。

實施例38提供如實施例42之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，其中正向重複序列係選自由SEQ ID NO: 4-6組成之群。

實施例39提供如實施例40或41中任一項之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，其中間隔序列鄰近於5'-CTG-3'原間隔序列相鄰模體結合。

實施例40提供如實施例40至42中任一項之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，其中引導RNA包含SEQ ID NO: 9、11、13、15、17、19、21及23中之任一者之核苷酸序列。

實施例41提供一種組成物，其包含如實施例37至40中任一項之引導RNA或編碼引導RNA之核酸。

實施例42提供如實施例41之組成物，其中組成物進一步包含CRISPR核酸酶或編碼CRISPR核酸酶之核酸。

實施例43提供如實施例42之組成物，其中CRISPR核酸酶包含與SEQ ID NO: 3具有至少80%一致性之胺基酸序列。

實施例44提供如實施例43之組成物，其中CRISPR核酸酶包含與SEQ ID NO: 3具有至少95%一致性之胺基酸序列。

實施例45提供如實施例41至44中任一項之組成物，其中CRISPR核酸酶為如實施例1至32中任一項之變異多肽。

實施例46提供一種製備如任何前述實施例之變異多肽之方法，該方法包含(i)將一或多個核苷酸取代引入至包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核酸中以產生編碼變異多肽之變異核酸，及(ii)由變異核酸表現變異多肽。

實施例47提供一種變異二元複合物，其包含如任何前述實施例之變異多肽及引導RNA。

實施例48提供一種變異三元複合物，其包含如任何前述實施例之變異多肽、引導RNA及目標核酸。

實施例49提供一種形成變異二元複合物之方法，該方法包含使如任何前述實施例之變異多肽與如任何前述實施例之引導RNA接觸。

實施例50提供一種形成變異三元複合物之方法，該方法包含使如任何前述實施例之變異多肽與如任何前述實施例之引導RNA及如任何前述實施例目標核酸接觸。

實施例51提供一種將如任何前述實施例之變異多肽或組成物或變異二元複合物遞送至細胞之方法，該方法包含向細胞中引入如實施例1至32中任一項之變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及視情況引入如任何前述實施例之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，或引入如實施例5之變異二元複合物，其中引入包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。

實施例52提供一種用於修飾細胞中之目標DNA分子之方法，該方法包含向細胞中引入如實施例1至32中任一項之變異多肽或編碼變異多肽之核酸，及引入如任何前述實施例之引導RNA或編碼引導RNA之核酸，或引入如實施例47之變異二元複合物，其中引入包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。

實施例53提供如實施例51或52之方法，其中向細胞中引入之步驟包含轉染或轉導細胞。

實施例54提供如實施例51至53中任一項之方法，其中向細胞中引入之步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。

實施例55提供一種修飾目標DNA分子之方法，該方法包含使目標DNA分子與如實施例1至32中任一項之變異多肽及如任何前述實施例之引導RNA接觸。

實施例56提供如實施例55之方法，其中目標DNA分子係在活體外或細胞中。

實施例57提供如實施例51至54及56中任一項之方法，其中細胞為活體外、離體或活體內細胞。

實施例58提供如實施例57之方法，其中細胞係選自原核細胞、真核細胞、植物細胞、哺乳動物細胞及人類細胞。

其他實施例本文所引用之每一專利、專利申請案及公開案之揭示內容均以全文引用的方式併入本文中。雖然已參考特定實施例揭示本發明，但顯而易見熟習此項技術者可在不背離本發明之真實精神及範疇的情況下設計本發明之其他實施例及變化形式。所附申請專利範圍意欲理解為包括所有該等實施例及等效變化形式。

圖 1展示跨越與5'-CTG-3' PAM序列相鄰之八個目標位點的插入/缺失活性(原始插入/缺失%)。目標位點及crRNA之序列展示於表4中。

Claims

一種變異多肽，其中該變異多肽包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之改變，其中該改變包含D509R、S511R、I521R、D535G、Q514G、L516R、L516G、E198R、S527R、D509K、D509G、L580G、V359R、D535K、Y381R、R354G、M380K、M380R、V383R、L580R、E367R、I521K、E367G、E507R、I521G、W350R、D535R、R528K、S527K、L385G、W350G、L516K、Y381G、H532R、D129R、P615R、G578R、M380G、V595G、R531G、D129G、R531K、D158G、N476G、G578K、A512R、P618R、V595R、V595K、V383G、A597G、Y381K、P618G、E198K、T288R、E507K、L385R、C538G、P615G、D386R、S511K、C371G、K136G、N220R、S78K、K141G、K240R、D277R、T165R或K374R，其中該變異多肽包含與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列至少90%一致性。
一種變異多肽，其中該變異多肽包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之改變，其中該改變包含D509R、S511R、I521R、D535G、Q514G、L516R、L516G、E198R、S527R、D509K、D509G、L580G、V359R、D535K、Y381R、R354G、M380K、M380R、V383R、L580R、E367R、I521K、E367G、E507R、I521G、W350R、D535R、R528K、S527K、L385G、W350G、L516K、Y381G、H532R、D129R、P615R、G578R、M380G、V595G、R531G、D129G、R531K、D158G、N476G、G578K、A512R、P618R、V595R、V595K、V383G、A597G、Y381K、P618G、E198K、T288R、E507K、L385R、C538G、P615G、D386R、S511K或C371G、K136G、N220R、S78K、K141G、K240R、D277R、T165R或K374R，且其中該變異多肽與SEQ ID NO: 3之胺基酸序列之差異為1-20個胺基酸殘基。
如請求項1或2之變異多肽，其中該改變係選自包含以下之群： i) D509R； ii) S511R； iii) I521R； iv) D535G；及 v) Q514G。
如請求項1至3中任一項之變異多肽，其中該變異多肽進一步包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的第二改變。
如請求項4之變異多肽，其中： i) 該改變包含L580G且第二改變包含L385G； ii) 該改變包含D509R且該第二改變包含M380R； iii) 該改變包含L580G且該第二改變包含A512R； iv) 該改變包含S527R且該第二改變包含C538G； v) 該改變包含D129R且該第二改變包含P618R；或 vi) 該改變包含Q514G且該第二改變包含A512R。
如請求項4之變異多肽，其中該變異多肽進一步包含相對於SEQ ID NO: 3之胺基酸序列的第三改變。
如請求項6之變異多肽，其中： i) 該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含I521R； ii) 該改變包含L516R，該第二改變包含Q514G，且該第三改變包含I521R； iii) 該改變包含D509R，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含I521R； iv) 該改變包含D535G，該第二改變包含L516R，且該第三改變包含Q514G； v) 該改變包含D535G，該第二改變包含Q514G，且該第三改變包含I521R； vi) 該改變包含K136G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含M380R； vii) 該改變包含S78K，該第二改變包含E198R，且該第三改變包含R354G； viii) 該改變包含K141G，該第二改變包含N220R，且該第三改變包含M380R； ix) 該改變包含K141G，該第二改變包含K240R，且該第三改變包含M380R；及， x) 該改變包含K141G，該第二改變包含D277R，且該第三改變包含M380R。
如請求項6之變異多肽，其中該變異多肽進一步包含第四改變。
如請求項8之變異多肽，其中該改變包含Q514G，該第二改變包含I521R，該第三改變包含L580G，且該第四改變包含E198R。
如請求項8之變異多肽，其中該變異多肽進一步包含第五改變。
如請求項10之變異多肽，其中該改變包含D509R，該第二改變包含D535G，該第三改變包含L516R，該第四改變包含Q514G，且該第五改變包含I521R。
如請求項10之變異多肽，其中該變異多肽進一步包含第六改變，且視情況進一步包含第七、第八、第九及第十改變。
如請求項4之變異多肽，其中該第二改變包含取代、插入或缺失。
如請求項6之變異多肽，其中該第三改變包含取代、插入或缺失。
如請求項8之變異多肽，其中該第四改變包含取代、插入或缺失。
如請求項10之變異多肽，其中該第五改變包含取代、插入或缺失。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽能夠結合至引導RNA。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽或包含該變異多肽之複合物相對於SEQ ID NO 3之多肽展現增強的酶活性及/或增強的穩定性。
如請求項18之變異多肽，其中該增強的酶活性為增強的核酸酶活性。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽或包含該變異多肽之複合物包含相對於SEQ ID NO: 3之多肽增強至少1.5倍、2倍、2.5倍或3倍的酶活性，例如藉由插入/缺失(indel)活性所量測，例如如實例9及10中所述。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽相對於親本多肽展現增強的與該引導RNA之結合活性。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽相對於該親本多肽展現增強的與該引導RNA之結合特異性。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽包含RuvC域或分離RuvC域。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽包含一或多個催化殘基(例如天冬胺酸或麩胺酸)。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該一或多個催化殘基包含D345及E506。
如請求項1至23中任一項之變異多肽，其具有降低之核酸酶活性或為核酸酶死亡多肽。
如前述請求項中任一項之變異多肽或系統，其中該第二改變包含插入多肽域，其中視情況，該插入位於SEQ ID NO: 3之序列之N端、C端或其內部。
如前述請求項中任一項之變異多肽，其中該變異多肽進一步包含肽標籤、螢光蛋白、鹼基編輯域、DNA甲基化域、組蛋白殘基修飾域、定位因子、轉錄修飾因子、光閘控控制因子、化學誘導因子或染色質可視化因子。
一種引導RNA或編碼該引導RNA之核酸，其中該引導RNA包含正向重複序列及間隔序列，且其中該正向重複序列包含SEQ ID NO: 4-6中之任一者之核苷酸序列或與其具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性之序列，其中緊接該正向重複序列之3'的核苷酸係選自C、T或G。
一種系統，其包含如前述請求項中任一項之變異多肽或編碼該變異多肽之第一核酸及引導RNA或編碼該引導RNA之第二核酸，其中該引導RNA包含正向重複序列及間隔序列，視情況其中該引導RNA為如請求項29之引導RNA。
如請求項30之系統，其中該正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少90%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項30或31之系統，其中該正向重複序列包含與SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6具有至少95%序列一致性之核苷酸序列。
如請求項30至32中任一項之系統，其中該正向重複序列包含SEQ ID NO: 4、SEQ ID NO: 5或SEQ ID NO: 6。
如請求項30至33中任一項之系統，其中該間隔序列之長度包含15至35個核苷酸。
如請求項30至34中任一項之系統，其中該第一核酸位於第一載體中，且該編碼該引導RNA之第二核酸位於載體(例如該第一載體或第二載體)中，視情況其中該第一載體及/或該第二載體為病毒載體。
如請求項30至35中任一項之系統，其中該目標核酸包含與該間隔序列中之核苷酸序列互補的序列。
如請求項30至36中任一項之系統，其中該目標核酸與原間隔序列相鄰模體(protospacer adjacent motif)(PAM)序列相鄰，其中該PAM序列包含闡述為5'-NTN-3'、5'-HTN-3'或5'-TNA-3'的核苷酸序列，其中N為任何核苷酸且H為A或C或T。
如請求項37之系統，其中該PAM序列包含闡述為5'-CTG-3'或5'-CTC-3'之核苷酸序列。
如請求項30至38中任一項之系統，其中該目標核酸為雙股DNA。
一種核酸，其編碼如請求項1至29中任一項之變異多肽。
如請求項40之核酸，其經密碼子最佳化以在細胞中表現。
如請求項40或41之核酸，其中該核酸進一步包含編碼該引導RNA之序列。
如請求項40至42中任一項之核酸，其中該核酸係以可操作方式連接至啟動子。
如請求項40至42中任一項之核酸，其中該核酸包含RNA (例如mRNA)。
如請求項40至44中任一項之核酸，其中該核酸係在載體中。
如請求項45之載體，其中該載體包含反轉錄病毒載體、慢病毒載體、噬菌體載體、腺病毒載體、腺相關載體或單純疱疹載體。
如請求項46之病毒載體，其中該病毒載體為腺相關病毒(AAV)載體。
一種組成物，其包含如請求項1至29中任一項之變異多肽、如請求項30至39中任一項之系統、如請求項40至45中任一項之核酸或如請求項46或47之載體，其中該組成物存在於奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡或基因槍中。
一種細胞，其包含如請求項1至29中任一項之變異多肽、如請求項30至39中任一項之系統、如請求項40至45中任一項之核酸或如請求項46或47之載體。
如請求項49之細胞，其中該細胞為真核細胞。
如請求項50之細胞，其中該細胞為哺乳動物細胞或植物細胞。
如請求項51之細胞，其中該細胞為人類細胞。
一種產生如請求項1至29中任一項之變異多肽的方法，該方法包含(i)產生編碼該變異多肽之核酸序列，及(ii)將該核酸序列引入至能夠表現該核酸序列之適當宿主細胞中，及(iii)使該宿主細胞表現該變異多肽。
一種產生如請求項1至29中任一項之變異多肽的方法，該方法包含(i)將一或多個核苷酸取代引入至包含SEQ ID NO: 1或SEQ ID NO: 2之核酸中以產生編碼該變異多肽之變異核酸，及(ii)由該變異核酸表現該變異多肽。
一種將如前述請求項中任一項之變異多肽遞送至細胞之方法，該方法包含向該細胞中引入如請求項1至29中任一項之變異多肽或編碼該變異多肽之核酸，及視情況引入引導RNA或該編碼該引導RNA之核酸，其中該引入視情況包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。
一種用於修飾細胞中之目標DNA分子之方法，該方法包含向該細胞中引入如請求項1至29中任一項之變異多肽或編碼該變異多肽之核酸，及引入引導RNA或該編碼該引導RNA之核酸，其中該引入視情況包含引入奈米粒子、脂質體、胞外體、微囊泡、病毒載體或其任何組合。
如請求項55或56之方法，其中向該細胞中引入之步驟包含轉染或轉導該細胞。
如請求項55至57中任一項之方法，其中該向該細胞中引入之步驟包含使用電穿孔、注射、基因槍或其任何組合。
如請求項55至57中任一項之方法，其中該編碼該變異多肽之核酸包含RNA (例如mRNA)。