CN101340925A - 用于介导蛋白质干扰的手段和方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于功能蛋白质组学领域，更特别地，属于蛋白质聚集领域。本发明公开了一种用于干扰靶蛋白功能的方法和非天然的、用户设计的分子的应用，所述分子称为干扰子，具有针对靶蛋白的特异性并且一旦与所述靶蛋白接触便诱导聚集。本发明还公开了这些干扰子分子及其在治疗应用方面的用途。

Description

用于介导蛋白质干扰的手段和方法

技术领域

本发明属于功能蛋白质组学领域，更特别地，属于蛋白质聚集(aggregation)领域。本发明公开了一种用于干扰靶蛋白功能的方法和非天然的、用户设计的分子的应用，所述分子称为干扰子(interferor)，具有针对靶蛋白的特异性并且一旦与所述靶蛋白接触便诱导聚集。本发明还公开了这些干扰子分子及其在治疗应用方面的用途。

背景技术

生物学正在进入一个由全基因组范围内的信息增长所带来的令人激动的时代。随着基因组测序和高通量功能基因组学方法产生越来越多的数据，研究人员需要新的方式解析出生物学相关信息。在将生物学手段应用于基因组数据方面，功能基因组学正在特别地产生快速进步。基因组中编码的信息包括基因和控制元件，所述基因的蛋白质产物在生物体中介导大多数功能。蛋白质被认为是细胞中最重要的效应器(effector)，尽管最近非编码RNA也被鉴定为调节过程中的重要参与者。

一些关键生物学问题是继续进行基因组课题的关键，并且与从细菌到人体的所有细胞生物体相关。一个挑战是要明白基因组中编码的基因是如何操控并相互作用以产生复杂的活系统的。一个相关的挑战是确定基因组中全部序列元件的功能。功能基因组学的工具箱已经给出了一些系统方法，对于基因组中的大多数基因，所述方法能够为一些基础问题提供答案，包括一个基因何时表达、其产物定位于何处、其与何种其他基因产物相互作用以及如果一个基因被突变将会得到何种表型结果。突变体的表型分析已经是一种确定基因功能的有力方法。基因功能可以通过基因缺失、插入突变和RNA干扰(RNAi)而被改变。RNAi是用于降低基因表达的一项相对较新的进展。其源自植物和其他模型生物体内的基因静默的报道，并基于秀丽隐杆线虫(C.elegans)中观察到的将双链RNA(dsRNA)加入到细胞中经常会以序列特异性方式干扰基因功能的现象。在很多情况下，功能降低的水平不能被充分控制，不完全，特异性的水平不能完全预测，并且在一些生物体中，RNAi并没有作用(例如在酵母白色假丝酵母(Candida albicans)中)。

很明显功能基因组学已经改变了之前生物学的方式，但是就详尽地描述生物学系统内的复杂性(例如基因调节、蛋白质相互作用和形成细胞的生物化学反应的复杂网络)而言，这个领域仍处于其幼年期。很明显需要开发创新型的技术，特别是在功能蛋白质组学领域，以加快发现的速度并使功能基因组学中的互补方法提供的潜力最大化。期望拥有一种灵活的技术，能够直接靶向特定细胞外或细胞内蛋白质的生物学功能而不是靶向翻译其的mRNA或操作编码其的基因。

正常可溶的蛋白质转化为构象改变的不可溶蛋白质被认为是导致多种疾病的过程，例如阿尔茨海默病和淀粉样脑血管病中出现的淀粉状蛋白β肽、帕金森病中Lewy小体内沉积的α突触核蛋白、克雅病(Creutzfeldt-Jacobdisease)中的朊病毒、肌萎缩性侧索硬化症中的超氧化物歧化酶和额颞叶痴呆症(frontal temporal dementia)及皮克病(Pick’s dementia)中神经元纤维缠结中的tau。迄今为止，蛋白质聚集已经主要作为一种不需要的、导致疾病的现象研究，并且已经广泛接受交叉β(cross-beta)介导的聚集是发生频率最高的，并且是聚集的生物学相关机制²。术语“交叉β聚集(cross-betaaggregation)”用于指聚集通过形成分子间的β-折叠而成核(nucleated)，聚集体中的每一个分子贡献一条相同的链，所述链典型地包含至少三个相邻氨基酸。现在已经有大量数据显示单个链相互作用以形成分子间的β-折叠，并且这个结构形成聚集体的骨架^3，4。靶蛋白中的自缔合区(self-associationregion)可以通过开发出来以用于预测肽和蛋白质的聚集倾向的计算机程序例如TANGO⁶确定。本领域已经研究了一种特殊形式的聚集，即高度有序的淀粉状蛋白纤维(highly ordered amyloid fibre)⁵用于材料科学中的潜在用途。另外，WO03102187(Scegen，Pty Ltd)公开了一种用于通过将一种分子与一种膜转位序列融合而增强所述分子活性的方法，其中所得到的嵌合分子自我组装为更高分子量的聚集体。US20050026165(AretéAssociates)公开了能够与不可溶蛋白质例如朊病毒的β-折叠构象相互作用的构象肽作为用于朊病毒疾病的诊断工具的应用。

发明概述

本发明涉及一种用于特定靶蛋白的可控和可诱导的蛋白质聚集的技术。本发明还提供了从头设计的分子，本文中称为干扰子分子，所述分子包括至少一个聚集区(aggregation region)，所述聚集区衍生自靶蛋白。在一个优选的实施方案中，所述干扰子分子包含至少一个自缔合区，所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的一种成分融合。当选定的靶蛋白和特异性设计的干扰子分子接触时，在所述靶和所述干扰子之间发生特异性共聚集，导致所述靶蛋白的生物学功能的功能性敲除或下调(down-regulation)。这种蛋白质敲低(knock-down)条件性依赖于聚集体的存在，所述聚集体由干扰子分子的存在诱导。另外的一个优点是所述蛋白质干扰的强度可以通过改变干扰子分子内的聚集区的数目而通过实验控制。本发明不仅提供了一种下调特定细胞外或细胞内蛋白质的生物学功能的有效工具，还具有重要的治疗、农业和诊断应用。

附图说明

图1.使用4种不同干扰子构建体的重组表达的大肠杆菌中的蛋白质干扰，所述构建体靶向参与氨基酸生物合成的特定酶。每种干扰子分子的B部分由3个合成的自缔合序列组成，所述序列被2个氨基酸的接头和衍生自所述酶的一个特定自缔合区分开。所述自缔合区(合成的并且特异性的)偶联至作为阻止所述自缔合区聚集的成分的蛋白质NusA(即所述干扰子分子的A部分)。

图2.用空质粒、仅具有聚合子(aggregator)序列的质粒或具有聚合子-Ura3融合构建体的质粒转化具有URA3内源野生型拷贝的酿酒酵母(S.cerevisiae)。细胞在含有葡萄糖的培养基中生长过夜，漂洗，然后在含有葡萄糖(左)或半乳糖(右)的培养基上铺板。将5μl 10倍稀释物铺板(OD₆₀₀＝1作为最高浓度)。

图3.用空质粒和具有干扰子-Tup1融合构建体的质粒转化具有两个TUP1内源野生型拷贝的白色假丝酵母细胞。细胞在含有葡萄糖的培养基中生长过夜，漂洗，然后在含有葡萄糖(左)或酪蛋白氨基酸(右)的培养基上将20个菌落铺板。上方组是用空质粒转化的菌落，下方组是用具有干扰子构建体的质粒转化的菌落(“+aggreg.-TUP1”表示干扰子-TUP1构建体)。照片摄于生长4天后。

发明目的和发明详述

在本发明中，我们开发了一种通过使用用具有针对靶蛋白的特异性的干扰子分子下调蛋白质的生物学功能的方法。一旦与靶蛋白接触，在所述干扰子分子和所述靶之间便发生共聚集。所述聚集使所述靶从其可溶性环境中退出并导致所述靶蛋白的功能性敲低。

因此在一个实施方案中，本发明提供了一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与包含分离自所述蛋白质的至少一个自缔合区的非天然存在的分子接触。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与由分离自所述蛋白质的至少一个自缔合区组成的非天然存在的分子接触。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与包含分离自所述蛋白质的至少一个自缔合区的非天然存在的分子接触，其中所述自缔合结构域与阻止所述自缔合区聚集的成分融合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与由分离自所述蛋白质的至少一个自缔合区组成的非天然存在的分子接触，其中所述自缔合结构域与阻止所述自缔合区聚集的成分融合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与包含A部分和B部分的非天然存在的分子接触，其中i)A部分是阻止B部分聚集的肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，ii)B部分包含至少一个由至少3个相邻氨基酸组成的自缔合区，其中所述区域分离自所述功能将被下调的蛋白质，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与包含A部分和B部分的非天然存在的分子接触，其中i)A部分是阻止B部分聚集的肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，从而B部分与所述分子和所述蛋白质所在的溶剂直接接触，ii)B部分包含至少一个自缔合区，其中所述区域由至少3个相邻氨基酸组成，并且其中所述区域分离自所述功能将被下调的蛋白质，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头。

在另一个实施方案中，所述非天然存在的分子的B部分包含至少2个自缔合区，其中至少一个所述区域衍生自所述功能将被干扰的蛋白质。

术语“非天然存在的分子”是指这种干扰子分子是人造的。例如，当干扰子分子是多肽时(即A部分和B部分都是肽)，所述多肽通过将B部分从靶蛋白分离(即所述自缔合区)并将所述B部分偶联至A部分而设计，其中所述A部分可以衍生自(i)另一个蛋白质或(ii)同一靶蛋白，在(ii)的情况下所述A部分不与B部分直接相邻。换句话说，衍生自靶的自缔合区与阻止自缔合区聚集的成分(当所述干扰子是多肽所述成分也是多肽时)融合与A部分和B部分之间天然存在的融合之间存在至少一个天然氨基酸的区别。典型地，干扰子分子在由非重组基因组中的基因编码的蛋白质中不以相邻多肽的形式存在。

应当清楚的是干扰子分子可以通过引入重复及改变A和B部分的顺序而以模式化方式设计。以下组合的一个非限制性列表是：具有A-B-结构的干扰子、具有B-A-结构的干扰子、具有A-B-A-结构的干扰子、具有B-A-B-结构的干扰子、具有A’-B-A”结构的干扰子和具有B’-A-B”结构的干扰子，其中在A、A’、A”和B、B’、B”部分之间任选地存在接头(间隔区)。A、A’和A”是不同的相似成分(例如不同的肽序列)。B、B’和B”是不同的或相似的自缔合序列(例如B是衍生自靶蛋白的自缔合序列，B’是合成的自缔合序列)。

换句话说，本发明提供了一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与包含分离自所述蛋白质的至少一个自缔合区的分子接触，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合，从而所述自缔合区与所述分子和所述蛋白质所在的溶剂直接接触。如上所述，应当清楚所述“成分(moiety)”与术语“A部分”等价，“B部分”与术语“至少一个自缔合区”等价。

术语“下调蛋白质的功能”是指蛋白质的正常生物学活性被降低(被抑制、被下调、被降低和被破坏在这里是等价术语)或所述蛋白质被从其正常生物学环境中退出(例如正常存在于内质网中的蛋白质通过下调其功能而不再存在)。因此，通过应用本发明的方法，一种蛋白质的功能通过将所述蛋白质与本发明的非天然分子接触而引起所述蛋白质的聚集而被破坏。所述非天然分子在本文中称为“干扰子”或“干扰子分子”。“聚集(aggregation)”是指正常可溶的蛋白质通过直接接触干扰子或与干扰子结合而在其正常生物学环境中变为不可溶蛋白质或聚集的蛋白质。术语“下调蛋白质的功能”也可以用术语“敲低(knocking down)蛋白质的功能”或“负干扰(negativelyinterfering with)蛋白质的功能”代替。蛋白质功能的下调也可以指蛋白质在细胞中不再以可溶形式存在或蛋白质在其正常生物学环境中(例如(亚)-细胞或细胞外定位)不再以可溶形式存在。另外，其也可以指聚集的蛋白质通过细胞的天然清除机制被降解并且以可溶形式或不可溶形式都不再可以检测到。另外，其也可以指一种跨膜受体蛋白经过干扰子诱导的所述跨膜蛋白的聚集而不再能结合其正常的配体。因此蛋白质功能的下调也可以指正常位于例如线粒体的蛋白质通过蛋白质干扰的方法而不再位于那里。在一个特定实施方案中，术语“蛋白质功能的下调”或“蛋白质功能的负干扰”或“敲低蛋白质的功能”是与所述蛋白质的正常(100％)功能相比，功能丧失至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％或甚至100％。

在其正常生物学环境(定位)中蛋白质的功能或缺少蛋白质的存在可以通过本领域已知方法方便地确定。例如，根据感兴趣的靶蛋白，所述功能可以通过测定降低的酶活性确定。一种蛋白质在其正常生物学定位中存在减少可以例如通过缺少复合物的形成、缺少亚细胞结构(compartment)内靶蛋白的出现、靶蛋白以可溶形式存在、靶蛋白以聚集(此处不可溶是等价术语)形式存在测定。或者，靶蛋白的下调的效应可以在细胞检测中测定(例如丧失或获得生长、丧失或获得扩张、丧失或获得蛋白水解活性)。

在一个特定实施方案中，蛋白质的这种正常生物学活性(或正常功能或正常定位)可以被细胞内或细胞外干扰。“细胞内”是指蛋白质定位于生物体或宿主的细胞内部(例如细胞质、线粒体、溶酶体、液泡、细胞核、叶绿体、内质网(ER)、细胞膜、线粒体膜、叶绿体膜、......)。“细胞外”不仅指蛋白质定位于细胞的细胞外培养基中，还指与细胞外培养基接触的蛋白质，例如膜锚定蛋白、跨膜蛋白等等。细胞外蛋白的非限制性实例是分泌性蛋白(例如蛋白酶、抗体和血液或血浆中的细胞因子)或存在于细胞外基质中的蛋白质(例如基质金属蛋白和跨膜蛋白(例如生长因子受体))。

可以用本发明的方法靶定的细胞或宿主包括原核和真核细胞。非限制性实例是病毒、细菌、酵母、真菌、原生动物、植物和哺乳动物包括人。

应当清楚蛋白质生物学功能的下调方法可以用于同时干扰1、2、3、4、5或甚至更多蛋白质的生物学功能。特别是因为B部分包含至少一个自缔合区，所以B部分可以例如包含不同的自缔合区，每一个特异性针对一个不同蛋白质。用于干扰至少一个靶蛋白的生物学功能的干扰子在自然界中不是天然存在的，而可以通过化学合成或通过重组蛋白质表达或通过将其组合而制备。

因此一个干扰子分子包含至少一个自缔合区(因此B部分包含至少一个自缔合区)。一个“自缔合区”在本文中定义为一个相邻氨基酸序列，所述序列具有高度倾向与相同的或非常紧密相关的序列形成紧密的分子集合(assembly)。术语“具有高度倾向形成紧密的分子集合”也可以解释为“具有高亲和力”。亲和力通常以解离值(Kd值)表示。干扰子和靶蛋白之间的Kd值典型地位于微摩至纳摩范围内，但可以低于纳摩或高于微摩。自缔合区的实例是分子间β-折叠区、α-螺旋元件、发夹环(hairpin loop)、跨膜序列和信号序列。在一个特定实施方案中，B部分中存在至少一个自缔合区。在另一个特定实施方案中，B部分中存在至少两个自缔合区。在另一个特定实施方案中，B部分中存在3、4、5、6或更多个自缔合区。所述自缔合区可以通过接头区(例如大约2个至大约4个氨基酸的间隔区)互相连接。B部分中存在的一个(或至少一个)自缔合区衍生自一个靶蛋白。在一个特定实施方案中，B部分中的2、3、4、5、6或更多个自缔合区衍生自一个靶蛋白。在另一个特定实施方案中，B部分中的2、3、4、5、6或更多个自缔合区衍生自多于一个靶蛋白。在另一个特定实施方案中，B部分中的至少两个自缔合区衍生自同一个靶蛋白。靶蛋白在本文中是指人们要干扰其功能的蛋白。因此，为了使B部分特异性针对至少一个蛋白质，B部分中的至少一个自缔合区应当“衍生自”靶蛋白或至少一个自缔合区应当存在于所述靶蛋白中。“衍生自”是指至少一个相邻的自缔合区应当与所述靶蛋白的一个相邻区域在氨基酸序列方面相同或同源。在一个优选的实施方案中，所述至少一个自缔合区与所述靶蛋白区域中的自缔合区至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少100％相同。

优选地，自缔合区的长度由至少3个相邻氨基酸组成。在一个优选的实施方案中，所述区域由大约3个至大约30个氨基酸组成。在另一个优选的实施方案中，所述区域由大约3个至大约25个氨基酸组成。在一个特别优选的实施方案中，所述区域由大约5个至大约20个氨基酸组成。

干扰子分子的B部分中的自缔合区也可以确定并分离自靶蛋白之外的蛋白质，并且所述自缔合区与衍生自靶蛋白的至少一个自缔合区偶联，任选地在所述自缔合区之间有一个间隔区(或接头)。例如，可用的自缔合区可衍生自正常情况下不在用来进行靶蛋白的生物学功能下调的宿主中的蛋白质的自缔合区(从而B部分中的一些自缔合区可以得自不相关的生物体)。所述自缔合区的性质决定了通过诱导的聚集进行的靶蛋白抑制的水平(即抑制强度)。在一个干扰子分子内可以使用得自一个靶蛋白的多于一个的自缔合区，也可以将合成的自缔合区或衍生自不同的靶蛋白的自缔合区与得自一个靶蛋白的一或多个自缔合区组合使用。

在一个特定实施方案中，这些自缔合区由一个非衍生自已知蛋白质的合成序列组成，因此不是天然存在的。这种合成的自缔合区的实例在Lópezde la Paz M.et al(2002)PNAS 99，25，p.16053，表1中描述，通过参考并入本文。

如果至少一个自缔合区(即干扰子分子的B部分)具有输水性质(因为其诱导聚集的性质)，优选地将其与阻止所述自缔合区聚集的成分(即干扰子分子的A部分)融合(或连接或偶联，在这里是等价术语)并将所述自缔合区暴露，与干扰子所在的溶剂直接接触。这样，在特定实施方案中，A部分具有增溶功能以将B部分保持在溶液中。在这些实施方案中，所述A部分例如是肽、蛋白质结构域、蛋白质(优选与靶蛋白不同，参见实施例2)、糖基化结构、(亲水)化学基团或环糊精或其衍生物。在其他特定实施方案中，所述A部分是琼脂糖珠、乳胶珠、纤维素珠、磁性珠、硅胶珠、聚丙烯酰胺珠、微球体、玻璃珠或任何固体支持物(例如聚苯乙烯、塑料、硝酸纤维素膜、玻璃)。

在干扰子分子中，B部分和A部分可以任选地通过接头区(间隔区是等价术语)方式连接(或偶联)。所述接头区可以例如是通过化学合成制造的非天然的接头(例如柔软接头如羟基取代的烷烃链、葡聚糖、聚乙二醇或者所述接头还可以由氨基酸类似物组成)或所述接头可以存在天然氨基酸例如聚苏氨酸或聚丝氨酸。优选地当所述接头包含氨基酸时，所述接头区的长度在大约3个至大约15个氨基酸之间，更优选地在大约5个至大约10个氨基酸之间。通常可以选择柔软接头，但是预期硬接头也会起作用。柔软接头序列可以得自自然界，大多数情况下这些区域在天然存在的蛋白质中连接结构域，例如src酪氨酸激酶SH2和SH3结构域之间的接头或BRCA1的BRCT结构域之间的接头。

术语“接触”是指干扰子与靶蛋白相互作用的过程。在一种形式下，干扰子被加入到含有靶蛋白的样品中(例如干扰子在溶液中以特定浓度存在)。在另一种形式下，干扰子分子被注入含有靶蛋白的生物体内。接触也可以例如通过转化含有靶蛋白的细胞的过程实现，所述细胞例如分离的细胞、在细胞培养物中、单细胞微生物或多细胞生物体内部的一个或多个细胞。转化是指干扰子分子通过通常已知的转染或转化方法(例如通过基因转移技术包括磷酸钙、DEAE-葡聚糖、电穿孔、微注射、病毒方法、阳离子脂质体应用(参见例如Feigner，P.L.et al.(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci USA 84，7413)、可商购的阳离子脂配制物例如Tfx 50(Promega)或Lipofectamin2000(Life Technologies)、颗粒轰击等等)被导入宿主(例如细胞)内部。干扰子分子可由重组载体(例如质粒、黏端质粒、病毒载体)编码并可在宿主内合成。在另一个实施方案中，干扰子分子可通过载体介导的输送(例如通过脂质体载体或纳米颗粒或通过注射)被导入细胞内。在另一个替代实施方案中，干扰子分子可通过介导细胞穿入(或细胞转位)的序列进入细胞。在这种情况中，干扰子分子通过重组或合成附着细胞穿入序列被进一步修饰。因此，干扰子分子(例如多肽)可进一步与一种序列融合或化学偶联，所述序列促进所述融合或化学偶联的蛋白质转导入原核或真核细胞内。促进蛋白质转导的序列是本领域技术人员已知的，包括但不限于蛋白质转导结构域(ProteinTransduction Domains)。优选地，所述序列选自由HIV TAT蛋白、聚精氨酸序列、穿膜肽(penetratin)和pep-1组成的一组。其他一些常用的可穿入细胞的肽(天然的和人造的肽)公开于Joliot A.and Prochiantz A.(2004)Nature CellBiol.6(3)189-193。

在一个特定的实施方案中，干扰子基本上由氨基酸组成。在一些实施方案中，干扰子分子的A部分和B部分的序列衍生自相同的靶蛋白。在其他实施方案中，干扰子是嵌合分子，所述嵌合分子是指A部分和B部分的序列衍生自不同蛋白质，例如A部分衍生自一种蛋白质而B部分的至少一个聚集区衍生自靶蛋白。“多肽”是指一种多聚体，其中单体是氨基酸并且通过肽键连接到一起，也称为肽。当所述氨基酸是α-氨基酸时，可以使用L-光学异构体或D-光学异构体。另外，也包括非天然氨基酸，例如β-丙氨酸、苯基甘氨酸和高精氨酸。通常遇到的非基因编码的氨基酸也可用于本发明。用于干扰子的全部或部分氨基酸可以是D-或L-异构体。另外，其他模拟肽(peptidomimetics)也可用于本发明。我们在本文中特别参考并并入模拟肽作为蛋白-蛋白相互作用的拮抗物的开发和应用的综述(Sillerud LO andLarson RS(2005)Curr Protein Pept Sci.6(2)：151-69)。另外，也可以将D-氨基酸加入到肽序列中以稳定转角特征(特别是在甘氨酸的情况下)。在另一种方法中，α-、β-、γ-或δ-转角模拟物(例如α-、β-、γ-或δ-二肽)可用于模拟肽中的结构基序和转角特征并同时提供蛋白水解稳定性和增强其他性质例如构象稳定性和溶解性。

从靶蛋白中分离自缔合区

自缔合序列通常是疏水的，但这并不是全部情况。例如，酵母朊病毒的自缔合区是相当极性的。事实上，衍生自多肽或蛋白质的氨基酸区域的交叉β-聚集当(1)它具有高度疏水性，(2)它具有很好的β-折叠倾向，(3)它具有低净电荷和(4)它暴露于溶剂时即可起始。因此，自缔合蛋白质区域(“片段”是“区域”的一个等价术语)在折叠状态下通常被隐藏并且不暴露于溶剂。这被实验中发现的在许多球状蛋白中，聚集发生在重折叠期间或在显著倾向于变性或部分折叠状态的条件下(即在高浓度或作为去稳定条件或突变的结果)所确证。

基于这些发现，开发出了能够预测蛋白质中的自缔合区(“β-聚集序列或片段”是等价术语)的计算机程序。一种这样的算法，TANGO，是基于一种考虑上述三个物理化学参数并且考虑不同结构构象(β-转角、α-螺旋、β-折叠聚集体)和折叠状态之间的竞争的统计力学算法(Fernandez-Escamilla，AM etal(2004)Nat.Biotechnol.22，1302-1306，特别是第1305和1306页上的“Methods”部分通过参考特别并入本文，以及同一篇文献中关于所述方法的进一步的详细内容的“Supplementary Notes 1 and 2”和用于校正和测试TANGO算法的数据组)。因此，靶蛋白内的自缔合区可通过计算机程序例如TANGO获得。自缔合区经常隐藏在靶蛋白的核心内部¹⁰，通过相应于靶蛋白稳定性的能量障碍而将肽遮盖起来以避免分子间缔合¹¹。在其正常环境中(例如细胞质、细胞外基质)，靶蛋白得到帮助蛋白质保持其功能性的单体形式的分子伴侣的帮助¹²。TANGO算法使用的模型⁶被设计为预测肽和蛋白质中的β-聚集，并由包含无规卷曲和天然构象以及其他主要构象状态(即β-转角、α-螺旋和β-聚集体)的相空间(phase-space)组成。根据玻尔兹曼分布(Boltzmann distribution)，肽的每一个片段都可以拥有这些状态中的每一个。因此，为了预测肽的自缔合区，TANGO简单地计算相空间的配分函数(partition function)。为了估算特定氨基酸序列的聚集倾向，作出下述假设：(i)在一个有序β-折叠聚集体中，主要二级结构是β-链，(ii)参与聚集过程的区域被完全隐藏，因此付出全部溶剂化代价和收获、全部熵并使其H键势能最优化(即在聚集体中形成的H键数目与受体补偿的供体基团的数目相关。过量的供体或受体保持不饱和状态)，(iii)在所选择的窗口中的互补电荷建立有利静电相互作用，并且所述窗口内和窗口外的肽的整体净电荷不利于聚集。TANGO可以在国际互联网http://tango.embl.de/上得到。zyggregator算法是另一个实例(Pawar AP et al(2005)J.Mol.Biol.350，379-392)。这些算法通过将给定氨基酸序列的聚集倾向分值与从一组相似长度的序列中计算得到的平均倾向进行比较而识别易于聚集的序列。

在本发明中，我们估计在一个靶蛋白中鉴定为TANGO分值为5％的自缔合区相应于体外聚集可能性为95％⁶。我们已经计算出了与疾病不相关的得自人蛋白质组的蛋白质的85％具有至少一个TANGO分值高于实验确定的5％门槛的区域。这显示尽管超过85％的人类蛋白质含有至少一个单一自缔合区，但是由于蛋白质的正常稳定性和来自分子伴侣系统的帮助，聚集被阻止。本发明从靶蛋白中分离这些自缔合区用于制备用于特异性诱导蛋白质聚集的干扰子分子。干扰子分子的B部分包含至少1个聚集区并且至少一个聚集区衍生自靶蛋白。可以通过将多于一个的靶蛋白聚集区掺入干扰子分子的B部分而控制蛋白质干扰的强度(蛋白质干扰的强度例如是当靶蛋白或含有靶蛋白的细胞与一种特异性干扰子分子接触时所述蛋白质的生物学功能丧失的％)。事实上，衍生自靶蛋白的具有低TANGO分值(典型地在5％至20％之间)的聚集区可以在干扰子的B部分内重复至2、3、4或更多个聚集区。作为另一个实施方案，衍生自同一蛋白质的具有低TANGO分值的1、2、3或4或更多个聚集区可以掺入干扰子的B部分内。作为另一个实施方案，1、2、3、4或更多个合成聚集区(因此不是衍生自靶蛋白)可以与衍生自靶蛋白的1、2、3、4、或更多个聚集区组合至B部分内以增强具有低TANGO分值的的靶蛋白的下调。

因此在另一个实施方案中，本发明提供了一种能够聚集靶蛋白的非天然存在的分子。在一个特定实施方案中，所述非天然分子在性质上类似蛋白质(proteinaceous)。类似蛋白质是指所述分子含有L-氨基酸或D-氨基酸或混和有L-和D-氨基酸或含有天然氨基酸和拟肽的组合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的分子，所述分子包含分离自能够溶于水的蛋白质结构域的至少一个自缔合区，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的分子，所述分子包含分离自能够溶于水的蛋白质结构域的至少一个自缔合区，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合，从而所述自缔合区与其所在的溶剂直接接触。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的分子，所述分子由分离自能够溶于水的蛋白质结构域的至少一个自缔合区组成，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种非天然存在的分子，所述分子由分离自能够溶于水的蛋白质结构域的至少一个自缔合区组成，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合，从而所述自缔合区与其所在的溶剂直接接触。

在一个特定实施方案中，所述成分例如是肽、琼脂糖珠、蛋白质结构域或蛋白质。在另一个特定实施方案中，所述非天然存在的分子包含至少两个自缔合区，其中至少一个自缔合区衍生自靶蛋白。

换句话说，本发明提供了一种非天然存在的分子，其包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一个阻止B部分聚集的区域，例如肽、蛋白质结构域、蛋白质或琼脂糖珠，和ii)B部分包含至少一个自缔合区，其中所述区域由至少3个相邻氨基酸组成，并且其中所述区域分离自所述功能将被干扰的蛋白质，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头。

另外换句话说，本发明提供了一种非天然存在的分子，其包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一个阻止B部分聚集的区域，例如肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，和ii)B部分包含至少一个由至少3个相邻氨基酸组成的自缔合区，并且其中至少一个自缔合区分离自所述功能将被干扰的蛋白质，并且其中所述区域分离自来自能够溶于水的所述蛋白质的一个结构域，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头，并且其中B部分与所述分子和所述蛋白质所在的环境直接接触。

另外换句话说，本发明提供了一种非天然存在的分子，其包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一个阻止B部分聚集的区域，例如肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，和ii)B部分由至少一个由至少3个相邻氨基酸组成的自缔合区组成，并且其中所述至少一个自缔合区分离自所述功能将被干扰的蛋白质，并且其中所述区域衍生自来自能够溶于水的所述蛋白质的一个结构域，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头，并且其中B部分与所述分子和所述蛋白质所在的环境直接接触。

术语“分离自(或衍生自)来自能够溶于水的所述蛋白质的一个结构域”是指自缔合区是分离自蛋白质的一个可溶结构域的相邻氨基酸序列。也指衍生自跨膜区的自缔合区或衍生自信号序列的自缔合区被特别地排除在这些实施方案中的这些干扰子分子产物的权利要求范围内之外。

在本发明中，干扰子分子的至少一个自缔合区(即干扰子分子的B部分)与所述干扰子分子所在的环境(即溶剂、细胞质)“直接接触”。这一点的重要性将被进一步阐明。在球状蛋白质中，自缔合区(也称为“聚集成核区”)通常隐藏在所述球状蛋白质的疏水核内并从而通过稳定天然状态的协同相互作用的致密网络与溶剂隔离。因此，在正常环境下，在所述自缔合区和环境(例如溶剂)之间没有“直接接触”。只有当蛋白质去折叠时(例如当其在核糖体上合成时或通过突变、温度、pH改变或失去特异性分子伴侣而被去稳定从而有利于去折叠状态时)，它才会将其自缔合区暴露于环境。自缔合区通常隐藏在蛋白质内部(以阻止聚集)，在非天然干扰子分子中，所述自缔合区被分离并且通过将所述区域与阻止聚集的成分(即干扰子分子的A部分)连接而暴露于环境。另外换句话说，非天然的干扰子分子不会折叠为球形结构，因此非天然干扰子分子内的至少一个自缔合区(即B部分)与所述干扰子分子所在的溶剂直接接触。因此，“直接接触”是指与“隐藏的并且与......隔离”相反的意思。

在一个特定实施方案中，包含衍生自可溶蛋白质结构域的至少一个自缔合区的干扰子分子是多肽。

在另一个特定实施方案中，本发明提供了含有编码这些干扰子分子的多核苷酸的载体。

在另一个特定实施方案中，本发明的干扰子分子被用作药物。

干扰子分子的治疗应用

蛋白质负责从大量酶促反应、信号传导到提供结构范围内的生物活性。蛋白质结构、含量或活性的改变是许多疾病的根本原因。许多药物通过特异性干扰一个或有限几个蛋白质发挥作用。本发明提供了一种开发能够特异性干扰选定的靶蛋白的一类新的化合物的方法。这些新化合物命名为干扰子。

因此，在另一个实施方案中，本发明提供了非天然存在的分子作为药物的应用，所述分子包含衍生自能够溶于水的蛋白质结构域的至少一个自缔合区，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合。

在另一个实施方案中，本发明提供了非天然存在的分子作为药物的应用，所述分子包含衍生自能够溶于水的蛋白质结构域的至少一个自缔合区，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合，从而所述自缔合区与所述分子所在的溶剂直接接触。

另外换句话说，本发明提供了非天然存在的干扰子分子作为药物的应用，所述干扰子分子包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一个阻止B部分聚集的区域，例如肽或蛋白质结构域，和ii)B部分包含至少一个自缔合区，其中所述区域包含衍生自靶蛋白的至少3个相邻氨基酸，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头。

另外换句话说，本发明提供了非天然存在的干扰子分子作为药物的应用，所述干扰子分子包含A部分和B部分，其中i)A部分包含一个阻止B部分聚集的区域，例如肽或蛋白质结构域，和ii)B部分包含至少一个自缔合区，其中所述区域包含衍生自靶蛋白的至少3个相邻氨基酸，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头，并且其中B部分与所述干扰子分子所在的溶剂直接接触。

所述干扰子分子可用于治疗疾病和/或用于制造治疗与至少一个靶蛋白例如癌基因蛋白的异常表达相关的疾病例如癌症的药物，术语“异常表达”是指例如在癌症情况下癌基因蛋白的(过)表达，也包括显性失活(dominantnegative)蛋白的表达、特定蛋白质的不希望的定位或特定蛋白质的剪接变体(splice variant)、特定蛋白质的特定剪接变体的不希望的表达、突变蛋白的更高活性或特定蛋白质的更高活性。

在一个特定实施方案中，“异常表达”是指不需要地存在翻译后修饰的蛋白质或是指不希望地存在非翻译后修饰的蛋白质。翻译后修饰改变被修饰的氨基酸的物理化学性质，因此它们具有改变给定的能够用于特异性地靶定具有最强聚集倾向的形式的多肽片段的聚集倾向的潜力。因此，如果一种翻译后修饰显著降低自缔合区的聚集倾向，那么使用未修饰的蛋白质将会使干扰最有效。相反，在增加自缔合区的聚集倾向的翻译后修饰的情况下，使用修饰的蛋白质将会使干扰最有效。仅基于亲水性，推测例如磷酸化和糖基化修饰将会降低聚集倾向，而脂附着将会增加聚集倾向。

本发明的干扰子分子所针对的靶蛋白可以与病原性疾病相关。例如，蛋白质可以是病原体相关蛋白例如病毒蛋白、肿瘤相关蛋白、或自身免疫疾病相关蛋白。一方面，本发明描述了一种治疗处于不需要的细胞增殖的危险中或患有不需要的细胞增殖(例如恶性或非恶性细胞增殖)的对象的方法。所述方法包括：提供干扰子分子例如具有本文所描述的结构的干扰子，其中所述干扰子分子能够干扰(抑制)促进不需要的细胞增殖的蛋白质的功能和/或存在，并且将所述干扰子给予对象，优选人类对象，从而治疗所述对象。

在一个优选的实施方案中，所述蛋白质是生长因子或生长因子受体、激酶(例如蛋白质酪氨酸、丝氨酸或苏氨酸激酶)、衔接子(adaptor)蛋白、来自G蛋白偶联受体超家族的蛋白、或转录因子。在一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰PDGF-β蛋白的生物学功能，并因此可用于治疗具有特征为不需要的PDGF-β表达的病症(例如睾丸癌和肺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子抑制(敲低)Erb-B蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的Erb-B表达的病症(例如乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子抑制Src蛋白的功能(或等价地“干扰其功能”)(或干扰其存在)，并因此可用于治疗具有特征为不需要的Src表达的病症(例如结肠癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子抑制CRK蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的CRK表达的病症(例如结肠癌和肺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子干扰GRB2蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的GRB2表达的病症(例如鳞状细胞癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰RAS基因的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的RAS表达的病症(例如胰腺癌、结肠癌和肺癌、以及慢性白血病)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰MEEK蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的MEEK表达的病症(例如鳞状细胞癌、黑素瘤或慢性白血病)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰JNK蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的JNK表达的病症(例如胰腺癌或乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰RAF蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的RAP表达的病症(例如肺癌或白血病)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰Erk1/2蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的Erk1/2表达的病症(例如肺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰PCNA(p21)蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的PCNA表达的病症(例如肺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰MYB蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的MYB表达的病症(例如结肠癌或慢性骨髓性白血病)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰c-MYC蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的c-MYC表达的病症(例如伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)或成神经细胞瘤)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰JUN蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的JUN表达的病症(例如卵巢癌、前列腺癌或乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰FOS蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的FOS表达的病症(例如皮肤癌或前列腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子抑制BCL-2蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的BCL-2表达的病症(例如肺癌或前列腺癌或非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin lymphoma))或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰细胞周期蛋白D的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的细胞周期蛋白D表达的病症(例如食道癌和结肠癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰VEGF蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的VEGF表达的病症(例如食道癌、结肠癌或病理性血管发生)或处于此病症危险中的对象。在一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰EGFR蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的EGFR表达的病症(例如乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰细胞周期蛋白A的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的细胞周期蛋白A表达的病症(例如肺癌和宫颈癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰细胞周期蛋白E的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的细胞周期蛋白E表达的病症(例如肺癌和乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰WNT-1蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的WNT-1表达的病症(例如基底细胞癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰β-联蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的β-联蛋白表达的病症(例如腺癌或肝细胞癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰c-MET蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的c-MET表达的病症(例如肝细胞癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰蛋白激酶C(PKC)的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的PKC表达的病症(例如乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰NFκ-B蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的NFκ-B表达的病症(例如乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。

在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰STAT3蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的STAT3表达的病症(例如前列腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰存活蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的存活蛋白表达的病症(例如宫颈癌或胰腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰Her2/Neu蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的Her2/Neu表达的病症(例如乳腺癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰拓扑异构酶I的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的拓扑异构酶I表达的病症(例如卵巢癌和结肠癌)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰拓扑异构酶IIα的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的拓扑异构酶II表达的病症(例如乳腺癌和结肠癌)或处于此病症危险中的对象。

另一方面，本发明提供了一种治疗处于疾病或病症的危险中或患有疾病或病症的对象例如人的方法，所述疾病或病症可受益于血管发生抑制，例如癌症。所述方法包括：提供干扰子分子例如具有本文所描述的结构的干扰子分子，其中所述干扰子分子能够抑制介导血管发生的蛋白质(或干扰其功能)，并且将所述干扰子分子给予对象，从而治疗所述对象。在一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰αv-整联蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的αv-整联蛋白表达的病症(例如脑肿瘤或源自上皮的肿瘤)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰Flt-1受体蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的Flt-1受体表达的病症(例如癌症和类风湿性关节炎)或处于此病症危险中的对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰微管蛋白的功能和/或存在，并因此可用于治疗具有特征为不需要的微管蛋白表达的病症(例如癌症和视网膜新血管形成)或处于此病症危险中的对象。

另一方面，本发明提供了一种治疗被病毒感染或处于与病毒感染相关的疾病或病症的危险中或患有与病毒感染相关的疾病或病症的对象的方法。所述方法包括：提供干扰子分子例如具有本文所描述的结构的干扰子分子，其中所述干扰子分子与一种病毒蛋白或介导病毒功能(例如侵入或生长)的细胞蛋白同源或可以使其静默，并且将所述干扰子分子给予对象，优选人类对象，从而治疗所述对象。同样本发明提供了将干扰子用于制造药物以治疗被病毒感染的患者的方法，所述病毒包括人乳头瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV)、乙型肝炎病毒(HBV)、甲型肝炎病毒(HAV)、丙型肝炎病毒(HCV)、呼吸道合胞病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、巨细胞病毒(CMV)、EB病毒(EBV)、鼻病毒、西尼罗病毒、蜱传脑炎病毒、麻疹病毒(MV)、或脊髓灰质炎病毒。

另一方面，本发明描述了治疗被病原体感染的对象的方法，所述病原体例如细菌性、阿米巴性、寄生虫性、或真菌性病原体。所述方法包括：提供干扰子分子，例如具有本文所描述的结构的干扰子分子，其中所述干扰子分子能够干扰衍生自所述病原体的病原体蛋白的功能，并且将所述干扰子分子给予对象，优选人类对象，从而治疗所述对象。来自病原体的靶蛋白可以是参与生长、细胞壁合成、蛋白质合成、转录、能量代谢(例如三羧酸循环)或毒素生产的蛋白。因此，本发明提供了用于治疗被例如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)、溃疡分枝杆菌(Mycobacterium ulcerans)、结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacteriumleprae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)、化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)、肺炎衣原体(Chlamydiapneumoniae)、或肺炎支原体(Mycoplasma pneumoniae)感染的患者的方法。

另一方面，本发明提供了一种治疗处于疾病或病症的危险中或患有疾病或病症的对象例如人的方法，所述疾病或病症的特征在于不需要的免疫应答，例如炎性疾病或病症，或者自身免疫疾病或病症。所述方法包括：提供干扰子分子例如具有本文所描述的结构的干扰子分子，其中所述干扰子分子能够抑制(下调)介导不需要的免疫应答的蛋白质的功能和/或存在，并且将所述干扰子分子给予对象，从而治疗所述对象。在一个优选的实施方案中，所述疾病或病症是缺血或再灌注损伤，例如与急性心肌梗塞、不稳定性绞痛、体外循环、手术干预(例如血管成形术如经皮冠状动脉腔内成形术)、对移植的器官和组织(例如移植的心脏或血管组织)的应答、或血栓溶解相关的缺血再灌注或损伤。在另一个优选的实施方案中，所述疾病或病症是再狭窄，例如与手术干预(例如血管成形术如经皮冠状动脉腔内成形术)相关的再狭窄。在另一个优选的实施方案中，所述疾病或病症是炎性肠病例如克罗恩病(Crohn’s Disease)或溃疡性结肠炎。在另一个优选的实施方案中，所述疾病或病症是与感染或损伤相关的炎症。在另一个优选的实施方案中，所述疾病或病症是哮喘、狼疮、多发性硬化、糖尿病例如II型糖尿病、关节炎例如类风湿性或银屑病关节炎。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰整联蛋白或其共配体例如VLA4、VCAM、ICAM的功能。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰选择蛋白或其共配体例如P-选择蛋白、E-选择蛋白(ELAM)、L-选择蛋白、或P-选择蛋白糖蛋白-(PSGL1)的功能。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰补体系统的成分例如C3、C5、C3aR、C5aR、C3转变酶、C5转变酶的功能。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰趋化因子或其受体例如TNF-α、IL-1α、IL-1、IL-2、IL-2R、IL-4、IL-4R、IL-5、IL-6、IL-8、TNFRI、TNFRII、IgE、SCYA11或CCR3的功能。

另一方面，本发明提供了一种治疗处于急性疼痛或慢性疼痛的危险中或患有急性疼痛或慢性疼痛的对象例如人的方法。所述方法包括提供干扰子分子，例如具有本文所描述的结构的干扰子分子，其中所述干扰子分子能够干扰介导疼痛发展的蛋白质，并且将所述干扰子分子给予对象，从而治疗所述对象。在另一个优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰离子通道的成分的功能。在另一个特别优选的实施方案中，所述干扰子分子干扰神经递质受体或配体的功能。

另一方面，本发明描述了一种治疗处于神经疾病或病症的危险中或患有神经疾病或病症的对象例如人的方法。所述方法包括提供干扰子分子，例如具有本文所描述的结构的干扰子分子，其中所述干扰子分子能够干扰介导神经疾病或病症的蛋白质，并且将所述干扰子分子给予对象，从而治疗所述对象。在一个特定实施方案中，所述可被治疗的疾病(或病症)包括阿尔茨海默病(在这种情况下所述干扰子分子干扰导致APP加工的分泌酶(例如参与γ-分泌酶复合物的蛋白质(例如早老蛋白1或2、Aph1蛋白、呆蛋白、BACE1或BACE2))的功能。所述干扰子抑制APP加工并阻止不可溶的淀粉状蛋白β的形成。同样的策略可以用于阻止和/或治疗其他神经退行性疾病例如亨廷顿病(Huntington′s disease)、脊髓小脑萎缩症(例如SCA1、SCA2、SCA3(Machado-Joseph病)、SCA7或SCA8)。

因此，一方面，本发明提供了用于生产或制造药物或药物组合物的方法，所述药物或药物组合物包含至少一个干扰子分子并进一步将所述干扰子分子与药物可接受的载体混和。在一个优选的实施方案中，所述干扰子分子是多肽，并可以合成制备或作为重组蛋白质制备。所述重组蛋白质可以使用重组表达系统包括细菌细胞、酵母细胞、动物细胞、昆虫细胞、植物细胞或转基因动物或植物制造。所述重组蛋白质可以通过任何常规蛋白质纯化方法纯化至接近均一和/或与添加剂混和。

给予含有干扰子分子的药物组合物可以通过口服、吸入、透皮或非胃肠道方式(包括静脉内、肿瘤内、腹膜内、肌内、腔内、和皮下)给予进行。活性化合物可以单独给予或优选地配制为药物组合物。一单位剂量通常含有0.01至500mg，例如0.01至50mg、或0.01至10mg、或0.05至2mg化合物或其药物学可接受的盐。单位剂量通常每天一次或多于一次给予，例如每天2、3、或4次，更常见地每天1至3次，因此总每日剂量通常在0.0001至10mg/kg范围内；因此用于70kg体重的成年人的合适的总每日剂量是0.01至700mg，例如0.01至100mg、或0.01至10mg或更常见地0.05至10mg。

优选地所述化合物或其药物学可接受的盐以单位剂量组合物的形式给予，例如单位剂量口服、非胃肠道、透皮或吸入组合物。这些组合物通过混和制备，并适于口服、吸入、透皮或非胃肠道给予，并因此可以是片剂、胶囊、口服液体制备物、粉末、颗粒剂、锭剂、可复水的粉末、可注射和可灌注的溶液或混悬剂或栓剂或气雾剂形式。

用于口服给药的片剂和胶囊通常以单位剂量存在，并含有常规赋形剂例如粘合剂、填充剂、稀释剂、成片剂(tabletting agent)、润滑剂、崩解剂、着色剂、矫味剂、和润湿剂。片剂可以根据本领域已知的方法加上包衣。合适的填充剂包括纤维素、甘露醇、乳糖及其他相似物质。合适的崩解剂包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮和淀粉衍生物例如羧甲基淀粉钠。合适的润滑剂包括例如硬脂酸镁。合适的药物学可接受的润湿剂包括十二烷基硫酸钠。这些固体口服组合物可通过混和、填充、压片或类似的常规方法制备。重复混和操作可用于将活性剂遍布那些使用大量填充剂的组合物中。当然，这些操作是本领域常规的。

口服液体制备物可以是例如水溶液或油状混悬液、溶液、乳液、糖浆、或酏剂的形式，或可以是用于在使用之前用水或其他合适的载体复水的干燥产物。这些液体制备物可以含有常规添加剂例如混悬剂如山梨醇、糖浆、甲基纤维素、明胶、羟乙基纤维素、羧甲基纤维素、硬脂酸铝凝胶或氢化食用脂肪，乳化剂如卵磷脂、失水山梨醇单油酸酯、或阿拉伯树胶；非水性载体(可包括食用油)如杏仁油、分馏的椰子油、油酯如甘油酯、丙二醇、或乙醇；防腐剂如甲基或丙基对羟基苯甲酸或山梨酸，以及如果希望，常规矫味剂或着色剂。口服配制物也包括常规缓释配制物，如具有肠溶包衣的片剂或颗粒剂。

优选地，用于吸入的组合物以吸入剂(snuff)或气雾剂或用于喷雾器的溶液或用于吹入的微细粉末的形式对呼吸道单独给药或与惰性载体例如乳糖组合给药。在这种情况下，活性化合物的颗粒适当地直径小于50微米，优选地小于10微米，例如在1至5微米之间如在2至5微米之间。或者，可以使用有包衣的纳米颗粒，颗粒大小在30至500nm之间。有利的吸入剂量在0.05至2mg之间，例如0.05至0.5mg、0.1至1mg或0.5至2mg。

对于非胃肠道给药，液体单位剂型制备为含有本发明的化合物和无菌载体。根据载体和浓度，活性化合物可以是混悬的或溶解的。非胃肠道溶液通常通过将所述化合物溶解于载体中制备，并在注入合适的小瓶或安瓿并封口之前过滤除菌。有利地，佐剂如局部麻醉剂、防腐剂和缓冲剂也溶解在所述载体中。为了增加稳定性，所述组合物可以在注入小瓶后冷冻并在真空下除去水。非胃肠道混悬剂基本上以相同的方式制备，不同之处是所述化合物混悬在载体中而不是被溶解，并且在混悬于无菌载体之前通过暴露于环氧乙烷除菌。有利地，所述组合物包含表面活性剂或润湿剂以促进活性化合物的均一分布。当合适时，可以包含小量的支气管扩张剂例如拟交感胺类如异丙肾上腺素、异丁子香酚(isoetharine)、沙丁胺醇、去氧肾上腺素和麻黄素，也可以包含黄嘌呤衍生物如茶碱和氨茶碱，以及糖皮质激素如强的松龙和肾上腺兴奋剂如ACTH。

作为通常实践，所述组合物通常会带有用于药物治疗相关方面的手写的或印刷的指导。

在一个优选的实施方案中，干扰子分子进一步包含一个蛋白质转导(transduction)结构域。已经显示称为蛋白质转导结构域(PTD)的一系列小蛋白结构域有效地并且不依赖转运蛋白或特异性受体而穿越生物膜，并且促进肽和蛋白质输送进入细胞。例如人免疫缺陷病毒(HIV-1)的TAT蛋白能够在体内输送生物活性蛋白。相似地，触角足同源结构域的第三个α-螺旋和单纯疱疹病毒的VP22蛋白促进共价连接的肽或蛋白质输送进入细胞(综述Ford KG et al(2001)Gene Ther.8，1-4)。基于短两性肽载体Pep-1的蛋白质输送对于各种肽和蛋白质以完全生物活性形式输送进入几个细胞系是有效的，而不需要之前的化学共价偶联(Morris MC et al，(2001)Nat.Biotechnol.19，1173-1176)。VP22嵌合蛋白从初级转导的细胞扩散至周围细胞的能力可以促进基因治疗方法(Zender L et al(2002)Cancer Gene Ther.9，489-496)。本领域技术人员已知促进蛋白质转导的序列，包括但不限于蛋白质转导结构域。优选地，所述序列选自包括HIV TAT蛋白、聚精氨酸序列、穿膜肽和pep-1的一组。其他经常使用的可穿透细胞的肽(天然的和人造肽)公开于Joliot A.and Prochiantz A.(2004)Nature Cell Biol.6(3)189-193。

药物组合物的另一方面是应用编码干扰子分子的核苷酸序列。在使用编码干扰子分子的核酸序列的情况下，所述药物优选地倾向于在基因疗法治疗中将所述核酸输送进入细胞。本领域技术人员已知大量的输送方法。优选地，给予核酸以用于体内或回体(ex vivo)基因治疗用途。非病毒载体输送系统包括DNA质粒、裸核酸、和与输送载体如脂质体复合的核酸。病毒载体输送系统包括DNA和RNA病毒，所述病毒在输送至细胞之后具有游离的或整合的基因组。核酸的非病毒输送方法包括脂转染、微注射、生物射弹、病毒体、脂质体、免疫脂质体、聚阳离子或脂：核酸缀合物、裸DNA、人工病毒颗粒、和活性物质(agent)增强的DNA摄取。脂转染描述于例如US Pat.No.5,049,386、US Pat No.4,946,787和US Pat.No.4,897,355，脂转染试剂已有商业出售(例如Transfectam^TM和Lipofectin^TM)。适于多核苷酸的有效的受体识别的脂转染的阳离子和中性脂类包括Flegner，WO 91/17424，WO 91/16024所述的那些。输送可以至细胞(回体给予)或靶组织(体内给予)。脂：核酸复合物包括靶定的脂质体如免疫脂复合物的制备是本领域技术人员已知的(参见例如Crystal，1995；Blaese et al.，1995；Behr，1994；Remy et al.，1994；Gao and Huang，1995；U.S.Pat.Nos.4,186,183，4,217,344，4,235,871，4,261,975，4,485,054，4,501,728，4,774,085，4,837,028，和4,946,787)。

使用基于RNA或DNA病毒的系统以输送核酸利用了已有高度进展的方法以将病毒靶向体内特定细胞并将病毒有效载荷运输至细胞核。病毒载体可以直接给予患者(体内)或者可以用于在体外处理细胞，然后被修饰的细胞被给予患者(回体)。用于输送核酸的常规的基于病毒的系统包括但不限于用于基因转移的反转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺伴随病毒和单纯疱疹病毒载体。病毒载体是现有最有效的和最通用的在靶细胞和组织内基因转移的方法。使用反转录病毒、慢病毒和腺伴随病毒基因转移方法使整合进宿主基因组成为可能，经常导致被插入的转基因的长期表达。另外，已经在很多不同细胞类型和靶组织中观察到了高转导效率。在优选核酸短暂表达的情况下，可以使用基于腺病毒的系统，包括复制缺陷的腺病毒载体。基于腺病毒的载体在许多细胞类型中具有非常高的转导效率并且不需要细胞分裂。使用这些载体，已经获得了高滴度和水平的表达。这种载体可以在相对简单的系统中大量生产。腺伴随病毒(“AAV”)载体，包括重组腺伴随病毒载体，也用于用靶核酸转导细胞，例如在核酸和肽的体外生产中，以及用于体内和回体基因治疗方法(参见例如U.S.Patent No.4,797,368；WO93/24641；Kotin，1994；重组AAV载体的构建描述于许多文献，包括U.S.Pat.No.5,173,414；Hermonat & Muzyczka，1984；Samulski et al，1989)。

基因治疗载体可以通过给予各个患者而体内输送，典型地通过全身给予(例如静脉内、腹膜内、肌内、气管内、皮下、或颅内灌注)或局部给予进行。在特定实施方案中，本发明还预想了使用水动力基因治疗方法。水动力基因治疗公开于US6627616(Mirus Corporation，Madison)，并包括血管内输送编码干扰子的非病毒核酸，从而血管通透性通过例如使用在所述血管内部增加的压力或通过共给予增加血管通透性的化合物例如罂粟碱而提高。

或者，可以将载体回体输送至细胞，例如外植自个体患者的细胞(例如淋巴细胞、骨髓象、组织切片)或全能供体造血干细胞，之后将所述细胞重移植进患者体内，通常在选择已整合所述载体的细胞之后进行。本领域技术人员熟知用于诊断、研究、或用于基因治疗的回体细胞转染(例如通过将转染的细胞再注入宿主生物体)。在一个优选的实施方案中，细胞从目标生物体中分离，用核酸(基因或cDNA)转染，并再注入回所述目标生物体(例如患者)内。本领域技术人员熟知适于回体转染的各种细胞类型(参见例如Freshney et al.，1994以及本文引用的用于讨论如何分离并培养来自患者的细胞的参考文献)。

在另一个实施方案中，本发明的蛋白质干扰的方法可用于确定能够介导蛋白质干扰的细胞或生物体内的蛋白质的功能。所述细胞可以是原核细胞或可以是真核细胞或可以是细胞系例如植物细胞或动物细胞如哺乳动物细胞例如胚胎细胞、多能干细胞、肿瘤细胞例如畸胎癌细胞或病毒感染的细胞。所述生物体优选真核生物体，例如植物或动物如哺乳动物，特别是人。

本发明的干扰子分子所针对的靶蛋白可以与一种病原性疾病相关。例如，所述蛋白可以是病原体相关蛋白，例如病毒蛋白、肿瘤相关蛋白或自身免疫疾病相关蛋白。靶蛋白也可以是在重组细胞或遗传学被改变的生物体内表达的异源基因。通过抑制这种蛋白的功能，可以获得在农业领域或在药物或兽药领域中有价值的信息和治疗利益。在一个特别优选的实施方案中，本发明的方法被用于具有靶蛋白特异性敲除表型的真核细胞或真核非人生物体，所述表型包括至少一种内源靶蛋白的至少部分缺陷表达，其中所述细胞或生物体与至少一种能够抑制至少一种内源靶蛋白的功能的干扰子分子接触，或与编码至少一种能够干扰至少一种内源蛋白质的功能和/或存在的干扰子分子的载体接触。应当指出本发明也允许由于干扰子分子的特异性导致的几种不同内源蛋白质的靶特异性敲除。

细胞或非人生物体，特别是人细胞或非人哺乳动物的蛋白质特异性敲除可用于分析方法，例如用于复杂生理过程的功能和/或表型分析，例如蛋白质组分析。例如人们可以在培养的细胞中制备推测为可变剪接过程的调节蛋白的人蛋白的敲除表型。在这些蛋白质中特别是SR剪接因子家族成员，例如ASF/SF2、SC35、SRp20、SRp40或SRp55。进一步地，可以分析SR蛋白质对预先确定为可变剪接基因例如CD44的mRNA分布(profile)的影响。

使用本文描述的基于蛋白质的敲除技术，可以在靶细胞或靶组织内抑制内源靶蛋白的表达。内源蛋白可以被编码靶蛋白或所述靶蛋白的变体或突变形式的外源靶核苷酸例如基因或cDNA互补，所述靶核苷酸可以任选地与编码可检测的肽或多肽例如亲和标签，特别是多亲和标签的另外的核酸序列融合。所述靶蛋白的变体或突变形式与内源靶蛋白的不同之处在于它们由于单一或多个氨基酸的氨基酸取代、插入和/或缺失而与所述内源蛋白不同。所述变体或突变形式可具有与内源靶蛋白相同的生物学活性。另一方面，所述变体或突变的靶蛋白也可具有与所述内源靶蛋白的生物学活性不同的生物学活性，例如部分缺失的活性、完全缺失的活性、提高的活性等等。互补可通过在靶细胞内共表达由外源核酸编码的多肽和用于敲除内源蛋白的干扰子分子实现，所述多肽例如包含靶蛋白和亲和标签的融合蛋白。这种共表达可通过使用表达由外源核酸编码的多肽和干扰子分子的合适的表达载体实现，所述多肽例如标签修饰的靶蛋白，或通过使用表达载体的组合实现，或者干扰子分子可从细胞外接触靶细胞。在靶细胞内从头合成的蛋白质和蛋白质复合物包含外源蛋白例如被修饰的融合蛋白。为了避免干扰子分子抑制外源蛋白的功能，外源蛋白在选择为用于设计干扰子分子的聚集区必须具有足够的氨基酸区别。或者，内源靶蛋白可以由来自其他物种的相应蛋白互补，或者内源靶蛋白可以由所述靶蛋白的一种剪接形式互补。与使用敲除的细胞相比，敲除一种内源蛋白并用突变的(例如部分缺失的)外源靶拯救的组合具有优势。另外，这种方法特别适于识别靶蛋白的功能结构域。

在另外一个优选的实施方案中，进行例如至少两种细胞或生物体的基因表达分布(profile)和/或蛋白质组和/或表型特征的比较。这些生物体选自：(i)不具有靶蛋白抑制的对照细胞或对照生物体，(ii)具有靶蛋白抑制的细胞或生物体，(iii)具有靶蛋白抑制并且具有由编码所述靶蛋白的外源靶核酸进行的靶蛋白互补的细胞或生物体。

本发明的方法也适于用于鉴定药用物质和/或描述药用物质的性质的方法，例如从测试物质的集合中鉴定新的药用物质和/或描述已知药用物质的作用机理和/或副作用的性质。因此，本发明还涉及用于鉴定作用于至少一种靶蛋白的药用物质和/或描述其性质的系统，包括：(a)能够表达至少一种编码所述靶蛋白的内源靶基因的的真核细胞或真核非人生物体，(b)至少一种能够抑制所述至少一种内源靶基因的表达的干扰子分子，和(c)一种测试物质或测试物质的集合，其中所述测试物质或所述集合的药学性质有待鉴定和/或其性质有待描述。另外，上述系统优选地包括：(d)至少一种编码靶蛋白或靶蛋白的变体或突变形式或剪接形式的外源靶核酸，其中所述外源靶蛋白与内源靶蛋白在聚集区的氨基酸水平上不同，从而所述外源靶蛋白的功能与内源蛋白的表达相比被干扰子分子基本上较少地抑制。

另外，本发明还包括含有干扰子分子的细胞和生物体。生物体可以是例如携带编码干扰子的遗传信息的转基因植物。这种转基因植物在一个优选的实施方案中是被静默的植物(即其中特定靶蛋白由于特异性干扰子存在于所述植物的细胞或器官的亚集合中或存在于全部细胞和器官中而被下调)。含有干扰子的细胞可以通过将所述细胞与特定干扰子分子接触或将所述细胞用特定干扰子分子电穿孔而产生。在一个特定实施方案中，含有干扰子的细胞通过转染(或转化)产生，其中所述干扰子由重组表达载体例如质粒或病毒载体编码。

分离：分离及检测

在另一个实施方案中，本发明提供了一种从样品中分离蛋白质的方法，包括将所述样品与包含所述蛋白质中的至少一个自缔合区的非天然存在的分子接触，并从所述样品中分离得到共聚集的分子-蛋白质复合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种从样品中分离蛋白质的方法，包括将所述样品与包含从所述蛋白质中分离的至少一个自缔合区的非天然存在的分子接触，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合，并从所述样品中分离得到共聚集的分子-蛋白质复合物。

在另一个实施方案中，本发明提供了一种从样品中分离蛋白质的方法，包括将所述样品与包含从所述蛋白质中分离的至少一个自缔合区的非天然存在的分子接触，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合，从而所述自缔合区与所述与所述成分融合的自缔合区和所述蛋白质所在的溶剂直接接触，并从所述样品中分离得到共聚集的分子-蛋白质复合物。

换句话说，本发明提供了一种用于从样品中分离蛋白质的方法，包括：

-将所述蛋白质与包含A部分和B部分的非天然存在的分子接触，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，和ii)B部分包含至少一个自缔合区，其中所述区域由至少3个相邻氨基酸组成，并且其中所述区域分离自所述蛋白质，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头，以及

-从所述样品中分离得到共聚集的分子-蛋白质复合物。

另外换句话说，本发明提供了一种用于从样品中分离蛋白质的方法，包括：

-将所述蛋白质与包含A部分和B部分的非天然存在的分子接触，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，和ii)B部分包含至少一个自缔合区，其中所述区域由至少3个相邻氨基酸组成，并且其中所述区域分离自所述蛋白质，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头，并且其中B部分与所述分子和蛋白质所在的环境直接接触，以及

-从所述样品中分离得到共聚集的分子-蛋白质复合物。

另外换句话说，本发明提供了一种用于从样品中分离蛋白质的方法，包括：

-将所述蛋白质与包含A部分和B部分的非天然存在的分子接触，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，和ii)B部分由至少一个自缔合区组成，其中所述区域由至少3个相邻氨基酸组成并且其中所述区域分离自所述蛋白质，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头，并且其中B部分与所述分子和蛋白质所在的环境直接接触，以及

-从所述样品中分离得到共聚集的分子-蛋白质复合物。

另外换句话说，本发明提供了一种用于从样品中分离蛋白质的方法，包括：

-将所述蛋白质与包含A部分和B部分的非天然存在的分子接触，其中i)A部分包含阻止B部分聚集的肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠，和ii)B部分由至少一个自缔合区组成，其中所述区域由至少3个相邻氨基酸组成并且其中所述区域分离自所述蛋白质，并且其中A部分和B部分之间任选地存在一个接头，以及

-从所述样品中分离得到共聚集的分子-蛋白质复合物。

分离

在进一步的实施方案中，用于分离至少一种蛋白质的方法进一步包括从样品中分离至少一种蛋白质。

从样品中分离至少一种蛋白质的一个应用是从样品中除去(或除尽)高度冗余的蛋白质。事实上，蛋白质靶的发现和确认的一个主要挑战是如何特异性地分解复杂的蛋白质样品(例如血浆、尿液、脑脊液)并测定痕量靶。冗余蛋白质经常比小量蛋白质浓度高6-10个数量级。因此，必须除去高度冗余的蛋白质以检测并测定有药学重要性的痕量蛋白质。由于清蛋白、IgG、抗胰蛋白酶、IgA、转铁蛋白和触珠蛋白组成了人血清中全部蛋白含量的大约90％，因此急需诊断工具以迅速除尽这些不需要的冗余蛋白质并显露出较少量的低分子量蛋白质生物标记物。本领域已经使用了几种方法：1)免疫球蛋白G(IgG)作为亲和试剂以捕获并分离冗余蛋白靶，2)卵黄免疫球蛋白(IgY)是分离自免疫的鸟类卵黄的类IgG抗体，3)预分级分离被用于将蛋白质混和物分离为不同的级分以除去原始混和物中的特定蛋白质，和4)A蛋白和G蛋白是细菌细胞壁蛋白，具有针对IgG抗体的特异性，因此A蛋白和G蛋白亲和树脂可除去IgG，和5)IgG-和IgY-微珠用于蛋白质检测。

检测

在另一个特定实施方案中，用于分离至少一种蛋白质的方法进一步包括在所述分子-蛋白质复合物中检测至少一种蛋白质。

检测可以通过分离干扰子分子-靶蛋白复合物进行，所述分离通过例如电泳、柱层析、过滤、静电吸引、磁性或顺磁吸引、质谱等等实现。

最广泛应用的生物检测技术基于抗体的应用。抗体基于形状和物理化学性质识别并结合其他分子。抗体高度适于在蛋白质的复杂混和物中检测小量靶蛋白。本发明显示使用干扰子分子(B部分具有针对至少一个特定蛋白质的特异性和识别性)可以替代使用抗体(作为识别元件)以于靶蛋白的特异性捕获。事实上，干扰子分子可用于典型地使用抗体的大量实际应用中。仅指出其中一些：可预见应用于诊断、微量分析、法医学及病原体的特异性检测中。

对于本发明的检测及分离应用，优选干扰子分子的B部分与本文中称为A部分的载体结合。载体可以是平坦表面例如塑料或硝酸纤维素或色谱柱，但是优选珠例如微球珠。针对作为干扰子分子的A部分的各种类型的珠和微球体的普遍讨论描述于US6682940的第9页和第10页，并且通过参考特别并入本文。

在一个特定实施方案中，干扰子分子的A部分是碳水化合物类型的载体，例如硝酸纤维素或琼脂糖。B部分可以用交联剂如戊二醛共价结合至所述碳水化合物载体。

在另一个特定实施方案中，A部分是支持物例如纤维素、玻璃或合成多聚体。A部分和B部分之间的共价附着可通过B部分的氨基酸残基和A部分上的叠氮化物、碳二亚胺、异氰酸盐或其他化学衍生物实现。

在另一个特定实施方案中，A部分是多孔硅烷化玻璃微珠。B部分可通过其肽氨基(通过Schiff反应后用硼氢化钠还原)至通过化学连接至硅原子的环氧基丙基硅烷(glycidoxypropylsilane)基团的高碘酸盐氧化形成的醛基而共价键合至A部分(这种偶联描述于Sportsman and Wilson(1980)Anal.Chem.52，2013-2018)。

在一个特定实施方案中，载体A部分被与A部分交联的类蛋白质膜包被(参见US4478946的权利要求1-50和涉及载体的实施例)。

在另一个特定实施方案中，A部分是荧光珠例如荧光乳胶颗粒。专利US4550017，特别是其中第4页，描述了可用于制造荧光珠的荧光化合物。

在另一个特定实施方案中，A部分改变大小并还可以含有或充满荧光染料。由于珠的不同大小和染料，可以在单一反应中检测和定量多个蛋白质。用于开发这种珠的方法描述于US6159748。

在另一个特定实施方案中，A部分(珠)和B部分之间的偶联通过聚苏氨酸、聚丝氨酸、葡聚糖或聚乙二醇进行。US6399317的实施例6、7、8和9阐明了这种偶联可以如何进行。

在另一个特定实施方案中，A部分是磁性珠。磁性珠、磁性珠和蛋白质物质之间的偶联及其应用描述于申请US6489092的第8页。

定义

除非另外定义，本文所用全部技术和科学术语具有相同于本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。尽管与本文描述的任何方法和材料相似或等价的方法和材料可用于实施或测试本发明，本文描述了优选的方法和材料。为本发明的目的，下面定义下列术语。

本文所用冠词“一种”是指一个或多于一个的本文所说的语法上的宾语。例如“一种靶蛋白”是指一个靶蛋白或多于一个靶蛋白。

如本文所用，术语“大约”是指量、水平、数值、尺寸、大小、或数量相比参考量、水平、数值、尺寸、大小、或数量改变多至30％，优选地多至20％，更优选地多至10％。

“双官能交联试剂”是指含有两个反应基团的试剂，从而所述试剂具有将两个元件例如干扰子分子的A部分和B部分共价连接的能力。交联试剂中的反应基团典型地属于包括琥珀酰亚胺酯、马来酰亚胺和卤乙酰胺如碘乙酰胺官能团的类型。在本说明书中，除非上下文另外需要，否则术语“包含”应理解为意味着包括阐明的步骤或元素或一组步骤或元素，而不是排除任何其他步骤或元素或一组步骤或元素。

“表达载体”或“重组载体”是指任何能够指导由所述载体编码的干扰子分子的合成的自主遗传元件。

“衍生物”是指已经通过修饰例如通过与其他化学成分缀合或复合(例如聚乙二醇化)或通过本领域理解的翻译后修饰技术而衍生自基本序列的干扰子分子。术语“衍生物”也将对亲代序列进行的改变包括在其范围内，所述改变包括形成功能性等价分子的添加或缺失。

“有效量”在调节活性或治疗或阻止一种疾病的上下文中是指将该量的干扰子分子以单一剂量或作为一系列剂量的一部分给予需要这种调节、治疗或预防的个体，所述量有效调节该效应或用于治疗或预防该种疾病。所述有效量根据接受治疗的个体的健康和身体条件、接受治疗的个体的分类学组别、组合物的配方、医疗状态的评估、以及其他相关因素变化。期望所述量落入可通过常规试验确定的相对宽的范围。

“分离的”是指一种物质，其基本上不含有在其天然状态通常伴随其的成分。例如，如本文所用，“分离的多肽”是指从在天然存在的状态下位于其侧翼的序列中纯化出来的多肽，例如从正常情况下与其相邻的序列中被转移出来的自缔合序列。自缔合序列(任选地与阻止聚集的成分偶联)可通过氨基酸化学合成产生或可通过重组生产产生。

如本文所用，术语“寡核苷酸”是指由通过磷酸二酯键连接的多个核苷酸单位(脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其相关结构变体或合成的类似物)组成的多聚体(或其相关结构变体或合成的类似物)。寡核苷酸典型地长度较短，通常从大约10至30个核苷酸，但是本术语可以指任何长度的分子，尽管术语“多核苷酸”或“核酸”典型地用于大的寡核苷酸。如本文所用，术语“多核苷酸”或“核酸”是指mRNA、RNA、cRNA、cDNA或DNA。本术语典型地指长度大于30个核苷酸的寡核苷酸。

如本文所用，术语“重组多核苷酸”是指在体外通过将核酸操作为在自然界通常找不到的形式而形成的多核苷酸。例如重组多核苷酸可以以表达载体的形式存在。通常，这些表达载体包含与核苷酸序列可操纵地连接的转录和翻译调节核酸。

“可操纵地连接”是指转录和翻译调节核酸相对于编码多肽的多核苷酸处于所述多核苷酸被转录并且所述多肽被翻译的位置。

术语“对象”或“个体”或“患者”，在本文中可互换使用，是指希望治疗或预防的任何对象，特别是脊椎动物对象，甚至更特别地是哺乳动物对象。落入本发明范围的合适的脊椎动物包括但不限于灵长类、禽类、鱼类、爬虫类、家畜(例如绵羊、奶牛、马、驴、猪)、实验室动物(例如兔、小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠)、宠物(例如猫、狗)和捕获的野生动物(例如狐狸、鹿、澳洲野狗)。然而，应当理解上述术语不意味着存在症状。

“药物学可接受的载体”是指可安全地用于对患者局部或全身给药的固体或液体填充剂、稀释剂或成胶囊物质。

“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中互换使用，是指氨基酸残基多聚体及其变体或合成的类似物。因此，这些术语可用于其中一或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸的氨基酸多聚体，例如相应天然存在的氨基酸的化学类似物，以及用于天然存在的氨基酸多聚体。

“重组多肽”是指使用重组技术即通过重组的或合成的多核苷酸表达制造的多肽。当嵌合多肽或其生物活性部分被重组产生时，其还优选地基本上不含有培养基，即培养基占蛋白质制备物体积的小于大约20％、更优选地小于大约10％，以及最优选地小于大约5％。

如本文所用，术语“序列同一性”是指序列在一个对比窗内一个一个核苷酸基础上或一个一个氨基酸基础上的相同性程度。因此，“序列同一性百分比”通过在一个对比窗内对比两个被最佳排列的序列、确定在两个序列里出现相同核酸碱基(例如A、T、C、G、I)或相同氨基酸残基(例如e.g.、Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置的数目而计算得到匹配位置的数目、用匹配位置的数目除以对比窗内位置总数(即窗口大小)、并将结果乘以100得到序列同一性百分比而计算得到。根据本发明的目的，“序列同一性”应理解为意思是由DNASIS计算机程序(windows使用Version 2.5；可得自Hitachi Software engineering Co.，Ltd.，South San Francisco，Calif.，USA)使用如在软件随附的参考手册中所用的标准默认值计算得到的“匹配百分比”。“相似性”是指相同的或组成型保守取代的氨基酸的数目百分比。相似性可使用序列对比程序例如GAP(Deveraux et al.1984，Nucleic Acids Research12，387-395)确定。通过这种方式，与本文引用的序列具有相似或基本上不同的长度的序列可通过在对比排列内部插入间隔(gap)而对比，所述间隔例如通过GAP使用的对比算法确定。

术语“转化”是指生物体例如细菌、酵母或植物的基因型通过引入外源或内源核酸而改变。用于转化的载体包括质粒、反转录病毒和其他动物病毒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)等等。“载体”是指多核苷酸分子，优选地衍生自例如质粒、噬菌体、酵母或病毒的DNA分子，其中可插入或克隆多核苷酸。载体优选地含有一或多个独特的限制位点并能够在已知的宿主细胞中自主复制，所述宿主细胞包括靶细胞或组织或其前体细胞或组织，或可整合已知宿主的基因组从而被克隆的序列可以复制。因此，载体可以是自主复制载体，即载体作为其复制不依赖于染色体复制的染色体外实体存在，例如线性或闭环质粒、染色体外元件、微小染色体(minichromosome)、或人工染色体。载体可以包含用于保证自我复制的任何工具。或者，载体可以是当导入细胞内部时整合进基因组并与其整合进的染色体一起复制的载体。载体系统可以包括单一载体或质粒、共同含有导入宿主细胞基因组的总DNA的两个或多个载体或质粒、或转座子。载体的选择典型地基于所述载体与导入所述载体的宿主细胞的兼容性。在一个优选的实施方案中，所述载体优选地是病毒或病毒衍生的载体，其在动物，优选哺乳动物细胞中可操纵地发挥功能。载体也可包含选择标记例如可用于选择合适的转化子的抗生素抗性基因。本领域技术人员熟知所述抗性基因的实例，包括产生抗生素卡那霉素和G418(Geneticin

)抗性的nptII基因和产生抗生素潮霉素B抗性的hph基因。

除非另外定义，本文所用全部技术和科学术语具有相同于本发明所属领域普通技术人员通常理解的含义。尽管与本文描述的任何方法和材料相似或等价的方法和材料可用于实施或测试本发明，下文描述了有用的方法和材料。所述材料、方法和实施例仅仅是为了说明目的而不是为了起到限制作用。本发明其他特征和优点可以从详细的说明书和权利要求书中明显地得到。

实施例

1.设计合成肽干扰子分子

我们构建了一种干扰子分子，其中B部分由三个合成的自缔合区组成，由两个氨基酸的短接头连接所述自缔合区(STLIVL-QN-STVIFE-QN-STVIFE)。所述三个自缔合区是具有强烈聚集倾向的六肽，所述干扰子分子的设计参见图1。注：在本发明文中全部氨基酸序列均从氨基末端开始列出，向羧基末端部分方向读，因此，“STLIVL”读作“NH2-STLIVL-COOH”)。合成干扰子分子的B部分在N末端与阻止聚集的成分(A部分)融合，并使所述自缔合区与环境直接接触(这里是大肠杆菌(E.coli)的细胞质)。(图1描述了所述合成干扰子设计的结构)。所述成分是NusA蛋白，其经常用作重组蛋白质生产中的增溶标签¹³。得到的合成干扰子分子(A-B结构)可以在大肠杆菌中以重组方式制备并纯化。

我们已经示出了所述合成干扰子分子(不含有任何特异性针对特定大肠杆菌蛋白的特异性自缔合区)的过表达并不阻止细菌生长。因此，用pETM60质粒(G.Stier，EMBL惠赠)中的所述合成干扰子构建体转化BL21大肠杆菌细胞。在所述质粒中干扰子受到嵌合T7启动子的控制(参见“材料和方法”部分)。重组子生长至0.6 OD，干扰子在37℃加入0.5μM IPTG 3小时的条件下表达，并将细菌悬浮液铺板在琼脂平板上。在37℃温育12h后检查所述平板，显示大量细菌生长。

下一步，将柔软的接头序列(“KPGAAKG”-图1中示为“接头”)偶联至合成干扰子构建体的COOH末端以使衍生自靶蛋白的自缔合序列融合。

2.原核生物中的蛋白质干扰

在本实施例中选择下调大肠杆菌蛋白质，对所述蛋白质进行功能性蛋白质干扰产生可选择的特征。得自大肠杆菌蛋白质组的靶蛋白用细胞质定位和具有合适的高TANGO分值的聚集区的存在进行选择。由于可以使用具有可控组成的生长培养基方便地测试针对单一氨基酸的条件营养缺陷体，我们选择了四种参与异亮氨酸(UniProt¹⁵entry：ILVI_ECOLI)、甲硫氨酸(UniProt¹⁵entries：METE_ECOLI和METK_ECOLI)和亮氨酸(UniProt¹⁵entry：LEU1_ECOLI)合成的候选酶。所述四个靶蛋白的基于TANGO预测分值的自缔合序列是：ILVI_ECOLI：“GVVLVTSG”，TANGO分值：44，METE_ECOLI：“LLLTTYF”，TANGO分值：32，METK_ECOLI：“”LTLLV”，TANGO分值：20，LEU1_ECOLI：“LAFIG”，TANGO分值：15。实施例1的合成干扰子分子的遗传信息与编码所述四个生物合成酶的各个自缔合区的DNA序列融合得到四个特异性干扰子分子。为了示出体内蛋白质干扰(其基本上是所述特异性干扰子(针对一种生物合成酶)和所述生物合成酶本身共聚集)，我们进行了如下操作。用含有各个干扰子构建体的质粒转化大肠杆菌并在丰富培养基中生长至对数生长期开始，此时用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导干扰子蛋白表达。在37℃进行蛋白质表达，收获细胞，用盐溶液漂洗细胞以除去过量的IPTG和丰富培养基，并在含有补充了二十种天然存在的氨基酸的基本M9培养基(称为M9完全培养基)和含有除了测试的营养缺陷体所针对的那种氨基酸之外的全部氨基酸的基本M9培养基(称为M9选择培养基)的琼脂平板上铺板。结果显示对于四种靶酶中的三种，可以实现完全功能性敲除，即发现在M9完全培养基上形成菌落的细菌在M9选择琼脂平板上不能形成菌落。干扰子构建体的表达及其主要存在于细胞裂解物的不溶解部分的事实通过western印迹确定。对于这里测试的四种酶，在其对共聚集方法的灵敏度和其基于TANGO算法预测的聚集倾向之间观察到了明显的相关性，进一步确定了TANGO预测的质量及其在功能性细胞环境中的相关性。具有最高TANGO分值的ILVI蛋白在不存在任何IPTG的情况下几乎完全被来自T7启动子的渗漏表达所敲除，并且一小时的诱导过表达导致完全的功能性敲除。METE和METK酶显示中等TANGO分值，没有受到干扰子仅一个小时的过表达的影响。但是在IPTG诱导三小时后，功能完全丧失，检测不到任何菌落形成。LEU1酶具有最弱的聚集分值，这种情况下的过表达仅对其活性产生最轻微的下调。值得注意的是，靶定的酶的功能性敲除是可逆的。当将加入了高水平过表达的干扰子物质的细胞在LB琼脂上铺板时，它们显示正常的菌落生长。当这些菌落复制至M9选择培养基时，又一次观察到正常生长。这提示在菌落生长过程中失去了聚集物，重新将细胞网络恢复正常。

3.包含具有低自缔合分值的自缔合区的靶的蛋白质干扰

自缔合区通常两侧是或含有带电荷的残基例如R、K、D和E以及P和G(所谓的守门(gatekeeper)氨基酸残基)(参见Rousseau，Serrano &Schymkowitz(2006)How Evolutionary Pressure Against Protein AggregationShaped Chaperone Specificity，J Mol Biol，doi：10.1016/j.jmb.2005.11.035)。这些守门残基降低与其相关的序列的自缔合倾向。为了使干扰子分子的B部分的灵敏度最优化以与给定的靶蛋白共聚集，可以突变靶蛋白的被包含进所述干扰子的B部分的自缔合区以使上述残基被促进聚集的残基例如L、V、I、F、W、Y取代，也可以包含进其他可以增加所述自缔合区的自缔合倾向的残基。包含进所述干扰子分子的B部分的(衍生自靶蛋白的)被突变的自缔合区与所述靶蛋白的自缔合区具有至少60％、优选地至少70％、更优选地至少80％及最优选地至少90％的序列同源性。另外，一些氨基酸在聚集方面是中性的，用有利于聚集的氨基酸取代这些氨基酸也会增加一个区域的自缔合倾向(例如S、T、C以及Q、N、H、M可以被易于聚集的残基例如L、V、I、F、W、Y取代)。这些优化的干扰子分子提高了具有预测的低聚合分值的靶的蛋白质干扰。在实施例2中，我们示出了大肠杆菌的LEU1酶的蛋白质干扰是效率较低的。在这个实施例中，我们优化了特异性针对LEU1酶的干扰子分子。LEU1中被确定的自缔合区是“LAFIG”。该序列侧翼是守门残基“...DYDLEALAFIGKQQEE...”，因此为了通过突变增强靶序列，我们使用了如下基于简并pcr的策略：设计互补引物，使得所述引物在被突变的密码子的每一侧具有20-25bp的重叠以使得所述引物与模板有效退火。通过在引物合成期间掺入等摩尔比例的四种碱基而引入简并密码子(所谓NNS密码子)。用此简并引物通过使用Quickchange PCR方案获得含有所述侧翼位置的20个点突变的文库。所述文库在Top10细胞(Invitrogen)中扩增，并使用miniPrep试剂盒(Qiagen)纯化质粒DNA。为了测试敲除效率是否提高，将针对LEU1靶的突变体干扰子(如实施例2所述进行设计)转化进BL21细胞(Invitrogen)中并在LB琼脂平板上铺板。在每孔含有0.2mLLB+抗生素的96孔平板上，挑起单个菌落接种每一个孔。将所述平板在37℃温育直至达到OD为0.6，此时在37℃加入0.5μM IPTG 3小时诱导突变体干扰子表达。每孔中的成分除了1μL外全部铺板在含有除亮氨酸外全部氨基酸的选择基本培养基上。对于在选择平板上显示不同等级的受损生长的菌落，加入TempliPhi试剂(GE Health Science)用于DNA扩增，并将平板转移至测序设备。序列信息为我们提供了优化的LEU1突变干扰子分子的全部谱系。

4.干扰子分子用于从血清中除尽免疫球蛋白G

在这个去除实验中，选择琼脂糖珠作为与衍生自靶蛋白的自缔合区通过氨基活性化学连接融合的成分(A部分)。所述琼脂糖材料可商购，例如得自GE healthcare的NHS-活化的Sepharose^TM 4Fast Flow。人免疫球蛋白G具有两个可用作自缔合区的强tango区，(I)IIVAVVIATAVAAIVAAVVALIY和II)LTVLLLLASA)。由于肽的价格与氨基酸长度成正比，因此将肽设计为含有来自第一个靶区域的10个氨基酸部分。所述靶序列(自缔合区)之前是接头序列ADPRGAAEGA，并且用未保护的末端进行合成以保留活性N末端氨基。所设计的序列是a)ADPRGAAEGAIIVAVVIATA、b)ADPRGAAEGAVVIATAVAAI、c)ADPRGAA GAIVAAVVALIY(a)、b)和c)含有衍生自强tango区I的十肽)、和d)ADPRGAAEGALTVLLLLASA(包含tango区II)。为了除尽，将10ml血清与1mg固定化的肽在25、30、37和45℃温育1小时。通过离心收集琼脂糖珠并除去血清，在PBS缓冲液中漂洗琼脂糖珠以除去残留的杂质。接下来将珠转移至SDS缓冲液并在95℃温育10分钟并充分涡旋混和。用SDS-PAGE检测IgG。靶的身份使用质谱确定。

5.干扰子分子用于检测

设计干扰子分子用于特异性检测3个可商购的重组蛋白质(来自猪心脏的柠檬酸合酶(Roche)、来自大肠杆菌的β-半乳糖苷酶(Sigma)和来自肠膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)的葡糖-6-磷酸脱氢酶(Sigma))。为此，在第一步中，从下列靶蛋白中用TANGO算法确定自缔合区：

a)柠檬酸合酶(CISY_PIG)：“ALFWLLVT”(TANGO分值60)，

b)β-半乳糖苷酶(BGAL_ECOLI)：“AVIIWSLGN”(TANGO分值30)和“ALAVVLQ”(TANGO分值42)，和

c)葡糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD_LEUME)：“AFVDAISAVYTA”(TANGO分值41)。

在下一步中，将生物素(biotine)通过氨基末端偶联至4个不同的自缔合区，产生4个不同干扰子分子：i)生物素-ALFWLLVT，特异性针对柠檬酸合酶，ii)生物素-AVIIWSLGN和生物素-ALAVVLQ，特异性针对β-半乳糖苷酶和iii)生物素-AFVDAISAVYTA，特异性针对葡糖-6-磷酸脱氢酶。生物素化的肽从Jerine Peptide Technologies获得。注意干扰子设计：生物素-自缔合区相应于A-B结构，其中生物素(A部分)阻止自缔合区(B部分)聚集并使得所述自缔合区与所述生物素-自缔合区所在的溶剂(PBST)直接接触。

个体点印迹通过将0.3mg的每一种靶蛋白点在硝酸纤维素膜上、接下来风干并在1％BSA-PBST(含有0.1％Tween-20的PBS)中过夜温育以封闭非特异性结合位点而制备。将所述膜浸在生物素化的检测肽的10mM溶液中并在室温摇动3小时。在用缓冲液漂洗之后，通过将生物素成分使用链霉抗生物素-HRP(辣根过氧化物酶，Pierce)显影并使用CCD成像系统进行化学发光检测确认肽与蛋白质的结合。

6.针对鼠VEGF的干扰子分子用于治疗病原性视网膜血管发生

视网膜新血管形成是世界上致盲的一个主要原因，病原性视网膜血管发生是在疾病例如早产儿视网膜病变(ROP)、糖尿病视网膜病变和衰老相关的黄斑变性中导致视力下降的一个最终的常见途径。已知血管内皮生长因子(VEGF)是病原性血管发生的发展过程中一个关键参与者。我们研究了针对VEGF的干扰子分子在两个鼠诱导的视网膜病变模型中的效果。在第一个模型中，新生小鼠(具有不成熟的视网膜血管系统)暴露于高氧环境，引起为视网膜供氧的发育中的血管管腔闭合。当所述小鼠接下来回到正常氧环境时，位于闭合血管末端的视网膜供血不足，诱导VEGF产生，并最终引起可重复的并且可定量的视网膜新血管形成(所述模型详细描述于PierceEA et al(1995)Proc.Natl.Acad.Sci.92(3)905-9，参见第905页“experimentalprocedures”-mouse model)。简而言之，将7日龄(P7)小鼠幼崽及照顾其的母鼠在特别设计的氧气腔中置于高氧环境(75％氧气)5天，不打开笼子。在P12，将所述动物返回室内空气中直至P17，此时评估视网膜的最大新血管应答。在P12，半数动物用针对VEGF的干扰子分子处理，半数不处理。接受处理的半数小鼠通过玻璃体内注射方式接受VEGF干扰子，而接受处理的组的另一半通过眼周注射方式接受VEGF干扰子(所述眼周或玻璃体内注射如Shen J et al(2006)Gene Therapy，提前在线发表于9月29日中所描述的进行)。针对鼠VEGF165同种型的不同干扰子分子在1-100μg/ml浓度范围使用。

a)REAG-FLLSWVHWTLALLLYLHH-GGEERAG；这个干扰子分子具有干扰子分子的A-B-A’结构。衍生自鼠VEGF165(下划线部分)的自缔合区侧翼是增溶区A(REAG和GGEERAG)，或换句话说A区和A’区阻止所述自缔合区(干扰子分子的B部分)的聚集。

b)

STVIIE-GGAG-NHVTLS-GGAGQ-FLLSWVHWTLALLLYLHH-；这个干扰子分子具有干扰子分子的B-A结构。增溶的A部分(GERAG)以斜体显示。B部分具有下述结构：STVIIE(＝合成的自缔合区)-GGAG(＝接头)-NHVTLS(＝合成的自缔合区)-GGAGQ(＝接头)-FLLSWVHWTLALLLYLHHG(＝衍生自鼠VEGF165的自缔合区)。

c)STVIIE-GGAG-FLLSWVHWTLALLLYLHH-

；这个干扰子分子具有干扰子分子的B-A结构。增溶的A部分(GERAG)以斜体显示。B部分具有下述结构：STVIIE(＝合成的自缔合区)-GGAG(＝自缔合区之间的接头)-FLLSWVHWTLALLLYLHHG(＝衍生自鼠VEGF165的自缔合区)。

在P17，通过左心室对被麻醉的小鼠灌注1ml含有50mg 2×10⁶分子量荧光素-葡聚糖的磷酸盐缓冲盐水。取下眼睛并在4％多聚甲醛中固定3小时(右眼)或24小时(左眼)。对于右眼，除去晶状体并切开周围视网膜以用甘油-明胶进行平面封片。被平面封片的视网膜通过荧光显微镜分析。左眼包埋在石蜡中，与视神经平行对角膜沿矢状线切割制备6μm连续切片，并用苏木精-伊红染色。增殖性新血管应答通过计数在染色的矢状横截切片上的新血管(＝细血管丛(tuft))数目和从视网膜内界膜延伸进玻璃体的内皮细胞数目定量。使用荧光素-葡聚糖灌注的血管造影计数与所述计数方法结合使用以迅速筛选视网膜或作为一种替代分级系统用于定量评价。在第二个模型中，视网膜新血管形成通过视网膜内激光诱导的静脉血栓被实验模拟。所述模型描述于Saito Y et al(1997)Curr.Eye Res.16(1)：26-33。Chi-Chun Lai etal(2005)Acta Ophtalmologica Scandinavica 83：590-594在591-592页的“materials and methods”部分描述了所述模型可被定量。VEGF干扰子分子的应用如本文前述进行。

7.人细胞系中的蛋白质干扰

细胞凋亡的调节(诱导或抑制)可容易地在细胞系统中监控。已知星形孢菌素(staurosporin)以p53依赖性方式诱导凋亡。因此，p53的下调或增强p53的功能的蛋白质(例如ASPP1)的下调抑制动物(例如人)细胞系中星形孢菌素诱导的凋亡。基于实施例1中描述的合成干扰子分子的设计构建编码干扰子分子的重组表达载体，不同之处是A部分(NusA蛋白)被改变为绿色荧光蛋白(GFP)并且启动子是组成型哺乳动物启动子例如肌动蛋白或CMV启动子。p53的自缔合区是ILTIITLE(tango分值为72)，这个序列被另外包含进合成干扰子的B部分，形成具有针对p53的特异性的干扰子分子。ASPP1的自缔合区是MILTVFLSN(tango分值为63)，这个序列被另外包含进合成干扰子的B部分，形成具有针对ASPP1的特异性的干扰子分子。培养HeLa细胞并用所述重组载体转染。GFP(A部分)使得可以观察干扰子分子的过表达。向转染的和非转染的对照细胞中加入1μM星形孢菌素诱导不同的凋亡应答。

8.斑马鱼中血管内皮生长因子(VEGF)的蛋白质干扰

开发出了针对斑马鱼VEGF的干扰子分子。分泌的VEGF的特异性失活(通过聚集进行)之后可以是斑马鱼胚胎中血管发育的干扰。

第一步，斑马鱼VEGF蛋白中的自缔合区用TANGO算法确定。具有最高TANGO分值的聚集区是NH₂-FLAALLHLSA-COOH。基于这个自缔合序列，我们开发了四种合成的干扰子分子：

干扰子A：NH₂-RLFLAALLRFLAALLHLSAR-COOH

干扰子B：NH₂-RFLAALLHLSARLFLAALLR-COOH

干扰子C：NH₂-RYLAILAGIRLFLAALLR-COOH

干扰子D：NH₂-RYLAILAGIRFLAALLHLSAR-COOH

干扰子E(NH₂-EALVVYLIQLAGR-COOH)作为对照序列，衍生自这个高TANGO区外的一段序列。

注意干扰子A、B和D包含完整的TANGO区，而干扰子C仅包含所述TANGO区的一部分。衍生自所述TANGO区的序列添加了下划线。

将这些干扰子分子以不同浓度加入到转基因Tg(flil：EGFP)^y1斑马鱼胚胎的培养基中。转基因Tg(flil：EGFP)^y1斑马鱼在其内皮细胞中表达增强的绿色荧光蛋白(GFP)，所述鱼描述于Lawson ND and Weinstein BM(2002)Dev.Biol.248，307-318，由斑马鱼国际资源中心(Zebrafish International ResourceCenter(University of Oregon))提供，并如斑马鱼书籍：a guide for thelaboratory use of zebrafish(Danio rerio)，Univ.Oregon Press，Eugene，1994中所描述的饲养。

受精之后20小时(hours post fertilization，hpf)的去绒毛膜(Dechorionated)的胚胎被置于24孔板中(10个胚胎/孔)并暴露于不同浓度的所选择的干扰子分子(起始浓度50μM)中24小时。在28和48hpf(受精后小时)使用共聚焦成像分析活胚胎。所述共聚焦成像使用Zeiss激光扫描显微镜LSM510进行。

尽管监控不同血管结构的发育，我们特别关注了(i)背主动脉(DA)、后主静脉(PCV)的结构，(ii)躯干后区肌节间血管(intersomitic vessel，ISV)的萌发和脉管丛(PV)的形成。剂量依赖性实验的总结示于表1。很明显干扰子A和C在发育中的斑马鱼幼虫中诱导明显的血管缺陷。令人吃惊的事实是干扰子分子被斑马鱼幼虫透过皮肤摄取，所以不需要注射所述干扰子。干扰子B和D需要在较低浓度给予，以能够监控特定血管缺陷。

9.酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的蛋白质干扰

我们用酵母Ura3酶的敲低示出了蛋白质干扰在真核细胞中起作用，因为Ura3蛋白的靶定失活(通过聚集)给出容易观察的结果。酿酒酵母的Ura3酶是参与尿嘧啶生物合成途径的必需的酶。因此，酿酒酵母缺乏URA3基因的突变体不能在不含有尿嘧啶的培养基上生长，但是可以通过向培养基中加入尿嘧啶使生长恢复。第一步，用TANGO算法确定Ura3蛋白中的自缔合区。具有最好的TANGO分值的自缔合区(或聚集区)是NH₂-VIGFIAQ-COOH(TANGO分值：74)。用这个肽序列产生干扰子表达构建体。为了将编码这个肽的自缔合序列与合成干扰子构建体(参见实施例1)在读框中克隆在一起，我们使用了下列两个寡核苷酸：

URA3aggregatorFor：5’CCTCTAGA

AAAGAAATTTTGGCTGTAG3’，和URA3aggregatorRev：5’CCGTCGAC

 AGC

 GCCAGCAGCGCCCGGTTTAGCAGC 3’。

下划线部分示出了XbaI和SalI限制位点。NusA蛋白的起始密码子以粗体注明。终止密码子以斜体示出，编码七个Ura3氨基酸的序列以粗体示出。

作为用于PCR的模板，我们使用了含有与合成干扰子/接头构建体(参见实施例1)偶联的NusA蛋白的pETM60质粒(惠赠自G.Stier，EMBL)。这个载体含有T7启动子，产生卡那霉素抗性并提供六组氨酸N末端表达标签。将得到的PCR产物利用XbaI和SalI限制位点亚克隆在pBEVY/GT载体(Miller CA 3^rd，Martinat MA and Hyman LE(1988)Nucleic Acids Res.26：3577-3583)中。在这个载体中，“NusA-合成干扰子-接头-Ura3自缔合序列”表达盒处于酿酒酵母GAL1/10启动子的控制之下。这个载体的选择标记是TRP1基因。

将序列已证实的并具有或不具有编码所述七个Ura3氨基酸(衍生自自缔合区)的DNA的构建体通过转化导入酿酒酵母PVD2株，基于trp1互补进行选择。所述PVD2株衍生自W303-1A株(Thomas BJ and Rothstein R.(1989)Cell 56，619-630)，但是PVD2株用HIS3和URA3的野生型等位基因转化。所述PVD2株仍旧是亮氨酸(LEU2)、色氨酸(TRP1)和腺嘌呤(ADE2)营养缺陷型。在SDglu-Trp培养基(含有2％葡萄糖但是不含有色氨酸的基本酵母培养基)上选择转化子。将菌落重涂在新鲜SDglu-Trp平板上以获取单菌落。在液体SDglu-Trp培养基中过夜生长两个独立菌落。接下来将培养基的OD600调整至1，并将5微升10倍系列稀释液点在SDglu-Ura-Trp(含有2％葡萄糖但是不含有尿嘧啶和色氨酸的SD培养基)或SDgal-Ura-Trp(含有2％半乳糖但是不含有尿嘧啶和色氨酸的SD培养基)平板上。此实验结果示于图2。这个实验重复了三次得到相似结果。空载体pBEVY/GT或仅表达NusA-合成干扰子构建体(不含有ura3的自缔合序列)的载体的表达在不含有尿嘧啶的培养基上不显示任何生长抑制。然而，NusA-合成干扰子-Ura3缔合区构建体的表达在不含有尿嘧啶的培养基上强烈抑制生长(当向生长培养基中加入尿嘧啶时，没有生长缺陷)，显示内源Ura3蛋白被蛋白质干扰特异性失活。

10.酵母白色假丝酵母(Candida albicans)中的蛋白质干扰

白色假丝酵母造成人类真菌感染的40％。这种共生物拥有许多致病因素。除了粘附于所有类型塑料的能力(重症监护室的一个主要问题)或产生酯酶和蛋白酶之外，其被最广泛研究的是形成各种形态的能力，因为这是主要致病因素之一。很多转录因子可以诱导从酵母样细胞到菌丝或假菌丝的转变。需要其他转录因子以保持细胞处于酵母样形式。这种菌丝形成的抑制物的一个实例是Tup1。作为白色假丝酵母中蛋白质干扰的一个实例，我们将所述Tup1蛋白用作一个靶。Tup1的生物学功能的下调应当诱导菌丝形成。第一步，用TANGO算法确定Tup1蛋白中的自缔合区。具有最高TANGO分值(TANGO分值：30)的自缔合区(或聚集区)是NH₂-VISVAVSL-COOH。将这个肽用于产生干扰子表达构建体。为了将编码这个肽的自缔合序列与实施例1的合成干扰子构建体在读框中克隆在一起，我们使用了下列两个寡核苷酸：

TUP1aggregatorFor：

5’ATTGTACAAATATCCGTATGTGCCTGACTACGCAATGGCTCAGTGGCAGAAC 3’，和TUP1aggregatorRev：5’GCGCTAGC

 AGC

 GCCAGCAGCGCCCGGTTTA 3’。

下划线部分示出了BsrGI和NheI限制位点。终止密码子以斜体示出，编码靶肽的逆向序列以粗体示出。

我们将含有NusA-合成干扰子构建体(来自实施例1)的pETM60质粒用作PCR模板。将得到的PCR产物利用BsrGI和NheI限制位点亚克隆在pPCK1-GFP质粒((Barelle CJ，Manson CL，MacCallum DM，Odds F，GowNAR，Brown AJP.Yeast 21：333-340，2004)中。在这个载体中，干扰子构建体与载体上的GFP基因在读框中克隆在一起，得到的干扰子表达盒“GFP-合成干扰子-接头-“Tup1自缔合序列”处于PCK1启动子的控制之下。在此构建体中，绿色荧光蛋白(GFP)被NusA取代并且GFP发挥干扰子分子的A部分的作用。PCK1启动子在含有酪蛋白氨基酸的培养基中被强烈诱导，在含有葡萄糖的培养基中被抑制(Leuker CE，Sonneborn A，Delbruck S，Ernst JF.Gene 192：235-240，1997)。接下来将序列被证实的质粒转化进白色假丝酵母株CAI4中(Fonzi WA，Irwin MY.Genetics 134：717-728，1993)。在SDglu-ura培养基(含有2％葡萄糖但是不含有尿嘧啶的基本酵母培养基)上选择转化子。在含有葡萄糖的基本培养基上过夜生长转化子，稀释细胞以获得大约20个细胞/100微升，将此体积铺板在SDglu-ura或SD酪蛋白氨基酸-ura琼脂平板上。生长4天和6天后记录菌落形态(参见图3)。如图3所示，在含有酪蛋白氨基酸的培养基中发生Tup1的下调，并且在菌落边缘明显可见菌丝形成。在对照转化子((不含有干扰子表达盒的pPCK1-GFP质粒))中和含有葡萄糖的培养基上没有发现菌丝形成。这个例子显示内源Tup1被蛋白质干扰特异性失活。

11.蛋白质干扰在植物中的应用

我们通过使用用几种GFP-融合基因(所述基因示于表2)转化的BY2细胞在烟草BY2细胞中显示了蛋白质干扰。拟南芥(Arabidopsis thaliana)基因及它们相应的被识别的自缔合区和tango分值列表示于表2。

针对表2的每一个靶的特异性干扰子分子基于实施例1中所描述的合成干扰子分子设计，不同之处是NusA蛋白被红色荧光蛋白(Red FluorescentProtein，RFP)取代，并且B部分另外含有表2中所示靶的特异性自缔合区。

将编码所述特异性干扰子分子的构建体导入合适的载体中以使用Gateway^TM技术(InVitrogen Life Technologies)进行过表达。为此开发一组Gateway相容性二元载体用于植物转化。pK7WGD2载体用于过表达，其中基因被置于p35S启动子的控制之下。三元载体系统被用于植物细胞转化。pBBR1MCS-5.virGN54D载体被用作三元载体。通过电转化将二元载体导入已经含有三元载体的根瘤土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)LBA4404菌株中。在用特定构建体转化之前建立新鲜的BY-2培养物。用1∶10接种5日龄BY-2并生长三天(28℃，130rpm，黑暗)。在BY-2转化前两天建立用pK7WGD2-GUS(对照载体)、pK7WGD2-干扰子1(例如特异性针对aurora1)、pK7WGD2-干扰子2(例如特异性针对aurora 2)等等转化的根瘤土壤杆菌液体培养物。将来自固体培养基的一满环细菌接种于5ml含有抗生素(利福平、艮他霉素、链霉素和壮观霉素)的液体LB培养基中。使培养物生长两天(28℃，130rpm)。BY-2的转化在空的培养皿(

 4，6cm)中用共培养(cocultivation)的方法进行。将三日龄BY-2(3ml)用移液管移入平板中并加入50或200μl细菌悬浮液。轻轻混和平板并在超净工作台上在黑暗中静置三天。在共培养后将细胞铺板在含有选择性(50μg/ml卡那霉素、500μg/ml万古霉素和500μg/ml羧苄青霉素以杀死多余的细菌)的固体BY-2培养基上。将平板用Millipore胶带封好，在黑暗中于28℃培养大约两周，之后可以看见愈伤组织。通过在荧光显微镜下检查GFP、RFP及GFP和RFP的共定位显示蛋白质干扰的效率(这里是GFP构建体和RFP构建体之间的聚集)。

涉及实施例1和2的材料和方法

构建体、细胞和培养基

干扰子分子被克隆进pETM60载体(惠赠自G.Stier，EMBL)中。这个载体处于RNA聚合酶T7控制下(所述T7RNA聚合酶处于来自大肠杆菌lac操纵子的调节元件控制下)，产生卡那霉素抗性并提供六组氨酸N末端表达标签，之后是NusA。使用编码干扰子B部分的序列的一系列重叠寡核苷酸通过PCR产生“合成基因”。这个基因通过Nco1和BamH1限制位点连接进pETM60。干扰子基因通过对干扰子B部分进行PCR产生，使用长的反编码寡核苷酸以在C末端包含柔软接头和蛋白质特异性自缔合区(饵)的序列。这些通过Nco1和BamH1限制位点连接进pETM60。所有寡核苷酸购自Sigma-Genosys，所有限制酶购自Fermentas，连接使用购自Roche的QuickLigation Kit进行。

内部制备化学感受态BL21(DE3)细胞并根据标准方案转化。制备标准LB-琼脂平板，所有琼脂平板含有50μg/mL卡那霉素。通过向标准M9培养基中补充全部20种氨基酸(50μg/mL)和核苷酸腺嘌呤、鸟嘌呤、尿嘧啶和黄嘌呤(20μg/mL)制备M9完全平板。M9选择平板与M9完全平板除了一种氨基酸之外完全相同。为了控制在贮存中可能发生的氨基酸降解，平板在使用前一天制备。根据标准方案制备LB，含有50μg/mL卡那霉素。所有氨基酸购自Sigma，卡那霉素和IPTG购自Duchefa。

方案

BL21(DE3)细胞用表达构建体转化，在添加了卡那霉素的LB-琼脂上铺板并在37℃温育过夜。使用单菌落接种添加了卡那霉素的10ml LB并在37℃摇动生长过夜。之后一天用这个培养物以1∶100接种添加了卡那霉素的10ml LB并生长至OD600为0.6。之后将培养物分为两份，向一份培养物中加入IPTG(50μM)以诱导干扰子表达，并将两份培养物在37℃进一步温育希望的表达时间。之后通过离心收集细胞并用盐溶液(0.85％w/vNaCl)(通过重悬和离心)漂洗两次。之后将细胞在盐溶液中重悬使最终OD600为0.05，并将200μL这种细胞悬浮液在琼脂平板上铺板。琼脂平板在37℃温育过夜，之后一天记录菌落生长。如果需要，用无菌牙签将菌落挑至新鲜琼脂平板上。

表

表1：不同VEGF干扰子分子(用于实施例8)对斑马鱼血管结构的剂量应答效应总结

表2：衍生自拟南芥的蛋白质、识别出的自缔合区及相应tango分值

参考文献

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Claims (15)

1.一种用于下调蛋白质生物学功能的方法，包括将所述蛋白质与非天然存在的分子接触，所述非天然存在的分子包含所述蛋白质中存在的至少一个自缔合区。

2.权利要求1的方法，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的一种成分融合。

3.权利要求2的方法，其中所述成分是肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠。

4.权利要求1-3的方法，其中所述自缔合区由至少3个相邻氨基酸组成。

5.权利要求1-4的方法，其中在所述自缔合区和所述成分之间存在接头。

6.权利要求5的方法，其中所述接头是多肽或具有非多肽性质。

7.权利要求1-6的方法，其中所述分子是多肽并由重组载体上存在的核苷酸序列编码，并且当转化进细胞或生物体时在所述细胞或生物体内产生所述多肽。

8.一种非天然存在的分子，包含分离自能够溶于水的蛋白质结构域的至少一个自缔合区，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的成分融合。

9.权利要求8的分子，其中所述成分是肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠。

10.一种重组载体，包含编码权利要求8或9的多肽的多核苷酸。

11.用作药物的权利要求8-10的分子。

12.一种从样品中分离蛋白质的方法，包括将所述样品与包含分离自所述蛋白质的至少一个自缔合区的分子接触，并从所述样品中分离所产生的共聚集的分子-蛋白质复合物。

13.权利要求12的方法，其中所述自缔合区与阻止所述自缔合区聚集的一种成分融合。

14.权利要求13的方法，其中所述成分是肽、蛋白质结构域或琼脂糖珠。

15.权利要求12-14任一项的方法，进一步包括检测所述样品的蛋白质。

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