JP2000060561A - メタロチオネイン多量体とその製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 安定した状態で、かつ多量に発現させること
のできる新規なメタロチオネイン多量体と、その製造方
法を提供する。 【解決手段】 メタロチオネインがｎ個連結した多量体
であって、隣接する各メタロチオネインのＣ端アミノ酸
残基とＮ端アミノ酸残基が３個のアミノ酸残基Ｘaaによ
り結合しているメタロチオネイン多量体。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】この出願は、新規なメタロチ
オネイン多量体とその製造方法に関するものである。さ
らに詳しくは、この出願は、大腸菌等の微生物を用いて
大量かつ安定した状態で製造することができ、しかも環
境汚染の一因である重金属の補足活性に優れたメタロチ
オネイン多量体と、その製造方法に関するものである。

【０００２】

【従来の技術】メタロチオネイン（metallothionein:以
下、ＭＴと略記することがある）は、酵母、カビ、植
物、無脊椎動物、脊椎動物等の細胞内に存在するタンパ
ク質であり、例えば以下の性質等によって特徴付けられ
ている。 (1) 種々の重金属（Cd, Zn, Cu, Hg, Ag等）と結合し、
一分子当たりの金属含有量が高い。 (2) 低分子量タンパク質である。金属を含まない状態
で、N.crassaでは約3000、脊椎動物の多くで6000-7000
である。 (3) アミノ酸残基Ｃysを多く含む。哺乳類のＭＴでは全
アミノ酸残基の１／３がＣysである（例えば、ヒトＭＴ
遺伝子IIの場合、６１アミノ酸のうち２０がＣysであ
る）。重金属はＣysのチオール基を介してＭＴと結合し
ている。 (4) 芳香族アミノ酸を含まないので280nm での吸光がな
い。ただし、カドミウムを結合した場合には、カドミウ
ムとチオール基間にのメルカプチド結合により254nm 付
近に吸光がある。低ｐＨでカドミウムをＭＴから分離さ
せるとこの吸光はなくなる。

【０００３】またＭＴは、¹³ＣｄＮＭＲによる分析結果
から、２つのクラスターを形成していることが知られて
いる。Ａクラスターは１１個のＣysが４原子のカドミウ
ムまたは亜鉛に結合していて、ＭＴのＣ末端の31-61 ア
ミノ酸領域にあたり、αドメインとも言われる。一方、
Ｂクラスターは９個のＣysが３原子のカドミウムまたは
亜鉛に結合していて、ＭＴのＮ末端の1-30アミノ酸領域
に相当し、βドメインとも言われている。Ｘ線解析によ
って、αおよびβドメインは直径1.5 〜2.0nmの球形で
あることが知られている。

【０００４】生物体の器官や組織から単離精製されたＭ
Ｔには様々な金属が結合している。例えば、ヒトの検死
体の肝臓より精製されたＭＴは亜鉛を多く含み、一方、
腎臓ではカドミウムを多く含むことが知られている。ま
た、実験的にカドミウムや亜鉛を投与した動物や肝臓や
腎臓からは、その金属を多く含むＭＴが得られることが
知られている。

【０００５】現在のところ、ＭＴの生物学的な存在意義
は明らかでないが、以下の機能が考えられている。すな
わち、重金属との結合能があり、また重金属、発癌遺伝
子産物やストレス刺激によって遺伝子転写レベルでの発
現の制御が行われていることから、重金属毒性の低減、
生体内での金属量の調節が考えられている。あるいは、
Ｃysを多く含むことから、酸化還元電位の調節、硫黄代
謝への関与が想定されている。さらに最近の報告では、
アルツハイマー病患者の脳で不足している神経成長阻害
因子とＭＴ量に高い相関があることも明らかになってい
る。そして、広範囲の生物種に分布していることから、
生命維持に係わる重要な役割を果たしているものと考え
られている。

【０００６】一方、ＭＴの生物学的な機能とは別に、そ
の優れた重金属結合能に着目し、例えば環境汚染物質の
原因となる重金属除去を目的としたＭＴの利用について
も検討されており、遺伝子工学的手法によるＭＴ生産に
ついて様々な試みがなされている。例えば、この出願の
発明者らは、サルＭＴIIｃＤＮＡをＰ_R プロモーターお
よびＳＤ配列下流に結合し、大腸菌における直接発現で
14mg/g(total protein) のＭＴの発現を既に報告してい
る（Appl. Environ. Microbiol. 53:204-207,1987）。
また、同じくこの出願の発明者らは、ヒトＭＴIIのアミ
ノ酸配列、ＤＮＡ配列、並びに大腸菌発現のための合成
ＤＮＡのデザイン法を参考にしてヒトＭＴII遺伝子の全
合成を行い、大腸菌でβ−ガタクトシダーゼとの融合発
現し、全タンパク質の約24％にあたる量を発現させるこ
とに成功し、しかも得られたＭＴが有為な金属結合活性
を示すことをも見出している（J. Ferment. Bioeng. 77
(2):113-118, 1994 ）。その他にも、大腸菌によるＭＴ
発現の例が幾つか知られている（例えば、J. Biochem.
104:924-926, 1988; Biochem. Biophys. Acta. 951:230
-234, 1988; J. Biochnol. 8:207-220, 1988; Gene 83:
95-103, 1989; Biochem. Biophys. Acta. 1048:178-18
6, 1990）。

【０００７】

【発明が解決しようとする課題】従来の大腸菌でのＭＴ
発現は、特に哺乳動物ＭＴの場合には、融合発現では比
較的多量（全タンパク質の10％オーダー）に発現させる
ことが可能であるが、直接発現では発現量が少量（全タ
ンパク質の約１％前後）に限られていた。融合タンパク
質の場合には、ＭＴの重金属結合能が変化する可能性が
あり、また融合タンパク質からＭＴを分離するには特別
な工程を必要とした。

【０００８】この出願は以上のとおりの事情に鑑みてな
されたものであって、大腸菌等の宿主細胞において、全
タンパク質の10％以上もの高いレベルで発現させること
のできるＭＴ多量体と、その製造方法を提供することを
課題としている。

【０００９】

【課題を解決するための手段】この出願は、前記の課題
を解決するための発明として、メタロチオネインがｎ個
連結した多量体であって、隣接する各メタロチオネイン
のＣ端アミノ酸残基とＮ端アミノ酸残基が３個のアミノ
酸残基Ｘaaにより結合しているメタロチオネイン多量体
を提供する。

【００１０】このメタロチオネイン多量体においては、
メタロチオネインがヒト由来のメタロチオネインである
こと、そして第１番目メタロチオネインが配列番号１の
アミノ酸配列からなり、第２、３、４・・・ｎ番目メタ
ロチオネインが配列番号２のアミノ酸配列からなること
を好ましい態様としている。また前記ＸaaがＧlyであ
り、ｎが２または４であることを好ましい態様としても
いる。

【００１１】この出願はまた、メタロチオネインをコー
ドする遺伝子をｎ個保有する組換えベクターであって、
隣接する各遺伝子の３’端と５’端の間に３個のアミノ
酸残基Ｘaaをコードするオリゴヌクレオチドが挿入され
ている組換えベクターを提供する。この組換えベクター
においては、メタロチオネインをコードする遺伝子がが
ヒトゲノムＤＮＡから調製されたｃＤＮＡであること、
そして第１番目ｃＤＮＡが配列番号１のアミノ酸配列を
コードするｃＤＮＡであり、第２、３、４・・・ｎ番目
ｃＤＮＡが配列番号２のアミノ酸配列をコードするｃＤ
ＮＡであることを好ましい態様としている。また、前記
ＸaaがＧlyであり、ｎが２または４であることを好まし
い態様としてもいる。

【００１２】この出願はさらに、前記の組換えベクター
を宿主細胞に導入して細胞を形質転換し、この形質転換
細胞の産生するメタロチオネイン多量体を単離精製する
ことを特徴とするメタロチオネイン多量体の製造方法を
提供する。この製造方法においては、宿主細胞が大腸菌
であること、そしてメタロチオネイン多量体をジチオト
レイトールにより可溶化して単離精製することをを好ま
しい態様としている。

【００１３】以下、この発明の実施の形態について詳し
く説明する。

【００１４】

【発明の実施の形態】この発明のＭＴ多量体は、ＭＴ遺
伝子をｎ個保有する組換えベクターであって、隣接する
各遺伝子の３’端と５’端の間に３個のアミノ酸残基Ｘ
aaをコードするオリゴヌクレオチドが挿入されている組
換えベクターを宿主細胞に導入して細胞を形質転換し、
この形質転換細胞の産生するＭＴ多量体を単離精製する
ことによって得ることができる。このようにして得られ
るＭＴ多量体は、ＭＴがｎ個連結した多量体であって、
隣接する各メタロチオネインのＣ端アミノ酸残基とＮ端
アミノ酸残基が３個のアミノ酸残基Ｘaaにより結合して
いる。

【００１５】ＭＴ遺伝子は、N.crassa、酵母、ニジマ
ス、サル、ヒト等の公知のＭＴ遺伝子を用いることがで
きる。特に、サルやヒト等の哺乳類の遺伝子は、公知の
ｃＤＮＡ等を含む配列を用いることができる。例えば、
サルの場合には、サルＭＴIIｃＤＮＡ（Appl. Environ.
Microbiol. 53:204-207, 1987）、ヒトの場合には、後
記する参考例に示したような合成ヒトＭＴIIｃＤＮＡを
用いることができる。また、これらの公知の配列を基に
作成したプローブを用いて既存のゲノムライブラリー、
ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングすることによ
り、目的とするＭＴ遺伝子またはそのｃＤＮＡを得るこ
ともできる。

【００１６】この様なＭＴ遺伝子ｎ個は、各々の３’端
と５’端の間に３個のアミノ酸残基Ｘaaをコードするオ
リゴヌクレオチドが挿入された状態で発現ベクターに組
み込むようにする。具体的には、３個のアミノ酸残基Ｘ
aaをコードするオリゴヌクレオチド（９bp）の５’側
に、ＭＴ遺伝子の３’側の一部配列を連結するか、３’
側にＭＴ遺伝子の５’側配列を連結するか、もしくは両
端にＭＴ遺伝子の３’側および５’側配列を連結したリ
ンカー配列を作成し、制限酵素による切断およびライゲ
ーションによって隣接するＭＴ遺伝子とリンカー配列と
を結合することができる。Ｘａａは任意のアミノ酸残基
とすることができ、３個をそれぞれ異なったものとして
もよく、あるいは同一のアミノ酸残基としてもよいが、
実施例に示したように３個全てをＧlyとすることが好ま
しい。これによって、結合したＭＴ同士が空間を自由に
動けるようにすることができる。

【００１７】ＭＴ遺伝子およびリンカー配列の発現ベク
ターへの挿入は、例えば、任意のプロモーター配列の下
流にＭＴ遺伝子を１個保有するベクターにリンカー配列
を挿入して増幅し、切り出した［ＭＴ遺伝子＋リンカー
配列］を別の組換えベクター挿入することを繰り返すこ
とによって、［ＭＴ遺伝子＋リンカー配列］をｎ個連続
して有する組換えベクターを作成することができる。

【００１８】発現ベクターは宿主細胞の種類に応じて適
宜なものを選択することができる。作成した組換えベク
ターは、公知の方法により宿主細胞に導入し、形質転換
細胞を選択する。宿主細胞として大腸菌を使用する場合
は、発現ベクターとしてはプラスミドベクターを使用す
ることができ、プラスミドの保有する薬剤耐性遺伝子を
用いて形質転換細胞を選択することができる。形質転換
細胞を所定温度で所定時間培養し、必要に応じてＩＰＧ
Ｔ添加等によりタンパク質を誘導し、菌体を超音波破砕
し、遠心分離ののち、その不溶性画分（沈殿）から目的
とするＭＴ多量体を回収することができる。なお、沈殿
物中のＭＴ多量体はＤＴＴ（ジチオトレイトール）によ
って可溶化し、最終的には遠心分離後の上清から回収す
ることが好ましい。

【００１９】

【実施例】以下、実施例および試験例を示してこの発明
についてさらに詳細かつ具体的に説明するが、この発明
は以下の例によって限定されるものではない。なお、以
下の実施例におけるＭＴ多量体の作成には、下記参考例
の方法により作成した合成ヒトＭＴII遺伝子と、このヒ
ト遺伝子によるＭＴ単量体発現ベクターを使用した。

【００２０】また、下記参考例および実施例における遺
伝子操作等は公知の方法（Maniatis,T., et al. Molecu
lar cloning: a laboratory manual, 1982等）に準拠し
て行った。 参考例１：ヒトＭＴ遺伝子の合成 図１上段の塩基配列に示したように、ＭＴ遺伝子をＭ１
〜Ｍ８の８個の断片に分け、ＤＮＡ synthesizer Cyclo
ne (Bio-Serch 社製）でそれぞれを合成した。ＤＮＡ配
列は、大腸菌の使用コドンを考慮して変更した。また、
制限酵素サイトをＭＴのＤＮＡ配列内に導入した。合成
した断片はＨＰＬＣ（日本分光社製。C-18カラムを使
用）で精製し、図１下段に示したように、リン酸化、ア
ニーリング、ライゲーションを行った。アガロース電気
泳動後、180 〜200bp 付近のバンドを抽出し、ｐＵＣ系
のベクターｐＨＳＧ298 （宝酒造株式会社製）のマルチ
クローニングサイトに挿入し、ｐＬＭＴ001 、ｐＬＭＴ
002 とした。 参考例２：ＭＴ単量体発現ベクター（ｔａｃプロモータ
ー）の構築 参考例１で作成したｐＬＭＴ001 、ｐＬＭＴ002 から、
図２に示した方法により、ヒトＭＴ遺伝子を１個保有す
る組換えベクターｐＴＡＭＴ１と、ヒトＭＴ遺伝子２個
をタンデムに並べたｐＴＡＭＴ２、３個タンデムに並べ
たｐＴＡＭＴ３を構築した。なお、この組換えベクター
作成に使用したプラスミドベクターのうち、ｐＲＭＴII
ＳＤ２１の出典はAppl. Environ. Microbiol. 53:204-2
07, 1987であり、ｐＴＴＱ18は前記のMolecular clonin
g: a laboratory manual, 1982である。また、ｐＴＴＱ
18の構成は図３に示したとおりである。

【００２１】さらに図４に示した方法により、ｐＴＡＭ
Ｔ２を基にヒトＭＴ遺伝子を４個タンデムに並べた組換
えベクターｐＴＡＭＴ４、またｐＴＡＭＴ３からＭＴ遺
伝子６個をタンデムに並べたｐＴＡＭＴ６を構築した。
なお、図４の下段に塩基配列を示したように、ｐＴＡＭ
Ｔ４およびｐＴＡＭＴ６の構築のためにMung Bean Nucl
ease処理した部分（◇）は、他のＭＴ遺伝子間の配列
（○）と比較して四角で囲った部分で１bpだけ短くなっ
ている。

【００２２】以上のとおりに構築した各ベクターの、Ｍ
Ｔ単量体コード配列を含むＤＮＡ断片（ＥcoＲＩ−Ｈin
dIII断片）の塩基配列を、各々図５〜図９に示す。各配
列中、下線部がＭＴ単量体のコード配列であり、この配
列は配列番号１のアミノ酸配列をコードしている。 参考例３：ＭＴ単量体発現ベクター（Ｐ_R プロモータ
ー）の構築 図１０に工程図を示した方法により、Ｐ_R プロモーター
（熱誘導プロモーター）によるＭＴ単量体発現ベクター
ｐＲＫＭＴ１を構築した。すなわち、図１１に構成図を
示したｐＲＬＫ14−ｍ１（Gene 51:255-267, 1987; J.
Biotech. 2:289-301, 1985）をＥcoＲＩとＸbaＩで切断
し、電気泳動後、ベクター断片（Ｐ_R プロモーター、 g
alＫ遺伝子、4.4kb 、1.6 μg ）を取得した。同時に、
参考例２で構築したｐＴＡＭＴ１（２μg ）をＥcoＲＩ
とＸbaＩで切断し、電気泳動後、小断片（ＭＴ遺伝子１
個、213bp 、0.7 μg ）を取得した。そして両者を結合
することによって、ｐＲＫＭＴ１を構築した。

【００２３】また、ｐＲＬＫ14−ｍ１のＥcoＲＩ−Ｘba
Ｉ断片（4.4kb ）と参考例２で構築したｐＴＡＭＴ４の
ＥcoＲＩ−ＸbaＩ断片（ＭＴ遺伝子４個、762bp ）を結
合して、ＭＴ遺伝子４個をタンデムに保有するｐＲＫＭ
Ｔ４を構築した。さらに、ｐＲＬＫ14−ｍ１のＥcoＲＩ
−ＸbaＩ断片（4.4kb ）と参考例２で構築したｐＴＡＭ
Ｔ６のＥcoＲＩ−ＸbaＩ断片（ＭＴ遺伝子６個、1277b
p）を結合して、ＭＴ遺伝子６個をタンデムに保有する
ｐＲＫＭＴ６を構築した。 実施例１：リンカー配列の作成 図１２上段に塩基配列を示したリンカー配列を合成し
た。このリンカー配列は、全長47bpで、ＭＴのＣ末端の
一部（８アミノ酸）と３個のＧly、ＭＴのＮ末端の３ア
ミノ酸をコードしている。またこのリンカー配列は、図
１２下段に示したように、ＭＴ２量体および４量体を構
築するための３つの制限酵素サイト（ＳpeＩ、ＢglII、
ＨindIII）が設けられている。作成方法は次の通りであ
る。先ず、４つの部分（ＭＴＬ１〜４）に分けて合成
し、このＭＴＬ１〜４の各一本鎖ＤＮＡをそれぞれ４nm
olずつ分取し、混合した。そして、Ｔ４ Polynucleotid
e Kinaseを用いて、各一本鎖ＤＮＡの5'- 末端をリン酸
化し、ライゲーションを行い、Ｐhe／Ｃhl処理後、Ｅｔ
ＯＨ沈殿を行った。この状態の合成鎖は47bp以上の長鎖
であるため、ＳpeＩおよびＨindIIIで切断して目的サイ
ズとしたのち、再びＰhe／Ｃhl処理後、ＥｔＯＨ沈殿を
行い、10μl のＴＥバッファーに溶解し、リンカー配列
を得た。 実施例２：ＭＴ２量体発現ベクター（ｔａｃプロモータ
ー）の構築 図１３に示した方法により、ＭＴ２量体発現ベクターｐ
ＴＡＭＴＬ２を構築した。

【００２４】参考例２で構築したｐＴＡＭＴ１（ＭＴ遺
伝子１個、4749bp、２μg ）をＮheＩとＨindIIIで切断
し、電気泳動後、ベクター断片（4687bp、1.4 μg ）を
取得した。これと、実施例１で作成したリンカー配列を
結合させ、ｐＴＡＭＴ１−Ｌ（4734bp）を構築した。な
お、ベクター断片とリンカー配列の結合はベクター側の
ＮheＩサイトとリンカー配列側のＳpeＩサイトの結合に
よってなされ、結合後は両者とも制限酵素サイトではな
くなる。このように、リンカー配列を結合させた部位の
制限酵素サイトを破壊することによって、ＭＴ多量体を
コードする組換えベクターの構築を可能とした。ベクタ
ー構築後、塩基配列の決定を行い、リンカー配列が正し
く合成されていることを確認した。

【００２５】次に、このｐＴＡＭＴ１−Ｌ（4734bp、２
μg ）をＢglIIで切断し、電気泳動後、ベクター断片
（4734bp、1.2 μg ）を取得した。同時に、ｐＴＡＭＴ
１（２μg ）をＢamＨＩで切断し、電気泳動後、小断片
（ＭＴ遺伝子１個、186bp 、0.5 μg ）を取得した。両
者のＢglIIおよびＢamＨＩを結合させ、ｐＴＡＭＴＬ２
（ＭＴ２量体遺伝子、4920bp）を構築した。この場合に
も、ＢglIIとＢamＨＩの結合によって制限酵素サイトを
破壊した。ベクター構築後、ＭＴ遺伝子＋リンカー配列
＋ＭＴ遺伝子（ＭＴ２量体遺伝子）が正しい方向に挿入
されていることを、ＰstＩ断片の長さ（202bp ）で確認
した。また、ベクターのＥcoＲＩ−ＨindIII断片をｐＢ
luescriptII ＳＫ＋ベクターに組み込んだ後、414bp の
塩基配列を決定し、図１４の塩基配列であることを確認
した。 実施例３：ＭＴ４量体発現ベクター（ｔａｃプロモータ
ー）の構築 図１３に示した方法により、ＭＴ４量体発現ベクターｐ
ＴＡＭＴ４２を構築した。

【００２６】実施例２で構築したｐＴＡＭＴ１−Ｌ（47
34bp、２μg ）をＢamＨＩとＢglIIで切断し、電気泳動
後、小断片（ＭＴ遺伝子１個＋リンカー配列、189bp 、
0.6μg ）を取得した。これを、ｐＴＡＭＴ１−ＬのＢg
lII開列部位に挿入結合し、ｐＴＡＭＴＬ−２（ＭＴ２
量体遺伝子＋リンカー配列、4923bp）を構築した。次
に、このｐＴＡＭＴ２−Ｌ（4923bp、２μg ）をＢamＨ
ＩとＢglIIで切断し、電気泳動後、ベクター断片（4911
bp、1.5 μg ）を取得した。同時に、実施例２で構築し
たｐＴＡＭＴ２（２μg ）をＢamＨＩとＨindIIIで切断
し、電気泳動後、小断片（ＭＴ２量体遺伝子、387bp 、
0.8 μg ）を取得した。両者を結合させ、ｐＴＡＭＴＬ
４（ＭＴ４量体遺伝子、5298bp）を構築した。ベクター
構築後、ＥcoＲＩ−ＨindIII断片をｐＢluescriptII Ｓ
Ｋ＋ベクターに組み込み、792bp の塩基配列を決定し、
図１５の塩基配列であることを確認した。 実施例４：ＭＴ２量体発現ベクター（Ｐ_R プロモータ
ー）の構築 図１６に示した方法により、ＭＴ２量体発現ベクターｐ
ＲＫＭＴＬ２を構築した。

【００２７】ｐＢluescriptII ＳＫ＋ベクター（2961b
p、２μg ）をＥcoＲＩとＨindIIIで切断し、電気泳動
後、ベクター断片（2949bp、1.3 μg ）を取得した。同
時に実施例２で取得したｐＴＡＭＴＬ２をＥcoＲＩとＨ
indIIIで切断し、電気泳動後、小断片（ＭＴ２量体遺伝
子、408bp 、1.2 μg ）を取得した。両者を結合し、ｐ
ＢＳＭＴＬ２（3357bp）を構築した。これにより、ＭＴ
２量体遺伝子のＥcoＲＩ−ＫpnＩによる切り出しが可能
となる。

【００２８】ｐＵＣ19（2689bp）をＥcoＲＩとＫpnＩで
切断し、電気泳動後、ベクター断片（2674bp、1.5 μg
）を取得した。同時にｐＢＳＭＴＬ２をＥcoＲＩとＫp
nＩで切断し、電気泳動後、小断片（ＭＴ２量体遺伝
子、444bp 、0.9 μg ）を取得した。両者を結合し、ｐ
ＵＣＭＴＬ２（3118bp）を構築した。次に、ｐＲＫＭ14
−ｍ１（Ｐ_R ：Ｐ_L プロモーター、 galＫ遺伝子、5.2k
b 、２μg ）をＥcoＲＩとＸbaＩで切断し、電気泳動
後、ベクター断片（Ｐ_R プロモーター、gal Ｋ遺伝子、
4.4kb 、1.5 μg ）を取得した。同時にｐＵＣＭＴＬ２
（２μg ）をＥcoＲＩとＸbaＩで切断し、電気泳動後、
小断片（ＭＴ２量体遺伝子、459bp 、0.9 μg ）を取得
した。両者を結合し、ｐＲＫＭＴＬ２（4.8kb ）を構築
した。 実施例５：ＭＴ４量体発現ベクター（Ｐ_R プロモータ
ー）の構築 図１６に示した方法により、ＭＴ４量体発現ベクターｐ
ＲＫＭＴＬ４を構築した。

【００２９】ｐＢluescriptII ＳＫ＋ベクター（2961b
p、２μg ）をＥcoＲＩとＨindIIIで切断し、電気泳動
後、ベクター断片（2949bp、1.3 μg ）を取得した。同
時に実施例３で取得したｐＴＡＭＴＬ４をＥcoＲＩとＨ
indIIIで切断し、電気泳動後、小断片（ＭＴ４量体遺伝
子、786bp 、1.2 μg ）を取得した。両者を結合し、ｐ
ＢＳＭＴＬ４（3735bp）を構築した。これにより、ＭＴ
４量体遺伝子のＥcoＲＩ−ＫpnＩによる切り出しが可能
となる。

【００３０】ｐＵＣ19（2689bp）をＥcoＲＩとＫpnＩで
切断し、電気泳動後、ベクター断片（2674bp、1.5 μg
）を取得した。同時にｐＢＳＭＴＬ４をＥcoＲＩとＫp
nＩで切断し、電気泳動後、小断片（ＭＴ４量体遺伝
子、822bp 、１μg ）を取得した。両者を結合し、ｐＵ
ＣＭＴＬ４（3496bp）を構築した。次に、ｐＲＫＭ14−
ｍ１（Ｐ_R ・Ｐ_L プロモーター、gal Ｋ遺伝子、5.2kb
、２μg ）をＥcoＲＩとＸbaＩで切断し、電気泳動
後、ベクター断片（Ｐ_R プロモーター、gal Ｋ遺伝子、
4.4kb 、1.5 μg ）を取得した。同時にｐＵＣＭＴＬ４
（２μg ）をＥcoＲＩとＸbaＩで切断し、電気泳動後、
小断片（ＭＴ４量体遺伝子、837bp 、1.1 μg ）を取得
した。両者を結合し、ｐＲＫＭＴＬ４（5.2kb ）を構築
した。 実施例６：タンパク質の発現 参考例２で作成したｐＴＡＭＴ１、ｐＴＡＭＴ２、ｐＴ
ＡＭＴ４、ｐＴＡＭＴ６、実施例２で作成したｐＴＡＭ
ＴＬ２および実施例３で作成したＴＡＭＴＬ４の各ベク
ターで、定法によりＥ.coli ＪＭ109 株を形質転換し、
この形質転換体からタンパク質を発現させた。

【００３１】先ず、各形質転換体を一晩振盪培養した前
培養液30μl をＡmp100 μg/ml入り３mlＬＢ培地に加
え、37℃で振盪培養した。２時間後、終濃度がそれぞれ
１mMのＩＰＴＧおよび亜鉛（ZnSO₂ ）を加えた。次い
で、３時間後および６時間後の２回に分けてタンパク質
発現後の大腸菌を集菌し、超音波破砕後、粗抽出液の状
態でＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色と銀染色の二
重染色を行った。

【００３２】結果は図１７に示したとおりである。３時
間後および６時間後ともＭＴ２量体および４量体の発現
が観察された（図１７の△印）。単量体の発現はわずか
に認められた。この単量体は、ゲル上では他のタンパク
質と重なるために判別しにくいが、ＨＰＬＣでの分離に
より発現が確認された。 実施例７：ＭＴ２量体、４量体の取得 参考例２のｐＴＡＭＴ１およびｐＴＡＭＴ６、実施例２
のｐＴＡＭＴＬ２、実施例３のＴＡＭＴＬ４の各ベクタ
ーで定法によりＥ.coli ＪＭ109 株を形質転換し、各形
質転換体を一晩振盪培養した前培養液30μl をＡmp100
μg/ml入り３mlＬＢ培地に加え、37℃で振盪培養し、２
時間後、終濃度がそれぞれ１mMのＩＰＴＧおよび亜鉛
（ZnSO₂ ）を加え、６時間後に超音波破砕し、15000rp
m、５分間、４℃で遠心分離して可溶性画分および不溶
性画分への分画を行った。

【００３３】また、参考例３のｐＲＫＭＴ１およびｐＲ
ＫＭＴ６、実施例４のｐＲＫＭＴＬ２、実施例５のＲＫ
ＭＴＬ４の各ベクターで定法によりＥ.coli ＪＭ109 株
を形質転換し、各形質転換体を一晩振盪培養した前培養
液30μl を３mlＬＢ培地に加え、28℃で２時間培養後、
温度を37℃に昇温して５時間培養した後、超音波破砕
し、15000rpm、５分間、４℃で遠心分離して可溶性画分
および不溶性画分への分画を行った。

【００３４】それぞれの画分の試料についてＳＤＳ−Ｐ
ＡＧＥを行い、ＣＢＢ染色と銀染色の二重染色を行っ
た。結果は図１８に示したとおりである。ＭＴ２量体お
よび４量体とも不溶性画分（遠心分離による沈殿物）に
分離された。発現量は、ｔａｃプロモーター系ベクター
（ｐＴＡＭＴＬ２、ｐＴＡＭＴＬ４）が高く、取得され
たＭＴ２量体および４量体は全タンパク質の約10％を占
めていた。

【００３５】次に、不溶性画分中のＭＴ２量体および４
量体について、可溶化条件を検討した。可溶化のための
試薬として、10mM 2−メルカプトエタノール（ＭＥ）、
８Ｍ尿素（Urea）、６Ｍ塩酸グアニジン（Gu）、１％ T
riton Ｘ−100 （Triton）を用い、各試薬は50mM Tris-
HCl （pH8.0 ）溶液で調製した。先ず、２量体、４量体
を含む不溶性の沈殿をそれぞれの試薬溶液中（30μl ）
に懸濁し、1.5 時間室温で静置した。15000rpm、５分
間、４℃で遠心分離を行い、再び可溶性画分と不溶性画
分とに分離し、可溶化の有無をＳＤＳ−ＰＡＧＥで確認
した。得られたバンドはＣＢＢ染色と銀染色とによって
二重染色した。

【００３６】結果は図１９に示したとおりであり、10mM
2−メルカプトエタノールが最も良好な溶出パターンを
示した。また、１％ Triton Ｘ−100 を用いた場合にも
31kDa 付近に可溶化されたタンパク質のバンドが見られ
たが、このバンドは２量体および４量体ともに同じ位置
であるため、菌体由来の膜タンパク質であると考えられ
る。

【００３７】さらに、同じＳＨ基還元試薬であるＤＴＴ
（ジチオトレイトール）と２−メルカプトエタノールの
溶出効果を比較した。濃度は両者とも10mMとし、溶出時
間の検討も同時に行った。結果は図２０に示したとおり
であり、ＤＴＴを用いた場合のほうが溶出効率が高かっ
た。また、溶出時間は１時間で十分であることが確認さ
れた。

【００３８】なお、以上の方法により得られたＭＴ２量
体、４量体はＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいてブロードなバン
ドを形成したが、Ｃysのチオール基をカルボキシメチル
化することによってシャープなバンドを得ることが可能
であった。すなわち、ＭＴ単量体（ＧＳＴ融合ＭＴをフ
ァクターＸａで切断したもの）、２量体および４量体タ
ンパク質溶液（各10μl ）に、２μl 0.2 Ｍ Tris-HCl
(pH8.8) 、８％ＳＤＳ、40％グリセロール、２μl 0.2M
ＤＴＴを添加し、５分間 100℃で熱した後、急冷した。
４μl １Ｍヨード酢酸溶液（pH8.0 ）を加えて50℃で30
分間インキュベートしてそれぞれをカルボキシメチル化
し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで泳動パターンを確認した。結果
は図２１に示したとおりであり、カルボキシメチル化し
たＭＴはシャープなバンドを形成した。このことから、
単量体、２量体および４量体とも単一のタンパク質とし
て発現されていることが判明した。

【００３９】以上の結果から、ＭＴ多量体の好ましい取
得方法をまとめると、図２２のとおりである。すなわ
ち、２回のＩＰＴＧ添加によりタンパク質を誘導し、同
時に亜鉛を培地に加えてタンパク質の安定化を行う。そ
して、不溶性画分から分離された２量体、４量体を1mM
のＤＴＴで洗浄した後、10mMのＤＴＴで溶出し、最終的
に上清中からＭＴ２量体、４量体を回収する。なお、1m
M ＤＴＴでの洗浄は、目的とする２量体、４量体以外の
非特異的なタンパク質を除去するために有効である。 実施例８：ＭＴ多量体の重金属結合活性の検討 実施例７で取得したＭＴ２量体および４量体について、
重金属の結合能を試験した。 (1) 試料の調製 実施例７で取得したＭＴ２量体、４量体をぞれぞれ0.5M
のHCl で５mlにメスアップし、測定試料とした。各試料
100ml に対して５g のChelex 100 Resin（Bio-Rad 社
製）を加え、１時間撹拌した後にフィルターでChelex 1
00 Resinを除去した。 (2) タンパク質の定量 改変Folin-Lowry 法（Analytical Biochemistry 54:304
-306, 1973）を用いて行った。試料溶液40μl にReagen
t Ｄを40μl 加えた後、Reagent Ｃを20μl 加えて30分
間室温で反応させ、次いで、Reagent Ｂを500 μl 加
え、10分間室温で反応させた後、Reagent Ｅを50μl 加
え、30分後に750nm で吸光度を測定した。 (3) 重金属含有量の測定 原子吸光光度計ＳＡＳ 7500A Atomic Absorption Spect
rophotometer（セイコー電子工業社製）を用い、そのプ
ロトコールに従って行った。 (4) 結果 結果は表１に示したとおりである。この表１から明らか
なように、カドミウムおよび亜鉛について、ＭＴ４量体
は２量体の約２倍の重金属を含有することが確認され
た。

【００４０】

【表１】

【００４１】

【発明の効果】以上詳しく説明したとおり、この発明に
よって、新規なメタロチオネイン多量体とその製造方法
が提供される。このメタロチオネイン多量体は、全タン
パク質の１０％以上もの高レベルで取得することが可能
であり、その優れた重金属結合能によって、汚染土壌や
汚染水等の環境修復のための材料としても有用である。

【００４２】

【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：６１ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 配列 Met Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala 1 5 10 15 Gly Ser Cya Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser 20 25 30 Cys Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys 35 40 45 Ile Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala 50 55 60 配列番号：２ 配列の長さ：６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：cDNA to mRNA 起源 生物名：ホモサピエンス 配列 Asp Pro Asn Cys Ser Cys Ala Ala Gly Asp Ser Cys Thr Cys Ala Gly 1 5 10 15 Ser Cya Lys Cys Lys Glu Cys Lys Cys Thr Ser Cys Lys Lys Ser Cys 20 25 30 Cys Ser Cys Cys Pro Val Gly Cys Ala Lys Cys Ala Gln Gly Cys Ile 35 40 45 Cys Lys Gly Ala Ser Asp Lys Cys Ser Cys Cys Ala 50 55 60

【図面の簡単な説明】

【図１】合成ヒトＭＴII遺伝子の作成方法を示した塩基
配列（上段）と、工程図（下段）である。

【図２】ＭＴ単量体発現ベクター（ｔａｃプロモータ
ー）の構築方法を示した工程図である。

【図３】プラスミドベクターｐＴＴＱ18の構成図であ
る。

【図４】別のＭＴ単量体発現ベクター（ｔａｃプロモー
ター）の構築方法を示した工程図である。

【図５】ｐＴＡＭＴ１（ＭＴ単量体遺伝子１個）のＥco
ＲＩ−ＨindIII断片の塩基配列と（上段）と、この配列
中にコードされたＭＴ単量体のアミノ酸配列（下段）で
ある。

【図６】ｐＴＡＭＴ２（ＭＴ単量体遺伝子２個）のＥco
ＲＩ−ＨindIII断片の塩基配列である。

【図７】ｐＴＡＭＴ３（ＭＴ単量体遺伝子３個）のＥco
ＲＩ−ＨindIII断片の塩基配列である。

【図８】ｐＴＡＭＴ４（ＭＴ単量体遺伝子４個）のＥco
ＲＩ−ＨindIII断片の塩基配列である。

【図９】ｐＴＡＭＴ６（ＭＴ単量体遺伝子６個）のＥco
ＲＩ−ＨindIII断片の塩基配列である。

【図１０】ＭＴ単量体発現ベクター（Ｐ_R プロモータ
ー）の作成方法を示した工程図である。

【図１１】プラスミドベクターｐＲＬＫ14−ｍ１の構成
図である。

【図１２】この発明のＭＴ多量体発現ベクターを構築す
るために使用したリンカー配列の塩基配列（上段）と、
その合成過程を示した工程図（下段）である。

【図１３】この発明のＭＴ多量体発現ベクター（ｔａｃ
プロモーター）の構築方法を示した工程図である。

【図１４】ｐＴＡＭＴＬ２（ＭＴ２量体遺伝子）のＥco
ＲＩ−ＨindIII断片の塩基配列と（上段）と、この配列
中にコードされたＭＴ２量体のアミノ酸配列（下段）で
ある。

【図１５】ｐＴＡＭＴＬ４（ＭＴ４量体遺伝子）のＥco
ＲＩ−ＨindIII断片の塩基配列と（上段）と、この配列
中にコードされたＭＴ４量体のアミノ酸配列（下段）で
ある。

【図１６】この発明のＭＴ多量体発現ベクター（Ｐ_R プ
ロモーター）の構築方法を示した工程図である。

【図１７】ＭＴ単量体、２量体、４量体の各発現ベクタ
ーによる形質転換大腸菌からのタンパク質発現の経時変
化を示したＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動パターンである。

【図１８】ＭＴ単量体、２量体、４量体の各発現ベクタ
ーによる形質転換大腸菌を破砕し、遠心分離した上清
（ｓ）および沈殿（ｐ）におけるタンパク質発現を測定
したＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動パターンである。

【図１９】２量体、４量体の上清（ｓ）および沈殿
（ｐ）におけるタンパク質可溶化効果を比較したＳＤＳ
−ＰＡＧＥ泳動パターンである。

【図２０】２量体、４量体の上清（ｓ）および沈殿
（ｐ）におけるタンパク質の２−メルカプトエタノール
とＤＴＴの可溶化効果を比較したＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動
パターンである。

【図２１】２量体、４量体をそれぞれカルボキシメチル
化した後のＳＤＳ−ＰＡＧＥ泳動パターンである。

【図２２】この発明のＭＴ２量体、４量体の製造方法を
例示した工程図である。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19） Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA03 AA07 BA21 BA80 CA04 DA06 EA04 GA11 HA01 4B064 AG02 CA02 CD01 CE02 CE08 DA01 DA17 4B065 AA26X AA93Y BA02 BD16 CA24 CA44 CA56 4H045 AA10 AA20 AA30 BA10 CA40 DA01 EA20 EA65 FA74 GA01 HA31

Claims (15)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 メタロチオネインがｎ個連結した多量体
   であって、隣接する各メタロチオネインのＣ端アミノ酸
   残基とＮ端アミノ酸残基が３個のアミノ酸残基Ｘaaによ
   り結合しているメタロチオネイン多量体。
2. 【請求項２】 メタロチオネインが、ヒト由来のメタロ
   チオネインである請求項１のメタロチオネイン多量体。
3. 【請求項３】 第１番目メタロチオネインが配列番号１
   のアミノ酸配列からなり、第２、３、４・・・ｎ番目メ
   タロチオネインが配列番号２のアミノ酸配列からなる請
   求項２のメタロチオネイン多量体。
4. 【請求項４】 ＸaaがＧlyである請求項１ないし３のい
   ずれかのメタロチオネイン多量体。
5. 【請求項５】 ｎが２である請求項１ないし４のいずれ
   かのメタロチオネイン多量体。
6. 【請求項６】 ｎが４である請求項１ないし４のいずれ
   かのメタロチオネイン多量体。
7. 【請求項７】 メタロチオネインをコードする遺伝子を
   ｎ個保有する組換えベクターであって、隣接する各遺伝
   子の３’端と５’端の間に３個のアミノ酸残基Ｘaaをコ
   ードするオリゴヌクレオチドが挿入されている組換えベ
   クター。
8. 【請求項８】 メタロチオネインをコードする遺伝子
   が、ヒトゲノムＤＮＡから調製されたｃＤＮＡである請
   求項７の組換えベクター。
9. 【請求項９】 第１番目ｃＤＮＡが配列番号１のアミノ
   酸配列をコードするｃＤＮＡであり、第２、３、４・・
   ・ｎ番目ｃＤＮＡが配列番号２のアミノ酸配列をコード
   するｃＤＮＡである請求項８の組換えベクター。
10. 【請求項１０】 ＸaaがＧlyである請求項７ないし９の
    いずれかの組換えベクター。
11. 【請求項１１】 ｎが２である請求項７ないし１０のい
    ずれかの組換えベクター。
12. 【請求項１２】 ｎが４である請求項７ないし１０のい
    ずれかの組換えベクター。
13. 【請求項１３】 請求項７ないし１２のいずれかの組換
    えベクターを宿主細胞に導入して細胞を形質転換し、こ
    の形質転換細胞の産生するメタロチオネイン多量体を単
    離精製することを特徴とするメタロチオネイン多量体の
    製造方法。
14. 【請求項１４】 宿主細胞が大腸菌である請求項１３の
    製造方法。
15. 【請求項１５】 メタロチオネイン多量体をジチオトレ
    イトールにより可溶化して単離精製する請求項１３また
    は１４の製造方法。