CN101255426A - 一个新的人类睾丸特异性基因tdrg1 - Google Patents
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Abstract
运用“数据库消减杂交”的方法克隆了一个新的人类睾丸特异性基因TDRG1，它的cDNA全长为1197bp，编码100个氨基酸。TDRG1基因仅在人睾丸组织中表达，且在青少年睾丸组织中强表达，胎儿和老年睾丸组织中表达明显减弱，表明该基因与男性性成熟与生精功能相关，有望成为诊治男性不育症的新靶点，为开发治疗男性不育症的新药物提供思路。
Description
技术领域：
本发明涉及人类基因，具体是一个新的睾丸特异性基因TDRG1的cDNA全长克隆，并明确了该基因编码的氨基酸序列以及在人体多种组织、不同发育阶段睾丸组织中的表达谱。
背景技术：
根据WHO(1986)人类生殖研究发展和培训特别规划署研究报告，在发达国家不育夫妇占已婚育龄夫妇的15％，而男性不育又占不育夫妇的43％。研究表明，男性不育发生和发展是一个多基因参与的过程，约2000个不同的基因参与了男性生殖及其调节过程，包括：睾丸发育、生殖细胞分化、减数分裂以及精子发生的各个阶段。这些基因有的位于性染色体，有的则定位于常染色体。因此，发现和研究与生精相关的新基因，成为了进一步揭示男性生精过程的分子机制的关键，也可能为诊治男性不育症提供新的思路。
人类基因组图谱公诸于世后，以计算机和互联网为工具，利用现有的表达序列标签(expressed sequence tag，EST)和生物信息数据库，对人类基因组未知功能新基因的发掘和蛋白质功能分析已成为近年研究的热点。美国NCBI的Unigene数据库中拥有大量的EST，它们来源于不同组织、不同细胞、不同病理状态下所构建的cDNA(complementary DNA)文库，已成为人们寻找新基因的重要标志物。运用：“数据库消减杂交”(Digital Differential Display，DDD)方法对不同文库进行比较，获得在统计学意义上存在明显差异的代表新基因的克隆重叠群，并结合实验验证克隆新基因的方法是目前发掘新基因的常用手段之一。
发明内容：
本发明的目的在于提供了一个新的睾丸特异性基因TDRG1的的cDNA全长序列，并明确了其编码的氨基酸序列，分析它在人体多种组织和不同发育阶段睾丸组织中的表达谱，以探索该基因在睾丸生精过程中所起的作用，进而开发治疗男性不育症的基因药物。
经互联网进入美国NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)的Unigene数据库，运用DDD方法进行数种平行材料之间的比较。以9个人类睾丸cDNA文库作为检测子(pool A)，76个其他组织或细胞株(如心、脾、肝、肺、脑、皮肤、肾、卵巢、骨骼肌、胸腺、前列腺、小肠、大肠等)来源的cDNA文库作为驱赶子(poolB)，通过pool A：pool B之间的比值来计算倍数差异，并以≥10倍的差异为筛选标准，经数据库消减杂交筛选获得可能存在表达差异的EST片段。选取了其中一个电子预测其可能在睾丸组织中特异表达的代表新基因的克隆重叠群(contig)Hs.180197，该EST族中包含BC071820.1、BC033995.2和BC042123.1，3个序列拼接后获得一条长度为1197bp的新序列。
以拼接后的新序列为探针，运用多种基因预测软件搜索EST和Unigene数据库，经互联网进入美国GenBank数据库，利用BLAST检索nr数据库和EST数据库进行归类、拼接、延长、查新，获得受人类基因组图谱支持的新基因的cDNA全长为1197bp。
以成人睾丸组织的总mRNA为模板，进行逆转录。依据电子克隆的新基因序列设计两对引物(P1/P2，P3/P4，见下文)在成人睾丸组织的cDNA文库中进行PCR扩增，以2％琼脂糖电泳检测PCR产物大小。将经琼脂糖电泳验证的PCR产物连接到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌JM109。重组克隆在AB1377-3自动测序仪上完成测序。结果表明两对引物均扩增成功，实验扩增产物的测序结果与电子克隆所获得的基因序列完全一致，从而实验验证了该基因在成人睾丸组织中的表达。
对睾丸、心脏、肝脏、脑、附睾、肺、肾、脾等人正常组织进行多组织半定量RT-PCR分析，结果表明该新基因仅在人睾丸组织中表达。多组织半定量Northern杂交分析亦显示仅在睾丸组织中有约1.19kb大小的阳性转录本存在。说明新克隆的基因为睾丸特异性表达的基因。用半定量RT-PCR分析新基因在人类不同发育阶段睾丸组织中的表达，发现新基因在4个月和6个月的胎儿睾丸中无表达，在15岁少年睾丸中强表达，在33岁青年睾丸中表达稍减弱，而在74岁老年男性睾丸组织中的表达明显减弱，从而提示该基因与男性性成熟与生精功能有关。因此，我们将该新基因全长cDNA序列提交到GeneBank，登录号为DQ168992，经国际人类基因命名委员会批准命名为TDRG1(Testis DevelopmentRelated Gene 1)。
TDRG1基因定位于6p211-6p21.2，整个基因跨越约1.8kb，包括2个外显子和1个内含子。该基因含有303bp(504-806bp)的完整开放阅读框，编码100个氨基酸，504-506bp处为起始密码子ATG，804-806bp处为终止密码子TAG，在ATG 5’端有1个同一相位的终止密码子TGA，3’端则有1个加尾信号AATAAA及poly A尾。
依据该基因的开放阅读框序列，构建大肠杆菌表达载体重组TDRG1蛋白，利用重组蛋白免疫小鼠，制备了抗TDRG1蛋白单克隆抗体。以抗TDRG1单克隆抗体为一抗，天然人睾丸组织裂解液为抗原，进行Western Blot检测。结果为阳性，表明人睾丸组织中有阳性的TDRG1蛋白表达。TDRG1蛋白包括100个氨基酸序列，分子量为17KD，无保守结构域，无跨膜区，无信号肽序列，推测为一非分泌性蛋白。对其修饰位点预测结果显示：可能含有1个蛋白激酶C磷酸化位点，2个酪蛋白激酶II磷酸化位点，3个N-肉豆蔻基化位点。对该蛋白质序列进行相似性比较，结果显示与其他已知蛋白质无明显同源性，表明该TDRG1基因及其编码蛋白质均是全新的。
本发明的优点：
1、克隆了一个人类睾丸特异性新基因TDRG1的全长cDNA序列，确定了其编码的氨基酸序列，初步阐明了该基因的功能，为下一步深入研究该基因功能提供了基础。
2、TDRG1基因与男性睾丸生精功能相关，有望成为诊治男性不育症的新靶点，为开发治疗男性不育症的新药物提供思路。
本发明通过以下附图和实施例作进一步阐述，但并不限制本发明的范围。
附图说明：
图1.TDRG1的cDNA核苷酸序列和其编码的氨基酸序列；
图2.RT-PCR实验验证电子克隆的新基因序列；
M：Marker；1：引物P1/P2；2：引物P3/P4
图3.TDRG1的多组织半定量RT-PCR；
M：Marker；1：睾丸；2：心脏；3：肝；4：脑；
5：附睾；6：肺；7：肾；8：脾.
图4.TDRG1的多组织Northern杂交；
M：Marker；1：成人脑；2：心脏；3：肝脏；4：肺；
5：脾脏；6：肾脏；7：睾丸；8：骨骼.
图5.TDRG1在不同发育阶段睾丸组织的半定量RT-PCR；
M：Marker；1：15岁人睾丸；2：33岁青年睾丸；3：74岁老年人睾丸；
4：4个月胎儿睾丸；5：6个月胎儿睾丸.
图6.Western Blot验证TDRG1蛋白；
M：Marker；
1、2、3抗原均为：人类睾丸裂解液；
抗体均为：抗-TDRG1单克隆抗体
具体实施方式：
实施例1实验验证TDRG1基因的cDNA序列
根据电子克隆的新基因序列设计P1/P2，P3/P4两对引物：
P1：sense 5’-GAAGAGGAGGGAGGCAGTCT-3’
P2：antisense 5’-GCCCAATTCCTCTTGACTGA-3’
P3：sense 5′-AAGGAGAGTGCCCTGCGTG-3′
P4：antisense 5′-TCCCTGAAGGTGGAGTGCTG-3′
PCR以成人睾丸组织的cDNA文库为模板。反应条件：94℃预变性5min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，完成30个循环，最后72℃延伸5min，置4℃保存。
以2％琼脂糖电泳检测PCR产物大小。将经琼脂糖电泳验证的PCR产物连接到pUCm-T载体上，转化大肠杆菌JM109。重组克隆在AB1377-3自动测序仪上完成测序。
实施例2TDRG1在全身多组织和不同发育阶段睾丸组织中的表达分析
利用上述P1/P2引物对在人各种组织cDNA文库中进行半定量RT-PCR，按逆转录试剂盒操作程序进行逆转录反应，反应体积20uL，模板RNA 1ug。以GAPDH基因作为内参。为较客观地反映mRNA表达的相对水平，在TDRG1基因及GAPDH的PCR平台期前结束PCR。采用下列反应条件进行：94℃预变性5min后，94℃变性30sec，58℃退火30sec，72℃延伸1min，完成30个循环，最后72℃延伸5min，置4℃保存。
利用上述同样的方法对新基因在不同发育阶段睾丸组织中的表达情况进行半定量RT-PCR。
实施例3多组织Northern杂交
(1)、用DDLK-010试剂盒标记GW探针，纯化后备用。
(2)、预杂交：将预制人全身多组织核酸印迹膜取出，放入杂交袋中三面封口，加入65℃预热的Hyb杂交液5mL，封口。放65℃水浴振荡杂交1小时。
(3)、杂交：将标记好的探针放100℃煮10～15分钟，立即放冰浴冷却10分钟。将预杂交袋从水浴中取出，尽量排干袋中的预杂交液，取5mLHyb杂交液，加入探针，混匀，加入到杂交袋中，封口，放65℃水浴振荡杂交过夜。
(4)、洗膜：剪开杂交袋，用镊子取出膜，放入装有20mL的2×SSC 0.1％SDS溶液的平皿中，在室温下振荡洗涤两次，每次5分钟。再将膜放入0.1×SSC01％SDS溶液(先放50℃水浴预热)中50℃水浴振荡洗涤两次，每次15分钟。用镊子将膜取出转入装有20mL洗涤缓冲液的平皿中振荡洗涤5分钟。
(5)、用20mL阻断封闭30分钟。
再将膜转入10mL抗体溶液中振荡孵育30分钟。
在20mL洗涤缓冲液中振荡洗涤两次，每次15分钟。
(6)、信号检测：将膜放20mL检测缓冲液中振荡平衡5分钟。
(7)、配制发光底物：按1∶100比例将CDP-STAR浓缩底物加入到检测缓冲液中，混匀。均匀加在膜上，室温反应5分钟，用X-光片曝光10-30分钟，记录结果。
Claims (1)
1、一个新的人类睾丸特异性基因TDRG1，其特征在于该人类新基因的cDNA核苷酸序列和编码氨基酸序列如下：
1 aagatcaggactgctgaaagaatgaagaagaacttacttggcctaggatg 50
51 tggctagagaacggagcgcactttcacttacctggcaaggtggttttgga 100
101 agtttccacggaagccttcccagggccgctgctgcccgtcctcgcctagg 150
151 tgtggagcttcccgaccggctggggagggaatgtcctgcgggagccgccg 200
201 aggaccctctttagcctcttccctggcttggctgcagctgcagtctggta 250
251 ctcgcccattctgctcttcttcacctccgtattttctctctcacggaaga 300
301 agaattccattctcccatcccaggaaggagagtgccctgcgtgccacgaa 350
351 agagcccaggacccacaggacaaatacgtcactggcagacctgccttcgc 400
401 cagcgccagcccatctctgaaacctccagcatttgtgccccggtccggcc 450
451 cctcccaggcctgactctttccgtgaacggtcactgcgcaggatcaagct 500
501 acaATGAAGAGGAGGGAGGCAGTCTGCGCGCACCGCCATTTTCTAGGAACT 550
M K R R E A V C A H R H F L G T
551 GGGAAGCCCCCCCACCCCTTAGGAAGATCCATCCCTGTGGAACCTTGCCCA 601
G K P P H P L G R S I P V E P C P
602 GGCTTACCAGCCTTTGCTGAGGTTGATCTATTGTCCCTCCTTGTCCCCATC 652
G L P A F A E V D L L S L L V P I
653 AAAATATCCAGCACTCCACCTTCAGGGAGTAGACTTGACCCTCAAATAGCA 703
K I S S T P P S G S R L D P Q I A
704 AGTTCAGCCTTCCCAGGTCTAGGTTCCCTGGGAGGTCAAGATTCGTCTGGT 754
S S A F P G L G S L G G Q D S S G
755 TCCTTAGTACAGAGGGCTAGCTGTGAGTTGGAATCCCCCTATGAGCTTTAG 806
S L V Q R A S C E L E S P Y E L *
807 aatcagtcaagaggaattgggccccttcccttcatccctcttcttttccct 857
858 ttttgtcccagagctcagctctgactcaaaagtttttccatttaccatcaa 908
909 catggaaacttggctcctcacgtaggtatattatcccccttttgtacatgg 959
960 tcttgttgatccaaactccctttctgtgaaagaggcctgtggggctcaaga 1010
1011 agcctggtcagccagccaggctagtcccacatacctcagaaccagtttaat 1061
1062 aaaaaaggctctatgtcattcttttttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1109
1110 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1160
1161 aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa 1197
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|---|---|---|---|---|
| CN106906215A (zh) * | 2017-02-20 | 2017-06-30 | 中国医科大学附属第医院 | 一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA‑TDRG1的siRNA和应用 |
| CN110170044A (zh) * | 2019-06-22 | 2019-08-27 | 江西省妇幼保健院 | Tat-tdrg1在制备治疗弱精子症药物中的应用 |
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2008
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