FI98705C - Monoklonaalinen vasta-aine intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi ruumiinnesteistä - Google Patents

Monoklonaalinen vasta-aine intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi ruumiinnesteistä Download PDF

Info

Publication number
FI98705C
FI98705C FI891953A FI891953A FI98705C FI 98705 C FI98705 C FI 98705C FI 891953 A FI891953 A FI 891953A FI 891953 A FI891953 A FI 891953A FI 98705 C FI98705 C FI 98705C
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
type iii
procollagen
amino
peptide
monoclonal antibody
Prior art date
Application number
FI891953A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI891953A0 (fi
FI891953L (fi
FI98705B (fi
Inventor
Volkmar Guenzler-Pukall
Dietrich Brocks
Rupert Timpl
Henning Hachmann
Juergen Puenter
Original Assignee
Hoechst Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hoechst Ag filed Critical Hoechst Ag
Publication of FI891953A0 publication Critical patent/FI891953A0/fi
Publication of FI891953L publication Critical patent/FI891953L/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI98705B publication Critical patent/FI98705B/fi
Publication of FI98705C publication Critical patent/FI98705C/fi

Links

Classifications

    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6887—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids from muscle, cartilage or connective tissue
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IG], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6878—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids in epitope analysis

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Materials By Optical Means (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Description

98705
Monoklonaalinen vasta-aine intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi ruumiinnesteistä 5 Prokollageenipeptidi (tyyppi III) (PIIIP) on kolla geenin (tyyppi III) aminoterminaalinen propeptidi, joka prokollageenimolekyylin (tyyppi III) erittymisen jälkeen hajoaa ekstrasellulaarisesti. Prokollageenipeptidi (tyyppi III) puolestaan on mahdollista hajottaa kollagenaasilla 10 edelleen osiksi Col 1, Col 2 ja Col 3, jotka voidaan eristää sinänsä tunnettujen proteiinikemiallisten menetelmien avulla (Nowack, H. et ai., Eur. J. Biochem. 70, 205-216 (1976), Bruckner, P. et ai., Eur. J. Biochem. 9(), 595-603 (1978)).
15 Tämän prokollageenipeptidin pitoisuus voidaan mää rittää ruumiinnesteistä radioimmunologisella määritysmenetelmällä, joka on kuvattu EP-patenttijulkaisussa no. 4940. Peptidin seerumikonsentraation tunteminen mahdollistaa ennusteet fibroottisten sairauksien, kuten esim. maksasai-20 rauksien, aktiivisuudesta (Rohde, H. et ai., Eur. J. Clin. Invest. 9, 451-459 (1979)).
Prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) tarkka, selektiivinen määritys seerumista ja muista ruumiinnesteistä on esitetty EP-patenttihakemuk-25 sessa 289 930. Tällöin ovat kuitenkin välttämättömiä monet sentrifugointivaiheet, jotka vaikeuttavat tämän testin käyttöä rutiinilaboratoriossa. Yksinkertaisemman suorituksen mahdollistaa Immunoradiometric Assay-testimenetelmä (IRMA). Tässä menetelmässä käytetään kahta vasta-ainetta, 30 joista toinen on sidottu kiinteään kantajaan, minkä johdosta saostusvaihe ja siten sentrifugointivaihe ja muutamia pipetointivaiheita jää pois. Yllättävästi löydettiin nyt monoklonaalinen vasta-aine, joka reagoi prokolla-geenifragmentin (tyyppi III) kanssa, joka tähän saakka ei 35 ole ollut geelisuodatuskromatografiassa erotettavissa oma- 2 98705 na piikkinään. Yhdistelmänä muiden monoklonaalisten tai polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa, jotka ovat spesifisiä prokollageenipeptidille (tyyppi III) ja/tai prokol-lageenille (tyyppi III), tämä vasta-aine mahdollistaa näi-5 den antigeenien määrittämisen IRMA-tekniikan avulla.
Keksintö koskee siten: 1. Monoklonaalista vasta-ainetta, jolla on kuviossa 2 esitetty reaktiomalli intaktia prokollageenia (tyyppi III) ja pN-kollageenia (prokollageeni, josta puuttuu C- 10 terminaalinen propeptidi (piikki la)), intaktia aminoter-minaalista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) (piikki 2a), aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joiden molekyylipainot ovat aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja Col l:n 15 (piikki 3a) molekyylipainojen välillä, sekä Col l:tä ja aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joilla on sama molekyylipaino kuin Col lrllä (piikki 4a), vastaan. Keksinnön mukaiselle vasta-aineelle on tunnusomaista, se mitä patenttivaatimuksessa 1 20 esitetään.
2. Hybridoma-solulinja ECACC 88030202, joka saadaan fuusioimalla myeloomalinjasta peräisin olevia soluja ja etukäteen prokollageenipeptidillä (tyyppi III) immunisoidun eläimen lymfosyyttejä ja joka tuottaa edellä 25 kuvattua vasta-ainetta.
3. Menetelmä keksinnön mukainen vasta-aineen valmistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 4 esitetään.
4. Menetelmä prokollageenipeptidin (tyyppi III) 30 kvantitatiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi keksin nön mukaisella vasta-aineella. Menetelmälle on tunnusoma-sita se, mitä patenttivaatimuksessa 6 esitetään.
5. Diagnostinen tarpeisto prokollageeni peptidin (tyyppi III) määrän määrittämiseksi ruumiinnesteistä, 35 joka muodostuu vaikuttavasta määrästä keksinnön mukaista
II
3 98705 monoklonaalista vasta-ainetta yksin tai yhdistelmänä muiden vasta-aineiden kanssa, erityisesti vaikuttavan määrän kanssa EP-patenttihakemuksessa 289 930 esitettyä mono klonaalista vasta-ainetta, seoksena diagnostisesti hyväk-5 syttävän kantajan kanssa. Tarpeistolle on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 12 esitetään.
Seuraavassa keksintöä valaistaan yksityiskohtaisesti, erityisesti edullisia suoritusmuotoja.
Monoklonaalisten vasta-aineiden valmistamiseksi 10 voidaan immunisoida eläimiä, edullisesti jyrsijöitä, kuten esim. hiiriä, rottia, kaneja, marsuja, prokollageenipep-tidillä (tyyppi III), joka on eristetty eurooppalaisen patentin 4940 menetelmän mukaisesti, adjuvantin läsnä ollessa. Erityisen edullisesti käytetään hiiriä, erityisesti 15 sellaisia, jotka kuuluvat SJL-kantaan. Immuunivastetta vahvistetaan toistetuilla sekundaari-injektioilla esimerkiksi 4-8 viikon välein. Immunisoinnin onnistumista kontrolloidaan määrittämällä vasta-aineiden pitoisuus radiologisella sitoutumistestillä (R. Timpl ja L. Risteli, Immu-20 nochemistry of the extracellular matrix, H. Furthmayr Ed., Voi 1, 199 (1982)). Muutamia päiviä ennen lymfosyyttien fuusiota myeloomasolulinjan kanssa eläimiä käsitellään prokollageenipeptidillä (tyyppi III) ilman adjuvanttia. Otetaan eläinten lymfosyytit ja fuusioidaan myeloomasolu-' 25 linjan kanssa, joka samoin voi olla peräisin jostakin edellä mainitusta eläinlajista, edullisesti kuitenkin hiirestä, erityisesti solulinjan P3X63AG8.653 kanssa. Edullisesti lymfosyytit fuusioidaan samojen lajien myeloo-masolulinjojen kanssa. Fuusio ja solukloonin jatkoviljely 30 suoritetaan ammattimiehen tuntemalla tavalla, jolloin so-luviljelynesteistä määritetään spesifisten vasta-aineiden pitoisuus immunologisella sitoutumistestillä. Tällä menetelmällä saaduista soluklooneista valitaan klooni käytettäväksi IRMA:ssa. Erityisen edullisesti käytetään solulin-35 jaa, joka valmistetaan fuusioimalla prokollageenipeptidil- 4 98705 lä (tyyppi III) immunisoiduista SJL-kannan hiiristä peräisin olevia lymfosyyttejä hiiren myeloomasolulinjan P3X63AG8.653 kanssa ja joka tuottaa monoklonaalista vasta-ainetta, jolla on kuviossa 2 esitetty reaktioinani. Tämä 5 solulinja talletettiin 2.3.1988 Budapestin sopimuksen ehdoilla kokoelmaan European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP40JG, U.K., numerolla 88 030 202.
10 Keksinnön mukaiset monoklonaaliset vasta-aineet kuuluvat IgG-proteiinien luokkaan. Alaluokan IgG2b vasta-aineet ovat erityisen edullisia käytettäviksi. Monoklonaa-listen vasta-aineiden ominaisuuksia selvennetään solulin-jasta ECACC 88030202 saadun monoklonaalisen vasta-aineen 15 PIIIP 226 avulla, kun seerumissa olevat antigeenit erotetaan geelisuodatuskromatografialla molekyylipainonsa perusteella ja kromatografiafraktiot käytetään radioimmunologiseen määritykseen (radioimmunoassay). Kuviossa 2 on esitetty geelisuodatuskromatografiän eluutioprofiili 20 monoklonaaliselle vasta-aineelle PIIIP 226, verrattuna polyklonaalisten vasta-aineiden eluutioprofiiliin. Piikki 1/la vastaa intaktia prokollageenia (tyyppi III) tai pN-kollageenia (tyyppi III) . Piikki 2/2a vastaa intaktia aminoterminaalista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) ja 25 tämän hajoamistuotteita, joilla on sama koko. Piikkiin 3a sisältyy prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, jotka antavat kromatogrammissa pienemmän piikin kuin prokollageenipeptidi (tyyppi III), kuitenkin selvästi suuremman kuin Col 1. Hajoamistuotteiden molekyylipainot 30 ovat siis kulloinkin välillä n. 45000 (prokollageenipeptidi) ja n. 10000 (Col 1). Piikki 4/4a vastaa Col l:tä sekä aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joilla on sama molekyylipaino kuin Col l:llä. Kävi ilmi, että antigeenifraktio, joka analyysissä 35 polyklonaalisten vasta-aineiden kanssa tarttuu mukaan ja
II
5 98705 jolla on hajoamistuotteen Col 1 molekyylipaino tai joka on Col 1, tarttuu keksinnön mukaiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen selvästi heikommin. Keksinnön mukaisella mono-klonaalisella vasta-aineella on siis spesifinen vaikutus 5 aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) epi-tooppia vastaan, jota ei ole Col l:ssä. Edelleen vasta-aine PIIIP 226 ei tunnista osaa antigeeneistä, jotka piikissä 2 tarttuvat polyklonaalisiin vasta-aineisiin siten, että piikin 2 kohdalla on vasta-aineella PIIIP 226 tunnis-10 tettavissa kaksi piikkiä (2a ja 3a). Piikkiä 3a ei havaita myöskään saksalaisessa patenttihakemuksessa esitetyllä vasta-aineella PIIIP 296.
Keksinnön mukaisten vasta-aineiden valmistamiseksi on tärkeää, että antigeenin saamiseksi on käytettävissä 15 sopiva lähde. Kuten jo on mainittu, eristetään ihmisen tai eläimen korkean puhtauden omaava prokollageenipeptidi (tyyppi III) edullisesti EP-patentin 4940 menetelmän mukaisesti hajottamalla kudokset tai patologiset ruumiinnesteet kollagenaasilla ja prokollageenipeptidi erotetaan 20 reaktioseoksesta ja puhdistetaan käyttäen kromatografisten menetelmien yhdistelmää ja/tai immunoadsorptiota.
Keksinnön mukaista monoklonaalista vasta-ainetta voidaan käyttää erilaisissa immunologisissa menetelmissä, mukaan lukien kaikki radioimmunologisen määrityksen muo-25 dot, esim. sekventiaalinen kyllästysanalyysi tai tasapai-noanalyysi, sekä muissa kompetitiivisissa ja ei-kompeti-tiivisisa sitoutumismääritysmentelmissä, kuten fluoresenssi-, entsyymi-, kemiluminesenssi- tai muut immunologiset määritysmenetelmät. Se soveltuu ennen kaikkea käytettäväk-30 si sandwich-menetelmissä immunoadsorbenssimenetelmien yh teydessä. Monoklonaalista vasta-ainetta voidaan siten käyttää immunologisissa menetelmissä prokollageenipeptidin (tyyppi III) eristämiseksi ja karakterisoimiseksi sekä kvantitatiiviseksi määrittämiseksi kudoksista ja ruumiin-35 nesteistä. Käytetään ammattimiehen sinänsä tuntemia mene- 6 98705 telmiä, edullisesti saattamalla nestemäinen näyte, joka sisältää prokollageenipeptidiä (tyyppi III), reaktioon keksinnön mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, joka on sidottu kiinteään matriisiin, joka on edullisesti 5 muovimateriaalia, erityisesti muoviputki, ja prokolla-geenipeptidin (tyyppi III) määrä määritetään sitoutumisen avulla polyklonaaliseen tai toiseen monoklonaaliseen vasta-aineeseen, edullisesti EP-patenttihakemuksessa 289 930 esitettyyn monoklonaaliseen vasta-aineeseen, joka on va-10 rustettu radioaktiivisella tai muulla leimalla. Tämä menetelmä voidaan suorittaa myös sitomalla polyklonaaliset tai monoklonaaliset vasta-aineet, erityisesti eurooppalaisessa patenttihakemuksessa 289 930 esitetty monoklonaalinen vasta-aine, kiinteään matriisiin ja saattamalla reaktioon 15 antigeenin kanssa, jolloin tämä antigeeni määritetään sitten kvantitatiivisesti leimatun keksinnön mukaisen vasta-aineen sitoutumisen perusteella. Näissä menetelmissä ei ole merkitystä sillä, onko prokollageenipeptidi (tyyppi III) vielä liittyneenä prokollageenin (tyyppi III) 20 aminopäähän vai ei. Tähän saakka immunologisessa määrityksessä polyklonaalisia vasta-aineita käyttäen prokolla-geenipeptidin (tyyppi III) häiritsevät hajoamistuotteet, erityisesti Col 1, eivät kuvatussa testisysteemissä tule mukaan.
25 EP-patenttihakemuksessa 289 930 esitetyllä monoklo- naalisella vasta-aineella on kuviossa 3 esitetty reaktio-malli intaktia prokollageenia (tyyppi III) ja pN-kollagee-nia (prokollageeni, josta puutttuu C-terminaalinen propep-tidi, piikki 4a) , intaktia aminoterminaalista prokollagee-30 nipeptidiä (tyyppi III) (piikki 5a) sekä Col l:tä ja aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joilla on sama molekyylipaino kuin Col l:llä (piikki 6a), vastaan.
Tämän monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi 35 menetellään pääasiassa, kuten edellä on kuvattu. Erityisen
II
7 98705 edullisesti käytetään solulinjaa, joka valmistetaan pro-kollageenipeptidillä (tyyppi III) immunisoiduista SJL-kan-nan hiiristä peräisin olevien lymfosyyttien fuusiolla hiiren myeloomasolulinjan P3X63AG8.653 kanssa. Tämä solulinja 5 on talletettu kokoelmaan European Collection of Animal Cell Cultures (ECACC), PHLS Centre for Applied Microbiology and Research, Porton Down, Salisbury, SP40JG, U.K. numerolla 87042308.
Seuraavissa esimerkeissä keksintöä valaistaan lä-10 hemmin. Prosenttiarvot perustuvat painoon ellei toisin ole ilmoitettu.
Esimerkki 1
Prokollageenipeptidin (tyyppi III) valmistus
Prokollageenipeptidi (tyyppi III) valmistetaan an-15 tamalla kollagenaasin vaikuttaa prokollageeniin (tyyppi III) 37 °C:ssa. Tällöin peptidi ei joudu alttiiksi denaturoiville aineille. Suurempien peptidimäärien valmistamiseksi käytetään modifioitua menetelmää. Kaikki menetelmä-vaiheet aina kollagenaasin vaikutukseen saakka suoritetaan 20 kylmähuoneessa. Eri NaCl-liuokset, joita käytetään liukoiseksi tekemiseen, sisältävät 0,05 M Tris-HCl:ää, pH 7,4, 0,01 M EDTA:aa, natriumatsidia (200 mg/ml) ja proteaasi-inhibiittoreita, fenyylimetyylisulfonyylifluoridia (3 pg/ ml) ja p-kloorimerkuribentsoaattia (3 pg/ml).
25 Fetaalista vasikan ihoa (3 kg) homogenisoidaan 10 l:ssa NaCl:a ja uutetaan kaksi päivää. Liukoinen kollageeni saostetaan uuttoliuoksesta lisäämällä kiinteää NaCl:a siten, että loppukonsentraatio on 2,5 M. Sekoittamisen jälkeen yli yön sakka kerätään sentrifugoimalla (1800 x g, 30 20 minuuttia), pestään kaksi kertaa 2,5 M NaCl:lla ja liuotetaan uudelleen sekoittamalla yli yön 10 l:ssa 0,5 M NaClra. Pienet määrät liukenematonta materiaalia poistetaan sentrifugoimalla. Siten saatu kollageenin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) seos saostetaan 1,6 M 35 NaCl:lla. Sakka suspendoidaan sitten 2 Iraan 0,05 M Tris- 8 98705 HCl:ää (pH 8,0) ja kuumennetaan 0,02 M CaCl2:n lisäyksen jälkeen 20 min 50 °C:ssa ja inkuboidaan sen jälkeen 3 tuntia 37 °C:ssa yhdessä 1500 U:n kanssa bakteeriperäistä kollageenia (CLSPA, Worthington, USA) grammaa kohti koste-5 aa sakkaa. Kollagenaasin vaikutuksen jälkeen erotetaan muodostunut sakka sentrifugoimalla ja liuos dialysoidaan 0, 005 M Tris-HClrää, pH 8,0, 6, 8 M virtsa-ainetta vastaan ja pannaan DEAE-selluloosapylvääseen (5,0 x 30 cm), joka oli tasapainotettu samalla puskurilla.
10 Pylvääseen sitoutuneet proteiinit pestään pois
NaCl-liuoksella, jonka konsentraatio lisääntyy 0-0,3 M. Kokonaiseluutiomäärä on 2 1. Pylväästä ulos virtaava liuos testataan absorption suhteen 236 nm:ssä ja antigeeniaktii-visuutensa suhteen käyttäen vasta-aineita, jotka ovat spe-15 sifisiä prokollageenin (tyyppi III) aminoterminaaliselle segmentille. Normaalisti viimeinen pylväästä eluoituva piikki sisältää prokollageenipeptidin (tyyppi III) . Peptidistä poistetaan suola dialysoimalla tislattua vettä vastaan ja kylmäkuivataan. Jatkopuhdistus tapahtuu pyl-20 väässä Agarose A 1,5 M:llä (2 x 120 cm) (Biorad), joka on tasapainotettu 1 M CaCl2:lla, 0,05 M Tris-HCl: llä, pH 7,5.
Esimerkki 2
Hybridoman valmistus SJL-kannan hiiriä immunisoidaan 5 pg:lla prokolla-25 geenipeptidiä (tyyppi III), joka oli saatu esimerkin 1 mukaisesti, komplementtisen Freundin adjuvantin läsnä ollessa intramuskulaarisesti. Neljän viikon kuluttua ja kolmen kuukauden kuluttua immuunirekatiota vahvistetaan int-ramuskulaarisella lisäinjektiolla 5 pg:lla prokolla-30 geenipeptidiä (tyyppi III) ei-komplementtisen Freundin adjuvantin läsnä ollessa. Kolme päivää ennen fuusiota immuunivastetta vahvistetaan injisoimalla vielä 50 pg pro-kollageenipeptidiä (tyyppi III) .
Fuusiota varten eläimet tapetaan ja pernasolut 35 eristetään. Polyetyleeniglykolin läsnäollessa pernasolut 9 98705 fuusioidaan myeloomasolulinjan P3X63AG8.653 kanssa. (Syntyvä solulinja on talletettu ECACCrhen numerolla 88030202.) Viljelemällä fuusioseosta hypoksantiini-aminop-teriini-tymidiini-elatusaineessa kahden viikon ajan vali-5 koidaan pernasolu x P3X63AG8.653-hybridit. Monoklonaalisen solulinjan saavuttamiseksi subkloonataan saadut solu-kloonit useampaan kertaan. Muodostuneiden solupesäkkeiden päällä olevat nesteet testataan radioimmunologisella sitoutumistestillä vasta-aineen tuoton suhteen. Siten saa-10 daan bimonoklonaalinen vasta-aine PIIIP 226.
Esimerkki 3
Radioimmunologinen sitoutumistesti 300 pl:aa soluviljelynestettä tai muuta näytettä, kuten esim. askitesta hiirten vatsaontelosta hybridomaso-15 lujen kasvatuksen jälkeen, inkuboidaan 100 μ1:η kanssa 125I-prokollageenipeptidin (tyyppi III) liuosta (1 ng proteii-nia/100 μΐ, valmistettu, kuten EP 4940:ssä, esimerkissä 1, on kuvattu) yli yön. Muodostuneet antigeeni-vasta-ainekom-pleksit saostetaan lisäämällä lampaan tai jonkin muun la-20 jin anti-hiiren-IgG-seerumia. Sentrifugoinnin ja päällä olevan nesteen dekantoinnin jälkeen määritetään saostuneen radioaktiivisuuden määrä gammatuikespektrometrillä.
Esimerkki 4
Vasta-aineiden radioaktiivinen leimaus 25 0,2 ml liuosta, jossa on 0,2 mg saksalaisen patent
tihakemuksen P 37 14 633.5, esimerkin 2, mukaisesti saatua monoklonaalista vasta-ainetta PIIIP 296 tai muuta vasta-ainetta 0,05 M fosfaattipuskurissa, pH 7,4, pannaan poly-styreenikoeputkeen (12 x 55 mm) ja lisätään 100 MBq Na125I-30 liuosta, puskuroitu 10 plrlla 0,5 M fosfaattipuskuria, pH
7,4. Kun on lisätty 50 1 kloramiini T:n (20 pg) vesipitoista liuosta, sekoitetaan 1 minuutti. Sen jälkeen jo-ditusreaktio lopetetaan lisäämällä 50 μΐ natriumdisulfii-tin (20 g) vesipitoista liuosta. Reagoimaton Na125I erote-35 taan sen jälkeen 125I-leimatuista vasta-aineista käyttäen 10 98705 kromatografiaa anioninvaihtajalla. Kromatografiafraktiot, jotka sisältävät puhdistetun 125I-leimatun vasta-aineen, laimennetaan liuoksella, jossa on 20 pg Tween 20:tä ja 41,6 g Na2EDTA:ta litrassa 0,05 M Tris-HCl:ää, pH 8,0, si-5 ten, että leimatun vasta-ainen pitoisuus on 200 pg/l.
Esimerkki 5
Koeputkien päällystäminen vasta-aineilla
Vasta-aineiden kiinnittämiseksi polystyreenikoeput-kiin (12 x 75 mm) pannaan jokaiseen putkeen 300 μΐ liuos-10 ta, joka sisältää 4 mg/1 vasta-ainetta, esim. PIIIP 226:-ta, 0,01 M natriumfosfaattipuskurissa, pH 6,4, ja inkuboi-daan yli yön huoneen lämpötilassa. Sen jälkeen vasta-aine-liuos imetään pois ja jokaiseen putkeen pannaan 500 μΐ naudan seerumin albumiinin 1-prosenttista liuosta 0,05 M 15 Tris-sitraatissa, pH 7,5. Inkubaation jälkeen yli yön huoneen lämpötilassa liuos imetään pois. Vasta-aineella päällystetyt putket kuivataan silikageelin päällä.
Esimerkki 6
Immunoradiometrinen testi (Radioimmunometric Assay, 20 IRMA) 0,1 ml:aa analysoitavaa näytettä tai prokollageeni-peptidin (tyyppi III) standardia inkuboidaan 2 tuntia huoneen lämpötilassa polystyreeniputkissa, jotka on päällystetty esimerkin 5 mukaisesti monoklonaalisella vasta-ai-25 neella PIIIP 226, lisäten 0,1 ml fosfaattipuskuroitua suolaliuosta (PBS). Sen jälkeen koeputket pestään kaksi kertaa kulloinkin 1 ml:lla PBS:ää. Sen jälkeen putkiin pannaan 200 μΐ 125I-leimattua vasta-ainetta PIIIP 296 (- 40 ng vasta-ainetta) tai muuta vasta-ainetta ja inkuboidaan 2 30 tuntia huoneen lämpötilassa. Putken seinämään sitoutuneen vasta-aine-antigeeni-125I-vasta-aine-kompleksin radioaktiivisuus määritetään kaksinkertaisen pesun jälkeen kulloinkin 1 ml:11a PBS:ää ja sitä seuraavan dekantoinnin jälkeen gammatuikespektrometrillä.
li 11 98705
Vertaamalla vakiokäyrään, jonka valmistamiseksi käytetään standardeja, joissa on eri määrä prokollageeni-peptidiä (tyyppi III), voidaan sitten laskea prokollagee-nipeptidin (tyyppi III) pitoisuus tuntemattomassa näyte-5 liuoksessa. Kuva 1 esittää immunoradiometrisen testin va-kiokäyrää (B/T tarkoittaa sitoutuneen radioaktiivisuuden suhdetta koko käytettyyn radioaktiivisuuteen).
Esimerkki 7
Ihmisen seerumin PIIIP 226:n kanssa reagoivien an-10 tigeenien molekyylipainojakauman määritys 1 ml seerumia erotetaan geelisuodatuskromatografiaa käyttäen allyylidekstraanilla, joka on ristisitoutunut /©) N,N'-metyleenibisakryyliamidin kanssa (Sephacryl S 300-pylväs (1,6 x 130 cm), tasapainotettu PBS:ssä, jossa on 15 0,04 % ei-ionista detergenttiä, esimerkiksi polyetoksiloi- tua sorbitaanimonolauraattia (Tween 20). 0,2 ml:aa jokaisesta yksittäisestä fraktiosta inkuboidaan leimatun antigeenin määrän suhteen rajoittuvan määrän kanssa tutkittavaa vasta-ainetta (0,1 ml:ssa puskuria) ja 0,1 ml:n kanssa 20 125I-leimattua prokollageenipeptidiä (tyyppi III) (sisältää 1 ng:n proteiinia) yli yön 4 °C:ssa. Sen jälkeen inkuboidaan etukäteen testatun määrän kanssa lampaan anti hiiren IgG-seerumia 10 %:n polyetyleeniglykolia (PEG 6000) läsnä ollessa 1 tunti. Saostuneet antigeeni-vasta-aine-komplek-25 sit sentrifugoidaan pois (1500 x g) ja dekantoinnin jälkeen radioaktiivisuus määritetään gammatuikespektrometril-lä. Vertaamalla vakiokäyrään, jonka valmistamiseksi käytetään standardeja, joissa on eri määrät prokollageenipeptidiä (tyyppi III), voidaan sitten määrittää käytetyn vas-30 ta-aineen kanssa reagoivien antigeenien pitoisuus kromato-grafiafraktioissa. Kuvio 2 esittää PIIIP 226:n avulla määritetyn antigeenin eluutioprofiilia verrattuna polyklo-naalisten vasta-aineiden avulla määritetyn antigeenin profiiliin.

Claims (12)

98705
1. Monoklonaalinen vasta-aine, tunnettu siitä, että 5 a) sillä on kuviossa 2 esitetty reaktioinani intak- tia prokollageenia (tyyppi III) ja pN-kollageenia (piikki la) , intaktia aminoterminaalista prokollagenipeptidiä (tyyppi III) (piikki 2a), aminoterminaalisen prokollagee-nipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joiden molekyy-10 lipainot ovat aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja Col l:n molekyylipainojen välillä (piikki 3a), sekä Col 1: tä ja aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joilla on sama mole-kyylipaino kuin Col l:llä (piikki 4a), vastaan; 15 b) sillä on spesifinen vaikutus sellaista aminoter minaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) epitooppia vastaan, jota ei ole Col l:ssä; c) se kuuluu IgG-luokkaan; ja d) se muodostuu hybridoomaa esim. ECACC 88030202 20 käyttäen, joka on muodostunut myeloomalinjan solujen fuusiolla etukäteen aminoterminaalisella prokollageenipepti-dillä (tyyppi III) immunisoidun eläimen lymfosyyttien kanssa.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen monoklonaalinen 25 vasta-aine, tunnettu siitä, että se on hybridoo- masolulinjan ECACC 88030202 monoklonaalinen vasta-aine PIIIP 226.
3. Hybridoomasolulinja, tunnettu siitä, että se tuottaa patenttivaatimuksen 1 mukaista vasta-ai- 30 netta, ja on muodostunut fuusioitumalla myeloomasolulinjan soluista ja etukäteen prokollageenipeptidillä (tyyppi III) immunisoidun eläimen lymfosyyteistä ja että se on ECACC 88030202. li 98705
4. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen valmistamiseksi, tunnettu siitä, että a) eläimiä immunisoidaan aminoterminaalisella pro- 5 kollageenipeptidillä (tyyppi III), b) otetaan lymfosyytit ja fuusioidaan myeloomasolu-jen kanssa, c) valitaan hybridit vasta-aineen, jolla on patenttivaatimuksessa 1 annetut ominaisuudet, esiintymisen pe- 10 rusteella ja kloonataan ja d) saadaan vasta-aine mainituista klooneista esim. hybridoomasta ECACC 88030202.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheen d) suorittamiseksi 15 käytetään hybridomasolulinjaa ECACC 88030202.
6. Menetelmä prokollageenipeptidin (tyyppi III) kvantitatiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi vasta-aineilla, tunnettu siitä, että a) nestemäinen näyte, joka sisältää aminoterminaa- 20 lista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) tai prokollagee- nia (tyyppi III), saatetaan reagoimaan patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen monoklonaalisen vasta-aineen kanssa, ja b) aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) tai prokollageenin (tyyppi III) määrä määritetään 25 muodostuneen antigeeni-vasta-aine-kompleksin perusteella.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että a) patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen monoklonaa-linen vasta-aine sidotaan kiinteään matriisiin, 30 b) nestemäinen näyte, joka sisältää aminoterminaa- lista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) tai prokollagee-nia (tyyppi III) saatetaan reagoimaan mainitun vasta-aineen kanssa, ja c) sitoutunut antigeeni osoitetaan käyttäen leimat-35 tuja monoklonaalisia tai polyklonaalisia vasta-aineita, 98705 jotka ovat spesifisiä prokollageenipeptidille (tyyppi III) tai prokollageenille (tyyppi III).
8. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että 5 a) polyklonaalinen tai monoklonaalinen vasta-aine, joka on spesifinen prokollageenipeptidille (tyyppi III) ja/tai prokollageenille (tyyppi III) sidotaan kiinteään matriisiin, b) nestemäinen näyte, joka sisältää aminoterminaa-10 lista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) tai prokollagee- nia (tyyppi III) saatetaan reagoimaan mainitun vasta-aineen kanssa, ja c) sitoutunut antigeeni osoitetaan käyttäen leimattua patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista monoklonaalista 15 vasta-ainetta.
9. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ettävaiheeseen c) käytetään mono-klonaalisena vasta-aineena vasta-ainetta, jolla on kuviossa 3 esitetty reaktiomalli intaktia prokollageenia (tyyppi
20 III) ja pN-kollageenia (piikki 4a), intaktia aminotermi- naalista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) (piikki 5a) sekä Col 1:tä ja aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joilla on sama molekyyli-paino kuin Col l:llä (piikki 6a), vastaan.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheeseen a) käytetään mono-klonaalisena vasta-aineena vasta-ainetta, jolla on kuviossa 3 esitetty reaktiomalli intaktia prokollageenia (tyyppi III) ja pN-kollageenia (piikki 4a), intaktia aminotermi- 30 naalista prokollageenipeptidiä (tyyppi III) (piikki 5a) sekä Col l:tä ja aminoterminaalisen prokollageenipeptidin (tyyppi III) hajoamistuotteita, joilla on sama molekyyli-paino kuin Col l:llä (piikki 6a), vastaan.
11. Patenttivaatimuksen 9 tai 10 mukainen menetel-35 mä, tunnettu siitä, että monoklonaalisena vasta- II 98705 aineena käytetään hybridomasolulinjan ECACC 87042308 PIIIP 296:ta.
12. Diagnostinen tarpeisto prokollageenipeptidin (tyyppi III) määrän määrittämiseksi ruumiinnesteistä, 5 tunnettu siitä, että se käsittää vaikuttavan määrän patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista monoklonaalista vasta-ainetta, seoksena diagnostisesta hyväksyttävän muovimateriaalia olevan kantajan kanssa. 98705
FI891953A 1988-04-27 1989-04-25 Monoklonaalinen vasta-aine intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi ruumiinnesteistä FI98705C (fi)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE3814216 1988-04-27
DE3814216 1988-04-27

Publications (4)

Publication Number Publication Date
FI891953A0 FI891953A0 (fi) 1989-04-25
FI891953L FI891953L (fi) 1989-10-28
FI98705B FI98705B (fi) 1997-04-30
FI98705C true FI98705C (fi) 1997-08-11

Family

ID=6353005

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI891953A FI98705C (fi) 1988-04-27 1989-04-25 Monoklonaalinen vasta-aine intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi ruumiinnesteistä

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0339443B1 (fi)
JP (1) JPH07110880B2 (fi)
AT (1) ATE115963T1 (fi)
CA (1) CA1338324C (fi)
DE (1) DE58908787D1 (fi)
DK (1) DK169571B1 (fi)
ES (1) ES2065350T3 (fi)
FI (1) FI98705C (fi)
GR (1) GR3014957T3 (fi)
IE (1) IE66320B1 (fi)
NO (1) NO179107C (fi)
PT (1) PT90369B (fi)

Families Citing this family (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6010862A (en) * 1987-11-06 2000-01-04 Washington Research Foundation Methods of detecting collagen type III degradation in vivo
DE4225038C2 (de) * 1992-07-29 1995-11-30 Boehringer Mannheim Gmbh Herstellung und Verwendung von Antikörpern gegen Kollagen
FI960392A7 (fi) * 1993-07-28 1996-01-29 Roche Diagnostics Gmbh Immunomääritys kollageenin tai kollageenifragmenttien osoittamiseksi
GB9506050D0 (en) 1995-03-24 1995-05-10 Osteometer A S Assaying collagen fragments in body fluids
ATE199185T1 (de) 1994-10-17 2001-02-15 Osteometer Biotech As Einschätzung der fragmentierungsmuster von kollagen in körperflüssigkeiten und diagnose von mit dem kollagenmetabolismus zusammenhängenden störungen
US6107047A (en) * 1996-03-21 2000-08-22 Osteometer Biotech A/S Assaying protein fragments in body fluids
GB9617616D0 (en) 1996-08-22 1996-10-02 Osteometer Biotech As Assaying protein fragments in body fluids
ES2160985T3 (es) 1996-12-09 2001-11-16 Osteometer Biotech As Ensayos de tipo sandwich para fragmentos de colageno.
US6117646A (en) * 1997-09-22 2000-09-12 Osteometer Biotech A/S Assaying protein fragments in body fluids
WO1999061477A2 (en) * 1998-05-28 1999-12-02 Bayer Aktiengesellschaft Monoclonal antibody and assay for detecting piiinp
US6602980B1 (en) 1998-06-19 2003-08-05 Washington Research Foundation Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays
US6916903B2 (en) 1998-06-19 2005-07-12 Washington Research Foundation Collagen type III synthetic peptides for collagen resorption assays

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3209149A1 (de) * 1982-03-13 1983-10-06 Hoechst Ag Verfahren zur gemeinsamen immunologischen bestimmung von prokollagen-peptid (typ iii) und prokollagen-peptid col 1 (typ iii) und verfahren zur herstellung von anti-prokollagen-peptid col 1 (typ iii)-serum

Also Published As

Publication number Publication date
DE58908787D1 (de) 1995-02-02
JPH07110880B2 (ja) 1995-11-29
DK202189D0 (da) 1989-04-26
IE891372L (en) 1989-10-27
NO891732D0 (no) 1989-04-26
NO179107B (no) 1996-04-29
EP0339443A3 (en) 1990-05-09
FI891953A0 (fi) 1989-04-25
FI891953L (fi) 1989-10-28
PT90369B (pt) 1994-08-31
JPH0213396A (ja) 1990-01-17
CA1338324C (en) 1996-05-14
DK202189A (da) 1989-10-28
ATE115963T1 (de) 1995-01-15
FI98705B (fi) 1997-04-30
NO891732L (no) 1989-10-30
DK169571B1 (da) 1994-12-05
ES2065350T3 (es) 1995-02-16
NO179107C (no) 1996-08-07
GR3014957T3 (en) 1995-05-31
IE66320B1 (en) 1995-12-27
PT90369A (pt) 1989-11-10
EP0339443A2 (de) 1989-11-02
EP0339443B1 (de) 1994-12-21

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Ruoslahti et al. [46] Fibronectin: Purification, immunochemical properties, and biological activities
CA1247539A (en) Method for detecting immune complexes in serum
JP2617289B2 (ja) モノクローナル抗体生産性ハイブリドマ細胞系
Curtiss et al. A novel method for generating region-specific monoclonal antibodies to modified proteins. Application to the identification of human glucosylated low density lipoproteins.
US4921790A (en) Tumor specific assay for CA125 ovarian cancer antigen
FI98705C (fi) Monoklonaalinen vasta-aine intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiiviseksi immunologiseksi määrittämiseksi ruumiinnesteistä
EP0741144B1 (en) Antiannexin-v monoclonal antibody, process for producing the same, and use therof
Giro et al. Quantitation of elastin production in cultured vascular smooth muscle cells by a sensitive and specific enzyme-linked immunoassay
CN119161475B (zh) 一种检测igfbp2蛋白或igfbp2多肽的单克隆抗体对及其应用
JPWO1996015152A1 (ja) 抗アネキシンｖモノクローナル抗体並びにその製法及びその利用
EP0605410B1 (en) Immunodiagnostic assay for rheumatoid arthritis
EP0131834B1 (en) Monoclonal antibody having specificity to only one type of an isozyme of human cardiac myosin heavy chain
US5679583A (en) Monoclonal antibodies for the selective immunological determination of intact procollagen peptide (type III) and procollagen (type III) in body fluids
FI96433C (fi) Monoklonaalisia vasta-aineita intaktin prokollageenipeptidin (tyyppi III) ja prokollageenin (tyyppi III) selektiivistä, immunologista määritystä varten kehonnesteistä
CA2155793C (en) Monoclonal antibiodies for selective immunological determination of high molecular weight, intact laminin forms in body fluids
KR960002740B1 (ko) 안티-트롬빈-결합물질 모노클로날 항체, 이를 생산하는 하이브리도마 및 모노클로날 항체를 이용한 트롬빈-결합물질의 정제법 및 측정법
FI92716B (fi) Uudet monoklonaaliset vasta-aineet IFN-omegalle, niiden valmistusmenetelmät ja niiden käyttö IFN-omegan puhdistamiseen ja osoittamiseen
WO1990006515A1 (en) Anti-idiotopic immunometric assay
Engvall et al. Monoclonal antibodies in analysis of oncoplacental protein SP1 in vivo and in vitro
Nilson et al. Cross-reacting monoclonal anti-α1-microglobulin antibodies produced by multi-species immunization and using protein G for the screening assay
JPH05207893A (ja) プラスミン−抗プラスミン複合体に対するモノクローナル抗体、その製造方法およびその使用
AU600261B2 (en) Reagent for and procedure in the determination of C3a by immunochemical assay
EP0417298A1 (en) Detection of human tissue factor activator
JPS60253871A (ja) 抗アポａ−１抗体
North et al. Development and characterization of a syngeneic monoclonal antibody to a rat mammary tumor metastasis‐associated mucin like cell‐surface antigen (gp580)

Legal Events

Date Code Title Description
BB Publication of examined application
FG Patent granted

Owner name: AVENTIS PHARMA DEUTSCHLAND GMBH

PC Transfer of assignment of patent

Owner name: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH

Free format text: SANOFI-AVENTIS DEUTSCHLAND GMBH

MA Patent expired