DE2622588A1 - Verfahren zur bestimmung des vorliegens einer lungenembolie beim menschen - Google Patents

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PATENTANWÄLTE

Dlpl.-Ing. P. WIRTH · Dr. V. SCHMIED-KOWARZIK Dipl.-Ing. G. DANNENBERG · Dr. P. WEINHOLD ■ Dr. D. GUDEL

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Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens einer Lungenembolie beim Menschen

Lungenthromboembolie ist eine weit verbreitete Krankheit, die von u/iederholtera Auftreten mit immer größerer Gefahr begleitet uiird und schließlich zum Tode führen kann. Obgleich eine sofortige Erkennung entscheidend ist, da vernünftige und wirksame Therapien zur Verfugung stehen, ist die klinische Diagnose schwer und häufig inkorrekt. Es besteht das dringende Bedürfnis nach einem diagnostischen Indikator, der in größerem Umfang als die bisherigen radiologischen Verfahren zur Verfügung steht, die oft unbestimmt sind. Ein solcher diagnostischer Indikator_könnte sowohl als Erkennungsverfahren als auch zur ergängenden Information radiologischer Verfahren dienen. Da die Erkennung von LungenthromboembG-lien ein weltweites medizinisches Hauptproblem ist, würde ein einfacher Erkennungstest allgemeine Verwendung finden und von großer Bedeutung bei der medizinischen Bekämpfung dieses Problems sein.

Es wurde nun gefunden, daß die Anwesenheit eines Antigens im menschlichen Serum eine sichere, verläßliche und wirksame Grundlage zur Bestätigung der Anwesenheit einer Lungenembolie bietet.

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Elin normalerweise in den menschlichen Lungen vorkommendes Antigen tritt in Anwesenheit einer Lungenembolie in das Blutserum aus. Das Antigen kann zur Stimulierung der Produktion eines Antikörpers in Tierblut verwendet werden. Der Antikörper wiederum kann zur Feststellung der Anwesenheit des Antigens im Serum verwendet werden, wodurch das Vorliegen einer Lungenembolie bestätigt wird.

Die vorliegende Erfindung betrifft daher ein Testverfahren zur Bestimmung des Vorliegens einer Lungenembolie beim Menschen, indem man zuerst normales 'Lungengewebe zum Stimulieren der Produktion eines Antikörpers in Tierserum verwendet und das den Antikörper enthaltende Serum dann mit dem zu testenden mensdiLichen Serum bebrütet. Die positive Anwesenheit einer Lungenembolie wird durch das Auftreten einer immunologischen Reaktion angezeigt.

Isolierung des Antigenpräparates und Herstellung des Antikörper

Obgleich praktisch jedes Tier zur Herstellung des Antikörpers verwendet werden kann - wie dies auch bei solchen Verfahren geschieht - wird das Verfahren der Einfachheit halber unter Verwendung eines Kaninchens beschrieben. Selbstverständlich können auch größere Tiere, wie Ziegen, Pferde und Rinder in gleicher Weise verwendet werden, was tatsächlich zu einer Produktion großer Hangen des Antikörpers führen würde.

Lungenwäschen wurden hergestellt, indem man zuerst 50-100 g Proben normaler menschlicher Lunge mit isotonischer Kochsalzlösung (0,85 % wässriges MaCl) herstellte. Die Lunge war nach der chirurgischen Entfernung eines Carcinoms erhalten worden. Es wurden vier Extrakte von jeweils etwa 50 ecm lyophilisiert und erneut in

etwa 10 ecm isctonischsr Kochsalzlösung gelöst und auf eine

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Sephadex G-200 Kolonne mit 2,5 cm Durchriasser und einem Bettvolumen von 260 ecm aufgebracht. Bei einer Fließgeschwindigkeit von 10 cern/std bei einer Temperatur von 16 C. wurden 1O-ccm-Fraktionen gesammelt. Die Kolonne wurde mit 0,1M Tris-Cl, pH 7,4-1MNaCl, entwickelt. Die Fraktionen wurden auf ihre Absor'uHn⁷ bei 280 nra, ein charakteristisches Absorbanz-merkmal für Proteinmoleküle,

untersucht. Unter Ausschluß der anfänglichen Spitze wurden die ("surfactant fractions")

Fraktionen/10-25 gepoolt und in 5-ccm-Anteile,aufgeteilt. Ein solcher Anteil wurde mit einem gleichen Anteil an Frpund's •Adjuvant gemischt und zur Entwicklung des Antikörpers in Kaninchen verwendet.

Bei einem anderen Verfahren zur Herstellung der antigenhaltigen Mischung wurden 0,4-1 g-Anteile der in ähnlicher Weise erhaltenen menschlichen Lunge, die nach der Entfernung bei 0°c. und dann bei -75⁰C. bis -85⁰C. gehalten worden waren, in kleine Stücke geschnitten und bei 0 C. in 3 ecm 0,1M Kaliumphosphat bei pH 7,0 homogenisiert. Ein anderer Homogenisierungsträger sind 3 ecm 0,25M Sucrose-IMillimol Kaliumphosphat bei pH 7,4.

Die Homogenisierung erfolgte in einer Gewebemahlvorrichtung aus Glas mit motorgetriebenen Teflonkolben oder in einer motorgetriebenen Lourdes-Homogenis-ierungsvorrichtung aus rostfreiem Stahl. Weiterer Puffer wird allmählich zugefügt, um das Volumen auf ecm zu erhöhen. Dann wird die Mischung zu einem gleichen Volumen Freund's Adjuvant zugefügt, und es wird bei 0 C. zur Bildung einer dicken cremigen Mischung weitergemischt. Diese Suspension kann zum Stimulieren der Antikörperproduktion verwendet werden«

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Etwa 5 ecm des antigenhaltigen Mediums wurden subkutan erwachsenenen weißen männlichen Kaninchen, geu/öhnlich an einer Stelle, jedoch manchmal an bis zu vier getrennten Stellen injiziert. Die Injektionen wurden etwa alle 2 Wachen für die Dauer von etwa Wochen wiederholt. Danach wurden die Kaninchen durch Herzpunktur oder aus der Ohrvene zur Ader gelassen. Das Blut wurde gerinnen lassen und das Serum durch 10 Minuten langen Zentrifugieren bei 2000 Umdr./min abgetrennt.

^"extraneous antibodies")

Die äußeren Antikörper/im Kaninchenserum wurden durch Absorption mit dem normalen menschlichen Serum entfernt. Dies erfolgte durch Mischen des normalen menschlichen Blutserums mit dem ■Kaninchenserum in einem Volumenverhältnis von etwa 0,03:1 bis 0,1:1 menschliches Serum zu Kaninchenserum. Die Mischung wurde 30 Minuten bei Zimmertemperatur gerührt und dann etwa 16 Stunden bei 4 C, gelagert. Die Mischung wurde 30 Minuten bei 4 C. und 10 000 g

("extraneous"")

zentrifugiert, um die Reaktionsprodukte der .äußeren/Antigen-^ Antikörper-Reaktionen auszufällen. Da normales menschliches Serum verwendet wurde, reagierte der gewünschte Antikörper nicht und verblieb in der überstehenden Flüssigkeit. Das Verfahren wurde etwa 3 Mal wiederholt um eine möglichst vollständige Entfernung potentiell störender Antikörper sicherzustellen. Die endgültige überstehende Flüssigkeit wurde als Testpräparat verwendet.

Dieses Testpräparat liefert eine immunologische Reaktion bei Bebrütung mit (wie oben hergestellter) überstehender Flüssigkeit der menschlichen Lunge ("human lung supernatant"), mit der Lungen-Oberflächenfraktion ("lung surfactant fraction")

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ader dem Serum von Patienten, bei denen durch Durchleuchten der Lunge das Vorhandensein einer Lungenembolie positiv diagnostiziert wurde. Daher scheint das Antigen normalerweise in der menschlichen Lunge, jedoch normalerweise nicht im normalen menschlichen Serum anwesend zu sein und erscheint im Serum won Patienten, die an Lungenembolie leiden.

("lung supernatant")

Die überstehende Flüssigkeit aus menschlicher Lunge/iuurde hergestellt, indem man Stücke- menschlicher Lunge, die in einer 1:1 Suspension mit 0,25M Sucrose- 1 mM Phosphat bei pH 7,4 homogenisiert waren, in einpr Ultrazentrifuge bsi 100 Ü00 g bei 4 C. 90 Minuten zentrifugieica.

Dia Antigenpräparate, d.h. die "surfactant fractions", die aus der Sephadex-G-200 Kolonne isoliert werdan, können weiter gereinigt werden. Dazu werden sie 24 Stunden gegen deionisiertes VJasser dialysiart, lyopholisiert, und der Rückstand wird in 0,1M Tris-Cl, pH 8,6, erneut gelöst. 1 ecm des gelösten Lyophilisates wird auf einer DEAE Cellulosekolonne (2,5 χ 66 cm) einem Ionenaustausch unterworfen und bei einer Fließgeschwindigkeit von 0,33 ccm/min mit einem Gradienten zwischen gleichen Volumen 0,1M Tris-Cl, pH 8,6 (Mischkammer) und 0,1M Tris-Cl, pH 8,6 plus 1M NaCl (Reservoir) eluiert. Es wurden 1O-ccm-Fraktionen gesammelt, lyophilisiert und in 0,5 ecm deionisiertem Wasser gelöst. Eine Probe von nur 3 Mikroüter ergibt durch Mikrodiffusion mit Kaninchen-Antikörperseum einen positiven Test.

Beim Testen der Surfactant-Fraktion menschlicher Lunge, der bei 100 000 g zentrifugieren überstehenden Flüssigkeit menschlicher Lunge und des Serums eines Patienten mit positiver Lungenembolie ,

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(laut Durchleuchten) gegen Kaninchenserumantikörper durch Standard immuno

&ion, Makroimmdnodiffusion und Elektrophorseverfahren

zeigten alle drei Materialien die Anwesenheit einer, gemeinsamen Antigens.

Dki FbkroimmunadilTusiun erfolgte, indem man auf Mikroskop Lrärier aus Kunststoff 2-5 ecm von 1,5-/£igem Difco Spezialedelagar in 38 /uM Barbitalpuffer, pH 8,2, goß. In den Agar wurden Löcher und Rinnen geschnitten. Das Antikörperpräparat wurde in die Rinnen gegeben, die Antigenpräparate wurden in die Löcher gegeben.

Die Maki-oimmunodiffusion erfolgte durch Herstellung einer 10Ox 1,5 cm Petri-Schale mit einer Agarschicht aus 8 ecm desselben Agars wie im Hikrouerfahren, worauf Löcher und Rinnen geschnitten wurden.

Beide Diffusionsarten erfolgten durch 24- bis 72-stündiges Bebrüten bei 37⁰C. Die Gele wurden etwa 24 Stunden mit normaler Kochsalzlösung gewaschen, wobei diese einige Male erneuert wurde. Die Präcipitinlinien wurden mit dem Auge durch Färben mit 1-^iger Amino-Schwarz-Farbstofflösung in Wasser, Methanol und Essigsäure - 5:5:1 (Vol.) ■- untersucht.

Optimale Konzentrationen aus Antikörper- und Antigenpräparaten wurden bestimmt, indem man die Antigenkonzentration in den Löchern bei konstanter Antikörperkonzentration in den Rinnen ('troughs") variierte, mo te i einige einfache Beobachtungen der Präcipitinlinien genügten.

Die Immunoelektrophorese erfolgte auf 7,5 χ 2,5 cm Glas- oder Kunststoffträgern, Der wie beim Diffusionsverfahren gepufferte Agar wurde aufgegossen, und man bildete Löcher auf der Mitte gegenüberliegenden Seiten. Die Antigenpräparate wurden in die Löcher ge-

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geben und etwa 2 Stunden bei Zimmertemperatur bei Stromzufuhr mit konstanter Spannung elektrophoresiert, so daß die Spannungsdifferenz über die Träger 40 Volt betrug. Die Gelträger und Pufferreservoire wurden durch mikroporöce Membrandochtc verbunden. Narh der Elektrophorse wurden Rinnen ausgeschnitten und das Antikörperpräparat oder Antiserum zugefügt. Die Bebrütung und Färbung evfolerfolgten wie im Immunodiffusionsverfahren. Die durch Präcipitin angezeigte Reaktion erfolgte an der Anodenseite des Ausgangsloches.

Die obigen Ausführungen machen klar, daß das Antigen durch Extraktion vom Lungengewebe abgetrennt werden kann, wobei alc Extraktionsmittel Kochsalzlösung oder ähnliche Mittel verwendet werden können. Anschließend kannn durch Chromatographie gereinigt werden, obgleich dies nicht notwendig ist, da man auch relativ rohe Suspensionen von Lungenhomogenisaten mit Erfolg verwendet kann. Zur Stimulierung der Antikörperproduktion kann jedes dieser Lungengewebepräparate verwendet werden.

Während die wesentliche immunologische, zur Beschreibung des erfindungsgemäßen Testverfahrens verwendete Reaktion die Präcipitinreaktion in Agar durch Immunodiffusion oder Elektrophorese war, können selbstverständlich auch andere Verfahren angewendet werden, wie z.B. Komplementfixation und Hämagglutinierung. Das Antigen .kann auch mit einem feststellbaren radioaktiven Element,

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wie 3, J, C oder S markiert werden. Die Markierung kann auch mit einem fluoreszierenden Material, wie Fluorescein, Rhodamin oder Auramin, oder mit einem Enzym, wie Peroxidase, •ß-Glucouronidase, Urease usw., erfolgen. Dann kann die Antitärper--Antigen-Reaktion kolorimetrisch oder durch Geigerzählung festgestellt werden.

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-B-

Der Einfachheit halber wurde das erfindungsgemäße Antigen vorläufig LA Antigen genannt. Bei einer Elektrophoreseuntersuchung von 106 Patienten mit ausgesetzter Lungenthromboembolie laut Durchleuchten zeigten 67 % der laut Durchleuchten als positiv/ diagnostizierten Patienten feststellbares LA Antigen im Uergleich zu πμγ 12-14 % der Patienten mit negativen Durchleuchtungsergebnis. Diese Ergebnisse sind in Wirklichkeit vermutlich besser, weil as ailge-

("scan technique") mein bekannt ist, daß das Durchleuchtungsverfahren/eine gewisse

Anzahl falscher positiver und negativer Befunde liefert.

Das folgende Beispiel zeigt die Herstellung von gereinigtem Antigen und das Testen zur Feststellung bestimmter chemischer und physikalischer Eigenschaften, ohne die vorliegende Erfindung einzuschränken.

Eine Analyse des Beispiels zeigt, daß das Antigen ein Protein mit einem offensichtlichen Molekulargewicht von etwa 210 000, in wässrigem Medium bei pH 8,2 negativ geladen ist und einen isoelektrischen Punkt oberhalb 5 hat. Bei der Polyacrylamid-Gelelektrophorese liefert es ein einziges Coomasie-Blau Band ("single coomasie blue staining band"). Es ist frei .von feststellbarem Lipoprotein adar Glycoprotein, d.h. es enthält keine offensichtlichen Lipid- oder Kohlehydratsegmente.

Das gereinigte Antigen oder die Antigenpräparate sind besonders wertvoll, weil bei der Verwendung zur Stimulierung der Antikörperproduktion weniger verunreinigende Antikörper gebildet werden, so daß die oben erwähnte anfängliche Absorption mit normalen menschlichem Serum weggelassen werden kann. Mit gereinigten Antigenpräparaten wird weiterhin eine höhere Antikörperkonzentration im -

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Tierserum gebildet und die Empfindlichkeit des Radioimmunotests kann merklich verbessert werden.

Beispiel

Insgesamt 340 g menschliches Lungengewebe wurden bei 0 Γ. in kleine Stücke geschnitten und in 4 UoI. Ο,ϋΊΜ Tris-0,25 M Natriumchlorid bei pH 7,6 in einer Mischer 5 Minuten in Abständen von 30 Sekunden bei 3-5⁰C. homogenisiert. Das Homogenisat wurde bei 6000 g 60 Minuten bei 5⁰C. zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit 2 Stunden bei 45 000 g und 5⁰C. zentrifuiert.

Dann wurde die erhaltene überstehende Flüssigkeit einer Salzfraktionierung unterworfen.

Die Ammoniumsulfatfraktionierung erfolgte durch langsame Zugabe von gesättigtem Ammoniumsulfat bei 0-5°C. unter Rühren bis zu einer Sättigung von 30 %, Die Flüssigkeit wurde mit 5N Natriumhydroxid auf einen pH-Wert von 7,8 eingestellt, 2 Stunden gerührt und der erhaltene Niederschlag bei 6000 g entfernt. Dann wurde die überstehende Flüssigkeit in derselben Weise mit Ammoniumsulfat auf eine Sättigung von 50 % gebracht und der Niederschlag durch Zentrifugieren bei 6000 g für 30 Minuten gewonnen.

Der Niederschlag wurde in einem Viertel des ursprünglichen Hurogenisatvolumens normaler Kochsalzlösung gelöst und erschöpfend gegen dieselbe Lösung bei 4°C. etwa 24 Stunden dialysiert.(Die normale Kochsalzlösung kann durch Ο,ϋΊΜ Tris-0,25M Natriumchlorid ersetzt werden.)

Die dialysierte Lösung wurde durch 60 Minuten langes Zentrifugieren bei 6000.g geklärt und der Niederschlag verworfen.

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Die überstehende Flüssigkeit wurde demselben Verfahren mit 30 % und 50 % Ammoniumsulfat unterworfen, dialysiert und die erhaltene dialysierte Lösung durch langsame Zugabe won 1N Salzsäure unter milden Rühren urihrend etwa 1 Stunde auf einen pH-Wsrt von 3,0 eingestellt. Die Lösung wurde zur Abtrennung eines unlöslichen Niaderschlages 60 Minuten bei 6000 g zentrifugiert und dieser dann i/erujorfen.

Die angesäuerte Lösung wurde durch langsame Zugabe eines gleichen Volumens an gesättigtem 'Ammoniumsulfat untsr ständigem Rühren, auf eine Ammoniumsulfat°ättigung uon 50 % gebracht* Dann wurde 2 Stunden weitegerührt und die Mischung 0,5 Stunden bei 6000 g zentrifugiert. Der Niederschlag wurde in einem gleichen Volumen 0,01M Tris-0,25 M Natriumchlorid bei pH 7,4 gelöst. Die Stufen des Ansäuern und der Ammoniumsulfatausfällung wurden wiederholt und der Niederschlag erneut in einem Viertel des ursprünglichen Volumens des Tris-Puffers gelöst. Die Lösung wurde gegen dieselbe Lösung dialysiert und 1 Stunde bei 6000 g zur Entfernung des Niederschlages zentrifugiert.

Die Lösung wurde auf einer Sepharose 6B Kolonne (2,6 χ 85 cm, vorher mit Tris-Puffer auf pH 7,4 äquilibriert) bei einer FlieG-

geschwindigkeit von 30-35 ccm/std bei 5°C. einer Gelfiltration

eluierten
unterworfen. Die/2,5-cm-Fraktionen wurden zur Feststellung von LA Antigen durch Immunoelektrophorese getestet; dieses erschien in den Fraktionen 95 bis 113 und stellte, gemessen durch Absorbanz bei 280 nm, etwa 9,9 % des aufgebrachten Proteins dar. Die Proteingewinnung betrug 98,6 %,

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Die. LA. Antigen enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert und erschöpfend gegen deionisiertes Wasser bei etwa 4 C. dialysiert. Der Niederschlag wurde durch 1-stündiges Zentrifugieren bei 6000 g entfernt. Die überstehende Flüssigkeit- wurde gegen Tris-Puffer_; pH 7,4,dialyisert unri zui Entfernung von Niederschlag 1 Stunda bei 6000 g zentrifugiert.

Das l/olumen wurde durch Einleiten eines Luftstromes auf die Lösung im Dialysebehälter verringert und die Lösung zweimal einer Gelfiltration auf der Sepharose 68 Kolonne unterworfen. Die LA Antigen enthaltenden Fraktionen wurden in identischer Waise in alle drei Gelfiltrationen und durch Immunoelektrophorese identifiziert.

Die LA Antigen enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert, konzentriert und bei 4°C. etwa 10 Stunden bei pH 6 gegen 0,01M Kaliumphosphat dialysiert, das Dialysat wurde 30 Minuten bei 6000 g zentrifugiert, die überstehende Lösung wurde auf eine Carboxymethylcellulosekolonne (2 χ 18 cm, 5& ecm Bettvolumen, vorher mit 0,5N Natriumhydroxid, Wasser, 0,5N Salzsäure, 0,5N Natriumacetat bei pH 4,7, und 0,06M Natriumacetat behandelt) aufgebracht und mit 0,01M Kaliumphosphatpuffer auf pH 6 eingestellt. Die Lösung wurde stufenweise mit getrennten Fraktionen aus 0,01M Kaliumphosphatpuffern bei pH 6,0 eluiert, wobei die anfängliche Pufferlösung von Natriumchlorid frei war und die anschließenden Lösungen 0,05M, 0,11% 0,15 0,15M bzw. 0,2M Natriumchlorid enthielten. Die eluierten Fraktionen von jeweils 2,5 ecm wurden durch Immunoelektrophorese analysiert, und das LA Antigen fand sich in den 0,15M Natriumchlorid ■enthaltenden Fraktionen. (Die hier und bereits oben beschriebene Immunoelektrophorese erfolgte mit Kaninchen-Antihuman-

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- 12 lungen-Antiserum ("rabbit antihuman lung antiserum".)

Die das Antigen enthaltenden Fraktionen wurden kombiniert, in ihrem Volumen verringert und gegen Ο,ϋΊΜ Kaliumphosphat bei pH ^,8 nialysiert. Das Dialysat luurde zur Entfernung von Niedbrschlag zentrifugiert.

Die überstehende Lösung wurde auf eine 0,8 χ 15 c.u Brushit-Hydroxyapatit-Kolonns (Analytical Biochemistry _59, 16-23 (1974)) aufgebracht, die vorher mit 0,01M Kaliumphosphat auf pH 6,3 äquilibriert worden war, und stufenweise mit 0,01, 0,1, 0,2 bzw» 0,4Fl Kaliumphosphat bei pH 6,8 eluiert. Die 2,5-ccm-Fraktionen wurden wie oben durch Immunoelektrophorese getestet. Das LA Antigen wurde in den mit 0,2M Kaliumphosphat eluierten Fraktionen festgestellt.

Die Fraktionen wurden kombiniert, im Volumen verringert und etwa 10 Stunden bei 4⁰C. gegen Tris-Puffer bei pH 7,4 dialysiert.

Das LA Antigen im Dialysat wurde analysiert. Es ist ein immunologisch mit Kaninchen-Antihunanlungen-Antiserum reagierendes Protein mit einem Molekulargewicht durch Sepharose 6B Filtration von etwa 210 000. Nach Polyacrylamid-Gelelektrophorese nach dem Verfahren von Ornstein und Davis (Annals of the New York Academy of Science, 121, 321 und 404; 2,5 Milliamp. pro Röhrchen, 1,5 std Laufzeit) lieferte es ein einziges Coomasie-Blau Band etwa 5 mm von der Oberseite des Gels, das etwa 5 cm lang war.

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Das Material enthält laut Fat Red 7B Färbung (Corning Fat Red 7B Stain Set, Katalog Nr. 470126, 3uli 1974, Instruktionsblatt, Corning ACI, 490 San Antonio Road, Palo Alto, Ca. 94300Ό) [<_ein feststellbares Lipoprotein.

Weiterhin ist es? offensichtlich frsi von Glycoprotein beim Test mit Alcian Blue Färbung gemäß dem Verfahren in Analytical Biochemistry 49. 607 (1972).

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Claims (1)

1. Patenten Sprüche

   /ΜΛ· Verfahren zur Bestimmung des Vorliegens einer Lungenembolie beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man menschliches Lunoßngeuiebe zum Stimulieren der Produktion eines Antikörpers in Tierserum verwendet, das Serum mit normalen menschlichem Serurr

   ( "extrai.ecus")
   zur Entfernung äußeren / Antikörper absorbiert, das erhaltene Antiserum abtrennt, mit oem zu testenden menschlichen Serum bebrütet und die positive Anwesenheit einer Lungenembolie durch das Auftreten einer immunologischen Reaktion bestimmt.

   2,- Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Immunologische Reaktion eine Präcipitinreaktion ist.

   3.- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch Mikroimmunodiffusion identifiziert wird«

   4.- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch Hakroimmunodiffusion identifiziert u/ird.

   5,- Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch Elektrophorese identifiziert u/ird.

   6,- Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein Kaninchen ist.

   7.- Verfahren zum Bestimmen des Vorliegens einer Lungenembolie beim Menschen, dadurch gekennzeichnet, daß man das zu testende menschliche Serum mit einem Antiserum bebrütet, das einen Antikörper, hergestellt durch Stimulieren mit einem in menschlichem Lungengeiuebe enthaltenen Antigen im Tierserum, enthält und das positive Vorliegen einer Lungenembolie durch das Auftreten einer immunologischen Reaktion bestimmt.

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   ß,- Verfahren n^ch Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die immunologische Reaktion eine Präcipitinreaktion ist.

   9.- Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch Mikroimmunodiffusicn identifiziert wirH.

   10,- Verfahren nach Anspruch H, dadurch gekennzeichnet, daP die Reaktion durch Makroimmunodiffusion identifziert wird«

   11.- Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch Elektrophorese identifiziert u/ird.

   12_#- Verfahren nach Anspruch 7 bis 1 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Tier ein Kaninchen ist.

   13,- Verfahren nach Anspruch 7 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß das Antiserum vor der Bebrütung mit dem zu testenden Serum mit normalem menschlichen Serum absorbiert ist.

   14.- Antikörperpräparat, enthaltend einen mit dem normalerweise in menschlichem Lungengewebe anwesenden Antigen reagierenden Antikörper, wobei das Antigen im Serum eines an Lungenembolie erkrankten Menschen erscheint.

   15.- Antigen, das ein Protein mit

   einem offensichtlichen Molekulargewicht von etwa 210 000 und in wässrigem Medium negativ geladen ist, einen isoelektrischen Punkt oberhalb 5 hat, ein einziges Coomasie-Blau Band bei der Polyacrylamid-Elektrophorese ergibt, von Lipid- oder Kohlehydratsegmenten frei ist, und das weiterhin in " Tierserum eine Antikörperproduktion stimulieren kann, so daß ein ' Antiserum gebildet wird, das mit dem Serum eine.s an Lungenembolie leidenden Menschen bebrütet werden kann und das Vorliegen einer

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   solchen Embolie durch Auftreten einer immunologischen Reaktion anzeigt.

   16.- Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktion durch Radioiißmunotes+; identifiziert wird.

   Der Patentanwalt

   (Dr. Y./^chmied-Kowarzik)

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