CN110498830A - 一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法 - Google Patents

一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法 Download PDF

Info

Publication number
CN110498830A
CN110498830A CN201810466571.2A CN201810466571A CN110498830A CN 110498830 A CN110498830 A CN 110498830A CN 201810466571 A CN201810466571 A CN 201810466571A CN 110498830 A CN110498830 A CN 110498830A
Authority
CN
China
Prior art keywords
peg
preparation
biotin
magnetic bead
protein
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201810466571.2A
Other languages
English (en)
Inventor
郭敏
吴亮
徐开
于雪
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kang Code (shanghai) Biological Technology Co Ltd
Original Assignee
Kang Code (shanghai) Biological Technology Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kang Code (shanghai) Biological Technology Co Ltd filed Critical Kang Code (shanghai) Biological Technology Co Ltd
Priority to CN201810466571.2A priority Critical patent/CN110498830A/zh
Publication of CN110498830A publication Critical patent/CN110498830A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/334—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur
    • C08G65/3348—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing sulfur containing nitrogen in addition to sulfur
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08G—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED OTHERWISE THAN BY REACTIONS ONLY INVOLVING UNSATURATED CARBON-TO-CARBON BONDS
    • C08G65/00—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule
    • C08G65/02—Macromolecular compounds obtained by reactions forming an ether link in the main chain of the macromolecule from cyclic ethers by opening of the heterocyclic ring
    • C08G65/32—Polymers modified by chemical after-treatment
    • C08G65/329—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds
    • C08G65/336—Polymers modified by chemical after-treatment with organic compounds containing silicon

Abstract

本发明涉及一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法，所述的方法包括步骤：(a)TsO‑PEG‑OTs的制备；(b)H2N‑PEG‑NH2的制备；(c)biotin‑PEG‑NH2的制备；(d)生物素磁珠的制备。本发明的磁珠的制备方法具有制备方法简单且易操作，制备工艺易放大，适用于大规模的工业化生产、制备原料价格低廉的特点。

Description

一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法
技术领域
本发明涉及生物领域，具体涉及一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法。
背景技术
蛋白质分离纯化的主要方法有电泳、层析、透析、超速离心、盐析与有机溶剂沉淀等。电泳法是在电场环境下，利用蛋白质电泳迁移率的区别，主要取决于蛋白质荷质比的不同，实现蛋白质的有效分离；层析法是利用蛋白质理化性质的差异，在固定相和流动相之间存在差异性分布，从而实现蛋白质的有效分离；透析法是利用半透膜将不同大小的蛋白质进行有效分离；超速离心是利用蛋白质密度的差异，在超速离心后蛋白质分布于不同的液层，从而实现有效分离；盐析是在蛋白质溶液中加入大量的中性盐，夺取蛋白质分子的水化层，从而使蛋白质胶粒凝结并沉淀析出；有机溶剂沉淀则是利用能与水混溶的有机溶剂，降低大多数蛋白质的溶解度，使其沉淀析出。电泳、层析、透析和超速离心均需专业和高成本的设备、试剂来实现相关蛋白的分离纯化，并且较难实现多功能的集成、处理样本的大倍数放大或缩小。盐析与有机溶剂沉淀的分离效率较低，沉淀的目标蛋白中通常夹杂着其他蛋白，并且较难分离相似的蛋白质，有机溶剂的使用也易使蛋白发生变性。
磁珠拥有强力的顺磁性，其表面可以通过包裹修饰上带有不同官能团的分子层，各种活性基团和化学生物分子可以被偶联到这些分子层上，在无外磁场存在的情况下，这些经过特定修饰的磁珠可以均匀地分散在溶液中，对特定的目标分子进行抓获，抓获完成后，通过外磁场的施加，可以将磁珠及目标分子便捷地从复杂溶液体系中分离富集。通过在磁珠表面修饰上特异性抗体、受体等，磁珠被广泛地应用在核酸提取、蛋白分离、细胞分离、免疫分析等诸多生物领域。
生物素广泛存在于动植物体中，其分子有两个环状结构，一个为咪唑酮环，一个为噻吩环，噻吩环上有一戊酸侧链，末端的羧基可通过化学修饰偶联到多种生物化学分子上，而咪唑酮环则是生物素与链霉亲和素结合的主要部位，生物素与链霉亲和素的特异性结合，拥有很强的非共价结合作用，其亲和常数约为1E-14M，比多数抗原与抗体间的亲和力还至少高几个数量级。除了亲和性强，生物素与链霉亲和素还拥有很强的结合专一性，这些优良的性质使该系统在蛋白分离、生物检测方面起到重要作用。
综上，本领域亟制备一种用于蛋白分离纯化的磁珠。
发明内容
本发明的目的是提供一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法。
本发明第一方面提供一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法，所述的方法包括步骤：
(a)TsO-PEG-OTs的制备：将溶有对甲苯磺酰氯的吡啶溶液滴加到溶有聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，制得TsO-PEG-OTs固体，所述TsO-PEG-OTs的结构如式I所示：
(b)H2N-PEG-NH2的制备：TsO-PEG-OTs溶于氨水，并置于高压反应釜中在120-160℃、10-30bar的条件下反应4-12h，反应完毕后，制得H2N-PEG-NH2固体，所述H2N-PEG-NH2的结构如式II所示：
(c)biotin-PEG-NH2的制备：将生物素溶于2-吗啉乙磺酸的水溶液中，再依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，反应完毕后，加入碳酸盐或碳酸氢盐调节pH为6-8后，加入H2N-PEG-NH2缓冲液制得biotin-PEG-NH2，所述biotin-PEG-NH2的结构如式III所示：
(d)生物素磁珠的制备：将被硅烷偶联剂修饰的羟基磁珠加入溶有biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液，加热搅拌进行反应，将磁珠沉降并清洗后得到可用于蛋白纯化的生物素磁珠。
在另一优选例中，所述的硅烷偶联剂选自下组：3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、3-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-(3,4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷或其组合。
在另一优选例中，所述的结构式I、结构式II、以及结构式III中，n为6-182。
在另一优选例中，所述的碳酸盐或碳酸氢盐选自下组：碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠或其组合。
在另一优选例中，所述的步骤(a)具有选自以下一个或多个特征：
(a-1)对甲苯磺酰氯的吡啶溶液的浓度为0.3-1.2mol/L；
(a-2)聚乙二醇的二氯甲烷溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；
(a-3)聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:2-8；
(a-4)聚乙二醇的分子质量为282-8036。
在另一优选例中，所述的步骤(b)具有选自以下一个或多个特征：
(b-1)氨水的浓度为25-28％(w/w)；
(b-2)TsO-PEG-OTs与氨水中铵根离子、氨分子及一水合氨分子总量的摩尔比为1:50-200。
在另一优选例中，所述的步骤(c)具有选自以下一个或多个特征：
(c-1)H2N-PEG-NH2的缓冲液中，H2N-PEG-NH2的摩尔浓度为1×10-4-2×10-3mol/L；
(c-2)H2N-PEG-NH2的缓冲液中，含有0.065-0.072mol/L的Na2HPO4，0.028-0.035mol/L的NaH2PO4，0.1-0.2mol/L的NaCl。
在另一优选例中，所述的步骤(d)具有选自以下一个或多个特征：
(d-1)所述的biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液中，biotin-PEG-NH2的摩尔浓度为5×10-8-5×10-3mol/L；
(d-2)所述的biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液中，醋酸的体积分数为0.5-2％。
本发明第二方面提供一种生物素磁珠，所述的生物素磁珠由本发明第一方面所述的制备方法制成，所制得生物素磁珠的结构如式IV所示，其中，n为6-182。
本发明第三方面提供一种生物素磁珠的用途，用于蛋白质分离纯化。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1显示了利用磁珠纯化反应混合液后的电泳图。
图2显示了未利用磁珠纯化反应混合液的电泳图。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，开发出一种新的用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法。
术语
如本文所用，术语“磁珠”指粒径在微纳米范围的超顺磁微球，具有很强的顺磁性，磁珠的磁核为超顺磁四氧化三铁，磁珠的外壳为二氧化硅。
如本文所用，术语“生物素”指D-(+)-生物素(CAS No.58-85-5)。
如本文所用，术语“磁珠沉降”指利用超强力磁铁使磁珠沉降聚集或利用离心机使磁珠沉降聚集。
如本文所用，术语“硅烷偶联剂”指一种分子结构式一般为“Y-R1-Si(OR2)3”的化合物，其中Y是有机官能团，OR2通常是甲氧基、乙氧基、甲氧基乙氧基、乙酰氧基、氯基等，R1通常是(CH2)n。
一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法，
一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法所述的方法包括步骤：
(a)TsO-PEG-OTs的制备：将溶有对甲苯磺酰氯的吡啶溶液滴加到溶有聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，20-50℃下搅拌1-40h，盐酸溶液洗涤有机相，碳酸氢盐去除盐酸，旋转蒸发去除液相，旋蒸过程在30-60℃下进行，并缓慢减压至真空(防止低沸点溶剂爆沸)，旋蒸至无流动态液相，得到第一粗产品，将所述的第一粗产品溶解于四氢呋喃，滴加乙醚使TsO-PEG-OTs析出，过滤后，在0-30℃下真空干燥得到TsO-PEG-OTs，所述TsO-PEG-OTs的结构如式I所示，其中，所述的聚乙二醇分子质量为282-8036，n为6-182；
(b)H2N-PEG-NH2的制备：TsO-PEG-OTs溶于氨水，TsO-PEG-OTs与氨水中铵根离子、氨分子及一水合氨分子总量的摩尔比为1:50-200，并置于高压反应釜中在120-160℃、10-30bar的条件下反应4-12h，反应完毕后，冷却到10-40℃后，用二氯甲烷萃取水相，用氢氧化钠溶液和蒸馏水依次洗涤有机相，旋转蒸发去除液相，旋蒸过程在30-60℃下进行，并缓慢减压至真空(防止低沸点溶剂爆沸)，旋蒸至无流动态液相，得第二粗产品后，将第二粗产品溶于四氢呋喃，再滴加过量乙醚使H2N-PEG-NH2析出，过滤，在0-30℃下真空干燥固态物得H2N-PEG-NH2，所述H2N-PEG-NH2的结构如式II所示，其中，n为6-182；
(c)biotin-PEG-NH2的制备：将生物素溶于2-吗啉乙磺酸的水溶液中，再依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，10-40℃下搅拌反应5-60min后加碳酸盐或碳酸氢盐粉末调整溶液pH为6-8，再加入溶有H2N-PEG-NH2的缓冲液，10-40℃下搅拌反应，用二氯甲烷萃取水相，用蒸馏水洗涤有机相，旋转蒸发去除液相，旋蒸过程在30-60℃下进行，并缓慢减压至真空(防止低沸点溶剂爆沸)，旋蒸至无流动态液相，得粗产品后，将粗产品溶于四氢呋喃，再滴加过量乙醚使biotin-PEG-NH2析出，过滤，在0-30℃下真空干燥固态物得biotin-PEG-NH2，所述biotin-PEG-NH2的结构如式III所示，其中，n为6-182，所述的碳酸盐或碳酸氢盐选自下组：碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠或其组合。
(d)生物素磁珠的制备：将被硅烷偶联剂修饰的羟基磁珠加入溶有biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液，加热搅拌进行反应，将磁珠沉降并清洗后得到可用于蛋白纯化的生物素磁珠，其中，所述的硅烷偶联剂选自下组：3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、3-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-(3,4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷或其组合。
所述的步骤(a)具有选自以下一个或多个特征：
(a-1)对甲苯磺酰氯的吡啶溶液的浓度为0.3-1.2mol/L；
(a-2)聚乙二醇的二氯甲烷溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；
(a-3)聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:2-8；
(a-4)聚乙二醇的分子质量为282-8036。
所述的步骤(b)还包括步骤：将第二粗产品溶于四氢呋喃，再滴加过量乙醚使H2N-PEG-NH2析出，在-10～5℃下冷却0-24h，所述的步骤(b)中，氨水的浓度为25-28％(w/w)。
所述的步骤(c)具有选自以下一个或多个特征：
(c-1)H2N-PEG-NH2的缓冲液中，H2N-PEG-NH2的摩尔浓度为1×10-4-2×10-3mol/L；
(c-2)H2N-PEG-NH2的缓冲液中，含有0.065-0.072mol/L的Na2HPO4，0.028-0.035mol/L的NaH2PO4，0.1-0.2mol/L的NaCl。
所述的步骤(d)具有选自以下一个或多个特征：
(d-1)所述的biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液中，biotin-PEG-NH2的摩尔浓度为5×10-8-5×10-3mol/L；
(d-2)所述的biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液中，醋酸的体积分数为0.5-2％。
一种生物素磁珠
生物素磁珠的结构如式IV所示，其中，n为6-182。
生物素磁珠的用途
所述生物素磁珠的用途：用于蛋白质分离纯化。
发明优点：
(1)制备方法简单易操作，制备工艺易放大，适用于大规模的工业化生产。
(2)制备所需的反应物均为价格低廉、易获取的化工、生物原材料。
(3)磁珠表面的修饰活化可根据需求进行调控，通过控制硅烷偶联剂和磁珠的添加比例实现对磁珠表面特异性抗体、受体分布密度的调控；通过调控不同分子链长的聚乙二醇作为制备起点，可实现对磁珠与特异性抗体、受体之间相对距离的调控。
(4)活化的磁珠分离目标蛋白可有效避免繁琐的离心、层析、电泳等操作。
(5)使用之后的磁珠也可在洗脱目标蛋白之后多次回收利用，进而降低成本。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
实施例1
磁珠的制备
步骤(a)：称量40.0g聚乙二醇(分子量2000)置于1L圆底烧瓶内，向此圆底烧瓶中加入200mL二氯甲烷将固态聚乙二醇完全溶解；称量11.4g对甲苯磺酰氯于烧杯中，向此烧杯中加入100mL吡啶将固态对甲苯磺酰氯完全溶解，然后将此对甲苯磺酰氯的吡啶溶液全部转移至恒压滴液漏斗中，通过恒压滴液漏斗将对甲苯磺酰氯的吡啶溶液缓慢滴加至溶有聚乙二醇的圆底烧瓶内，滴加过程为1小时并通过磁子持续搅拌，滴加完成后室温搅拌反应24小时。反应完成后向反应液中加入450mL 3mol/L的盐酸溶液，搅拌洗涤1小时，然后将溶液全部转移至1L的分液漏斗中，静置分层。取下层有机相至烧杯中，向此有机相中缓慢加入固态碳酸氢钠粉末同时剧烈搅拌至无气泡产生，通过滤纸过滤除去固态物，将滤液旋转蒸发除去有机溶剂，得到白色粗产品。将此粗产品溶于18mL四氢呋喃中，并通过恒压滴液漏斗缓慢滴加800mL的过量乙醚，滴加过程中不断有白色固态物析出，乙醚滴加完后将整个混合物体系置于4摄氏度的冰室10小时。通过布氏漏斗抽滤将白色析出物从混合体系中分离出来，将所得白色析出物真空干燥获得TsO-PEG-OTs。
步骤(b)：称量22.7g TsO-PEG-OTs置于250mL圆底烧瓶内，向此圆底烧瓶中加入80mL氨水(25～28％)将固态TsO-PEG-OTs完全溶解，然后将圆底烧瓶内的溶液转移至两个100mL高压反应釜内，用20mL氨水(25～28％)润洗圆底烧瓶，润洗液也转移至这两个高压反应釜中，将这两个高压反应釜置于140摄氏度油浴中反应6小时，反应结束后，自然冷却至室温。将两个高压反应釜内的溶液转移至同一1L的圆底烧瓶内，加入160mL二氯甲烷搅拌萃取4小时，将溶液全部转移至1L的分液漏斗中，静置分层。取下层有机相于圆底烧瓶内，并向其中加入150mL 1mol/L的氢氧化钠溶液，搅拌反应4小时，将溶液全部转移至1L的分液漏斗中，静置分层。取下层有机相于圆底烧瓶内，加入100mL蒸馏水搅拌洗涤2小时，将溶液全部转移至1L的分液漏斗中，静置分层，分离出下层有机相，继续用蒸馏水以相同的方式再洗涤两次。将所得有机相旋转蒸发，除去有机溶剂，得到固体粗产品，将此粗产品溶于60mL四氢呋喃中，之后通过恒压滴液漏斗缓慢滴加500mL的乙醚，乙醚滴加完后将整个混合物体系置于4摄氏度的冰室10小时。通过布氏漏斗抽滤将固体析出物从混合体系中分离出来，将所得析出物真空干燥获得H2N-PEG-NH2。
步骤(c)：称量59.87g的NaH2PO4置于1L烧杯中，用蒸馏水溶解并转移至500mL容量瓶中定容，配得1mol/L的NaH2PO4溶液；称量70.94g的Na2HPO4置于1L烧杯中，用蒸馏水溶解并转移至500mL容量瓶中定容，配得1mol/L的Na2HPO4溶液。Coupling buffer的配置：移取34.2mL 1mol/L的Na2HPO4溶液和15.8mL 1mol/L的NaH2PO4溶液至1L烧杯中，称量4.39gNaCl至同一烧杯中，用蒸馏水溶解并转移至500mL容量瓶中定容；Activation buffer的配置：称量9.76g 2-吗啉乙磺酸和14.63g NaCl至同一烧杯中，用蒸馏水溶解并转移至500mL容量瓶中定容。称取0.25g D-(+)-biotin至装有250mL的activation buffer中，再依次加入0.77g1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐、0.46g N-羟基丁二酰亚胺，搅拌15分钟，加入碳酸氢钠粉末调整溶液pH至7.2，加入250mL溶有2g H2N-PEG-NH2的coupling buffer，室温搅拌反应20小时。向反应体系中加入200mL二氯甲烷搅拌萃取8小时，将溶液全部转移至1L的分液漏斗中，静置分层，分离出下层有机相，向有机相中加入100mL蒸馏水搅拌洗涤2小时，将溶液再全部转移至1L的分液漏斗中，静置分层，分离出下层有机相。将所得有机相进行旋转蒸发蒸发，除去有机溶剂，得到固体粗产品，向此粗产品中加入15mL四氢呋喃，之后通过恒压滴液漏斗缓慢滴加300mL乙醚，乙醚滴加完后将整个混合物体系置于4摄氏度的冰室10小时。通过布氏漏斗抽滤将固体析出物从混合体系中分离出来，将所得析出物真空干燥获得biotin-PEG-NH2。
步骤(d)：移取200mL羟基磁珠溶液(50mg/mL)至1L烧杯中，沉降磁珠，移除水层，加入100mL四氢呋喃，摇匀混合，沉降磁珠，移除液相层，第二次加入100mL四氢呋喃，摇匀混合，沉降磁珠，移除液相层，向烧杯中加入300mL二氯甲烷和10mL 3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷，50摄氏度水浴搅拌反应24h，沉降磁珠，移除液相层，加入100mL四氢呋喃，摇匀混合，沉降磁珠，移除液相层，第二次加入100mL四氢呋喃，摇匀混合，沉降磁珠，移除液相层，加入250mL 1％(v/v)醋酸，摇匀混合，沉降磁珠，移除液相层，向烧杯中加入200mL 1％(v/v)醋酸和0.2g biotin-PEG-NH2，50摄氏度水浴搅拌反应24h，沉降磁珠，移除液相层，加入200mL 1％醋酸清洗两次，加入200mL蒸馏水清洗一次，最后加入200mL蒸馏水，密封保存于4摄氏度冷室。
实施例2
取实施例1合成的磁珠溶液2mL，利用磁铁沉降磁珠，去除上层清液，加入2mL PBS溶液清洗(136.89mM NaCl，2.67mM KCl，8.10mM Na2HPO4，1.76mM KH2PO4，pH 7.2-7.4)，充分摇晃混合，利用磁铁沉降磁珠，去除上层清液，继续用2mL PBS溶液重复清洗两次，向清洗后的磁珠中加入2mL PBS溶液混匀，取500μL上述磁珠溶液至15mL离心管中，加入5mL无细胞体外蛋白合成系统的反应混合液(该系统中包含酵母细胞提取物、DNA模板、多种无机盐、氨基酸、核苷三磷酸等)和5mL PBS，室温下翻转混合反应2小时，利用磁铁沉降磁珠，去除上清液，加入5mL洗涤液(washing buffer)(1M NaCl，20mM tris-HCl，1％tween，pH7.5)，室温下翻转混合5min，利用磁铁沉降磁珠，去除上清液，继续用5mL wash buffer重复清洗两次，向清洗后的磁珠中加入5mL PBS溶液混匀，利用磁铁沉降磁珠，去除大部分上清液，留1mLPBS，转移至1.5mL离心管中，利用磁铁沉降磁珠，去除上清液，加入500μL PBS溶液混匀，取20μL，加入5μL的5X SDS-PAGE loading buffer,95度加热5分钟，取20μL进行SDS-PAGE凝胶电泳，在180V电压下进行40min,考马斯亮蓝染色显色，确定目标条带。
如图1所示，1号样品的分离纯化条件为500μL磁珠+5mL无细胞体外蛋白合成系统的反应混合液；2号样品的分离纯化条件为500μL磁珠+3.75mL反应混合液；3号样品的分离纯化条件为500μL磁珠+2.5mL反应混合液。目标蛋白的分子量约为62kDa。利用磁珠分离纯化反应混合液后，凝胶电泳图中仅有三条较为明显的条带，其中包含明显被区分出来的目标条带，大多数非目标条带在磁珠分离纯化后消失不见，说明目标蛋白已被较好地分离纯化，在体系中占有较高的比例。综上所述，合成的磁珠对目标蛋白具有较好的分离纯化效果。
对比例
取无细胞体外蛋白合成系统的反应混合液2mL(该系统中包含酵母细胞提取物、DNA模板、多种无机盐、氨基酸、核苷三磷酸等)，加入18mL PBS缓冲液混合均匀，加入5mL的5X SDS-PAGE上样缓冲液(loading buffer),95度加热5分钟，取20uL进行SDS-PAGE凝胶电泳，在180V电压下进行40min,考马斯亮蓝染色显色，确定目标条带。
图2所示，PC代表阳性对照，无细胞体外蛋白合成系统的反应混合液中含有DNA模板，所以有被合成的目标蛋白；NC代表阴性对照，不含有目标蛋白，但是反应混合液本身含有多种非目标蛋白。目标蛋白分子量约为62kDa，埋没在反应混合液本身含有的非目标蛋白条带中。未利用磁珠分离纯化反应混合液时，凝胶电泳图中含有很多颜色较深的非目标条带，即反应混合液中有很多种非目标蛋白，并且这些非目标蛋白拥有很高的浓度，目标蛋白仅占很小的比例，并被埋没在非目标条带中。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法，其特征在于，所述的方法包括步骤：
(a)TsO-PEG-OTs的制备：将溶有对甲苯磺酰氯的吡啶溶液滴加到溶有聚乙二醇的二氯甲烷溶液中，制得TsO-PEG-OTs固体，所述TsO-PEG-OTs的结构如式I所示：
(b)H2N-PEG-NH2的制备：TsO-PEG-OTs溶于氨水，并置于高压反应釜中在120-160℃、10-30bar的条件下反应4-12h，反应完毕后，制得H2N-PEG-NH2固体，所述H2N-PEG-NH2的结构如式II所示：
(c)biotin-PEG-NH2的制备：将生物素溶于2-吗啉乙磺酸的水溶液中，再依次加入1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺盐酸盐和N-羟基丁二酰亚胺，反应完毕后，加入碳酸盐或碳酸氢盐调节pH为6-8后，加入H2N-PEG-NH2缓冲液制得biotin-PEG-NH2，所述biotin-PEG-NH2的结构如式III所示：
(d)生物素磁珠的制备：将被硅烷偶联剂修饰的羟基磁珠加入溶有biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液，加热搅拌进行反应，将磁珠沉降并清洗后得到可用于蛋白纯化的生物素磁珠。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的硅烷偶联剂选自下组：3-(2,3-环氧丙氧)丙基三甲氧基硅烷、3-(2,3-环氧丙氧)丙基三乙氧基硅烷、3-(3,4-环氧环己基)乙基三甲氧基硅烷、3-(3,4-环氧环己基)乙基三乙氧基硅烷或其组合。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的结构式I、结构式II、以及结构式III中，n为6-182。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的碳酸盐或碳酸氢盐选自下组：碳酸钾、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠或其组合。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(a)具有选自以下一个或多个特征：
(a-1)对甲苯磺酰氯的吡啶溶液的浓度为0.3-1.2mol/L；
(a-2)聚乙二醇的二氯甲烷溶液的浓度为0.05-0.2mol/L；
(a-3)聚乙二醇与对甲苯磺酰氯的摩尔比为1:2-8；
(a-4)聚乙二醇的分子质量为282-8036。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(b)具有选自以下一个或多个特征：
(b-1)氨水的浓度为25-28％(w/w)；
(b-2)TsO-PEG-OTs与氨水中铵根离子、氨分子及一水合氨分子总量的摩尔比为1:50-200。
7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(c)具有选自以下一个或多个特征：
(c-1)H2N-PEG-NH2的缓冲液中，H2N-PEG-NH2的摩尔浓度为1×10-4-2×10-3mol/L；
(c-2)H2N-PEG-NH2的缓冲液中，含有0.065-0.072mol/L的Na2HPO4，0.028-0.035mol/L的NaH2PO4，0.1-0.2mol/L的NaCl。
8.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤(d)具有选自以下一个或多个特征：
(d-1)所述的biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液中，biotin-PEG-NH2的摩尔浓度为5×10-8-5×10-3mol/L；
(d-2)所述的biotin-PEG-NH2的醋酸水溶液中，醋酸的体积分数为0.5-2％。
9.一种生物素磁珠，其特征在于，所述的生物素磁珠由权利要求1所述的制备方法制成，所制得生物素磁珠的结构如式IV所示，其中，n为6-182。
10.如权利要求9所述生物素磁珠的用途，其特征在于，用于蛋白质分离纯化。
CN201810466571.2A 2018-05-16 2018-05-16 一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法 Pending CN110498830A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810466571.2A CN110498830A (zh) 2018-05-16 2018-05-16 一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201810466571.2A CN110498830A (zh) 2018-05-16 2018-05-16 一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN110498830A true CN110498830A (zh) 2019-11-26

Family

ID=68583622

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201810466571.2A Pending CN110498830A (zh) 2018-05-16 2018-05-16 一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110498830A (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111569844A (zh) * 2020-04-29 2020-08-25 南京理工大学 一种预活化的亲水磁性微球及其制备方法

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1829803A (zh) * 2003-07-18 2006-09-06 Qtl生物系统有限公司 蛋白酶活性分析
CN101511892A (zh) * 2006-06-29 2009-08-19 英维特罗根戴内尔公司 含有多嵌段聚合物的颗粒
EP2133695A1 (en) * 2008-06-12 2009-12-16 Koninklijke Philips Electronics N.V. Parathyroid hormone assay
CN102617810A (zh) * 2012-02-27 2012-08-01 重庆医科大学 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用
CN103255104A (zh) * 2013-04-17 2013-08-21 广州爱菲科生物科技有限公司 单抗l-ngfr免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法
CN103444979A (zh) * 2013-08-09 2013-12-18 南昌大学 一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法
CN104498602A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 南京医科大学第二附属医院 一种基于磁珠与超声分离发光标记物的核酸检测方法

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1829803A (zh) * 2003-07-18 2006-09-06 Qtl生物系统有限公司 蛋白酶活性分析
CN101511892A (zh) * 2006-06-29 2009-08-19 英维特罗根戴内尔公司 含有多嵌段聚合物的颗粒
EP2133695A1 (en) * 2008-06-12 2009-12-16 Koninklijke Philips Electronics N.V. Parathyroid hormone assay
CN102617810A (zh) * 2012-02-27 2012-08-01 重庆医科大学 用两端带羧基的直链亲水聚合物包被纳米磁芯制备微纳米磁性材料的方法及其应用
CN103255104A (zh) * 2013-04-17 2013-08-21 广州爱菲科生物科技有限公司 单抗l-ngfr免疫磁珠可逆分选人脂肪间充质干细胞的方法
CN103444979A (zh) * 2013-08-09 2013-12-18 南昌大学 一种固定化酶水解降低蛋清蛋白致敏性的方法
CN104498602A (zh) * 2014-12-11 2015-04-08 南京医科大学第二附属医院 一种基于磁珠与超声分离发光标记物的核酸检测方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
LONG GB等: "Facile one-step coating approach to magnetic submicron particles with poly(ethylene glycol) coats and abundant accessible carboxyl groups", 《INTERNATIONAL JOURNAL OF NANOMEDICINE》 *
刘永军: "基于诊断治疗学多功能纳米系统用于肝细胞癌的分子诊断与治疗", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *
徐鹏等: "免疫磁珠法分离纯化骨髓间充质干细胞及向神经细胞定向分化", 《中国组织工程研究与临床康复》 *
曾戎: "《多糖基高分子药物轭合物的设计、合成、表征和评价》", 31 May 2011, 广州：华南理工大学出版社 *
谭贵良等: "《现代分子生物学及组学技术在食品安全检测中的应用》", 30 June 2014, 广州：中山大学出版社 *
高正炎等: "端氨基聚乙二醇-聚乳酸嵌段共聚物的合成及表征", 《化工新型材料》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN111569844A (zh) * 2020-04-29 2020-08-25 南京理工大学 一种预活化的亲水磁性微球及其制备方法
CN111569844B (zh) * 2020-04-29 2023-05-26 南京理工大学 一种预活化的亲水磁性微球及其制备方法

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101646610B1 (ko) 생체 물질 정제용 고활성 실리카 자성나노입자 및 이의 제조 방법
CN104418990B (zh) 一种有机无机杂化微球颗粒及其制备和应用
US8551332B2 (en) Affinity particle and affinity separation method
CN108136275A (zh) 用于超临界流体色谱法的包含离子配对键合相的高纯度色谱材料
US10859477B2 (en) Bioseparation compositions and methods for making and using same
Zhao et al. An epitope imprinting method on the surface of magnetic nanoparticles for specific recognition of bovine serum album
US20100174052A1 (en) Separation method using polymer multi phase systems
CN104549183B (zh) 硅胶色谱填料及其制备方法
Xu et al. A deep eutectic solvent modified magnetic β-cyclodextrin particle for solid-phase extraction of trypsin
CN104289209B (zh) 一种用于蛋白质分离的wcx/hic双功能混合模式聚合物基质色谱固定相及其制备方法
CN110498830A (zh) 一种用于蛋白分离纯化的磁珠的制备方法
CN105289558B (zh) 多组分嵌段亲水共聚物‑硅胶杂化色谱填料的制备及应用
EP0160988B1 (en) Stable silica-based ether bonded phases for biopolymer separations
Meng et al. The use of aggregation-induced emission probe doped silica nanoparticles for the immunoassay of human epididymis protein 4
CN109337678A (zh) 一种光色可调疏水性荧光碳点的制备方法
CN108889285A (zh) 限进型色谱填料及其制备方法和包含其的固定相以及应用
He et al. Multidentate boronate magnetic adsorbent assembled with polyhedral oligomeric silsesquioxanes and intramolecular diboronic acid for improving the binding strength toward glycoproteins
Zheng et al. Preparation of tungstotellurate (VI)-coated magnetic nanoparticles for separation and purification of ovalbumin in egg white
CN112973655A (zh) 一种离子交换色谱固定相及其制备和应用
CN116116385A (zh) 一种血液中外泌体的提取及其蛋白质组学分析方法
CN111057185B (zh) 一种用于对胃蛋白酶选择性分离的功能磁性材料和应用
KR101800004B1 (ko) 산화그래핀으로 수식된 자성 비드, 이의 제조방법 및 이를 이용한 핵산의 분리방법
CN110170305B (zh) 一种聚赖氨酸的分离工艺
Hu et al. A novel high-capacity immunoadsorbent with PAMAM dendritic spacer arms by click chemistry
CN117599763B (zh) 一种双富集基团富集磁珠的制作方法及应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
RJ01 Rejection of invention patent application after publication

Application publication date: 20191126

RJ01 Rejection of invention patent application after publication