CN104549183B - 硅胶色谱填料及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种硅胶色谱填料，其表面的有机层覆盖率大，残余硅羟基效应弱，残余金属杂质影响小，色谱性能稳定；在100%水作为流动相条件下寿命长，填料表面的固定相分子流失小，分析重现性高；在分析强极性化合物时，色谱峰形对称性好，柱效和分离度较高；硅胶表面有机层覆盖度较高，表面通过极性改性，同时增加了亲水性和弱离子交换功能；其具有如下结构式：

Description

硅胶色谱填料及其制备方法
技术领域
本发明涉及色谱材料领域，具体涉及一种硅胶色谱填料及其制备方法。
背景技术
色谱分离从二十世纪七十年代开始在分析和分离领域广泛应用。其中反相色谱采用非极性键合相作为固定相，根据不同组分和固定相之间疏水作用的不同达到分离目的，分离效率高、保留机理清楚，是最为广泛应用的一种分离模式。目前有70%的分析工作都是在反相模式中完成的，对于生物分子、药物分子及蛋白质的分析，反相液相色谱正受到越来越多的关注。
随着生物和制药技术的发展，生物和制药样品越来越复杂，在样品的分离纯化和分析技术上还有很多难题需要解决，例如对强极性化合物的分离，特别是在生物和制药领域。传统的反相色谱模式对这些强极性化合物的保留很弱，导致对于复杂样品没有很好的分离度；为了增加强极性化合物的保留，往往会在传统反相色谱中添加离子对试剂提高分离度；或者为了改善色谱峰型，添加无机的酸、碱和盐。随着分析仪器的不断发展，越来越多的分析工作在液相色谱-质谱联用系统开展，这些传统反相色谱中流动相添加剂的使用，严重干扰质谱的信号，甚至造成仪器污染和损坏。因此，近年来技术人员开发出了亲水作用液相色谱模式（HILIC）用于强极性化合物的分离。HILIC分离机理类似于正相色谱，使用极性固定相和弱极性流动相，但是与正相色谱不同的是HILIC可以使用水作为流动相，这样，达到增加强极性化合物的保留的目的，又可以和质谱进行联用。
但是HILIC色谱的固定相类型仍然是使用正相固定相，直接在硅胶表面键合氨基、氰基等极性基团。这种固定相能够很好的解决强极性化合物的保留问题，但是存在使用寿命短和重现性差的问题。例如，固定相在酸性条件下会发生电离，硅胶表面的状态会随pH变化发生改变，对分离造成不可逆的影响，对于柱子寿命有很大影响。技术人员开始研制能耐100%水溶液的色谱分离材料，使得对亲水化合物分离度的提高。这种亲水色谱分离填料属于反相色谱模式，是在硅胶表面和烷烃链之间插入特定的极性基团，从而改变硅胶极性，增强对极性化合物的保留。亲水反相色谱填料，可以100%水作为流动相，且填料在酸性条件下稳定，保证了结果的重现性和柱子的稳定性。
发明目的
本发明的目的在于提供一种硅胶色谱填料，其表面的有机层覆盖率大，残余硅羟基效应弱，残余金属杂质影响小，色谱性能稳定。
为实现上述目的本发明采用如下技术方案：
一种硅胶色谱填料，其具有以下结构式：
其中：X为极性小分子氨、三甲胺、二乙胺、三乙胺等；
R为疏水性长链烷基。
优选，R为C1～C18的疏水性长链烷基。
上述硅胶色谱填料具有如下优点：
1、表面的有机层覆盖率大，残余硅羟基效应弱，残余金属杂质影响小，色谱性能稳定；
2、在100%水作为流动相条件下寿命长，填料表面的固定相分子流失小，分析重现性高；
3、在分析强极性化合物时，色谱峰形对称性好，柱效和分离度较高；
4、硅胶表面有机层覆盖度较高，表面通过极性改性，同时增加了亲水性和弱离子交换功能。
该硅胶色谱填料可由硅胶改性试剂、硅胶和偶氮二异丁腈制得，硅胶改性试剂的结构式为：
具体的制备方法为：
一种制备硅胶色谱填料的方法，包括如下步骤：
S1:将甘油二酯与2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷进行低温酯化反应，低温酯化反应结束后将X试剂与低温酯化反应产物进行开环反应合成硅胶改性剂，反应式具体如下：
S2:将活化硅胶与有机硅烷偶联剂进行反应制得经有机硅烷偶联剂表面修饰后的硅胶，反应式具体如下：
S3:将硅胶改性剂、表面修饰后的硅胶和偶氮二异丁腈混合进行聚合反应得到改性后的硅胶，然后对改性后的硅胶进行洗涤纯化后制得该硅胶色谱填料，反应式具体如下：
进一步的方案为：
该方法还包括用封尾试剂与改性后的硅胶搅拌回流进行封尾处理，封尾试剂为三甲基氯硅烷/三甲基氯硅烷和六甲基二硅氮烷按照1～3:1的体积比混合配制而成，搅拌回流的时间为12～48h。
通过长期试验，在实现本发明目的的基础上，按以下优化方案制得的硅胶色谱填料各项性能更佳，该优化方案具体如下：
活化硅胶为多孔球形硅胶经盐酸回流，用蒸馏水洗涤、真空干燥后得到，多孔球形硅胶为单分散微球硅胶，单分散微球硅胶的粒径为1.5～40μm、孔径为50～300A，反应式具体如下：
有机硅烷偶联剂为(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、甲基三甲(乙)氧基硅烷、乙基三甲(乙)氧基硅烷和丙基桥链六甲(乙)氧基硅烷中的一种或几种构成。
S2中活化硅胶与有机硅烷偶联剂在惰性气体保护下进行搅拌回流反应，反应结束后冷却、抽滤，然后依次用甲苯、甲醇、水、乙醚对反应产物进行洗涤，洗涤后对产物进行真空干燥；活化硅胶与有机硅烷偶联剂所用的反应溶剂为乙腈或甲苯，有机硅烷偶联剂与活化硅胶的液固比为5-40ml/g。
S3中聚合反应在乙腈反应溶剂中进行，改性后的硅胶用乙腈、甲醇和乙醚进行洗涤，以除去未键合的有机硅烷偶联剂和硅胶改性剂。
本发明中未对上述步骤S1、S2、S3中反应的物料比、温度、时间进行限定，本领域技术人员可以根据上述公开的反应式、各物料的性质以及后续具体实施例内容而选取相应的物料比、温度、时间进行反应，其不应理解为公开不充分。
附图说明
图1为实施例1制得的硅胶色谱填料的电镜图；
图2为实施例1制得的硅胶色谱填料的色谱图。
具体实施方式
以下通过具体的操作来对本发明作进一步的详细说明，但其不应理解为对本发明权利要求的限制，其中实施例1为制备硅胶改性剂，实施例2～4为制备硅胶色谱填料。
实施例1
低温油浴中安装250ml四口烧瓶。称取十八烷酸-丙烯酸-甘油酯【CH2CH(CO)OCH(CH2OH)CH2O(CO)(CH2)16CH3】4.12g和1.3g的三乙胺（Et3N）加入到反应器中，再加入30ml无水乙醚和四氢呋喃的混合溶剂，控制油浴在-5℃，10min内加入1.6g的COP和5ml的混合溶剂加入到反应器中，同时反应器升温至室温。加入5ml正己烷，过滤反应液，再用混合溶剂清洗，旋转蒸发后将残留物溶于20ml乙腈，倒入反应器中，再加入2倍理论反应物质的量的氨水，冷凝回流。反应温度60℃，反应时间48小时。将反应产物冷却到室温，加入200ml乙醚，过滤，冲洗，重结晶得到白色粉状产物（用Y-C18-NH3表示）。
实施例2
硅胶活化：将20%盐酸与3μm粒径、120A孔径的多孔球形硅胶混合（按盐酸与硅胶体积质量比质量比2ml/g），90℃回流6小时，用蒸馏水洗涤，105℃烘3小时，50℃真空干燥6小时，得到活化硅胶。
称取4g活化的硅胶加入反应器中，加入25ml甲苯作为反应溶剂。加入4ml(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷（MPS），惰性气体保护，搅拌回流，反应72小时。反应完毕后冷却，抽滤，依次用甲苯、甲醇、水、乙醚洗涤，真空干燥（室温）得到表面MPS修饰的硅胶（Sil-MPS）。
将Sil-MPS（4g）、由实施例1制备得到的Y-C18-NH3（4g）和偶氮二异丁腈（AIBN）30mg混合，以40ml乙腈作为反应溶剂，加入三口烧瓶器中，60℃搅拌反应60小时。反应完成后冷却，过滤沉淀，依次用乙腈、甲醇和乙醚洗涤，产物在105℃下烘4小时，50℃真空干燥6小时，得到极性改性键合硅胶（SilY-C18-NH3）。
把所得到的改性色谱填料填装于2.1mm*100mm的不锈钢色谱柱中，填装的色谱柱用于测试其在亲水模式下对强极性化合物混合样品的分离。用于分离青霉素及其结构类似物的条件为：乙腈/水作为流动相，乙腈：水=5:95（体积比），流速200μl/min，柱温30℃，检测波长254nm，色谱图如图2所示（1为6-氧代哌啶-2-甲酸，2为6-氨基青霉烷酸，3为青霉素V，4为青霉素G）
实施例5
硅胶活化：将20%盐酸与3μm粒径、300A孔径的多孔球形硅胶混合（按盐酸与硅胶体积质量比质量比3ml/g），95℃回流6小时，用蒸馏水洗涤，105℃烘3小时，50℃真空干燥6小时，得到活化硅胶。
称取4.5g活化的硅胶加入反应器中，加入35ml甲苯作为反应溶剂。加入5mlMPS，惰性气体保护，搅拌回流，反应72小时。反应完毕后冷却，抽滤，依次用甲苯、甲醇、水、乙醚洗涤，真空干燥（室温）得到表面MPS修饰的硅胶（Sil-MPS）。
将Sil-MPS（4.5g）、由实施例1制备得到的Y-C18-NH3（4g）和AIBN（35mg）混合，以40ml乙腈作为反应溶剂，加入三口烧瓶器中，60℃搅拌反应72小时。反应完成后冷却，过滤沉淀，依次用乙腈、甲醇和乙醚洗涤，产物在105℃下干燥3小时，50℃真空干燥6小时，得到极性改性键合硅胶（SilY-C18-NH3）。
实施例4
硅胶活化：将20%盐酸与10μm粒径、150A孔径的多孔球形硅胶混合（按盐酸与硅胶体积质量比质量比4ml/g），93℃回流6小时，用蒸馏水洗涤，105℃烘3小时，50℃真空干燥6小时，得到活化硅胶。
称取4.5g活化的硅胶加入反应器中，加入35ml甲苯作为反应溶剂。加入4.5mlMPS，惰性气体保护，搅拌回流，反应72小时。反应完毕后冷却，抽滤，依次用甲苯、甲醇、水、乙醚洗涤，真空干燥（室温）得到表面MPS修饰的硅胶（Sil-MPS）。
将Sil-MPS（4.5g）、由实施例1制备得到的Y-C18-NH3（4g）和AIBN（35mg）混合，以40ml乙腈作为反应溶剂，加入三口烧瓶器中，60℃搅拌反应72小时。反应完成后冷却，过滤沉淀，依次用乙腈、甲醇和乙醚洗涤，产物在105℃下干燥3小时，50℃真空干燥6小时，得到极性改性键合硅胶（SilY-C18-NH3）。

Claims (8)

1.一种硅胶色谱填料，其具有以下结构式：
其中：X为极性小分子氨、三甲胺、二乙胺、三乙胺；
R为C1～C18的疏水性烷基。
2.一种硅胶改性剂，其具有以下结构式：
其中：X为极性小分子氨、三甲胺、二乙胺、三乙胺；
R为C1～C18的疏水性烷基。
3.一种制备如权利要求1所述硅胶色谱填料的方法，包括如下步骤：
S1:将甘油二酯与2-氯-2-氧-1，3，2-二氧磷杂环戊烷进行低温酯化反应，低温酯化反应结束后将X试剂与低温酯化反应产物进行开环反应合成如权利要求2所述的硅胶改性剂；
S2:将活化硅胶与有机硅烷偶联剂进行反应制得经有机硅烷偶联剂表面修饰后的硅胶；
S3:将如权利要求2所述的硅胶改性剂、表面修饰后的硅胶和偶氮二异丁腈混合进行聚合反应得到改性后的硅胶，然后对改性后的硅胶进行洗涤纯化后制得该硅胶色谱填料；
X试剂为极性小分子氨、三甲胺、二乙胺、三乙胺。
4.如权利要求3所述的制备硅胶色谱填料的方法，其特征在于：该方法还包括用封尾试剂与改性后的硅胶搅拌回流进行封尾处理，封尾试剂为三甲基氯硅烷/三甲基氯硅烷和六甲基二硅氮烷按照1～3:1的体积比混合配制而成，搅拌回流的时间为12～48h。
5.如权利要求3所述的制备硅胶色谱填料的方法，其特征在于：活化硅胶为多孔球形硅胶经盐酸回流，用蒸馏水洗涤、真空干燥后得到，多孔球形硅胶为单分散微球硅胶，单分散微球硅胶的粒径为1.5～40μm、孔径为
6.如权利要求3所述的制备硅胶色谱填料的方法，其特征在于：有机硅烷偶联剂为(3-巯基丙基)三甲氧基硅烷、甲基三甲氧基硅烷、甲基三乙氧基硅烷、乙基三甲氧基硅烷、乙基三乙氧基硅烷、丙基桥链六甲氧基硅烷和丙基桥链六乙氧基硅烷中的一种或几种构成。
7.如权利要求3所述的制备硅胶色谱填料的方法，其特征在于：
S2中活化硅胶与有机硅烷偶联剂在惰性气体保护下进行搅拌回流反应，反应结束后冷却、抽滤，然后依次用甲苯、甲醇、水、乙醚对反应产物进行洗涤，洗涤后对产物进行真空干燥；活化硅胶与有机硅烷偶联剂所用的反应溶剂为乙腈或甲苯，有机硅烷偶联剂与活化硅胶的液固比为5～40ml/g。
8.如权利要求3所述的制备硅胶色谱填料的方法，其特征在于：
S3中聚合反应在乙腈反应溶剂中进行，改性后的硅胶用乙腈、甲醇和乙醚进行洗涤。
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