JP2661712C - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は決定されるべき性質のため１つまたはそれ以上の生理学的結合パート
ナーの存在において生物学流体中に特にホルモン，ステロイド，薬剤またはその
代謝物質，ビタミンまたは毒素のハプテン性質を有する遊離物質の決定のための
免疫方法に関する。この関連にて研究されるべき生物学的流体におけるこの型式
の物質の全量は遊離画分及び結合画分にわたり分布している。この関連にて、結
合画分は１つまたはそれ以上の生理学的タンパク質または同様のこれらの物質の
これらの結合パートナーに結合し、一定の親和力をもって特異的に多かれ少なか
れ特別の物質に結合できる。 ［従来の技術］ 結合及び非結合画分は相互に平衡状態にあり、非結合画分，換言すれば遊離物
質が生理的に活性成分を代表していること、一方結合画分は、この物質を使用で
きるようにする容器の型を構成することは妥当として最近の理論に基づき考えら
れている。更に、所謂輸送タンパク質に結合することは知られていて輸送タンパ ク質はその物質を有機体に分布させるよう働き、作用する位置に彼等を輸送する
。 物質の生理的に活性な画分と称される遊離物質の決定が臨床的診断においては
結合画分及び非結合画分を同時的に決定することよりもさらに価値があると近年
一般的に認められきた。「人体の流体における遊離（タンパク質−非結合）ホル
モンの直接的免疫的検定法」と題するＲ.Ｐ.Ｅkinsの論文はモデル的假説に基づ
き遊離物質の決定の理由を説明し、さらに遊離物質の決定に適している免疫学的
決定法の種々のタイプを図表にする試みを行っている。（「臨床化学のめの免疫
学的検定法」Ｗ.Ｎ.Ｈunter及びＪ.Ｅ.Ｔ.Ｃorrieによる編輯，Ｃhurchill Ｌiv
ingston,第２版（1983年）319-339頁） ヨーロッパ特許26,103及び73,865，ドイツ特許3,415,813は実際の応用階段で
開発された遊離物質のための免疫学的決定法を記載している。 Ｌ−サイロキシン（Ｔ4）及びＬ−トリヨードサイロナイン（Ｔ3）の遊離チロ
イドホルモンの決定を経由してチロイドの生理学的状態を確立することは医学的
に重要であるので前記特許はまず第１にこの型の決定方法に関し、記載された基
本的な方法のこの特殊な場合に対する応用を検討している。本発明において記述
した免疫学的決定方法の第１の重要さはチロイドの生理学的状態を確立すること
にある。 生きているヒトの有機体のなかを循環するＴ4が分布している結合タンパク質
はアルブミン（約１０％），サイロキシン−結合アルブミン（ＴＢＰＡ，約３０
％）及びサイロキシン−結合グロブリン（ＴＢＧ,約６０％）である。生理学的
能動遊離Ｔ4(ＦＴ4)はタンパク質結合Ｔ4の約０．０１から０．０３％である。
このことはＦＴ4の正規の濃度範囲が人体の流体の約８から２０ｐｇ／ｍｌの範
囲にあることを意味している。 現在、ＦＴ4を決定する方法で承認されたものは血清の平衡透析法である。（
Ｃlin.Ｉnvest.45（1966）153-163頁を参照）。これは血清に加えられている放
射性Ｔ4またはＴ4の放射性免疫決定法で直接得られる透析物中のＴ4含量を伴う
。しかしながら、高い信頼性にも拘わらず、この方法は２０時間という各々の決
定に好ましくない長時間を必要として日常の臨床診断には不適当である。 従って、さらに表示する特徴を有し、或る場合には可成りの不正確さを生じる
方法に加えて、日常的臨床診断のための決定されるべき遊離物質の濃度について
の直接的情報を与えることのできる免疫学的決定法が開発されてきた。これに関
連してこの型の免疫学的決定法が実際の応用階段で開発され、特に放射性免疫検
定法が決定されるべき物質の標識した形が研究されるべき試料に加えられ、公知
の競争原理が行われ、適当な抗体との反応の後に、決定されるべき物質の濃度に
ついて標識された抗体に基づいて確立された結合形の画分から結論がひき出され
る。この関連して、特にＦＴ4の遊離物質の決定において結合タンパク質の変形
による干渉を除外するために公知の方法において所謂Ｔ4−類似のトレーサーが
決定されるべき物質の標識された形として使用される。（ＦＴ4）のこれらのト
レーサーは化学構造により結合タンパク質に対する親和力が明らかに減少し、遊
離物質／結合物質の平衡に最小の作用を持つものである。しかしながら、多くの
著者はすくなくとも或る特殊な場合でこれからの方法の有効性と臨床値について
疑問を投げている。（Ｈelenius,Ｔ.,Ｌiewendahl,Ｋ.,Ｃlin.Ｃhem.29（５）（
1983）,816-822頁 ;Ｍardell,Ｒ.,Ｇamlen,Ｔ.Ｒ,Ｔhe Ｌancet,24th Ａpril 19
83,973-974頁 ;Ｇow,Ｓ.Ｍ.等、Ｃlinica Ｃhimica Ａcta 152（1985）,325-333
頁 ;Ｃhopra,Ｉ.Ｊ等、Ｊ.Ｃlin.Ｅndocrin.Ｍet.51(1)（1980）,135-143頁及び
Ｈerrmann,Ｊ.等、Ｎucl-Ｍed.21（5）（1982）,186-191頁）。その方法は厳し
い病（ＮＴＩ＝非−甲状腺病）の場合に多数の干渉及び影響因子（異化代謝産物
，タンパク質損失，内発的に放出されまたはヘパリンの影響のもとで脂肪酸）の
ための失敗している。（Ｒeiner,Ｃh.,Ａrztl.Ｌeb.31（1985）,331-344頁を参
照）。Ｉto，Ｍ.等によりＣlim.Ｃhem30（10）（1984）,1682-1685頁に記述され
たＦＴ4の決定のための酵素免疫検定法は類似のトレーサー方法に含まれるもの
であり、そこでＴ4−β−Ｄガラクトシダーゼ接合はトレーサーとして使用され
、結合タンパク質に結合していないものである。 酵素免疫検定法はＷeetal等によりＣlin.Ｃhen.28（4）（1982）666-671頁に
記載されているがＦＴ4画分を計画するための複雑な数学的モデル及び遊離及び
タンパク質−結合画分に対するＴ4−ワサビダイコン パオキシダーゼ接合の分
布に基づいている。２つの最後に述べた方法は日常臨床診断の本質的な部分に未
だなっていない。 決定されるべき物質の今迄の標識された形を記載したすべての方法につまり標
識された抗原が用いられた。 しかしながら、これらの抗体に結合する抗原の定量的検出のための標識抗体の
使用は原理としてすでに同様にＭiles,Ｌ.Ｅ.Ｍ.及びＨalcs.,Ｃ.Ｎ.,により最
初Ｎature219，（1986）186-189頁に記載されている。標識抗体及び固相に結合
した抗体の使用によりステロイドホルモンのようなより低い分子量の可能な免疫
的決定の記述はＳtafftord,Ｊ.Ｅ.Ｈ及びＫilgallon,Ｗ.のＪ.mmunol.Ｍethods
34（1980）,339-343頁にあり、放射性標識を使用している。蛍光標識を使用する
同様な決定法はＷood,Ｗ,Ｇ等によるＪ.Ｃlin.Ｃhem.Ｃlin.Ｂiochem.20（1982
）,825-831頁に記載されている。 すでに引用したＥkinsの理論的研究において１つの解説がある。その330頁に
第８図8.Ｉ.Ｊに記載された図を参照して決定されるべき物質のため１つまたそ
れ以上の生理学的結合タンパク質を有する遊離物質の決定のための免疫学的方法
を設計する他の可能な方法であり、そこで生物学流体は決定されるべぎ物質に対
して特異性抗体の一定量と反応する。さらに決定されるべき物質または過剰のこ
の物質の誘導体をもって液相から分離される固相について固相に結合して固定さ
れた形で標識を測定することにより、液相及び／または固相における標識された
抗体の含量を測定し、生物学的試料の決定されるべき遊離物質の含量が得られた
測定結果の電算機による処理で得られる。この方法が有効であるとすると考察に
おいて固相に結合する抗原の性質は標識された抗体の混合物と１００％の交差反
応性があるものであり、それは遊離形にて存在する抗原と比較して使用されてい
る。かくして標識抗原が可能であるこの方法による決定のために、固相に結合す
る抗原及び遊離抗原に対して比較的高い親和力を持つべきである。しかしながら
、この型の決定方法が実際に成功したということは未だ報告されていない。 ドイツ公開公報3,442,817によればＦＴ4の定量的決定を記載する方法の原則の
変形が記述されている。そこでの試料は標識した抗−Ｔ4と共にＴ4の全モル量を
基にして１／１０から１／２００の量で１０分間以下の培養が行われる。そのあ
とただちに過剰の固定されたＴ4が加えられ、再び新しい培養がすくなくとも１
分間行われる。ドイツ公開公報3,442,817のこの方法は代表的な「動的」方法で
あり、それは標識された抗−Ｔ4抗原と共に第１の主な培養の間で最初遊離形で
存在す るＴ4の量のみが捕獲され、そこには暖慢に平衡に戻るために放出されないです
でに結合したＴ4の放出が出ないという假説に明らかに基づいている。そのこと
は測定の結果を歪曲するであろう。前培養の期間において遊離Ｔ4と結合Ｔ4との
間の平衡がよく知られているように迅速に到達するために検定法の結果は影響を
うけるのでこの検定法はすべての同様の２段階検定法のように検定条件における
変化から干渉される傾向があり、実際の臨床に適切な方法として使用することを
困難にする欠点を持つのは当然である。 本発明の目的は日常の臨床診断に適していて、すぐに行うことができ、臨床的
情報の術語において適切であり、最適の感度を有し、決定方法に必要とされる材
料及び物質の最適な品質管理を実施し、製造を可能とする遊離物質の決定方法を
提供することである。 この目的は、本発明の特許請求の範囲第１項の前おき部によりその特徴部にあ
る特色による免疫学的決定方法により達成される。 有利な具体例は従属特許請求の範囲にある。本発明はそれ自身公知である基本
的方法に基づく免疫学的決定方法の開発にあたり例えばＥkingによりすでに記述
されているように実際の目的のために充分に高い再現性をもつ決定法がもしも得
られるならば、決定されるべきである遊離抗原に比較して好ましくは８から２５
％の範囲にあり５０％以下の大きく減少した交差反応性を持つことが固相に結合
した抗原のために必要であるという驚くべき認識に基づいている。Ｅkinsにより
提案された１００％交差反応性以上またはその領域においてより高い交差反応性
が明らかに歪曲した結果に導き、測定範囲が遊離物質のための臨床適に最適な濃
度範囲の外側にあることが驚くほどに明らかになった。交差反応性がすでに述べ
られた範囲の中に保たれる時に、ドイツ公開公報3,442,817の方法では必要とさ
れている前培養は不必要なものとなり、その方法は生物学的流体が標識された抗
体と過剰に存在する固定された抗原と同時に実質的に反応することができるため
に一段階で行うことができる。 この一段階方法の可能性は重要な利点を表している。一定の親和力を有する適
切な抗体または抗体混合物を選択するために、一段階方法では遊離物質／結合物
質の平衡において干渉がないかまたはごく僅かである。したがって、標識された 抗体と遊離物質及び固定された物質の異なる交差反応性が、固定された抗原に対
する標識された抗体の結合の動的挙動について把握することを必要とすることを
意味している。しかしながら、培養時間が変えられるところでは、これは遊離物
質／結合物質の平衡の移動に影響を及ぼさないで結合比に影響を及ぼす。 かくして一段階方法としての本発明による方法を重要な単純性をもたらす前培
養なしに行うことは好ましいことである。 本発明による方法は特にホルモン、ステロイド、薬剤またはその代謝物質、ビ
タミンまたは毒素を生物学的流体のなかでハプテン性質を持つ遊離物質の決定の
ために一般的に適当であるが、特に必要なことは遊離サイロキシン（ＦＴ4）と
遊離トリヨードサイロナイン（ＦＴ3）との関連である。 さらに本発明の方法は固相に結合することにより固定された反応物を使用する
決定方法のすべて公知の利点を持っている。固相の上の固定は必要である洗浄工
程を著しく簡単にし、決定の精度を改良する。決定されるべきである物質の固定
された形に結合される適切な固相はすべてそれ自身よく知られている不活性のキ
ャリヤ材料であり、適当な高結合能力及び充分に安定な結合性質を有し、それに
はポリスチレン、ホリエチレン、テフロンのようなプラスチックまたはガラスが
含まれている。適当な固相はアメリカ特許4,657,873及びＷood,Ｗ.Ｇ.及びＧado
w,Ａ.によりＪ.Ｃlin.Ｃhem.Ｃlin.Ｂiochem.21(1983)789-797頁の刊行物に記載
されている。抗体の反応性に相対的に小さい作用を有する相対的に小さいマーカ
ーによる標識は本発明の範囲において好ましいものである。特別に放射性同位元
素、特にヨードアイソトープ、及び発光物がある。しかしながら、トレーサー部
分が保持されるべき適切な抗体に関して必要な交差反応性を与えることを仮定す
るときに例えば酵素、基質、蛍光を発する標識、燐光を発する標識、ビオチン（
標識されたアビジンを経由して検知できる）または助因子はマーカーとして適し
ている。マーカーが測定の前に抗体から再び分離され、光学的、物理的または化
学的反応に基づき定量適に検知することのできるすべての物質も同じく直接標識
方法に使用できる。 本発明による方法の適切な抗体はこの型の方法に適切であると知られているす
べての抗体である。この型の抗体はＴ4及びＴ3のために親和力を有し、生理学的 結合タンパク質に対するＴ4とＴ3のおのおのの親和力よりも大きくない。この型
の抗−Ｔ4（またはＴ3）抗体は普通１０¹⁰１／ｍｏｌまたはそれ以下の親和力常
数を持っている。 本発明による方法において固定された物質またはその誘導体はキャリヤ物質と
接合の形で固相に固定されるのが望ましい。このための適切なキャリヤ成分はタ
ンパク質、ポリペプチドまたは多糖類のような高分子量物質であり、標識された
抗体及び標識された抗体混合は０．５％以下の交差反応性を持っている。これら
のキャリヤ成分は決定されるべきである物質が使用される抗体の生成に結合され
たキャリヤ成分に同一でないのが適切であり好ましい。 これに関連して、特別な接合の交差反応性がたとえ同一条件の下で同一の出発
物質から製造されたとしても広く変化できることは明らかである。特別に固定さ
れた形で明らかに同一な接合は非常に異なる交差反応性を表示できる。したがっ
て使用された抗体に関して各々特別の一群の交差反応性は本発明による方法のた
めに適当であるかを決定するために決定されねばならない。そこで交差反応性の
決定は本発明による方法において関係する接合を使用する可能性についてなされ
るよう明確な言明を与えている。これらの環境は決定されるべきであるところの
物質または誘導体の直接的使用の場合に存在する環境とは明らかに異なる。固定
された形または溶液中にて特殊な抗体に関する交差反応性はただ物質それ自身の
本質にのみ依存している。 本発明による方法を行うための培養条件はある限界の範囲内で使用した標識に
よって結合物質に及ぼす影響の考察して使用した特殊な抗体に依存し、本発明に
よって確立された範囲内で正確な交差反応性に依存する。適切な培養条件は培養
温度が１７°から３７℃であり、培養時間は３０分から３時間である。好ましい
培養条件は、実施例に使用された培養条件では２２℃で、２時間（±１０分）水
平型振とう機のなかで振とうして培養される。 結果として生じる検定方法の品質のために固相に結合するところの物質または
誘導体の減少した交差反応性の重要性はＦＴ3及びＦＴ4の決定に関係する本発明
の請求の範囲にあって好ましい実施例によって以下詳しく説明される。 固定に使用されるＴ4誘導体の製造 １．Ｌ−サイロキシン エチルエステル（Ｌ−Ｔ4 ＯＥt） サイロキシンエチルエステルはＣlyton，Ｊ.Ｃ及びＨems,Ｂ.Ａ.，Ｊ.Ｑrg.Ｃ
hem.1950年,840-843頁）を変形した方法により製造された。 ２．Ｎ−トリフルオロアセチルサイロキシン（ＴＦＡＴ4） ＴＦＡＴ4はＳchroeder等：「酵素学の方法」、57巻、生物発光及び化学発光
、ニューヨーク、アカデミープレス 1978年,424-445頁の変形した方法により製
造された。 この目的のため５ｇのＬ−サイロキシンは６０ｍｌの無水酢酸エチルに溶解し
た。１１．５ｍｌの３フッ化酢酸及び１．９ｍｌの３フッ化酢酸無水物が加えら
れ、混合物は０℃で１時間攪拌した。 反応混合物は加温して室温にした。２００ｍｌの水が反応混合物に加えられ、
得られた溶液は塩化ナトリウムで飽和した。有機相は分離して除かれ、飽和塩化
ナトリウム溶液で洗浄し、無水硫酸マグネシウムで乾燥した。乾燥した相は濾過
され、乾燥のため蒸発された。精製残渣は次の合成にさらに精製することなしに
使用した。 収量 ４．８ｇ 元素分析 計算値：Ｃ23.39％ Ｈ1.15％ Ｎ1.60％ 実測値 Ｃ23.19％ Ｈ1.12％ Ｎ1.63％ Ｔ4又はＴ4誘導体の接合（conjugate）の製造 接合（conjugate）１：ＩｇＧ−Ｌ−Ｔ40Ｅｔ接合（ＮＨ2に結合） 接合（conjugate）は活性エステル法により製造された。 ８０．５ｍｇのＬ−Ｔ4ＯＥｔ及び１１ｍｇの無水コハク酸は２ｍｌの乾燥し
アミンを除去したＤＭＦに溶融され、室温で一夜間攪拌された。１２．６ｍｇの
Ｎ−ヒドロキシコハク酸イミド及び２２．６ｍｇのＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシカ
ルボジイミドが反応混合物に加えられ、室温で１時間攪拌された。 活性エステル混合物は接合の製造にさらに精製することなしに使用された。 この目的のために１００ｍｇのウサギの免疫グロブリンＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ,
Ｍunich ）は２０ｍｌの水に溶解された。２００μｌの活性エステルが８００μｌの乾燥
したアミンを除去したＤＭＦに稀釈され、ウサギのＩｇＧの水溶液に加えられた
。約１２時間後、反応混合物は限外濾過により精製された。 収量：８５ｍｇ Ｌ−Ｔ4ＯＥｔとりこみ速度は紫外線分光器により決定されＩｇＧモル当たり
４．２であった。 接合タンパク質の構造 接合２：ＩｇＧ−Ｌ−Ｔ4接合（ＮＨ2及びＣＯＯＨに結合） 接合はカルボジイミド法により製造された。 １ｇのウサギのＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ,Ｍunich）が１００ｍｌの二回蒸留した水
に溶解され、１０から１５℃にて均衡を保った。 ２００ｍｇのＬ−サイロキシン（Ｈenning Ｂerlin,Ｂerlin）が乾燥されアミ
ンを除去したＤＭＦ及びメタノールのアルカリ性１：１混合物の５ｍｌに溶解さ
れた。 １．２５ｍｌのサイロキシン溶渣及び１００ｍｇの固体の１−エチル−２−（
３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミド（ＥＤＣ）が１．５時間の間、攪
拌されたＩｇＧ水溶液に加えられた。ｐＨを５と６の間に保った。最後の添加の
後、混合物は４℃で１夜間放置され、その後限外濾過により精製された。 収量：８６０ｍｇ Ｌ−Ｔ4とりこみ速度は紫外線分光器により決定されＩｇＧのモル当たり４．
３であった。 接合タンパク質の構造 又は 接合３：ＩｇＧ−Ｌ−Ｔ4接合（ＣＯＯＨに結合） 接合は活性エステル法により製造された。 ４３．６ｍｇのＮ−トリフッ素アセチルサイロキシン、６．３２ｍｇのＮ−ヒ
トロキシコハク酸イミド及び１１．３３ｍｇのＮ，Ｎ′−ジシクロヘキシルカル
ボジイミドが１ｍｌの乾燥したアミンを除去したＤＭＦに溶解され室温で１時間
攪拌した。 １００ｍｇのウサギＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ,Ｍunich）が二回蒸留した水の２０ｍ
ｌに溶解された。 ４００μｌの活性エステル混合物は乾燥したアミンを除去したＤＭＦの６００
μｌで稀釈し、ＩｇＧ水溶液に加えられた。反応混合物が室温で１２時間攪拌さ
れた後にアンモニヤ性の条件下で限外濾過により精製された。同時にトリフッ素
アセチル保護基の同時消去が行われる。 収量：９４ｍｇ Ｌ−Ｔ４とりこみ速度は紫外線分光器により決定されＩｇＧのモル当たり１１
．５であった。 接合タンパク質の構造 接合４：ＩｇＧ−Ｌ−Ｔ4ＯＥｔ接合（ＮＨ2で結合） 接合はカルボイミド法により製造された。 １０ｇのウサギのＩｇＧ（ＳＩＧＭＡ,Ｍunich）が１０００ｍｌの二回蒸留し
た水に溶解された。 １．２５ｇのＬ−Ｔ40Ｅｔが僅かに酸性の４０ｍｌのメタノールに溶解され２
．５ｇのＥＤＣと共にＩｇＧ水溶液に加えられた。反応混合物は室温でｐＨを約
５にして２時間光を排除して攪拌され、一夜間４℃で貯蔵された。混合物はその
後限外濾過により精製された。 収量：６．８ｇ Ｌ−Ｔ4ＯＥｔとりこみ速度は紫外線分光器により決定されＩｇＧモル当たり
１．５であった。 接合タンパク質の構造：接合５：Ｌ−Ｔ4−ＩｇＧ接合（ＮＨ2及びＣＯＯＨで結合） 接合はカルボジイミド法により製造された。 ５００ｍｇのＬ−サイロキシン（Ｈenning Ｂerling,Ｂerlin）が弱アルカリ
性条件のもとで１０％のアミンを除去したＤＭＦを含む５００ｍｌの２回蒸留し
た水に溶解された。 ５ｇのウサギのＩｇＧは５００ｍｌの２回蒸留された水に溶解された。Ｌ−サ
イロキシンとウサギのＩｇＧの２つの水溶液は混合され、約１０分間の間隔を置
いて攪拌しながら全部で１．９ｇのＥＤＣが１０部に加えられた。反応混合物は 一夜間４℃に放置されその後限外濾過により精製された。 収量：２．３ｇ Ｌ−Ｔ4とりこみ速度は紫外線分光器により決定され、ＩｇＧモル当たり３．
３であった。 得られた接合の構造は接合２で表示した構造に一致している。 抗体に関して製造された接合の交差反応性の決定 一般的方法：交差反応性試験を行うため、使用されるポリーまたはモノクロナル
抗体、またはこれら抗体の混合物はエポキシ基を含み、均一な粒子の大きさ１．
０５５±０．０３２μｍを有する超微粒子に共有結合している。各々の場合に結
合する抗体（複数）／抗体の混合物の量は超微粒子のグラム当たり３５０μｇの
精製抗体（複数）または抗体混合物であった。結合の後に表れる別の結合位置は
不活性物質で飽和された。このやり方で製造された超微粒子は１０ｍｌの０．１
Ｍの燐酸塩緩衝液すなわち超微粒子のグラム当たりｐＨ７．２で１ｍｏｌ／１の
ＮａＣｌと０．０５％のアジドを含んでいる緩衝液に溶解した。 交差反応性試験に使用される。トレーサーは¹²⁵ｌ−標識サイロキシンであり
、比活性度は濃度２７．６ｍｇ／ｌにおいて６．２２Ｍ Ｂｇ／μｇであった。 研究されるべき接合タンパク質は決定されるべき物質の参照物質として使用さ
れるトリヨウ素サイロキシンまたはサイロキシンと同様に０．２％のゼラチン及
び遊離の結合タンパク質を含む２０ｍｍｏｌ／ｌの燐酸塩緩衝液から成る緩衝液
マトリックスのなかに各検定法のために新しく調合された。このために次の濃度
が選択された。 ＦＴ4：Ｌ−Ｔ4／ｍｌの７．８，１６，３１，６２，１２５，２５０及び５００
ｍｇ。 接合の濃度は次のように調整された。 接合：接合／ｍｌの０．０１，０，１，１，１０及び１００μｇ。 すべての交差反応性試験の混合物に使用される計画は次のようであった。 １００μｌの緩衝液（ゼロ標準）標準プラス１００μｌの¹²⁵Ｉ−標識サイロ
キシン（トレーサー）プラス適当な稀釈度の１ｍｌの超微粒子懸濁液。 このため、使用された抗体に結合する超微粒子懸濁液の稀釈度は最大識別がＴ
4／ｍｌの３０と４０ｎｇとの間の範囲にあるように調整された。 混合物は２２℃で１時間培養された。１０分間２０００ｘｇで遠心分離し、つ
づいて遠心分離のあいだ沈降した超微粒子から上澄液を（結合／遊離の分離）乾
燥されるまで吸引された。結合相の測定はガンマ線計数器で６０秒間各々の接合
の交差反応性が公知の方法によって決定された。 マウスの抗体を使用して得られた交差反応性は次に示す表の最後から２番目の
欄に示されている。 表の最後の欄は「５０％交差」（ｐｇ／ｍｌ）の欄であり、次に示される実施
例１及び実施例２を基に決定された。この欄は本発明による方法に使用されるた
めに研究された抗体との接合において特別な接合が適しているかどうかを示して
いる。標準のプロットの最大傾斜の領域を表し、濃度における小さな差異の間の
最大識別を表す５０％切点が８から２０ｐｇ／ｍｌのＦＴ4のため正規の生理学
的濃度範囲であるときには、相当する接合は本発明による方法で使用するのに非
常に好都合である。 第１図で交差反応性が３０％（９．５から２８％）以下であるこれらの接合に
よってこれらの条件が一致していることが理解できる。交差反応性が３６％であ
るときには５０％交点は４０ｐｇ／ｍｌであり、検定法の感度における現象が明
らかに表示されている。 表の最後の欄に与えられた数字は第１図に示されるように実施例１プラス２の 同一の検定条件下で決定された。 第１図に示されるプロット及び表の最後の欄に示された数値を決定するための
記憶された形式で使用された本発明の方法はさらに詳しく２つの実施例に基づき
この後に説明される。 実施例１ 遊離サイロキシン（ＦＴ4）の決定方法 研究された接合の各々の１μｇは公知の被覆されたポリスチレン管である固相
に結合された。 使用された抗体はモノクロナールＴ4−特異性のマウスの抗体であった。抗体
は公知の方法で¹²⁵Ｉをもって生成された。精製した標識抗体の比活性度は抗体
の２５及び３５Ｋ Ｂｑ／μｇの間であった。標識抗体はｐＨ７．２の１ｍｏｌ
／ｌの塩化ナトリウムの０．０５％のアジドを含む０．１Ｍの燐酸塩緩衝液に溶
解された。標識抗体の濃度はこの緩衝液において１及び１．２５μｇ／ｌの間で
あった。 使用された標準物質は次の濃度を持つヒトの血清マトリックスであった。 ＦＴ4／ｍｌの０，２．８，５．６，１１．３，２２．５，４５及び９０ｐｇで
ある。 検定は次のように行われた。 ５０μｌの標準物質は研究されるべき固定された接合を含むポリスチレン管の
なかにピペットで採取され、５００μｌの¹²⁵Ｉ−標準抗体（トレーサー）が加
えられた。 反応物は２２℃で２時間水平振とう機で培養された。免疫反応はすべて管の外
に培養液を吸引することにより停止された。 ４ｍｌの洗浄溶液（０．１５ｍｏｌ／ｌ ＮａＣｌ）が各々管のなかに置かれ
３回デカンテーションした。 固相に結合し残った活性度は６０秒間ガンマ線計数器で測定された。得られた
結果は公知方法によりデータ減少によって数値を求めた。 実施例２ 遊離サイロキシン（ＦＴ4）の決定 実施例１と同様に被覆されたポリスチレン管が研究されるべき接合の固定に用
いられた。 用いられた抗体はモノクロナールＴ4−特異性マウスの抗体であった。しかし
放射性核種で標識されないで発光物で標識された。発光物は公知の方法（アメリ
カ特許4,645,646: ドイツ公開公報2,921,781または3,132,491を参照）で抗体に
結合された。環式ジアシルヒトラジド誘導体が発光物として用いられた。 発光物で標識した抗体はｐＨ７．２の１ｍｏｌ／１のＮａＣｌと０．０５％の
アジドを含む０．１Ｍの燐酸塩緩衝液に溶解された。標識抗体の濃度はこの緩衝
液中１と１．２５μｇ／ｌとの間であった。 用いられた標準物質は実施例１と同じく同じヒトの血清マトリックスであった
。検定法は実施例１のそれに正確に一致している。 固相に結合し残った活性度は化学発光を測定するため発光計ですくなくとも４
秒間測定位置に（Ｂerlhold ＬＢ9502またはＨamilton ＬＵＭＩＣＯＮ）注入し
て測定された。測定方法及びこのために用いられる試薬は、なかんづく、すでに
引用したアメリカ特許4,645,646に詳しく記載されている。 公知方法により後のデータ減少は想像した濃度を与えた。 ２つの実施例の方法１及び２で用いられた固相は被覆されたポリスチレン管で
あった。しかしながら、固相として他のプラスチック例えばポリプロピレン、ナ
イロン、テフロン及び他の適当な活性化プラスチックもガラスと同じく困難なく
使用できる。この場合の接合の結合は文献から公知の方法で例えば吸着によりま
たは共有、結合的行われる。（Ｃlat,Ｋ.,Ｔregear,Ｇ.Ｗ:Ｓcience,158(1967)1
570/1572頁；アメリカ特許4,657,873またはＷood,Ｗ.Ｇ.及びＧadow,Ａ.:Ｊ.Ｃl
in.Ｃhem.Ｂiochem.21(1983),789-797頁を参照）。 放射性核種（¹²⁵Ｉ）及び実施例１及び２において用いられた発光物による標
識の代わりに他の公知の方法で標識することができる。酵素、基板、蛍光物質ま
たは他の検知できる物質が使用され、勿論その場合適当な検知方法が選択される
べきである。 本発明に含まれる実験はすべてＦＴ4の検出に関係している。ＦＴ3の検出に対
して本発明による方法が適当であるために同じ方法に関係する実験結果が利用で きる。ＦＴ3についても本発明の記述における供述を確認している。

【図面の簡単な説明】 第１図は同一検定条件のもと異なる交差反応性の接合（conjugate）１から５
についてのＦＴ4検定のため標準プロット（マウスの抗−Ｔ4抗体）を示し、縦軸
は抗原抗体反応時結合Ｔ4と非結合Ｔ4（Ｂ／Ｂ０）比を、横軸は定量されるＦＴ
4の濃度を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ハプテン性質を有するホルモン及び該ホルモンと結合する１つまたはそれ
   以上の生理学的結合パートナーを含む生物学的流体中に存在する遊離したハプテ
   ン性質を有するホルモンを定量的に決定するための免疫学的方法において、 ｉ）１７から３７℃の範囲の温度で、前記生物学的流体を、 ａ）所定量の前記ホルモンに特異的な標識抗体、及び、 ｂ）固相に固定化された過剰量の前記ホルモンまたはその誘導体の接合であっ
   て、前記生理学的結合パートナーに対する反応性が前記ホルモンの反応性より低
   下した接合を含む液体反応混合物とを接触させ、 ｉｉ）３０分から３時間反応させた後、前記固相を前記液体反応混合物から分離
   し、 ｉｉｉ）前記液体反応混合物中の標識抗体、及び、前記固相中の標識抗体の量を
   測定し、その結果から前記生物学的流体中の遊離したハプテン性質を有するホル
   モンの量を決定する過程を具備し、 前記特異的な標識抗体を固定化した場合の、遊離した前記接合に対する親和力
   が、前記決定すべき遊離したハプテン性質を有するホルモンに対する前記特異的
   な標識抗体を固定化した場合の親和力の２８％より低い（交差反応性＜２８％）
   ことを特徴とする方法。 ２．前記固定化接合に対する前記特異的な標識抗体の親和力が、前記決定すべ
   き遊離したハプテン性質を有するホルモンに対する該特異的な標識抗体の親和力
   の８から２５％の範囲（８％＜交差反応性＜２５％）から選択されることを特徴
   とする請求項１記載の方法。 ３．前記決定すべき遊離したハプテン性質を有するホルモンを含む生物学的流
   体が、前記標識抗体及びホルモンまたはその誘導体の固定化接合と、実質 的に同時に接触することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。 ４．決定すべき遊離したハプテン性質を有するホルモンが、チロイドホルモン
   のＬ−サイロキシンまたはＬ−トリヨードサイロナインでることを特徴とする請
   求項１から３のいずれかに記載の方法。 ５．前記固相が、プラスチックまたはガラスからなることを特徴とする請求項
   １から４のいずれかに記載の方法。 ６．前記ホルモンまたはその誘導体の固定化接合が、タンパク質、ポリペプチ
   ド、またはポリサッカライドからなるキャリア成分を含有し、このキャリア成分
   を介して固相に固定化されることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載
   の方法。 ７．前記キャリア成分に対する前記標識抗体の親和力が、前記決定すべき遊離
   したハプテン性質を有するホルモンに対する該標識抗体の親和力の０．５％より
   低いことを特徴とする請求項１から６のいずれかに記載の方法。