JPH01225494A - 水不溶性融合蛋白質の可溶化方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ［産業上の利用分野］ 本発明は、水不溶性融合蛋白質の可溶化方法に関し、更
に詳しくは遺伝子組換え技術によって得られる水不溶性
融合蛋白質を可溶化する方法に関するものである。

［従来の技術及び発明が解決しようとする課題］今日、
遺伝子組換え技術によって種々の融合蛋白質が製造され
、医薬、検査試薬等、広く利用されている。

しかしながら、遺伝子組換え技術によって得られる融合
蛋白質の中には、水に不溶性又は難溶性のものもあり、
そのままでは利用ができない場合がある。

ある種の融合蛋白質は、ｐＨ９，０以上の塩基性条件下
で処理するか、尿素、チオシアン酸カリウム等の塩類の
高濃度の存在下で処理することにより、可溶化すること
ができるが、この場合であっても、前者では蛋白質が部
分的に分解されて変性されてしまい、また後者では抗原
抗体反応が生じなくなってしまう。

そこで、本発明者らは、水不溶性の融合蛋白質を可溶化
する手段を見出すべく鋭意研究を重ねた結果、本発明を
完成するに至った。

［課題を解決するための手段及び作用］本発明は、水に
不溶性又は難溶性の融合蛋白質を陰イオン界面活性剤１
両性界面活性剤及び非イオン界面活性剤からなる群から
選ばれる少なくとも１種の界面活性剤で処理することを
特徴とする水不溶性融合蛋白質の可溶化方法に関するも
のである。

本発明の対象となる融合蛋白質は、特に制限はなく、水
に不溶性又は難溶性のものであれば、如何なるものでも
よい。

かかる水に不溶性又は難溶性の融合蛋白質としては、例
えば、ヒ）Ｕ１ｓｎＲＮＰ複合体のＣ蛋白質を規定する
ｃＤＮＡ　（４８９塩基；以下「ｐＳ２」という）と細
菌のクローβ−ガラクトシダーゼ（ベーリンガー・マン
ハイム社製ＰＥＸ２ベクターが規定する蛋白質）遺伝子
との融合遺伝子、ヒｈＵ２ｓｎＲＮＰ複合体のＢ”蛋白
質を規定するｃＤＮＡと細菌のクローβ−ガラクトシダ
ーゼ遺伝子との融合遺伝子等を含む微生物が産生ずる融
合蛋白質が挙げられる。

本発明に用いる界面活性剤は、陰イオン界面活性剤１両
性界面活性剤及び非イオン界面活性剤からなる群から選
ばれるものであれば、如何なるものでもよいが、可溶化
の効果の点から、陰イオン界面活性剤及び非イオン界面
活性剤が好ましく、陰イオン界面活性剤が更に好ましい
、陽イオン界面活性剤は、蛋白質の陰性基と結合し、抗
原抗体反応を阻害してしまう。

陰イオン界面活性剤としては、例えば、ラウリル硫酸ナ
トリウム（以下ｒＳＤＳＪという）、アルキルベンゼン
スルホン酸ナトリウム、ジオクチルスルホサクシネート
、オレイルメチルタウレート、ポリオキシエチレンアル
キルフェノールスルホネート、好ましくは、ＳＤＳに代
表される直鎖炭素数１０〜１４のアルキルサルフェート
が挙げられる。

両性界面活性剤としては、例えば、ドデシルアミノエチ
ルグリシンなどのグリシン誘導体やアルキルベタイン、
好ましくは、Ｎ−フルキル−Ｎ。

Ｎ−ジメチルグリシンが挙げられる。

非イオン界面活性剤としては、例えば、ヘプチルチオグ
ルコシド、オクチルチオグルコシド、シュクロースモア
カプレート、シュクロースモノラウレート、Ｎ、Ｎ−ビ
ス（３−Ｄ−グルコンアミドプロピル）デオキシコール
アミド、好ましくは、オクチルチオグルコシドが挙げら
れる。

前記ｐＳ２と細菌のクローβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
との融合遺伝子を含む微生物が産生ずる融合蛋白質（以
下ｒｐＳ２ＥＸ融合蛋白質」という）を例にとり、以下
詳細に説明するが、これらの記載は本発明の範囲を何ら
制限するものではない。

ｐ３２ＥＸ融合蛋白質は、以下のようにして製造するこ
とができる。

クローン化したｃＤＮＡ　（ｐｓ２）をクローβ−ガラ
クトシダーゼとの融合蛋白質を産生ずるプラスミドベク
ターｐＥＸ２に組換える。温度を変化させることにより
、分子１１３０にの融合蛋白質を発現させ、これを不溶
性封入体の性質を利用して他の可溶性細菌蛋白質から分
離する。大腸菌のゲノムＤＮＡはデオキシリボヌクレア
ーゼと超音波処理にて可溶化させて封入体から分離する
。

以上のようにして精製した融合蛋白質を含む封入体を得
ることができる。

得られた封入体を前記界面活性剤の水溶液中で処理する
ことにより、融合蛋白質を可溶化することができる。

前記界面活性剤の濃度は、通常０．０１〜１０重量％、
好ましくは０．１〜２．５重量％である。媒体としては
、好ましくはｐＨ６〜８の緩衝液１例えばリン酸緩衝生
理食塩水、トリス−塩酸緩衝液、グツド緩衝液等を用い
る。処理温度は、通常４〜５０℃、好ましくは１０〜２
５℃である。

以上のようにして可溶化されたｐＳ２ＥＸ融合蛋白質は
、例えば、固相酵素抗体法によって自己抗体として知ら
れている抗ＲＮＰ抗体を測定するための試験試薬として
用いることができる。

［実施例］ 以下、調製例、実施例及び参考例により本発明を更に詳
細に説明するが、これらは本発明の範囲を何ら制限する
ものではない。

調製例　ｐ３２ＥＸ融合蛋白質の調製 抗ＲＮＰ抗体陽性患者の血清を用い、ヒトｍ！ａ芽細胞
より作製したｃＤＮＡを入ｇｔｌｌベクターに構築した
ライブラリーの中から陽性シグナルを選んで単一のプラ
ークになるまでクローニングした、このベクターで産生
される蛋白質量は多くないので、制限酵素ＥｃｏＲＩに
てクローン化ｃＤＮＡ　（ｐＳ２）を分離し、蛋白質発
現プラスミドベクターｐＥＸ２　（ベーリンガー拳マン
ハイム社製）に組換えた。このプラスミドを温度感受性
リプレッサーＣｌ８５７をゲノムに持つ大腸菌（ｐｏｐ
　２１３Ｂ）に移入した（該形質転換株は、Ｅ。

ｃｏｌｉ　ｐｏｐ　２１３Ｅｔ　　ｐ　Ｓ　２　ＥＸ　
微工研菌寄第９９１Ｏ号として通商産業省工業技術院に
寄託されている。）。

このプラスミドと大腸菌の組み合わせで以下の蛋白質発
現が可能となる。即ち、大腸菌の数が充分に増えたとこ
ろで培養温度を４２℃に上昇させることにより、ＰＥＸ
２に組み込まれているクローβ−ガラクトシダーゼの大
部分（Ｃ末端５３塩基まで）とヒトからとったｃＤＮＡ
　（ｐＳ　２）が規定する融合蛋白質が発現されること
になる。

この方法により、異種蛋白質の細菌内発現による細菌の
増殖阻害を避けることができた。産生じた融合蛋白質は
、大腸菌内で對人体となり不溶性となった。

実施例１　　ｐＳ２ＥＸ融合蛋白質の精製・可溶化蛋白
質誘導後の大腸菌培養液５００−を６０００回転／分で
１５分間遠心し上清を除去した。１５０ｍＭ塩化ナトリ
ウム、５ｍＭ塩化マグネシウムを含む５０ｍＭトリス塩
酸緩衝液（ｐＨ７，６）２０−に沈澱を浮遊させ、１０
ｍｇ／ｍｌリゾチーム溶液２−を加えて時々撹拌した（
４０分間氷上）、氷上で２分間の超音波処理を３回繰り
返した。デオキシリボヌクレアーゼを２ルｇ／−になる
ように加え、３７℃で２時間反応させた。２分間の超音
波処理を５回繰り返した。

８０００回転／分で２０分間遠心した。ベレットを０．
５％（ｖ／ｖ）トリトｙＸ−１００，１０ｍＭ　　ＥＤ
ＴＡ、５０ｍＭ塩化ナトリウムを含む５０ｍＭのトリス
塩酸緩衝液（ｐＨ７，６）に浮遊させ、４℃で一晩放置
した。８０００回転／分で２０分間遠心した。ペレット
を０．５％（ｖ　／　ｖ　）　　ト　リ　ト　ン　Ｘ−
１００，ｌｏｍＭＥＤＴＡ、５０ｍＭ塩化ナトリウムを
含む５０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ＰＨ７，６）に浮遊
させ、５分間室温に放置した。ａｏｏｏ回転／分で２０
分間遠心した。２％ＳＤＳ含有リン酸緩衝生理食塩水８
−でベレットを浮遊させ、２０分間室温に放置した後、
２分間超音波処理を行って完全に溶解させた。０．１％
ＳＤＳ含有リン酸緩衝生理食塩水で一晩透析した。その
結果、ＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲル電気泳動で
８５％以上の純度を有するｐＳ２ＥＸ融合蛋白質を得た
。

以上のようにして得たｐＳ２ＥＸ融合蛋白質ヲプロムシ
アンで活性化したセファロース４Ｂのゲルビーズに固定
し、これを用いて患者血清から該融合蛋白質と反応する
精製抗体（以下「抗ｐＳ２ＥＸ抗体」という）を得た。

この抗ｐ３２ＥＸ抗体を主に用いて以下の実験を行い、
ｐＳ２がヒトＵ１ｓｎＲＮＰ複合体（７）Ｃ蛋白質であ
ることを証明した。

先ず、ガラスプレート上に固定したヒーラ細胞を用いて
間接蛍光抗体法を行うと、抗ｐＳ２ＥＸ抗体は核の部分
をスペックルパターンに染め、これは抗ＲＮＰ抗体に特
徴的な蛍光染色パターンであった０次いで、ヒト細胞か
らの全蛋白質をＳＤＳを含むポリアクリルアミドゲルで
泳動し、ニトロセルロース膜に転写した後、抗ｐｓ２Ｅ
Ｘ抗体と反応させると分子量２万２千のバンドと反応し
た。２万９千及び２万８千のバンドとも弱く反応したが
、これは主な反応でないことが抗体希釈により明らかと
なった。更に、ｐＳ２によるｍＲＮＡのハイブリッド精
製とこれに続くインビトロ蛋白質合成系でもｐＳ２が分
子量２万２千の蛋白質を規定していることが証明された
。また抗ｐＳ２ＥＸ抗体を用い、これと被抽出物を反応
させ免疫沈降した後、除蛋白処理して核酸成分のみを抽
出し、尿素を含むポリアクリルアミドゲルで分析すると
、この分子量２万２千の蛋白質はヒトＵＬｓｎＲＮＰと
結合していることが判明した。

以上のことから、クローン化したｃＤＮＡ　（ｐｓ２）
はヒ）Ｕ１ｓｎＲＮＰ複合体のＣ蛋白質であることが判
明した。

実施例２　他の陰イオン界面活性剤によるｐＳ２ＥＸ融
合蛋白質の可溶化 蛋白質誘導後の大腸菌から、不溶性の融合蛋白質を得る
操作は実施例１と同様に行った。

ベレット状の不溶性融合蛋白質を２％ポリオキシエチレ
ンアルキルエーテル硫酸ナトリウム（商品名　ＮＥＳ−
２０３日光ケミカル）含有リン酸緩衝生理食塩水８ｗＪ
で浮遊させ、２０分間室温に放置した後、２分間超音波
処理を行って完全に溶解させた。０．１％ポリオキシエ
チレンアルキルエーテル硫酸ナトリウム含有リン酸緩衝
生理食塩水で一晩透析を行い得られた融合蛋白質は、Ｓ
ＤＳにて溶解した融合蛋白質と同等の純度を有していた
。なお、本界面活性剤は、低温でＳＤＳより溶解度が高
く、処理操作を低温のまま行える利点を有していた。

実施例３　非イオン界面活性剤によるｐｓ２ＥＸ融合蛋
白質の可溶化 蛋白質誘導後の大腸菌から、不溶性の融合蛋白質を得る
操作は実施例１と同様に行った。

ペレット状の不溶性融合蛋白質を１％　３−〔（３−コ
ールアミドプロピル）ジメチルアミノコ−２−ヒドロキ
シ−１−プロパンスルホネート（商品名　ＣＨＡＰＳ　
　同位化学研究所）含有リン酸緩衝生理食塩水８−で浮
遊させ、２０分間室温に放置した後、２分間超音波処理
を行って完全に溶解させた。不溶成分を遠心分離によっ
て除去し、上清をリン酸緩衝生理食塩水で一晩透析を行
い得られた融合蛋白質は、約９０％の純度を有していた
０本界面活性剤を用いる場合には、透析中に界面活性剤
を添加する必要はないが、収率はＳＤＳの１７３程度で
あった。

参考例　ヒトＵＬｓｎＲＮＰ複合体のＣ蛋白質に対する
自己抗体の測定 （１）実施例で得たｐＳ２ＥＸ融合蛋白質を０．１１−
１Ｏ０ＪＬ／−の濃度範囲内で適当な溶液を用いて希釈
する。この希釈に用いる液は、水を主体とし、ｐＨの維
持のための緩衝成分、イオン強度調節のための塩類、粘
度ｇｉｍのための無機又は有機成分、界面活性剤、防腐
剤の一部又は全てを含むものが用いられる。特に５０ｍ
Ｍの炭酸緩衝液（ｐＨ９，５）を用いることが好ましい
。

（２）希釈したＰＳ２ＥＸ融合蛋白質を酵素免疫測定法
（以下ｒＥＩＡＪという）用９６穴マイクロプレートに
約２０〜５００４１、好ましくは５０〜２５０ｕＬｉ入
れる。このマイクロプレートを１０分間以上放置して、
ｐ３２ＥＸ融合蛋白質をマイクロプレートに吸着させる
。この際の温度は４〜５０℃の範囲内に維持すべきであ
る。

（３）ｐＳ２ＥＸ融合蛋白質を固定したマイクロプレー
トを水又はツイーン２０などの界面活性剤を含むリン酸
緩衝生理食塩水を用いて数回洗浄する。

（４）洗浄済みのマイクロプレートに蛋白質１〜２００
　＋ｓｇ／−を含むリン酸緩衝生理食塩水を５０ｋ１以
上入れる。これに用いる蛋白質としては、ヒト、牛、鶏
卵等の動物の組織、体液、分泌液から得られるもの又は
大豆、麦等の植物から得られるもの等、大半の蛋白質材
料が使用し得る。特に、脱脂粉乳を５０ｍｇ／−の濃度
で用いることが好ましい。

（５）マイクロプレートを４〜５０℃に１０分間以上放
置する。

（６）（３）と同様にマイクロプレートを洗浄する。

（７）ｍ定に供するヒトの体液、分泌液、組織からの抽
出液をそのまま又は緩衝液を用いて、数倍〜数百万倍に
希釈し、（６）で作成したｐＳ２ＥＸ融合蛋白質を固定
したマイクロプレートに入れる。この時の液量は５０〜
２５０ｇ１であることが好ましい。

（８）（７）のマイクロプレートを４〜５０℃に１５分
間以上放置する。

（９）（３）と同様にマイクロプレートを洗浄する。

（１０）酵素を結合させたプロティンＡ又は酵素を結合
させた抗ヒト免疫グロブリン動物血清を緩衝液を用いて
数十〜数千倍に希釈し、（９）のマイクロプレートに入
れる。この際の液量は、５０〜２５０ｕ、ｉであること
が好ましい、ここでは、西洋ワナどのペルオキシダーゼ
を結合させたプロティンＡを用いた。

（ｌｌ）（８）と同様に放置した後、（３）と同様に洗
浄する。

（１２）酵素活性を測定するための基質試薬をマイクロ
プレートに入れる。ペルオキシダーゼ活性を測定する場
合は、Ｏ−フェニレンジアミン、２．２′−アジノビス
（３−エチルベンゾチアゾリン−６−スルホン酸）、フ
ェノール又はアニリン誘導体と４−アミノアンチピリン
、還元型色素等を過酸化水素と共存させ、ペルオキシダ
ーゼによる酢化反応によって生ずる発色を測定する。あ
るいは、４−メチルウンベリフェロン類等の酵素の働き
により蛍光を発する基質や、ケミルミネッセンスにより
発光を呈するものも全て適用できる。

（１３）マイクロプレートを直接測定しうる専用の分光
光度計、蛍光光度計、発光分光光度計を用いるか、ある
いは試料を吸引や移し変えにより測定装置に供し、酵素
活性の強さを測定する。ここでは、マイクロプレートを
用いたＥＩＡ法によりヒト血清中のＵＬ、５ｎＲＮＰ複
合体のＣ蛋白質に対する自己抗体の定量を可能にした。

この方法の測定操作に要する時間は約３時間であるが、
ｐＳＺＥＸｍ合蛋白質を固定したマイクロプレートは４
℃の保存で３力月以上安定であるので、予めこのプレー
トを作製しておけば測定結果は約９０分で得られる。こ
の方法の感度は西洋ワサビのペルオキシダーゼを結合さ
せたプロティンＡを用い。

０−フェニレンジアミンと過酸化水素を基質として測定
すると０．０１ｎｇ／−以上のＵＩＳｎＲＮＰ複合体の
Ｃ蛋白質に特異的な免疫グロブリンＧ（免疫グロブリン
Ｇ３を除く）が試料中に存在するならばこれを検出しう
る。

測定精度は、Ｌｏｎｇ／−の試料を１００倍に希釈した
条件（０、１ｎｇ／ａＺ）　テ、ＣＶ＝５．４％程度で
ある。

［発明の効果］ 本発明によれば、融合蛋白質を生物活性や抗原性を失う
ことなく可溶化することができる。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 水に不溶性又は難溶性の融合蛋白質を陰イオン界面活性
   剤、両性界面活性剤及び非イオン界面活性剤からなる群
   から選ばれる少なくとも１種の界面活性剤で処理するこ
   とを特徴とする水不溶性融合蛋白質の可溶化方法。