JP6588055B2 - 細菌検出装置 - Google Patents
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Description
検出チップの流路には、表面プラズモン共鳴を発現する電場増強層(表面プラズモン共鳴励起層)が形成されている。
そして、細菌検出装置は、検出チップの流路が設けられている面とは反対の面側から電場増強層に光を照射し、被検体液中に含まれる細菌に結合させた蛍光標識から発せられる蛍光を光検出器で検出するようにして、被検体液中に含まれる細菌を検出するようになっている。
特に、この装置の検出チップの流路には、表面プラズモン共鳴を好適に励起させるプリズム機能が付与されているので、細菌に結合させた蛍光標識から発せられる蛍光を高感度で検出することが可能になっている。
光透過性を有し、その上面に表面プラズモン共鳴励起層が形成されている透明基板と、前記透明基板の上面側に蛍光標識が結合された細菌が含まれている被検体液を貯留する凹部を形成するために組み付けられている液体保持部材と、を有する検出チップと、
前記検出チップが載置されるステージと、
第1モータと、前記第1モータの回転力を前記ステージに伝達するコグドベルトを有し、前記ステージを一の方向に移動させる第1駆動機構と、
第2モータと、前記第2モータの回転力を前記ステージに伝達する円筒カムを有し、前記ステージを一の方向と直交する方向に移動させる第2駆動機構と、
前記検出チップの裏側から前記表面プラズモン共鳴励起層に光を照射する光照射部と、
前記被検体液が貯留されている前記凹部の前記表面プラズモン共鳴励起層の上面を撮像し、表面プラズモン共鳴を発現させた前記表面プラズモン共鳴励起層の上面で前記細菌に結合されている蛍光標識を発光させている画像を撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像した画像中の発光点をカウントすることで、前記凹部に貯留されていた前記被検体液中の細菌の数をカウントする制御部と、
を備え、
前記液体保持部材には、略長方形状を呈し、その長手方向が前記一の方向に沿う向きとなる複数の溝が上下に貫通して互いに平行に形成されており、
前記複数の溝の下部が前記透明基板に塞がれて、前記凹部が形成されるように構成されているようにした。
検出チップの凹部に貯留されている被検体液に蛍光標識が結合された細菌が含まれていれば、その細菌を表面プラズモン共鳴による発光点として撮像部によって撮像できる。
そして、撮像部が撮像した画像中の発光点をカウントすることで、検出チップの凹部に貯留されていた被検体液中の細菌の数をカウントすることができる。
また、細菌検出装置の第2駆動機構は、円筒カムを介してステージを一の方向と直交する方向(例えば左右方向)に移動させるので、平行に並んでいる複数の凹部のいずれかを撮像部の撮像位置に合わせるような、比較的短い移動の位置合わせに適している。
このような2つの移動機構の協働によって、検出チップが載置されたステージを好適に移動させて、検出チップの凹部を撮像部で好適に撮像できるので、検出チップの凹部に貯留されていた被検体液中の細菌の数を好適にカウントすることができる。
前記溝の長尺側の縁には、前記撮像部による撮像位置確認用の目盛として機能するように複数の切欠が所定間隔で設けられているようにする。
こうすることで、撮像部が撮像した画像中に含まれている切欠を基準にして、検出チップの凹部(溝)の撮像位置を確認し易くなる。
前記溝の長尺側の縁に形成されている複数の切欠は、対向する縁において互い違いとなる配置に設けられているようにする。
例えば、撮像部が検出チップの凹部(溝)をその長手方向に複数に分割して撮像する際、その凹部において対向する縁の切欠が一対、撮像した画像中に含まれていれば、凹部を長手方向に複数に分割して撮像した画像の重複部分を画像処理によって取り除き易くなる。
つまり、撮像部が撮像した複数の画像の重複部分を取り除く画像処理を行って、各凹部の画像中の発光点をカウントする処理を行えれば、検出チップの凹部に貯留されていた被検体液中の細菌の数をより正確にカウントすることができる。
前記液体保持部材は、遮光性を有しているようにする。
例えば、透明基板からの自家蛍光が、使用している蛍光標識の発光波長に近いと、フィルタ等の分光素子を用いても分離できずにノイズになってしまうことがある。
そこで、液体保持部材が遮光性を有していれば、透明基板に光が入射された際に生じる自家蛍光が上面に放出されることを防ぐ遮光部材として機能するので、ノイズを遮断して被検体液中の細菌の数を好適にカウントすることが可能になる。
まず、細菌検出装置100に取り付けて使用する検出チップ10について説明する。
検出チップ10は、図1(a)(b)に示すように、上面に電場増強層である表面プラズモン共鳴励起層2が形成されている透明基板1と、透明基板1の上面側に被検体液を貯留する凹部を形成するために組み付けられている液体保持部材3と、を有している。
また、透明基板1には、表面プラズモン共鳴励起層2が形成されている上面と鋭角を成して接しているプリズム面1aが設けられている。
このプリズム面1aから入射した光は屈折し、所定の角度で表面プラズモン共鳴励起層2に入射するようになっている。
この表面プラズモン共鳴励起層2は、所定の入射角度で光を受けると、表面側に染み出したエバネセント波が表面プラズモン共鳴の励起条件を満たし、表面プラズモン共鳴励起層2の表面に表面プラズモン共鳴を発現させる。
この表面プラズモン共鳴により表面プラズモン共鳴励起層2の上面に形成された増強電場によって、被検体液中の細菌に結合された蛍光標識を発光させる。また、この表面プラズモン共鳴励起層2は、表面プラズモン共鳴を発現させると同時に、透明基板1に光が入射された際に生じる自家蛍光が表面プラズモン共鳴励起層2の上面に放出されることを防ぐ遮光膜としても機能する。これらの効果により、表面プラズモン共鳴励起層2を形成することで、透明基板1のみの場合と比べて良好なコントラストで細菌を観測することが可能である。
本実施形態の液体保持部材3には、略長方形状を呈する3本の溝4が互いに平行となる配置に形成されている。
この液体保持部材3を透明基板1の上面に組み付け、液体保持部材3の溝4の下部を塞ぐようにすることで、その溝4からなる凹部が透明基板1の上面側に形成されるようになっている。
このような凹部(溝4)に、細菌検出装置100による検査対象となる被検体液(蛍光標識が結合された細菌が含まれている被検体液)が貯留される。
特に、その溝4の長尺側の縁に形成されている複数の切欠4aは、対向する縁において互い違いとなる配置に設けられている。
この液体保持部材3の溝4の縁に設けられている複数の切欠4aは、後述する細菌検出装置100の撮像部60による撮像位置確認用の目盛として機能する。
本実施形態の細菌検出装置100は、図2、図3に示すように、検出チップ10が取り付けられているステージ20と、ステージ20を一の方向(前後方向)に移動させる第1駆動機構30と、ステージ20を一の方向と直交する方向(左右方向)に移動させる第2駆動機構40と、ステージ20に載置された検出チップ10に向けて光を照射する光照射部50と、ステージ20に載置された検出チップ10の凹部を撮像する撮像部60と、装置各部を統括制御するとともに、撮像部60が撮像した画像に基づいて検出チップ10の凹部に貯留された被検体液中の細菌の数をカウントする制御部70等を備えている。
サブステージ22は、装置の筐体に設けられている前後方向に延在するガイド(図示省略)に沿って前後に移動可能に配設されている。
ステージ本体21は、サブステージ22に設けられている左右方向に延在する軸22aに沿って左右に移動可能に配設されている。
このステージ本体21に検出チップ10が取り付けられる装着部が設けられており、装着部に取り付けられた検出チップ10の略長方形状の溝4(凹部)は、その長手方向が前後方向に沿う向きとなり、3つの溝4(凹部)が左右方向に互いに平行に並ぶようになる。
第1モータ31とコグドベルト32は装置の筐体に配設されており、コグドベルト32がサブステージ22の一部に連結されている。第1モータ31はステッピングモータである。
この第1駆動機構30によって、サブステージ22が前後方向に移動される。
なお、サブステージ22上のステージ本体21と第2駆動機構40(第2モータ41、円筒カム42)は、サブステージ22とともに前後方向に移動される。
第2モータ41と円筒カム42はサブステージ22上に配設されており、円筒カム42の螺旋状の案内溝42aには、ステージ本体21に設けられているピン21aが挿し入れられている。第2モータ41はステッピングモータである。
この第2駆動機構40によって、ステージ本体21がサブステージ22上で左右方向に移動される。
光照射部50は、例えば、半導体レーザー(LD:Laser Diode)を備えており、ステージ本体21(ステージ20)に載置された検出チップ10に向けてレーザー光を照射し、透明基板1から入射した光が伝搬して検出チップ10の表面プラズモン共鳴励起層2にレーザー光が照射される。具体的には、光照射部50が照射したレーザー光は、検出チップ10の透明基板1のプリズム面1aから入射し、屈折した光がチップ内部を伝搬し検出チップ10の表面プラズモン共鳴励起層2の下方から入射するようになっている。
もちろん液体保持部材3として自家蛍光性の無い材料もしくは蛍光標識と異なる蛍光波長の材料を選択すれば、そのようなノイズの問題は発生しないが、それにより液体保持部材3の材料選択性が制限されるので、その設計自由度が著しく低下してしまう。また、液体保持部材3を透明基板1に組み付けて検出チップ10とするために接着部材等を使用する場合、接着部材に自家蛍光性があると同様の問題が発生することがある。このような場合も、液体保持部材3が遮光性を有していれば、ノイズの問題を回避することができる。
このCCDカメラ61はレンズユニット62を通して、ステージ本体21(ステージ20)に載置された検出チップ10を撮像する。
具体的には、CCDカメラ61(撮像部60)は、被検体液が貯留されている検出チップ10の凹部の表面プラズモン共鳴励起層2の上面を撮像する。
なお、検出チップ10の凹部(溝4)に貯留される被検体液には、蛍光標識が結合された細菌が含まれている。
制御部70には、細菌検出装置100の制御用プログラムが格納されており、この制御部70から装置の制御基板71へ動作指令を与える。そして、制御基板71から装置各部に動作指令を与えて、第1駆動機構30(第1モータ31)や第2駆動機構40(第2モータ41)を作動させてステージ20(ステージ本体21、サブステージ22)を移動させたり、光照射部50を作動させてステージ本体21(ステージ20)に載置されている検出チップ10に向けてレーザー光を照射したりすることができるように構成されている。
また、制御部70は、撮像部60(CCDカメラ61)に動作指令を与えて、被検体液が貯留されている検出チップ10の凹部の表面プラズモン共鳴励起層2の上面を撮像することができるように構成されている。
具体的には、制御部70は、撮像部60が撮像した画像中の発光点をカウントすることで、検出チップ10の凹部(溝4)に貯留されている被検体液中の細菌の数をカウントする。
まず、検出チップ10の凹部(溝4)に、DAPIなどの蛍光標識が結合された細菌が含まれている被検体液を所定量スポイトで滴下するなどして貯留する。
被検体液に蛍光標識が結合された細菌が含まれていれば、撮像部60(CCDカメラ61)によってその細菌を発光点として撮像できる。なお、表面プラズモン共鳴を利用して被検体液中に含まれる細菌を発光点として撮像する技術は公知なので、ここでは詳述しない。
具体的には、第2駆動機構40によってステージ20(ステージ本体21)を左右方向に移動させて、互いに平行に並んでいる3つの凹部(溝4)のいずれかに撮像部60の撮像エリアRを合わせ、第1駆動機構30によってステージ20(サブステージ22)を前後方向に移動させつつ、略長方形状の凹部(溝4)を長手方向に複数に分割した画像を撮像する。
また、細菌検出装置100の第1駆動機構30は、コグドベルト32を介してステージ20(サブステージ22)を移動させるので、凹部(溝4)の長手方向に沿う各所に撮像部60の撮像エリアRを合わせるような、比較的長い移動に適している。
この凹部(溝4)の縁に設けられている複数の切欠4aは、撮像部60による撮像位置確認用の目盛として機能するので、撮像部60が撮像した画像中に一対の切欠4aが含まれていれば、凹部(溝4)を長手方向に複数に分割して撮像した画像の重複部分を制御部70において取り除く画像処理が可能になる。
なお、検出チップ10の切欠4aをより認識しやすくするため、ステージ20上の検出チップ10の周辺を照らすLED等の補助光源(図示省略)が備え付けられていてもよい。
このように、検出チップ10の凹部(溝4)に貯留した所定量の被検体液中の細菌の数を計測することで、例えば、その被検体液1cc当りの細菌数を検出することができる。
なお、この細菌検出装置100は、被検体液中に含まれる細菌の数を正確にカウントすることに用いることに限らず、被検体液中に含まれる細菌の数が閾値以上か、閾値未満か判定することにも用いることができる。被検体液中に含まれる細菌の数が閾値以上か否かを判定する処理であれば、被検体液中に含まれる細菌の数を全てカウントする処理よりも短時間で行うことができる。
1a プリズム面
2 表面プラズモン共鳴励起層(電場増強層)
3 液体保持部材
4 溝(凹部)
4a 切欠
10 検出チップ
20 ステージ
21 ステージ本体
21a ピン
22 サブステージ
22a 軸
30 第1駆動機構
31 第1モータ
32 コグドベルト
40 第2駆動機構
41 第2モータ
42 円筒カム
42a 案内溝
50 光照射部
60 撮像部
61 CCDカメラ
62 レンズユニット
63、64 ミラー
70 制御部
71 制御基板
72 ケーブル
100 細菌検出装置
R 撮像エリア
Claims (4)
- 光透過性を有し、その上面に表面プラズモン共鳴励起層が形成されている透明基板と、前記透明基板の上面側に蛍光標識が結合された細菌が含まれている被検体液を貯留する凹部を形成するために組み付けられている液体保持部材と、を有する検出チップと、
前記検出チップが載置されるステージと、
第1モータと、前記第1モータの回転力を前記ステージに伝達するコグドベルトを有し、前記ステージを一の方向に移動させる第1駆動機構と、
第2モータと、前記第2モータの回転力を前記ステージに伝達する円筒カムを有し、前記ステージを一の方向と直交する方向に移動させる第2駆動機構と、
前記検出チップの裏側から前記表面プラズモン共鳴励起層に光を照射する光照射部と、
前記被検体液が貯留されている前記凹部の前記表面プラズモン共鳴励起層の上面を撮像し、表面プラズモン共鳴を発現させた前記表面プラズモン共鳴励起層の上面で前記細菌に結合されている蛍光標識を発光させている画像を撮像する撮像部と、
前記撮像部が撮像した画像中の発光点をカウントすることで、前記凹部に貯留されていた前記被検体液中の細菌の数をカウントする制御部と、
を備え、
前記液体保持部材には、略長方形状を呈し、その長手方向が前記一の方向に沿う向きとなる複数の溝が上下に貫通して互いに平行に形成されており、
前記複数の溝の下部が前記透明基板に塞がれて、前記凹部が形成されるように構成されていることを特徴とする細菌検出装置。 - 前記溝の長尺側の縁には、前記撮像部による撮像位置確認用の目盛として機能するように複数の切欠が所定間隔で設けられていることを特徴とする請求項1に記載の細菌検出装置。
- 前記溝の長尺側の縁に形成されている複数の切欠は、対向する縁において互い違いとなる配置に設けられていることを特徴とする請求項2に記載の細菌検出装置。
- 前記液体保持部材は、遮光性を有していることを特徴とする請求項1〜3のいずれか一項に記載の細菌検出装置。
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