JP6766820B2 - 光学式検体検出システム - Google Patents
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Description
本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance）現象を応用した表面プラズモン共鳴装置や、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ：Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置などを用いてセンサーチップ内に含まれる測定対象物質の検出を行う光学式検体検出システムに関する。
従来、極微少な物質の検出を行う場合において、物質の物理的現象を応用することでこのような物質の検出を可能とした様々な検体検出装置が用いられている。
このような検体検出装置の一つとして、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光が共鳴することにより、高い光出力を得る現象（表面プラズモン現象（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance））を応用し、例えば、生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下、「ＳＰＲ装置」と言う）が挙げられる。
このような検体検出装置の一つとして、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光が共鳴することにより、高い光出力を得る現象（表面プラズモン現象（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance））を応用し、例えば、生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下、「ＳＰＲ装置」と言う）が挙げられる。
また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ：Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づき、ＳＰＲ装置よりもさらに高精度にアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と言う）も、このような検体検出装置の一つである。
この表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの励起光が、金属膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ：Attenuated Total Reflectance）する条件において、金属膜表面に表面プラズモン光（疎密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍〜数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得るようになっている。
図１３は、従来のＳＰＦＳシステムの構成を説明するための概略構成図である。
従来のＳＰＦＳシステム１００は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１０２と、この誘電体部材１０２の水平な上面１０２ａに形成された金属膜１０４と、金属膜１０４の上面に形成された反応層１０６と、反応層１０６を囲繞するように流路１０８を形成する流路形成部材１１０及び流路蓋部材１１２とからなるセンサーチップ１１４を備えており、このセンサーチップ１１４は、ＳＰＦＳ装置１０１のセンサーチップ装填部１１６に装填されている。
従来のＳＰＦＳシステム１００は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１０２と、この誘電体部材１０２の水平な上面１０２ａに形成された金属膜１０４と、金属膜１０４の上面に形成された反応層１０６と、反応層１０６を囲繞するように流路１０８を形成する流路形成部材１１０及び流路蓋部材１１２とからなるセンサーチップ１１４を備えており、このセンサーチップ１１４は、ＳＰＦＳ装置１０１のセンサーチップ装填部１１６に装填されている。
センサーチップ１１４の反応層１０６は、蛍光物質で標識されたアナライトを捕捉するための固相膜を有しており、アナライトを含む検体液を流路１０８に送液することにより、アナライトを金属膜１０４上に固定することができる。
また、センサーチップ１１４の上方には、金属膜１０４上に発生した表面プラズモン光（疎密波）により励起された蛍光物質により発光される蛍光１１８の強度を測定するため、ＳＰＦＳ装置１０１の受光ユニット１２０が配置されている。
また、誘電体部材１０２の下方の一方の側面（入射面１０２ｂ）側には、図１３に示すように、ＳＰＦＳ装置１０１の光源１２２が配置されており、この光源１２２から照射される励起光１２４が、誘電体部材１０２の外側下方から、誘電体部材１０２の入射面１０２ｂに入射し、誘電体部材１０２を介して、誘電体部材１０２の上面１０２ａに形成された金属膜１０４に照射される。
このように構成された従来のＳＰＦＳシステム１００では、光源１２２から金属膜１０４に向かって励起光１２４を照射することにより、金属膜１０４表面に表面プラズモン光（疎密波）が発生し、この表面プラズモン光（疎密波）によって、アナライトを標識する蛍光物質が励起され、蛍光１１８が発光する。この蛍光１１８を受光ユニット１２０によって検出し、蛍光１１８の光量に基づき、アナライトの量を算出している。
このようなＳＰＦＳ測定では、蛍光１１８の光量は、励起光量に対して１０桁程度低いため、受光ユニット１２０に励起光１２４が僅かでも入射するとＳ／Ｎが悪化し、検出精度が劣化してしまうため、迷光を低減することが重要となる。
励起光１２４は、図１３に示すように、誘電体部材１０２の入射面１０２ｂから入射した後、金属膜１０４で反射し、誘電体部材１０２の出射面１０２ｃから出射するようになっている。
しかしながら、図１３に示すように、誘電体部材１０２の出射面１０２ｃにおいて、励起光１２４の一部が反射し、誘電体部材１０２の入射面１０２ｂから出射する出射面反射光１２４ｂが存在する。
この出射面反射光１２４ｂが、図１３に示すように、流路蓋部材１１２に入射すると、流路蓋部材１１２内を導光する光となり、受光ユニット１２０の視野範囲に出射面反射光１２４ｂが存在すると、流路蓋部材１１２内の自家蛍光を検出してしまい、Ｓ／Ｎの悪化に繋がる。
なお、出射面反射光１２４ｂは、通常、励起光１２４の４％程度の光量があり、蛍光１１８に対して十分大きな光量であるため、除去すべき迷光と言える。
このような迷光を除去するために、特許文献１では、図１４に示すように、金属膜１０４で反射した金属膜反射光を吸収する光吸収部１２６を誘電体部材１０２の光路中に設けている。
また、特許文献２では、図１５に示すように、センサーチップ１１４内部の散乱光や反射光を除去するための励起光カットフィルタ（波長フィルタ）１２８をセンサーチップ１１４の上面に設けることで励起光１２４をカットしている。
しかしながら、特許文献１のような構成では、光吸収部１２６において金属膜反射光が１００％吸収されるわけではなく、光吸収部１２６において微小な反射光が存在してしまい、このような反射光の迷光を完全に除去することは出来なかった。
また、図１３に示すような構成では、誘電体部材外に出射した出射面反射光などをカットすることはできず、やはり迷光が発生してしまっていた。
さらに、特許文献１のように、流路蓋部材１１２の幅が、誘電体部材１０２の幅よりも大きい場合には、上述したように、発生した迷光が流路蓋部材１１２に入射することで、測定精度に大きな影響を及ぼしていた。
さらに、特許文献１のように、流路蓋部材１１２の幅が、誘電体部材１０２の幅よりも大きい場合には、上述したように、発生した迷光が流路蓋部材１１２に入射することで、測定精度に大きな影響を及ぼしていた。
本発明では、このような現状に鑑み、流路蓋部材などの蓋部材に入射する迷光を除去し、受光ユニットの視野範囲に蛍光よりも光量の大きい励起光由来の光が存在しないようにして、高精度に検体を測定することができる光学式検体検出システムを提供することを目的とする。
本発明は、前述したような従来技術における課題を解決するために発明されたものであって、上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した光学式検体検出システムは、誘電体部材と、
前記誘電体部材の上面に隣接する金属膜と、
前記金属膜の上面に隣接する反応層と、
前記反応層の上面に配置される蓋部材と、を備えたセンサーチップと、
前記センサーチップを保持するためのチップ保持手段と、
前記金属膜に前記誘電体部材を介して励起光を照射する投光ユニットと、を備え、前記金属膜に前記誘電体部材を介して前記励起光を照射することで検体の検出を行う光学式検体検出システムであって、
前記励起光の光路断面において、前記蓋部材の幅が、前記誘電体部材の幅よりも大きく、
前記励起光が前記誘電体部材の出射面に反射した後、前記誘電体部材外に出射する出射面反射光が、前記励起光の測定走査角度内において、前記蓋部材に入射しないように構成され、
前記誘電体部材の入射面と出射面が、それぞれ平滑面であり、
前記励起光の測定走査角度内の少なくとも一部の角度において、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θ a 、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θ b 、前記誘電体部材の屈折率ｎ 1 が、下記式を満たす光学式検体検出システム。
ここで、θは前記励起光の前記金属膜への入射角度、ｎ 0 は前記誘電体部材の前記入射面における励起光入射側の屈折率である。
前記誘電体部材の上面に隣接する金属膜と、
前記金属膜の上面に隣接する反応層と、
前記反応層の上面に配置される蓋部材と、を備えたセンサーチップと、
前記センサーチップを保持するためのチップ保持手段と、
前記金属膜に前記誘電体部材を介して励起光を照射する投光ユニットと、を備え、前記金属膜に前記誘電体部材を介して前記励起光を照射することで検体の検出を行う光学式検体検出システムであって、
前記励起光の光路断面において、前記蓋部材の幅が、前記誘電体部材の幅よりも大きく、
前記励起光が前記誘電体部材の出射面に反射した後、前記誘電体部材外に出射する出射面反射光が、前記励起光の測定走査角度内において、前記蓋部材に入射しないように構成され、
前記誘電体部材の入射面と出射面が、それぞれ平滑面であり、
前記励起光の測定走査角度内の少なくとも一部の角度において、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θ a 、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θ b 、前記誘電体部材の屈折率ｎ 1 が、下記式を満たす光学式検体検出システム。
本発明によれば、蛍光に比べて光量の大きい励起光に由来する出射面反射光が蓋部材に入射しないように設計されているため、蓋部材内に出射面反射光が導光されず、大幅にＳ／Ｎを向上させることができ、高精度に検体を測定することができる。
以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいて、より詳細に説明する。
図１は、本発明の光学式検体検出システムの一態様であるＳＰＦＳシステムの概略を模式的に示す概略図、図２は、図１のＳＰＦＳシステムの一部を底面側から見た概略図である。
なお、本明細書では、図１の状態において、「上」、「下」の方向を規定する。
図１は、本発明の光学式検体検出システムの一態様であるＳＰＦＳシステムの概略を模式的に示す概略図、図２は、図１のＳＰＦＳシステムの一部を底面側から見た概略図である。
なお、本明細書では、図１の状態において、「上」、「下」の方向を規定する。
この実施例のＳＰＦＳシステム１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属膜１４と、金属膜１４の上面に形成された反応層１６と、反応層１６を囲繞するように流路１８を形成する流路形成部材２０及び流路蓋部材２２とからなるセンサーチップ２４を備えており、このセンサーチップ２４は、ＳＰＦＳ装置１１のチップ装填部２６に装填されている。
センサーチップ２４の反応層１６は、蛍光物質で標識されたアナライトを細くするための固相膜を有しており、アナライトを含む検体液を流路１８に送液することにより、アナライトを金属膜１４上に固定することができる。
固相膜は、アナライトを捕捉するためのリガンドが固定化されたものであって、例えば、ＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）及びＳＡＭ上に形成された固相化層によって構成することができる。
なお、固相化層としては、例えば、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
また、誘電体部材１２としては、少なくとも励起光４０に対して光学的に透明な材料であれば、特に限定されるものではないが、安価で取り扱い性に優れるセンサーチップとする上で、射出成型による樹脂材料から形成されている。
誘電体部材１２を形成する樹脂材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。
また、金属膜１４としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは、金からなり、さらに、これら金属の合金から構成してもよい。
すなわち、このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ、後述するような表面プラズモン光（疎密波）による電場増強効果が大きくなるため、金属膜１４として好適である。
また、金属膜１４の形成方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ法、無電解メッキ法などが挙げられる。好ましくは、スパッタリング法、蒸着法を使用するのが、薄膜形成条件の調整が容易である点で望ましい。
さらに、金属膜１４の厚さとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、５ｎｍ〜５００ｎｍの範囲内であることが望ましい。なお、電場増強効果の観点からは、より好ましくは、金：２０ｎｍ〜７０ｎｍ、銀：２０ｎｍ〜７０ｎｍ、アルミニウム：１０〜５０ｎｍ、銅：２０〜７０ｎｍ、白金：２０〜７０ｎｍ、および、これらの合金：１０〜７０ｎｍの範囲内であることが望ましい。
金属膜１４の厚さが上記範囲内であれば、表面プラズモン光（疎密波）が発生しやすく好適である。また、このような厚さを有する金属膜１４であれば、形状は、特に限定されない。
また、流路形成部材２０としては、例えば、所定幅、所定長さの流路溝が打ち抜かれたアクリル系粘着シートなどを用いることができる。このようなアクリル系粘着シートの厚さとしては、特に限定されるものではないが、０．１ｍｍ程度であることが好ましい。
また、流路蓋部材２２としては、励起光４０や蛍光４８に対して透光性を有する素材であれば、特に限定されるものではないが、上述する誘電体部材１２と同様な樹脂材料を用いることができる。
なお、流路蓋部材２２には、アナライトを含む検体液を流路１８の送液するための検体流入口２８及び検体排出口３０を備えている。この検体流入口２８と検体排出口３０とを、例えば、ポンプなどの循環送液手段によって接続することで、検体液を一方向に循環送液することができる。
なお、流路蓋部材２２には、アナライトを含む検体液を流路１８の送液するための検体流入口２８及び検体排出口３０を備えている。この検体流入口２８と検体排出口３０とを、例えば、ポンプなどの循環送液手段によって接続することで、検体液を一方向に循環送液することができる。
また、図３に示すように、検体排出口３０に液溜部３２を設け、例えば、ピペットなどを用いて検体液を検体流入口２８に注入するとともに、ピペットによって検体液の吸引・注入を繰り返すことで、ピペット、流路１８、液溜部３２において、検体液を往復移動させることができ、固相膜に固定化されたリガンドに、迅速かつ効率良く検体液中のアナライトが捕捉されることになる。特に、固相膜に対して検体液を往復移動させることによって、少量の検体液であっても、アナライトと固相膜との反応効率が高くなり、アナライトの検出精度を向上させることができる。
なお、本実施例では、流路１８に反応層１６を設け、検体液を流路１８に送液する構成で説明しているが、例えば、図４に示すように、ウェル部１９に反応層１６を設け、検体液をこのウェル部１９に滞留させるようにしてもよい。この場合、蓋部材としては、流路蓋部材２２の代わりに、ウェル蓋部材２３が用いられる。
また、本実施例では、励起光４０の光路断面において、流路蓋部材２２の幅が、誘電体部材１２の幅よりも大きく設計されている。このように構成することによって、流路蓋部材２２に保持領域３４を設けることができ、センサーチップ２４は、この保持領域３４とチップ装填部２６のチップ保持手段３６とが接触するように、チップ装填部２６に装填することができる。
このように装填することにより、センサーチップ２４の交換を行った場合にも、センサーチップ２４と後述する投光ユニットとの位置関係を一定に保つことができ、測定誤差を少なくすることができる。
なお、本明細書において「光路断面」とは、投光ユニット３８から金属膜１４に向かって励起光４０を照射した場合に、励起光４０の光路（後述する金属膜反射光４０ａ、出射面反射光４０ｃの光路を含む）を含む面と一致する断面を意味している。
なお、本明細書において「光路断面」とは、投光ユニット３８から金属膜１４に向かって励起光４０を照射した場合に、励起光４０の光路（後述する金属膜反射光４０ａ、出射面反射光４０ｃの光路を含む）を含む面と一致する断面を意味している。
センサーチップ２４の下方の一方の側面側には、図１に示すように、励起光４０を照射するＳＰＦＳ装置１１の投光ユニット３８が設けられている。
投光ユニット３８は、例えば、ＬＤ（Laser Diode：レーザーダイオード）やＬＥＤ（Light Emitting Diode：発光ダイオード）、ＨＩＤ（High Intensity Discharge）ランプ（高輝度放電ランプ）などからなる光源と、光源から照射された光を平行光束とするコリメートレンズなどを含んで構成される。
投光ユニット３８は、例えば、ＬＤ（Laser Diode：レーザーダイオード）やＬＥＤ（Light Emitting Diode：発光ダイオード）、ＨＩＤ（High Intensity Discharge）ランプ（高輝度放電ランプ）などからなる光源と、光源から照射された光を平行光束とするコリメートレンズなどを含んで構成される。
図５は、本実施例のＳＰＦＳシステム１０における投光ユニット３８の光学構成の一例を示す模式図である。
図５に示すように、投光ユニット３８の光学系は、光源であるＬＤ（レーザーダイオード）５４と、ＬＤ５４から出射した光をコリメートするためのコリメートレンズ５６と、センサーチップ２４の金属膜１４へ照射する励起光４０をＰ偏光とするための偏光板５８と、ＬＤ５４の散乱光や迷光が受光ユニット５０により検出されないように一部の波長の光をカットするためのショートパスフィルター６０と、金属膜１４への照射スポットサイズを規制するためのアパーチャー６２とを備えている。
図５に示すように、投光ユニット３８の光学系は、光源であるＬＤ（レーザーダイオード）５４と、ＬＤ５４から出射した光をコリメートするためのコリメートレンズ５６と、センサーチップ２４の金属膜１４へ照射する励起光４０をＰ偏光とするための偏光板５８と、ＬＤ５４の散乱光や迷光が受光ユニット５０により検出されないように一部の波長の光をカットするためのショートパスフィルター６０と、金属膜１４への照射スポットサイズを規制するためのアパーチャー６２とを備えている。
このような投光ユニット３８から出射する励起光４０は略平行光となっている。なお、ＬＤ５４の出射波長は、少なくとも金属膜１４上で表面プラズモンを発生させる波長を含んでいる。
ここで、ＬＤ５４に定電流を流していたとしても、測定環境温度等によりＬＤ５４の出射光量が変化するため、被検体の量に相関する光量として絶対光量を計測する必要がある光学式検体検出システムにおいては、正確な測定ができなくなる。
このため、本実施例のＳＰＦＳシステム１０では、投光ユニット３８の出射光量を一定に保つためにＡＰＣ（Auto Power Control）用光学系６４が投光ユニット３８内に設けられている。具体的には、ＡＰＣ用フォトダイオード６６と、アパーチャー６２から出射した励起光４０の一部をＡＰＣ用フォトダイオード６６へ反射させ、残りの光を金属膜１４へ出射させるビームスプリッタ６８とを備えてなる光学系である。
ビームスプリッタ６８で反射した光の光量をＡＰＣ用フォトダイオード６６で検出し、検出した光量に応じて、ＬＤ５４の投入電流値にフィードバックをかけて、ＡＰＣ用フォトダイオード６６の検出光量が一定となるよう、すなわち、投光ユニット３８の出射光量が一定となるように図示しない制御部により制御している。
さらに、ビームスプリッタ６８は、例えば、屈折率１．６以上の高屈折率材料で形成することが望ましく、また、ビームスプリッタ６８への励起光４０の入射角度は小さい方が望ましく、例えば、４０°以下であることが望ましい。
このように構成することにより、投光ユニット３８内のＬＤ５４やコリメートレンズ５６などの光学素子が、環境変化や経時変化によって偏芯することで、ビームスプリッタ６８への励起光４０の入射角度が変化したとしても、ビームスプリッタ６８の反射／透過の分岐比率の変動量を小さく抑えられるため、投光ユニット３８の出射光量を安定させることができる。
この投光ユニット３８は、励起光４０の金属膜１４への入射角度を、所定の測定走査角度の範囲で変更可能なように、照射角度可変機構（図示せず）を備えている。
ここで、測定走査角度とは、投光ユニット３８から励起光４０を出射し、受光ユニット５０で蛍光４８またはプラズモン散乱光などの散乱光、もしくは蛍光４８と散乱光の両方を計測している間に、投光ユニット３８を走査し出射する励起光４０の出射角度（角度のゼロ基準は、金属膜１４平面の垂線）を言う。
ここで、測定走査角度とは、投光ユニット３８から励起光４０を出射し、受光ユニット５０で蛍光４８またはプラズモン散乱光などの散乱光、もしくは蛍光４８と散乱光の両方を計測している間に、投光ユニット３８を走査し出射する励起光４０の出射角度（角度のゼロ基準は、金属膜１４平面の垂線）を言う。
ここで、プラズモン散乱光とは、金属膜１４上で発生する表面プラズモン自体が散乱する光であり、その波長は励起光４０の波長に等しい。なお、励起光４０の出射角度を走査した場合に、プラズモン散乱光の光量が最大となる角度が増強角度であり、この増強角度の近傍の角度において、表面プラズモンによる強い蛍光強度が得られる。
増強角度は、センサーチップ２４における誘電体部材１２の形状や屈折率、金属膜１４の材料や膜厚、流路１８内の流体屈折率などに依存するため、センサーチップ２４の製造時の誤差を考慮すると、測定ごとに最適な増強角度を求めることが望ましい。
投光ユニット３８から、誘電体部材１２の入射面１２ｂに向けて励起光４０が照射され、誘電体部材１２の上面に隣接する金属膜１４に入射する。これにより、金属膜１４上に発生した表面プラズモン光（疎密波）により励起された蛍光物質により発光される蛍光４８を、センサーチップ２４の上方に設けられた受光ユニット５０により検出する。
受光ユニット５０の光学系としては、例えば、表面プラズモンにより発生した散乱光（プラズモン散乱光）や蛍光４８を受光するための受光素子であるフォトダイオードと、フォトダイオードへ集光するためのレンズと、励起光４０の波長の光をカットするための励起光カットフィルタとを備えてなる。
励起光カットフィルタは、蛍光４８を測定する場合には、受光ユニット５０内の光路上に設置してあり、プラズモン散乱光を測定する場合には、例えば、励起光カットフィルタ駆動機構を用いて、受光ユニット５０内の光路上から少なくとも一部分を待避して、プラズモン散乱光がフォトダイオードへ入射できるように構成されている。
励起光カットフィルタは、例えば、誘電体多層膜からなるバンドパスフィルタであり、受光ユニット５０内における光路のうち、蛍光４８が略平行光束となる位置に設置されている。
また、受光素子としては、例えば、光電子倍増管やアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）など受光光量を測定できるものであればフォトダイオードに限らない。
一方で、励起光４０のうち、金属膜１４において反射した光（金属膜反射光４０ａ）は、誘電体部材１２の出射面１２ｃより出射する。
また、図１に示すように、金属膜反射光４０ａの一部は、出射面１２ｃにおいて反射し、この出射面反射光４０ｂは、励起光４０の金属膜１４への入射角度にもよるが、入射面１２ｂに向けて直進し、入射面１２ｂより誘電体部材１２外へ出射する。
本実施例のＳＰＦＳシステム１０では、この出射面反射光４０ｂが、測定走査角度内において、流路蓋部材２２に入射しないように構成されている。
具体的には、以下のように構成することによって、出射面反射光４０ｂが、測定走査角度内において、流路蓋部材２２に入射しないようにできる。
具体的には、以下のように構成することによって、出射面反射光４０ｂが、測定走査角度内において、流路蓋部材２２に入射しないようにできる。
以下に、本実施例のＳＰＦＳシステム１０における測定の流れの一例を示す。
図６は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける測定の流れを説明するフローチャートである。
図６は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける測定の流れを説明するフローチャートである。
（Ｓ１０１）センサーチップ２４が準備され、ＳＰＦＳシステム１０のチップ装填部２６に取り付けられる。センサーチップ２４は、生化学検査の１検体ごとに交換され使い捨てされる。検体は一般的には血液などが使用される。
（Ｓ１０２）次に、センサーチップ２４の流路１８内の洗浄を行う。センサーチップ２４の流路１８内には、固相膜においてアナライトを捕捉する感度を保つために保湿剤が塗布されている。流路１８内に洗浄液を導入することで、この保湿剤を洗浄する。また、洗浄により、固相膜周辺の汚染物も除去される。
（Ｓ１０３）次に、アナライトが混在している検体液を流路１８内に導入し、抗原抗体反応（１次反応）によって、流路１８中の固相膜にアナライトが捕捉される。捕捉後、余剰な検体液は流路１８内から吸引することで除去される。また、必要に応じて適当な洗浄液で流路１８内の残留物を除去する。
（Ｓ１０４）次に、増強角測定を行う。増強角測定では、投光ユニット３８から出射する励起光４０の出射角度を走査し、受光ユニット５０によってプラズモン散乱光を検出し、増強角度を求める。このとき、受光ユニット５０における光路から、後述する蛍光測定で用いる励起光カットフィルタは待避させておく。これにより、励起光４０と同じ波長であるプラズモン散乱光が受光ユニット５０内の受光素子まで到達でき、受光ユニット５０でプラズモン散乱光の光量を測定することが可能となる。
（Ｓ１０５）次に、受光ユニット５０における光路内に励起光カットフィルタを配置させ、投光ユニット３８から励起光４０を照射し、受光ユニット５０で検出した光量を計測し、この光量を光学ブランク値（ｏＢ）として記録する。このとき、励起光４０の出射角度は、増強角測定で求めた増強角度となるように、投光ユニット３８の角度を設定する。
（Ｓ１０６）次に、流路１８内に蛍光標識液を導入し、蛍光標識液に含まれる蛍光標識抗体をアナライトに接触、結合させて蛍光標識化反応（２次反応）を行う。これにより、蛍光標識がアナライトに付加される。その後、余剰な蛍光標識抗体を除去するために流路１８内を洗浄する。
（Ｓ１０７）次に、励起光４０の出射角度を増強角度となるように投光ユニット３８の角度を設定し、受光ユニット５０内における光路上に励起光カットフィルタを配置した状態で、励起光４０を照射し、受光ユニット５０で検出した蛍光シグナル値（Ｓ）を計測する。
さらに、蛍光シグナル値（Ｓ）から、光学ブランク値測定Ｓ１０５で得られた光学ブランク値（ｏＢ）を引いた値を算出する。これにより、アナライトの量に相関する蛍光強度（ΔＳ）が求まる。
（Ｓ１０８）最後に、センサーチップ２４をＳＰＦＳシステム１０から取り外し、測定が終了する。
以上の過程において、センサーチップ２４や励起光カットフィルタなどの移動や、流路１８内への検体液の導入や吸引、洗浄などの作業は、測定者が手動で行ってもよいし、ＳＰＦＳシステム１０内において自動で行う駆動機構や制御機構を有してもよい。また、測定結果を記録する記録手段や結果を出力する出力手段をＳＰＦＳシステム１０に設けてもよい。
図７は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける誘電体部材の形状の一例を示す模式図である。
図１に示す実施例では、誘電体部材１２において、入射面１２ｂと出射面１２ｃがそれぞれ平滑面であり、誘電体部材１２の金属膜１４に隣接する上面１２ａと、入射面１２ｂとがなす角度θaと、誘電体部材１２の金属膜１４に隣接する上面１２ａと、出射面１２ｃとがなす角度θbとが同じ角度になっているが、図７に示す実施例では、θaとθbとが異なる角度となっている。
図１に示す実施例では、誘電体部材１２において、入射面１２ｂと出射面１２ｃがそれぞれ平滑面であり、誘電体部材１２の金属膜１４に隣接する上面１２ａと、入射面１２ｂとがなす角度θaと、誘電体部材１２の金属膜１４に隣接する上面１２ａと、出射面１２ｃとがなす角度θbとが同じ角度になっているが、図７に示す実施例では、θaとθbとが異なる角度となっている。
図７（ａ）の例では、θaがθbよりも小さい角度となっている。この場合、金属膜反射光４０ａは、出射面１２ｃで反射した後、上面１２ａで反射し、入射面１２ｂから出射する。このように、上面１２ａで反射した出射面反射光４０ｂは、流路蓋部材２２側に向かうことはないため、測定走査角度内において、出射面反射光４０ｂを流路蓋部材２２に入射しないようにできる。
図７（ｂ）の例では、θaがθbよりも大きい角度であり鈍角となっている。この場合、金属膜反射光４０ａは、出射面１２ｃで反射した後、底面１２ｄから出射する。このように、誘電体部材１２の底面１２ｄから出射面反射光４０ｂを出射させることにより、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射しないようにすることができる。
なお、図７（ｃ）に示すように、出射面１２ｃを複数の面で構成していてもよく、この場合も、θaがθbよりも大きい角度となっていれば、図７（ｂ）と同様に、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射しないようにすることができる。
このように、θaをθbよりも大きい角度にすることによって、図６に示すように、入射面１２ｂに向かう出射面反射光４０ｂは、底面１２ｄ寄りとなるため、センサーチップ２４を構成しやすくなる。
なお、図８（ａ）は、θa＝８０°，θb＝８２°の場合、図８（ｂ）は、θa＝８０°，θb＝８０°の場合、図８（ｃ）は、θa＝８０°，θb＝７８°の場合の励起光４０の入射角度と出射面反射光４０ｂの入射面１２ｂにおける出射角度θcとの関係を示している。
なお、出射面反射光４０ｂの底面１２ｄへの入射角によっては、一部の光が入射面１２ｂに向かい、流路蓋部材２２に入射してしまうことがある。このため、誘電体部材１２の底面１２ｄを散乱面や非平面とすることで底面１２ｄから入射面１２ｂに出射面反射光４０ｂが向かわないようにすることが好ましい。
また、励起光４０の測定走査角度内の少なくとも一部の角度において、下記式（１）を満たすように誘電体部材１２を形成することで、入射面１２ｂにおいて出射面反射光４０ｂが水平よりも底面側に出射することになり、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射しないようにすることができる。
但し、ｎ1は誘電体部材１２の屈折率、ｎ0は誘電体部材１２の入射面１２ｂにおける励起光入射側の屈折率、θは励起光４０の金属膜１４への入射角度である。
なお、誘電体部材１２の入射面１２ｂにおいては、励起光４０の入射時に、励起光４０の一部が入射面１２ｂに反射してしまう。このような入射面反射光４０ｃが、流路蓋部材２２に入射してしまうと、上述するような出射面反射光４０ｂと同様な問題が生じるため、入射面反射光４０ｃが流路蓋部材２２に入射しないようした方がよい。
また、励起光４０の測定走査角度内において、入射面１２ｂにおける出射面反射光４０ｂの出射角度θcと、入射面１２ｂにおける入射面反射光４０ｃの反射角度θdとが一致するように構成することが好ましい。
このように構成することによって、図９，１０に示すように、励起光４０の測定走査角度内において、出射面反射光４０ｂの出射角度θcの範囲と、入射面反射光４０ｃの反射角度θdの範囲とが重複するため、出射面反射光４０ｂ及び入射面反射光４０ｃが通過する光の存在範囲が狭くなり、センサーチップ２４を、出射面反射光４０ｂ及び入射面反射光４０ｃが流路蓋部材２２に入射しないように構成しやすくなる。
なお、図９は、励起光４０の測定走査角度を６０°から７２°とし、図９（ａ）は、θa＝８０°，θb＝８２°の場合、図９（ｂ）は、θa＝８０°，θb＝８０°の場合、図９（ｃ）は、θa＝８０°，θb＝７８°の場合の励起光４０の入射角度と、出射面反射光４０ｂの入射面における出射角度θc及び入射面反射光４０ｃの反射角度θdとの関係を示している。
また、図１０は、励起光４０の測定走査角度を６１°から７３°とし、図１０（ａ）は、θa＝８０°，θb＝８２°の場合、図１０（ｂ）は、θa＝８０°，θb＝８０°の場合、図１０（ｃ）は、θa＝８０°，θb＝７８°の場合の励起光４０の入射角度と、出射面反射光４０ｂの入射面における出射角度θc及び入射面反射光４０ｃの反射角度θdとの関係を示している。
また、図１１に示すように、励起光４０の光路断面において、流路蓋部材２２の一部に切欠部２２ａを設けることもできる。
このように切欠部２２ａを設けることによって、流路蓋部材２２に保持領域３４を設けることができるとともに、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射することがない。
このように切欠部２２ａを設けることによって、流路蓋部材２２に保持領域３４を設けることができるとともに、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射することがない。
なお、誘電体部材１２から出射した出射面反射光４０ｂは、例えば、ＳＰＦＳシステム１０の壁面などに反射して、これが迷光の原因となってしまうことがある。このため、図１に示すように、誘電体部材１２の入射面１２ｂから出射した出射面反射光４０ｂを吸光したり、もしくは、影響のない方向へ反射させたりするための遮光部材５２を設けることが好ましい。
図１２は、本発明の光学式検体検出システムの一態様であるＳＰＦＳシステムの別の一例を模式的に示す概略図である。
この実施例のＳＰＦＳシステム１０は、基本的には、図１に示すＳＰＦＳシステム１０と同様な構成であるため、同一の構成部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
この実施例のＳＰＦＳシステム１０は、基本的には、図１に示すＳＰＦＳシステム１０と同様な構成であるため、同一の構成部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
本実施例では、センサーチップ２４が、励起光４０に対して透光性を有する素材により形成された試薬ウェル４２を備えている。
試薬ウェル４２は、例えば、検体液や薬液などが収容される容器である。センサーチップ２４は、試薬ウェル４２に設けられたセンサーチップ装填孔４４に装填される。
試薬ウェル４２は、例えば、検体液や薬液などが収容される容器である。センサーチップ２４は、試薬ウェル４２に設けられたセンサーチップ装填孔４４に装填される。
この時、流路蓋部材２２の保持領域３４と、センサーチップ装填孔４４の保持部４４ａとが接触するように、センサーチップ２４をセンサーチップ装填孔４４に装填することによって、センサーチップ２４と試薬ウェル４２との位置関係を一定に保つことができる。
さらに、試薬ウェル４２の保持領域４６とチップ装填部２６のチップ保持手段３６とが接触するように、チップ装填部２６に装填することによって、センサーチップ２４と投光ユニット３８との位置関係を一定に保つことができ、測定誤差を少なくすることができる。
このように励起光４０に対して透光性を有する素材により形成された試薬ウェル４２を備える場合には、出射面反射光４０ｂが、励起光４０の測定走査角度内において、流路蓋部材２２のみならず、試薬ウェル４２にも入射しないように構成することが好ましい。
具体的には、上述するように、θa及びθbの角度など誘電体部材１２の形状を、出射面反射光４０ｂが試薬ウェル４２に入射しないように設計することで対応可能である。
また、図１２に示すように、励起光４０の光路断面において、試薬ウェル４２の一部に切欠部４２ａを設けることもできる。
このように切欠部４２ａを設けることによって、試薬ウェル４２に保持領域４６を設けることができるとともに、出射面反射光４０ｂが試薬ウェル４２に入射することがない。
また、図１２に示すように、励起光４０の光路断面において、試薬ウェル４２の一部に切欠部４２ａを設けることもできる。
このように切欠部４２ａを設けることによって、試薬ウェル４２に保持領域４６を設けることができるとともに、出射面反射光４０ｂが試薬ウェル４２に入射することがない。
以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、光学式検体検出システムの一態様としてＳＰＦＳシステムを例に挙げて説明したが、他の態様として例えば、ＳＰＲシステムなどにも適用可能であるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
本発明は、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた、血液検査などの臨床試験のような、高精度の検出が要求される分野において、検体検出を高精度かつ迅速に行うことができる。
１０ ＳＰＦＳシステム
１１ ＳＰＦＳ装置
１２ 誘電体部材
１２ａ 上面
１２ｂ 入射面
１２ｃ 出射面
１２ｄ 底面
１４ 金属膜
１６ 反応層
１８ 流路
２０ 流路形成部材
２２ 流路蓋部材
２２ａ 切欠部
２４ センサーチップ
２６ チップ装填部
２８ 検体流入口
３０ 検体排出口
３２ 液溜部
３４ 保持領域
３６ チップ保持手段
３８ 投光ユニット
４０ 励起光
４０ａ 金属膜反射光
４０ｂ 出射面反射光
４０ｃ 入射面反射光
４２ 試薬ウェル
４２ａ 切欠部
４４ センサーチップ装填孔
４４ａ 保持部
４６ 保持領域
４８ 蛍光
５０ 受光ユニット
５２ 遮光部材
５４ ＬＤ（レーザーダイオード）
５６ コリメートレンズ
５８ 偏光板
６０ ショートパスフィルター
６２ アパーチャー
６４ ＡＰＣ用光学系
６６ ＡＰＣ用フォトダイオード
６８ ビームスプリッタ
１００ ＳＰＦＳシステム
１０１ ＳＰＦＳ装置
１０２ 誘電体部材
１０２ａ 上面
１０２ｂ 入射面
１０２ｃ 出射面
１０４ 金属膜
１０６ 反応層
１０８ 流路
１１０ 流路形成部材
１１２ 流路蓋部材
１１４ センサーチップ
１１６ センサーチップ装填部
１１８ 蛍光
１２０ 受光ユニット
１２２ 光源
１２４ 励起光
１２４ｂ 出射面反射光
１２６ 光吸収部
１２８ 励起光カットフィルタ
１１ ＳＰＦＳ装置
１２ 誘電体部材
１２ａ 上面
１２ｂ 入射面
１２ｃ 出射面
１２ｄ 底面
１４ 金属膜
１６ 反応層
１８ 流路
２０ 流路形成部材
２２ 流路蓋部材
２２ａ 切欠部
２４ センサーチップ
２６ チップ装填部
２８ 検体流入口
３０ 検体排出口
３２ 液溜部
３４ 保持領域
３６ チップ保持手段
３８ 投光ユニット
４０ 励起光
４０ａ 金属膜反射光
４０ｂ 出射面反射光
４０ｃ 入射面反射光
４２ 試薬ウェル
４２ａ 切欠部
４４ センサーチップ装填孔
４４ａ 保持部
４６ 保持領域
４８ 蛍光
５０ 受光ユニット
５２ 遮光部材
５４ ＬＤ（レーザーダイオード）
５６ コリメートレンズ
５８ 偏光板
６０ ショートパスフィルター
６２ アパーチャー
６４ ＡＰＣ用光学系
６６ ＡＰＣ用フォトダイオード
６８ ビームスプリッタ
１００ ＳＰＦＳシステム
１０１ ＳＰＦＳ装置
１０２ 誘電体部材
１０２ａ 上面
１０２ｂ 入射面
１０２ｃ 出射面
１０４ 金属膜
１０６ 反応層
１０８ 流路
１１０ 流路形成部材
１１２ 流路蓋部材
１１４ センサーチップ
１１６ センサーチップ装填部
１１８ 蛍光
１２０ 受光ユニット
１２２ 光源
１２４ 励起光
１２４ｂ 出射面反射光
１２６ 光吸収部
１２８ 励起光カットフィルタ
Claims (15)
- 誘電体部材と、
前記誘電体部材の上面に隣接する金属膜と、
前記金属膜の上面に隣接する反応層と、
前記反応層の上面に配置される蓋部材と、を備えたセンサーチップと、
前記センサーチップを保持するためのチップ保持手段を有するチップ装填部と、
前記金属膜に前記誘電体部材を介して励起光を照射する投光ユニットと、を備え、前記金属膜に前記誘電体部材を介して前記励起光を照射することで検体の検出を行う光学式検体検出システムであって、
前記励起光の光路断面において、前記蓋部材の幅が、前記誘電体部材の幅よりも大きく、
前記励起光が前記誘電体部材の出射面に反射した後、前記誘電体部材外に出射する出射面反射光が、前記励起光の測定走査角度内において、前記蓋部材に入射しないように構成され、
前記誘電体部材の入射面と出射面が、それぞれ平滑面であり、
前記励起光の測定走査角度内の少なくとも一部の角度において、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θ a 、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θ b 、前記誘電体部材の屈折率ｎ 1 が、下記式を満たす光学式検体検出システム。
- 前記誘電体部材の入射面と出射面が、それぞれ平滑面であり、
前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θaと、
前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θbと、が異なる請求項１に記載の光学式検体検出システム。 - 前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θbが、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θaよりも大きい請求項２に記載の光学式検体検出システム。
- 前記励起光の測定走査角度内において、前記入射面における前記出射面反射光の出射角度と、前記入射面における前記励起光の反射角度とが一致する請求項１から３のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記出射面反射光が、前記出射面から前記入射面に向けて直進し、前記誘電体部材外へ出射するように構成されている請求項１から４のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記蓋部材の保持領域と、前記チップ保持手段とが接することで、前記センサーチップと前記投光ユニットとの位置決めがなされる請求項１から５のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記センサーチップが、試薬ウェルをさらに備える請求項１から６のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記試薬ウェルが、前記励起光に対して透光性を有する素材により形成されており、
前記出射面反射光が、前記励起光の測定走査角度内において、前記試薬ウェルに入射しないように構成されている請求項７に記載の光学式検体検出システム。 - 前記試薬ウェルの保持領域と、前記チップ保持手段とが接することで、前記センサーチップと前記投光ユニットとの位置決めがなされる請求項７または８に記載の光学式検体検出システム。
- 前記励起光の光路断面において、前記試薬ウェルの一部に切欠部を有する請求項７から９のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記励起光の光路断面において、前記蓋部材の一部に切欠部を有する請求項１から１０のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記誘電体部材の底面が散乱面である請求項１から１１のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記誘電体部材の底面が非平面である請求項１から１２のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記出射面反射光の光量が、前記励起光の光量の２％よりも大きい請求項１から１３のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
- 前記光学式検体検出システムが、遮光部材をさらに備え、
前記入射面から出射した前記出射面反射光が、前記遮光部材に照射されるように構成されている請求項１から１４のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
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