WO2017082043A1 - 光学式検体検出システム - Google Patents

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WO2017082043A1
WO2017082043A1 PCT/JP2016/081592 JP2016081592W WO2017082043A1 WO 2017082043 A1 WO2017082043 A1 WO 2017082043A1 JP 2016081592 W JP2016081592 W JP 2016081592W WO 2017082043 A1 WO2017082043 A1 WO 2017082043A1
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light
dielectric member
excitation light
detection system
metal film
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PCT/JP2016/081592
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English (en)
French (fr)
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史生 長井
野田　哲也
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コニカミノルタ株式会社
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Priority to EP22195116.3A priority patent/EP4137799A1/en
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    • G01N21/64—Fluorescence; Phosphorescence
    • G01N21/645—Specially adapted constructive features of fluorimeters
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    • G—PHYSICS
    • G02—OPTICS
    • G02B—OPTICAL ELEMENTS, SYSTEMS OR APPARATUS
    • G02B5/00—Optical elements other than lenses
    • G02B5/04—Prisms

Definitions

  • the present invention relates to a surface plasmon resonance apparatus applying a surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, and surface plasmon excitation based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS).
  • SPR surface plasmon resonance
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • the present invention relates to an optical specimen detection system that detects a measurement target substance contained in a sensor chip using an enhanced fluorescence measurement device or the like.
  • SPFS device based on the principle of surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS) using surface plasmon resonance (SPR) phenomenon, analyte detection can be performed with higher accuracy than SPR equipment.
  • SPFS device The surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectrometer (hereinafter referred to as “SPFS device”) is also one of such specimen detection devices.
  • surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy SPFS
  • surface plasmon light is applied to the surface of the metal film under the condition that excitation light such as laser light emitted from a light source attenuates total reflection (ATR) on the surface of the metal film.
  • excitation light such as laser light emitted from a light source attenuates total reflection (ATR) on the surface of the metal film.
  • ATR total reflection
  • FIG. 13 is a schematic configuration diagram for explaining the configuration of a conventional SPFS system.
  • a conventional SPFS system 100 includes a prism-shaped dielectric member 102 having a substantially trapezoidal vertical cross-sectional shape, a metal film 104 formed on a horizontal upper surface 102 a of the dielectric member 102, and an upper surface of the metal film 104.
  • a sensor chip 114 including a flow path forming member 110 that forms a flow path 108 and a flow path lid member 112 so as to surround the reaction layer 106, and the sensor chip 114 includes SPFS.
  • a sensor chip loading unit 116 of the apparatus 101 is loaded.
  • the reaction layer 106 of the sensor chip 114 has a solid phase film for capturing an analyte labeled with a fluorescent substance, and the analyte liquid containing the analyte is sent to the flow path 108, whereby the analyte is collected. Can be fixed on the metal film 104.
  • the light receiving unit 120 of the SPFS device 101 is used to measure the intensity of the fluorescence 118 emitted by the fluorescent material excited by the surface plasmon light (dense wave) generated on the metal film 104. Is arranged.
  • a light source 122 of the SPFS device 101 is disposed on one side surface (incident surface 102 b) below the dielectric member 102, and excitation light 124 irradiated from the light source 122. Enters the incident surface 102b of the dielectric member 102 from below the outer side of the dielectric member 102, and irradiates the metal film 104 formed on the upper surface 102a of the dielectric member 102 through the dielectric member 102.
  • surface plasmon light (dense wave) is generated on the surface of the metal film 104 by irradiating the excitation light 124 from the light source 122 toward the metal film 104.
  • the fluorescent substance that labels the analyte is excited by light (dense wave), and the fluorescence 118 emits light.
  • the fluorescence 118 is detected by the light receiving unit 120, and the amount of the analyte is calculated based on the light amount of the fluorescence 118.
  • the light amount of the fluorescence 118 is about 10 orders of magnitude lower than the excitation light amount, so that even if the excitation light 124 is incident on the light receiving unit 120 even slightly, the S / N deteriorates and the detection accuracy deteriorates. Therefore, it is important to reduce stray light.
  • the excitation light 124 is incident from the incident surface 102 b of the dielectric member 102, reflected by the metal film 104, and emitted from the output surface 102 c of the dielectric member 102.
  • the exit surface reflected light 124 b when the exit surface reflected light 124 b enters the channel lid member 112, the exit surface reflected light 124 b becomes light that guides the inside of the channel lid member 112. If present, autofluorescence in the flow path lid member 112 is detected, leading to deterioration of S / N.
  • the exit surface reflected light 124b usually has a light amount of about 4% of the excitation light 124, and is a sufficiently large amount of light with respect to the fluorescence 118. Therefore, it can be said to be stray light to be removed.
  • Patent Document 1 In order to remove such stray light, in Patent Document 1, as shown in FIG. 14, a light absorbing portion 126 that absorbs the metal film reflected light reflected by the metal film 104 is provided in the optical path of the dielectric member 102. Yes.
  • excitation light is provided by providing an excitation light cut filter (wavelength filter) 128 for removing scattered light and reflected light inside the sensor chip 114 on the upper surface of the sensor chip 114. 124 is cut.
  • excitation light cut filter wavelength filter
  • the light absorption unit 126 does not absorb 100% of the reflected light from the metal film, and a minute amount of reflected light exists in the light absorption unit 126. The stray light could not be completely removed.
  • An object of the present invention is to provide an optical sample detection system capable of measuring a sample with high accuracy.
  • the present invention was invented in order to solve the above-described problems in the prior art, and in order to realize at least one of the above-described objects, an optical sample reflecting one aspect of the present invention.
  • the detection system includes a dielectric member, A metal film adjacent to the top surface of the dielectric member; A reaction layer adjacent to an upper surface of the metal film; A lid member disposed on the upper surface of the reaction layer, and a sensor chip, Chip holding means for holding the sensor chip; A light projecting unit that irradiates the metal film with excitation light through the dielectric member, and detects the specimen by irradiating the metal film with the excitation light through the dielectric member
  • a sample detection system comprising: In the optical path cross section of the excitation light, the width of the lid member is larger than the width of the dielectric member, After the excitation light is reflected on the exit surface of the dielectric member, the exit surface reflected light exiting the dielectric member is configured not to enter the lid member within the measurement scan angle of the excitation light.
  • the exit surface reflected light derived from the excitation light having a larger amount of light than fluorescence is designed not to enter the lid member, the exit surface reflected light is not guided into the lid member, The S / N can be greatly improved, and the specimen can be measured with high accuracy.
  • FIG. 1 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS system which is an embodiment of the optical analyte detection system of the present invention.
  • FIG. 2 is a schematic bottom view of a part of the SPFS system of FIG. 1 viewed from the bottom side.
  • FIG. 3 is a schematic cross-sectional view showing an example of a sensor chip.
  • FIG. 4 is a schematic cross-sectional view showing another example of the sensor chip.
  • FIG. 5 is a schematic diagram illustrating an example of the optical configuration of the light projecting unit in the SPFS system of the present embodiment.
  • FIG. 6 is a flowchart for explaining the flow of measurement in the SPFS system of this embodiment.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an example of the shape of the dielectric member in the SPFS system of the present embodiment.
  • FIG. 8 is a graph showing the relationship between the incident angle of the excitation light and the exit angle of the exit surface reflected light.
  • FIG. 9 shows the relationship between the incident angle of the excitation light when the measurement scanning angle of the excitation light is changed from 60 ° to 72 °, and the exit angle of the exit surface reflected light and the reflection angle of the incident surface reflected light. It is a graph.
  • FIG. 10 shows the relationship between the incident angle of the excitation light when the measurement scan angle of the excitation light is 61 ° to 73 °, and the exit angle of the exit surface reflected light and the reflection angle of the incident surface reflected light. It is a graph.
  • FIG. 11 is a schematic bottom view showing still another example of the sensor chip.
  • FIG. 12 is a schematic view schematically showing another example of the SPFS system which is an aspect of the optical analyte detection system of the present invention.
  • FIG. 13 is a schematic diagram for explaining the configuration of a conventional SPFS system.
  • FIG. 14 is a schematic diagram for explaining the configuration of the sensor chip disclosed in Patent Document 1.
  • FIG. 15 is a schematic diagram for explaining the configuration of the SPFS system disclosed in Patent Document 2.
  • FIG. 1 is a schematic view schematically showing an outline of an SPFS system which is an embodiment of the optical analyte detection system of the present invention
  • FIG. 2 is a schematic view showing a part of the SPFS system of FIG. is there.
  • the directions of “up” and “down” are defined in the state of FIG.
  • the SPFS system 10 of this embodiment includes a prism-shaped dielectric member 12 having a substantially trapezoidal vertical cross-sectional shape, a metal film 14 formed on a horizontal upper surface 12a of the dielectric member 12, and an upper surface of the metal film 14. And a sensor chip 24 including a flow path forming member 20 that forms a flow path 18 and a flow path lid member 22 so as to surround the reaction layer 16. Are loaded in the chip loading section 26 of the SPFS device 11.
  • the reaction layer 16 of the sensor chip 24 has a solid phase film for thinning the analyte labeled with the fluorescent substance, and the analyte liquid containing the analyte is sent to the flow path 18, thereby the analyte. Can be fixed on the metal film 14.
  • the solid phase film is one in which a ligand for capturing an analyte is immobilized, for example, a SAM (Self-Assembled Monolayer) and a solid phase layer formed on the SAM. Can be configured.
  • a ligand for capturing an analyte for example, a SAM (Self-Assembled Monolayer) and a solid phase layer formed on the SAM. Can be configured.
  • solid phase layer examples include glucose, carboxymethylated glucose, and vinyl esters, acrylic esters, methacrylic esters, olefins, styrenes, crotonic esters, itaconic diesters, malee, and the like.
  • hydrophilic polymers such as dextran and dextran derivatives and vinyl esters, acrylic esters, methacrylic esters, olefins, styrenes, crotonic esters, itaconic diesters, maleic diesters, fumaric acid Jie
  • the dielectric member 12 is not particularly limited as long as it is a material that is optically transparent at least with respect to the excitation light 40. However, in order to obtain a sensor chip that is inexpensive and excellent in handleability, it is injection molded. It is formed from the resin material.
  • Examples of the resin material forming the dielectric member 12 include polyesters such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate, polyolefins such as polyethylene (PE) and polypropylene (PP), cyclic olefin copolymer (COC), and cyclic.
  • polyesters such as polyethylene terephthalate (PET) and polyethylene naphthalate
  • polyolefins such as polyethylene (PE) and polypropylene (PP)
  • PP polypropylene
  • COC cyclic olefin copolymer
  • Polycyclic olefins such as olefin polymer (COP), vinyl resins such as polyvinyl chloride and polyvinylidene chloride, polystyrene, polyether ether ketone (PEEK), polysulfone (PSF), polyether sulfone (PES), polycarbonate ( PC), polyamide, polyimide, acrylic resin, triacetyl cellulose (TAC), and the like can be used.
  • COP olefin polymer
  • vinyl resins such as polyvinyl chloride and polyvinylidene chloride
  • PEEK polyether ether ketone
  • PSF polysulfone
  • PES polyether sulfone
  • PC polycarbonate
  • PC polyamide
  • polyimide acrylic resin
  • TAC triacetyl cellulose
  • the metal film 14 is not particularly limited, but is preferably made of at least one metal selected from the group consisting of gold, silver, aluminum, copper, and platinum, and more preferably made of gold. Furthermore, you may comprise from the alloy of these metals.
  • such a metal is suitable as the metal film 14 because it is stable against oxidation and has an increased electric field enhancement effect by surface plasmon light (dense wave) as described later.
  • the method for forming the metal film 14 is not particularly limited, and examples thereof include sputtering, vapor deposition (resistance heating vapor deposition, electron beam vapor deposition, etc.), electrolytic plating, electroless plating, and the like. It is done.
  • the sputtering method or the vapor deposition method is used because it is easy to adjust the thin film formation conditions.
  • the thickness of the metal film 14 is not particularly limited, but is preferably in the range of 5 nm to 500 nm. From the viewpoint of the electric field enhancing effect, more preferably, gold: 20 nm to 70 nm, silver: 20 nm to 70 nm, aluminum: 10 to 50 nm, copper: 20 to 70 nm, platinum: 20 to 70 nm, and alloys thereof: It is desirable to be within the range of 10 to 70 nm.
  • the thickness of the metal film 14 is within the above range, surface plasmon light (dense wave) is likely to be generated, which is preferable. Moreover, if it is the metal film 14 which has such thickness, a shape will not be specifically limited.
  • an acrylic pressure-sensitive adhesive sheet in which flow path grooves having a predetermined width and a predetermined length are punched can be used as the flow path forming member 20, for example.
  • the thickness of such an acrylic pressure-sensitive adhesive sheet is not particularly limited, but is preferably about 0.1 mm.
  • the flow path lid member 22 is not particularly limited as long as it is a material having translucency with respect to the excitation light 40 and the fluorescence 48, but the same resin material as that of the dielectric member 12 described above is used. Can be used.
  • the channel lid member 22 is provided with a sample inlet 28 and a sample outlet 30 for sending the sample liquid containing the analyte through the channel 18. By connecting the sample inlet 28 and the sample outlet 30 by a circulating liquid feeding means such as a pump, the sample liquid can be circulated in one direction.
  • a liquid reservoir 32 is provided at the sample discharge port 30, and for example, the sample liquid is injected into the sample inlet 28 using a pipette or the like, and the aspiration and injection of the sample liquid are repeated with the pipette.
  • the sample liquid can be reciprocated in the pipette, the flow path 18 and the liquid reservoir 32, and the analyte in the sample liquid is quickly and efficiently captured by the ligand immobilized on the solid phase membrane. It will be.
  • the reaction efficiency between the analyte and the solid phase membrane is increased even with a small amount of sample liquid, and the detection accuracy of the analyte can be improved. it can.
  • the reaction layer 16 is provided in the flow path 18 and the sample liquid is sent to the flow path 18.
  • the sample liquid is retained in the well portion 19.
  • a well lid member 23 is used as the lid member instead of the flow path lid member 22.
  • the width of the flow path lid member 22 is designed to be larger than the width of the dielectric member 12 in the optical path cross section of the excitation light 40.
  • the holding region 34 can be provided in the flow path lid member 22, and the sensor chip 24 is configured so that the holding region 34 and the chip holding means 36 of the chip loading unit 26 are in contact with each other.
  • the loading unit 26 can be loaded.
  • the “optical path cross section” means an optical path of the excitation light 40 (a metal film reflected light 40a, which will be described later, and an exit surface reflection) when the excitation light 40 is irradiated from the light projecting unit 38 toward the metal film 14. It means a cross section that coincides with a plane including the optical path of the light 40c.
  • a light projecting unit 38 of the SPFS device 11 that irradiates the excitation light 40 is provided on one side surface below the sensor chip 24.
  • the light projecting unit 38 is irradiated with a light source composed of, for example, an LD (Laser Diode), an LED (Light Emitting Diode), an HID (High Intensity Discharge) lamp, and the like.
  • a collimating lens that converts the reflected light into a parallel light beam.
  • FIG. 5 is a schematic diagram illustrating an example of an optical configuration of the light projecting unit 38 in the SPFS system 10 of the present embodiment.
  • the optical system of the light projecting unit 38 includes an LD (laser diode) 54 as a light source, a collimating lens 56 for collimating light emitted from the LD 54, and the metal film 14 of the sensor chip 24.
  • the excitation light 40 emitted from such a light projecting unit 38 is substantially parallel light.
  • the emission wavelength of the LD 54 includes at least a wavelength that generates surface plasmons on the metal film 14.
  • the amount of light emitted from the LD 54 changes depending on the measurement environment temperature or the like, and therefore it is necessary to measure the absolute light amount as the light amount correlated with the amount of the subject. In this case, accurate measurement cannot be performed.
  • an APC (Auto Power Control) optical system 64 is provided in the light projecting unit 38 in order to keep the emitted light quantity of the light projecting unit 38 constant.
  • an APC photodiode 66 and a beam splitter 68 that reflects a part of the excitation light 40 emitted from the aperture 62 to the APC photodiode 66 and emits the remaining light to the metal film 14 are provided. It is an optical system.
  • the amount of light reflected by the beam splitter 68 is detected by the APC photodiode 66, and the input current value of the LD 54 is fed back according to the detected amount of light so that the detected amount of light of the APC photodiode 66 becomes constant. That is, control is performed by a control unit (not shown) so that the amount of light emitted from the light projecting unit 38 is constant.
  • the beam splitter 68 is desirably formed of, for example, a high refractive index material having a refractive index of 1.6 or more, and the incident angle of the excitation light 40 to the beam splitter 68 is desirably small, for example, 40 ° The following is desirable.
  • the optical element such as the LD 54 and the collimating lens 56 in the light projecting unit 38 is decentered due to environmental changes and changes with time, so that the incident angle of the excitation light 40 to the beam splitter 68 changes. Even if it does, since the variation
  • the light projecting unit 38 includes an irradiation angle variable mechanism (not shown) so that the incident angle of the excitation light 40 on the metal film 14 can be changed within a predetermined measurement scanning angle range.
  • the measurement scanning angle means that the excitation light 40 is emitted from the light projecting unit 38 and the light receiving unit 50 measures scattered light such as fluorescence 48 or plasmon scattered light, or both fluorescence 48 and scattered light.
  • the emission angle of the excitation light 40 that scans and emits the light projecting unit 38 (the zero reference for the angle is a perpendicular to the plane of the metal film 14).
  • the plasmon scattered light is light scattered by the surface plasmon itself generated on the metal film 14, and its wavelength is equal to the wavelength of the excitation light 40. Note that when the emission angle of the excitation light 40 is scanned, the angle at which the amount of plasmon scattered light is maximized is the enhancement angle, and strong fluorescence intensity due to surface plasmons is obtained at angles near this enhancement angle.
  • the enhancement angle depends on the shape and refractive index of the dielectric member 12 in the sensor chip 24, the material and film thickness of the metal film 14, the fluid refractive index in the flow path 18, etc. Considering this, it is desirable to obtain an optimal enhancement angle for each measurement.
  • the excitation light 40 is irradiated from the light projecting unit 38 toward the incident surface 12 b of the dielectric member 12 and is incident on the metal film 14 adjacent to the upper surface of the dielectric member 12.
  • the fluorescence 48 emitted from the fluorescent material excited by the surface plasmon light (dense wave) generated on the metal film 14 is detected by the light receiving unit 50 provided above the sensor chip 24.
  • a photodiode that is a light receiving element for receiving scattered light (plasmon scattered light) or fluorescence 48 generated by surface plasmons, a lens for condensing the photodiode, An excitation light cut filter for cutting light having the wavelength of the excitation light 40 is provided.
  • the excitation light cut filter When measuring the fluorescence 48, the excitation light cut filter is installed on the optical path in the light receiving unit 50.
  • the plasmon scattered light can be incident on the photodiode while at least a part of the light path in the light receiving unit 50 is retracted.
  • the excitation light cut filter is, for example, a bandpass filter made of a dielectric multilayer film, and is installed at a position where the fluorescence 48 becomes a substantially parallel light beam in the optical path in the light receiving unit 50.
  • the light receiving element is not limited to a photodiode as long as it can measure the amount of received light, such as a photomultiplier tube or an avalanche photodiode (APD).
  • a photodiode such as a photomultiplier tube or an avalanche photodiode (APD).
  • the excitation light 40 the light reflected by the metal film 14 (metal film reflected light 40 a) is emitted from the emission surface 12 c of the dielectric member 12.
  • a part of the metal film reflected light 40a is reflected by the emission surface 12c, and this emission surface reflected light 40b depends on the incident angle of the excitation light 40 to the metal film 14, The light travels straight toward the incident surface 12b, and exits from the dielectric member 12 through the incident surface 12b.
  • the exit surface reflected light 40b is configured not to enter the flow path lid member 22 within the measurement scanning angle. Specifically, by configuring as follows, the exit surface reflected light 40b can be prevented from entering the channel lid member 22 within the measurement scanning angle.
  • FIG. 6 is a flowchart for explaining the flow of measurement in the SPFS system of this embodiment.
  • the sensor chip 24 is prepared and attached to the chip loading unit 26 of the SPFS system 10.
  • the sensor chip 24 is replaced and disposable for each specimen of the biochemical test.
  • As a specimen, blood or the like is generally used.
  • the enhancement angle is measured.
  • the emission angle of the excitation light 40 emitted from the light projecting unit 38 is scanned, the plasmon scattered light is detected by the light receiving unit 50, and the enhancement angle is obtained.
  • an excitation light cut filter used in fluorescence measurement described later is retracted from the optical path in the light receiving unit 50.
  • plasmon scattered light having the same wavelength as the excitation light 40 can reach the light receiving element in the light receiving unit 50, and the light amount of the plasmon scattered light can be measured by the light receiving unit 50.
  • an excitation light cut filter is arranged in the optical path of the light receiving unit 50, the excitation light 40 is irradiated from the light projecting unit 38, the light quantity detected by the light receiving unit 50 is measured, and this light quantity is calculated as an optical blank value. Record as (oB). At this time, the angle of the light projecting unit 38 is set so that the emission angle of the excitation light 40 becomes the enhancement angle obtained by the enhancement angle measurement.
  • a fluorescence labeling reaction (secondary reaction) is performed by introducing a fluorescence labeling solution into the flow path 18 and contacting and binding the fluorescence labeled antibody contained in the fluorescence labeling solution to the analyte. This adds a fluorescent label to the analyte. Thereafter, the inside of the flow path 18 is washed to remove excess fluorescently labeled antibody.
  • the angle of the light projecting unit 38 is set so that the emission angle of the excitation light 40 becomes an enhancement angle, and the excitation light 40 is placed in the state where the excitation light cut filter is disposed on the optical path in the light receiving unit 50.
  • the fluorescence signal value (S) detected by the light receiving unit 50 is measured.
  • operations such as movement of the sensor chip 24 and the excitation light cut filter, introduction of the sample liquid into the flow path 18, suction, and washing may be performed manually by the measurer or the SPFS system.
  • 10 may have a drive mechanism and a control mechanism which are automatically performed.
  • the SPFS system 10 may be provided with a recording means for recording the measurement result and an output means for outputting the result.
  • FIG. 7 is a schematic diagram showing an example of the shape of the dielectric member in the SPFS system of the present embodiment.
  • the incident surface 12b and the exit surface 12c are smooth surfaces, and the angle formed between the upper surface 12a adjacent to the metal film 14 of the dielectric member 12 and the incident surface 12b.
  • ⁇ a and the angle ⁇ b formed by the upper surface 12 a adjacent to the metal film 14 of the dielectric member 12 and the emission surface 12 c are the same angle, in the embodiment shown in FIG. 7, ⁇ a and ⁇ The angle is different from b .
  • ⁇ a is smaller than ⁇ b .
  • the metal film reflected light 40a is reflected by the emission surface 12c, then reflected by the upper surface 12a, and emitted from the incident surface 12b.
  • the outgoing surface reflected light 40b reflected by the upper surface 12a does not travel toward the flow path lid member 22, so that the outgoing surface reflected light 40b does not enter the flow path lid member 22 within the measurement scanning angle.
  • ⁇ a is an angle larger than ⁇ b and an obtuse angle.
  • the metal film reflected light 40a is reflected from the emission surface 12c and then emitted from the bottom surface 12d.
  • the exit surface reflected light 40b can be prevented from entering the flow path lid member 22.
  • the output surface 12c may be comprised by the several surface, and in this case, if (theta) a is an angle larger than (theta) b , FIG.7 (b) ), The exit surface reflected light 40b can be prevented from entering the flow path lid member 22.
  • the bottom surface 12d of the dielectric member 12 be a scattering surface or a non-planar surface so that the outgoing surface reflected light 40b does not go from the bottom surface 12d to the incident surface 12b.
  • the outgoing surface reflected light 40b is more horizontal than the horizontal at the incident surface 12b.
  • the light is emitted to the bottom surface side, and the outgoing surface reflected light 40b can be prevented from entering the flow path lid member 22.
  • n 1 is the refractive index of the dielectric member 12
  • n 0 is the refractive index of the incident surface 12 b of the dielectric member 12 on the excitation light incident side
  • ⁇ is the incident angle of the excitation light 40 to the metal film 14.
  • the incident surface 12b of the dielectric member 12 when the excitation light 40 is incident, a part of the excitation light 40 is reflected on the incident surface 12b. If such incident surface reflected light 40c enters the channel lid member 22, the same problem as the exit surface reflected light 40b as described above occurs, and therefore the incident surface reflected light 40c becomes the channel lid member 22. It is better not to enter.
  • the emission angle ⁇ c of the exit surface reflected light 40b on the entrance surface 12b and the reflection angle ⁇ d of the entrance surface reflected light 40c on the entrance surface 12b are configured to match. It is preferable.
  • FIG. 9 shows that the measurement scanning angle of the excitation light 40 is 60 ° to 72 °
  • 2 shows the relationship between the emission angle ⁇ c and the reflection angle ⁇ d of the incident surface reflected light 40 c .
  • FIG. 10 shows that the measurement scanning angle of the excitation light 40 is 61 ° to 73 °
  • 2 shows the relationship between the emission angle ⁇ c and the reflection angle ⁇ d of the incident surface reflected light 40 c .
  • a cutout portion 22 a may be provided in a part of the flow path lid member 22 in the cross section of the optical path of the excitation light 40.
  • the outgoing surface reflected light 40b emitted from the dielectric member 12 may be reflected on, for example, the wall surface of the SPFS system 10 and cause stray light. For this reason, as shown in FIG. 1, a light shielding member 52 is provided for absorbing the outgoing surface reflected light 40 b emitted from the incident surface 12 b of the dielectric member 12 or reflecting it in a direction that has no influence. Is preferred.
  • FIG. 12 is a schematic view schematically showing another example of the SPFS system which is an aspect of the optical analyte detection system of the present invention. Since the SPFS system 10 of this embodiment has basically the same configuration as that of the SPFS system 10 shown in FIG. 1, the same reference numerals are given to the same components and the detailed description thereof is omitted. .
  • the sensor chip 24 includes a reagent well 42 formed of a material that is transparent to the excitation light 40.
  • the reagent well 42 is a container for storing, for example, a sample liquid or a chemical liquid.
  • the sensor chip 24 is loaded into a sensor chip loading hole 44 provided in the reagent well 42.
  • the sensor chip 24 and the reagent are loaded by loading the sensor chip 24 into the sensor chip loading hole 44 so that the holding region 34 of the flow path lid member 22 and the holding portion 44a of the sensor chip loading hole 44 are in contact with each other.
  • the positional relationship with the well 42 can be kept constant.
  • the positional relationship between the sensor chip 24 and the light projecting unit 38 is fixed by loading the chip loading unit 26 so that the holding region 46 of the reagent well 42 and the chip holding unit 36 of the chip loading unit 26 are in contact with each other. Measurement error can be reduced.
  • the exit surface reflected light 40b is within the measurement scanning angle of the excitation light 40, and the flow path lid member 22 is used.
  • the shape of the dielectric member 12 such as the angles of ⁇ a and ⁇ b can be designed so that the exit surface reflected light 40 b does not enter the reagent well 42.
  • a cutout portion 42 a may be provided in a part of the reagent well 42 in the optical path cross section of the excitation light 40.
  • the present invention has been described above, but the present invention is not limited to this.
  • the SPFS system is taken as an example of one embodiment of the optical specimen detection system.
  • various modifications can be made without departing from the object of the present invention, such as being applicable to other aspects such as an SPR system.
  • the present invention performs specimen detection with high accuracy and speed in a field that requires high accuracy detection, such as a clinical test such as blood test using surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy (SPFS). be able to.
  • SPFS surface plasmon excitation enhanced fluorescence spectroscopy
  • SPFS system 11 SPFS apparatus 12 Dielectric member 12a Upper surface 12b Incident surface 12c Output surface 12d Bottom surface 14 Metal film 16 Reaction layer 18 Channel 20 Channel formation member 22 Channel lid member 22a Notch 24 Sensor chip 26 Chip loading part 28 Specimen inlet 30 Specimen outlet 32 Liquid reservoir 34 Holding area 36 Chip holding means 38 Projection unit 40 Excitation light 40a Metal film reflected light 40b Emission surface reflected light 40c Incident surface reflected light 42 Reagent well 42a Notch 44 Sensor chip loading Hole 44a Holding portion 46 Holding region 48 Fluorescence 50 Light receiving unit 52 Light shielding member 54 LD (Laser diode) 56 Collimating lens 58 Polarizing plate 60 Short pass filter 62 Aperture 64 APC optical system 66 APC photodiode 68 Beam splitter 100 SPFS system 101 SPFS device 102 Dielectric member 102a Upper surface 102b Incident surface 102c Output surface 104 Metal film 106 Reaction layer 108 Flow

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Abstract

[課題]流路蓋部材などの蓋部材に入射する迷光を除去し、受光ユニットの視野範囲に蛍光よりも光量の大きい励起光由来の光が存在しないようにして、高精度に検体を測定することができる光学式検体検出システムを提供する。 [解決手段]　誘電体部材と、誘電体部材の上面に隣接する金属膜と、金属膜の上面に隣接する反応層と、反応層の上面に配置される蓋部材とを備えたセンサーチップと、センサーチップを保持するためのチップ保持手段と、金属膜に誘電体部材を介して励起光を照射する投光ユニットとを備え、金属膜に誘電体部材を介して励起光を照射することで検体の検出を行う光学式検体検出システムであって、励起光の光路断面において、蓋部材の幅が、誘電体部材の幅よりも大きく、励起光が誘電体部材の出射面に反射した後、誘電体部材外に出射する出射面反射光が、励起光の測定走査角度内において、蓋部材に入射しないように構成する。

Description

光学式検体検出システム
　本発明は、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance）現象を応用した表面プラズモン共鳴装置や、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ：Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づいた表面プラズモン励起増強蛍光測定装置などを用いてセンサーチップ内に含まれる測定対象物質の検出を行う光学式検体検出システムに関する。
　従来、極微少な物質の検出を行う場合において、物質の物理的現象を応用することでこのような物質の検出を可能とした様々な検体検出装置が用いられている。
　このような検体検出装置の一つとして、ナノメートルレベルなどの微細領域中で電子と光が共鳴することにより、高い光出力を得る現象（表面プラズモン現象（ＳＰＲ：Surface Plasmon Resonance））を応用し、例えば、生体内の極微少なアナライトの検出を行うようにした表面プラズモン共鳴装置（以下、「ＳＰＲ装置」と言う）が挙げられる。
　また、表面プラズモン共鳴（ＳＰＲ）現象を応用した、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ：Surface Plasmon-field enhanced Fluorescence Spectroscopy）の原理に基づき、ＳＰＲ装置よりもさらに高精度にアナライト検出を行えるようにした表面プラズモン励起増強蛍光分光測定装置（以下、「ＳＰＦＳ装置」と言う）も、このような検体検出装置の一つである。
　この表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）は、光源より照射したレーザー光などの励起光が、金属膜表面で全反射減衰（ＡＴＲ：Attenuated Total Reflectance）する条件において、金属膜表面に表面プラズモン光（疎密波）を発生させることによって、光源より照射した励起光が有するフォトン量を数十倍～数百倍に増やして、表面プラズモン光の電場増強効果を得るようになっている。
　図１３は、従来のＳＰＦＳシステムの構成を説明するための概略構成図である。
　従来のＳＰＦＳシステム１００は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１０２と、この誘電体部材１０２の水平な上面１０２ａに形成された金属膜１０４と、金属膜１０４の上面に形成された反応層１０６と、反応層１０６を囲繞するように流路１０８を形成する流路形成部材１１０及び流路蓋部材１１２とからなるセンサーチップ１１４を備えており、このセンサーチップ１１４は、ＳＰＦＳ装置１０１のセンサーチップ装填部１１６に装填されている。
　センサーチップ１１４の反応層１０６は、蛍光物質で標識されたアナライトを捕捉するための固相膜を有しており、アナライトを含む検体液を流路１０８に送液することにより、アナライトを金属膜１０４上に固定することができる。
　また、センサーチップ１１４の上方には、金属膜１０４上に発生した表面プラズモン光（疎密波）により励起された蛍光物質により発光される蛍光１１８の強度を測定するため、ＳＰＦＳ装置１０１の受光ユニット１２０が配置されている。
　また、誘電体部材１０２の下方の一方の側面（入射面１０２ｂ）側には、図１３に示すように、ＳＰＦＳ装置１０１の光源１２２が配置されており、この光源１２２から照射される励起光１２４が、誘電体部材１０２の外側下方から、誘電体部材１０２の入射面１０２ｂに入射し、誘電体部材１０２を介して、誘電体部材１０２の上面１０２ａに形成された金属膜１０４に照射される。
　このように構成された従来のＳＰＦＳシステム１００では、光源１２２から金属膜１０４に向かって励起光１２４を照射することにより、金属膜１０４表面に表面プラズモン光（疎密波）が発生し、この表面プラズモン光（疎密波）によって、アナライトを標識する蛍光物質が励起され、蛍光１１８が発光する。この蛍光１１８を受光ユニット１２０によって検出し、蛍光１１８の光量に基づき、アナライトの量を算出している。
　このようなＳＰＦＳ測定では、蛍光１１８の光量は、励起光量に対して１０桁程度低いため、受光ユニット１２０に励起光１２４が僅かでも入射するとＳ／Ｎが悪化し、検出精度が劣化してしまうため、迷光を低減することが重要となる。
　励起光１２４は、図１３に示すように、誘電体部材１０２の入射面１０２ｂから入射した後、金属膜１０４で反射し、誘電体部材１０２の出射面１０２ｃから出射するようになっている。
　しかしながら、図１３に示すように、誘電体部材１０２の出射面１０２ｃにおいて、励起光１２４の一部が反射し、誘電体部材１０２の入射面１０２ｂから出射する出射面反射光１２４ｂが存在する。
　この出射面反射光１２４ｂが、図１３に示すように、流路蓋部材１１２に入射すると、流路蓋部材１１２内を導光する光となり、受光ユニット１２０の視野範囲に出射面反射光１２４ｂが存在すると、流路蓋部材１１２内の自家蛍光を検出してしまい、Ｓ／Ｎの悪化に繋がる。
　なお、出射面反射光１２４ｂは、通常、励起光１２４の４％程度の光量があり、蛍光１１８に対して十分大きな光量であるため、除去すべき迷光と言える。
　このような迷光を除去するために、特許文献１では、図１４に示すように、金属膜１０４で反射した金属膜反射光を吸収する光吸収部１２６を誘電体部材１０２の光路中に設けている。
　また、特許文献２では、図１５に示すように、センサーチップ１１４内部の散乱光や反射光を除去するための励起光カットフィルタ（波長フィルタ）１２８をセンサーチップ１１４の上面に設けることで励起光１２４をカットしている。
特開２０１４－１６７４７９号公報 特開２０１２－２０２９１１号公報
　しかしながら、特許文献１のような構成では、光吸収部１２６において金属膜反射光が１００％吸収されるわけではなく、光吸収部１２６において微小な反射光が存在してしまい、このような反射光の迷光を完全に除去することは出来なかった。
　また、図１３に示すような構成では、誘電体部材外に出射した出射面反射光などをカットすることはできず、やはり迷光が発生してしまっていた。
　さらに、特許文献１のように、流路蓋部材１１２の幅が、誘電体部材１０２の幅よりも大きい場合には、上述したように、発生した迷光が流路蓋部材１１２に入射することで、測定精度に大きな影響を及ぼしていた。
　本発明では、このような現状に鑑み、流路蓋部材などの蓋部材に入射する迷光を除去し、受光ユニットの視野範囲に蛍光よりも光量の大きい励起光由来の光が存在しないようにして、高精度に検体を測定することができる光学式検体検出システムを提供することを目的とする。
　本発明は、前述したような従来技術における課題を解決するために発明されたものであって、上述した目的のうち少なくとも一つを実現するために、本発明の一側面を反映した光学式検体検出システムは、誘電体部材と、
　前記誘電体部材の上面に隣接する金属膜と、
　前記金属膜の上面に隣接する反応層と、
　前記反応層の上面に配置される蓋部材と、を備えたセンサーチップと、
　前記センサーチップを保持するためのチップ保持手段と、
　前記金属膜に前記誘電体部材を介して励起光を照射する投光ユニットと、を備え、前記金属膜に前記誘電体部材を介して前記励起光を照射することで検体の検出を行う光学式検体検出システムであって、
　前記励起光の光路断面において、前記蓋部材の幅が、前記誘電体部材の幅よりも大きく、
　前記励起光が前記誘電体部材の出射面に反射した後、前記誘電体部材外に出射する出射面反射光が、前記励起光の測定走査角度内において、前記蓋部材に入射しないように構成される。
　本発明によれば、蛍光に比べて光量の大きい励起光に由来する出射面反射光が蓋部材に入射しないように設計されているため、蓋部材内に出射面反射光が導光されず、大幅にＳ／Ｎを向上させることができ、高精度に検体を測定することができる。
図１は、本発明の光学式検体検出システムの一態様であるＳＰＦＳシステムの概略を模式的に示す概略図である。 図２は、図１のＳＰＦＳシステムの一部を底面側から見た概略底面図である。 図３は、センサーチップの一例を示す概略断面図である。 図４は、センサーチップの別の一例を示す概略断面図である。 図５は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける投光ユニットの光学構成の一例を示す模式図である。 図６は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける測定の流れを説明するフローチャートである。 図７は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける誘電体部材の形状の一例を示す模式図である。 図８は、励起光の入射角度と、出射面反射光の出射角度との関係を示すグラフである。 図９は、励起光の測定走査角度を６０°から７２°とした場合における励起光の入射角度と、出射面反射光の入射面における出射角度及び入射面反射光の反射角度との関係を示すグラフである。 図１０は、励起光の測定走査角度を６１°から７３°とした場合における励起光の入射角度と、出射面反射光の入射面における出射角度及び入射面反射光の反射角度との関係を示すグラフである。 図１１は、センサーチップのさらに別の一例を示す概略底面図である。 図１２は、本発明の光学式検体検出システムの一態様であるＳＰＦＳシステムの別の一例を模式的に示す概略図である。 図１３は、従来のＳＰＦＳシステムの構成を説明するための概略図である。 図１４は、特許文献１に開示されたセンサーチップの構成を説明するための概略図である。 図１５は、特許文献２に開示されたＳＰＦＳシステムの構成を説明するための概略図である。
　以下、本発明の実施の形態（実施例）を図面に基づいて、より詳細に説明する。
　図１は、本発明の光学式検体検出システムの一態様であるＳＰＦＳシステムの概略を模式的に示す概略図、図２は、図１のＳＰＦＳシステムの一部を底面側から見た概略図である。
　なお、本明細書では、図１の状態において、「上」、「下」の方向を規定する。
　この実施例のＳＰＦＳシステム１０は、鉛直断面形状が略台形であるプリズム形状の誘電体部材１２と、この誘電体部材１２の水平な上面１２ａに形成された金属膜１４と、金属膜１４の上面に形成された反応層１６と、反応層１６を囲繞するように流路１８を形成する流路形成部材２０及び流路蓋部材２２とからなるセンサーチップ２４を備えており、このセンサーチップ２４は、ＳＰＦＳ装置１１のチップ装填部２６に装填されている。
　センサーチップ２４の反応層１６は、蛍光物質で標識されたアナライトを細くするための固相膜を有しており、アナライトを含む検体液を流路１８に送液することにより、アナライトを金属膜１４上に固定することができる。
　固相膜は、アナライトを捕捉するためのリガンドが固定化されたものであって、例えば、ＳＡＭ（Self-Assembled Monolayer：自己組織化単分子膜）及びＳＡＭ上に形成された固相化層によって構成することができる。
　なお、固相化層としては、例えば、グルコース，カルボキシメチル化グルコース，ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも１種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類，アクリル酸エステル類，メタクリル酸エステル類，オレフィン類，スチレン類，クロトン酸エステル類，イタコン酸ジエステル類，マレイン酸ジエステル類，フマル酸ジエステル類，アリル化合物類，ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン（ＣＭＤ）などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
　また、誘電体部材１２としては、少なくとも励起光４０に対して光学的に透明な材料であれば、特に限定されるものではないが、安価で取り扱い性に優れるセンサーチップとする上で、射出成型による樹脂材料から形成されている。
　誘電体部材１２を形成する樹脂材料としては、例えば、ポリエチレンテレフタレート（ＰＥＴ）、ポリエチレンナフタレートなどのポリエステル類、ポリエチレン（ＰＥ）、ポリプロピレン（ＰＰ）などのポリオレフィン類、環状オレフィンコポリマー（ＣＯＣ）、環状オレフィンポリマー（ＣＯＰ）などのポリ環状オレフィン類、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデンなどのビニル系樹脂、ポリスチレン、ポリエーテルエーテルケトン（ＰＥＥＫ）、ポリサルホン（ＰＳＦ）、ポリエーテルサルホン（ＰＥＳ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、ポリアミド、ポリイミド、アクリル樹脂、トリアセチルセルロース（ＴＡＣ）などを用いることができる。
　また、金属膜１４としては、特に限定されるものではないが、好ましくは、金、銀、アルミニウム、銅、および白金からなる群から選ばれる少なくとも１種の金属からなり、より好ましくは、金からなり、さらに、これら金属の合金から構成してもよい。
　すなわち、このような金属は、酸化に対して安定であり、かつ、後述するような表面プラズモン光（疎密波）による電場増強効果が大きくなるため、金属膜１４として好適である。
　また、金属膜１４の形成方法としては、特に限定されるものではなく、例えば、スパッタリング法、蒸着法（抵抗加熱蒸着法、電子線蒸着法など）、電解メッキ法、無電解メッキ法などが挙げられる。好ましくは、スパッタリング法、蒸着法を使用するのが、薄膜形成条件の調整が容易である点で望ましい。
　さらに、金属膜１４の厚さとしては、特に限定されるものではないが、好ましくは、５ｎｍ～５００ｎｍの範囲内であることが望ましい。なお、電場増強効果の観点からは、より好ましくは、金：２０ｎｍ～７０ｎｍ、銀：２０ｎｍ～７０ｎｍ、アルミニウム：１０～５０ｎｍ、銅：２０～７０ｎｍ、白金：２０～７０ｎｍ、および、これらの合金：１０～７０ｎｍの範囲内であることが望ましい。
　金属膜１４の厚さが上記範囲内であれば、表面プラズモン光（疎密波）が発生しやすく好適である。また、このような厚さを有する金属膜１４であれば、形状は、特に限定されない。
　また、流路形成部材２０としては、例えば、所定幅、所定長さの流路溝が打ち抜かれたアクリル系粘着シートなどを用いることができる。このようなアクリル系粘着シートの厚さとしては、特に限定されるものではないが、０．１ｍｍ程度であることが好ましい。
　また、流路蓋部材２２としては、励起光４０や蛍光４８に対して透光性を有する素材であれば、特に限定されるものではないが、上述する誘電体部材１２と同様な樹脂材料を用いることができる。
　なお、流路蓋部材２２には、アナライトを含む検体液を流路１８の送液するための検体流入口２８及び検体排出口３０を備えている。この検体流入口２８と検体排出口３０とを、例えば、ポンプなどの循環送液手段によって接続することで、検体液を一方向に循環送液することができる。
　また、図３に示すように、検体排出口３０に液溜部３２を設け、例えば、ピペットなどを用いて検体液を検体流入口２８に注入するとともに、ピペットによって検体液の吸引・注入を繰り返すことで、ピペット、流路１８、液溜部３２において、検体液を往復移動させることができ、固相膜に固定化されたリガンドに、迅速かつ効率良く検体液中のアナライトが捕捉されることになる。特に、固相膜に対して検体液を往復移動させることによって、少量の検体液であっても、アナライトと固相膜との反応効率が高くなり、アナライトの検出精度を向上させることができる。
　なお、本実施例では、流路１８に反応層１６を設け、検体液を流路１８に送液する構成で説明しているが、例えば、図４に示すように、ウェル部１９に反応層１６を設け、検体液をこのウェル部１９に滞留させるようにしてもよい。この場合、蓋部材としては、流路蓋部材２２の代わりに、ウェル蓋部材２３が用いられる。
　また、本実施例では、励起光４０の光路断面において、流路蓋部材２２の幅が、誘電体部材１２の幅よりも大きく設計されている。このように構成することによって、流路蓋部材２２に保持領域３４を設けることができ、センサーチップ２４は、この保持領域３４とチップ装填部２６のチップ保持手段３６とが接触するように、チップ装填部２６に装填することができる。
　このように装填することにより、センサーチップ２４の交換を行った場合にも、センサーチップ２４と後述する投光ユニットとの位置関係を一定に保つことができ、測定誤差を少なくすることができる。
　なお、本明細書において「光路断面」とは、投光ユニット３８から金属膜１４に向かって励起光４０を照射した場合に、励起光４０の光路（後述する金属膜反射光４０ａ、出射面反射光４０ｃの光路を含む）を含む面と一致する断面を意味している。
　センサーチップ２４の下方の一方の側面側には、図１に示すように、励起光４０を照射するＳＰＦＳ装置１１の投光ユニット３８が設けられている。
　投光ユニット３８は、例えば、ＬＤ（Laser Diode：レーザーダイオード）やＬＥＤ（Light Emitting Diode：発光ダイオード）、ＨＩＤ（High Intensity Discharge）ランプ（高輝度放電ランプ）などからなる光源と、光源から照射された光を平行光束とするコリメートレンズなどを含んで構成される。
　図５は、本実施例のＳＰＦＳシステム１０における投光ユニット３８の光学構成の一例を示す模式図である。
　図５に示すように、投光ユニット３８の光学系は、光源であるＬＤ（レーザーダイオード）５４と、ＬＤ５４から出射した光をコリメートするためのコリメートレンズ５６と、センサーチップ２４の金属膜１４へ照射する励起光４０をＰ偏光とするための偏光板５８と、ＬＤ５４の散乱光や迷光が受光ユニット５０により検出されないように一部の波長の光をカットするためのショートパスフィルター６０と、金属膜１４への照射スポットサイズを規制するためのアパーチャー６２とを備えている。
　このような投光ユニット３８から出射する励起光４０は略平行光となっている。なお、ＬＤ５４の出射波長は、少なくとも金属膜１４上で表面プラズモンを発生させる波長を含んでいる。
　ここで、ＬＤ５４に定電流を流していたとしても、測定環境温度等によりＬＤ５４の出射光量が変化するため、被検体の量に相関する光量として絶対光量を計測する必要がある光学式検体検出システムにおいては、正確な測定ができなくなる。
　このため、本実施例のＳＰＦＳシステム１０では、投光ユニット３８の出射光量を一定に保つためにＡＰＣ（Auto Power Control）用光学系６４が投光ユニット３８内に設けられている。具体的には、ＡＰＣ用フォトダイオード６６と、アパーチャー６２から出射した励起光４０の一部をＡＰＣ用フォトダイオード６６へ反射させ、残りの光を金属膜１４へ出射させるビームスプリッタ６８とを備えてなる光学系である。
　ビームスプリッタ６８で反射した光の光量をＡＰＣ用フォトダイオード６６で検出し、検出した光量に応じて、ＬＤ５４の投入電流値にフィードバックをかけて、ＡＰＣ用フォトダイオード６６の検出光量が一定となるよう、すなわち、投光ユニット３８の出射光量が一定となるように図示しない制御部により制御している。
　さらに、ビームスプリッタ６８は、例えば、屈折率１．６以上の高屈折率材料で形成することが望ましく、また、ビームスプリッタ６８への励起光４０の入射角度は小さい方が望ましく、例えば、４０°以下であることが望ましい。
　このように構成することにより、投光ユニット３８内のＬＤ５４やコリメートレンズ５６などの光学素子が、環境変化や経時変化によって偏芯することで、ビームスプリッタ６８への励起光４０の入射角度が変化したとしても、ビームスプリッタ６８の反射／透過の分岐比率の変動量を小さく抑えられるため、投光ユニット３８の出射光量を安定させることができる。
　この投光ユニット３８は、励起光４０の金属膜１４への入射角度を、所定の測定走査角度の範囲で変更可能なように、照射角度可変機構（図示せず）を備えている。
　ここで、測定走査角度とは、投光ユニット３８から励起光４０を出射し、受光ユニット５０で蛍光４８またはプラズモン散乱光などの散乱光、もしくは蛍光４８と散乱光の両方を計測している間に、投光ユニット３８を走査し出射する励起光４０の出射角度（角度のゼロ基準は、金属膜１４平面の垂線）を言う。
　ここで、プラズモン散乱光とは、金属膜１４上で発生する表面プラズモン自体が散乱する光であり、その波長は励起光４０の波長に等しい。なお、励起光４０の出射角度を走査した場合に、プラズモン散乱光の光量が最大となる角度が増強角度であり、この増強角度の近傍の角度において、表面プラズモンによる強い蛍光強度が得られる。
　増強角度は、センサーチップ２４における誘電体部材１２の形状や屈折率、金属膜１４の材料や膜厚、流路１８内の流体屈折率などに依存するため、センサーチップ２４の製造時の誤差を考慮すると、測定ごとに最適な増強角度を求めることが望ましい。
　投光ユニット３８から、誘電体部材１２の入射面１２ｂに向けて励起光４０が照射され、誘電体部材１２の上面に隣接する金属膜１４に入射する。これにより、金属膜１４上に発生した表面プラズモン光（疎密波）により励起された蛍光物質により発光される蛍光４８を、センサーチップ２４の上方に設けられた受光ユニット５０により検出する。
　受光ユニット５０の光学系としては、例えば、表面プラズモンにより発生した散乱光（プラズモン散乱光）や蛍光４８を受光するための受光素子であるフォトダイオードと、フォトダイオードへ集光するためのレンズと、励起光４０の波長の光をカットするための励起光カットフィルタとを備えてなる。
　励起光カットフィルタは、蛍光４８を測定する場合には、受光ユニット５０内の光路上に設置してあり、プラズモン散乱光を測定する場合には、例えば、励起光カットフィルタ駆動機構を用いて、受光ユニット５０内の光路上から少なくとも一部分を待避して、プラズモン散乱光がフォトダイオードへ入射できるように構成されている。
　励起光カットフィルタは、例えば、誘電体多層膜からなるバンドパスフィルタであり、受光ユニット５０内における光路のうち、蛍光４８が略平行光束となる位置に設置されている。
　また、受光素子としては、例えば、光電子倍増管やアバランシェ・フォトダイオード（ＡＰＤ）など受光光量を測定できるものであればフォトダイオードに限らない。
　一方で、励起光４０のうち、金属膜１４において反射した光（金属膜反射光４０ａ）は、誘電体部材１２の出射面１２ｃより出射する。
　また、図１に示すように、金属膜反射光４０ａの一部は、出射面１２ｃにおいて反射し、この出射面反射光４０ｂは、励起光４０の金属膜１４への入射角度にもよるが、入射面１２ｂに向けて直進し、入射面１２ｂより誘電体部材１２外へ出射する。
　本実施例のＳＰＦＳシステム１０では、この出射面反射光４０ｂが、測定走査角度内において、流路蓋部材２２に入射しないように構成されている。
　具体的には、以下のように構成することによって、出射面反射光４０ｂが、測定走査角度内において、流路蓋部材２２に入射しないようにできる。
　以下に、本実施例のＳＰＦＳシステム１０における測定の流れの一例を示す。
　図６は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける測定の流れを説明するフローチャートである。
　（Ｓ１０１）センサーチップ２４が準備され、ＳＰＦＳシステム１０のチップ装填部２６に取り付けられる。センサーチップ２４は、生化学検査の１検体ごとに交換され使い捨てされる。検体は一般的には血液などが使用される。
　（Ｓ１０２）次に、センサーチップ２４の流路１８内の洗浄を行う。センサーチップ２４の流路１８内には、固相膜においてアナライトを捕捉する感度を保つために保湿剤が塗布されている。流路１８内に洗浄液を導入することで、この保湿剤を洗浄する。また、洗浄により、固相膜周辺の汚染物も除去される。
　（Ｓ１０３）次に、アナライトが混在している検体液を流路１８内に導入し、抗原抗体反応（１次反応）によって、流路１８中の固相膜にアナライトが捕捉される。捕捉後、余剰な検体液は流路１８内から吸引することで除去される。また、必要に応じて適当な洗浄液で流路１８内の残留物を除去する。
　（Ｓ１０４）次に、増強角測定を行う。増強角測定では、投光ユニット３８から出射する励起光４０の出射角度を走査し、受光ユニット５０によってプラズモン散乱光を検出し、増強角度を求める。このとき、受光ユニット５０における光路から、後述する蛍光測定で用いる励起光カットフィルタは待避させておく。これにより、励起光４０と同じ波長であるプラズモン散乱光が受光ユニット５０内の受光素子まで到達でき、受光ユニット５０でプラズモン散乱光の光量を測定することが可能となる。
　（Ｓ１０５）次に、受光ユニット５０における光路内に励起光カットフィルタを配置させ、投光ユニット３８から励起光４０を照射し、受光ユニット５０で検出した光量を計測し、この光量を光学ブランク値（ｏＢ）として記録する。このとき、励起光４０の出射角度は、増強角測定で求めた増強角度となるように、投光ユニット３８の角度を設定する。
　（Ｓ１０６）次に、流路１８内に蛍光標識液を導入し、蛍光標識液に含まれる蛍光標識抗体をアナライトに接触、結合させて蛍光標識化反応（２次反応）を行う。これにより、蛍光標識がアナライトに付加される。その後、余剰な蛍光標識抗体を除去するために流路１８内を洗浄する。
　（Ｓ１０７）次に、励起光４０の出射角度を増強角度となるように投光ユニット３８の角度を設定し、受光ユニット５０内における光路上に励起光カットフィルタを配置した状態で、励起光４０を照射し、受光ユニット５０で検出した蛍光シグナル値（Ｓ）を計測する。
　さらに、蛍光シグナル値（Ｓ）から、光学ブランク値測定Ｓ１０５で得られた光学ブランク値（ｏＢ）を引いた値を算出する。これにより、アナライトの量に相関する蛍光強度（ΔＳ）が求まる。
　（Ｓ１０８）最後に、センサーチップ２４をＳＰＦＳシステム１０から取り外し、測定が終了する。
　以上の過程において、センサーチップ２４や励起光カットフィルタなどの移動や、流路１８内への検体液の導入や吸引、洗浄などの作業は、測定者が手動で行ってもよいし、ＳＰＦＳシステム１０内において自動で行う駆動機構や制御機構を有してもよい。また、測定結果を記録する記録手段や結果を出力する出力手段をＳＰＦＳシステム１０に設けてもよい。
　図７は、本実施例のＳＰＦＳシステムにおける誘電体部材の形状の一例を示す模式図である。
　図１に示す実施例では、誘電体部材１２において、入射面１２ｂと出射面１２ｃがそれぞれ平滑面であり、誘電体部材１２の金属膜１４に隣接する上面１２ａと、入射面１２ｂとがなす角度θaと、誘電体部材１２の金属膜１４に隣接する上面１２ａと、出射面１２ｃとがなす角度θbとが同じ角度になっているが、図７に示す実施例では、θaとθbとが異なる角度となっている。
　図７（ａ）の例では、θaがθbよりも小さい角度となっている。この場合、金属膜反射光４０ａは、出射面１２ｃで反射した後、上面１２ａで反射し、入射面１２ｂから出射する。このように、上面１２ａで反射した出射面反射光４０ｂは、流路蓋部材２２側に向かうことはないため、測定走査角度内において、出射面反射光４０ｂを流路蓋部材２２に入射しないようにできる。
　図７（ｂ）の例では、θaがθbよりも大きい角度であり鈍角となっている。この場合、金属膜反射光４０ａは、出射面１２ｃで反射した後、底面１２ｄから出射する。このように、誘電体部材１２の底面１２ｄから出射面反射光４０ｂを出射させることにより、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射しないようにすることができる。
　なお、図７（ｃ）に示すように、出射面１２ｃを複数の面で構成していてもよく、この場合も、θaがθbよりも大きい角度となっていれば、図７（ｂ）と同様に、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射しないようにすることができる。
　このように、θaをθbよりも大きい角度にすることによって、図６に示すように、入射面１２ｂに向かう出射面反射光４０ｂは、底面１２ｄ寄りとなるため、センサーチップ２４を構成しやすくなる。
　なお、図８（ａ）は、θa＝８０°，θb＝８２°の場合、図８（ｂ）は、θa＝８０°，θb＝８０°の場合、図８（ｃ）は、θa＝８０°，θb＝７８°の場合の励起光４０の入射角度と出射面反射光４０ｂの入射面１２ｂにおける出射角度θcとの関係を示している。
　なお、出射面反射光４０ｂの底面１２ｄへの入射角によっては、一部の光が入射面１２ｂに向かい、流路蓋部材２２に入射してしまうことがある。このため、誘電体部材１２の底面１２ｄを散乱面や非平面とすることで底面１２ｄから入射面１２ｂに出射面反射光４０ｂが向かわないようにすることが好ましい。
　また、励起光４０の測定走査角度内の少なくとも一部の角度において、下記式（１）を満たすように誘電体部材１２を形成することで、入射面１２ｂにおいて出射面反射光４０ｂが水平よりも底面側に出射することになり、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射しないようにすることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-M000002
 　但し、ｎ1は誘電体部材１２の屈折率、ｎ0は誘電体部材１２の入射面１２ｂにおける励起光入射側の屈折率、θは励起光４０の金属膜１４への入射角度である。
　なお、誘電体部材１２の入射面１２ｂにおいては、励起光４０の入射時に、励起光４０の一部が入射面１２ｂに反射してしまう。このような入射面反射光４０ｃが、流路蓋部材２２に入射してしまうと、上述するような出射面反射光４０ｂと同様な問題が生じるため、入射面反射光４０ｃが流路蓋部材２２に入射しないようした方がよい。
　また、励起光４０の測定走査角度内において、入射面１２ｂにおける出射面反射光４０ｂの出射角度θcと、入射面１２ｂにおける入射面反射光４０ｃの反射角度θdとが一致するように構成することが好ましい。
　このように構成することによって、図９，１０に示すように、励起光４０の測定走査角度内において、出射面反射光４０ｂの出射角度θcの範囲と、入射面反射光４０ｃの反射角度θdの範囲とが重複するため、出射面反射光４０ｂ及び入射面反射光４０ｃが通過する光の存在範囲が狭くなり、センサーチップ２４を、出射面反射光４０ｂ及び入射面反射光４０ｃが流路蓋部材２２に入射しないように構成しやすくなる。
　なお、図９は、励起光４０の測定走査角度を６０°から７２°とし、図９（ａ）は、θa＝８０°，θb＝８２°の場合、図９（ｂ）は、θa＝８０°，θb＝８０°の場合、図９（ｃ）は、θa＝８０°，θb＝７８°の場合の励起光４０の入射角度と、出射面反射光４０ｂの入射面における出射角度θc及び入射面反射光４０ｃの反射角度θdとの関係を示している。
　また、図１０は、励起光４０の測定走査角度を６１°から７３°とし、図１０（ａ）は、θa＝８０°，θb＝８２°の場合、図１０（ｂ）は、θa＝８０°，θb＝８０°の場合、図１０（ｃ）は、θa＝８０°，θb＝７８°の場合の励起光４０の入射角度と、出射面反射光４０ｂの入射面における出射角度θc及び入射面反射光４０ｃの反射角度θdとの関係を示している。
　また、図１１に示すように、励起光４０の光路断面において、流路蓋部材２２の一部に切欠部２２ａを設けることもできる。
　このように切欠部２２ａを設けることによって、流路蓋部材２２に保持領域３４を設けることができるとともに、出射面反射光４０ｂが流路蓋部材２２に入射することがない。
　なお、誘電体部材１２から出射した出射面反射光４０ｂは、例えば、ＳＰＦＳシステム１０の壁面などに反射して、これが迷光の原因となってしまうことがある。このため、図１に示すように、誘電体部材１２の入射面１２ｂから出射した出射面反射光４０ｂを吸光したり、もしくは、影響のない方向へ反射させたりするための遮光部材５２を設けることが好ましい。
　図１２は、本発明の光学式検体検出システムの一態様であるＳＰＦＳシステムの別の一例を模式的に示す概略図である。
　この実施例のＳＰＦＳシステム１０は、基本的には、図１に示すＳＰＦＳシステム１０と同様な構成であるため、同一の構成部材には同一の符号を付して、その詳細な説明を省略する。
　本実施例では、センサーチップ２４が、励起光４０に対して透光性を有する素材により形成された試薬ウェル４２を備えている。
　試薬ウェル４２は、例えば、検体液や薬液などが収容される容器である。センサーチップ２４は、試薬ウェル４２に設けられたセンサーチップ装填孔４４に装填される。
　この時、流路蓋部材２２の保持領域３４と、センサーチップ装填孔４４の保持部４４ａとが接触するように、センサーチップ２４をセンサーチップ装填孔４４に装填することによって、センサーチップ２４と試薬ウェル４２との位置関係を一定に保つことができる。
　さらに、試薬ウェル４２の保持領域４６とチップ装填部２６のチップ保持手段３６とが接触するように、チップ装填部２６に装填することによって、センサーチップ２４と投光ユニット３８との位置関係を一定に保つことができ、測定誤差を少なくすることができる。
　このように励起光４０に対して透光性を有する素材により形成された試薬ウェル４２を備える場合には、出射面反射光４０ｂが、励起光４０の測定走査角度内において、流路蓋部材２２のみならず、試薬ウェル４２にも入射しないように構成することが好ましい。
　具体的には、上述するように、θa及びθbの角度など誘電体部材１２の形状を、出射面反射光４０ｂが試薬ウェル４２に入射しないように設計することで対応可能である。
　また、図１２に示すように、励起光４０の光路断面において、試薬ウェル４２の一部に切欠部４２ａを設けることもできる。
　このように切欠部４２ａを設けることによって、試薬ウェル４２に保持領域４６を設けることができるとともに、出射面反射光４０ｂが試薬ウェル４２に入射することがない。
　以上、本発明の好ましい実施の態様を説明してきたが、本発明はこれに限定されることはなく、例えば、上記実施例では、光学式検体検出システムの一態様としてＳＰＦＳシステムを例に挙げて説明したが、他の態様として例えば、ＳＰＲシステムなどにも適用可能であるなど、本発明の目的を逸脱しない範囲で種々の変更が可能である。
　本発明は、例えば、表面プラズモン励起増強蛍光分光法（ＳＰＦＳ）を用いた、血液検査などの臨床試験のような、高精度の検出が要求される分野において、検体検出を高精度かつ迅速に行うことができる。
１０　　　ＳＰＦＳシステム
１１　　　ＳＰＦＳ装置
１２　　　誘電体部材
１２ａ　　上面
１２ｂ　　入射面
１２ｃ　　出射面
１２ｄ　　底面
１４　　　金属膜
１６　　　反応層
１８　　　流路
２０　　　流路形成部材
２２　　　流路蓋部材
２２ａ　　切欠部
２４　　　センサーチップ
２６　　　チップ装填部
２８　　　検体流入口
３０　　　検体排出口
３２　　　液溜部
３４　　　保持領域
３６　　　チップ保持手段
３８　　　投光ユニット
４０　　　励起光
４０ａ　　金属膜反射光
４０ｂ　　出射面反射光
４０ｃ　　入射面反射光
４２　　　試薬ウェル
４２ａ　　切欠部
４４　　　センサーチップ装填孔
４４ａ　　保持部
４６　　　保持領域
４８　　　蛍光
５０　　　受光ユニット
５２　　　遮光部材
５４　　　ＬＤ（レーザーダイオード）
５６　　　コリメートレンズ
５８　　　偏光板
６０　　　ショートパスフィルター
６２　　　アパーチャー
６４　　　ＡＰＣ用光学系
６６　　　ＡＰＣ用フォトダイオード
６８　　　ビームスプリッタ
１００　　ＳＰＦＳシステム
１０１　　ＳＰＦＳ装置
１０２　　誘電体部材
１０２ａ　上面
１０２ｂ　入射面
１０２ｃ　出射面
１０４　　金属膜
１０６　　反応層
１０８　　流路
１１０　　流路形成部材
１１２　　流路蓋部材
１１４　　センサーチップ
１１６　　センサーチップ装填部
１１８　　蛍光
１２０　　受光ユニット
１２２　　光源
１２４　　励起光
１２４ｂ　出射面反射光
１２６　　光吸収部
１２８　　励起光カットフィルタ

Claims (16)

  1. 　誘電体部材と、
    　前記誘電体部材の上面に隣接する金属膜と、
    　前記金属膜の上面に隣接する反応層と、
    　前記反応層の上面に配置される蓋部材と、を備えたセンサーチップと、
    　前記センサーチップを保持するためのチップ保持手段を有するチップ装填部と、
    　前記金属膜に前記誘電体部材を介して励起光を照射する投光ユニットと、を備え、前記金属膜に前記誘電体部材を介して前記励起光を照射することで検体の検出を行う光学式検体検出システムであって、
    　前記励起光の光路断面において、前記蓋部材の幅が、前記誘電体部材の幅よりも大きく、
    　前記励起光が前記誘電体部材の出射面に反射した後、前記誘電体部材外に出射する出射面反射光が、前記励起光の測定走査角度内において、前記蓋部材に入射しないように構成されている光学式検体検出システム。
  2. 　前記誘電体部材の入射面と出射面が、それぞれ平滑面であり、
    　前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θaと、
    　前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θbと、が異なる請求項１に記載の光学式検体検出システム。
  3. 　前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θbが、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θaよりも大きい請求項２に記載の光学式検体検出システム。
  4. 　前記誘電体部材の入射面と出射面が、それぞれ平滑面であり、
    　前記励起光の測定走査角度内の少なくとも一部の角度において、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記入射面とがなす角度θa、前記誘電体部材の前記金属膜に隣接する面と前記出射面とがなす角度θb、前記誘電体部材の屈折率ｎ1が、下記式を満たす請求項１から３のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
    Figure JPOXMLDOC01-appb-M000001
     　ここで、θは前記励起光の前記金属膜への入射角度、ｎ0は前記誘電体部材の前記入射面における励起光入射側の屈折率である。
  5. 　前記励起光の測定走査角度内において、前記入射面における前記出射面反射光の出射角度と、前記入射面における前記励起光の反射角度とが一致する請求項１から４のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  6. 　前記出射面反射光が、前記出射面から前記入射面に向けて直進し、前記誘電体部材外へ出射するように構成されている請求項１から５のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  7. 　前記蓋部材の保持領域と、前記チップ保持手段とが接することで、前記センサーチップと前記投光ユニットとの位置決めがなされる請求項１から６のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  8. 　前記センサーチップが、試薬ウェルをさらに備える請求項１から７のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  9. 　前記試薬ウェルが、前記励起光に対して透光性を有する素材により形成されており、
    　前記出射面反射光が、前記励起光の測定走査角度内において、前記試薬ウェルに入射しないように構成されている請求項８に記載の光学式検体検出システム。
  10. 　前記試薬ウェルの保持領域と、前記チップ保持手段とが接することで、前記センサーチップと前記投光ユニットとの位置決めがなされる請求項８または９に記載の光学式検体検出システム。
  11. 　前記励起光の光路断面において、前記試薬ウェルの一部に切欠部を有する請求項８から１０のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  12. 　前記励起光の光路断面において、前記蓋部材の一部に切欠部を有する請求項１から１１のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  13. 　前記誘電体部材の底面が散乱面である請求項１から１２のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  14. 　前記誘電体部材の底面が非平面である請求項１から１３のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  15. 　前記出射面反射光の光量が、前記励起光の光量の２％よりも大きい請求項１から１４のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
  16. 　前記光学式検体検出システムが、遮光部材をさらに備え、
    　前記入射面から出射した前記出射面反射光が、前記遮光部材に照射されるように構成されている請求項１から１５のいずれかに記載の光学式検体検出システム。
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