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Die
vorliegende Erfindung betrifft ein verbessertes Modulationskontrastmikroskop
für die Lichtmikroskopie sowie eine verbesserte Beleuchtungsanordnung
für ein derartiges Mikroskop.
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Bei
der Untersuchung mikroskopischer Proben ist stets der höchstmögliche
Detailreichtum erwünscht. Praktisch ist dieser vor allem
bei einem hohen Kontrast des beobachteten Bildes erreichbar. Insbesondere
bei der Verwendung von Bildsensoren ist ein hoher Kontrast vorteilhaft,
um den gesamten Dynamikbereich eines Bildsensors auszunutzen und so
bestmögliche Abbildungsergebnisse zu erreichen. Aber auch
beim klassischen Mikroskopieren mit Hilfe des Okulars ist ein hoher
Kontrast von großem Interesse.
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Ein
großer Anteil der gewöhnlich mit lichtmikroskopischen
Techniken untersuchten Proben, insbesondere Zeltproben wie beispielsweise
Eizellen, weist oft einen sehr geringen Kontrast auf, d. h. die für
die im Durchlicht entstehende Abbildung solcher Proben relevanten
lokalen Absorptionsunterschiede, die zu einer Amplitudenmodulation
des Lichts führen, sind gering. Andererseits weisen solche
Proben normalerweise lokale Brechzahlunterschiede auf, die zwar
zu einer Phasenmodulation des Lichts führen, welche aber
ohne spezielle Kontrastverfahren weder durch den Beobachter am Okular
noch mit Hilfe von Bildsensoren im Abbild erfaßt werden
können, da dort nur Amplitudenmodulation erfaßbar
ist.
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Der
Kontrast bzw. die Amplitudenmodulation in der Abbildung des Mikroskops
einer solchen Probe kann verbessert werden, indem das zu untersuchende
Objekt geeignet angefärbt wird, die Ausleuchtung optimiert
wird oder, bei Verwendung einer Kamera, durch analoge oder digitale
Verstärkung des Kontrasts. Oft ist es jedoch vorteilhaft,
die Phasenmodulation des Objektes, die für den Beobachter
nicht sichtbar ist, zu einer Kontrastverbesserung einzusetzen. Mittels
geeigneter Hilfsmittel kann die Phasenmodulation teilweise in eine
Amplitudenmodulation gewandelt und dadurch sichtbar gemacht werden.
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Ein
solches Verfahren, mit dem Unterschiede in der optischen Dichte
des betrachteten Objekts in Kontrastunterschiede umgewandelt werden,
ist bekannt unter dem Namen Differential Interference Contrast (DIC).
Der Differential Interference Contrast (DIC) beruht auf dem Interferometerprinzip,
zur Realisierung werden mehrere optische Komponenten benötigt.
Das Licht wird zuerst mittels eines Polarisationsfilters polarisiert
und anschließend durch ein Nomarski-(oder Wollaston-)Prisma
geleitet, welches der Aufspaltung des Lichtes in zwei Strahlen mit
unterschiedlicher Phasenlage dient. Nach dem Durchgang durch die
zu analysierende Probe werden beide Strahlen in einem zweiten Prisma
wieder überlagert und durch ein weiteres Polarisationsfilter,
den Analysator, geleitet, wobei die geringfügigen Unterschiede im
Brechungsindex der Probe und der daraus folgende Überlagerungseffekt
zu der gewünschten Amplitudenmodulation und damit einem
erhöhtem Kontrast führen.
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Eine
weitere Gruppe von Verfahren, bei dem die Objekte kontrastierend
in Abhängigkeit von ihrem Lichtbrechungsindex und ihrer
Dicke dargestellt werden, sind bekannt als Phasenkontrast-Verfahren.
Bei diesen Verfahren wird der in der mikroskopierten Probe vorhandene
Phasengradient durch ringförmige Blenden sichtbar gemacht.
In der Brennebene des Objektivs befindet sich eine Scheibe mit einer
ringförmigen Abschattung aus optisch dichterem Material, und
im Kondensor eine Schlitzblende mit einem dazu optisch konjugierten
ringförmigen Schlitz.
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Bei
Anwendung des aus
US 4,200,353 bekannten
Modulationskontrastes nach Hoffman wird in der hinteren Brennebene
des Objektivs ein spezielles Amplitudenfilter (Analysator) mit drei
Zonen unterschiedlicher optischer Dichte angeordnet: ein schmaler,
optisch undurchlässiger Streifen und ein daneben liegender
schmaler Streifen mit einem Transmissionsgrad von etwa 15%, die
verbleibende Fläche ist transparent. Im Kondensor ist eine
dazu optisch konjugierte Filterscheibe (Modulator) angebracht: ein schmaler,
randnaher Streifen ist transparent, eine weiterer zu etwa 15%, wobei
dieser Teil des Filters als Polarisationsfilter ausgeführt
ist, und die übrige Filterfläche ist nicht durchlässig.
Die Breite der sich ergebenden Öffnung aus den beiden schmalen
Streifen kann durch ein hinter der Blende angebrachtes drehbares
lineares Polarisationsfilter variiert werden. Diese Kontrastmethode
wirkt ähn lich dem o. g. Phasenkontrast, das Auflösungsvermögen
wird jedoch verbessert durch das Vermeiden von Halo-Effekten an
Kanten.
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Nachteilig
an den bekannten Verfahren ist, daß die Festlegung der
Einstellungen, der Anordnung und der Form der jeweiligen Filter
und Blenden im Kondensor und im Objektiv jeweils für eine
Kombination der Komponenten im Strahlengang nur manuell erfolgen
kann und dann, abgesehen von minimalen manuellen Nachregelungen
für unterschiedliche Proben zur weiteren Verbesserung des
Kontrastes bzw. zur Anpassung auf unterschiedliche Objektive, nur
durch vollständige, manuelle Neufestlegung verändert
werden kann.
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Es
ist daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Modulationskontrastmikroskop
für die Lichtmikroskopie anzugeben, welches diesen Nachteil
vermeidet.
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Diese
Aufgabe wird gelöst durch eine Mikroskopieranordnung mit
einer Beleuchtungsanordnung, einem optischen Sensor oder einem Okular und
einem Strahlengang, der sich zwischen der Beleuchtungsanordnung
und dem optischen Sensor oder dem Okular erstreckt, wobei ein zu
mikroskopierendes Objekt in diesem Strahlengang angeordnet ist,
und wobei die Beleuchtungsanordnung Licht aussendet, dessen Parameter
abhängig von einer Position im Querschnitt des Strahlengangs
durch elektrische Steuersignale variierbar sind.
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Vorzugsweise
weist die Beleuchtungsanordnung einen durch elektrische Steuersignale
beeinflußbaren Spatial Light Modulator in der Brennebene eines
Kondensors auf, durch welchen die Lichtparameter positionsabhängig
variierbar sind. Der Spatial Light Modulator kann aber auch an anderer
Stelle im Strahlengang zwischen Lichtquelle und Kondensor angeordnet
sein.
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Als
Spatial Light Modulator können beispielsweise folgende
Elemente verwendet werden: Durchlicht-Flüssigkristalldisplay,
Liquid Crystal an Silicon Element, oder Mikrospiegelarray. Alternativ
wird eine Beleuchtungsanordnung verwendet, die eine Leuchtelementematrix
aufweist, bei der die flächige Verteilung der Lichtausgabeparameter
durch elektrische Steuersignale variierbar ist.
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Die
Mikroskopieranordnung weist vorzugsweise zusätzlich ein
Analyseelement im Strahlengang zwischen Objekt und Sensor auf, welches
die Parameter durch das Analyseelement hindurchtretenden oder vom
Analyseelement reflektierten Lichts abhängig von einer
Position im Querschnitt des Strahlengangs verändert, wobei
eine Ansteuerung der Beleuchtungsanordnung auf das Analyseelement abgestimmt
ist.
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Vorteilhaft
wird dabei ein Analyseelement verwendet, bei dem die Veränderung
der Lichtparameter durch elektrische Steuersignale variierbar ist.
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In
einer Ausgestaltung der Erfindung wird für das Analyseelement
ein durch elektrische Steuersignale beeinflußbarer weiterer
Spatial Light Modulator genutzt, durch welchen die Lichtparameter
positionsabhängig variierbar sind. Dabei können
wiederum folgende Elemente als Spatial Light Modulator genutzt werden:
Durchlicht-Flüssigkristalldisplay, Liquid Crystal an Silicon
Element, oder Mikrospiegelarray.
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Vorzugsweise
ist eine erfindungsgemäße Mikroskopieranordnung
mit einer Steuerung oder einem Computer ausgerüstet bzw.
gekoppelt mit:
- – Mitteln zum Empfangen
aufgenommener Bilder vom optischen Sensor;
- – Mitteln zur Analyse der empfangenen Bilder; und
- – Mitteln zum Erzeugen von Steuersignalen und Übertragen
von Steuersignalen an die Beleuchtungsanordnung und/oder das Analyseelement;
wobei
die Steuereinrichtung in einer geschlossenen Regelschleife die aufgenommenen
Bilder bezüglich vorgebbarer Parameter optimiert, indem
die Ansteuerung Beleuchtungsanordnung und/oder Analyseelement solange
verändert und die Auswirkungen der Veränderungen
auf die empfangenen Bilder analysiert werden, bis ein optimales
aufgenommenes Bild erreicht wurde.
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Die
Erfindung betrifft ferner eine Beleuchtungsanordnung für
eine Mikroskopieranordnung, die Licht aussendet, dessen Parameter
abhängig von einer Position im Querschnitt eines Strahlengangs
der Mikroskopieranordnung durch elektrische Steuersignale variierbar
sind.
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Ein
Vorteil der vorliegenden Erfindung ist darin zu sehen, daß über
die elektrisch ansteuerbare Beleuchtungsanordnung beliebige Licht-
oder Filtermuster nachgebildet werden können, unter anderem auch
die Blenden für Phasenkontrast oder den Modulationskontrast
nach Hoffman, ohne daß hierfür Elemente im Strahlengang
getauscht werden müßten. Ein weiterer Vorteil
besteht darin, daß bei Ansteuerung durch einen Computer
diese Licht- oder Filtermuster solange automatisch variiert werden
können, bis ein Optimum hinsichtlich eines vorgebbaren
Parameters (z. B. maximaler Kontrast in bestimmten Bildregionen)
erreicht ist.
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Im
folgenden werden Ausführungsbeispiele der vorliegenden
Erfindung anhand von 3 Figuren näher erläutert.
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1 ist
eine schematische Darstellung eines ersten Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung, umfassend ein Durchlicht-LCD als Spatial Light
Modulator;
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2 ist
eine schematische Darstellung eines zweiten Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung, umfassend ein LCOS-Element als Spatial Light
Modulator; und
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3 ist
eine schematische Darstellung eines dritten Ausführungsbeispiels
der vorliegenden Erfindung, umfassend ein Mikrospiegelarray als
Spatial Light Modulator.
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1 zeigt
eine Mikroskopieranordnung mit einer (in der Regel punktförmigen)
Lichtquelle 1, beispielsweise eine Halogenleuchte oder
eine LED. Lichtquelle 1 erzeugt ein Lichtbündel 2,
welches durch eine geeignete Kollektorlinse 3 oder ein
Linsensystem gesammelt wird. Nach dem Passieren eines optionalen
Wärmefilters 4, einer Leuchtfeldblende 5 und
eines optionalen Umlenkspiegels 6 trifft das Licht auf
ein Durchlicht-Flüssigkristalldisplay 7, welches
als Modulator dient. Ein Kondensor 8 fokussiert das Licht
auf ein zu mikroskopierendes Objekt 9, auch Probe genannt.
Durch ein Objektiv 10 und ein dahinter liegendes zweites
Durchlicht-Flüssigkristalldisplay 11, welches
als Demodulatorfilter dient, wird das Licht einer elektronischer
Kamera 12 zugeleitet, welche ein Bild aufnimmt. Das erzeugte
Zwischenbild kann ebenfalls durch ein Okular direkt betrachtet werden.
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Dabei
wird hier die Zusammenfassung aller Elemente im Strahlengang, die
der Bereitstellung der Ausleuchtung der Probe 9 dienen,
als Beleuchtungsanordnung bezeichnet. Die Beleuchtungsanordnung umfaßt
in 1 daher Lichtquelle 1, Kollektorlinse 3, Wärmefilter 4,
Leuchtfeldblende 5, Umlenkspiegel 6, Durchlicht-Flüssigkristalldisplay 7 (Modulator),
und Kondensor 8.
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In 1 wird
somit das aus dem Stand der Technik bekannte statische Modulatorelement
durch ein variables ersetzt, genauer durch eines, welches elektrisch
einstellbar variabel ist: Ein bildgebendes Bauelement, nämlich
das Durchlicht-Flüssigkristalldisplay 7, welches
durch eine entsprechende Ansteuerung beliebige Muster darstellen
kann, wird anstelle der klassischen Blenden im Strahlengang zwischen
Lichtquelle 1 und Kondensor 8 in Phasen- oder Modulationskontrastanordnungen
eingesetzt. Durchlicht-Flüssigkristalldisplay 7 ist
dabei ein Beispiel eines allgemein als Spatial Light Modulator (räumlicher Lichtmodulator)
bekannten Bauteils ist. Der Spatial Light Modulator gestattet Orts-
und zeitabhängig die Modulation der Lichtintensität.
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Mittels
eines derartigen Spatial Light Modulators, im Beispiel der 1 das
transparente Flüssigkristalldisplay (LCD) 7, ist
es möglich, beliebige Figuren abzubilden, unter anderem
auch die Blenden für Phasenkontrast oder den Modulationskontrast nach
Hoffman. Die Qualität eines durch Kamera bzw. Sensor 12 aufgenommenen
Bildes kann eingesetzt werden, um automatisch die Parameter dieser
Maske nachzuregeln bzw. zu optimieren, so etwa die Breite des Ringes
im Falle einer Phasenkontrastblende oder die Breite, Position und
optische Dichte im Fall des Modulationskontrastes nach Hoffman.
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Falls
ein Modulationskontrast nach Hoffman zum Einsatz kommt, so kann
alternativ zum LCD 11 aus 1 eine feste
Blende zur Demodulation in sämtliche Objektive 10 eingesetzt
werden. Der Spatial Light Modulator 7 wird dann für
jedes Objektiv 10 auf die Winkellage der in der Objektivbrennebene
befindlichen Streifen eingestellt und kann außerdem in der
Breite variiert werden.
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Vorteilhaft
wird jedoch, wie in 1 gezeigt, ein weiteres LCD 11 als
Demodulator bzw. Analysator im Strahlengang hinter der Probe in
der Brennebene des Objektivs genutzt, insbesondere wenn die Beobachtung
zusätzlich oder ausschließlich durch ein Okular
(nicht dargstellt) erfolgt.
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Ist
die Beobachtung durch ein Okular nicht zwingend erforderlich und
erfolgt die Bildaufnahme nur über die elektronische Kamera 12,
so kann der Effekt des Analysators auch durch ein entsprechendes
Softwarefilter im Bildausgabeprogramm nachgebildet werden, wodurch
sich die Konstruktion vereinfacht. Andererseits kann natürlich
auch bei reinem Kamerabetrieb der Mikroskopieranordnung ein optisch
realisiertes Demodulatorfilter 11 genutzt werden, was möglicherweise
eine bessere Auflösung interessierender Bildbereiche gegenüber
einer Softwarefilterung liefert.
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Der
Spatial Light Modulator, welcher zwischen Lichtquelle 1 und
Kondensor 8 angeordnet ist, kann außer mit platzsparenden
Durchlicht-LCD 7 auch durch reflektive Bauelemente realisiert
werden.
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Ein
erstes Beispiel mit einem reflektiven Spatial Light Modulator zeigt 2. 2 zeigt
wiederum eine Beleuchtungsanordnung umfassend Lichtquelle 1,
Kollektorlinse 3, Wärmefilter 4, und
Leuchtfeldblende 5. Zusätzlich umfaßt
die Beleuchtungsanordnung der 2 einen
polarisierenden Strahlteiler 14, welcher den kollimierten
Lichtstrahl durch eine Zwischenlinse bzw. Linsenkombination 15 auf
ein LCOS-Element 16 fokussiert.
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LCOS
steht für Liquid Crystal on Silicon und ist ein Anzeigegerät ähnlich
einem LCD. Im Gegensatz zu diesem läßt es das
Licht allerdings nicht durch, sondern reflektiert es.
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Im
Beispiel der 2 reflektiert das LCOS-Element
den Strahl mit einem darauf modulierten Muster. Die übrigen
Komponenten der in 2 dargestellten Mikrosko pieranordnung
entsprechen denen der Mikroskopieranordnung aus 1. Insbesondere
für die Auswertung der optischen Information gelten die
entsprechenden Erläuterungen zu 1 ohne Einschränkungen.
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Da
LCOS-Elemente sehr kurze Schaltzeiten ermöglichen, können
unterschiedliche Helligkeiten einzelner Pixel sowohl durch unterschiedliche
Grauwerte als auch durch eine Veränderung des Tastverhältnisses
erreicht werden.
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Ein
weiteres Beispiel mit einem reflektiven Spatial Light Modulator
zeigt 3. Die Mikroskopieranordnung der 3 weist
eine Beleuchtungseinheit auf, bei der das Licht durch eine Mikrospiegel-Matrix 18 abgelenkt
wird (eventuell notwendige Linsen zur Zwischenfokussierung auf die
Matrix 18 sind nicht dargestellt). Aufgrund des bei der
Reflexion an den Spiegelelementen der Matrix 18 auftretenden Ablenkwinkels
kommt ein sogenanntes TIR-Prisma 17 (TIR = Total Internal
Reflectance) zum Einsatz. Falls die Größe der
Lichtquelle 1 (z. B. im Falle einer LED) es zuläßt,
kann dieses Prisma 17 auch entfallen und die Lichtquelle 1 und
der Kollektor 3 im entsprechenden Winkel zur Mikrospiegel-Matrix 18 angeordnet
werden.
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Für
alle Ausführungsbeispiele der Erfindung ist es besonders
vorteilhaft, die Ansteuerung der bildgebenden Elemente bzw. Modulatoren 7, 16, 18 und, sofern
vorhanden, des Analysators 11, über einen Computer
vorzunehmen (nicht dargestellt).. Dies bietet den Vorteil, daß Form
und Größe der Blende sowie deren Transmissions-
und/oder Reflexionsgrad kontinuierlich variiert werden können.
Falls das durch eine elektronische Kamera 12 aufgenommene
Bild analysiert wird, ist eine Variation in Abhängigkeit
der Bildqualität in einer geschlossenen Regelschleife in Echtzeit
möglich.
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Ferner
können bei Computeransteuerung vordefinierte Muster für
die Spatial Light Modulatoren 7, 16, 18 in
Bilddateien gespeichert und entsprechend angezeigt werden. Diese
Muster können sowohl den klassischen Kontrastverbesserungsmethoden
entsprechen oder auch darüber hinausgehen (z. B. im Fall
des Hoffman-Kontrastes ein echter Graukeil anstelle einer Zone konstanter
optischer Dichte).
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Der
Benutzer besitzt bei einer Computeransteuerung die größtmögliche
Flexibilität, zusätzlich manuell Einfluß auf
die Blendenparameter, d. h. die mittels LCD 7, LCOS 16 oder
Mikrospiegelarray 18 dargestellten Modulatorfilter zu nehmen.
Außerdem kann die Ansteuerung des Filters 7, 16, 18 mit
der Bildaufnahme der Kamera 12 synchronisiert werden.
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Als
Lichtquelle 1 sind kollimierte Punktstrahler oder LED-Matrixanordnungen
einsetzbar. Anstelle einer Matrix mit einzeln abgesteuerten LED
können in Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung einzelne
LED auch fest vorverdrahtet sein (z. B. Zeilen), um beispielsweise
in Anlehnung an den Modulationskontrast nach Hoffman die Schlitzbreite
zu variieren. Bei Anordnung an entsprechender Stelle im Strahlengang
ist es möglich, aktive optische Bauelemente ausreichender
Helligkeit und Homogenität, z. B. eine Leuchtdiodenmatrix
oder ein aktives LCD, anstelle des Modulators 7, 16, 18 zu
nutzen. In diesem Fall werden die o. g. konventionelle Lichtquelle 1 und
die Modulatorscheibe 7, 16, 18 ersetzt
durch eine derartige Matrix und einen Kollektor. Der beobachterseitige
Analysator 11 kann wie bereits beschrieben realisiert werden.
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In
Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung wird das bildgebende
Bauelement 7, 16, 18 im nicht direkt
durch den zur Bildanzeige und Steuerung dienenden Computer, sondern
durch einen Mikrocontroller angesteuert. Dann kann es von Vorteil
sein, einzelne Muster auf der Mikrocontrollerplatine zu speichern.
Ferner ist es dann möglich, Bedienelemente vorzusehen,
mit denen direkt zwischen auf der Mikrocontrollerplatine vorgespeicherten
Mustern umgeschaltet werden kann.
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Muster,
die etwa verschiedenen herkömmlichen Modulatoren entsprechen,
können vorgespeichert und bei Objektivwechsel automatisch
abgerufen werden. Kommt im Objektiv ein fester Analysator zum Einsatz,
so sind Ausgestaltungen der vorliegenden Erfindung denkbar, bei
denen der Modulator unter Zuhilfenahme kontinuierlich aufgenommener
Bilder und der Berechnung des Kontrastes automatisch darauf abgestimmt
wird.
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Die
vorgeschlagene Beleuchtungsanordnung kann ebenso vorteilhaft für
Auflichtmikroskope zur Kontrastverbesserung eingesetzt werden.
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ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur
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