WO2006066286A1

WO2006066286A1 - Vorrichtung zur mikroskopischen untersuchung von proben

Info

Publication number: WO2006066286A1
Application number: PCT/AT2004/000457
Authority: WO
Inventors: Günter FREUDENTHALER; Max Sonnleitner; Alois Sonnleitner
Original assignee: Upper Austrian Research Gmbh
Priority date: 2004-12-23
Filing date: 2004-12-23
Publication date: 2006-06-29

Abstract

Beschrieben ist eine Vorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung von Proben, insbesondere im Scan-Verfahren, umfassend eine abbildende Optik (1) und einen Probenträger (2), wobei die abbildende Optik und die zu untersuchende Probe auf dem Probenträger relativ zueinander bewegbar sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Vorrichtung zur Kontrolle und gegebenenfalls Adjustierung der Fokusebene aufweist, wobei die Vorrichtung zur Kontrolle der Fokusebene umfasst: - eine Laserlichtquelle (4), die einen Laserstrahl erzeugt, der parallel zur optischen Achse der abbildenden Optik durch die abbildende Optik verläuft, so dass der Laserstrahl an der Grenzfläche zwischen Probenträger und der zu untersuchenden Probe total reflektiert wird, - eine Detektionseinrichtung (9) zur Detektion des total reflektierten Laserstrahles und - eine mit der Detektionseinrichtung gekoppelte Kontrolleinrichtung (10, 11) für die Fokusebene, die vorzugsweise auch eine Adjustierungseinrichtung für die Fokusebene ist.

Description

Vorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung von Proben

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Vorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung von Proben .

Die immer höhere Auflösung von Mikroskopen, insbesondere von solchen, die zum Scannen eingesetzt werden, hat zur Folge, dass auch deren Tiefenschärfe besser wird . Dadurch tritt das Problem auf , dass sich Unebenheiten auf der Probenträgeroberfläche oder nicht exakt planes Aufliegen der Probenträger in Form von unscharfen Bildabschnitten negativ auf die Untersuchung auswirken, insbesondere im Rahmen von kontinuierlichen oder diskontinuierlichen Scans .

Einen Ansatz , dieses Problem zu beseitigen, lieferten Hellen und Axelrod (1990) , die eine Vorrichtung beschrieben, mit der Drifts im Fokus der Proben, bedingt durch thermische und mechanische Effekte, kompensiert werden sollten . Allerdings wird dieses Konzept den Anforderungen hinsichtlich Empfindlichkeit , Genauigkeit und Geschwindigkeit bei großflächigen und hochaufgelösten Scans , nicht gerecht, weil die Fokusebene nur auf +/-500nm genau gehalten werden kann. Für konfokale Mikroskopie ist diese Genauigkeit zu gering (Schärfentiefe : Größenordnung 300nm - wellenlängenabhängig) , insbesondere in der Einzelmolekülmikroskopie mit Positionsgenauigkeiten von 40nm [Schütz et al . , 2000 ] .

Ein weiterer Nachteil der im Hellen und Axelrod beschriebenen Vorrichtung liegt darin, dass rund 96% der Laserintensität durch den Probenträger auf die Probe gelangen . Nur rund 4% der einfallenden Intensität werden zur Abstandsmessung verwendet . Dies hat zur Folge, dass durch den transmittierten Strahl , insbesondere in der Fluoreszenzmikroskopie, ein störendes Hintergrundsignal , z . B . durch angeregte Fluorophore, auf der Probe entsteht . Weiters können auch andere unerwünschte Wechselwirkungen mit der zu untersuchenden Probe entstehen, z . B durch Wärmeentwicklung und die dadurch bedingten Reaktionen, wodurch das Untersuchungs- ergebnis verfälscht werden kann.

Es war daher Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein System zur Verfügung zu stellen, mit der der Fokus einer derartigen Mikro- skopiereinrichtung verlässlich und sehr genau kontrolliert und gegebenenfalls adjustiert werden kann, z .B . im Rahmen eines laufenden Scans entlang einer Probenoberfläche . Weiters soll das Fokussystem keinerlei wesentliche negative Auswirkungen auf die Probe selbst mit sich bringen. Schließlich soll ein derartiges Fokussystem auch als Autofokussystem betrieben werden können und gegebenenfalls einfach in bestehende Mikroskope, z . B . Fluoreszenzmikroskope, insbesondere Scan-Fluoreszenzmikroskope, wie sie z . B in der WO 00/25113 A beschrieben werden, eingebaut werden können.

Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung eine Vorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung von Proben, insbesondere im Scan- Verfahren, umfassend eine abbildende Optik und einen Probenträger, wobei die abbildende Optik und die zu untersuchende Probe auf dem Probenträger relativ zueinander bewegbar sind, dadurch gekennzeichnet , dass sie eine Vorrichtung zur Kontrolle und gegebenenfalls Adjustierung der Fokusebene aufweist , wobei die Vorrichtung zur Kontrolle der Fokusebene umfasst :

- eine Laserlichtquelle, die einen Laserstrahl erzeugt, der parallel zur optischen Achse der abbildenden Optik durch die abbildende Optik verläuft , so dass der Laserstrahl an der Grenzfläche zwischen Probenträger und der zu untersuchenden Probe total reflektiert wird,

- eine Detektionseinrichtung zur Detektion des total reflektierten Laserstrahles und

- eine mit der Detektionseinrichtung gekoppelte Kontrolleinrichtung für die Fokusebene, die vorzugsweise auch eine Adjustierungseinrichtung für die Fokusebene ist .

Mit der vorliegenden Erfindung kann in einfacher und effizienter Weise eine höchst empfindliche Überwachung und gegebenenfalls Adjustierung des Mikroskop-Fokus hinsichtlich einer Probe gewährleistet werden . Erfindungsgemäß wird dabei ein parallel (im Abstand) zur optischen Achse verlaufender Laserstrahl so auf den Probenträger gelenkt , dass der Strahl auf der Grenzfläche zwischen Probenträger und Probenmedium total reflektiert wird. Der reflektierte Strahl , dessen Position die Abstandsinformation beinhaltet, kann dann in einer Detektionseinrichtung gemessen werden. Mit dieser gemessenen Laserstrahl-Information kann dann die Adjustierung des Fokus vorgenommen werden .

Im einfachsten Fall gibt das total reflektierte Laserlicht lediglich die Information „Fokus o . k . " oder Fokus nicht o . k. " weiter, j edoch können auch weitere Informationen durch die Abweichung des Laserstrahls eruiert werden, etwa wie weit der Fokus verschoben werden muss , in welche Richtung, etc ..

In einer bevorzugten Variante der vorliegenden Erfindung wird der total reflektierte Laserstrahl auf eine 2-Segment-Photodiode gelenkt . Das entstehende Differenzsignal wird über einen Regler der Steuereinheit eines piezogetriebenen Nanopositionierers zugeführt, welcher den Abstand zwischen abbildender Optik und Probenträgeroberfläche konstant hält und somit als Autofokussystem ausgebildet werden kann.

Die erfindungsgemäße Nutzung des Prinzips der Totalreflexion in Kombination mit dem Einsatz eines piezogesteuerten Nanopositionierers bewirkt , dass :

- die notwendige Empfindlichkeit in der Abstandsanderung, dh, erreicht wird, da die Änderung der Verschiebung des reflektierten Strahls , dx, direkt proportional zum Einfallswinkel alpha ist : dx=dh*tan (alpha) ; da erst für große Einfallswinkel (Bereich: >60° , abhängig von den Brechungsindi- zes) Totalreflexion auftritt , ist damit die Änderung dx am größten (vgl . auch: Fig. l ) ;

- nur ein evaneszentes Feld erzeugt wird, das beim Eindringen in die Probe exponentiell abklingt und eine Eindringtiefe in der Größenordnung von lOOnm besitzt; die Eindringtiefe ist indirekt proportional zum Einfallswinkel [Hecht] ; dies hat den Vorteil , dass es kaum zu einer Fluoreszenzanregung kommt und somit kein störendes Hintergrundsignal erzeugt wird;

- eine Genauigkeit , mit welcher der Abstand gehalten wird, erreicht wird; die den Anforderungen für Anwendungen in der Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie entspricht [Schütz et al . , 2000] .

Durch die kurze Ansprechzeit einer Piezosteuerung konnte auch das Problem hinsichtlich Geschwindigkeit bei großflächigen und schnellen Scans gelöst werden . Axelrod und Hellen benutzen hingegen einen elektrischen Motor, um den eingestellten Fokus nachzuregeln . Durch Drifts und Totgänge, die bei Mechanikkomponenten auftreten, kann damit nicht die geforderte Genauigkeit erreicht werden .

Ein wesentlicher Unterschied zu bisher entwickelten Autofokus- Systemen ist j ener, dass erfindungsgemäß der eingekoppelte Laserstrahl so justiert wird, dass an der Grenzfläche zwischen Probenplättchen und Probenmedium Totalreflexion stattfindet . Dies liefert einerseits ein weitaus höheres Messsignal und andererseits dringt das Licht nur wenige 10nm in die Probe ein . Bei bisher eingesetzten Systemen wird der Laserstrahl nur leicht schräg zur optischen Achse durch die Probe geschickt . Dabei entsteht ein Reflex von nur rund 4% . Außerdem wird durch die Totalreflexionsmethode die Winkeländerung in Abhängigkeit der Höhenänderung maximiert .

Weiteres stellt auch der gemäß einer bevorzugten Ausführungsform vorgesehene Einsatz eines piezogesteuerten Obj ektivs ( „ Piezo" ) einen wesentlichen Vorteil dar . Damit lassen sich Reaktionszeiten im 100 μs - Bereich realisieren. Das bedeutet, dass das erfindungsgemäße System weitaus schneller reagiert , als ein Fokushaltesystem, bei dem das Obj ektiv mit einem Motor angetrieben wird. Außerdem kann mit einem Piezo die Fokusebene auf mindestens 50nm genau eingestellt werden . Diese Genauigkeit liegt weit unterhalb der Schärfentiefe (rund 300nm) des Mikroskops . Drifts und Totgänge von Mechanikkomponenten fallen bei Piezos auch weg .

Wie erwähnt, umfasst die Detektionseinrichtung eine 2-Segment- Photodiode .

Die relative Bewegbarkeit zwischen abbildender Optik und Probenträger ist besonders bei Scans wesentlich, bei welcher der Scan- Prozess entlang der x- und y-Achse durchgeführt wird. Hier sind auch bislang die größten Probleme bei nicht befriedigend fokus- sierten Analysen aufgetreten, insbesondere bei schnellen x-y- Scans ( z . B . bei Analysen von Mikroarrays oder Mikrotiterplat- ten) . Die erfindungsgemäße Vorrichtung ist aber auch z . B . bei dreidimensionalen Scans , z . B . über ganze Zellen oder Zellkompar- timente) geeignet .

Bevorzugter Weise umfasst die Kontrolleinrichtung der erfindungsgemäßen Vorrichtung einen Regler, der Informationen der De- tektionseinrichtung verarbeitet, insbesondere ein Differenzsignal einer 2-Segment-Photodiode . Es ist weiters bevorzugt , wenn die Kontrolleinrichtung eine Steuereinheit umfasst , die die Informationen der Detektionseinrichtung, insbesondere die über einen Regler verarbeiteten Informationen, die die Adjustierungs- einrichtung ansteuert, weiterverarbeitet . Besonders vorteilhaft ist , wie erwähnt, das Vorsehen eines piezogetriebenen Nanoposi- tionierers als Adjustierungseinrichtung .

Weiters hat sich auch bewährt, in der Vorrichtung zur Kontrolle der Fokusebene einen Strahlenteiler zum Auskoppeln des reflektierten Laserstrahls aus dem Strahlengang vorzusehen. Mit diesen Maßnahmen lassen sich in besonders einfacher Weise herkömmliche Mikroskope, z . B Fluoreszenzmikroskope, mit einem erfindungsgemäßen System ausstatten und leicht adaptieren . Die erfindungsgemäße Fokus-Uberprüfungs- und -Adjustierungsvorrichtung ist ohne weiteres auch in alle gängigen Hochleistungs-Fluoreszenzmikro- skope einbaubar . Diese Analysesysteme sind als besonders leistungsfähige Mittel vor allem im wissenschaftlichen Bereich anerkannt und setzen sich auch immer mehr in der Routineanalyse durch, insbesondere bei der schnellen Untersuchung von Reihen- testungen mit einer großen Anzahl von Proben mit sehr geringen Probenvolumina .

Besonders bevorzugt ist daher die erfindungsgemäße Vorrichtung als Fluoreszenzmikroskop, insbesondere als Scanner-Mikroskop, ausgebildet . Damit kann man dann unter Ausnutzung der Vorteile der vorliegenden Erfindung Scans über Probenoberflächen durchführen, mit welchen in kürzester Zeit auch enorme Probenzahlen z . B . auf Mikroarrays mikroskopiert werden können ( z . B . wie in der WO 00/25113 A dargestellt) . Damit ist die vorliegende Erfindung ganz besonders für Hochdurchsatz-Scans geeignet .

Vorteilhafter Weise verläuft erfindungsgemäß der Laserstrahl im Randbereich der abbildenden Optik, so dass der Einfallswinkel an der Grenzfläche zwischen Probenträger und der zu untersuchenden Probe aresin (nl/n.2 ) (nl = Brechungsindex des Probenmediums , n2 = Brechungsindex des Probenträgers ) [Bergmann, Schäfer] oder größer ist, wobei der maximale Einfallswinkel durch die numerische Apertur (NA) der abbildenden Optik aresin (NA/n) (n = Brechungsindex des Probenträgers) limitiert ist . Demgemäß hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn die Vorrichtung zur Kontrolle der Fokusebene eine Sammellinse umfasst , die den Laserstrahl der Laserlichtquelle auf die hintere Fokusebene der abbildenden Optik fokussiert und somit einen Parallelstrahl durch den Probenträger erzeugt .

Die Erfindung wird anhand der folgenden Beispiele und der Zeichnungsfiguren näher erläutert , j edoch ohne darauf beschränkt zu sein .

Es zeigen:

Fig. 1 : eine schematische Skizze für den Strahlengang, um Totalreflexion zu erreichen;

Fig . 2 : ein Beispiel für die erfindungsgemäße Verrichtung;

Fig. 3 : einen Vergleich von Scans mit Autofokus (A) bzw. ohne Autofokus (B) von ingesamt 12 IgG-Cy3 Spots in vier Sektoren auf einer Fläche von 8 x 8 mm bei einer lateralen Auflösung von 100 mm/pixel , wobei ein Spot als Referenz-Fokus (R) festgelegt ist .

Beispiele:

Die vorliegende Erfindung wird in den folgenden Beispielen anhand einer besonders bevorzugten Ausführungsform erläutert .

Ein Laserstrahl , der paralellverschoben zur optische Achse der abbildenden Optik (Obj ektiv, Linsensystem, etc . ) des Scanners eingekoppelt ist, wird an der Grenzfläche zwischen Probenträger und Probenmedium totalreflektiert (Fig . 1 ) . Totalreflexion tritt für den Fall ein, dass der Einfallswinkel des Laserstrahls größer als aresin (nl/n2 ) [Bergmann, Schäfer] ist (nl = Brechungsindex des Probenmediums , n2 = Brechungsindex des Probenträgers ) . Ansonsten wird der Großteil des Strahls transmittiert und nur ein sehr geringer Anteil (rund 4% , [Bergmann, Schäfer] ) reflektiert .

Dabei wird der Laserstrahl mit Hilfe einer Sammellinse auf die hintere Fokusebene der abbildenden Optik fokussiert, wodurch in der Obj ektebene ein Parallelstrahl entsteht .

Der reflektierte Strahl , in dessen Position die Abstandsinforma- tion zwischen abbildender Optik und Probenträger steckt, wird durch einen Strahlteiler aus dem Strahlengang ausgekoppelt und auf eine 2-Segment-Photodiode gelenkt . Das daraus resultierende Differenzsignal wird von einer Reglereinheit verarbeitet , welche die Steuereinheit des piezogetriebenen Nanopositionierers kontrolliert . Der Nanopositionierer variiert die Position der abbildenden Optik und hält damit die zu untersuchende Probe in der Fokusebene (Fig . 2 ) .

Beispiel 1 :

Da - aufgrund der rasanten Entwicklung in der Fluoreszenzmikroskopie - bereits die Möglichkeit besteht, Flächen im cτn²-Bereich mit einer lateralen Auflösung von rund lOOnm/pixel - das eine sehr geringe Schärfentiefe zur Folge hat - innerhalb relativ kurzer Zeit (~5min) abzuscannen, ist es notwendig, eine einmal eingestellte Fokusebene auf einer großen Fläche konstant zu halten und aber dabei auf eventuell auftretende Störungen, in Form von Unebenheiten des Probenträgers , extrem schnell zu reagieren und diese auszugleichen (Fig. 3 ) .

Figur 3 zeigt einen Vergleich von Scans mit bzw. ohne Einsatz der oben beschriebenen Vorrichtung, welche hier kurz mit "Autofokus " bezeichnet wird. Das mittlere, quadratische Bild zeigt Spots von IgG - Cy3 (ein Antikörper mit dem Fluoreszenzfarbstoff Cy3 ) auf einer Fläche von 8 x 8 mm². Die Spots haben eine Größe von rund 120 x 120 um². Der Abstand zwischen den einzelnen Spots beträgt rund 300 um. Der linke, obere Spot wurde als Referenz- Fokus festgelegt . Beginnend in dieser fokalen Ebene wurden verschiedene Sektoren mit 3 Spots , j eweils mit bzw. ohne Einsatz der Autofokus-Vorrichtung, mit einem speziellen Fluoreszenzmikroskop aufgenommen. Die laterale Auflösung betrug lOOnm/pixel . Ein sehr wichtiger Bereich für die Anwendung dieser Entwicklung liegt im Bereich des Auslesens von DNA- bzw. Protein-Chips .

Beispiel 2 :

Eine weitere Anwendung findet diese Vorrichtung im Fokussieren auf die Oberfläche von hochreinen Probenträgern . Zuerst wird die Fokusebene mithilfe von Referenz-Probenträgern, welche fluoreszierende Markierungspunkte tragen, festgelegt . Wird dieser Probenträger zum Zweck der Untersuchung der Autofluoreszenz durch einen hochreinen getauscht , so stellt sich wieder der zuvor eingestellte Arbeitsabstand zwischen abbildender Optik und Probenträger ein.

Beispiel 3 :

Auch wenn man TIRFM ( total internal reflection fluorescence mi- croscopy) betreibt, ist es sehr wichtig, dass der Arbeitsabstand der abbildenden Optik möglichst konstant bleibt , da das dadurch erzeugte evaneszente Feld exponentiell mit dem Abstand abklingt . Möchte man bei TIRFM eine größere Fläche abscannen, so benötigt man eine, wie oben beschriebene Vorrichtung, um eine konstante Anregungsintensität zu gewährleisten .

Beispiel 4 :

Bei der Bearbeitung von planen Oberflächen, z . B . bei der Erzeugung von Mikrostrukturen mittels Mehrphotonen-Absorption, ist es auch möglich diese Vorrichtung einzusetzen, um exaktere definierte Strukturen zu erzeugen.

Beispiel 5 :

Vergleichsparameter zwischen der erfindungsgemäßen Vorrichtung und der Vorrichtung gemäß dem Stand der Technik (Hellen und Axelrod (1990 ) ) : Vergleich Autofokus : Erfindung ^^ Hellen & Axelrod

Genauigkeit Δz : +/- 64 nm ~ 500nm max . Reaktionszeit : ~ 100 μs keine Angaben Intensität d . Messsignals : 99% ~ 4%

(% der eingekopp . Intens . )

Einfluß Laser auf Probe : - 1% ~ 96%

( % der eingekopp . Intens . )

Empfindlichkeit : maximal keine Angaben, aber bei weitem kleiner

Literatur:

Bergmann, Schäfer, Optik - Lehrbuch der Experimentalphysik, Band

3 , 9.Auflage, Verlag de Gruyter .

Hecht E . , Optics , 4th Edition, Verlag Addison Wesley

Hellen E . , Daniel Axelrod ( 1990 ) An automatic focus/hold System for optical microscopes . Rev . Sei . Instrum. , Vol .61 , No .12 , pp .

3722-3725

Schütz G. J . , Pastuschenko V. Ph . , Gruber H . J . , Knaus H . -G. ,

Pragl B . , Schindler H. (2000) 3D imaging of individual ion- channels in live chells in 40nm resolution . , Single Mol . , Vol . l , pp . 25-30

Claims

P a t e n t a n s p r ü c h e :

1. Vorrichtung zur mikroskopischen Untersuchung von Proben, insbesondere im Scan-Verfahren, umfassend eine abbildende Optik und einen Probenträger, wobei die abbildende Optik und die zu untersuchende Probe auf dem Probenträger relativ zueinander bewegbar sind, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Vorrichtung zur Kontrolle und gegebenenfalls Adjustierung der Fokusebene aufweist, wobei die Vorrichtung zur Kontrolle der Fokusebene um- fasst :

- eine Laserlichtquelle, die einen Laserstrahl erzeugt , der parallel zur optischen Achse der abbildenden Optik durch die abbildende Optik verläuft, so dass der Laserstrahl an der Grenzfläche zwischen Probenträger und der zu untersuchenden Probe total reflektiert wird,

- eine mit der Detektionseinrichtung gekoppelte Kontrolleinrichtung für die- Fokusebene, die vorzugsweise auch eine Adjustierungseinrichtung für die Fokusebene ist .

2. Vorrichtung nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Detektionseinrichtung eine 2-Segment-Photodiode umfasst .

3. Vorrichtung nach Anspruch 1 oder 2 , dadurch gekennzeichnet, dass die Kontrolleinrichtung einen Regler, der Informationen der Detektionseinrichtung verarbeitet , insbesondere ein Differenzsignal einer 2-Segment-Photodiode, umfasst .

4. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 3 , dadurch gekennzeichnet , dass die Kontrolleinrichtung eine Steuereinheit umfasst , die die Informationen der Detektionseinrichtung, insbesondere die über einen Regler verarbeiteten Informationen, die die Adjustierungseinrichtung ansteuert , weiterverarbeitet .

5. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 4 , dadurch gekennzeichnet, dass die Adjustierungseinrichtung ein piezogetrie- bener Nanopositionierer ist .

6. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 5 , dadurch gekennzeichnet , dass die Vorrichtung zur Kontrolle der Fokusebene eine Sammellinse umfasst , die den Laserstrahl der Laserlichtquelle auf die hintere Fokusebene der abbildenden Optik fokus- siert .

7. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 , dadurch gekennzeichnet, dass die Vorrichtung zur Kontrolle der Fokusebene einen Strahlenteiler zum Auskoppeln des reflektierten Laserstrahls aus dem Strahlengang aufweist .

8. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 7 , dadurch gekennzeichnet, dass sie als Fluoreszenzmikroskop ausgebildet ist .

9. Vorrichtung nach einem der Ansprüche 1 bis 8 , dadurch gekennzeichnet , dass der Laserstrahl im Randbereich der abbildenden Optik verläuft , so dass der Einfallswinkel an der Grenzfläche zwischen Probenträger und der zu untersuchenden Probe aresin (nl/n2 ) (nl = Brechungsindex des Probenmediums , n2 = Brechungsindex des Probenträgers ) oder größer ist, wobei der maximale Einfallswinkel durch die numerische Apertur (NA) der abbildenden Optik aresin (NA/n) (n = Brechungsindex des Probenträgers) limitiert ist .