JP6276749B2 - 蛍光受光装置および蛍光受光方法 - Google Patents

Description

本発明は、蛍光受光装置および蛍光受光方法に関するものである。

従来、空間光変調器（Spatial Light Modulator、以下「ＳＬＭ」）の一つである音響光学変調素子を用いて、試料上に複数のスポット光を生成する蛍光走査顕微鏡が知られている（例えば特許文献１および非特許文献１を参照）。例えば特許文献１の開示内容によれば、当該蛍光走査顕微鏡は、同時に走査する走査点の数、位置あるいは間隔等を光量ロスなく自由に変更することができ、画像取得時間の短縮だけでなく、用途に応じた観察をフレキシブルに行うことができるという効果を奏するとしている。

特開２００９−１０３９５８号公報

Yonghong Shao他、"Ultrafast,large-field multiphoton microcscopy based on an acousto-optic deflector and aspatial light modulator"、OPTICS LETTERS、Vol. 37、No.13、July 2012

蛍光走査顕微鏡の光学系にＳＬＭを導入し、ＳＬＭにＣＧＨ（Computer Generated Hologram）と呼ばれる位相分布や強度分布を示したパターンを呈示すると、対物レンズの集光点上に多点を生成させることができる。そのため、試料から励起された蛍光も複数点となる。これをマルチアノードの光電子増倍管等で受光することにより、多点計測が可能となる。しかし、集光位置における多点の光の強度の制御が大きな問題となる。これは、ＳＬＭで生成された多点にバラツキがあること、および観測側のマルチアノードの光電子増倍管等にも感度バラツキがあることに起因する。一方で、上記の特許文献１および非特許文献１の何れの文献においても、集光位置における多点の光の強度を制御することについては言及も示唆もない。

そこで、本発明は上記に鑑みてなされたもので、集光位置における多点の光の強度を制御することが可能な蛍光受光装置および蛍光受光方法を提供することを目的とする。

上記課題を解決するために、本発明の一側面に係る蛍光受光装置（蛍光検出装置）は、空間光変調器によって変調された励起光により発生する蛍光を検出する装置であって、励起光を出力する励起光源と、励起光が入力され、第１ホログラムを表現すること（呈示すること）により、励起光の位相および振幅の少なくともいずれか一方を変調し、変調光を出力する空間光変調器と、空間光変調器の後段に設けられ、変調光を試料に集光する集光光学系と、試料が載置される試料ステージと、変調光が試料に集光されることにより発生する蛍光を集光光学系を介して検出する蛍光検出器と、空間光変調器に第１ホログラムを表現させること（呈示させること）により、２次元配列された複数の画素それぞれにおいて励起光の位相および振幅の少なくとも何れか一方を変調させ、且つ変調光を集光光学系により試料の集光位置に集光させる制御部と、第１ホログラムを補正する補正部と、を備え、補正部は、蛍光検出器固有の受光位置ごとの感度情報および集光位置における蛍光の強度に基づき、第１ホログラムを補正することにより、第２ホログラムを生成し、制御部は、第２ホログラムを表現するように（呈示するように）空間光変調器を制御する。

また、本発明の一側面に係る蛍光受光方法（蛍光検出方法）は、空間光変調器により変調された励起光によって生じる蛍光を受光する（検出する）方法であって、励起光源から出力された励起光を空間光変調器に入力し、空間光変調器に第１ホログラムを表現させること（呈示させること）により、励起光の位相および振幅の少なくとも何れか一方を変調することにより得られた変調光を出力し、空間光変調器の後段に設けられた集光光学系により、変調光を試料に集光し、蛍光検出器により、変調光が試料に集光されることにより発生する蛍光を集光光学系を介して検出し、蛍光検出器固有の受光位置ごとの感度情報と集光位置における蛍光の強度に基づき、第１ホログラムを補正することにより、第２ホログラムを生成し、空間光変調器に第２ホログラムを表現させること（呈示させること）により、励起光の位相および振幅の少なくとも何れか一方を変調することにより得られた変調光を出力する。

このような本発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法によれば、制御部により最初に空間光変調器に呈示された第１ホログラムが補正部によって補正され、当該補正により新たに生成された第２ホログラムが制御部により再び空間光変調器に呈示される。つまり、補正部および制御部によりホログラムがフィードバックされることにより、当該ホログラムの補正が行われる。第２ホログラムは、集光位置における蛍光の強度および蛍光受光器固有の受光位置ごとの感度情報に基づき、第１ホログラムが補正されることにより得られ、この第２ホログラムにより、空間光変調器で生成された多点における強度バラツキが、蛍光受光器における感度バラツキが考慮された上で、例えば均一に制御される。ここで、ホログラムがフィードバック補正されることにより、試料に照射される位相変調光と試料から照射される蛍光とがそれぞれ例えば均一に制御される。特に、補正部による補正が、蛍光受光器固有の受光位置ごとの感度情報に基づき行われるため、蛍光受光器固有の受光位置ごとの場所依存の感度バラツキを認めながらも、当該感度バラツキによる影響を低減させることができる。

また、本発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法において、補正部による補正は、複数個の集光位置ごとに行われても良い。

この発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法によれば、補正部による補正が複数個の集光位置ごとに行われるため、空間光変調器およびホログラムにより生成された多点それぞれに当該補正を適用することができる。

この発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法では、励起光源は多光子励起を行うことができる短パルスレーザであってもよい。

この発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法は、多光子励起を行うことができる短パルスレーザを用いた場合に顕著に起こる、複数個の集光位置の強度バラツキに対して特に有用である。

また、本発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法において、蛍光検出器はマルチアノード型の光電子増倍管であっても良い。

この発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法によれば、マルチアノード型の光電子増倍管のような、場所依存の感度バラツキの存在する蛍光受光器に特に有用である。

また、本発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法において、試料は、試料に集光された変調光と試料から発生する蛍光の強度の比率において、場所依存のバラツキのない均質な蛍光材料からなっていても良い。

試料への変調光および試料からの蛍光の両方を例えば均一に強度制御する際に、場所依存のバラツキのない均質な蛍光材料を試料として用いることにより、計算量を減らすことができ、当該制御を簡易且つ好適に行うことができる。

また、本発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法において、補正部による補正は、集光光学系に含まれた対物レンズの光軸方向に沿った所定の間隔の走査層ごとに行われても良い。

これによれば、ある程度の深さを有する試料に対しても本発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法を適用させることができる。

また、本発明の一側面に係る蛍光受光装置および蛍光受光方法において、走査層ごとの走査は、空間光変調器によって、対物レンズの光軸方向における集光位置が制御されることにより行われても良い。

これによれば、走査層ごとの走査を好適に行うことができる。

本発明によれば、集光位置における多点の光の強度を制御することが可能な蛍光受光装置および蛍光受光方法を提供することができる。

蛍光受光装置１の全体的な構成を示す図である。 制御部２１および補正部２２のハードウェア構成図である。 本実施形態における多点走査を例示する図である。 補正部２２の機能構成図である。 蛍光受光器４０固有の受光位置ごとの感度バラツキを説明するための図である。 フィードバック補正の手順を示すフローチャートである。 本実施形態において、補正部２２が蛍光受光器４０固有の受光位置ごとの感度情報に基づきフィードバック補正を行うことにより、蛍光受光器４０固有の受光位置ごとの場所依存の感度バラツキを認めながらも、当該感度バラツキによる影響を低減させ、位相変調光Ｌ２および蛍光Ｌ３の強度を均一にしていることを説明するための図である。 本実施形態による効果を説明するための図である。 本実施形態によるフィードバック補正の実施回数（横軸）と、蛍光強度のバラツキ（縦軸）との間の関係を示す図である。

１…蛍光受光装置、１０…励起光源、１１…スペイシャルフィルタ、１２…コリメートレンズ、１３…ミラー、２０…空間光変調器、２１…制御部、２２…補正部、２２１…第１ホログラム入力部、２２２…受光器固有感度情報格納部、２２３…第２ホログラム生成部、３０…集光光学系、３１…両側テレセントリックレンズ系、３２…ダイクロイックミラー、３３…対物レンズ、３４…レンズ、９０…試料、９１…集光位置、９２…試料ステージ、Ｌ１…励起光、Ｌ２…位相変調光、Ｌ３…蛍光。

以下、添付図面を参照して本発明にかかる蛍光受光装置および蛍光受光方法の一実施形態を詳細に説明する。なお、図面の説明において同一の要素には同一の符号を付し、重複する説明を省略する。

（蛍光受光装置１の構成）
最初に、本実施形態に係る蛍光受光装置（蛍光検出装置）１の全体構成について説明する。図１は、蛍光受光装置１の全体的な構成を示す図である。この図に示される蛍光受光装置１は、励起光Ｌ１が変調され、変調光Ｌ２が集光されることにより試料９０から発生する蛍光Ｌ３を受光する装置であって、励起光源１０、スペイシャルフィルタ１１、コリメートレンズ１２、ミラー１３、空間光変調器２０、制御部２１、補正部２２、集光光学系３０、および蛍光受光器（蛍光検出器）４０を備えて構成さ、例えば、蛍光走査顕微鏡装置やＳＴＥＤ顕微鏡装置、ＰＡＬＭ、ＳＴＯＲＭなどである。

励起光源１０は、試料９０の集光位置９１に照射されるべき励起光Ｌ１を出力するものである。励起光源１０は、励起光Ｌ１としてレーザ光を出力しても良く、例えばフェムト秒レーザ光源、Ｎｄ:ＹＡＧレーザ光源等のパルスレーザ光源であっても良い。これに限らず、励起光源１０として、ＬＤ(Laser Diode)、ＳＬＤ（Super Luminescent Diode）、ハロゲンランプ、キセノンランプ等が用いられても良い。励起光源１０から出力された励起光Ｌ１は、スペイシャルフィルタ１１を経た後、コリメートレンズ１２によりコリメートされ、ミラー１３により反射されて、空間光変調器２０に入力される。なお、この構成に限らず、スペイシャルフィルタ１１とコリメートレンズ１２の組み合わせの代わりに、エキスパンダレンズ（図示せず）を備えても良い。この場合には、励起光源１０からの励起光Ｌ１がエキスパンダレンズによって広げられ、ミラー１３により反射されて、空間光変調器２０に入力される。

空間光変調器２０は、位相変調型のものであって、励起光Ｌ１を入力し、当該励起光Ｌ１を位相変調することにより得られた位相変調光Ｌ２を出力するものである。すなわち、空間光変調器２０は、励起光源１０から出力された励起光Ｌ１を入力し、２次元配列された複数の画素それぞれにおいて励起光Ｌ１の位相を変調するホログラムを用いて励起光Ｌ１を位相変調し、その位相変調後の位相変調光Ｌ２を出力する。この空間光変調器２０において用いられるホログラムは、数値計算により求められたホログラム（Computer Generated Hologram、以下「ＣＧＨ」）であっても良い。

この空間光変調器２０は、反射型のものであっても良く、透過型のものであっても良い。反射型の空間光変調器２０としては、ＬＣＯＳ（Liquid Crystal on Silicon）型のもの、ＭＥＭＳ（Micro Electro Mechanical Systems）型のもの、および光アドレス型のものの何れかが用いられても良い。また、透過型の空間光変調器２０としては、ＬＣＤ（Liquid Crystal Display）型のもの等が用いられても良い。更に、これに限らず、Segment Mirror型のもの、Continuous Deformable Mirror型のものが用いられても良い。

また、空間光変調器２０は、振幅（強度）変調型のものであって、励起光Ｌ１を入力し、当該励起光Ｌ１を振幅変調することにより得られた変調光Ｌ２を出力するものであってもよい。すなわち、空間光変調器２０は、励起光源１０から出力された励起光Ｌ１を入力し、２次元配列された複数の画素それぞれにおいて励起光Ｌ１の振幅を変調するホログラムを用いて励起光Ｌ１を振幅変調し、その振幅変調後の振幅変調光Ｌ２を出力する。振幅（強度）変調型の空間光変調器２０は、反射型でも透過型でもよく、テキサスインスツルメンツ社のＤＬＰを含むＭＥＭＳ（MicroElectro Mechanical Systems）型およびＬＣＤ（Liquid Crystal Display）型などの空間光変調器が挙げられる。この空間光変調器２０において用いられるホログラムは、数値計算により求められたホログラム（Computer Generated Hologram、以下「ＣＧＨ」）であっても良い。なお、図１では、空間光変調器２０として反射型で位相変調型の空間光変調器が例示され、以降、位相変調型の空間光変調器を用いた場合で説明する。

制御部２１は、空間光変調器２０にＣＧＨを表現させることにより、２次元配列された複数の画素それぞれにおいて励起光Ｌ１を変調させ、且つ変調光Ｌ２を集光光学系３０により試料９０の複数個の集光位置９１に集光させるものである。例えば、空間光変調器２０が位相変調型の空間光変調器の場合、制御部２１は、空間光変調器２０にＣＧＨを呈示させることにより、２次元配列された複数の画素それぞれにおいて励起光Ｌ１の位相を変調させ、且つ位相変調光Ｌ２を集光光学系３０により試料９０の複数個の集光位置９１に集光させるものである。特に、ＬＣＯＳ型など液晶を用いる空間光変調器では、空間光変調器２０にＣＧＨを表示することで、空間光変調器２０はＣＧＨを表現する。なお、空間光変調器２０がＣＧＨを表現するとは、空間光変調器２０がＣＧＨを呈示することや表示することを含む。実際の動作を行うために駆動部（図示せず）を別途備え、制御部２１が駆動部を操作することにより、上記位相変調および集光を行っても良い。この場合の駆動部は、制御部２１のＣＧＨを用いた制御のもとで、空間光変調器２０の２次元配列された複数の画素それぞれにおける位相変調量を設定し、画素ごとの位相変調量を示す信号を空間光変調器２０に与える。

ＣＧＨの作成は、フーリエ変換型およびフレネルゾーンプレート型の何れの手法により行っても良い。ＣＧＨの作成を制御部２１が行っても良く、別途のＣＧＨ作成部（図示せず）を備えても良い。フーリエ変換型はＧＳ法等のアルゴリズムによりホログラムを作成することができ、フレネルゾーンプレート型はＯＲＡ（optimal-rotation-angle）法等のアルゴリズムによりホログラムを作成することができる。なお、ＧＳ法については下記の参考文献１に記載されており、ＯＲＡ法については下記の参考文献２に記載されている。
＜参考文献１＞ R. W. Gerchberg and W. O.Saxton, "Apractical algorithm for the determination of phase from imageand diffractionplane pictures", Optik, Vol.35, pp.237-246 (1972).
＜参考文献２＞ Jorgen Bengtsson, "Kinoform designwith anoptimal-rotation-angle method", Applied Optics, Vol.33,No.29,pp.6879-6884 (1994).

図２は制御部２１のハードウェア構成図である。図２に示すように、制御部２１は、物理的には、ＣＰＵ２０１、ＲＯＭ２０２及びＲＡＭ２０３等の主記憶装置、キーボード及びマウス等の入力デバイス２０４、ディスプレイ等の出力デバイス２０５、空間光変調器２０等との間でデータの送受信を行うためのネットワークカード等の通信モジュール２０６、ハードディスク等の補助記憶装置２０７等を含む通常のコンピュータシステムとして構成される。制御部２１の各機能は、ＣＰＵ２０１、ＲＯＭ２０２、ＲＡＭ２０３等のハードウェア上に所定のコンピュータソフトウェアを読み込ませることにより、ＣＰＵ２０１の制御の元で入力デバイス２０４、出力デバイス２０５、通信モジュール２０６を動作させると共に、主記憶装置２０２，２０３や補助記憶装置２０７におけるデータの読み出し及び書き込みを行うことで実現される。

図１に戻り、集光光学系３０は、空間光変調器２０の後段に設けられ、画素毎に位相変調された位相変調光Ｌ２を試料９０に集光するものである。図１の例において集光光学系３０は、両側テレセントリックレンズ系３１、ダイクロイックミラー３２、対物レンズ３３、レンズ３４を備えて構成される。空間光変調器２０からの位相変調光Ｌ２は、両側テレセントリックレンズ系３１およびダイクロイックミラー３２によって対物レンズ３３まで転送され、試料ステージ９２上に載置された試料９０を多点で照射する。染色された試料９０からは、光照射によって蛍光Ｌ３が発生し、その蛍光Ｌ３の一部は対物レンズ３３、ダイクロイックミラー３２、レンズ３４を介して蛍光受光器４０に入射する。

試料９０への光照射は、ガルバノスキャナーや共振ミラー、ポリゴンミラーなどのスキャナーと光軸方向に動くステージあるいは対物レンズを用いて走査しても良く、ステージが光軸に対して垂直な面と光軸方向に動く３軸ステージを用いて走査しても良い。また、図１の対物レンズ３３が走査のために動いても良い。更に、試料９０へ照射するレンズは対物レンズに限らず、一般的なレンズやＦθレンズでも良い。以上のような構成により、図３に例示するような多点走査を行なうことができ、高速に画像を取得することが可能となる。図３は本実施形態における多点走査を例示する図である。図３（ａ）は多点を１次元で配列したものを例示し、図３（ｂ）は多点を２次元で配列したものを例示する。それぞれの例において多点を用いてスキャンしており、まず、横方向をスキャンし、次に縦方向に１行移動してスキャンする（ラスタスキャン）。なお、ラスタスキャンに限らず、多点を用いた種々のスキャン手法が用いられても良い。

図１に戻り、蛍光受光器４０は、位相変調光Ｌ２が試料９０に集光されることにより発生する蛍光Ｌ３を集光光学系３０を介して受光するものであり、例えばマルチアノード型の光電子増倍管（ＰＭＴ）により構成することができる。なお、これに限らず、蛍光受光器４０として、フォトマルチプライヤーチューブ、ＣＣＤやＣＭＯＳイメージセンサ等の２次元撮像装置、アバランシェフォトダイオードアレイ、フォトダイオードアレイ等の２次元検出器を用いてもよい。蛍光受光器４０は、受光器固有の場所依存の感度バラツキが存在するものであっても良い。また、蛍光受光部４０の前にピンホール（図示せず）を配置し、コンフォーカル効果を持たせても良い。

補正部２２は、制御部２１により空間光変調器２０にすでに呈示されたＣＧＨを補正するものである。補正部２２は制御部２１と同様のハードウェア構成（図２参照）を有する。制御部２１と補正部２２とが同じコンピュータシステム内に存在していても良い。図４は、補正部２２の機能構成図である。図４に示されるように、補正部２２は第１ホログラム入力部２２１、受光器固有感度情報格納部２２２、第２ホログラム生成部２２３を備えて構成される。

第１ホログラム入力部２２１は、制御部２１により空間光変調器２０にすでに呈示されたＣＧＨであって、補正前のＣＧＨを入力する。第１ホログラム入力部２２１が入力するＣＧＨが第１ホログラムである。第１ホログラム入力部２２１は、入力した第１ＣＧＨを第２ホログラム生成部２２３に出力する。

受光器固有感度情報格納部２２２は、蛍光受光器固有の受光位置ごとの感度情報（以下、「受光器固有感度情報」）を予め取得し格納するものである。図５は、２光子励起蛍光顕微鏡における受光器固有感度情報を説明するための図である。図５の例において、蛍光受光器４０には受光器固有の場所依存の感度バラツキが存在する。つまり、蛍光受光器４０が例えばマルチアノード型のＰＭＴであれば、複数のアノード間で感度バラツキが存在する。図５（ａ）に示すような受光面の場所にかかわらず均一な光を入射したときに、アノードのユニフォミティに感度バラツキがあると、蛍光受光器４０において検出された蛍光の強度情報は図５（ｂ）のようになる。つまり、強度１００の均一な蛍光Ｌ３が入射したとしても、蛍光受光器４０の場所によって例えば強度８２、９５、９７、１００の異なる強度として当該蛍光Ｌ３が検出される。

また、図５（ｄ）に示すように、蛍光受光器４０において検出された蛍光Ｌ３の強度が均一であっても、実際に入射された蛍光Ｌ３は図５（ｃ）に示すように不均一なものである場合がある。つまり、蛍光受光器４０において検出された蛍光Ｌ３の強度が例えば強度１００で均一な場合には、空間光変調器２０は実際には例えば強度１００、８６、８４、８２の不均一な光を照射していたことになる。言い換えれば、蛍光受光器４０において検出された蛍光Ｌ３の強度が均一な場合に、これは蛍光受光器４０の固有の場所依存の感度バラツキを考慮しない場合には一見入射された蛍光Ｌ３が均一なものと思われがちである。しかし、蛍光受光器４０の固有の場所依存の感度バラツキを考慮すると、入射された蛍光Ｌ３は実は、不均一なものであったことになる。

受光器固有感度情報格納部２２２は、所定の均一な強度の蛍光を入射した場合の、蛍光受光器４０固有の受光位置ごとの感度情報を予め取得し格納する。具体的には、励起光源１０から射出した光をエキスパンダレンズ等で広げて、強度が略均一な平行光を２次元イメージセンサである蛍光受光器４０に入射させ、蛍光受光器４０の感度ムラを予め調査する。この調査によって、均一な光（蛍光）が入射したときに、蛍光受光器４０で得られる多点のそれぞれの強度を「受光器固有感度情報」として記録する。なお、感度バラツキを観察するために、光の強度を複数回に渡って変更することにより、受光器固有感度情報の束である「受光器固有感度マップ」を作成しても良い。

第２ホログラム生成部２２３は、励起状態、集光位置における蛍光Ｌ３の強度、および受光器固有感度情報格納部２２２に格納された受光器固有感度情報に基づき、第１ＣＧＨをフィードバック補正することにより、第２ＣＧＨを生成するものである。第２ホログラム生成部２２３は、生成した第２ＣＧＨを制御部２１に出力する。第２ホログラム生成部２２３により生成され制御部２１に出力されるＣＧＨが第２ホログラムである。制御部２１は、第２ＣＧＨを入力し、空間光変調器２０に呈示する。つまり、制御部２１が空間光変調器２０に呈示したホログラムが補正部２２によりフィードバック補正され、補正後のホログラムが再び制御部２１により空間光変調器２０に呈示される。これは、試料９０に照射される多点の強度バラツキが所定の閾値以下になるまで繰り返される。または、フィードバック補正の実施回数が所定の閾値以上になるまで繰り返される。

（フィードバック補正の手順）
続いて、第１ホログラムがフィードバック補正され、第２ホログラムが生成される際の手順について詳細に説明する。図６は、この手順を示すフローチャートである。

最初に、受光器固有感度情報格納部２２２が、所定の均一な強度の光を入射した場合の受光器固有感度情報を予め取得し格納しておく（ステップＳ１）。

次に、制御部２１の制御のもとで、第１ＣＧＨが設計される（ステップＳ２）。

次に、制御部２１の制御のもとで、第１ＣＧＨが空間光変調器２０に呈示されることで、空間光変調器２０は第１ＣＧＨを表現する。これにより、励起光Ｌ１は第１ＣＧＨに対応した位相分布を持つ位相変調光Ｌ２となり、この生成された位相変調光Ｌ２が試料９０に多点照射される（ステップＳ３）。

次に、ステップＳ３の照射によって生じた蛍光Ｌ３を蛍光受光器４０が撮像し、当該蛍光の強度情報を取得する（ステップＳ４）。

次に、補正部２２（第２ホログラム生成部２２３）が、ステップＳ４で取得した蛍光Ｌ３の強度情報におけるバラツキを算出する。強度バラツキの算出には、Peak-to-valley (PV)法やRMS (Root Mean Square error)法を用いる。このとき、ステップＳ１で予め取得して格納した受光器固有感度情報を考慮して、ステップＳ４で取得した蛍光Ｌ３の強度のバラツキを算出する。例えば、ステップＳ４で取得した蛍光Ｌ３の強度情報と、ステップＳ１で取得した受光器固有感度情報とが同等であれば、強度バラツキはゼロであると言える。なお、ステップＳ１で取得した受光器固有感度情報を考慮する際には、Peak-to-valley (PV)法やRMS (Root Mean Square error)法の評価がある一定の範囲内にあるかないかを更に判別するようにしても良い。（ステップＳ５）

次に、ステップＳ５で算出した強度バラツキが所定の閾値以下である場合には（ステップＳ６：ＹＥＳ）、処理を終了する。一方、ステップＳ５で算出した強度バラツキが所定の閾値以下でない場合には（ステップＳ６：ＮＯ）、処理の流れはステップＳ７に移行し、蛍光強度を制御するために、第２ホログラム生成部２２３が第１ＣＧＨを再設計して第２ＣＧＨを生成する。なお、本実施形態では、蛍光強度を制御する一つの態様として、蛍光強度を均一化することとする。そして、処理の流れはステップＳ３に移行され、ステップＳ３〜ステップＳ６が繰り返される。なお、ステップＳ６の判断においては、ステップＳ５で算出した強度バラツキが所定の閾値以下であるか否かを判断する変わりに、フィードバック補正の実施回数が所定の閾値以上であるか否かを判断しても良い。

（ＣＧＨ再設計の手順、その１）
ここで、第１ＣＧＨを再設計して第２ＣＧＨを生成する方法（ステップＳ７）について説明する。

最初に、第２ホログラム生成部２２３が、ステップＳ４で取得した蛍光Ｌ３の強度バラツキに基づき、ＣＧＨ設計にフィードバックするための補正係数Ｖｋを下記の式（１）より導出する。
ただし、ｍは多点の位置、ｋはフィードバック回数、ｑはステップＳ４で取得した蛍光Ｌ３の強度、ｎは光子の数である。上記式（１）からわかるように、補正部２２による補正は、複数個の集光位置ごとに行われる（ステップＳ７１）。また、上記式（１）では、ｎ光子吸収過程によって補正係数Ｖｋが変化する。

次に、第２ホログラム生成部２２３が、ステップＳ７１で導出した補正係数Ｖｋを用いて、第１ＣＧＨを再設計して第２ＣＧＨを生成する。例えば、反復フーリエ変換法の一種であるOver Compensation（ＯＣ）法では、ターゲットパターン（多点の位置や強度を示したパターン）をイタレーションごとにウェイトを用いて変更するので、ＯＣ法での第２ＣＧＨにおけるターゲットパターンは下記の式（２）のようになる。
ただし、ｌはＯＣ法のイタレーション回数、
はＯＣ法で用いられるウェイト、Ｔgoal（ｍ）はターゲットパターン、ｓ（ｍ）は受光器固有感度情報を考慮した係数である（ステップＳ７２）。

（ＣＧＨ再設計の手順、その２）
続いて、第１ＣＧＨを再設計して第２ＣＧＨを生成する別の方法（ステップＳ７）について説明する。

上述のＣＧＨ再設計の手順その１においては、補正係数Ｖｋに係数ｓ（ｍ）が考慮されておらず、フィードバック時に係数ｓ（ｍ）が適用された。一方で、ＣＧＨ再設計の手順その２では、係数ｓ（ｍ）が補正係数Ｖｋに最初から考慮されている点で異なる。

すなわち、最初に、第２ホログラム生成部２２３が、ステップＳ４で取得した蛍光Ｌ３の強度バラツキに基づき、ＣＧＨ設計にフィードバックするための補正係数Ｖｋを下記の式（３）より導出する。
式（１）の場合と同様に、式（３）を用いた場合でも、補正部２２による補正は、複数個の集光位置ごとに行われる（ステップＳ７３）。

次に、第２ホログラム生成部２２３が、ステップＳ７３で導出した補正係数Ｖｋを用いて、第１ＣＧＨを再設計して第２ＣＧＨを生成する。例えば、反復フーリエ変換法の一種であるOver Compensation（ＯＣ）法では、ターゲットパターン（多点の位置や強度を示したパターン）をイタレーションごとにウェイトを用いて変更するので、ＯＣ法での第２ＣＧＨにおけるターゲットパターンは下記の式（４）のようになる（ステップＳ７４）。

（係数ｓ（ｍ）の算出方法）
以下、ステップＳ７２およびステップＳ７３における２光子励起蛍光顕微鏡における係数ｓ（ｍ）の算出方法について詳細に説明する。以下の説明においては、ステップＳ１で取得した受光器固有感度情報が例えば図５（ｂ）だったものとする。

最初に、ステップＳ１で取得した受光器固有感度情報の４乗根を求める。この演算は、２光子励起蛍光顕微鏡では位相変調光Ｌ２の強度は振幅の２乗であり、蛍光Ｌ３の強度は位相変調光Ｌ２の強度の２乗であることに起因する。求めた４乗根を下記の式（５）に示す（ステップＳ７３１）。

次に、式（５）における最小の要素で各要素を割る。その演算結果を下記の式（６）に示す（ステップＳ７３２）。

次に、式（６）における各要素の逆数を計算する。その計算結果を下記の式（７）に示す（ステップＳ７３３）。

次に、式（７）を規格化することにより、ステップＳ７２およびステップＳ７３における係数ｓ（ｍ）が最終的に算出される。算出された係数ｓ（ｍ）を下記の式（８）に示す（ステップＳ７３４）。

以上により算出した係数ｓ（ｍ）をステップＳ７２およびステップＳ７３にて用いることにより、ＣＧＨ再設計の手順その１およびその２を実行することができる。

なお、ｎ光子励起蛍光顕微鏡の場合には、位相変調光Ｌ２の強度は振幅の２乗であり、蛍光Ｌ３の強度は位相変調光Ｌ２の強度のｎ乗であることを利用する。例えば、１光子励起蛍光顕微鏡の場合には、位相変調光Ｌ２の強度は振幅の２乗であり、蛍光Ｌ３の強度は位相変調光Ｌ２の強度の１乗、つまり蛍光Ｌ３の強度は位相変調光Ｌ２の強度と同じである。また、例えば、３光子励起蛍光顕微鏡の場合には、位相変調光Ｌ２の強度は振幅の２乗であり、蛍光Ｌ３の強度は位相変調光Ｌ２の強度の３乗である。

なお、蛍光L３の強度、すなわちqの導出方法については、受光器固有感度情報（例えば図５（ｂ））の代わりに、蛍光受光器４０によりステップＳ４で取得した蛍光Ｌ３の強度情報を用いて、上述のステップＳ７３１〜ステップＳ７３４と同様の演算を行うことによって算出することができる。

以上で説明したステップＳ１〜ステップＳ７を実行することにより、試料９０に照射される位相変調光Ｌ２、および試料９０から射出される蛍光Ｌ３を両方とも例えば均一に制御することができる。ここで、試料９０に照射される位相変調光Ｌ２と試料９０から照射される蛍光Ｌ３とをそれぞれ均一にするために、どの位置に照射されても励起光強度が同じであれば、同じ強度の蛍光が得られるような均質な蛍光材料を試料９０として用いても良い。つまり、試料９０に集光された位相変調光Ｌ２対試料９０から発生する蛍光Ｌ３の強度の比率において、場所依存のバラツキのない均質な蛍光材料からなるものを、本実施形態における試料９０として用いても良い。

なお、蛍光受光器４０固有の受光位置ごとの場所依存の感度バラツキを均一にするために、画像処理等によるシェーディング補正を更に施しても良い。これにより、フィードバック補正の実施回数を減らすことができる。

ここまでの設計方法は、OC法に従って説明をしたが、CGH設計方法は、OC法に限らない。OC法が含まれる反復フーリエ変換法や、シミュレーティドアニーリング、Optimal rotation angle method (ORA法)や遺伝的アルゴリズムなどの１画素の変化に着目する方法、複素振幅の形で足し合わせる重ね合わせ方法などもCGH設計方法として採用できる。以上列挙した何れの手法でも、フィードバック時には上記式（１）または式（３）が用いられる。

（ｚ−ｓｔａｃｋ）
以上で説明した補正部２２による補正は、集光光学系３０に含まれた対物レンズ３３の光軸方向に沿った所定の間隔の走査層ごとに行われても良い。以下では、走査層ごとの補正を実現するためのｚ−ｓｔａｃｋについて説明する。ｚ−ｓｔａｃｋとは、試料９０の奥行き方向をずらして画像を撮像することで、３次元画像を得ることをいう。ｚ−ｓｔａｃｋは、（ａ）空間光変調器２０にフレネルレンズパターンを呈示する方法、（ｂ）蛍光受光装置１を含む蛍光走査顕微鏡装置のＺステージを移動させる方法、（ｃ）対物レンズ３３そのものを移動させる方法、（ｄ）これらの組み合わせ、によって、対物レンズ３３の光軸方向に沿った所定の間隔で走査層を移動させることにより実現される。

以下、ｚ−ｓｔａｃｋを行う際の処理手順について説明する。なお、以下の説明では、空間光変調器２０に呈示する多点を生成するためのＣＧＨにフレネルレンズを加えることで、つまり上記方法（ａ）で、対物レンズ３３の光軸方向における深さ方向の制御を行い、且つ３つの深さＤ１、Ｄ２、Ｄ３で走査層を移動させてスキャンを行う例について説明する。

最初に、多点を生成するためのＣＧＨを設計する（ステップＳ１０１）。

次に、ステップＳ１０１で設計したＣＧＨに深さＤ１を観察するためのフレネルレンズを加える（ステップＳ１０２）。

次に、ステップＳ１０２で合成されたＣＧＨに、必要に応じて、収差補正パターンを更に加える（ステップＳ１０３）。

次に、ステップＳ１０３で合成されたＣＧＨを空間光変調器２０に呈示することで、空間光変調器２０はステップＳ１０３で合成されたＣＧＨを表現し、生成した多点を均質な試料９０に照射する（ステップＳ１０４）。

次に、試料９０から発生した蛍光像をマルチアノード型のＰＭＴ、カメラ等で撮像する（ステップＳ１０５）。

次に、検出した蛍光強度のバラツキを調べる。バラツキの算出には、Peak-to-valley (PV)法やRMS (Root Mean Square error) 法を用いる。このとき、集光点の中心を中心とした観察領域を設け、その中の強度の合計におけるバラツキを調べても良い。また、生体を考慮した収差補正を行うために意図的に大きな収差を加えて観察する場合には、収差によって広がったスポット全体を網羅するように観察領域を設けても良い。ここで、「意図的に大きな収差」とは、媒質の屈折率をｎ、媒質の入射面からレンズの焦点までの深さをｄ、媒質によって発生する収差をΔｓとした場合に、例えば、「ｎ×ｄ-Δｓ」以上、且つ「ｎ×ｄ＋Δｓ」以下の範囲における収差をいう。なお、これに限らず、観測対象と浸液等との屈折率のミスマッチングで発生する球面収差、対象物の形状によって発生する非点収差等を予めシミュレーションまたはシャックハルトマンセンサ等を用いて測定して、これらを更に考慮した範囲における収差を上記「意図的に大きな収差」としても良い（ステップＳ１０６）。

ステップＳ１０６で算出したバラツキが許容の範囲内ならば処理を終了する（ステップＳ１０７）。

ステップＳ１０６で算出したバラツキが許容の範囲外であるならば、ステップＳ１０１で設計したＣＧＨを初期位相としてＣＧＨの再設計を行なう。つまり、ステップＳ１０１で設計したＣＧＨを第１ＣＧＨとし、上述したＣＧＨ再設計の手順その１、その２、および係数ｓ（ｍ）の算出方法を用いて第２ＣＧＨを生成する（ステップＳ１０８）。

次に、ステップＳ１０４〜ステップＳ１０８を繰り返し、ステップＳ１０６で算出したバラツキが許容の範囲内になるまで繰り返しを継続し、深さＤ１に対する最適なＣＧＨを設計する。この繰り返しにおいて、ステップＳ１０２およびステップＳ１０３は除外される。つまり、ステップＳ１０２およびステップＳ１０３の手順は深さごとに１回のみ行われる（ステップＳ１０９）。

次に、深さをＤ２に変えて、ステップＳ１０１〜ステップＳ１０９の処理を行う。また、深さをＤ３に変えて、ステップＳ１０１〜ステップＳ１０９の処理を行う。

最終的に、深さごとに最適化されたＣＧＨをそれぞれの深さで呈示してｚ−ｓｔａｃｋにおける走査を行なう。

以上の説明においては、ｚ−ｓｔａｃｋを行うための方法として上記の方法（ａ）の場合を説明した。つまり、空間光変調器２０によって、対物レンズ３３の光軸方向における集光位置が制御されることで、走査層ごとの走査が行われる場合を説明した。これに限らず、上記の方法（ｂ）および（ｃ）の場合にも以上と同様の手順を適用することができる。なお、方法（ａ）ではフレネルレンズパターンを変えることにより深さを変更していたが、方法（ｂ）の場合にはＺステージを移動させ、且つ方法（ｃ）の場合には対物レンズ３３を移動させることにより深さを変更する。

空間光変調器２０の特性や集光光学系３０の調整ミス等によって蛍光強度が均一にならなかったことから、本実施形態では、フィードバック補正を行なうことで、これらの問題が補正されたＣＧＨを設計し、それを空間光変調器２０に再呈示させている。しかし、ｚ−ｓｔａｃｋを行なうためにＺ軸を移動した場合には、集光過程にある媒質の状態が光学的に変化することによって光学系が変化するために、折角フィードバック補正によって制御された蛍光強度の均一性が崩れてしまう恐れがある。更に、フレネルレンズパターンを用いてｚ−ｓｔａｃｋを実現した場合には、フレネルレンズパターンが加えられることにより、折角求めた最適なＣＧＨがこれ以上もう最適なＣＧＨでなくなってしまうことがある。また、高ＮＡの対物レンズ等で対象物を観察する場合には、対物レンズから対象物までの間に様々な屈折率の異なる媒質が存在し、それらにより収差が発生する。収差を補正するためには、空間光変調器２０に収差補正パターンを呈示することが考えられるが、その結果最適なＣＧＨになるための条件がまた変化してしまう。

以上の課題に対応するために、本実施形態では、最初に設計したＣＧＨにフレネルレンズパターンや収差補正パターンを足し合わせ、更に、フレネルレンズパターンや収差補正パターンはフィードバック補正には用いないこととしている。これにより、収差を収差補正パターンによって補正するとともに、フレネルレンズパターンや収差補正パターンが固定された上で、フィードバック補正が行われる。したがって、フレネルレンズパターンが加えられること等によりＺ軸が移動し媒質の光学的な状態および光学系の変化が発生する場合や、高ＮＡの対物レンズ等の光学系または伝搬過程に存在する媒質での屈折率の相違等により収差が発生した場合でも、当該収差を補正するとともに、フィードバック補正によって得られる蛍光強度の均一性を維持することができる。

また、本実施形態の蛍光受光装置１によれば、最初に空間光変調器２０によって表現される第１ＣＧＨが補正部２２によって補正され、当該補正により新たに生成された第２ＣＧＨが空間光変調器２０によって改めて表現される。つまり、補正部２２および制御部２１によりホログラムがフィードバックされることにより、当該ホログラムの補正が行われる。第２ＣＧＨは、励起状態、集光位置における蛍光Ｌ３の強度および受光器固有感度情報に基づき、第１ＣＧＨが補正されることにより得られ、この第２ＣＧＨにより、空間光変調器２０で生成された多点における強度バラツキが、蛍光受光器４０における感度バラツキが考慮された上で、例えば均一に制御される。ここで、ホログラムがフィードバック補正されることにより、試料９０に照射される位相変調光Ｌ２と試料９０から照射される蛍光Ｌ３とがそれぞれ例えば均一に制御される。特に、補正部２２による補正が、受光器固有感度情報に基づき行われるため、蛍光受光器４０固有の受光位置ごとの場所依存の感度バラツキを認めながらも、当該感度バラツキによる影響を低減させることができる。

図７は、本実施形態における思想を別の側面で説明するための図である。図７（ａ）は、図５（ａ）および（ｂ）を用いて上記説明したように、入射された蛍光Ｌ３が均一なものと一見思われがちであるものの、蛍光受光器４０の固有の場所依存の感度バラツキを考慮すると、入射された蛍光Ｌ３は実は、不均一なものであったことをイメージする。図７（ａ）においては、試料９０の集光位置９１および蛍光受光器４０の受光位置４１における丸の大きさで強度の度合いを示している。すなわち、試料９０の集光位置９１においては丸の大きさが異なっており、これは集光位置９１における光の強度が不均一であることを示す。一方、蛍光受光器４０の受光位置４１においては丸の大きさが同一であり、これは受光位置４１において光の強度が一見均一に見えることを示す。

一方、図７（ｂ）は、図５（ｃ）および（ｄ）を用いて上記説明したように、蛍光受光器４０にて検出される蛍光の強度は不均一であるものの、試料９０に入射する位相変調光Ｌ２および蛍光Ｌ３の強度は均一であることをイメージする。これは、本実施形態の補正部２２が受光器固有感度情報に基づきフィードバック補正を行うことにより、蛍光受光器４０固有の受光位置ごとの場所依存の感度バラツキを認めながらも、当該感度バラツキによる影響を低減させ、位相変調光Ｌ２および蛍光Ｌ３の強度を均一にしていることを意味する。

以下、本実施形態による効果について実例を示して説明する。すなわち、この実例においては試料９０としてrAcGFP1溶液を用い、蛍光受光装置１による多点照射を行った。その結果を図８に示す。図８（ａ）は、フィードバック補正を行う前の蛍光画像を示す。図８（ａ）では中心部に比べて右上部の蛍光強度が低くなっており、また目視では確認しにくいものの、場所に依存する強度バラツキが中央付近にも存在する。なお、図８においては、蛍光の強度を明るさで示している。図８（ｂ）は、本実施形態にかかるフィードバック補正を行った蛍光画像を示す。図８（ａ）とは異なり、場所に依存する強度バラツキが低減されていることがわかる。なお、図８は、受光器固有感度情報を考慮した上で、各受光位置で検出した蛍光の強度を示している。

図９は、本実施形態によるフィードバック補正の実施回数（横軸）と、蛍光強度のバラツキ（縦軸）との間の関係を示す図である。バラツキの評価関数としては、上述したようにPeak-to-valley (PV)法やRMS (Root Mean Square error) 法を用いた。なお、PV法とRMS法における算出バラツキはそれぞれ下記の式（９）、（１０）でそれぞれ表すことができる。
ただし、ｑ（ｍ）はｍ番目の蛍光の観察領域における蛍光の総和であり、ｑｍａｘ、ｑｍａｘ、ｑｄｅｓｉｒｅｄはそれぞれ最大、最小、所望の蛍光強度である。図９に示されるように、補正前（フィードバック補正の実施回数＝０）にＰＶ＝２６％、ＲＭＳ＝１０％だったものが、６回のフィードバック補正後にはＰＶ＝３％、ＲＭＳ＝１％と大幅に改善していることが確認できる。

また、本実施形態では、試料９０を置いて蛍光Ｌ３を検出している。ここで、試料９０を置いて蛍光を検出するメリットは以下の通りである。すなわち、rACGFP溶液やクマリンエタノール等の蛍光強度が均一に得られる媒質を試料９０として用いて、一度補正を行なえば、その後、細胞等を試料として用いた場合でも均一なデータが得られることが一つ目のメリットである。二つ目のメリットとしては、試料を用いることで、実際に計測する光学系を用いることができるので、光学系全体の補正が可能であるということが挙げられる。三つ目のメリットとしては、観察する条件に近い屈折率を持つ均質媒質を用意することで、球面収差補正やレンズパターンを適用した状態で均一化が可能であるということが挙げられる。なお、試料９０と観察媒質の屈折率が極端に異なると集光像がボケてしまい、ＳＮが下がるため、均一化の精度が低下する恐れがある。したがって、試料９０の屈折率を観察媒質の屈折率にある程度合わせるようにしても良い。更に、OC法は最適化法であり、局所解に陥るのを防ぐために初期位相にランダム位相が用いられることが多い。その結果、第１ホログラムごとに、生成される多点のバラツキの分布が異なる。または、同じ初期位相を用いてもターゲットパターンにおける多点の位置や強度が変化すると、第１ホログラムによって生成される多点のバラツキの分布が異なる。蛍光強度が均一に得られる媒質を試料９０として用いることで、ホログラム起因のバラツキを明確に把握できることが四つ目のメリットである。

また、本実施形態によれば、補正部２２による補正が複数個の集光位置ごとに行われるため、空間光変調器２０およびホログラムにより生成された多点それぞれに当該補正を適用することができる。

この発明は、多光子励起を行うことができる短パルスレーザを励起光源１０に用いた場合に起こる、複数個の集光位置の強度バラツキに対して特に有用である。このような励起光源１０としては、ナノ秒以下のパルス幅を有し、波長が６５０ｎｍ以上の短パルスレーザを出射できる光源が好ましい。

また、本実施形態は、マルチアノード型の光電子増倍管のような、場所依存の感度バラツキの存在する蛍光受光器４０に特に有用である。

また、本実施形態によれば、試料９０への位相変調光Ｌ２および試料９０からの蛍光Ｌ３の両方を例えば均一に強度制御する際に、場所依存のバラツキのない均質な蛍光材料を試料９０として用いることにより、計算量を減らすことができ、当該制御を簡易且つ好適に行うことができる。

また、本実施形態によれば、補正部２２による補正は、集光光学系３０に含まれた対物レンズ３３の光軸方向に沿った所定の間隔の走査層ごとに行われるため、ある程度の深さを有する試料９０に対しても本実施形態を適用させることができる。

また、本実施形態によれば、空間光変調器２０が対物レンズ３３の光軸方向における集光位置を制御することで走査層ごとの走査を行うため、走査層ごとの走査を好適に行うことができる。

なお、試料として、実際の測定試料の屈折率に近い屈折率を有し、蛍光物質などの溶質の濃度が均一なキャリブレーション試料を用いてもよい。このようなキャリブレーション試料を用いると、蛍光強度の均一性を保つことができる。

本発明は、集光位置における多点の蛍光の強度を制御することができる蛍光受光装置および蛍光受光方法を提供する。

Claims (8)

1. 位相変調された励起光が集光されることにより試料から発生する蛍光を受光する蛍光受光装置であって、
   前記励起光を出力する励起光源と、
   前記励起光を入力し、前記励起光を位相変調することにより得られた位相変調光を出力する位相変調型の空間光変調器と、
   前記空間光変調器の後段に設けられ、前記位相変調光を前記試料に集光する集光光学系と、
   前記試料が載置される試料ステージと、
   前記位相変調光が前記試料に集光されることにより発生する蛍光を前記集光光学系を介して受光する蛍光受光器と、
   前記空間光変調器に第１ホログラムを表示することにより、２次元配列された複数の画素それぞれにおいて前記励起光の位相を変調させ、且つ前記位相変調光を前記集光光学系により前記試料の複数個の集光位置に集光させる制御部と、
   前記第１ホログラムを補正する補正部と、
   を備え、
   前記補正部は、
   前記第１ホログラムを入力する第１ホログラム入力部と、
   前記蛍光受光器固有の受光位置ごとの感度情報を予め取得し格納する受光器固有感度情報格納部と、
   前記集光位置における前記蛍光の強度および前記受光器固有感度情報格納部に格納された前記感度情報に基づき、前記第１ホログラムを補正することにより、第２ホログラムを生成する第２ホログラム生成部と、
   を備え、
   前記制御部は前記空間光変調器に前記第２ホログラムを表示する、蛍光受光装置。
2. 前記補正部による前記補正は、前記複数個の集光位置ごとに行われる、請求項１に記載の蛍光受光装置。
3. 前記励起光源は、多光子励起を行うことができる短パルスレーザである、請求項１または２に記載の蛍光受光装置。
4. 前記蛍光受光器はマルチアノード型の光電子増倍管である、請求項１〜３の何れか１項に記載の蛍光受光装置。
5. 前記試料は、前記試料に集光された前記位相変調光対前記試料から発生する前記蛍光の強度の比率において、場所依存のバラツキのない均質な蛍光材料からなる、請求項１〜４の何れか１項に記載の蛍光受光装置。
6. 前記補正部による前記補正は、前記集光光学系に含まれた対物レンズの光軸方向に沿った所定の間隔の走査層ごとに行われる、請求項１〜５の何れか１項に記載の蛍光受光装置。
7. 前記走査層ごとの走査は、前記空間光変調器によって、前記対物レンズの前記光軸方向における集光位置が制御されることにより行われる、請求項６に記載の蛍光受光装置。
8. 位相変調された励起光が集光されることにより、試料ステージに載置された試料から発生する蛍光を受光する蛍光受光装置における蛍光受光方法であって、
   励起光源が、前記励起光を出力するステップと、
   位相変調型の空間光変調器が、前記励起光を入力し、前記励起光を位相変調することにより得られた位相変調光を出力するステップと、
   前記空間光変調器の後段に設けられた集光光学系が、前記位相変調光を前記試料に集光するステップと、
   蛍光受光器が、前記位相変調光が前記試料に集光されることにより発生する蛍光を前記集光光学系を介して受光するステップと、
   制御部が、前記空間光変調器に第１ホログラムを表示することにより、２次元配列された複数の画素それぞれにおいて前記励起光の位相を変調させ、且つ前記位相変調光を前記集光光学系により前記試料の複数個の集光位置に集光させるステップと、
   補正部が、前記第１ホログラムを補正するステップと、
   を備え、
   前記補正部が前記第１ホログラムを補正するステップは、
   第１ホログラム入力部が、前記第１ホログラムを入力するステップと、
   受光器固有感度情報格納部が、前記蛍光受光器固有の受光位置ごとの感度情報を予め取得し格納するステップと、
   第２ホログラム生成部が、前記集光位置における前記蛍光の強度および前記受光器固有感度情報格納部に格納された前記感度情報に基づき、前記第１ホログラムを補正することにより、第２ホログラムを生成するステップと、
   を備え、
   前記制御部が、前記空間光変調器に前記第２ホログラムを表示するステップを更に備える、蛍光受光方法。