CN106133580A - 受激发射损耗显微镜装置 - Google Patents

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Abstract

STED显微镜装置(1A)包括输出STED光(LS1)的STED光源(11)、输出激励光(LE1)的激励光源(12)、呈现用于通过相位调制将STED光(LS1)成形为圆环状的相位图案的相位调制型的SLM(13)、用于向观察对象区域照射激励光(LE2)和相位调制后的STED光(LS2)的光学系统(15A)、对从观察对象区域产生的荧光(PL)进行检测的检测器(16)、以及控制相位图案的控制部(17a)。控制部(17a)为了控制相位调制后的STED光(LS2)的圆环的内径而设定相位图案。由此，实现了在分辨率和所需时间方面能够提高使用者的便利性的STED显微镜装置。

Description

受激发射损耗显微镜装置
技术领域
本发明的一个方面涉及受激发射损耗显微镜装置。
背景技术
在非专利文献1中记载有涉及受激发射损耗(Stimulated Emission Depletion：STED)显微镜的技术。在该文献所记载的STED显微镜中，使用相位调制型的空间光调制器而生成环状的STED光束。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特开2013-92687号公报
非专利文献
非专利文献1：Travis J.Gould et al.,“Adaptive optics enables 3D STEDmicroscopy in aberrating specimens”,OPTICS EXPRESS Vol.20 No.19,pp.20998-21009(2012)
发明内容
发明所要解决的问题
目前，正在开发通过光学的衍射界限以下的分辨率取得图像的、所谓超高分辨率显微镜。作为该超高分辨率显微镜所使用的超高分辨率技术提出有各种方法，其一可以列举STED显微镜。STED显微镜通过向观察对象物大致同时地照射作为观察用激励光(以下，称为激励光束)的激光、受激发射用的短脉冲激光(以下，称为STED光束)，能够局部地产生来自观察对象物的荧光。
以下表示STED显微镜的原理。图18(a)和图18(b)是表示荧光的产生原理的图。如图18(a)所示，当对观察对象物照射具有激励波长的激励光LE时，电子从基底状态被激励为激励状态(图中的箭头A1)。之后，电子在几微秒之间从激励状态向基底状态转化(图中的箭头A2)，此时，产生与基底状态与激励状态之间的能量差相当的波长的荧光PL。
另一方面，图18(b)所示的STED光LS从被照射上述的激励光LE起具有规定的时间差地被照射于观察对象物。被激励光LE激励为激励状态的电子被STED光LS激发，转化为基底状态(图中的箭头A3)。此时，因为仅相当于STED光LS的波长的能量大小发生转化，所以产生的光LA的波长等于STED光LS的波长。通过这样的作用，在被照射激励光LE后被照射STED光LS的区域，代替荧光PL而产生波长与荧光PL不同的光LA。此外，通过令上述规定的时间差为纳米级，能够在荧光PL的产生时机与光LA的产生时机之间赋予时间差。
图19是表示(a)激励光LE、(b)STED光LS和(c)荧光PL各自的形状的一个例子的图。在STED显微镜，如图19(a)所示，首先向某个观察对象区域照射圆形的激励光LE。之后，如图19(b)所示，与该圆形的区域重叠而照射圆环形状的STED光LS。由此，在圆环形状的区域抑制荧光PL的产生，因此，如图19(c)所示，能够仅从该圆环形状的中心附近(被该圆环形状包围的区域)那样极小的区域产生荧光PL，能够由衍射界限以下的分辨率取得图像。
在上述的STED显微镜中，分辨率由图19(c)所示的荧光PL的直径D2决定。为了提高分辨率，将直径D2变小即可，但是，这样会使得扫描(scan)观察对象区域的全体所需要的时间变长。此外，如果为了缩短扫描(scan)观察对象区域的全体所需要的时间而将直径D2变大，则分辨率会降低。因此，在现有的STED显微镜中，在分辨率的提高与所需时间的缩短之中，仅能够实现任意一方，存在便利性欠缺等的问题。
本发明是鉴于这样的问题而完成的发明，其一个方面的目的在于，提供能够在分辨率和所需时间方面提高使用者的便利性的STED显微镜装置。
解决问题的技术手段
为了解决上述问题，本发明的一个方面的STED显微镜(microscope)装置是对观察对象物照射STED光和激励光并检测荧光的装置，包括输出STED光的STED光源、输出激励光的激励光源、呈现用于通过相位调制令STED光成形为圆环状的第一相位图案的相位调制型的第一空间光调制器、用于对观察对象区域照射激励光和相位调制后的STED光的光学系统、检测从观察对象区域产生的荧光的检测器和控制第一相位图案的控制部，控制部为了控制相位调制后的STED光的圆环的内径而设定第一相位图案。
此外，本发明的一个方面的STED显微(microscopy)方法是对观察对象物照射STED光和激励光并检测荧光的方法，包括：利用STED光源输出STED光的步骤(STED光输出步骤)；利用激励光源输出激励光的步骤(激励光输出步骤)；利用呈现用于令STED光成形为圆环状的第一相位图案的相位调制型的第一空间光调制器，对STED光进行相位调制的步骤(调制步骤，第一调制步骤)；利用光学系统，对观察对象区域照射激励光和相位调制后的STED光的步骤(照射步骤)；利用检测器检测从观察对象区域产生的荧光的步骤(检测步骤)；和为了控制相位调制后的STED光的圆环的内径而设定第一相位图案的步骤(设定步骤)。
在上述的STED显微镜装置和STED显微方法中，从STED光源输出的STED光通过在第一空间光调制器的相位调制而成形为圆环状。该圆环状的STED光在激励光被照射于观察对象区域后被照射于该观察对象区域。由此，在圆环状的区域抑制荧光的产生，仅从被圆环状的STED光包围的区域产生荧光。因而，根据上述的STED显微镜装置和STED显微方法，能够由衍射界限以下的分辨率取得图像。
此外，在上述的STED显微镜装置和STED显微方法中，通过控制部改变相位图案，从而能够改变相位调制后的STED光的圆环的内径。由此，能够在需要提高分辨率时使圆环的内径变小，在要缩短扫描(scan)观察对象区域的全体所需的时间时使圆环的内径变大。这样，根据上述的STED显微镜装置和STED显微方法，在分辨率和所需时间方面，能够提高使用者的便利性。
发明的效果
根据本发明的一个方面的STED显微镜装置，能够在分辨率和所需时间方面提高使用者的便利性。
附图说明
图1是表示第一实施方式所涉及的STED显微镜装置的结构的框图。
图2(a)是表示被输入到SLM的STED光的与光轴垂直的截面形状的图，(b)是表示从SLM输出的STED光的与光轴垂直的截面形状的图。
图3(a)～(d)是示意地表示在SLM呈现的STED光成形用相位图案所包含的、用于将STED光成形为圆环形状的图案的图。
图4(a)～(d)是通过颜色的浓淡表示图3所示的图案的各像素的相位值的图。
图5(a)～(d)是表示图3所示的图案分别通过在SLM被呈现而得到的STED光的形状的图。
图6是表示STED显微镜装置的动作的流程图。
图7是表示控制部的处理的流程图。
图8是表示控制部的处理的流程图。
图9是表示作为比较例的STED显微镜装置的结构的框图。
图10是示意地表示在SLM呈现的STED光成形用相位图案所包含的、用于将STED光成形为圆环形状的图案的图。
图11(a)、(b)是表示在SLM呈现的STED光成形用相位图案所包含的、用于将STED光成形为圆环形状的图案的图，(c)是表示作为比较例的图案的图。
图12(a)～(c)是示意地表示m＝2π、2π＜m＜4π和m＝4π的情况下的STED光的圆环形状的图。
图13(a)是表示通过分割激励光而生成的多个激励光的图，(b)是表示通过分割STED光而生成的多个STED光的图，(c)是表示多个荧光的图。
图14是表示用于对STED光进行分割而生成多个STED光的图案的一个例子的图。
图15是表示作为第四变形例的STED显微镜装置的结构的框图。
图16(a)是示意地表示在第四变形例的二维摄像装置的受光面扫描荧光的成像点的情形的图，(b)是表示激励光和STED光的照射时机的图表。
图17是表示作为第五变形例的STED显微镜装置的结构的框图。
图18(a)、(b)是表示荧光的产生原理的图。
图19是表示(a)激励光、(b)STED光和(c)荧光各自的形状的一个例子的图。
具体实施方式
以下，参照附图，对本发明的受激发射损耗(STED)显微镜装置的实施方式进行详细的说明。另外，在附图的说明中，对相同的要素标注相同的符号，省略重复的说明。
图1是表示本发明的第一实施方式所涉及的STED显微镜装置1A的结构的框图。STED显微镜装置1A例如是用于获得细胞标本等观察对象物B的荧光图像的装置。如图1所示，本实施方式的STED显微镜装置1A包括STED光源11、激励光源12、空间光调制器(SpatialLight Modulator：SLM)13和14、光学系统15A、检测器16以及运算控制装置17。
STED光源11是产生、输出STED光LS1的光源。STED光源11例如是输出激光等具有高的相干性的光的脉冲光源。作为STED光源11，例如能够列举灯类光源、激光二极管等激光光源或LED等。STED光LS1的波长是不与在观察对象物B产生的荧光PL的峰波长重叠且包含于该荧光PL的波长区域内的任意的波长。另外，STED光源11也可以不是脉冲光源，例如也可以由输出连续光(CW光)的光源与光开闭器(shutter)或脉冲调制用AOM(Acousto-OpticModulator(声光调制器))的组合构成。
激励光源12是产生、输出激励光LE1的光源。激励光源12例如是输出激光等具有高的相干性的光的脉冲光源。作为激励光源12，例如，能够列举激光二极管等激光光源或LED等。激励光LE1的波长为包含下述的观察对象物B所包含的荧光物质的激励波长的波长。另外，激励光源12也可以不是脉冲光源，例如也可以由输出连续光(CW光)的光源与光开闭器或脉冲调制用AOM的组合构成。
SLM13为相位调制型SLM，在二维的调制面的各部调制输入光的相位，输出相位调制后的光。SLM13是本实施方式中的第一空间光调制器。SLM13与STED光源11光学结合。SLM13从STED光源11接收STED光LS1，输出调制后的STED光LS2。SLM13通过在调制面呈现通过数值计算求得的相位图案(开诺全息照片)，控制STED光LS2的聚光位置、聚光强度、聚光形状等聚光照射条件。
图2(a)是表示被输入到SLM13的STED光LS1的与光轴垂直的截面形状的图。此外，图2(b)是表示从SLM13输出的STED光LS2的与光轴垂直的截面形状的图。在本实施方式中，向SLM13输入图2(a)所示那样的圆形的STED光LS1，在SLM13呈现用于通过相位调制令STED光LS2成为具有图2(b)所示那样的内径D1的圆环状的STED光成形用相位图案(第一相位图案)。该STED光成形用相位图案根据从运算控制装置17的控制部17a发送的图案信号SP1控制。
另外，SLM13也可以为反射型和透过型中的任一种。此外，作为SLM13，例如优选使用折射率变化材料型SLM。作为折射率变化材料型等的SLM，例如能够列举LCOS(LiquidCrystal on Silicon(硅基液晶))型SLM、LCD(Liquid Crystal Display(液晶显示器))、电地址型液晶元件、光地址型液晶元件和可变镜型SLM(Segment Mirror(拼接镜面)型SLM，Continuous Deformable Mirror(连续变形镜)型SLM)等。
再次参照图1。SLM14是本实施方式中的第二空间光调制器。SLM14与激励光源12光学结合。SLM14从激励光源12接收激励光LE1，输出调制后的激励光LE2。SLM14通过在调制面呈现通过数值计算求得的相位图案(开诺全息照片)，控制激励光LE2的聚光位置、聚光强度、聚光形状等聚光照射条件。在本实施方式中，在SLM14呈现用于通过相位调制令激励光LE2成形为圆形(参照图19(a))的激励光成形用相位图案(第二相位图案)。该激励光成形用相位图案根据从控制部17a发送的图案信号SP2控制。
另外，SLM14既可以为相位调制型，也可以为强度调制(振幅调制)型。作为相位调制型的SLM，能够列举与上述的SLM13相同的SLM。此外，SLM14也可以为反射型和透过型中的任一种。此外，也可以代替SLM14而设置DOE(Diffractive Optical Element(衍射光学元件))。在以下的说明中，主要对SLM14为相位调制型的情况进行说明。
光学系统15A为了向观察对象物B的观察对象区域照射激励光LE2和STED光LS2而设置。光学系统15A至少具有与SLM13和激励光源12光学结合的物镜15d。此外，在STED显微镜装置1A，光学系统15A具有分色镜15a和15b、光扫描仪15c、物镜15d以及成像光学系统15e。
分色镜15a将包含STED光LS2的波长的波长区域的光反射，将包含在观察对象物B产生的荧光PL的波长的波长区域的光透过。分色镜15a配置在连结物镜15d与成像光学系统15e的光轴上。分色镜15a从SLM13接收STED光LS2，将该STED光LS2向观察对象物B反射。此外，分色镜15a将来自观察对象物B的荧光PL透过。
分色镜15b将包含激励光LE2的波长的波长区域的光反射，将包含STED光LS2和在观察对象物B产生的荧光PL的各波长的波长区域的光透过。分色镜15b配置在连结物镜15d与分色镜15a的光轴上。分色镜15b从SLM14接收激励光LE2，将该激励光LE2向观察对象物B反射。此外，分色镜15b将来自分色镜15a的STED光LS2和来自观察对象物B的荧光PL透过。
光扫描仪15c是用于在观察对象物B上扫描STED光LS2和激励光LE2的聚光位置的装置。光扫描仪15c与SLM13、激励光源12和物镜15d光学结合。光扫描仪15c配置在连结物镜15d与分色镜15b的光轴上。作为光扫描仪15c，例如能够优选使用加尔瓦诺(检流计反射镜)、谐振器、多棱镜、MEMS(Micro Electro Mechanical System(微机电系统))反射镜或音响光学元件(AOM或AOD(Acousto-Optic Deflector(声光偏转器)))等。
物镜15d与SLM13和激励光源12光学结合。物镜15d以与观察对象物B对峙的方式例如配置在其上方，将STED光LS2和激励光LE2聚光并照射于观察对象物B。此时，由SLM13和14以使得STED光LS2和激励光LE2的各光轴彼此一致的方式控制它们的光轴。此外，物镜15d对由于激励光LE2的照射而在观察对象物B产生的荧光PL进行准直(Collimate)。
成像光学系统15e与物镜15d光学结合。成像光学系统15e配置在分色镜15a与检测器16之间的光轴上。成像光学系统15e被物镜15d准直并接收通过了分色镜15a、15b的荧光PL，使该荧光PL在检测器16的检测面上成像。
检测器16对通过成像光学系统15e成像的荧光PL的光强度进行检测。作为检测器16，例如能够优选使用光电倍增管、光电二极管或雪崩光电二极管等检测一个点的光强度的光传感器、CCD图像传感器或CMOS图像传感器等区域图像传感器、线传感器等一维检测器或多阳极光电倍增管。检测器16与光扫描仪15c光学结合，被光扫描仪15c退扫描(Descanned)，检测在观察对象物B产生的荧光PL。
检测器16将表示荧光PL的光强度的光强度信号SD1提供给运算控制装置17。特别是在使用多阳极光电倍增管和区域图像传感器的情况下，如下述的第四变形例所示那样，如果采用由SLM13和SLM14生成多点的结构，则能够在检测器16检测降低了扫描产生的影响的固定多点荧光PL，能够减少扫描时间。另外，在使用多阳极光电倍增管的情况下，优选采用能够按各个检测部进行增益调整的结构。
运算控制装置17例如由具有CPU和存储器的计算机构成。运算控制装置17包括控制部17a和图像处理部17b。控制部17a与SLM13和SLM14电结合。控制部17a控制在SLM13呈现的第一相位图案和在SLM14呈现的第二相位图案。即，控制部17a根据STED光LS1的波长、STED光LS2的圆环形状的所期望的内径和外径决定在SLM13呈现的STED光成形用相位图案。此外，控制部17a根据激励光LE1的波长、激励光LE2的圆形的所期望的直径决定在SLM14呈现的激励光成形用相位图案。
另外，STED光LS1和激励光LE1彼此波长不同，因此根据各自的波长设计相位图案。详细而言，在SLM13呈现的STED光成形用相位图案根据STED光LS1的波长设计，在SLM14呈现的激励光成形用相位图案根据激励光LE1的波长设计。
更详细而言，控制部17a使以赋予使STED光LS2在规定的位置聚光的相位分布的方式设计的开诺全息照片的相位图案φkinoform与用于使STED光LS2成形为圆环形状的聚光控制图案φpat之和φSLM＝φkinoform+φpat作为STED光成形用相位图案呈现在SLM13。同样，控制部17a使以赋予使激励光LE2在规定的位置聚光的相位分布的方式设计的开诺全息照片的相位图案φkinoform与用于使激励光LE2成形为圆形的聚光控制图案φpat之和φSLM＝φkinoform+φpat作为激励光成形用相位图案呈现在SLM14。另外，当令被输入到相位型SLM的光的相位为φin、令在相位型SLM被赋予的相位值为φSLM时，输出的调制光的相位φout成为φout＝φSLM+φin。
此外，在STED显微镜，需要对观察对象物B、从照射激励光LE2起经过规定的时间地照射STED光LS2。因此，控制部17a以在激励光源12照射脉冲状的激励光LE1之后、并经过上述规定的时间后使得STED光源11照射脉冲状的STED光LS1的方式，控制STED光源11和激励光源12的光出射时机。此外，控制部17a通过控制光扫描仪15c，在观察对象物B上扫描激励光LE2和STED光LS2的聚光位置。
图像处理部17b输入来自检测器16的光强度信号SD1。图像处理部17b根据在检测器16检测到的荧光PL的光强度和光扫描仪15c的聚光位置，制作荧光图像。由图像处理部17b制作的荧光图像显示在表示装置19。显示装置19与图像处理部17b电结合。
此处，在本实施方式中，通过控制部17a设定或改变在SLM13呈现的STED光成形用相位图案，能够设定或改变STED光LS2的圆环的内径D1(参照图2(b))。以下对这一点进行说明。
图3(a)～图3(d)是示意地表示在SLM13呈现的STED光成形用相位图案所包含的、用于将STED光LS2成形为圆环形状的图案P11～P14的图。此外，图4(a)～图4(d)分别是通过颜色的浓淡表示图3(a)～图3(d)各自所示的图案P11～P14的各像素的相位值的图，颜色越淡则相位值越接近0(rad)，颜色越浓则相位值越接近2π(rad)。
如图3和图4所示，这些图案P11～P14是将以某个点A为中心螺旋状地从0(rad)增加至2π(rad)的相位的增加重复n次(n为1以上的整数)的图案。图3(a)和图4(a)表示n＝1的情况，图3(b)和图4(b)表示n＝2的情况，图3(c)和图4(c)表示n＝3的情况，图3(d)和图4(d)表示n＝4的情况。
另外，图案P11～P14是所谓拉盖尔高斯(LG)光束的相位图案。这样的图案P11～P14也能够使用拉盖尔多项式表达。此外，在STED光成形用相位图案中，从0(rad)达到2π(rad)为止的灰度范围根据STED光LS1的波长设定。
图5(a)～图5(d)分别是表示通过在SLM13分别呈现上述的图案P11～P14获得的STED光LS2的形状的图。另外，在图5(a)～图5(d)，以颜色的浓淡表示光强度，光强度越大则越淡，光强度越小则越浓。参照图5(a)～图5(d)可知，重复次数n越大，则STED光LS2的圆环的内径越大。即，控制部17a能够通过设定或改变重复次数n来控制图2(b)所示的圆环的内径D1。
控制部17a例如也可以具有预先存储与圆环的多个内径D1分别对应的重复次数的多个图案的存储部17c(参照图1)。在这种情况下，控制部17a根据从与控制部17a电结合的输入装置18(输入部，参照图1)输入的所期望的内径D1选择与该内径D1对应的图案，使该图案与STED光成形用相位图案重叠。或者，控制部17a也可以根据从与控制部17a电结合输入装置18输入的所期望的内径D1计算出能够实现该内径D1的重复次数n，使基于该重复次数n的图案与STED光成形用相位图案重叠。另外，存储部17c也可以由与运算控制装置17电结合的外部装置构成。
对以上说明的本实施方式的STED显微镜装置1A的动作进行说明。图6是表示STED显微镜装置1A的动作的流程图。如图6所示，首先，与STED光LS1和激励光LE1相关的信息经输入装置18被输入运算控制装置17(步骤S1)。接着，运算控制装置17的控制部17a决定STED光成形用相位图案和激励光成形用相位图案(步骤S2：设定步骤)。
然后，激励光源12根据来自控制部17a的指示输出激励光LE1(步骤S31：激励光输出步骤)。从激励光LE1的输出延后仅规定时间、STED光源11根据来自控制部17a的指示输出STED光LS1(步骤S41：STED光输出步骤)。激励光LE1被SLM14成形为圆形(步骤S32：第二调制步骤)，STED光LS1被SLM13成形为圆环形状(步骤S42：调制步骤，第一调制步骤)。
成形后的激励光LE2经分色镜15b、光扫描仪15c和物镜15d照射于观察对象物B的观察对象区域(步骤S33)。之后，在上述规定时间之后，成形后的STED光LS2经分色镜15a、光扫描仪15c和物镜15d，与观察对象物B的观察对象区域重叠地被照射(步骤S43：照射步骤)。由此，在圆环形状的区域抑制荧光PL的产生，仅从被该圆环形状包围的区域产生荧光PL(参照图19(c))。接着，在检测器16检测荧光PL的光强度(步骤S5：检测步骤)。关于荧光PL的光强度的光强度信号SD1从检测器16被送到运算控制装置17。
步骤S5结束之后，观察对象物B上的STED光LS2和激励光LE2的聚光位置通过光扫描仪15c而移动。然后，再次进行上述步骤S2～S5。这样，通过交替地重复聚光位置的移动和上述步骤S2～S5，检测观察对象物B的宽的区域上的荧光PL的强度。接着，在运算控制装置17的图像处理部17b制作荧光图像(步骤S6)。该荧光图像由显示装置19显示(步骤S7)。
另外，为了取得三维的荧光图像，在上述步骤S1～S之后，改变物镜15d与观察对象物B的距离，再次进行上述步骤S1～S6即可。通过将这样的动作重复多次，蓄积平面的断层图像。之后，图像处理部17b基于该蓄积数据进行三维图像再构成处理即可。另外，也可以使用计数器等对图像取得进行测量，通过重复多次使观察对象物B向光轴方向移动而改变观察深度的动作取得连续改变深度后的图像组，通过对各图像间进行插补(线形插补、样条(spline)等)再次构成三维图像。
此外，控制部17a也可以预先存储与圆环的多个内径D1分别对应的多个图案P11～P14，根据来自输入装置18的输入，从这些图案P11～P14选择恰当的图案。图7是表示这样的控制部17a的处理的流程图。如图7所示，首先，由使用者从与多个扫描时间或多个分辨率相应的多个动作模式(扫描模式)中选择所期望的动作模式(步骤S11)。接着，控制部17a从图案P11～P14中选择与所选择的动作模式对应的图案(步骤S12)。接着，控制部17a制作包含所选择的图案的STED光成形用相位图案，并使该STED光成形用相位图案呈现在SLM13(步骤S13)。
或者，控制部17a也可以通过以下那样的处理制作STED光成形用相位图案。图8是表示控制部17a的处理的流程图。如图8所示，首先，由使用者输入所期望的内径D1(步骤S21)。接着，控制部17a根据所期望的内径D1计算出能够实现该内径D1的重复次数n(步骤S22)。之后，控制部17a制作基于计算出的重复次数n的图案(步骤S23)，制作包含该图案的STED光成形用相位图案，并使该STED光成形用相位图案呈现在SLM13(步骤S24)。
对通过以上说明的本实施方式的STED显微镜装置1A获得的效果进行说明。在STED显微镜装置1A中，从STED光源11输出的STED光LS1，通过在SLM13的相位调制而成形为圆环状。圆环状的STED光LS2在对观察对象区域照射激励光LE2后、与该观察对象区域重叠地被照射。由此，在圆环状的区域抑制荧光PL的产生，仅从被圆环状的STED光LS2包围的区域产生荧光PL。因而，根据本实施方式的STED显微镜装置1A，能够由衍射界限以下的分辨率取得图像。
此外，图9是表示作为比较例的STED显微镜装置100的结构的框图。该STED显微镜装置100不具备SLM13、14而具备用于将STED光LS2成形为圆环状的相位板102。在这样的结构中，为了改变STED光LS2的圆环形状的内径D1，需要将相位板102更换为别的相位板。
与此相对，在本实施方式的STED显微镜装置1A中，通过控制部17a对相位图案进行设定或改变，能够设定或改变相位调制后的STED光LS2的圆环的内径D1。由此，能够在需要提高分辨率时使圆环的内径D1变小，在要缩短对观察对象区域的全体进行扫描(scan)所需的时间时使圆环的内径D1变大。这样，根据本实施方式的STED显微镜装置1A，在分辨率和所需时间方面能够提高使用者的便利性。
此外，也可以如本实施方式那样，STED显微镜装置1A具备用于通过相位调制将激励光LE2成形为圆形的SLM14，控制部17a对在SLM14呈现的激励光成形用相位图案进行控制。由此，能够任意且容易地控制激励光LE2的形状。
此外，如图3和图4所示，STED光成形用相位图案也可以包含将以某个点A为中心螺旋状地0(rad)～2π(rad)的相位的增加重复n次的图案P11～P14中的任一图案，控制部17a通过设定或改变整数n而控制圆环的内径D1。例如能够通过这样的STED光成形用相位图案恰当地控制相位调制后的STED光LS2的圆环的内径D1。
此外，也可以如本实施方式那样，控制部17a具有存储与STED光LS2的圆环的多个内径D1分别对应的多个图案的存储部17c，在STED光成形用相位图案中含有所选择的图案。由此，使用者能够根据所期望的分辨率和所需时间容易地设定或改变STED光成形用相位图案。
此外，也可以如本实施方式那样，检测器16对通过光扫描仪15c后的光进行检测。由此，即使不像一般的共聚焦显微镜装置那样使用共焦针孔，也能够取得共聚焦图像。
(第一变形例)
图10是示意地表示在SLM13呈现的STED光成形用相位图案所包含的、用于将STED光LS2成形为圆环形状的图案P15的图。在上述实施方式中，控制部17a也可以代替图3所示的图案P11～P14而使图10所示的图案P15与在SLM13呈现的STED光成形用相位图案重叠。
如图10所示，该图案P15是相位以某个点A为中心螺旋状地从0(rad)增加至2π×n(rad)(n为1以上的整数)的图案。例如，在n＝2的情况下，图案P15成为相位以点A为中心螺旋状地从0(rad)增加至4π(rad)的图案，但利用这样的图案实现的圆环的内径D1与通过将螺旋状地从0(rad)至2π(rad)的相位的增加重复两次的图案(参照图3(b))实现的圆环的内径D1相等。另外，图案P15是所谓拉盖尔高斯(LG)光束的相位图案。这样的图案P15也能够使用拉盖尔多项式表达。
如本变形例那样，STED光成形用相位图案也可以包含相位以某个点A为中心螺旋状地从0(rad)增加至2π×n(rad)的图案P15，控制部17a通过设定或改变整数n来控制圆环的内径D1。例如通过这样的STED光成形用相位图案，能够恰当地控制相位调制后的STED光LS2的圆环的内径D1。另外，在SLM13的相位调制幅为0～2π(rad)的情况下，如图3所示的图案P11～P14那样，使用将螺旋状地从0(rad)至2π(rad)的相位的增加重复n次的(即，按相位2π折返的)图案即可。
(第二变形例)
图11(a)是示意地表示在SLM13呈现的STED光成形用相位图案所包含的用于将STED光LS2成形为圆环形状的图案P16的图。在上述实施方式中，控制部17a也可以代替图3所示的图案P11～P14而使图11(a)所示的图案P16与在SLM13呈现的STED光成形用相位图案重叠。
如图11(a)所示，该图案P16是相位以某个点A为中心螺旋状地从0(rad)增加至m(rad)(m为2π以上的实数)的图案。例如，在m＝3π的情况下，图案P16成为相位以点A为中心螺旋状地从0(rad)增加至3π(rad)的图案。STED光成形用相位图案包含这样的图案P16，控制部17a通过设定或改变实数m，也能够恰当地控制圆环的内径D1。在本变形例中，控制部17a根据从输入装置18输入的所期望的内径D1，计算出能够实现该内径D1的实数m，使基于实数m的图案与STED光成形用相位图案重叠。
另外，如图11(b)所示，本变形例的图案也可以为在相位螺旋状地从0(rad)增加至2π(rad)之后，在2π(rad)折回、相位再次从0(rad)增加至π(rad)那样的图案P17。通过这样的图案P17实现的圆环的内径D1与通过相位螺旋状地从0(rad)增加至3π(rad)的图案P16实现的圆环的内径D1相等。不过，如图11(c)所示，在相位螺旋状地从0(rad)增加至1.5π(rad)之后在1.5π(rad)折回、相位再次从0(rad)增加至1.5π(rad)那样的图案P18中，不能将STED光LS2成形为圆环形状。
图12(a)～图12(c)是示意地表示m＝2π、2π＜m＜4π和m＝4π的情况下的STED光LS2的圆环形状的图。如图12所示，m的值越小圆环的内径D1就越小，m的值越大圆环的内径D1就越大。因而，控制部17a能够通过设定实数m而恰当地控制圆环的内径D1。
(第三变形例)
在上述实施方式中，控制部17a也可以分割激励光LE1并使用于将分割后的激励光LE2同时照射至多个区域的图案进一步与激励光成形用相位图案重叠。图13(a)是表示通过分割激励光LE1而生成的多个激励光LE2的图。在这种情况下，控制部17a将STED光LS1分割为多个，并使用于将分割后的STED光LS2同时照射至观察对象物B的多个区域的图案进一步与STED光成形用相位图案重叠即可。
图13(b)是表示通过分割STED光LS1而生成的多个STED光LS2的图。在照射图13(a)的激励光LE2之后立即照射图13(b)的STED光LS2的情况下，如图13(c)所示，从观察对象物B的多个区域同时产生荧光PL。另外，在图13(a)～图13(c)，以颜色的浓淡表示光强度，光强度越大就越淡，光强度越小就越浓。
图14是表示用于分割STED光LS1而生成多个STED光LS2的图案的一个例子的图。在图14中，各像素的相位值以颜色的浓淡表示，颜色越淡则相位值越接近0(rad)，颜色越浓则相位值越接近2π(rad)。在本变形例中，例如通过在用于成形为圆环状的图案(例如图3所示的图案P11～P14)重叠图14所示那样的图案，生成圆环形状的多个STED光LS2。另外，用于分割激励光LE1而生成多个激励光LE2的图案也与用于将激励光LE2成形为圆形的图案重叠。另外，图14所示的图案基于STED光LS1的波长设计。
根据本变形例，能够同时观察观察对象物B的多个区域。因而，光扫描仪15c的扫描时间少些即可，因此能够进一步缩短观察所需的时间。
(第四的变形例)
图15是作为上述实施方式的第四变形例而表示STED显微镜装置1B的结构的框图。本变形例的STED显微镜装置1B与上述实施方式的STED显微镜装置1A的差异在于荧光PL的摄像方式。即，本变形例的STED显微镜装置1B代替上述实施方式的光学系统15A和检测器16而具备光学系统15B和二维摄像装置20。另外，STED显微镜装置1B的其它结构与上述实施方式相同。
光学系统15B为了向观察对象物B的观察对象区域照射激励光LE2和STED光LS2而设置。光学系统15B至少具有与SLM13和激励光源12光学结合的物镜15d。此外，在STED显微镜装置1B，光学系统15B具有分色镜15a和15b、光扫描仪15c、物镜15d、分色镜15f以及成像光学系统15g。另外，分色镜15a和15b、光扫描仪15c以及物镜15d的结构与上述实施方式相同。
分色镜15f将包含在观察对象物B产生的荧光PL的波长的波长区域的光反射，将包含STED光LS2的波长和激励光LE2的波长的波长区域的光透过。另外，在本变形例中，STED光LS2的波长设定为荧光PL的波长与激励光LE2的波长之间的波长。分色镜15f配置在连结物镜15d与光扫描仪15c的光轴上。分色镜15f从观察对象物B接收荧光PL，将该荧光PL向二维摄像装置20反射。成像光学系统15g配置在分色镜15f与二维摄像装置20之间，接收在分色镜15f反射的荧光PL，使该荧光PL在二维摄像装置20的检测面成像。
二维摄像装置20对通过成像光学系统15g成像的荧光PL的光强度进行检测。二维摄像装置20不与光扫描仪15c光学结合，不通过光扫描仪15c而检测在观察对象物B产生的荧光PL。作为二维摄像装置20，例如优选使用CCD图像传感器或CMOS图像传感器等区域图像传感器。二维摄像装置20将荧光PL的光像的光像信号SD2提供给运算控制装置17。运算控制装置17的图像处理部17b根据在二维摄像装置20摄像的荧光PL的光像，制作荧光图像。由图像处理部17b制作成的荧光图像显示在显示装置19。
图16(a)是示意地表示在本变形例的二维摄像装置20的受光面20a、扫描荧光PL的成像点的情形的图。在图16(a)，以实线的箭头表示荧光PL的扫描方向。受光面20a具有呈M行N列(M、N为2以上的整数)二维状排列的多个像素20b。光扫描仪15c以沿荧光PL行方向扫描各像素20b、完成一行的扫描之后进行下一行的扫描的方式控制激励光LE2和STED光LS2的照射位置。另外，二维摄像装置20的曝光时间设定为从荧光PL的扫描开始至扫描结束的时间。
此外，图16(b)是表示激励光LE2和STED光LS2的照射时机的图表，横轴对应图16(a)所示的一行的扫描时间。在本变形例中，为了提高分辨率，优选避免一个像素20b多次接收荧光PL。因而，激励光LE2和STED光LS2的脉冲时间间隔T优选根据扫描方向的像素20b的宽度、光扫描仪15c的扫描速度以及物镜15d和成像光学系统15g的成像倍率设定。
具体而言，如图16(b)所示，首先，在荧光PL的光轴位于该行的最初的像素20b时，连续照射激励光LE2和STED光LS2，此时产生的荧光PL入射至最初的像素20b。接着，在激励光LE2和STED光LS2的光轴被光扫描仪15c移动而使得荧光PL的光轴位于该行的下一像素20b之后，连续照射激励光LE2和STED光LS2，此时产生的荧光PL入射至下一像素20b。通过在该行的多个像素20b重复进行这样的动作，获得一行的荧光图像。然后，通过在多个行重复进行这样的动作，获得一张荧光图像。
(第五变形例)
图17是作为上述实施方式的第五变形例而表示STED显微镜装置1C的结构的框图。本变形例的STED显微镜装置1C与上述实施方式的STED显微镜装置1A的差异在于，不使用从激励光源12接收激励光LE1并输出调制后的激励光LE2的SLM14。即，本变形例的STED显微镜装置1C通过具备反射镜22和分色镜23，使来自激励光源12的激励光LE1的光轴与来自STED光源11的STED光LS1的光轴彼此一致，在SLM13接收STED光LS1和激励光LE1双方。因而，SLM13与STED光源11和激励光源12光学结合。另外，STED显微镜装置1C的其它结构与上述实施方式相同。
来自激励光源12的激励光LE1在反射镜22被反射，被输入至分色镜23。分色镜23使STED光LS1的波长透过、使激励光LE1反射，因此能够使来自激励光源12的激励光LE1的光轴与来自STED光源11的STED光LS1的光轴一致，SLM13接收激励光LE1和STED光LS1。
此处，在SLM13为例如LCOS-SLM等那样仅对特定的偏振光的光进行调制的空间光调制器的情况下，能够通过令STED光LS1的偏振光为该特定的偏振光、令激励光LE1的偏振光为与该特定的偏振光正交的偏振光而仅对STED光LS1进行调制。详细而言，在SLM13为LCOS-SLM的情况下，LCOS-SLM能够仅对与液晶的取向方向相同方向的偏振光成分(例如，水平偏振光成分)进行相位调制。因此，当以应该以成为圆环形状的方式被相位调制的STED光LS1为水平偏振光、以不需要相位调制的激励光LE1为垂直偏振光地将它们预先在同轴进行波的合成并输入SLM13时，STED光LS1被进行相位调制，作为STED光LS2输出。另一方面，激励光LE1不被调制，直接作为激励光LE1输出。另外，在STED显微镜装置1C，也可以使用STED显微镜装置1B中的光学系统15B和二维摄像装置20代替光学系统15A和检测器16。
根据本变形例的STED显微镜装置1C那样的结构，能够在STED光源11和激励光源12与SLM13之间、例如使用保存偏振光的偏振光纤进行导光，能够将STED光源11和激励光源12与光学系统15A物理分离。由此，能够缓和由于在STED光源11和激励光源12产生的振动和热而对光学系统15A产生的影响，实现光学系统15A的小型化·稳定化，此外，容易进行STED光源11和激励光源12的变更。
本发明的STED显微镜装置并不限定于上述的实施方式和结构例、变形例，能够进行各种变形。
在上述实施方式的受激发射损耗(STED)显微镜装置中，包括产生受激发射损耗光(STED光)的受激发射损耗光源(STED光源)、产生激励光的激励光源、呈现用于通过相位调制将受激发射损耗光成形为圆环状的第一相位图案的相位调制型的第一空间光调制器、用于向观察对象区域照射激励光和相位调制后的受激发射损耗光的光学系统、对从观察对象区域产生的荧光进行检测的检测器和控制第一相位图案的控制部，控制部能够通过改变第一相位图案而改变相位调制后的受激发射损耗光的圆环的内径。
或者，上述实施方式的受激发射损耗(STED)显微镜装置包括：输出受激发射损耗光(STED光)的受激发射损耗光源(STED光源)；输出激励光的激励光源；与受激发射损耗光源光学结合、呈现用于通过相位调制将受激发射损耗光成形为圆环状的第一相位图案的相位调制型的第一空间光调制器；与激励光源和第一空间光调制器光学结合、用于向观察对象区域照射激励光和相位调制后的受激发射损耗光的光学系统；与光学系统光学结合、对从观察对象区域产生的荧光进行检测的检测器；和与第一空间光调制器电结合、控制第一相位图案的控制部，控制部为了控制相位调制后的受激发射损耗光的圆环的内径而设定第一相位图案。
此外，上述实施方式的受激发射损耗(STED)显微方法包括：利用受激发射损耗光源(STED光源)，输出受激发射损耗光(STED光)的步骤(受激发射损耗光输出步骤，STED光输出步骤)；利用激励光源，输出激励光的步骤(激励光输出步骤)；利用与受激发射损耗光源光学结合、呈现用于将受激发射损耗光成形为圆环状的第一相位图案的相位调制型的第一空间光调制器，对受激发射损耗光进行相位调制的步骤(调制步骤，第一调制步骤)；利用与激励光源和第一空间光调制器光学结合的光学系统，向观察对象区域照射激励光和相位调制后的受激发射损耗光的步骤(照射步骤)；利用与光学系统光学结合的检测器，对从观察对象区域产生的荧光进行检测的步骤(检测步骤)；和为了控制相位调制后的受激发射损耗光的圆环的内径而设定第一相位图案的步骤(设定步骤)。
此外，上述的STED显微镜装置也可以进一步包括与激励光源光学结合、呈现用于通过相位调制将激励光成形为圆形的第二相位图案的第二空间光调制器，控制部进一步控制第二相位图案。此外，上述的STED显微方法也可以进一步包括利用与激励光源光学结合、呈现用于将激励光成形为圆形的第二相位图案的第二空间光调制器，对激励光进行相位调制的步骤(第二调制步骤)。由此，能够任意地控制激励光的形状和大小。
此外，上述的STED显微镜装置也可以采用控制部分割STED光而使用于向多个区域照射的图案与第一相位图案重叠、并且分割激励光而使用于向多个区域照射的图案与第二相位图案重叠的结构。此外，上述的STED显微方法也可以在第一调制步骤分割STED光而使用于向多个区域照射的图案与第一相位图案重叠、并且第二调制步骤分割激励光而使用于向多个区域照射的图案与第二相位图案重叠。由此，能够同时对多个区域进行观察，能够进一步缩短所需时间。
此外，上述的STED显微镜装置和STED显微方法的检测器也可以为二维检测器。
此外，在这种情况下，STED显微镜装置也可以进一步包括使荧光在二维检测器的受光面上进行扫描的光扫描仪，激励光和受激发射损耗光的照射时间间隔根据扫描方向的受光面的像素的宽度和光扫描仪的扫描速度、以使得各像素不对荧光进行多次受光的方式设定。此外，STED显微方法也可以进一步包括利用光扫描仪使荧光在二维检测器的受光面上进行扫描的步骤(扫描步骤)，激励光和受激发射损耗光的照射时间间隔根据扫描方向的受光面的像素的宽度和光扫描仪的扫描速度、以使得各像素不对荧光进行多次受光的方式设定。由此，能够提高分辨率。
此外，上述的STED显微镜装置也可以为第一相位图案包含相位以某个点为中心螺旋状地从0(rad)增加至2π×n(rad)(n为1以上的整数)的图案、控制部为了控制圆环的内径而设定整数n的结构。此外，上述的STED显微方法也可以为，第一相位图案包含相位以某个点为中心螺旋状地从0(rad)增加至2π×n(rad)(n为1以上的整数)的图案，在设定步骤，为了控制圆环的内径而设定整数n。例如根据这样的第一相位图案，能够恰当地控制相位调制后的STED光的圆环的内径。
此外，上述的STED显微镜装置也可以为第一相位图案包含将以某个点为中心螺旋状地从0(rad)增加至2π(rad)的相位的增加重复进行n次(n为1以上的整数)的图案，控制部为了控制圆环的内径而设定整数n。此外，上述的STED显微方法也可以为，第一相位图案包含将以某个点为中心螺旋状地从0(rad)增加至2π(rad)的相位的增加重复进行n次(n为1以上的整数)的图案，在设定步骤，为了控制圆环的内径而设定整数n。例如根据这样的第一相位图案，能够恰当地控制相位调制后的STED光的圆环的内径。
此外，上述的STED显微镜装置也可以进一步包括存储与受激发射损耗光的圆环的多个内径分别对应的多个图案的存储部，将从多个图案中选择的图案包含于第一相位图案。此外，上述的STED显微方法也可以在设定步骤将从存储在存储部的、与受激发射损耗光的圆环的多个内径分别对应的多个图案中选择的图案包含于第一相位图案。由此，使用者能够根据所期望的分辨率和所需时间，容易地设定或改变第一相位图案。
此外，上述的STED显微镜装置也可以进一步包括输入圆环的内径的期望值的输入部，第一相位图案包含相位以某个点为中心螺旋状地从0(rad)增加至m(rad)(m为2π以上的实数)的图案，控制部基于从输入部输入的圆环的内径的期望值设定实数m。此外，上述的STED显微方法也可以为，第一相位图案包含相位以某个点为中心螺旋状地从0(rad)增加至m(rad)(m为2π以上的实数)的图案，在设定步骤，基于从输入部输入的圆环的内径的期望值设定实数m。例如根据这样的第一相位图案，能够恰当地控制相位调制后的STED光的圆环的内径。
工业上的可利用性
本发明能够作为在分辨率和所需时间方面能够提高使用者的便利性的STED显微镜装置加以利用。
符合的说明
1A…STED显微镜装置、1B…STED显微镜装置、11…STED光源、12…激励光源、13、14…SLM、15A、15B…光学系统、15a、15b…分色镜、15c…光扫描仪、15d…物镜、15e…成像光学系统、15f…分色镜、15g…成像光学系统、16…检测器、17…运算控制装置、17a…控制部、17b…图像处理部、17c…存储部、18…输入装置、19…显示装置、20…二维摄像装置、20a…受光面、20b…像素、B…观察对象物、LE1、LE2…激励光、LS1、LS2…STED光、PL…荧光。

Claims (9)

1.一种受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
包括：
输出受激发射损耗光的受激发射损耗光源；
输出激励光的激励光源；
呈现用于通过相位调制将所述受激发射损耗光成形为圆环状的第一相位图案的相位调制型的第一空间光调制器；
用于向观察对象区域照射所述激励光和相位调制后的所述受激发射损耗光的光学系统；
对从所述观察对象区域产生的荧光进行检测的检测器；和
控制所述第一相位图案的控制部，
所述控制部为了控制相位调制后的所述受激发射损耗光的圆环的内径而设定所述第一相位图案。
2.如权利要求1所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
还包括呈现用于通过相位调制将所述激励光成形为圆形的第二相位图案的第二空间光调制器，
所述控制部还控制所述第二相位图案。
3.如权利要求2所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
所述控制部分割所述受激发射损耗光并使用于向多个区域照射的图案与所述第一相位图案重叠，并且分割所述激励光并使用于向所述多个区域照射的图案与所述第二相位图案重叠。
4.如权利要求3所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
所述检测器为二维检测器。
5.如权利要求4所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
还包括使所述荧光在所述二维检测器的受光面上进行扫描的光扫描仪，
所述激励光和所述受激发射损耗光的照射时间间隔根据扫描方向上的所述受光面的像素的宽度和所述光扫描仪的扫描速度，以各像素不对所述荧光进行多次受光的方式设定。
6.如权利要求1～5中的任一项所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
所述第一相位图案包含相位以某个点为中心螺旋状地从0rad增加至2π×n rad的图案，
所述控制部为了控制所述圆环的内径而设定整数n，
其中，n为1以上的整数。
7.如权利要求1～5中的任一项所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
所述第一相位图案包含将以某个点为中心螺旋状地从0rad增加至2π rad的相位的增加重复进行n次的图案，
所述控制部为了控制所述圆环的内径而设定整数n，
其中，n为1以上的整数。
8.如权利要求1～7中的任一项所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
还包括存储与所述受激发射损耗光的圆环的多个内径分别对应的多个图案的存储部，将从所述多个图案中选择的图案包含于所述第一相位图案。
9.如权利要求1～5中的任一项所述的受激发射损耗显微镜装置，其特征在于，
还包括输入所述圆环的内径的期望值的输入部，
所述第一相位图案包含相位以某个点为中心螺旋状地从0rad增加至m rad的图案，
所述控制部基于从所述输入部输入的所述圆环的内径的期望值，设定实数m，
其中，m为2π以上的实数。
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