CN108181235A - 一种基于均匀结构光照明的sted并行显微成像系统 - Google Patents

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Abstract

本发明提供的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，通过对照明模块进行设计，将激发光激光器出射的一束激发光分成两束相干光，利用平顶高斯光束整形器将高斯分布的损耗光调制成平顶光束，并将该束损耗光分成两束相干光，通过干涉分别得到均匀分布的条纹状激发结构光和损耗结构光，并对样品进行激发和损耗，进行STED并行显微成像，再采用STED的坐标定位方法和SIM频域频谱图融合法进行图像重建，实现超分辨成像，有助于扩大STED显微系统的视场范围和成像速度。

Description

一种基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统
技术领域
本发明涉及显微检测仪器设计及制造领域，尤其是涉及一种基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统。
背景技术
超分辨显微成像技术是一种用于生物等研究领域中的前沿技术，主要分为坐标定位类和坐标随机类两大类显微成像方法。其中坐标定位类显微成像方法中的典型代表为受激辐射损耗(STED)显微成像，STED显微成像直接采用光学方法，对样品进行逐点扫描，实现超分辨成像。但受单点扫描方式的限制，STED显微成像的成像速度比较慢。
近年来，为提高STED显微成像技术的成像速度，STED并行显微成像被提出。其中效果较好的是采用二维结构光照明模式，明显提高了成像速度。但是由于二维结构光的加入，导致成像系统复杂度变高，并且该技术中激发光没有采用结构光模式而采用宽场激发，使得有效荧光的信噪比显著降低，影响了成像分辨率。
发明内容
本发明的目的是：
提供一种成像分辨率高且成像速度快的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统。
为实现上述目的，本发明采用下述技术方案：
一种基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，包括照明模块、探测模块、控制模块及图像重建模块；
所述照明模块包括：激发光激光器、损耗光激光器、第一平顶高斯光束整形器、第二平顶高斯光束整形器、液晶空间光调制器、沃拉斯顿棱镜、第一透镜、第二透镜、第一反射镜、第三透镜、通孔掩膜板、第四透镜、第一半波片、第二反射镜、第一二色镜、第五透镜、第六透镜、第二半波片、第二二色镜、筒镜、物镜以及三维纳米位移台，所述三维纳米位移台可在XYZ三维方向移动，所述三维纳米位移台承载有待检测样品；
所述探测模块包括滤光片、探测透镜以及面阵探测器，所述面阵探测器中的像素可形成虚拟针孔；
所述控制模块电性连接于所述三维纳米位移台、面阵探测器以及液晶空间光调制器；所述图像重建模块电性连接于所述控制模块；其中：
所述激发光激光器发出的高斯光束作为激发光，所述激发光经过所述第一平顶高斯光束整形器形成平顶高斯光束，所述平顶高斯光束经所述第一透镜和第二透镜后再由所述第一反射镜反射到所述液晶空间光调制器，所述液晶空间光调制器对所述平顶高斯光束进行调制生成衍射光，所述衍射光包括±1级衍射光及0级衍射光；所述衍射光经所述第三透镜进行聚焦后入射进入所述通孔掩膜板，所述通孔掩膜板遮挡所述0级衍射光，只允许所述±1级衍射光通过，所述±1级衍射光经所述第四透镜准直后再依次经所述第一半波片、第二反射镜、第一二色镜、第二二色镜及筒镜后进入所述物镜，并在所述物镜前焦面处进行干涉，生成均匀分布的干涉条纹状的激发结构光，所述激发结构光对样品进行照明激发；
所述损耗光激光器发出高斯光束作为损耗光，所述损耗光经所述第二平顶高斯光束整形器后形成平顶高斯光束，所述平顶高斯光束经所述第五透镜和第六透镜后入射到所述沃拉斯顿棱镜并形成两束偏振方向互相垂直的第一损耗光和第二损耗光，所述第一损耗光及第二损耗光经所述第二半波片后偏振方向相同，经所述第二半波片后的第一损耗光及第二损耗光再依次经所述第二二色镜、和所述筒镜后进入所述物镜，并在所述物镜的前焦面处进行干涉，生成均匀分布的干涉条纹状的损耗结构光，所述损耗结构光对样品进行损耗；
样品经过激发结构光的激发和损耗结构光的损耗，形成均匀分布的有效结构光光场，所述有效结构光光场依次经所述物镜、所述筒镜、所述第二二色镜、所述第一二色镜、所述滤光片及所述探测透镜，再在所述面阵探测器的感光面形成均匀条纹分布的图像，所述面阵探测器探测所述图像并通过所述虚拟针孔对所述图像进行空间滤波后将所述图像转化为电信号；
所述控制模块采集所述电信号，所述图像重建模块采用坐标定位及SIM频域频谱图融对所述电信号进行图像重建，实现基于均匀结构光照明的STED并行显微成像。
在其中一些实施例中，所述第一平顶高斯光束整形器的出光面、所述液晶空间光调制器的感光面、所述物镜的前焦面、所述第二平顶高斯光束整形器的出光面、所述沃拉斯顿棱镜出光平面和所述面阵探测器感光面处于共轭面。
在其中一些实施例中，所述面阵探测器为CCD或CMOS相机中的一种。
在其中一些实施例中，通过所述控制模块调整加载在液晶空间光调制器上的相位分布，可改变激发光光场的方向、周期和初相位，使得所述激发光结构光光场和损耗光结构光光场具有相同的方向和周期，初相位相差半个周期。
本发明采用上述技术方案的优点是：
本发明提供的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，通过对照明模块进行设计，将激发光激光器出射的一束激发光分成两束相干光，利用平顶高斯光束整形器将高斯分布的损耗光调制成平顶光束，并将该束损耗光分成两束相干光，通过干涉分别得到均匀分布的条纹状激发结构光和损耗结构光，并对样品进行激发和损耗，进行STED并行显微成像，再采用STED的坐标定位方法和SIM频域频谱图融合法进行图像重建，实现超分辨成像，有助于扩大STED显微系统的视场范围和成像速度。
附图说明
图1为本发明实施例提供的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统结构示意图。
图2(a)为本发明实施例提供的均匀分布的激发结构光光场的结构示意图；
图2(b)为本发明实施例提供的均匀分布的损耗结构光光场的结构示意图；
图2(c)为本发明实施例提供的均匀分布的有效结构光光场的结构示意图；
图3(a)为本发明实施例提供的面阵探测器上均匀分布的结构光的条纹状图像；
图3(b)为本发明实施例提供的虚拟针孔的结构示意图；
图4(a)为本发明实施例提供的在频率域中将每幅二维图像的频域图进行融合的结构示意图；
图4(b)为本发明实施例提供的经过逆傅里叶变换转换到空间域得到最终的超分辨图像的结构示意图。
其中：照明模块110、探测模块120、控制模块130、图像重建模块140、激发光激光器111、损耗光激光器112、第一平顶高斯光束整形器113、第二平顶高斯光束整形器114、液晶空间光调制器115、沃拉斯顿棱镜116、第一透镜117、第二透镜118、第一反射镜119、第三透镜1111、通孔掩膜板1112、第四透镜1113、第一半波片1114、第二反射镜1115、第一二色镜1116、第五透镜1117、第六透镜1118、第二半波片1119、第二二色镜1121、筒镜1122、物镜1123、三维纳米位移台1124、滤光片121、探测透镜122、面阵探测器123。
具体实施方式
请参考图1，为本发明实施例提供的一种基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统100，照明模块110、探测模块120、控制模块130及图像重建模块140。其中：
所述照明模块110包括：激发光激光器111、损耗光激光器112、第一平顶高斯光束整形器113、第二平顶高斯光束整形器114、液晶空间光调制器115、沃拉斯顿棱镜116、第一透镜117、第二透镜118、第一反射镜119、第三透镜1111、通孔掩膜板1112、第四透镜1113、第一半波片1114、第二反射镜1115、第一二色镜1116、第五透镜1117、第六透镜1118、第二半波片1119、第二二色镜1121、筒镜1122、物镜1123以及三维纳米位移台1124，所述三维纳米位移台1124可在XYZ三维方向移动，所述三维纳米位移台承载有待检测样品。
所述探测模块120包括滤光片121、探测透镜122以及面阵探测器123，所述面阵探测器123中的像素可形成虚拟针孔。
所述控制模块130电性连接于所述三维纳米位移台1115、面阵探测器123以及液晶空间光调制器113；所述图像重建模块140电性连接于所述控制模块130。
以下详细说明本发明提供的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统100的工作原理：
所述激发光激光器111发出的高斯光束作为激发光，所述激发光经过所述第一平顶高斯光束整形器113形成平顶高斯光束，所述平顶高斯光束经所述第一透镜117和第二透镜118后再由所述第一反射镜119反射到所述液晶空间光调制器115，所述液晶空间光调制器115对所述平顶高斯光束进行调制生成衍射光，所述衍射光包括±1级衍射光及0级衍射光；所述衍射光经所述第三透镜1111进行聚焦后入射进入所述通孔掩膜板1112，所述通孔掩膜1112遮挡所述0级衍射光，只允许所述±1级衍射光通过，所述±1级衍射光经所述第四透镜1113准直后再依次经所述第一半波片1114、第二反射镜1115、第一二色镜1116、第二二色镜1121及筒镜1122后进入所述物镜1123，并在所述物镜1123前焦面处进行干涉，生成均匀分布的干涉条纹状的激发结构光，所述激发结构光对样品进行照明激发；
所述损耗光激光器112发出高斯光束作为损耗光，所述损耗光经所述第二平顶高斯光束整形器114后形成平顶高斯光束，所述平顶高斯光束经所述第五透镜1117和第六透镜1118后入射到所述沃拉斯顿棱镜并形成两束偏振方向互相垂直的第一损耗光和第二损耗光，所述第一损耗光及第二损耗光经所述第二半波片1119后偏振方向相同，经所述第二半波片1119后的第一损耗光及第二损耗光再依次经所述第二二色镜1121和所述筒镜1122后进入所述物镜1123，并在所述物镜1123的前焦面处进行干涉，生成均匀分布的干涉条纹状的损耗结构光，所述损耗结构光对样品进行损耗；
样品经过激发结构光的激发和损耗结构光的损耗，形成均匀分布的有效结构光光场，所述有效结构光光场依次经所述物镜1123、所述筒镜1122、所述第二二色镜1121、所述第一二色镜1116、所述滤光片121及所述探测透镜122，再在所述面阵探测器123的感光面形成均匀条纹分布的图像，所述面阵探测器123探测所述图像并通过所述虚拟针孔对所述图像进行空间滤波后将所述图像转化为电信号；
所述控制模块130采集所述电信号，所述图像重建模块140采用坐标定位及SIM频域频谱图融对所述电信号进行图像重建，实现基于均匀结构光照明的STED并行显微成像。
优选地，所述第一平顶高斯光束整形器113的出光面P1、液晶空间光调制器115的感光面P2、物镜1123的前焦面P4、第二平顶高斯光束整形器114的出光面P5、沃拉斯顿棱镜116出光平面P6和面阵探测器123感光面P7处于共轭面。
进一步地，面阵探测器123可以为CCD或CMOS相机，可以接收荧光样品中有效均匀分布的结构光的荧光信号，并将其转化为电信号；且面阵探测器123中的像素可以形成虚拟针孔，对探测到的均匀分布的结构光进行空间滤波。
进一步地，由于所述控制模块140电性连接于所述三维纳米位移台1115、面阵探测器123以及液晶空间光调制器113，通过所述控制模块140可实现对所述三维纳米位移台1115、面阵探测器123以及液晶空间光调制器113的扫描控制，且所述控制模块130将采集电信号传输至所述图像重建模块140，所述图像重建模块140根据SIM频域频谱图融合法对所述电信号进行图像重建，实现基于均匀结构光照明的STED并行显微成像。
以下详细说明图像重建模块140采用坐标定位及SIM频域频谱图融对所述电信号进行图像重建，实现基于结构光照明的STED并行显微成像的工作过程：
第一，并行探测均匀分布的有效结构光光场
通过控制模块130调整加载在液晶空间光调制器113上的相位分布，改变激发光光场的方向、周期和初相位，使得均匀分布的激发光结构光光场和均匀分布的损耗光结构光光场具有相同的方向和周期，初相位相差半个周期；样品经过激发结构光的激发和损耗结构光的损耗后，形成均匀分布的有效结构光光场，所述有效结构光光场依次经所述物镜1123、所述筒镜1122、所述第二二色镜1121、所述第一二色镜1116、所述滤光片121及所述探测透镜122，再在所述面阵探测器123的感光面形成均匀条纹分布的图像，从而实现并行光信号的探测收集，请参阅图2(a)、图2(b)及图2(c)分别表示为均匀分布的激发结构光光场，均匀分布的损耗结构光光场及均匀分布的有效结构光光场。
第二，获取给定均匀分布的结构光方向以及给定样本位置的STED图像
可以理解，给定均匀分布的结构光方向以及给定样本位置时，在面阵探测器123的感光面形成均匀条纹分布的图像中包含很多条光信号条纹，每条光信号条纹都对应一排虚拟针孔，如图3(a)和图3(b)分别为面阵探测器上均匀分布的结构光的条纹状图像和虚拟针孔，其中，长条状矩形代表一条条纹光强分布，小的正方形格子代表面阵探测器的像素，较大的正方形格子代表一个虚拟针孔(包含多个像素)，虚拟针孔的排布位于光信号条纹的中央，抑制杂光干扰，将虚拟针孔中每个像素探测到的光强Ii叠加，可以得到样品中一点对应的STED图像像素值将每个光信号条纹对应的所有虚拟针孔进行同样的处理，可以得到样品中一行对应的STED图像像素值，将所有光信号条纹中的虚拟针孔都作相同的处理，将得到一幅像素值条状间隔分布的STED图像。
第三，获取给定均匀结构光方向下样本扫描后的STED图像
保持结构光(激发结构光及损耗结构光)方向不变，采用三维纳米位移台1115带动样本沿着垂直于结构光条纹方向分步移动，每个结构光条纹方向下总的移动次数为dp/ds-1，dp为条纹空间周期，ds为单次移动步距，位移台每停留一个位置，用面阵探测器123记录下该位置处的样本条纹状荧光图像，采用上述第二步的处理方法，将得到一幅像素值条状间隔分布的STED图像，这样一来，每一个均匀结构光条纹方向下将得到dp/ds幅像素值条状间隔分布的STED图像，将这些图像叠加，生成对应于一个均匀结构光条纹方向的一幅图像，将这种图像重建方法记为坐标定位法，该图像在与该均匀结构光条纹相垂直的方向实现了超分辨成像。
第四，获取各个方向均匀结构光下样本扫描后的STED图像
旋转沃拉斯顿棱镜114，并相应地旋转液晶空间光调制器115上加载的相位图，使得物镜1123焦面处激发光和损耗光的结构光光场条纹能够位于不同的方向，生成不同方向的均匀分布的有效荧光结构光光场，对于各个方向的有效荧光结构光光场进行第三步和第二步相同的处理，可以得到均匀结构光场各个方向上包含一维超分辨信息的二维图像。
第五，经过SIM频域频谱融合得到超分辨图像
采用SIM频域频谱图融合法进行图像重建，先将第四步得到的多幅二维图像进行傅里叶变换转换到频率域，如图4(a)所示，在频率域中将每幅二维图像的频域图进行融合，如图4(b)所示，最后再经过逆傅里叶变换转换到空间域，得到最终的超分辨图像。
本发明提供的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，通过对照明模块进行设计，将激发光激光器出射的一束激发光分成两束相干光，利用平顶高斯光束整形器将高斯分布的损耗光调制成平顶光束，并将该束损耗光分成两束相干光，通过干涉分别得到均匀分布的条纹状激发结构光和损耗结构光，并对样品进行激发和损耗，进行STED并行显微成像，再采用STED的坐标定位方法和SIM频域频谱图融合法进行图像重建，实现超分辨成像，有助于扩大STED显微系统的视场范围和成像速度。
当然本发明的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统还可具有多种变换及改型，并不局限于上述实施方式的具体结构。总之，本发明的保护范围应包括那些对于本领域普通技术人员来说显而易见的变换或替代以及改型。

Claims (4)

1.一种基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，其特征在于，包括照明模块、探测模块、控制模块及图像重建模块；
所述照明模块包括：激发光激光器、损耗光激光器、第一平顶高斯光束整形器、第二平顶高斯光束整形器、液晶空间光调制器、沃拉斯顿棱镜、第一透镜、第二透镜、第一反射镜、第三透镜、通孔掩膜板、第四透镜、第一半波片、第二反射镜、第一二色镜、第五透镜、第六透镜、第二半波片、第二二色镜、筒镜、物镜以及三维纳米位移台，所述三维纳米位移台可在XYZ三维方向移动，所述三维纳米位移台承载有待检测样品；
所述探测模块包括滤光片、探测透镜以及面阵探测器，所述面阵探测器中的像素可形成虚拟针孔；
所述控制模块电性连接于所述三维纳米位移台、面阵探测器以及液晶空间光调制器；所述图像重建模块电性连接于所述控制模块；其中：
所述激发光激光器发出的高斯光束作为激发光，所述激发光经过所述第一平顶高斯光束整形器形成平顶高斯光束，所述平顶高斯光束经所述第一透镜和第二透镜后再由所述第一反射镜反射到所述液晶空间光调制器，所述液晶空间光调制器对所述平顶高斯光束进行调制生成衍射光，所述衍射光包括±1级衍射光及0级衍射光；所述衍射光经所述第三透镜进行聚焦后入射进入所述通孔掩膜板，所述通孔掩膜板遮挡所述0级衍射光，只允许所述±1级衍射光通过，所述±1级衍射光经所述第四透镜准直后再依次经所述第一半波片、第二反射镜、第一二色镜、第二二色镜及筒镜后进入所述物镜，并在所述物镜前焦面处进行干涉，生成均匀分布的干涉条纹状的激发结构光，所述激发结构光对样品进行照明激发；
所述损耗光激光器发出高斯光束作为损耗光，所述损耗光经所述第二平顶高斯光束整形器后形成平顶高斯光束，所述平顶高斯光束经所述第五透镜和第六透镜后入射到所述沃拉斯顿棱镜并形成两束偏振方向互相垂直的第一损耗光和第二损耗光，所述第一损耗光及第二损耗光经所述第二半波片后偏振方向相同，经所述第二半波片后的第一损耗光及第二损耗光再依次经所述第二二色镜、和所述筒镜后进入所述物镜，并在所述物镜的前焦面处进行干涉，生成均匀分布的干涉条纹状的损耗结构光，所述损耗结构光对样品进行损耗；
样品经过激发结构光的激发和损耗结构光的损耗，形成均匀分布的有效结构光光场，所述有效结构光光场依次经所述物镜、所述筒镜、所述第二二色镜、所述第一二色镜、所述滤光片及所述探测透镜，再在所述面阵探测器的感光面形成均匀条纹分布的图像，所述面阵探测器探测所述图像并通过所述虚拟针孔对所述图像进行空间滤波后将所述图像转化为电信号；
所述控制模块采集所述电信号，所述图像重建模块采用坐标定位及SIM频域频谱图融对所述电信号进行图像重建，实现基于均匀结构光照明的STED并行显微成像。
2.根据权利要求1所述的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，其特征在于，所述第一平顶高斯光束整形器的出光面、所述液晶空间光调制器的感光面、所述物镜的前焦面、所述第二平顶高斯光束整形器的出光面、所述沃拉斯顿棱镜出光平面和所述面阵探测器感光面处于共轭面。
3.根据权利要求1所述的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，其特征在于，所述面阵探测器为CCD或CMOS相机中的一种。
4.根据权利要求1所述的基于均匀结构光照明的STED并行显微成像系统，其特征在于，通过所述控制模块调整加载在液晶空间光调制器上的相位分布，可改变激发光光场的方向、周期和初相位，使得所述激发光结构光光场和损耗光结构光光场具有相同的方向和周期，初相位相差半个周期。
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