JP2017090591A - 画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニット - Google Patents

画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニット Download PDF

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Abstract

【課題】構成を簡易化できる画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニットを提供する。
【解決手段】画像取得装置１は、光Ｌ１を出力する光源１１と、二次元に配列された複数の画素を有し、光源１１から出力された光Ｌ１の位相を複数の画素毎に変調する空間光変調器１３と、空間光変調器１３で変調された光Ｌ１を観察対象物Ｓに照射する対物レンズ１６と、観察対象物Ｓからの光Ｌ１を撮像する光検出器１８と、複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部１９と、を備える。位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンである。基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域と、第１の領域と対向し、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域と、を有する。
【選択図】図１

Description

本発明は、画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニットに関する。
従来、観察対象物に縞状の光（構造化照明光）を照射し、それに伴って観察対象物から発せられる蛍光又は反射光等を撮像することで画像を取得する構造化照明顕微鏡がある（例えば、下記特許文献１，２又は下記非特許文献１，２参照）。これらの構造化照明顕微鏡は、例えば、回折格子と、回折格子を並進させる並進機構及び／又は回折格子を回動させる回動機構等とを備え、それらの機構により構造化照明光の位相及び縞の方向が変更可能となっている。そして、構造化照明光の位相及び縞の方向を変えて複数の画像を取得し、それらの画像に基づいて所定の演算を行うことで、解像限界を超えた高い解像度を有する超解像画像が構築可能となっている。
特開２０１５−９９１７７号公報 特開平１１−２４２１８９号公報
Shwetadwip Chowdhury, Al-HafeezDhalla, and Joseph Izatt, "Structured oblique illumination microscopy forenhanced resolution imaging of non-fluorescent, coherently scattering sample",1 August 2012/ Vol.3, No.8/ BIOMEDICAL OPTICS EXPRESS pp.1841-1854 Thorsten Lang, Silvio O. Rizzoli,"Membrane Protein Clusters at Nanoscale Resolution: More Than PrettyPictures", 1 April 2010/ Vol.25, No. 2/ PHYSIOLOGY, pp.116-124
上記のような構造化照明顕微鏡は、回折格子の並進機構及び／又は回動機構等を備え、それらの機構により構造化照明光の位相及び縞の方向が変更可能となっている。そのため、装置構成が複雑化するおそれがある。
そこで、本発明は、構成を簡易化できる画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニットを提供することを目的とする。
本発明の一側面に係る画像取得装置は、構造化照明光を照射して観察対象物の画像を取得する画像取得装置であって、光を出力する光源と、二次元に配列された複数の画素を有し、光源から出力された光の位相を複数の画素毎に変調する空間光変調器と、空間光変調器で変調された光を観察対象物に照射する対物レンズと、観察対象物からの光を撮像する光検出器と、複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域と、所定の方向において第１の領域と対向し、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域と、を有する。
この画像取得装置では、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域と、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域と、を有する基本位相パターンに基づいて位相パターンが算出される。この位相パターンに従って空間光変調器で光を変調することにより、対物レンズから観察対象物に対して縞状の光を照射することが可能となる。この画像取得装置では、空間光変調器に入力する位相パターンを変更することによって、生成される縞状の光の位相及び縞の方向を変更することができる。そのため、従来技術のように縞状の光の位相及び縞の方向を変更するための可動機構を設ける必要がなく、それらを省略することができる。よって、この画像取得装置によれば、構成を簡易化することができる。
本発明の一側面に係る画像取得装置においては、第１の領域では、位相値は所定の方向に沿って直線的に増加し、第２の領域では、位相値は所定の方向に沿って直線的に減少していてもよい。これによれば、基本位相パターンが単純化されるため、縞状の光を生成するのに複雑な光学素子等を用いる必要がなく、構成を一層簡易化することができる。
本発明の一側面に係る画像取得装置では、基本位相パターンは、所定の方向における中心を通り且つ所定の方向と直交する直線に関して線対称となっていてもよい。これによれば、対物レンズの光軸方向（深さ方向）に伸長された縞状の光を得ることができる。
本発明の一側面に係る画像取得装置では、基本位相パターンは、所定の方向における中心を通り且つ所定の方向と直交する直線に関して非線対称となっていてもよい。これによれば、縞状の光における縞の発生位置や深さ、伸長量を調整することができる。
本発明の一側面に係る画像取得装置では、第１の領域と第２の領域とは、互いに隣接し、その境界において位相値が連続していてもよい。これによれば、基本位相パターンが単純化されるため、縞状の光を生成するのに複雑な光学素子等を用いる必要がなく、構成をより一層簡易化することができる。
本発明の一側面に係る画像取得装置では、基本位相パターンは、位相値が一定である第３の領域を更に有していてもよい。これによれば、対物レンズの光軸方向に沿って構造化された三次元の構造化照明光を生成することが可能となる。この構造化照明光を用いることで、三次元の超解像画像を構築することが可能となる。
本発明の一側面に係る画像取得装置では、第３の領域は、所定の方向において第１の領域と第２の領域との間に配置されていてもよい。本発明の一側面に係る画像取得装置では、基本位相パターンは、２つの第１の領域と、２つの第２の領域と、２つの第３の領域と、を有し、２つの第３の領域の一方は、所定の方向において２つの第１の領域の間に配置され、２つの第３の領域の他方は、所定の方向において２つの第２の領域の間に配置されていてもよい。本発明の一側面に係る画像取得装置では、基本位相パターンは、２つの第３の領域を有し、２つの第３の領域の一方は、第１の領域に対して所定の方向において第２の領域と反対側に配置され、２つの第３の領域の他方は、第２の領域に対して所定の方向において第１の領域と反対側に配置されていてもよい。これらによれば、基本位相パターンが単純化されるため、縞状の光を生成するのに複雑な光学素子等を用いる必要がなく、構成をより一層簡易化することができる。
本発明の一側面に係る画像取得装置では、位相パターンは、回折格子状の回折格子パターンと基本位相パターンとが重畳された位相パターンであってもよい。これによれば、回折格子素子を設けることなく、照明光の位相を回折格子状とすることができる。そのため、構成をより一層簡易化することができる。
本発明の一側面に係る画像取得装置では、位相パターンは、レンズ状のレンズパターンと基本位相パターンとが重畳された位相パターンであってもよい。これによれば、レンズ素子を設けることなく、照明光の位相をレンズ状とすることができる。そのため、構成をより一層簡易化することができる。
本発明の一側面に係る画像取得方法は、構造化照明光を照射して観察対象物の画像を取得する画像取得方法であって、二次元に配列された複数の画素を有する空間光変調器により、光源から出力された光の位相を複数の画素毎に変調する第１のステップと、空間光変調器で変調された光を観察対象物に照射し、観察対象物からの光を撮像する第２のステップと、を含み、第１のステップでは、所定の基本位相パターンに基づいて生成され、複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って複数の画素毎の位相変調量を制御し、基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域と、所定の方向において第１の領域と対向し、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域と、を有する。
この画像取得方法では、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域と、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域と、を有する基本位相パターンに基づいて位相パターンを算出する。この位相パターンに従って空間光変調器で照明光を変調することにより、観察対象物に対して縞状の光を照射することが可能となる。この画像取得方法では、空間光変調器に入力する位相パターンを変更することによって、生成される縞状の光の位相及び縞の方向を変更することができる。そのため、従来技術のように縞状の光の位相及び縞の方向を変更するための可動機構を設ける必要がなく、それらを省略することができる。よって、この画像取得方法によれば、構成を簡易化することができる。
本発明の一側面に係る空間光変調ユニットは、構造化照明顕微鏡に用いられる空間光変調ユニットであって、二次元に配列された複数の画素を有し、入力された光の位相を複数の画素毎に変調して変調後の光を出力する空間光変調器と、複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域と、所定の方向において第１の領域と対向し、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域と、を有する。
この空間光変調ユニットでは、所定の方向に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域と、所定の方向に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域と、を有する基本位相パターンに基づいて位相パターンを算出する。この位相パターンに従って空間光変調器で照明光を変調することにより、観察対象物に対して縞状の光を照射することが可能となる。この空間光変調ユニットでは、空間光変調器に入力する位相パターンを変更することによって、生成される縞状の光の位相及び縞の方向を変更することができる。そのため、従来技術のように縞状の光の位相及び縞の方向を変更するための可動機構を設ける必要がなく、それらを省略することができる。よって、この空間光変調ユニットを用いた構造化照明顕微鏡によれば、構成を簡易化することができる。
本発明によれば、構成を簡易化できる画像取得装置、画像取得方法、及び空間光変調ユニットを提供できる。
本発明の画像取得装置の一実施形態である構造化照明顕微鏡の構成を示すブロック図である。 図１のライトシート顕微鏡で用いられる基本位相パターンを示す図である。 縞状の照明光が生成される様子を説明する概念図である。 生成された縞状の照明光を示す概念図である。 超解像画像の構築手法を説明する概念図である。 超解像画像の構築手法を説明する概念図である。 基本位相パターンの第１の変形例を示す図である。 第１変形例の基本位相パターンを用いて縞状の光が生成される様子を説明する概念図である。 基本位相パターンの第２〜第４の変形例を示す図である。 回折格子パターンが基本位相パターンに重畳される様子を説明する図である。 レンズパターンが基本位相パターンに重畳される様子を説明する図である。 基本位相パターンの第５〜第７の変形例を示す図である。 第５〜第７変形例の基本位相パターンによって生成される縞状の照明光を示す概念図である。 基本位相パターンの第８〜第１０の変形例を示す図である。
以下、本発明の画像取得装置及び画像取得方法に係る実施形態について、図面を参照しつつ詳細に説明する。なお、以下の説明において、同一又は相当要素には同一符号を用い、重複する説明は省略する。
図１に示される構造化照明顕微鏡（画像取得装置）１は、試料（観察対象物）Ｓの表面に照明光Ｌ１を照射し、それに伴って試料Ｓから発せられる蛍光又は反射光等の検出光Ｌ２を撮像することで、試料Ｓの画像を取得する装置である。試料Ｓに照射される照明光Ｌ１は、所定の周期構造をもった縞状の光（構造化照明光）となっている。構造化照明顕微鏡１では、後述するように、構造化照明光の位相及び縞の方向を変えて複数の画像を取得し、それらの画像に基づいて所定の演算を行うことで、解像限界を超えた高い解像度を有する超解像画像を構築することが可能となる。
観察対象物となる試料Ｓは、例えば、蛍光色素又は蛍光遺伝子等の蛍光物質を含む細胞又は生体等のサンプルである。また、試料Ｓは、半導体デバイス又はフィルム等のサンプルであってもよい。試料Ｓは、所定の波長域の光（励起光又は照明光）が照射された場合に、例えば蛍光等の検出光Ｌ２を発する。試料Ｓは、例えば、少なくとも照明光Ｌ１及び検出光Ｌ２に対する透過性を有するホルダ内に収容されている。このホルダは、例えばステージ上に保持されている。
図１に示されるように、構造化照明顕微鏡１は、光源１１と、コリメータレンズ１２と、空間光変調器（ＳＬＭ：Spatial Light Modulator）１３と、第１の光学系１４と、ダイクロイックミラー１５と、対物レンズ１６と、第２の光学系１７と、光検出器１８と、制御部１９と、を備えている。
光源１１は、試料Ｓを励起させる波長を含む照明光Ｌ１を出力する。光源１１は、例えば、コヒーレント光又はインコヒーレント光を出射する。コヒーレント光源としては、例えば、レーザダイオード（ＬＤ）といったレーザ光源等が挙げられる。インコヒーレント光源としては、例えば、発光ダイオード（ＬＥＤ）、スーパールミネッセントダイオード（ＳＬＤ）又はランプ系光源等が挙げられる。レーザ光源としては、連続波（Continuous Wave)を発振する光源が好ましく、超短パルス光等のパルス光を発振する光源が用いられてもよい。パルス光を発振する光源としては、パルス光を出力する光源と、光シャッタ又はパルス変調用のＡＯＭ（Acousto-Optic Modulator）とを組み合わせたユニットが用いられてもよい。光源１１は、複数の波長域を含む照明光Ｌ１を出力するように構成されてもよい。この場合、音響光学可変フィルタ（Acousto-Optic Tunable Filter）等の光学フィルタにより照明光Ｌ１の波長の一部を選択的に透過させてもよい。
コリメータレンズ１２は、光源１１から出力された照明光Ｌ１を平行化し、平行化された照明光Ｌ１を出力する。ＳＬＭ１３は、二次元に配列された複数の画素を有し、光源１１から出力された照明光Ｌ１の位相を当該複数の画素毎に変調する位相変調型の空間光変調器である。ＳＬＭ１３は、コリメータレンズ１２から入射された照明光Ｌ１を変調し、変調された照明光Ｌ１を第１の光学系１４に向けて出力する（第１のステップ）。ＳＬＭ１３は、例えば透過型又は反射型に構成されている。図１では、透過型のＳＬＭ１３が示されている。ＳＬＭ１３は、例えば、屈折率変化材料型ＳＬＭ（例えば、ＬＣＯＳ（Liquid Crystal on Silicon）型ＳＬＭ、ＬＣＤ（LiquidCrystal Display））、可変鏡型ＳＬＭ（例えば、Segment Mirror型ＳＬＭ、Continuous Deformable Mirror型ＳＬＭ）、又は電気アドレス型液晶素子若しくは光アドレス型液晶素子を用いたＳＬＭ等である。ＳＬＭ１３は、制御部１９のコントローラ２１に電気的に接続されており、空間光変調ユニットを構成している。ＳＬＭ１３は、制御部１９のコントローラ２１によりその駆動が制御される。制御部１９によるＳＬＭ１３の制御の詳細については後述する。
第１の光学系１４は、ＳＬＭ１３から出力された照明光Ｌ１が対物レンズ１６に導光されるように、ＳＬＭ１３と対物レンズ１６とを光学的に結合している。ここでの第１の光学系１４は、ＳＬＭ１３からの照明光Ｌ１を対物レンズ１６の瞳で集光させるレンズ１４ａを有している。
ダイクロイックミラー１５は、照明光Ｌ１と検出光Ｌ２とを分離するための光学素子である。ダイクロイックミラー１５は、例えば、励起波長の照明光Ｌ１を透過し、蛍光波長の検出光Ｌ２を反射するように構成されている。また、ダイクロイックミラー１５の代わりに偏光ビームスプリッタを用いてもよい。なお、ダイクロイックミラー１５の前後の光学系（例えば、第１の光学系１４及び第２の光学系１７）、又は適用する顕微鏡の種類によっては、ダイクロイックミラー１５は、照明光Ｌ１を反射し、蛍光波長の検出光Ｌ２を透過するように構成されていてもよい。
対物レンズ１６は、ＳＬＭ１３で変調された照明光Ｌ１を集光して試料Ｓに照射すると共に、それに伴って試料Ｓから発せられる検出光Ｌ２を導光する（第２のステップ）。対物レンズ１６は、ピエゾアクチュエータ又はステッピングモータ等の駆動素子により、その光軸に沿って移動可能に構成されている。これにより、照明光Ｌ１の集光位置、及び検出光Ｌ２の検出のための焦点位置が調整可能となっている。
第２の光学系１７は、対物レンズ１６から導光された検出光Ｌ２が光検出器１８で結像されるように、対物レンズ１６と光検出器１８とを光学的に結合している。第２の光学系１７は、対物レンズ１６からの検出光Ｌ２を光検出器１８の受光面で結像させるレンズ１７ａを有している。
光検出器１８は、対物レンズ１６により導光されて受光面で結像された検出光Ｌ２を撮像する（第２のステップ）。光検出器１８は、例えば、ＣＣＤイメージセンサ又はＣＭＯＳイメージセンサ等のエリアイメージセンサである。
制御部１９は、プロセッサ及びメモリ等を含むコンピュータ２０及びプロセッサ及びメモリ等を含むコントローラ２１により構成されている。コンピュータ２０は、例えば、パーソナルコンピュータあるいはスマートデバイスであり、プロセッサにより、対物レンズ１６、及び光検出器１８等の動作を制御し、各種の制御を実行する。
コントローラ２１は、コンピュータ２０と電気的に接続され、図２に示されるような二次元の位相パターンＰに従ってＳＬＭ１３における複数の画素毎の位相変調量を制御する。位相パターンＰは、二次元平面上の位置に関する位相値のパターンであり、位相パターンＰにおける各位置は、ＳＬＭ１３の複数の画素に対応している。位相パターンＰの位相値は、０〜２πラジアンの間で規定されている。図２では、色の濃さによって位相パターンＰの各部における位相値が表されている。なお、位相パターンＰの位相値の上限は、２πラジアンよりも大きくてもよい。
コントローラ２１は、ＳＬＭ１３の各画素について、位相パターンＰにおける当該画素に対応する位置の位相値に従って当該画素の位相変調量を制御する。具体的には、例えば、コントローラ２１内には、ＤＶＩ（Digital Video Interface）等のデジタルデータとして入力される位相パターンＰの位相値を各画素に印加される駆動電圧値に変換するＤ／Ａ変換部（デジタル−アナログ変換器）が設けられている。コンピュータ２０からコントローラ２１に位相パターンＰが入力されると、コントローラ２１は、Ｄ／Ａ変換部により位相パターンＰの位相値を駆動電圧値に変換し、ＳＬＭ１３に駆動電圧値を入力する。ＳＬＭ１３は、入力された駆動電圧値に応じて各画素に電圧を印加する。なお、例えば、ＳＬＭ１３がＤ／Ａ変換部を有し、コントローラ２１が位相パターンＰに応じたデジタルデータをＳＬＭ１３に入力してもよい。この場合、ＳＬＭ１３のＤ／Ａ変換部で位相パターンＰの位相値を駆動電圧値に変換する。また、Ｄ／Ａ変換を行わず、ＳＬＭ１３がコントローラ２１から出力されたデジタル信号に基づいて各画素に印加される電圧値を制御してもよい。
位相パターンＰは、制御部１９のコンピュータ２０により、所定の基本位相パターン３１に基づいて算出される。基本位相パターン３１は、例えば、コンピュータ２０のメモリに予め記憶されている。基本位相パターン３１に基づいて算出された位相パターンＰに従ってＳＬＭ１３で照明光Ｌ１を変調することで、対物レンズ１６から縞状の照明光Ｌ１を照射することが可能となる。後述するように、位相パターンＰは、基本位相パターン３１に他のパターンを更に重畳することで算出される場合もあるが、以下では、基本位相パターン３１がそのまま位相パターンＰとして用いられる場合について説明する。
図２に示されるように、基本位相パターン３１は、例えば矩形状の範囲内に設定されている。基本位相パターン３１は、所定の方向Ｄ１に沿って連続的に位相値が増加する矩形状の第１の領域３２と、方向Ｄ１において第１の領域３２と対向し、方向Ｄ１に沿って連続的に位相値が減少する矩形状の第２の領域３３と、を有している。すなわち、第１の領域３２と第２の領域３３とでは、位相値が増減する方向が互いに反対になっている。なお、ある領域において「連続的に位相値が増加する」とは、当該領域の全体に亘って位相値が途切れることなく連続していることを意味する。また、位相値が０ラジアンである場合と位相値が２πラジアンである場合とは同じ状態を意味しており、位相値が０ラジアンと２πラジアンとの間を跨いで変化したとしても位相値は連続している。
第１の領域３２では、位相値は方向Ｄ１に沿って直線的に増加している。第２の領域３３では、位相値は方向Ｄ１に沿って直線的に減少している。第１の領域３２及び第２の領域３３のいずれにおいても、位相値は２πラジアンだけ変化している。すなわち、第１の領域３２における位相値の傾き（増加の割合）の絶対値と第２の領域３３における位相値の傾き（減少の割合）の絶対値とは、等しくなっている。第１の領域３２及び第２の領域３３のいずれにおいても、方向Ｄ１と直交する方向Ｄ２に沿っては、位相値が一定となっている。第１の領域３２と第２の領域３３とは、互いに隣接し、その境界において位相値が連続している。この例では、境界における位相値は０ラジアンとなっている。基本位相パターン３１は、方向Ｄ１における中心を通り且つ方向Ｄ１と直交する直線（中心線）Ｃに関して線対称となっている。この例では、第１の領域３２と第２の領域３３の境界は中心線Ｃ上に位置している。
図３は、基本位相パターン３１に従ってＳＬＭ１３で照明光Ｌ１が変調されることで縞状の照明光Ｌ１が生成される様子を説明する概念図である。図３（ａ）は、方向Ｄ２に対応する方向ｄ２から見た場合の照明光Ｌ１の光路を示す図であり、図３（ｂ）は、方向Ｄ１に対応する方向ｄ１から見た場合の照明光Ｌ１の光路を示す図である。図３（ａ）では、第１の領域３２に入射する照明光Ｌ１の光路の例として、対物レンズ１６の光軸Ｘからの距離が小さい順に３つの照明光Ａ１，Ｂ１，Ｃ１が示されている。また、第２の領域３３に入射する照明光Ｌ１の光路の例として、光軸Ｘからの距離が小さい順に３つの照明光Ａ２，Ｂ２，Ｃ２が示されている。
図３（ａ）に示されるように、照明光Ａ１，Ａ２は、ＳＬＭ１３でその位相が所定量だけ遅らせられる。照明光Ｂ１，Ｂ２では、ＳＬＭ１３での位相の遅れ量が照明光Ａ１，Ａ２よりも大きくなる。照明光Ｃ１，Ｃ２では、ＳＬＭ１３での位相の遅れ量が照明光Ａ１，Ａ２よりも小さくなり、位相はＳＬＭ１３でほぼ変化しない。図３（ｂ）に示されるように、方向ｄ１から見た場合には、照明光Ｌ１の位相はＳＬＭ１３で変化しない。以上により、図３の直線Ｙ１に沿う位置には、図４に示されるような縞状の照明光Ｌ１が生成される。この例では、縞状の照明光Ｌ１は、光軸Ｘと直交する平面に沿って生成される。
構造化照明顕微鏡１では、ＳＬＭ１３に入力される位相パターンＰを変更することで、生成される縞状の照明光Ｌ１の位相及び縞の方向を制御することができる。例えば、第１の領域３２及び第２の領域３３における位相値のオフセット値（初期位相値）を変更することにより、生成される縞状の照明光Ｌ１の位相を変更することができる。また、例えば、第１の領域３２及び第２の領域３３において位相値が変化する方向Ｄ１の角度を変更することにより、生成される照明光Ｌ１の縞の方向を変更することができる。
次に、構造化照明顕微鏡１に基づく超解像画像の構築手法を説明する。構造化照明法の基本原理は、例えば下記参考文献１に記載されている。
（参考文献１）及川義明、超解像顕微鏡の技術と応用、顕微鏡Ｖｏｌ．４７、Ｎｏ．４、２０１２
構造化照明法では、ある既知の空間周波数をもった縞状の照明光Ｌ１が試料Ｓに照射される。縞状の照明光Ｌ１が従来の顕微鏡で解像できないほどの微小構造に照射されると、空間周波数が低い模様（モアレ）が現れる。このとき、試料Ｓの微小構造の空間周波数をＶ１、照明光Ｌ１の空間周波数をＶ２、モアレの空間周波数をＶ３とすると、次の式（１）の関係が成り立つ。
Ｖ１＝Ｖ２＋Ｖ３ …（１）
ここで、Ｖ２は既知であり、モアレの空間周波数Ｖ３は画像から読み取れるので、これらＶ２，Ｖ３から試料Ｓの空間周波数Ｖ１を算出することができる。
さらに、縞状の照明光Ｌ１の位相及び縞の方向を変えて取得した画像を用いることで、従来の顕微鏡で解像可能な低周波成分とモアレに含まれる超解像成分（高周波成分）とを互いに分離することができる。例えば、図５に示されるように、互いに角度が１２０度ずつ異なる３つの方向を第１方向Ｓ１、第２方向Ｓ２、及び第３方向Ｓ３とすると、縞の方向が第１方向Ｓ１と一致し且つ互いに位相が異なる３つの縞状の照明光Ｐ１，Ｐ２，Ｐ３、縞の方向が第２方向Ｓ２と一致し且つ互いに位相が異なる３つの縞状の照明光Ｑ１，Ｑ２，Ｑ３、及び縞の方向が第３方向Ｓ３と一致し且つ互いに位相が異なる３つの縞状の照明光Ｒ１，Ｒ２，Ｒ３の各照明光で照明した９枚の試料Ｓの画像が取得される。
次いで、図６に示されるように、それらの９つの画像にフーリエ変換が施され、９つの画像が周波数空間上におけるフーリエ像に変換される。次いで、フーリエ像の超解像成分が、周波数空間上において本来の空間周波数の位置に再配置される。これにより、表現される空間周波数の範囲Ｚ１が、従来の空間周波数の範囲Ｚ２の２倍まで拡張される。次いで、再配置により得られた像に逆フーリエ変換が施される。以上により、実空間上の超解像画像を構築することができる。
以上説明したように、構造化照明顕微鏡１では、方向Ｄ１に沿って連続的に位相値が増加する第１の領域３２と、方向Ｄ１に沿って連続的に位相値が減少する第２の領域３３と、を有する基本位相パターン３１に基づいて位相パターンＰが算出される。この位相パターンＰに従ってＳＬＭ１３で照明光Ｌ１を変調することにより、対物レンズ１６から試料Ｓに対して縞状の照明光Ｌ１を照射することが可能となる。構造化照明顕微鏡１では、ＳＬＭ１３に入力する位相パターンＰを変更することによって、生成される縞状の照明光Ｌ１の位相及び縞の方向を変更することができる。そのため、従来技術のように縞状の照明光Ｌ１の位相及び縞の方向を変更するための可動機構を設ける必要がなく、それらを省略することができる。よって、構造化照明顕微鏡１によれば、構成を簡易化することができる。
構造化照明顕微鏡１においては、第１の領域３２では、位相値は方向Ｄ１に沿って直線的に増加し、第２の領域３３では、位相値は方向Ｄ１に沿って直線的に減少している。これにより、基本位相パターン３１が単純化されるため、縞状の照明光Ｌ１を生成するのに複雑な光学素子等を用いる必要がなく、構成を一層簡易化することができる。すなわち、第１の領域３２及び第２の領域３３の少なくとも一方において位相値が方向Ｄ１に沿って直線的に増加していない場合、縞状の照明光Ｌ１を生成するための第１の光学系１４又は対物レンズ１６等の光学系の構成が複雑化してしまうおそれがある。対して、構造化照明顕微鏡１においては、第１の領域３２及び第２の領域３３のいずれにおいても位相値が方向Ｄ１に沿って直線的に増加しているため、縞状の照明光Ｌ１を生成するための光学系の構成が簡易化されている。
構造化照明顕微鏡１では、基本位相パターン３１が直線Ｃに関して線対称となっている。これにより、対物レンズ１６の光軸Ｘに沿う方向（深さ方向）に伸長させた縞状の光を得ることができる。また、構造化照明顕微鏡１では、基本位相パターン３１が左右対称となっている（方向Ｄ２における中心を通り且つ方向Ｄ２と直交する直線に関して線対称となっている）。これにより、セルフヒーリング効果による散乱の影響を緩和することができ、試料Ｓの表面だけでなく深部にまで到達する照明光Ｌ１を生成することが可能となる。
構造化照明顕微鏡１では、第１の領域３２と第２の領域３３とが互いに隣接し、その境界において位相値が連続している。これにより、基本位相パターン３１が単純化されるため、縞状の照明光Ｌ１を生成するのに複雑な光学素子等を用いる必要がなく、構成を一層簡易化することができる。
以上、本発明の好適な実施形態について説明したが、本発明は上記実施形態に限られない。例えば、図７に示される第１の変形例の基本位相パターン３１Ａが用いられてもよい。基本位相パターン３１Ａの第２の領域３３Ａでは、位相値が方向Ｄ１に沿って直線的に４πラジアンだけ減少している。すなわち、第１の領域３２における位相値の傾きの絶対値と第２の領域３３Ａにおける傾きの絶対値とが異なっている。基本位相パターン３１Ａは、中心線Ｃに関して非線対称となっている。この例でも、第１の領域３２と第２の領域３３Ａの境界は中心線Ｃ上に位置している。
このような基本位相パターン３１Ａが用いられた場合でも、図８に示されるように、基本位相パターン３１Ａに従ってＳＬＭ１３で照明光Ｌ１が変調されることにより、縞状の照明光Ｌ１が生成される。この場合、図８（ａ）に示されるように、第２の領域３３Ａに入射する照明光Ａ２では、ＳＬＭ１３での位相の遅れ量が第１の領域３２に入射する照明光Ａ１よりも大きくなる。同様に、照明光Ｂ２では、ＳＬＭ１３での位相の遅れ量が照明光Ｂ１よりも大きくなり、照明光Ｃ２では、ＳＬＭ１３での位相の遅れ量が照明光Ｃ１よりも大きくなる。これにより、上記実施形態の場合とは異なる図８の直線Ｙ２に沿う位置に、縞状の照明光Ｌ１が生成される。この場合も、縞状の照明光Ｌ１は、光軸Ｘと直交する平面に沿って生成される。
このように、第１の変形例によっても、上記実施形態の場合と同様に、対物レンズ１６から試料Ｓに対して縞状の照明光Ｌ１を照射することが可能となり、構成を簡易化することができる。また、第１の変形例では、基本位相パターン３１が直線Ｃに関して非線対称となっているため、縞状の光における縞の発生位置や深さ、伸長量を調整することができる。
また、図９に示される第２の変形例の基本位相パターン３１Ｂ、第３の変形例の基本位相パターン３１Ｃ、又は第４の変形例の基本位相パターン３１Ｄが用いられてもよい。基本位相パターン３１Ｂの第１の領域３３Ｂでは、位相値が方向Ｄ１に沿って直線的に４πラジアンだけ増加している。すなわち、第１の領域３２Ｂにおける位相値の傾きの絶対値と第２の領域３３Ａにおける位相値の傾きの絶対値とが等しくなっている。
基本位相パターン３１Ｃでは、第１の領域３２と第２の領域３３との方向Ｄ１における位置関係が上記実施形態の場合とは逆になっている。すなわち、上述した基本位相パターン３１においては、第１の領域３２では、境界（中心線Ｃ）からの距離が大きくなるほど位相値が増加し、第２の領域３３では、境界からの距離が小さくなるほど位相値が減少していたのに対し、基本位相パターン３１Ｃにおいては、第１の領域３２では、境界からの距離が小さくなるほど位相値が増加し、第２の領域３３では、境界からの距離が大きくなるほど位相値が減少している。
基本位相パターン３１Ｄでは、上記第３の変形例と同様に、第１の領域３２Ｄと第２の領域３３Ｄとの方向Ｄ１における位置関係が上記実施形態の場合と逆になっている。さらに、基本位相パターン３１Ｄにおいては、第１の領域３２Ｄでは、位相値が方向Ｄ１に沿って直線的に４πラジアンだけ増加し、第２の領域３３Ｄでは、位相値が方向Ｄ１に沿って直線的に４πラジアンだけ減少している。基本位相パターン３１Ｂ〜３１Ｄは、中心線Ｃに関して線対称となっている。基本位相パターン３１Ｂ〜３１Ｄでも、第１の領域３２と第２の領域３３Ａの境界は中心線Ｃ上に位置している。
これらの基本位相パターン３１Ｂ〜３１Ｄが用いられた場合でも、上記実施形態の場合と同様に、対物レンズ１６から試料Ｓに対して縞状の照明光Ｌ１を照射することが可能となり、構成を簡易化することができる。
また、図１０に示されるように、回折格子状の回折格子パターン４１を基本位相パターン３１に重畳することで位相パターンＰが算出されてもよい。回折格子パターン４１は、方向Ｄ２において回折格子状をなしている。また、図１１に示されるように、例えばフレネルレンズ等のレンズ状のレンズパターン４２を基本位相パターン３１に重畳することで位相パターンＰが算出されてもよい。なお、回折格子パターン４１又はレンズパターン４２を基本位相パターン３１Ａ〜３１Ｃに重畳することで位相パターンＰが算出されてもよい。
これらの場合でも、上記実施形態の場合と同様に、対物レンズ１６から試料Ｓに対して縞状の照明光Ｌ１を照射することが可能となり、構成を簡易化することができる。また、回折格子素子又はレンズ素子を設けることなく、照明光の位相を回折格子状又はレンズ状とすることができる。そのため、構成を一層簡易化することができる。
また、図１２に示される第５の変形例の基本位相パターン３１Ｅ、第６の変形例の基本位相パターン３１Ｆ、又は第７の変形例の基本位相パターン３１Ｇが用いられてもよい。基本位相パターン３１Ｅ，３１Ｆ，３１Ｇは、第１の領域３２Ｅ，３２Ｆ，３２Ｇ及び第２の領域３３Ｅ，３３Ｆ，３３Ｇに加えて、位相値が一定である第３の領域３４Ｅ，３４Ｆ，３４Ｇを有している。第１の領域３２Ｅ，３２Ｆ，３２Ｇ及び第２の領域３３Ｅ，３３Ｆ，３３Ｇは、上記実施形態の第１の領域３２及び第２の領域３３における対応する部分と同一となっている。すなわち、第１の領域３２及び第２の領域３３から第３の領域３４Ｅ，３４Ｆ，３４Ｇを除いた部分が第１の領域３２Ｅ，３２Ｆ，３２Ｇ及び第２の領域３３Ｅ，３３Ｆ，３３Ｇとなっている。
基本位相パターン３１Ｅは、第１の領域３２Ｅと、第２の領域３３Ｅと、第３の領域３４Ｅと、を有している。第３の領域３４Ｅは、矩形状をなし、方向Ｄ１において第１の領域３２Ｅと第２の領域３３Ｅとの間に配置されている。第１の領域３２Ｅと第３の領域３４Ｅとの境界、及び第２の領域３３Ｅと第３の領域３４Ｅとの境界のそれぞれにおいては、位相値が連続している。
基本位相パターン３１Ｆは、２つの第１の領域３２Ｆ，３２Ｆと、２つの第２の領域３３Ｆ，３３Ｆと、２つの第３の領域３４Ｆ，３４Ｆと、を有している。第３の領域３４Ｆ，３４Ｆの一方は、方向Ｄ１において第１の領域３２Ｆ，３２Ｆの間に配置され、第３の領域３４Ｆ，３４Ｆの他方は、方向Ｄ１において第２の領域３３Ｆ，３３Ｆの間に配置されている。第１の領域３２Ｆと第３の領域３４Ｆとの領域においては、位相値が不連続となっている。第２の領域３３Ｆと第３の領域３４Ｆとの境界においては、位相値が連続している。
基本位相パターン３１Ｇは、２つの第３の領域３４Ｇ，３４Ｇを有している。基本位相パターン３１Ｇでは、第３の領域３４Ｇ，３４Ｇの一方は、第１の領域３２Ｇに対して方向Ｄ１において第２の領域３３Ｇと反対側に配置され、第３の領域３４Ｇ，３４Ｇの他方は、第２の領域３３Ｇに対して方向Ｄ１において第１の領域３２Ｇと反対側に配置されている。この例では、第３の領域３４Ｇ，３４Ｇのそれぞれは、基本位相パターン３１Ｇにおいて方向Ｄ１の両端に配置されている。第１の領域３２Ｇと第３の領域３４Ｇとの境界、及び第２の領域３３Ｇと第３の領域３４Ｇとの境界のそれぞれにおいては、位相値が連続している。基本位相パターン３１Ｅ〜３１Ｇは、中心線Ｃに関して線対称となっている。
このような基本位相パターン３１Ｅ〜３１Ｇによっても、上記実施形態の場合と同様に、対物レンズ１６から試料Ｓに対して縞状の照明光Ｌ１を照射することが可能となり、構成を簡易化することができる。また、基本位相パターン３１Ｅ〜３１Ｇが単純化されるため、縞状の光を生成するのに複雑な光学素子等を用いる必要がなく、構成をより一層簡易化することができる。
さらに、基本位相パターン３１Ｅ〜３１Ｇによれば、対物レンズ１６の光軸Ｘに沿う方向（光軸方向）に沿って構造化された三次元の構造化照明光を生成することが可能となる。すなわち、位相値が一定である第３の領域３４Ｅ，３４Ｆ，３４Ｇを有する基本位相パターン３１Ｅ〜３１Ｇを用いた場合、例えば、光軸方向の第１の位置においては、図１３（ａ）に示されるように、縞上に一定間隔で隙間５１が形成された縞状の照明光Ｌ１が生成される。一方、光軸方向の第１の位置とは異なる第２の位置においては、図１３（ｂ）に示されるように、図１３（ａ）の場合とは異なる位置に隙間５２が形成された縞状の照明光Ｌ１が生成される。このように、基本位相パターン３１Ｅ〜３１Ｇを用いた場合、対物レンズ１６の光軸方向における位置に従って生成される照明光Ｌ１の位相が変化することとなり、光軸方向に沿っても構造化された三次元の構造化照明光を生成することが可能となる。
この三次元の構造化照明光を用いることで、三次元の超解像画像を構築することが可能となる。すなわち、例えば、対物レンズ１６の焦点位置を光軸方向に移動することで、光軸方向の複数の位置において試料Ｓの画像が取得される。このとき、各位置において、例えば上記実施形態の場合と同様に、位相及び縞の方向を変えて複数の画像が取得される。これにより取得された複数の画像に基づいて構築される各位置での二次元の超解像画像を互いに組み合わせる（三次元方向に積算する）ことで、光軸方向に沿っても構造化された三次元の超解像画像を構築することができる。
あるいは、三次元の超解像画像を構築する方法としては、下記参考文献２に記載された方法が用いられてもよい。この方法では、光軸方向の各位置で取得された画像から、二次元の超解像画像を構築することなく、直接的に三次元の超解像画像を構築する。
（参考文献２）MatsG. L. Gustafsson, Lin Shao Peter M. Carlton, C. J. Rachel Wang, Inna N. Golubovskaya,W. Zacheus Cande, David A. Agard, and John W. Sedat, "Three-dimensionalresolution doubling in wide-field fluorescence microscopy by structuredillumination", June 2008/ Vol.94, No.12/ Biophysical Journal pp.4957-70
すなわち、二次元の場合には円形状の領域を切り出して周波数空間上で再配置するのに対し（図６）、三次元の場合には例えば中央部が窪んだ円盤状の領域を切り出して三次元の周波数空間上で再配置すればよい。例えば、照明光Ｌ１の位相及び縞の方向を変えて得られた１８個（３方向のそれぞれについて６個ずつ）のフーリエ像を立体的に再配置し、再配置により得られた像に対して三次元の逆フーリエ変換を行うことで、光軸方向に沿っても構造化された三次元の超解像画像を構築することができる。
また、図１４に示される第８の変形例の基本位相パターン３１Ｈ、第９の変形例の基本位相パターン３１Ｉ、又は第１０の変形例の基本位相パターン３１Ｊが用いられてもよい。基本位相パターン３１Ｈは、第３の領域３４Ｈにおいて位相が０ラジアンとなっており、第１の領域３２Ｅと第３の領域３３Ｈとの境界、及び第２の領域３３Ｅと第３の領域３４Ｈとの境界のそれぞれにおいて位相値が不連続となっている点で上記基本位相パターン３１Ｅと相違する。
基本位相パターン３１Ｉは、第２つの第３の領域３４Ｉにおいて位相が０ラジアンとなっており、第１の領域３２Ｆと第３の領域３３Ｉとの境界、及び第２の領域３３Ｆと第３の領域３４Ｉとの境界のそれぞれにおいて位相値が不連続となっている点で上記基本位相パターン３１Ｆと相違する。基本位相パターン３１Ｊは、第２つの第３の領域３４Ｊにおいて位相が０ラジアンとなっており、第１の領域３２Ｇと第３の領域３３Ｊとの境界、及び第２の領域３３Ｇと第３の領域３４Ｊとの境界のそれぞれにおいて位相値が不連続となっている点で上記基本位相パターン３１Ｇと相違する。
このような基本位相パターン３１Ｈ〜３１Ｊによっても、上記実施形態の場合と同様に、対物レンズ１６から試料Ｓに対して縞状の照明光Ｌ１を照射することが可能となり、構成を簡易化することができる。また、対物レンズ１６の光軸方向に沿っても構造化された三次元の構造化照明光を生成することが可能となる。
また、上記実施形態において、蛍光に代えて試料Ｓからの反射光を撮像してもよく、あるいは、試料Ｓの透過光を撮像してもよい。これらの場合、試料Ｓに照射する照明光Ｌ１は励起光でなくてもよい。また、上記実施形態において、制御部１９は、収差補正のためのパターンを基本位相パターン３１に重畳して位相パターンＰを算出してもよい。
また、上記実施形態の照明光Ｌ１は、光軸Ｘ上においてシート状に結像している。そのため、本発明の画像取得装置は、ライトシート顕微鏡に適用することもできる。ライトシート顕微鏡では、シート状の励起光（照明光Ｌ１）を試料Ｓに照射し、照明光Ｌ１の照射に伴って試料Ｓから発せられる検出光Ｌ２を撮像する。ライトシート顕微鏡は、例えば、ＳＬＭ１３で変調された照明光Ｌ１を試料Ｓに照射する第１の対物レンズと、第１の対物レンズからの照明光Ｌ１の照射に伴って試料Ｓから発せられる検出光Ｌ２を光検出器１８へ導光する第２の対物レンズと、を備えて構成される。第１の対物レンズの光軸と第２の対物レンズ光軸とは、例えば直交（交差）する。そして、第１の対物レンズの光軸と直交する方向に沿って照明光Ｌ１の集光位置が試料Ｓに対して走査され、各集光位置において試料Ｓの画像が取得される。ライトシート顕微鏡では、照明光Ｌ１が試料Ｓに照射される領域が狭いため、例えば光退色又は光毒性等の試料Ｓの劣化を抑制することができると共に、画像取得を高速化することができる。
１…構造化照明顕微鏡（画像取得装置）、１１…光源、１３…空間光変調器、１６…対物レンズ、１８…光検出器、１９…制御部、２０…コンピュータ、２１…コントローラ、３１…基本位相パターン、３２…第１の領域、３３…第２の領域、３４Ｅ〜３４Ｊ…第３の領域、４１…回折格子パターン、４２…レンズパターン、Ｃ…直線（中心線）、Ｄ１…所定の方向、Ｌ１…照明光、Ｌ２…検出光、Ｐ…位相パターン、Ｓ…試料（観察対象物）。

Claims (13)

  1. 構造化照明光を照射して観察対象物の画像を取得する画像取得装置であって、
    光を出力する光源と、
    二次元に配列された複数の画素を有し、前記光源から出力された光の位相を前記複数の画素毎に変調する空間光変調器と、
    前記空間光変調器で変調された光を前記観察対象物に照射する対物レンズと、
    前記観察対象物からの光を撮像する光検出器と、
    前記複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って前記複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、
    前記位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、
    前記基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に前記位相値が増加する第１の領域と、前記所定の方向において前記第１の領域と対向し、前記所定の方向に沿って連続的に前記位相値が減少する第２の領域と、を有する、画像取得装置。
  2. 前記第１の領域では、前記位相値は前記所定の方向に沿って直線的に増加し、前記第２の領域では、前記位相値は前記所定の方向に沿って直線的に減少している、請求項１記載の画像取得装置。
  3. 前記基本位相パターンは、前記所定の方向における中心を通り且つ前記所定の方向と直交する直線に関して線対称となっている、請求項１又は２記載の画像取得装置。
  4. 前記基本位相パターンは、前記所定の方向における中心を通り且つ前記所定の方向と直交する直線に関して非線対称となっている、請求項１又は２記載の画像取得装置。
  5. 前記第１の領域と前記第２の領域とは、互いに隣接すると共に、その境界において前記位相値が連続している、請求項１〜４のいずれか一項記載の画像取得装置。
  6. 前記基本位相パターンは、前記位相値が一定である第３の領域を更に有している、請求項１〜４のいずれか一項記載の画像取得装置。
  7. 前記第３の領域は、前記所定の方向において前記第１の領域と前記第２の領域との間に配置されている、請求項６記載の画像取得装置。
  8. 前記基本位相パターンは、２つの前記第１の領域と、２つの前記第２の領域と、２つの前記第３の領域と、を有し、
    前記第３の領域の一方は、前記所定の方向において前記第１の領域の間に配置され、前記第３の領域の他方は、前記所定の方向において前記第２の領域の間に配置されている、請求項６記載の画像取得装置。
  9. 前記基本位相パターンは、２つの前記第３の領域を有し、
    前記第３の領域の一方は、前記第１の領域に対して前記所定の方向において前記第２の領域と反対側に配置され、前記第３の領域の他方は、前記第２の領域に対して前記所定の方向において前記第１の領域と反対側に配置されている、請求項６記載の画像取得装置。
  10. 前記位相パターンは、回折格子状の回折格子パターンと前記基本位相パターンとが重畳された位相パターンである、請求項１〜９のいずれか一項記載の画像取得装置。
  11. 前記位相パターンは、レンズ状のレンズパターンと前記基本位相パターンとが重畳された位相パターンである、請求項１〜１０のいずれか一項記載の画像取得装置。
  12. 構造化照明光を照射して観察対象物の画像を取得する画像取得方法であって、
    二次元に配列された複数の画素を有する空間光変調器により、光源から出力された光の位相を前記複数の画素毎に変調する第１のステップと、
    前記空間光変調器で変調された光を前記観察対象物に照射し、前記観察対象物からの光を撮像する第２のステップと、を含み、
    前記第１のステップでは、所定の基本位相パターンに基づいて生成され、前記複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って前記複数の画素毎の位相変調量を制御し、
    前記基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に前記位相値が増加する第１の領域と、前記所定の方向において前記第１の領域と対向し、前記所定の方向に沿って連続的に前記位相値が減少する第２の領域と、を有する、画像取得方法。
  13. 構造化照明顕微鏡に用いられる空間光変調ユニットであって、
    二次元に配列された複数の画素を有し、入力された光の位相を前記複数の画素毎に変調して変調後の光を出力する空間光変調器と、
    前記複数の画素それぞれに対応する位相値が二次元に分布する位相パターンに従って前記複数の画素毎の位相変調量を制御する制御部と、を備え、
    前記位相パターンは、所定の基本位相パターンに基づいて生成された位相パターンであり、
    前記基本位相パターンは、所定の方向に沿って連続的に前記位相値が増加する第１の領域と、前記所定の方向において前記第１の領域と対向し、前記所定の方向に沿って連続的に前記位相値が減少する第２の領域と、を有する、空間光変調ユニット。
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