JP2020079929A - 構造化照明を備えた三次元顕微鏡法のための高速化された方法および装置 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明の有利な改良点は、従属請求項に特定されている。
本発明は、蛍光試料または非蛍光試料で実現することができる。蛍光試料の場合、光源は、試料に提供される蛍光色素の励起のために適切に具体化される。光源は、励起強度の幅広い変化を可能にするために、1つまたは複数のレーザー、特に強度調整可能な変調器を含むことが好ましい。
図1は、古典的な顕微鏡法、即ち解像度が回折限界の顕微鏡法と、超解像度顕微鏡法、即ち解像度が回折限界を超えた顕微鏡法との両方を実行することができる顕微鏡1を示す。
対物レンズ3は、ビームスプリッタ4を介して、チューブレンズ5と共に試料をCCD検出器6上に結像する。CCD検出器6は、この例では、一般的に可能性のあるエリア検出器である。この構成において、顕微鏡1は従来の光学顕微鏡モジュール7を有し、試料2から対物レンズ3およびチューブレンズ5を介してCCD検出器6までのビーム経路は、従来の広視野検出ビーム経路8と対応している。図1の双方向矢印で示されているように、ビームスプリッタ4は、米国特許出願公開第2008/0088920号明細書のように、異なるダイクロイック特性を有するビームスプリッタまたはアクロマティックビームスプリッタ間で切り替えられるように交換可能である。
図1に示す構成では、様々な顕微鏡法の照明放射が通過する集合照明ビーム経路16は、ビームスプリッタモジュール12、より具体的にはスイッチングミラー14で結合される。個々の照明モジュールの異なる照明ビーム経路は、この集合照明ビーム経路16に結合される。例えば、広視野照明モジュール17は、試料2がチューブレンズ27および対物レンズ3を介して広視野で照明されるように、広視野照明放射をスイッチングミラー18を介して集合照明ビーム経路16に結合する。広視野照明モジュール17は、例えば、HBOランプを有することができる。さらなる照明モジュールとして設けられるのは、スイッチングミラー18の適切な位置決めによりTIRF照明を実現するTIRF照明モジュール19である。この照明のために、TIRF照明モジュール19は、光ファイバー20を介してレーザーモジュール15から放射を受ける。TIRF照明モジュール19は、長手方向に変位可能なミラー21を有する。長手方向の変位により、TIRF照明モジュール19によって放射された照明ビームは、放射された照明ビームの主伝搬方向に対して垂直に変位し、その結果、TIRF照明は、対物レンズの光軸に関して調整可能な角度で対物レンズ3に入射する。このようにして、カバースリップでの全内部反射に必要な角度を確保することができる。当然ながら、他の手段もこの角度調整を行うのに適している。
図2は、SIM方法に従って単一焦点面を用いて超解像度画像を生成するために使用される概念を概略的に示している。図1の顕微鏡1下の試料は、広視野で繰り返し撮像され、その際、異なる照明状態が設定される。
照明パターンI(x,y,z)は、試料2との相互作用のために、その光学特性S(x,y,z)によって乗算され、検出PSF H(x,y,z)で振動される(convulsed)。
1…顕微鏡
2…試料
3…対物レンズ
4…ビームスプリッタ
5…チューブレンズ
6…CCD検出器
7…光学顕微鏡モジュール
8…広視野検出ビーム経路
9…レーザー走査モジュール
11…スイッチングミラー
12…ビームスプリッタモジュール
13…放射フィルタ
14…光ファイバー
15…レーザーモジュール
16…集合照明ビーム経路
17…広視野照明モジュール
18…スイッチングミラー18
19…TIRF照明モジュール
20…光ファイバー
21…ミラー
22…マニピュレータモジュール
23…格子
24…変位駆動装置
25…画像フィールド回転子
26…回転子駆動装置
27…チューブレンズ
28…制御装置
30…個別画像のセット
40…個別画像
41…照明構造
50…最終画像
Fi…焦点面
Xi…追加の試料平面
Claims (18)
- 顕微鏡(1)を使用して試料を撮像する方法であって、前記顕微鏡(1)を使用して、試料(2)の焦点面に焦点が合わされ、前記焦点面が構造化照明光(41)により連続的に複数の位相で照明され、位相ごとに試料(2)から放射および/または散乱された試料光が、検出器(6)を使用して個々の個別画像(40)に記録されて、前記個別画像(40)から解像度が増加した最終画像(50)が再構成される方法において、第1の焦点面とは異なる第2の焦点面に焦点を合わせ、かつ前記第2の焦点面に対しても異なる照明位相で個別画像(40)を記録するように前記顕微鏡(1)が使用され、2つの焦点面の前記個別画像(40)から最終画像(50)が再構成され、前記最終画像は、焦点面間に位置する試料平面を表すことを特徴とする方法。
- 追加の試料平面が間に位置する前記2つの焦点面間の距離が、前記顕微鏡によって光学的に分解可能な最小の軸方向距離の半分より大きくなるように選択される、請求項1に記載の方法。
- 追加の試料平面が間に位置する前記2つの焦点面間の距離が、前記顕微鏡によって光学的に分解可能な最小の軸方向距離よりも短くなるように選択される、請求項1または2に記載の方法。
- 焦点面および焦点面間に位置する試料平面の両方において、光構造と試料の光学特性および前記顕微鏡の点広がり関数との相互作用を記述する連立方程式の少なくとも1つの解が近似的に特定される、請求項1乃至3のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の連立方程式、または数学的に等価な連立方程式
- 近似解のために、線形回帰、特に正則化が使用され、特にすべての特異値の実際のサブセットのみが特定される打ち切り特異値分解が使用される、請求項2または3に記載の方法。
- 前記個別画像が、横方向に光学的にオーバーサンプリングされ、特に前記顕微鏡の光学系の光学解像度の2倍の解像度で記録される、請求項1乃至6のいずれか一項に記載の方法。
- 以下の連立方程式、または数学的に等価な連立方程式
- 試料で生成される光構造が、特に横方向の周期性および/または軸方向の周期性により規則的に構造化され、かつ特に、照明位相の各々における異なる位置および/または異なる方向に配置される、請求項1乃至8のいずれか一項に記載の方法。
- 焦点面間に位置する試料平面を表す前記最終画像(50)が、前記個別画像と比較して増加した解像度で再構成される、請求項1乃至9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個別画像または前記最終画像は、前記顕微鏡の点広がり関数のモデルに基づいて、特に計算により照明位相を分離した後、近似的に逆畳み込みされる、請求項1乃至10のいずれか一項に記載の方法。
- 逆畳み込みにおいて、前記個別画像の1つの、特に正確に1つのピクセルの(強度)部分が異なる最終画像に割り当てられる、請求項9に記載の方法。
- 逆畳み込みにおいて、前記個別画像の1つの、特に正確に1ピクセルの(強度)部分が、焦点面の1つを表す最終画像の少なくとも1つに部分的に割り当てられ、かつ焦点面間に位置する試料平面を表す最終画像に部分的に割り当てられる、請求項10に記載の方法。
- 焦点面間に位置する試料平面を表す最終画像への割り当てが、少なくとも2つの最も近い焦点面の個別画像の強度に基づいて行われる、請求項10または11に記載の方法。
- 二次元空間分解検出器が前記個別画像を記録するために使用され、特に試料を光学的に切片化するストップが検出器の前に配置されていない、請求項1乃至14のいずれか一項に記載の方法。
- 前記顕微鏡の点広がり関数は、軸非対称性を生成するために操作されない、請求項1乃至15のいずれか一項に記載の方法。
- 前記個別画像の各々の記録中に、前記顕微鏡を使用して正確に1つの焦点面のみが焦点合わせされる、請求項1乃至16のいずれか一項に記載の方法。
- 請求項1乃至17のいずれか一項に記載の方法を実行するように構成された制御ユニット(28)を含む顕微鏡(1)であって、光源と、試料(2)内の異なる焦点面に焦点を合わせるための手段と、瞬間的な焦点面の個別画像(40)を記録するための二次元空間分解検出器(6)と、試料(2)内への構造化照明光(41)を生成するための手段とを備え、検出器(6)の前に試料(2)を光学的に切片化するストップが配置されておらず、さらに特に軸非対称性を生成するために前記顕微鏡の点広がり関数が操作されない、顕微鏡。
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