KR101864984B1 - 유도방출억제를 이용한 형광 현미경 - Google Patents

유도방출억제를 이용한 형광 현미경 Download PDF

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이원섭
임건
최국종
문형배
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연세대학교 산학협력단
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Abstract

개시된 본 발명에 의한 유도방출억제를 이용한 형광 현미경은, 형광물질이 포함된 시료로 여기광(Excitation beam)을 방출하는 여기유닛, 시료로 유도방출억제(STED, Stimulated emission depletion)광을 방출하는 유도방출억제유닛, 여기광과 유도방출억제광을 상호 중첩시켜 시료로 안내하는 대물렌즈를 포함하는 광학유닛 및, 광학유닛에 의해 중첩된 광으로부터 시료의 이미지를 검출하는 검출유닛을 포함하며, 여기유닛은 여기광을 복수개 방출하거나 여기광을 분리시켜 방출하여 대물렌즈의 초점면에서 간섭을 발생시킨다. 이러한 구성에 의하면, 낮은 출력으로도 여기광의 간섭을 통해 고해상도의 검출이 가능해진다.

Description

유도방출억제를 이용한 형광 현미경{FLUORESCENCE MICROSCOPY USING THE SW-STED}
본 발명은 형광 현미경에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 여기광(excitation beam)의 간섭을 통해 점상 강도 분포함수(PSF; Point Spread Function)를 감소시킴으로써 해상도를 향상시킬 수 있는 유도방출억제를 이용한 형광 현미경에 관한 것이다.
근래에는 수직 방향의 해상도가 광학 현미경 대비 상대적으로 우수한 형광 현미경이 바이오 시료와 같은 시료의 이미징을 위해 적용되고 있다. 형광 현미경 중, 유도방출억제(STED, Stimulated emission depletion)를 이용한 형광 현미경(이하, 유도방출억제 현미경으로 지칭함)은 회절한계를 극복한 형광 현미경의 한 종류로써, 유도 방출을 응용하여 기존의 형광 현미경보다 월등한 해상도를 구현한다.
이러한 유도방출억제 현미경은 공초점 현미경(confocal microscopy) 방식을 기본으로 한다. 보다 구체적으로, 유도방출억제 현미경은 공초점 현미경과 유사하게, 여기광(Excitation beam)을 입사시켜 시료에 염색된 형광물질을 여기시키며, 여기 과정에서 초점영역의 형광물질이 여기상태로 전이되게 된다.
한편, 일반적인 형광 현미경에서는 여기된 형광물질에서 일어나는 자연 방출(spontaneous emission)을 감지하여 이미지를 획득함으로써, 이미지의 해상도는 렌즈의 스펙에 의해 좌우된다. 반면, 유도방출억제 현미경의 경우, 초점면의 외곽부에 도넛형상의 억제광(Depletion beam)을 집광시킴으로써, 여기된 영역의 외곽부에서는 유도 방출이 발생되고 중심부에서는 자연방출이 발생된다.
이때, 자연방출 파장대역이 유도방출 파장대역보다 상대적으로 넓기 대문에, 유도방출을 노치 필터(Notch filter) 또는 밴드 패스 필터(band pass filter) 등을 통해 차단한다. 여기서, 유도방출 영역이 차단됨에 따라, 광학 스팟 사이즈(Optical Spot Size)가 증가한 것과 같은 효과를 기대할 수 있으며, 이렇게 개선된 광학 스팟을 통해 시료를 스캔함으로써 기존 광학 현미경 대비 월등한 해상도를 획득할 수 있다. 또한, 유도방출억제 현미경은 펄스 레이저와 CW 레이저 기반으로 구분된다. 여기서, 유도방출억제 현미경의 효율이 억제빔의 단위 시간당 입사 강도에 의해 결정되므로, CW 유도방출억제 현미경의 해상도는 펄스 기반에 비해 매우 낮은 수준이다.
이에 따라, 근래에는 유도방출억제 현미경의 해상도를 향상시키기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있으며, 특히 CW 레이저 기반의 유도방출억제에 대한 해상도 향상이 지속적으로 연구되고 있는 추세이다.
국내출원번호 제10-2010-7009514호 국내출원번호 제10-2003-0075916호
본 발명의 목적은 여기광의 간섭을 유도하여 광학계의 회절한계 이상의 해상도로 향상시킬 수 있는 유도방출억제를 이용한 형광 현미경을 제공하기 위한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명에 의한 형광 현미경은, 형광물질이 포함된 시료로 여기광(Excitation beam)을 방출하는 여기유닛, 상기 시료로 유도방출억제(STED, Stimulated emission depletion)광을 방출하는 유도방출억제유닛, 상기 여기광과 유도방출억제광을 상호 중첩시켜 상기 시료로 안내하는 대물렌즈를 포함하는 광학유닛 및, 상기 광학유닛에 의해 중첩된 광으로부터 상기 시료의 이미지를 검출하는 검출유닛을 포함하며, 상기 여기유닛은 상기 여기광을 복수개 방출하거나 상기 여기광을 분리시켜 방출하여 상기 대물렌즈의 초점면에서 간섭을 발생시킨다.
일측에 의하면, 상기 여기유닛은 상기 대물렌즈의 초점면 외곽영역으로 상기 여기광을 입사시킬 수 있다.
일측에 의하면, 상기 여기유닛은 적어도 한 쌍의 여기부를 포함하여, 상기 대물렌즈의 초점면 외곽영역으로 상기 여기광을 입사시킬 수 있다.
일측에 의하면, 상기 유도방출억제유닛으로부터 방출된 상기 유도방출억제광의 경로 상에 위상판이 마련될 수 있다.
일측에 의하면, 상기 여기광 및 유도방출억제광은 정재파(Standing Wave, SW)를 유도할 수 있다.
일측에 의하면, 상기 여기유닛은 상기 여기광의 경로 상에 빔스플리터(Beam splitter), 원뿔형 렌즈, 어퍼쳐(Aperture) 중 적어도 어느 하나를 배치하여, 간섭을 위해 상기 여기광을 분리시킬 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 의한 형광 현미경은, 형광물질이 포함된 시료로 여기광(Excitation beam) 및 유도방출억제(STED, Stimulated emission depletion)광을 방출하는 광원유닛, 상기 여기광과 유도방출억제광을 상호 중첩시켜 상기 시료로 안내하는 대물렌즈를 포함하는 광학유닛 및, 상기 광학유닛에 의해 중첩된 광으로부터 상기 시료의 이미지를 검출하는 검출유닛을 포함하며, 상기 광원유닛은 상기 대물렌즈의 초점면에서 상기 여기광의 간섭을 일으키도록 상기 여기광을 복수개 입사시킬 수 있다.
일측에 의하면, 상기 광원유닛은 상기 여기광을 복수개 방출하거나 상기 여기광을 분리시켜 방출할 수 있다.
일측에 의하면, 상기 광원유닛은, 상기 시료로 상기 여기광을 방출하는 여기광원부 및 상기 시료로 상기 유도방출억제광을 방출하며, 상기 유도방출억제광의 경로 상에 위상판이 마련되는 유도방출억제광원부를 포함할 수 있다.
일측에 의하면, 상기 여기광원부는 상기 여기광을 방출하는 복수의 여기부를 포함하거나, 상기 여기광의 경로 상에 빔스플리터(Beam splitter), 원뿔형 렌즈, 어퍼쳐(Aperture) 중 적어도 어느 하나를 배치하여 상기 여기광을 분리시킬 수 있다.
일측에 의하면, 상기 광원유닛은 상기 대물렌즈의 초점면 외곽영역으로 상기 복수의 여기광을 입사시킬 수 있다.
상기와 같은 구성을 가지는 본 발명에 의하면, 첫째, 대물렌즈의 초점면에서 간섭을 일으키기 위한 복수의 여기광을 입사시킴으로써, 점상 강도 분포함수(PSF; Point Spread Function)를 감소시켜 회절한계 이상의 고해상도 검출이 가능해진다.
둘째, 여기광이 대물렌즈 초점면의 외곽영역에 입사시켜 간섭 패턴의 크기를 최소화할 수 있어, 유도방출억제광의 낮은 출력에도 시료의 해상 품질 향상에 기여할 수 있게 된다.
셋째, 여기광을 분리시키거나 복수개 방출하는 간단한 구조로 고해상도 구현이 가능해져, 경제성 향상과 사용 다양성 확보에 유리하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 일 실시예에 유도방출억제를 이용한 형광 현미경을 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2는 도 1에 도시된 대물렌즈의 초점면에 여기광이 입사된 상태를 종래와 비교하여 개략적으로 도시한 도면이다.
도 3은 본 발명에 의한 유도방출억제 현미경에 의해 측정되는 시료의 점성 강도 분포를 개략적으로 비교 도시한 그래프이다.
도 4a 내지 도 4e는 40nm의 옐로우-그린 비즈(yellow-green beads)를 측정한 점상 강도 분포를 개략적으로 비교한 그래프들이다. 그리고,
도 5는 40nm의 옐로우-그린 비즈(yellow-green beads)를 촬영한 결과를 개략적으로 비교한 이미지들이다.
이하, 본 발명의 바람직한 제1실시예를 첨부된 도면을 참고하여 설명한다.
도 1 및 도 2를 참고하면, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 의한 형광 현미경(1)은 여기유닛(10), 유도방출억제유닛(20), 광학유닛(30) 및 검출유닛(40)을 포함한다.
참고로, 본 발명에서 설명하는 형광 현미경(1)은 바이오 시료와 같은 시료(S)을 이미지하기 위한 것으로서, 보다 구체적으로는 형광물질을 포함한 시료(S)을 촬영하는 형광 현미경인 것으로 예시한다.
상기 여기유닛(10)은 형광물질이 포함된 시료(S)로 여기광(Excitation beam)(L1)을 방출한다. 상기 여기유닛(10)은 여기광(L1)을 방출하는 여기광원일 수 있다.
한편, 상기 여기유닛(10)은 여기광(L1)을 복수개로 방출하거나 여기광(L1)을 분리 방출하여, 후술할 광학유닛(30)으로 안내한다. 이러한 여기유닛(10)의 구체적인 구성은 보다 자세히 후술한다.
상기 유도방출억제유닛(20)은 시료(S)로 유도방출억제(STED, Stimulated emission depletion)광(L2)을 방출하는 일종의 유도방출억제광원이다. 여기서, 상기 유도방출억제유닛(20)은 여기광(L1)에 의해 여기된 시료(S)의 형광물질을 탈여기시키는 것으로서, 여기광(L1)의 파장과 상이하다. 보다 구체적으로, 상기 여기광(L1)에 비해 유도방출억제광(L2)은 파장이 짧은 파장의 광일 수 있다.
상기 유도방출억제유닛(20)은 유도방출억제광(L2)의 경로 상에, 위상판(Phase Plate)(21)이 마련된다. 상기 위상판(21)은 유도방출억제광(L2)을 도넛 형상으로 만드는 역할을 할 수 있다.
참고로, 상기 여기유닛(10)과 유도방출억제유닛(20)의 위치는 도 1의 도시로 한정되지 않으며, 위치가 상호 바뀔 수도 있다.
상기 광학유닛(30)은 여기광(L1)과 유도방출억제광(L2)을 상호 중첩시켜 시료(S)로 안내한다. 상기 광학유닛(30)은 여기광(L1)과 유도방출억제광(L2)을 각각 시료(S)로 반사시켜 안내하는 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32)를 포함한다. 상기 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32)는 여기광(L1) 및 유도방출억제광(L2)을 반사하고 시료(S)의 형광물질에서 방출되는 형광 빛은 통과시키는 이색형 미러(Dichroic mirror)를 포함할 수 있다. 참고로, 상기 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32)는 이색형 미러 뿐만 아니라, 빔 스플리터를 포함할 수도 있다.
이러한 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32)는 기 설정된 각도로 기울어져 배치되어, 여기광(L1) 및 유도방출억제광(L2)을 각각 후술할 대물렌즈(33)로 반사시킨다. 아울러, 상기 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32)은 시료(S)에서 발생하는 형광 빛은 통과시켜 후술할 검출유닛(40)으로 유입되도록 안내한다.
상기 광학유닛(30)은 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32)를 통해 안내되는 여기광(L1) 및 유도방출억제광(L2)을 중첩시켜 시료(S)로 안내하는 대물렌즈(33)를 포함한다. 상기 대물렌즈(33)는 여기광(L1)과 유도방출억제광(L2)이 중첩되는 초점면(33a)(도 2 참고)을 가진다.
상기 검출유닛(40)은 광학유닛(30)에 의해 중첩된 중첩광(L3)으로부터 시료(S)의 이미지를 검출한다. 상기 검출유닛(40)은 대물렌즈(33)와 대면하도록 상부에 마련되나, 도 1에 도시된 위치로 위치가 한정되지 않는다. 예컨대, 상기 검출유닛(40)은 대물렌즈(33)의 하부, 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32)과 대물렌즈(33) 사이의 공간 또는 여기광 안내부(31) 및 유도방출억제광 안내부(32) 사이의 공간 가운데 중 적어도 어느 하나의 위치에 마련될 수 있다. 이러한 검출유닛(40)은 단일광자 검출기(Avalanche photodiode, APD)를 포함할 수 있다.
도 2를 참고하면, 상기 여기유닛(10)으로부터 방출된 여기광(L1)이 대물렌즈(33)의 초점면(33a)에 입사되는 상태가 개략적으로 도시된다. 여기서, 도 2의 (a)는 종래의 여기광(L1')이 대물렌즈(33)의 초점면(33a)에 입사된 상태를 개략적으로 도시한 도면이고, 도 2의 (b)는 본 발명에 의한 복수의 여기광(L1)이 대물렌즈(33)의 초점면(33a)에 입사된 상태를 개략적으로 도시한 도면이다.
도 2의 도시와 같이, 상기 여기유닛(10)은 복수의 여기광(L1)을 방출하거나 분리시켜 초점면(33a)에 입사시킨다. 여기서, 상기 여기유닛(10)은 4개의 여기광(L1)을 방출하여 대물렌즈(33)의 초점면(33a)에 입사시키는 것으로 도시 및 예시한다. 또한, 상기 여기유닛(10)은 유도방출억제광(L2)과의 간섭 패턴의 크기를 감소시키기 위해, 대물렌즈(33)의 초점면(33a) 외곽영역에 여기광(L1)을 입사시킴이 좋다.
한편, 상기 여기유닛(10)은 자세히 도시되지 않았으나, 여기광(L1)을 각각 방출하는 적어도 한 쌍의 여기부(미도시)를 포함할 수 있다. 도 2의 경우, 상기 여기유닛(10)은 4개의 여기부(미도시)를 포함하여, 대물렌즈(33)의 초점면(33a)에 4개의 여기광(L1)을 입사시킨다. 그러나, 꼭 이에 한정되지 않으며, 상기 여기유닛(10)이 한 쌍의 여기부(미도시)를 포함하여 2개의 여기광(L1)을 4개로 분리하여 대물렌즈(33)의 초점면(33a)으로 입사시키거나, 3쌍 또는 4쌍 이상으로 마련되는 것과 같이 다양하게 변형 가능하다.
또한, 자세히 도시되지 않았으나, 상기 여기유닛(10)은 여기광(L1)의 경로 상에 빔스플리터(Beam splitter), 원뿔형 렌즈, 어퍼쳐(Aperture) 중 적어도 어느 하나를 배치하여, 간섭을 위해 여기광(L1)을 분리시킬 수도 있다. 이때, 상기 여기광(L1)의 분리된 개수 또한, 도시된 4개로 한정되지 않음은 당연하다.
도 1 및 도 2를 참고하여, 본 발명에 의한 유도방출억제를 이용한 형광 현미경(1)의 동작을 설명한다.
도 1의 도시와 같이, 상기 여기유닛(10) 및 유도방출억제유닛(20)에서 각각 방출된 여기광(L1)과 유도방출억제광(L2)은 여기광 안내부(31)과 유도방출억제광 안내부(32)를 통해 각각 안내되어 대물렌즈(33)로 입사된다. 여기서, 상기 여기유닛(10)은 4개의 여기광(L1)을 도 2의 도시와 같이, 대물렌즈(33)의 초점면(33a) 외곽영역에 입사시킨다.
상기 여기광(L1)은 대물렌즈(33)를 통해 집광되어 시료(S)에서 에너지를 흡수하여 형광을 발하며, 도넛 형태의 유도방출억제광(L2)과 중첩되어 중심영역의 공간을 제외한 다른 영역의 형광은 억제되어 중심영역의 형광만이 검출유닛(40)을 통해 관측된다.
한편, 상술한 여기유닛(10)과 유도방출억제유닛(20)로부터 방출되는 여기광(L1) 및 유도방출억제광(L2)은 정재파(Standing Wave, SW)를 유도할 수 있다. 즉, 도 1 및 도 2에 도시된 형광 현미경(1)은 정재파 유도방출억제를 이용한다.
도 3을 참고하면, 일반적인 점상 강도 분포 함수(Point spread function, PSF)를 개략적으로 도시한 그래프이다. 도 3의 그래프에서, N=0은 간섭이 없는 공초점 현미경(confocal microscopy)의 점상 강도 분포 함수(PSF)이며, N=1은 1축 간섭을 일으키기 위해 2개의 여기광(L1)을 입사시킨 경우의 간섭에 의한 점상 강도 분포 함수(PSF)를 나타낸다. 아울러, N=2, 3, 4는 각각 2, 3, 4개 축에서 간섭을 일으키기 위해 4, 6, 8개의 여기광(L1)을 입사시켰을 경우의 간섭에 의한 점상 강도 분포 함수(PSF)를 나타낸다.
도 3의 그래프에서와 같이, 입사되는 상기 여기광(L1)의 파장이 488nm 기준으로 반치폭(Full Width at Half Maximum, FWHM)이 ~190nm이나, 4개의 여기광(L1)을 입사시켜 x축 및 y축 모두 간섭시키는 2축 간섭의 경우에는 반치폭이 105nm로 감소함을 확인할 수 있다. 아울러, 감소한 여기 영역에 유도방출억제광(L2)을 입사시킬 경우, ~80 nm 이하의 해상도를 획득할 수 있음을 해석상으로 확인할 수 있다. 이로 인해, 별도의 이미지 프로세스를 수행하지 않은 종래의 해상도 100~120 nm에 비해, 간섭을 위한 복수의 여기광(L1)을 이용하는 본 발명의 경우에는 20~30 % 향상된 해상도를 검출할 수 있게 된다.
도 4a 내지 4e는 40nm의 옐로우-그린 비즈(yellow-green beads)인 시료(S)을 측정한 점상 강도 분포를 비교한 그래프들이다.
도 4a 및 도 4b의 그래프는 종래의 공초점 현미경과 연속파 유도방출억제(CW-STED) 현미경으로 측정된 점상 강도 분포를 나타내는 그래프이며, 도 4c, 도 4d 및 도 4e는 종래의 공초점 현미경, SW-공초점 현미경 및 본 발명에 의한 정재파 유도방출억제(SW-STED) 현미경으로 측정된 점상 강도 분포를 각각 나타내는 그래프이다. 도 4a 내지 4e의 그래프에서와 같이, 비슷한 공초점 점상 강도 분포를 나타내는 시료에 대해 연속파 유도방출억제 현미경의 경우 110 내지 130nm의 해상도를 나타냈으나, 본 발명에 의한 정재파 유도방출억제를 이용한 형광 현미경(1)의 경우 70 내지 90nm 급의 고 해상도를 보인다.
도 5의 (a) 및 (b)는 종래의 공초점 현미경에 의해 촬영된 이미지와 연속파 유도방출억제 현미경에 의해 촬영된 이미지가 비교된다. 아울러, 도 5의 (c), (d) 및 (e)는 종래의 공초점 현미경, 정재파 공초점 현미경 및 본 발명에 의한 정재파 유도방출억제를 이용한 현광 현미경(1)에 의해 촬영된 이미지가 비교된다.
도 4 및 도 5의 비교 결과에서와 같이, 본 발명에 의한 정재파 유도방출억제를 이용한 형광 현미경(1)은 대물렌즈(33)의 초점면(33a) 외곽영역에 복수의 여기광(L1)을 입사시켜 간섭시킴으로써, 고 해상도의 이미지 측정이 가능해짐을 확인할 수 있다. 즉, 낮은 유도방출억제광(L2)의 출력으로도 고해상도의 이미지 획득이 가능해지는 것이다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 바람직한 실시예를 참조하여 설명하였지만 해당 기술분야의 숙련된 당업자라면 하기의 청구범위에 기재된 본 발명의 사상 및 영역으로부터 벗어나지 않는 범위 내에서 본 발명을 다양하게 수정 및 변경시킬 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.
1: 유도방출억제 현미경 10: 여기유닛
20: 유도방출억제유닛 21: 위상판
30: 광학유닛 31: 여기광 안내부
32: 유도방출억제광 안내부 33: 대물렌즈
40: 검출유닛

Claims (11)

  1. 형광물질이 포함된 시료로 여기광(Excitation beam)을 방출하는 여기유닛;
    상기 시료로 유도방출억제(STED, Stimulated emission depletion)광을 방출하는 유도방출억제유닛;
    상기 여기광과 유도방출억제광을 상호 중첩시켜 상기 시료로 안내하는 대물렌즈를 포함하는 광학유닛; 및
    상기 광학유닛에 의해 중첩된 광으로부터 상기 시료의 이미지를 검출하는 검출유닛;
    을 포함하며,
    상기 여기유닛은 상기 여기광을 복수개 방출하거나 상기 여기광을 분리시켜 방출하여 상기 대물렌즈의 초점면에서 간섭을 발생시키고,
    상기 여기유닛은 상기 대물렌즈의 초점면 외곽영역으로 상기 여기광을 입사시키는 형광 현미경.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서,
    상기 여기유닛은 적어도 한 쌍의 여기부를 포함하여, 상기 대물렌즈의 초점면 외곽영역으로 상기 여기광을 입사시키는 형광 현미경.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 유도방출억제유닛으로부터 방출된 상기 유도방출억제광의 경로 상에 위상판이 마련되는 형광 현미경.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 여기광 및 유도방출억제광은 정재파(Standing Wave, SW)를 유도하는 형광 현미경.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 여기유닛은 상기 여기광의 경로 상에 빔스플리터(Beam splitter), 원뿔형 렌즈, 어퍼쳐(Aperture) 중 적어도 어느 하나를 배치하여, 간섭을 위해 상기 여기광을 분리시키는 형광 현미경.
  7. 형광물질이 포함된 시료로 여기광(Excitation beam) 및 유도방출억제(STED, Stimulated emission depletion)광을 방출하는 광원유닛;
    상기 여기광과 유도방출억제광을 상호 중첩시켜 상기 시료로 안내하는 대물렌즈를 포함하는 광학유닛; 및
    상기 광학유닛에 의해 중첩된 광으로부터 상기 시료의 이미지를 검출하는 검출유닛;
    을 포함하며,
    상기 광원유닛은 상기 대물렌즈의 초점면에서 상기 여기광의 간섭을 일으키도록 상기 여기광을 복수개 입사시키고,
    상기 광원유닛은 상기 대물렌즈의 초점면 외곽영역으로 상기 복수의 여기광을 입사시키는 형광 현미경.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 광원유닛은 상기 여기광을 복수개 방출하거나 상기 여기광을 분리시켜 방출하는 형광 현미경.
  9. 제7항에 있어서,
    상기 광원유닛은,
    상기 시료로 상기 여기광을 방출하는 여기광원부; 및
    상기 시료로 상기 유도방출억제광을 방출하며, 상기 유도방출억제광의 경로 상에 위상판이 마련되는 유도방출억제광원부;
    를 포함하는 형광 현미경.
  10. 제9항에 있어서,
    상기 여기광원부는 상기 여기광을 방출하는 복수의 여기부를 포함하거나, 상기 여기광의 경로 상에 빔스플리터(Beam splitter), 원뿔형 렌즈, 어퍼쳐(Aperture) 중 적어도 어느 하나를 배치하여 상기 여기광을 분리시키는 형광 현미경.
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