JP5321305B2

JP5321305B2 - 走査型顕微鏡

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Publication number: JP5321305B2
Application number: JP2009166402A
Authority: JP
Inventors: 祐樹吉田; まゆみ萩原
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Priority date: 2009-07-15
Filing date: 2009-07-15
Publication date: 2013-10-23
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Description

本発明は、走査型顕微鏡に関し、特に、試料からの光をデスキャンせずに検出する走査型顕微鏡に関する。

近年、生物顕微鏡の分野では、非線形効果を利用した顕微鏡が注目を浴びている。なかでも、多光子励起を利用した走査型多光子顕微鏡（例えば、特許文献１参照）は、拡散に強く、試料の深い部位まで観察することができるため、ユーザからの需要が増加している。走査型多光子顕微鏡を用いれば、例えば、これまで観察の難しかった脳などの拡散の大きい試料の観察が可能となる。

また、従来の走査型共焦点顕微鏡では、レーザ光（以下、励起光と称する）を走査しながら照射することにより試料から発せられる観察光をデスキャンしながら、ピンホールを通過させて共焦点効果を得ることにより、光軸方向の分解能を得ている。これに対して、走査型多光子顕微鏡では、試料における励起光の集光位置の部位だけが励起されるので、ピンホールを用いなくても光軸方向の分解能を得ることができる。

このように、走査型多光子顕微鏡では、ピンホールを使用しなくてよいため、必ずしも試料からの観察光をデスキャンする必要はない。従って、例えば、励起光を走査する走査手段と対物レンズとの間に光束分離手段を設け、光束分離手段により励起光と異なる方向に観察光を反射し、反射された観察光を、デスキャンせずにPMT（photo multiplier tube：光電子増倍管）などの検出手段により検出するようにすることが可能である。このように走査型顕微鏡において観察光をデスキャンせずに検出する光学系をNDD（Non Descanned Detector）ともいう。

従来の走査型共焦点顕微鏡が、試料のピンホールと共役な部分からの観察光しか受光できないのに対し、NDDを用いた走査型多光子顕微鏡では、励起光のスポットの周りの散乱した光も受光することができ、より明るい画像を得ることができる。

特開２０００−３３００２９号公報

ところで、従来の観察光をデスキャンする光学系では、検出手段に入射する光束の入射角がほぼ０度となるため、検出手段に入射する光束に対して垂直にバリアフィルタを配置するだけで、カバーガラスなどで反射された励起光が検出手段に入射するのを十分に防止することができた。

一方、NDDでは、観察光をデスキャンせずに検出するため、検出手段に入射する光束の入射角は必ずしも０度とは限らず、様々な入射角の光束が入射する。従って、バリアフィルタに入射する光束の入射角も一定ではなくなるため、観察光をデスキャンする光学系の場合と同様にバリアフィルタを配置したのでは、励起光が検出手段に入射するのを十分に防止できない可能性がある。

本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、試料からの観察光を検出する検出手段への励起光の入射を簡単かつ確実に防止できるようにするものである。

本発明の一側面の走査型顕微鏡は、多光子励起可能な励起光を走査手段を介して走査しながら試料に照射し、前記試料から発せられた観察光を前記走査手段による走査をせずに検出手段で検出する走査型顕微鏡であって、前記観察光を検出する前記検出手段までの前記観察光の光路上に、前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第１の遮光手段と、前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第２の遮光手段とを備え、前記第１の遮光手段を透過し、前記第２の遮光手段に入射する前記励起光の少なくとも一部の前記第２の遮光手段への入射角が、前記第１の遮光手段への入射角とは異なるように構成されてなる。

本発明の一側面の走査型顕微鏡においては、第１の遮光手段および第２の遮光手段により、観察光を検出する検出手段に向かう光のうち、励起光と同じ波長域の光が遮蔽される。

本発明の一側面によれば、試料からの観察光を検出する検出手段への励起光の入射を簡単かつ確実に防止することができる。

本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態を示すブロック図である。走査型顕微鏡を走査型多光子顕微鏡として用いる場合の観察光の光路の具体例を示す図である。 IRカットフィルタの性能の一例を示す図である。対物レンズから、IRカットフィルタの間に配置されるレンズの焦点面までの光路を直線上に並べて示した図である。 IRカットフィルタの間に配置されるレンズの設置条件を説明するための図である。 IRカットフィルタの間に配置されるレンズの設置条件を説明するための図である。 IRカットフィルタの間に配置されるレンズの設置条件を説明するための図である。 IRカットフィルタの設置条件を変えて遮光性能を比較した実験結果を示す図である。 IRカットフィルタの他の設置例を示す図である。

以下、図を参照して、本発明の実施の形態について説明する。

図１は、本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態を示す図である。

走査型顕微鏡１のレーザ光源１１は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時または個別に射出することが可能である。なお、以下、レーザ光源１１から赤外光および可視光の２種類のレーザ光が射出されるものとして説明する。また、以下、レーザ光源１１から射出される赤外光は、試料２の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短い（例えば、100フェムト秒）パルス状の光（以下、IRパルス光と称する）であるものとする。

レーザ光源１１から射出されたレーザ光は、走査装置１２、集光レンズ１３、ダイクロイックミラー１４および対物レンズ１５を通って、ステージ１６上に設置されている試料２に照射される。

より具体的には、レーザ光源１１から射出されたレーザ光は、走査装置１２に入射し、ダイクロイックミラー４１を透過し、走査部４２に入射する。走査部４２は、例えば、ガルバノスキャナにより構成され、レーザ光は、走査部４２により偏向され、瞳投影レンズ４３を透過して、走査装置１２から射出される。

瞳投影レンズ４３を透過したレーザ光は、いったん集光した後、集光レンズ１３により平行光束とされ、ダイクロイックミラー１４を透過し、対物レンズ１５により試料２の観察面において集光される。このとき、走査部４２は、図示せぬ制御部の制御の基に、レーザ光の走査範囲や走査速度を制御しながら、試料２の観察面においてレーザ光を走査する。

なお、試料２の観察時には、IRパルス光または可視光のいずれか一方が試料２の画像を得るためのイメージング（励起）用の励起光として用いられる。

例えば、IRパルス光を励起光として用いる場合、可視光は、全く使用されないか、または試料２の光刺激用として使用される。この場合、IRパルス光が試料２に照射されると、試料２からは多光子励起による蛍光が発現し、この蛍光は、観察光となって、対物レンズ１５を透過し、対物レンズ１５により平行光束とされ、ダイクロイックミラー１４に入射し、ダイクロイックミラー１４により、NDD（Non Descaned Detector）１７の方向に反射され、NDD１７に入射する。

NDD１７に設けられているIRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂは、同じ性能を有し、IRパルス光と同じ波長域を含む所定の波長域の光を遮蔽し、それ以外の波長の光を透過する。そして、NDD１７に入射した観察光は、IRカットフィルタ６１ａにより所定の波長域の成分が遮蔽され、それ以外の成分が透過される。IRカットフィルタ６１ａを透過した観察光は、レンズ６２により集光されながら、IRカットフィルタ６１ｂに入射し、IRカットフィルタ６１ｂにより所定の波長域の成分が遮蔽され、それ以外の成分が透過される。

IRカットフィルタ６１ｂを透過した観察光は、ダイクロイックミラー６３に入射し、所定の第１の波長域以外の成分が、ダイクロイックミラー６３を透過し、第１の波長域の成分が、ダイクロイックミラー６３により、バリアフィルタ６４ｂの方向に反射される。ダイクロイックミラー６３を透過した観察光は、バリアフィルタ６４ａにより所定の第２の波長域の成分が透過され、レンズ６５ａにより平行光束とされ、PMT（photo multiplier tube：光電子増倍管）６６ａに入射する。また、バリアフィルタ６４ｂの方向に反射された観察光は、バリアフィルタ６４ｂにより第１の波長域の成分が透過され、レンズ６５ｂにより平行光束とされ、PMT６６ｂに入射する。

PMT６６ａ，６６ｂは、それぞれ受光した観察光を検出し、その光量に応じた電圧の検出信号を図示せぬコントローラに供給する。なお、試料２に照射されるIRパルス光は、上述したように走査部４２により走査されるので、PMT６６ａ，６６ｂは、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。そして、図示せぬコントローラは、PMT６６ａ，６６ｂからの各電気信号に基づいて、試料２の観察画像を生成する。

これに対して、可視光が励起光として用いられる場合、IRパルス光は、多光子励起による試料２の光刺激用として使用される。すなわち、IRパルス光により試料２の観察面が刺激された状態で、その観察面に可視光が照射されると、試料２からは蛍光が発現し、この蛍光は観察光となって、対物レンズ１５を透過し、対物レンズ１５により平行光束とされ、ダイクロイックミラー１４を透過し、集光レンズ１３によりいったん集光された後、瞳投影レンズ４３により平行光束とされ、走査部４２に入射する。そして、観察光は、走査部４２によりデスキャンされ、ダイクロイックミラー４１により集光レンズ４４の方向に反射される。集光レンズ４４の方向に反射された観察光は、対物レンズ１５の焦点位置とほぼ共役な位置に設けられたピンホール４５を通って、PMT４６に入射する。

PMT４６は、受光した観察光を検出し、その光量に応じた電圧の検出信号を図示せぬコントローラに供給する。なお、試料２に照射される可視光は、上述したように走査部４２により走査されるので、PMT４６は、試料２の観察面にわたる観察光を検出する。そして、図示せぬコントローラは、PMT４６からの電気信号に基づいて、試料２の観察画像を生成する。

このように、走査型顕微鏡１では、走査型多光子顕微鏡および走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。

なお、以下、IRカットフィルタ６１ａおよびIRカットフィルタ６１ｂを、特に区別する必要がない場合、単に、IRカットフィルタ６１と称する。

図２は、走査型顕微鏡１を走査型多光子顕微鏡として用いる場合の観察光の光路の具体例を示す図である。

対物レンズ１５の光軸付近にある、試料２の観察面Ｓの点Ａ１から発現された観察光Ｌ１は、対物レンズ１５により平行光束とされ、対物レンズ１５の瞳Ｐを通過し、ダイクロイックミラー１４によりNDD１７の方向に反射される。NDD１７に入射した観察光Ｌ１は、ほぼ垂直な方向からIRカットフィルタ６１ａに入射し、IRカットフィルタ６１ａを透過した後、レンズ６２により集光されながら、IRカットフィルタ６１ｂを透過し、レンズ６２の焦点面Ｆにおいて集光する。そして、観察光Ｌ１は、ダイクロイックミラー６３により２方向に分岐され、ダイクロイックミラー６３を透過した観察光は、バリアフィルタ６４ａを透過し、レンズ６５ａにより平行光束とされ、ほぼ垂直な方向からPMT６６ａに入射する。一方、ダイクロイックミラー６３により反射された観察光Ｌ１は、バリアフィルタ６４ｂを透過し、レンズ６５ｂにより平行光束とされ、ほぼ垂直な方向からPMT６６ｂに入射する。

また、対物レンズ１５の光軸からずれた位置にある、試料２の観察面Ｓの点Ａ２から発現された観察光Ｌ２は、観察光Ｌ１と同様にして、NDD１７に入射する。NDD１７に入射した観察光Ｌ２は、斜め方向からIRカットフィルタ６１ａに入射し、IRカットフィルタ６１ａを透過した後、レンズ６２により集光されながら、IRカットフィルタ６１ｂを透過し、レンズ６２の焦点面Ｆにおいて集光する。そして、観察光Ｌ２は、ダイクロイックミラー６３により２方向に分岐され、ダイクロイックミラー６３を透過した観察光は、バリアフィルタ６４ａを透過し、レンズ６５ａにより平行光束とされ、斜め方向からPMT６６ａに入射する。一方、ダイクロイックミラー６３により反射された観察光Ｌ２は、バリアフィルタ６４ｂを透過し、レンズ６５ｂにより平行光束とされ、斜め方向からPMT６６ｂに入射する。

このように、走査型顕微鏡１を走査型多光子顕微鏡として使用する場合、観察光がデスキャンされないため、試料２の観察面Ｓにおいて観察光が発現する位置によって、NDD１７の各部（IRカットフィルタ６１ａ、IRカットフィルタ６１ｂ、PMT６６ａ、PMT６６ｂなど）への入射角が異なる。

また、NDD１７には、多光子励起に用いるIRパルス光の一部が、ノイズ光として入射する。例えば、対物レンズ１５の瞳Ｐを通過したIRパルス光の一部が、試料２の上に載置されたカバーガラス（不図示）の界面や対物レンズ１５により反射され、観察光とほぼ同じ光路を辿って、NDD１７に入射する。NDD１７に入射するIRパルス光の大部分は、この光路を辿る。

また、例えば、IRパルス光の一部が、対物レンズ１５の瞳に入らずに、走査型顕微鏡１の鏡筒内で反射され、NDD１７に入射する。そのほとんどは、対物レンズ１５の瞳Ｐおよびその近傍を通過して、NDD１７に入射する。

従って、NDD１７に入射するIRパルス光（ノイズ光）は、ほぼ対物レンズ１５の瞳Ｐを通過してNDD１７に入射すると考えてよい。そして、ノイズ光のNDD１７への入射角も、観察光と同様に様々な値をとる。

IRパルス光は、光出力が数Ｗに及ぶ強力なレーザ光であり、ノイズ光の光量は、試料２から発現される蛍光の光量と比較して決して弱くない。そのため、走査型顕微鏡１では、PMT６６ａ，６６ｂにノイズ光が入射するのを確実に防止するために、IRカットフィルタ６１ａおよびIRカットフィルタ６１ｂの２枚のフィルタが設けられている。

ところで、一般的に光学フィルタの性能は、光線の入射角により異なる。図３は、IRカットフィルタ６１の性能の一例を示している。なお、図内の横軸は波長を示し、縦軸はOD（Optical Density，光学濃度）を示している。また、図内の実線は、IRカットフィルタ６１への光線の入射角が０度の場合の遮光特性を示し、点線は、入射角が４５度の場合の遮光特性を示している。

図３に示されるように、入射角により、IRカットフィルタ６１の遮光特性、すなわち、遮蔽される光の波長域および透過光のOD値は大きく異なり、入射角が小さいほど、全体的にOD値が大きくなり、遮光率が向上する。図３の例では、特に、850mn以上の長波長域において、その傾向が顕著に現れている。

上述したように、ノイズ光のIRカットフィルタ６１ａへの入射角は様々であり、例えば、図２の観察光Ｌ１と同様に、IRカットフィルタ６１ａに対して垂直に入射するノイズ光については、IRカットフィルタ６１ａで十分に遮蔽することができる。一方、図２の観察光Ｌ２と同様に、IRカットフィルタ６１ａに対して斜めから入射するノイズ光については、その入射角によっては、IRカットフィルタ６１ａで十分に遮光できない可能性がある。そのため、走査型顕微鏡１では、IRカットフィルタ６１ａだけでなく、IRカットフィルタ６１ｂを用いて、ノイズ光の除去を行っている。

また、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂとの間に配置されているレンズ６２により、IRカットフィルタ６１ａを透過するノイズ光のほとんどが屈折され、IRカットフィルタ６１ａへの入射角とIRカットフィルタ６１ｂへの入射角とが異なるようになっている。従って、レンズ６２を挟まずに、互いの遮光面が平行になるようにIRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂとを並べた場合と比較して、IRカットフィルタ６１ａを透過したノイズ光を、より確実にIRカットフィルタ６１ｂにより遮蔽することができる。

ここで、図４乃至図７を参照して、レンズ６２の設置位置の条件について考える。なお、図４は、対物レンズ１５からレンズ６２の焦点面Ｆまでの光路を、分かりやすくするために直線上に並べて示した図である。なお、図中、光束Ｌ１１は、図２の観察光Ｌ１と同じ光路を進む光束を示しており、光束Ｌ１２は、図２の観察光Ｌ２と同じ光路を進む光束を示している。また、以下、対物レンズ１５の瞳Ｐとレンズ６２との間の距離をｄとし、レンズ６２の焦点距離（図内のレンズ６２と焦点面Ｆとの間の距離）をｆとする。

上述したように、例えば、ノイズ光が光束Ｌ１１と同じ光路を進み、ほぼ垂直な方向からIRカットフィルタ６１ａに入射する場合、ノイズ光は、IRカットフィルタ６１ａにより十分遮蔽される。一方、ノイズ光が光束Ｌ１２と同じ光路を進み、斜め方向からIRカットフィルタ６１ａに入射する場合、ノイズ光は、IRカットフィルタ６１ａにより遮蔽されずに透過する割合が増え、十分な遮光率を確保できない可能性がある。よって、以下、ノイズ光が光束Ｌ１２と同じ光路を進む場合について考える。

まず、距離ｄ＝焦点距離ｆである場合、光束Ｌ１２の主光線Ｌｍは、レンズ６２を透過することにより、レンズ６２の光軸とほぼ平行になり、ほぼ垂直な方向からIRカットフィルタ６１ｂに入射する。従って、この場合、IRカットフィルタ６１ａを透過したノイズ光が、IRカットフィルタ６１ｂにより遮蔽される割合は最大となる。

次に、焦点距離ｆ＜距離ｄである場合について考える。

まず、図５に示されるように、レンズ６２の中心からの高さｈの位置を通過する光線Ｌ２１のIRカットフィルタ６１ａへの入射角（＝対物レンズ１５からの射出角＝レンズ６２への入射角）をθ_aとし、光線Ｌ２１のIRカットフィルタ６１ｂへの入射角（＝レンズ６２からの射出角）をθ_bとすると、入射角θ_aと入射角θ_bとの関係は、以下の式（１）により表される。

なお、以下、図内の角度について、時計回りの方向を正の方向とし、反時計回りの方向を負の方向とする。従って、図５において、入射角θ_aは負の値となり、入射角θ_bは正の値となる。

そして、以下の式（２）が成り立つとき、すなわち、入射角θ_bの大きさ（絶対値）が入射角θ_aの大きさ（絶対値）より小さいとき、光線Ｌ２１と同じ光路を進み、IRカットフィルタ６１ａを透過したノイズ光は、IRカットフィルタ６１ｂにより十分に遮蔽されると考えられる。

上述したように、NDD１７に入射するノイズ光は、ほぼ対物レンズ１５の瞳Ｐを通過すると考えてよい。従って、焦点距離ｆが距離ｄより短い場合に、ノイズ光のIRカットフィルタ６１ａへの入射角θ_aの大きさが最大になるのは、例えば、図６の光線Ｌ３１のように、対物レンズ１５の瞳Ｐの下端を通過し、レンズ６２の有効径の上端を通過するときである。そして、入射角θ_aの大きさが最大のときに、式（２）が成り立つようにすれば、入射角θ_aの大きさに関わらず、IRカットフィルタ６１ａを透過したノイズ光を、IRカットフィルタ６１ｂにより十分に遮蔽することができると考えられる。

ここで、観察に推奨される対物レンズ１５の瞳Ｐの半径をｈ₁、レンズ６２の有効径の半径をｈ₂とし、入射角θ_aが小さく、θ_a≒ｔａｎθ_a＝−（ｈ₁＋ｈ₂）／ｄが成り立つとすると、図６の光線Ｌ３１について、式（２）は以下の式（３）に変形することができる。

そして、焦点距離ｆが左辺にくるように式（３）を整理すると、以下の式（４）となる。

従って、焦点距離ｆが距離ｄより短い場合、距離ｄと焦点距離ｆとの関係が式（４）を満たすとき、IRカットフィルタ６１ａを透過したノイズ光を、IRカットフィルタ６１ｂにより十分に遮蔽することができると考えられる。

次に、焦点距離ｆ＞距離ｄである場合について考える。この場合、レンズ６２を透過した光が、レンズ６２の焦点面Ｆにおいて、レンズ６２の有効径以上の大きさで結像してしまうと、NDD１７のサイズを大きくする必要が生じる。

例えば、図７に示されるように、レンズ６２の有効径の上端を通過する光束Ｌ４１の焦点面Ｆにおける結像位置をｘとし、結像位置ｘとレンズ６２の光軸との間の距離をｈ₃とすると、距離ｈ₃＞レンズ６２の有効径の半径ｈ₂となる場合に、NDD１７のサイズを大きくする必要が生じる。これは、光束Ｌ４１の上端の光線ＬｕのIRカットフィルタ６１ｂへの入射角θ_bが、０より小さくなる場合である。従って、焦点距離ｆが距離ｄより長い場合には、光線ＬｕのIRカットフィルタ６１ｂへの入射角θ_bが、以下の式（５）を満たすようにすればよい。すなわち、光線Ｌｕが、レンズ６２を透過した後、図内の水平方向または斜め下方向に進むようにすればよい。

なお、式（５）のθ_aは、光線ＬｕのIRカットフィルタ６１ａへの入射角を表している。ここで、入射角θ_aが小さく、θ_a≒ｔａｎθ_a＝−（ｈ₂−ｈ₁）／ｄが成り立つとすると、式（５）は以下の式（６）に変形することができる。

そして、焦点距離ｆが左辺にくるように式（６）を整理すると、以下の式（７）となる。

以上の式（４）と式（７）を組み合わせると、以下の式（８）となる。

ここで、対物レンズ１５の瞳Ｐの半径ｈ１およびレンズ６２の有効径の半径ｈ２の代わりに、対物レンズ１５の瞳径φ１およびレンズ６２の有効径φ２を用いると、式（８）は以下の式（９）となる。

なお、対物レンズ１５の瞳径φ１＜レンズ６２の有効径φ２（対物レンズ１５の瞳Ｐの半径ｈ１＜レンズ６２の有効径の半径ｈ２）であるものとする。

従って、距離ｄと焦点距離ｆとの関係が、式（９）を満たす場合、NDD１７のサイズを大きくすることなく、PMT６６ａおよびPMT６６ｂへのノイズ光の入射を確実に防止することができる。

なお、式（９）を距離ｄについて整理すると、以下の式（１０）となる。

なお、以上に説明したレンズ６２の設置条件は、その一例であり、例えば、IRカットフィルタ６１の性能、レンズ６２の性能など、さらに他のパラメータを考慮して、設置条件を求めるようにしてもよい。

図８は、走査型顕微鏡１において、IRカットフィルタ６１の設置条件を変えて遮光性能を比較した実験結果を示している。より具体的には、図８は、試料２の代わりに素ガラスを設置し、素ガラスにより反射されたIRレーザ光がNDD１７に入射される状態で、IRカットフィルタ６１ａを１枚のみで使用したした場合、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂの間にレンズ６２を挟まずに２枚重ねた場合、または、上述したようにIRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂの間にレンズ６２を挟んだ場合のPMT６６ａの受光量を比較した結果を示している。

図８に示されるように、PMT６６ａの受光量は、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂの間にレンズ６２を挟んだ場合が最も小さく、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂを２枚重ねた場合が次に小さく、IRカットフィルタ６１ａを１枚のみで使用した場合が最も大きくなっている。換言すれば、IRパルス光（ノイズ光）に対する遮光性能は、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂの間にレンズ６２を挟んだ場合が最も高く、IRカットフィルタ６１ａを１枚のみで使用した場合が最も低くなる。特に、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂの間にレンズ６２を挟んだ場合には、IRパルス光（ノイズ光）に対する遮光性能が劇的に向上していることが分かる。

以上の結果から、ただIRカットフィルタ６１を２枚重ねて置くだけでなく、設置条件を工夫することにより、簡単にノイズ光に対する遮光性能を向上できることが分かる。

なお、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂの間にレンズ６２を挟む以外にも、例えば、図９に示されるように、レンズ６２の前に、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂを、互いの遮光面を傾けて配置するようにしてもよい。これにより、ノイズ光のIRカットフィルタ６１ａへの入射角とIRカットフィルタ６１ｂへの入射角が異なるようになり、IRカットフィルタ６１ａを透過したノイズ光を、より確実にIRカットフィルタ６１ｂにより遮蔽することが可能になる。

なお、図９では、IRカットフィルタ６１ａの遮光面が、レンズ６２の光軸に対して垂直になるように配置されているが、IRカットフィルタ６１ａではなくIRカットフィルタ６１ｂの遮光面を、レンズ６２の光軸に対して垂直になるように配置するようにしてもよい。また、IRカットフィルタ６１ａおよびIRカットフィルタ６１ｂの両方とも、レンズ６２の光軸に対して傾けて配置するようにしてもよい。

また、入射角に対する性能が互いに異なるように、IRカットフィルタ６１ａとIRカットフィルタ６１ｂを選定するようにしてもよい。例えば、入射光を遮蔽できる遮光帯域がほぼ同じで、入射角に対する遮光特性が互いに異なるように（例えば、一方が、入射角が０度の光線に対する遮光率が最も高く、他方が、所定の斜め方向の入射角の光線に対する遮光率が最も高くなるように）、IRカットフィルタ６１ａおよびIRカットフィルタ６１ｂを選定するようにしてもよい。これにより、IRカットフィルタ６１ａを透過したノイズ光を、より確実にIRカットフィルタ６１ｂにより遮蔽することが可能になる。

さらに、IRカットフィルタ６１の枚数は２枚に限定されるものではなく、３枚以上用いるようにしてもよい。

また、レンズ６２は、１枚のレンズにより実現するようにしてもよいし、複数のレンズ群により実現するようにしてもよい。

なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。

１走査型顕微鏡，２試料，１１レーザ光源，１２走査装置，１４ダイクロイックミラー，１５対物レンズ，１７ NDD，６１ａ，６１ｂ IRカットフィルタ，６２レンズ，６５ａ，６５ｂレンズ，６６ａ，６６ｂ PMT

Claims

多光子励起可能な励起光を走査手段を介して走査しながら試料に照射し、前記試料から発せられた観察光を前記走査手段による走査をせずに検出手段で検出する走査型顕微鏡において、
前記観察光を検出する前記検出手段までの前記観察光の光路上に、
前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第１の遮光手段と、
前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第２の遮光手段と
を備え、
前記第１の遮光手段を透過し、前記第２の遮光手段に入射する前記励起光の少なくとも一部の前記第２の遮光手段への入射角が、前記第１の遮光手段への入射角とは異なるように構成されてなる
走査型顕微鏡。
前記第１の遮光手段と前記第２の遮光手段とは同じ性能を有し、
前記第１の遮光手段と前記第２の遮光手段との間に、前記第１の遮断手段を透過した光を集光するレンズを備える
請求項１に記載の走査型顕微鏡。
前記励起光を前記試料に集光し、前記試料から発せられた前記観察光が透過する対物レンズの瞳と前記レンズとの間の距離をｄ、前記レンズの焦点距離をｆ、前記対物レンズの瞳径をφ1、前記レンズの有効径をφ2とした場合、以下の式を満たす

請求項２に記載の走査型顕微鏡。
前記第１の遮光手段の遮光面と前記第２の遮光手段の遮光面のうちの少なくとも１つの遮光面が前記第１の遮光手段と前記第２の遮光手段とを含む光学系の光軸に対して傾けて配置されている
請求項１に記載の走査型顕微鏡。
前記第１の遮光手段と前記第２の遮光手段とは、遮光帯域がほぼ同じであり、かつ、入射角に対する遮光特性が異なる
請求項１に記載の走査型顕微鏡。
前記第２の遮光手段と前記検出手段との間に、前記観察光を選択的に透過するバリアフィルタを備える
請求項１乃至５のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。