JP5321305B2 - Scanning microscope - Google Patents
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Description
本発明は、走査型顕微鏡に関し、特に、試料からの光をデスキャンせずに検出する走査型顕微鏡に関する。 The present invention relates to a scanning microscope, and more particularly to a scanning microscope that detects light from a sample without descanning.
近年、生物顕微鏡の分野では、非線形効果を利用した顕微鏡が注目を浴びている。なかでも、多光子励起を利用した走査型多光子顕微鏡(例えば、特許文献1参照)は、拡散に強く、試料の深い部位まで観察することができるため、ユーザからの需要が増加している。走査型多光子顕微鏡を用いれば、例えば、これまで観察の難しかった脳などの拡散の大きい試料の観察が可能となる。 In recent years, in the field of biological microscopes, microscopes using nonlinear effects have attracted attention. In particular, a scanning multiphoton microscope using multiphoton excitation (see, for example, Patent Document 1) is resistant to diffusion and can observe a deep part of a sample, so that the demand from users is increasing. If a scanning multiphoton microscope is used, for example, it is possible to observe a highly diffuse sample such as a brain, which has been difficult to observe.
また、従来の走査型共焦点顕微鏡では、レーザ光(以下、励起光と称する)を走査しながら照射することにより試料から発せられる観察光をデスキャンしながら、ピンホールを通過させて共焦点効果を得ることにより、光軸方向の分解能を得ている。これに対して、走査型多光子顕微鏡では、試料における励起光の集光位置の部位だけが励起されるので、ピンホールを用いなくても光軸方向の分解能を得ることができる。 Further, in a conventional scanning confocal microscope, laser light (hereinafter referred to as excitation light) is irradiated while scanning, and the observation light emitted from the sample is descanned while passing through a pinhole to achieve a confocal effect. Thus, the resolution in the optical axis direction is obtained. On the other hand, in the scanning multiphoton microscope, only the portion of the sample where the excitation light is condensed is excited, so that resolution in the optical axis direction can be obtained without using a pinhole.
このように、走査型多光子顕微鏡では、ピンホールを使用しなくてよいため、必ずしも試料からの観察光をデスキャンする必要はない。従って、例えば、励起光を走査する走査手段と対物レンズとの間に光束分離手段を設け、光束分離手段により励起光と異なる方向に観察光を反射し、反射された観察光を、デスキャンせずにPMT(photo multiplier tube:光電子増倍管)などの検出手段により検出するようにすることが可能である。このように走査型顕微鏡において観察光をデスキャンせずに検出する光学系をNDD(Non Descanned Detector)ともいう。 As described above, in the scanning multiphoton microscope, since it is not necessary to use a pinhole, it is not always necessary to descan the observation light from the sample. Therefore, for example, a light beam separating unit is provided between the scanning unit that scans the excitation light and the objective lens, and the observation light is reflected by the light beam separating unit in a direction different from the excitation light, and the reflected observation light is not descanned. In addition, it is possible to detect by a detecting means such as PMT (photo multiplier tube). An optical system that detects observation light without descanning in a scanning microscope is also referred to as NDD (Non Descanned Detector).
従来の走査型共焦点顕微鏡が、試料のピンホールと共役な部分からの観察光しか受光できないのに対し、NDDを用いた走査型多光子顕微鏡では、励起光のスポットの周りの散乱した光も受光することができ、より明るい画像を得ることができる。 The conventional scanning confocal microscope can only receive the observation light from the part conjugate with the pinhole of the sample, while the scanning multiphoton microscope using NDD also has scattered light around the excitation light spot. Light can be received and a brighter image can be obtained.
ところで、従来の観察光をデスキャンする光学系では、検出手段に入射する光束の入射角がほぼ0度となるため、検出手段に入射する光束に対して垂直にバリアフィルタを配置するだけで、カバーガラスなどで反射された励起光が検出手段に入射するのを十分に防止することができた。 By the way, in the conventional optical system for descanning the observation light, since the incident angle of the light beam incident on the detection means becomes almost 0 degrees, the cover can be simply provided by arranging the barrier filter perpendicular to the light beam incident on the detection means. It was possible to sufficiently prevent the excitation light reflected by glass or the like from entering the detection means.
一方、NDDでは、観察光をデスキャンせずに検出するため、検出手段に入射する光束の入射角は必ずしも0度とは限らず、様々な入射角の光束が入射する。従って、バリアフィルタに入射する光束の入射角も一定ではなくなるため、観察光をデスキャンする光学系の場合と同様にバリアフィルタを配置したのでは、励起光が検出手段に入射するのを十分に防止できない可能性がある。 On the other hand, in the NDD, since the observation light is detected without descanning, the incident angle of the light beam incident on the detection means is not necessarily 0 degree, and light beams with various incident angles are incident. Therefore, since the incident angle of the light beam entering the barrier filter is not constant, the arrangement of the barrier filter as in the case of the optical system for descanning the observation light sufficiently prevents the excitation light from entering the detection means. It may not be possible.
本発明は、このような状況に鑑みてなされたものであり、試料からの観察光を検出する検出手段への励起光の入射を簡単かつ確実に防止できるようにするものである。 The present invention has been made in view of such a situation, and makes it possible to easily and reliably prevent excitation light from entering a detection means for detecting observation light from a sample.
本発明の一側面の走査型顕微鏡は、多光子励起可能な励起光を走査手段を介して走査しながら試料に照射し、前記試料から発せられた観察光を前記走査手段による走査をせずに検出手段で検出する走査型顕微鏡であって、前記観察光を検出する前記検出手段までの前記観察光の光路上に、前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第1の遮光手段と、前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第2の遮光手段とを備え、前記第1の遮光手段を透過し、前記第2の遮光手段に入射する前記励起光の少なくとも一部の前記第2の遮光手段への入射角が、前記第1の遮光手段への入射角とは異なるように構成されてなる。 A scanning microscope according to one aspect of the present invention irradiates a sample while scanning excitation light that can be excited by multiphotons through a scanning unit, and does not scan the observation light emitted from the sample by the scanning unit. A scanning microscope for detecting by the detection means , having a characteristic of shielding light in the same wavelength range as the excitation light on the optical path of the observation light to the detection means for detecting the observation light , and A first light shielding means that does not have a property of selectively transmitting observation light; a property of shielding light in the same wavelength region as the excitation light; and a property of selectively transmitting the observation light. An incident angle to the second light shielding means of at least a part of the excitation light that passes through the first light shielding means and is incident on the second light shielding means. It is configured to be different from the incident angle to one light shielding means.
本発明の一側面の走査型顕微鏡においては、第1の遮光手段および第2の遮光手段により、観察光を検出する検出手段に向かう光のうち、励起光と同じ波長域の光が遮蔽される。 In the scanning microscope according to one aspect of the present invention, light having the same wavelength region as that of the excitation light is shielded by the first light shielding unit and the second light shielding unit out of the light toward the detection unit that detects the observation light. .
本発明の一側面によれば、試料からの観察光を検出する検出手段への励起光の入射を簡単かつ確実に防止することができる。 According to one aspect of the present invention, it is possible to easily and reliably prevent excitation light from entering a detection unit that detects observation light from a sample.
以下、図を参照して、本発明の実施の形態について説明する。 Hereinafter, embodiments of the present invention will be described with reference to the drawings.
図1は、本発明を適用した走査型顕微鏡の一実施の形態を示す図である。 FIG. 1 is a diagram showing an embodiment of a scanning microscope to which the present invention is applied.
走査型顕微鏡1のレーザ光源11は、波長が異なる複数のレーザ光を、同時または個別に射出することが可能である。なお、以下、レーザ光源11から赤外光および可視光の2種類のレーザ光が射出されるものとして説明する。また、以下、レーザ光源11から射出される赤外光は、試料2の多光子励起を誘発するための、所定の周期で射出される非常に短い(例えば、100フェムト秒)パルス状の光(以下、IRパルス光と称する)であるものとする。
The
レーザ光源11から射出されたレーザ光は、走査装置12、集光レンズ13、ダイクロイックミラー14および対物レンズ15を通って、ステージ16上に設置されている試料2に照射される。
Laser light emitted from the
より具体的には、レーザ光源11から射出されたレーザ光は、走査装置12に入射し、ダイクロイックミラー41を透過し、走査部42に入射する。走査部42は、例えば、ガルバノスキャナにより構成され、レーザ光は、走査部42により偏向され、瞳投影レンズ43を透過して、走査装置12から射出される。
More specifically, the laser light emitted from the
瞳投影レンズ43を透過したレーザ光は、いったん集光した後、集光レンズ13により平行光束とされ、ダイクロイックミラー14を透過し、対物レンズ15により試料2の観察面において集光される。このとき、走査部42は、図示せぬ制御部の制御の基に、レーザ光の走査範囲や走査速度を制御しながら、試料2の観察面においてレーザ光を走査する。
The laser light that has passed through the
なお、試料2の観察時には、IRパルス光または可視光のいずれか一方が試料2の画像を得るためのイメージング(励起)用の励起光として用いられる。
When observing the
例えば、IRパルス光を励起光として用いる場合、可視光は、全く使用されないか、または試料2の光刺激用として使用される。この場合、IRパルス光が試料2に照射されると、試料2からは多光子励起による蛍光が発現し、この蛍光は、観察光となって、対物レンズ15を透過し、対物レンズ15により平行光束とされ、ダイクロイックミラー14に入射し、ダイクロイックミラー14により、NDD(Non Descaned Detector)17の方向に反射され、NDD17に入射する。
For example, when IR pulse light is used as excitation light, visible light is not used at all or is used for light stimulation of the
NDD17に設けられているIRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bは、同じ性能を有し、IRパルス光と同じ波長域を含む所定の波長域の光を遮蔽し、それ以外の波長の光を透過する。そして、NDD17に入射した観察光は、IRカットフィルタ61aにより所定の波長域の成分が遮蔽され、それ以外の成分が透過される。IRカットフィルタ61aを透過した観察光は、レンズ62により集光されながら、IRカットフィルタ61bに入射し、IRカットフィルタ61bにより所定の波長域の成分が遮蔽され、それ以外の成分が透過される。
The
IRカットフィルタ61bを透過した観察光は、ダイクロイックミラー63に入射し、所定の第1の波長域以外の成分が、ダイクロイックミラー63を透過し、第1の波長域の成分が、ダイクロイックミラー63により、バリアフィルタ64bの方向に反射される。ダイクロイックミラー63を透過した観察光は、バリアフィルタ64aにより所定の第2の波長域の成分が透過され、レンズ65aにより平行光束とされ、PMT(photo multiplier tube:光電子増倍管)66aに入射する。また、バリアフィルタ64bの方向に反射された観察光は、バリアフィルタ64bにより第1の波長域の成分が透過され、レンズ65bにより平行光束とされ、PMT66bに入射する。
The observation light transmitted through the
PMT66a,66bは、それぞれ受光した観察光を検出し、その光量に応じた電圧の検出信号を図示せぬコントローラに供給する。なお、試料2に照射されるIRパルス光は、上述したように走査部42により走査されるので、PMT66a,66bは、試料2の観察面にわたる観察光を検出する。そして、図示せぬコントローラは、PMT66a,66bからの各電気信号に基づいて、試料2の観察画像を生成する。
Each of the
これに対して、可視光が励起光として用いられる場合、IRパルス光は、多光子励起による試料2の光刺激用として使用される。すなわち、IRパルス光により試料2の観察面が刺激された状態で、その観察面に可視光が照射されると、試料2からは蛍光が発現し、この蛍光は観察光となって、対物レンズ15を透過し、対物レンズ15により平行光束とされ、ダイクロイックミラー14を透過し、集光レンズ13によりいったん集光された後、瞳投影レンズ43により平行光束とされ、走査部42に入射する。そして、観察光は、走査部42によりデスキャンされ、ダイクロイックミラー41により集光レンズ44の方向に反射される。集光レンズ44の方向に反射された観察光は、対物レンズ15の焦点位置とほぼ共役な位置に設けられたピンホール45を通って、PMT46に入射する。
On the other hand, when visible light is used as excitation light, IR pulse light is used for light stimulation of the
PMT46は、受光した観察光を検出し、その光量に応じた電圧の検出信号を図示せぬコントローラに供給する。なお、試料2に照射される可視光は、上述したように走査部42により走査されるので、PMT46は、試料2の観察面にわたる観察光を検出する。そして、図示せぬコントローラは、PMT46からの電気信号に基づいて、試料2の観察画像を生成する。
The
このように、走査型顕微鏡1では、走査型多光子顕微鏡および走査型共焦点顕微鏡の両方として使用することができる。
Thus, the
なお、以下、IRカットフィルタ61aおよびIRカットフィルタ61bを、特に区別する必要がない場合、単に、IRカットフィルタ61と称する。
Hereinafter, the IR cut
図2は、走査型顕微鏡1を走査型多光子顕微鏡として用いる場合の観察光の光路の具体例を示す図である。
FIG. 2 is a diagram illustrating a specific example of the optical path of the observation light when the
対物レンズ15の光軸付近にある、試料2の観察面Sの点A1から発現された観察光L1は、対物レンズ15により平行光束とされ、対物レンズ15の瞳Pを通過し、ダイクロイックミラー14によりNDD17の方向に反射される。NDD17に入射した観察光L1は、ほぼ垂直な方向からIRカットフィルタ61aに入射し、IRカットフィルタ61aを透過した後、レンズ62により集光されながら、IRカットフィルタ61bを透過し、レンズ62の焦点面Fにおいて集光する。そして、観察光L1は、ダイクロイックミラー63により2方向に分岐され、ダイクロイックミラー63を透過した観察光は、バリアフィルタ64aを透過し、レンズ65aにより平行光束とされ、ほぼ垂直な方向からPMT66aに入射する。一方、ダイクロイックミラー63により反射された観察光L1は、バリアフィルタ64bを透過し、レンズ65bにより平行光束とされ、ほぼ垂直な方向からPMT66bに入射する。
The observation light L1 expressed from the point A1 on the observation surface S of the
また、対物レンズ15の光軸からずれた位置にある、試料2の観察面Sの点A2から発現された観察光L2は、観察光L1と同様にして、NDD17に入射する。NDD17に入射した観察光L2は、斜め方向からIRカットフィルタ61aに入射し、IRカットフィルタ61aを透過した後、レンズ62により集光されながら、IRカットフィルタ61bを透過し、レンズ62の焦点面Fにおいて集光する。そして、観察光L2は、ダイクロイックミラー63により2方向に分岐され、ダイクロイックミラー63を透過した観察光は、バリアフィルタ64aを透過し、レンズ65aにより平行光束とされ、斜め方向からPMT66aに入射する。一方、ダイクロイックミラー63により反射された観察光L2は、バリアフィルタ64bを透過し、レンズ65bにより平行光束とされ、斜め方向からPMT66bに入射する。
In addition, the observation light L2 expressed from the point A2 on the observation surface S of the
このように、走査型顕微鏡1を走査型多光子顕微鏡として使用する場合、観察光がデスキャンされないため、試料2の観察面Sにおいて観察光が発現する位置によって、NDD17の各部(IRカットフィルタ61a、IRカットフィルタ61b、PMT66a、PMT66bなど)への入射角が異なる。
Thus, when the
また、NDD17には、多光子励起に用いるIRパルス光の一部が、ノイズ光として入射する。例えば、対物レンズ15の瞳Pを通過したIRパルス光の一部が、試料2の上に載置されたカバーガラス(不図示)の界面や対物レンズ15により反射され、観察光とほぼ同じ光路を辿って、NDD17に入射する。NDD17に入射するIRパルス光の大部分は、この光路を辿る。
Further, part of the IR pulse light used for multiphoton excitation is incident on the
また、例えば、IRパルス光の一部が、対物レンズ15の瞳に入らずに、走査型顕微鏡1の鏡筒内で反射され、NDD17に入射する。そのほとんどは、対物レンズ15の瞳Pおよびその近傍を通過して、NDD17に入射する。
For example, a part of the IR pulse light does not enter the pupil of the
従って、NDD17に入射するIRパルス光(ノイズ光)は、ほぼ対物レンズ15の瞳Pを通過してNDD17に入射すると考えてよい。そして、ノイズ光のNDD17への入射角も、観察光と同様に様々な値をとる。
Therefore, it can be considered that the IR pulse light (noise light) incident on the
IRパルス光は、光出力が数Wに及ぶ強力なレーザ光であり、ノイズ光の光量は、試料2から発現される蛍光の光量と比較して決して弱くない。そのため、走査型顕微鏡1では、PMT66a,66bにノイズ光が入射するのを確実に防止するために、IRカットフィルタ61aおよびIRカットフィルタ61bの2枚のフィルタが設けられている。
The IR pulse light is a powerful laser light having an optical output of several W, and the amount of noise light is never weak compared to the amount of fluorescence expressed from the
ところで、一般的に光学フィルタの性能は、光線の入射角により異なる。図3は、IRカットフィルタ61の性能の一例を示している。なお、図内の横軸は波長を示し、縦軸はOD(Optical Density,光学濃度)を示している。また、図内の実線は、IRカットフィルタ61への光線の入射角が0度の場合の遮光特性を示し、点線は、入射角が45度の場合の遮光特性を示している。 By the way, in general, the performance of an optical filter varies depending on the incident angle of light. FIG. 3 shows an example of the performance of the IR cut filter 61. In the figure, the horizontal axis represents wavelength, and the vertical axis represents OD (Optical Density, optical density). In addition, the solid line in the figure indicates the light blocking characteristic when the incident angle of the light beam to the IR cut filter 61 is 0 degrees, and the dotted line indicates the light blocking characteristic when the incident angle is 45 degrees.
図3に示されるように、入射角により、IRカットフィルタ61の遮光特性、すなわち、遮蔽される光の波長域および透過光のOD値は大きく異なり、入射角が小さいほど、全体的にOD値が大きくなり、遮光率が向上する。図3の例では、特に、850mn以上の長波長域において、その傾向が顕著に現れている。 As shown in FIG. 3, the light shielding characteristics of the IR cut filter 61, that is, the wavelength range of the light to be shielded and the OD value of the transmitted light are greatly different depending on the incident angle. Becomes larger and the light shielding rate is improved. In the example of FIG. 3, the tendency is particularly prominent in a long wavelength region of 850 mn or more.
上述したように、ノイズ光のIRカットフィルタ61aへの入射角は様々であり、例えば、図2の観察光L1と同様に、IRカットフィルタ61aに対して垂直に入射するノイズ光については、IRカットフィルタ61aで十分に遮蔽することができる。一方、図2の観察光L2と同様に、IRカットフィルタ61aに対して斜めから入射するノイズ光については、その入射角によっては、IRカットフィルタ61aで十分に遮光できない可能性がある。そのため、走査型顕微鏡1では、IRカットフィルタ61aだけでなく、IRカットフィルタ61bを用いて、ノイズ光の除去を行っている。
As described above, the incident angle of the noise light to the IR cut
また、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bとの間に配置されているレンズ62により、IRカットフィルタ61aを透過するノイズ光のほとんどが屈折され、IRカットフィルタ61aへの入射角とIRカットフィルタ61bへの入射角とが異なるようになっている。従って、レンズ62を挟まずに、互いの遮光面が平行になるようにIRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bとを並べた場合と比較して、IRカットフィルタ61aを透過したノイズ光を、より確実にIRカットフィルタ61bにより遮蔽することができる。
Also, most of the noise light transmitted through the IR cut
ここで、図4乃至図7を参照して、レンズ62の設置位置の条件について考える。なお、図4は、対物レンズ15からレンズ62の焦点面Fまでの光路を、分かりやすくするために直線上に並べて示した図である。なお、図中、光束L11は、図2の観察光L1と同じ光路を進む光束を示しており、光束L12は、図2の観察光L2と同じ光路を進む光束を示している。また、以下、対物レンズ15の瞳Pとレンズ62との間の距離をdとし、レンズ62の焦点距離(図内のレンズ62と焦点面Fとの間の距離)をfとする。
Here, the conditions of the installation position of the
上述したように、例えば、ノイズ光が光束L11と同じ光路を進み、ほぼ垂直な方向からIRカットフィルタ61aに入射する場合、ノイズ光は、IRカットフィルタ61aにより十分遮蔽される。一方、ノイズ光が光束L12と同じ光路を進み、斜め方向からIRカットフィルタ61aに入射する場合、ノイズ光は、IRカットフィルタ61aにより遮蔽されずに透過する割合が増え、十分な遮光率を確保できない可能性がある。よって、以下、ノイズ光が光束L12と同じ光路を進む場合について考える。
As described above, for example, when noise light travels on the same optical path as the light beam L11 and enters the IR cut
まず、距離d=焦点距離fである場合、光束L12の主光線Lmは、レンズ62を透過することにより、レンズ62の光軸とほぼ平行になり、ほぼ垂直な方向からIRカットフィルタ61bに入射する。従って、この場合、IRカットフィルタ61aを透過したノイズ光が、IRカットフィルタ61bにより遮蔽される割合は最大となる。
First, when the distance d = focal length f, the principal ray Lm of the light beam L12 is transmitted through the
次に、焦点距離f<距離dである場合について考える。 Next, consider a case where the focal length f <the distance d.
まず、図5に示されるように、レンズ62の中心からの高さhの位置を通過する光線L21のIRカットフィルタ61aへの入射角(=対物レンズ15からの射出角=レンズ62への入射角)をθaとし、光線L21のIRカットフィルタ61bへの入射角(=レンズ62からの射出角)をθbとすると、入射角θaと入射角θbとの関係は、以下の式(1)により表される。
First, as shown in FIG. 5, the incident angle of the light ray L21 passing through the position of the height h from the center of the
なお、以下、図内の角度について、時計回りの方向を正の方向とし、反時計回りの方向を負の方向とする。従って、図5において、入射角θaは負の値となり、入射角θbは正の値となる。 Hereinafter, regarding the angles in the figure, the clockwise direction is defined as a positive direction, and the counterclockwise direction is defined as a negative direction. Accordingly, in FIG. 5, the incident angle θ a is a negative value, and the incident angle θ b is a positive value.
そして、以下の式(2)が成り立つとき、すなわち、入射角θbの大きさ(絶対値)が入射角θaの大きさ(絶対値)より小さいとき、光線L21と同じ光路を進み、IRカットフィルタ61aを透過したノイズ光は、IRカットフィルタ61bにより十分に遮蔽されると考えられる。
Then, when the following equation (2) holds, i.e., when the magnitude of the incident angle theta b (absolute value) is smaller than the size of the incident angle theta a (absolute value), the process proceeds along the same optical path as the light beam L21, IR The noise light transmitted through the
上述したように、NDD17に入射するノイズ光は、ほぼ対物レンズ15の瞳Pを通過すると考えてよい。従って、焦点距離fが距離dより短い場合に、ノイズ光のIRカットフィルタ61aへの入射角θaの大きさが最大になるのは、例えば、図6の光線L31のように、対物レンズ15の瞳Pの下端を通過し、レンズ62の有効径の上端を通過するときである。そして、入射角θaの大きさが最大のときに、式(2)が成り立つようにすれば、入射角θaの大きさに関わらず、IRカットフィルタ61aを透過したノイズ光を、IRカットフィルタ61bにより十分に遮蔽することができると考えられる。
As described above, it can be considered that the noise light incident on the
ここで、観察に推奨される対物レンズ15の瞳Pの半径をh1、レンズ62の有効径の半径をh2とし、入射角θaが小さく、θa≒tanθa=−(h1+h2)/dが成り立つとすると、図6の光線L31について、式(2)は以下の式(3)に変形することができる。
Here, the radius of the pupil P of the
そして、焦点距離fが左辺にくるように式(3)を整理すると、以下の式(4)となる。 Then, when formula (3) is arranged so that the focal length f is on the left side, the following formula (4) is obtained.
従って、焦点距離fが距離dより短い場合、距離dと焦点距離fとの関係が式(4)を満たすとき、IRカットフィルタ61aを透過したノイズ光を、IRカットフィルタ61bにより十分に遮蔽することができると考えられる。
Therefore, when the focal distance f is shorter than the distance d, when the relationship between the distance d and the focal distance f satisfies Expression (4), the noise light transmitted through the IR cut
次に、焦点距離f>距離dである場合について考える。この場合、レンズ62を透過した光が、レンズ62の焦点面Fにおいて、レンズ62の有効径以上の大きさで結像してしまうと、NDD17のサイズを大きくする必要が生じる。
Next, consider the case where the focal length f> the distance d. In this case, if the light transmitted through the
例えば、図7に示されるように、レンズ62の有効径の上端を通過する光束L41の焦点面Fにおける結像位置をxとし、結像位置xとレンズ62の光軸との間の距離をh3とすると、距離h3>レンズ62の有効径の半径h2となる場合に、NDD17のサイズを大きくする必要が生じる。これは、光束L41の上端の光線LuのIRカットフィルタ61bへの入射角θbが、0より小さくなる場合である。従って、焦点距離fが距離dより長い場合には、光線LuのIRカットフィルタ61bへの入射角θbが、以下の式(5)を満たすようにすればよい。すなわち、光線Luが、レンズ62を透過した後、図内の水平方向または斜め下方向に進むようにすればよい。
For example, as shown in FIG. 7, the imaging position on the focal plane F of the light beam L41 passing through the upper end of the effective diameter of the
なお、式(5)のθaは、光線LuのIRカットフィルタ61aへの入射角を表している。ここで、入射角θaが小さく、θa≒tanθa=−(h2−h1)/dが成り立つとすると、式(5)は以下の式(6)に変形することができる。
In the equation (5), θ a represents an incident angle of the light beam Lu to the IR cut
そして、焦点距離fが左辺にくるように式(6)を整理すると、以下の式(7)となる。 Then, when formula (6) is arranged so that the focal length f is on the left side, the following formula (7) is obtained.
以上の式(4)と式(7)を組み合わせると、以下の式(8)となる。 Combining the above equations (4) and (7) yields the following equation (8).
ここで、対物レンズ15の瞳Pの半径h1およびレンズ62の有効径の半径h2の代わりに、対物レンズ15の瞳径φ1およびレンズ62の有効径φ2を用いると、式(8)は以下の式(9)となる。
Here, when the pupil diameter φ1 of the
なお、対物レンズ15の瞳径φ1<レンズ62の有効径φ2(対物レンズ15の瞳Pの半径h1<レンズ62の有効径の半径h2)であるものとする。
It is assumed that the pupil diameter φ1 of the
従って、距離dと焦点距離fとの関係が、式(9)を満たす場合、NDD17のサイズを大きくすることなく、PMT66aおよびPMT66bへのノイズ光の入射を確実に防止することができる。
Therefore, when the relationship between the distance d and the focal length f satisfies the equation (9), it is possible to reliably prevent noise light from entering the
なお、式(9)を距離dについて整理すると、以下の式(10)となる。 In addition, when the formula (9) is arranged with respect to the distance d, the following formula (10) is obtained.
なお、以上に説明したレンズ62の設置条件は、その一例であり、例えば、IRカットフィルタ61の性能、レンズ62の性能など、さらに他のパラメータを考慮して、設置条件を求めるようにしてもよい。
The installation conditions for the
図8は、走査型顕微鏡1において、IRカットフィルタ61の設置条件を変えて遮光性能を比較した実験結果を示している。より具体的には、図8は、試料2の代わりに素ガラスを設置し、素ガラスにより反射されたIRレーザ光がNDD17に入射される状態で、IRカットフィルタ61aを1枚のみで使用したした場合、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bの間にレンズ62を挟まずに2枚重ねた場合、または、上述したようにIRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bの間にレンズ62を挟んだ場合のPMT66aの受光量を比較した結果を示している。
FIG. 8 shows the experimental results of comparing the light shielding performance in the
図8に示されるように、PMT66aの受光量は、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bの間にレンズ62を挟んだ場合が最も小さく、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bを2枚重ねた場合が次に小さく、IRカットフィルタ61aを1枚のみで使用した場合が最も大きくなっている。換言すれば、IRパルス光(ノイズ光)に対する遮光性能は、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bの間にレンズ62を挟んだ場合が最も高く、IRカットフィルタ61aを1枚のみで使用した場合が最も低くなる。特に、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bの間にレンズ62を挟んだ場合には、IRパルス光(ノイズ光)に対する遮光性能が劇的に向上していることが分かる。
As shown in FIG. 8, the amount of light received by the
以上の結果から、ただIRカットフィルタ61を2枚重ねて置くだけでなく、設置条件を工夫することにより、簡単にノイズ光に対する遮光性能を向上できることが分かる。 From the above results, it can be seen that not only two IR cut filters 61 are stacked, but also the light shielding performance against noise light can be easily improved by devising the installation conditions.
なお、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bの間にレンズ62を挟む以外にも、例えば、図9に示されるように、レンズ62の前に、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bを、互いの遮光面を傾けて配置するようにしてもよい。これにより、ノイズ光のIRカットフィルタ61aへの入射角とIRカットフィルタ61bへの入射角が異なるようになり、IRカットフィルタ61aを透過したノイズ光を、より確実にIRカットフィルタ61bにより遮蔽することが可能になる。
In addition to sandwiching the
なお、図9では、IRカットフィルタ61aの遮光面が、レンズ62の光軸に対して垂直になるように配置されているが、IRカットフィルタ61aではなくIRカットフィルタ61bの遮光面を、レンズ62の光軸に対して垂直になるように配置するようにしてもよい。また、IRカットフィルタ61aおよびIRカットフィルタ61bの両方とも、レンズ62の光軸に対して傾けて配置するようにしてもよい。
In FIG. 9, the light shielding surface of the IR cut
また、入射角に対する性能が互いに異なるように、IRカットフィルタ61aとIRカットフィルタ61bを選定するようにしてもよい。例えば、入射光を遮蔽できる遮光帯域がほぼ同じで、入射角に対する遮光特性が互いに異なるように(例えば、一方が、入射角が0度の光線に対する遮光率が最も高く、他方が、所定の斜め方向の入射角の光線に対する遮光率が最も高くなるように)、IRカットフィルタ61aおよびIRカットフィルタ61bを選定するようにしてもよい。これにより、IRカットフィルタ61aを透過したノイズ光を、より確実にIRカットフィルタ61bにより遮蔽することが可能になる。
Further, the IR cut
さらに、IRカットフィルタ61の枚数は2枚に限定されるものではなく、3枚以上用いるようにしてもよい。 Furthermore, the number of IR cut filters 61 is not limited to two, and three or more may be used.
また、レンズ62は、1枚のレンズにより実現するようにしてもよいし、複数のレンズ群により実現するようにしてもよい。
The
なお、本発明の実施の形態は、上述した実施の形態に限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々の変更が可能である。 The embodiment of the present invention is not limited to the above-described embodiment, and various modifications can be made without departing from the gist of the present invention.
1 走査型顕微鏡, 2 試料, 11 レーザ光源, 12 走査装置, 14 ダイクロイックミラー, 15 対物レンズ, 17 NDD, 61a,61b IRカットフィルタ, 62 レンズ, 65a,65b レンズ, 66a,66b PMT 1 scanning microscope, 2 samples, 11 laser light source, 12 scanning device, 14 dichroic mirror, 15 objective lens, 17 NDD, 61a, 61b IR cut filter, 62 lens, 65a, 65b lens, 66a, 66b PMT
Claims (6)
前記観察光を検出する前記検出手段までの前記観察光の光路上に、
前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第1の遮光手段と、
前記励起光と同じ波長域の光を遮蔽する特性を有し、かつ前記観察光を選択的に透過する特性を有しない第2の遮光手段と
を備え、
前記第1の遮光手段を透過し、前記第2の遮光手段に入射する前記励起光の少なくとも一部の前記第2の遮光手段への入射角が、前記第1の遮光手段への入射角とは異なるように構成されてなる
走査型顕微鏡。 In a scanning microscope that irradiates a sample while scanning excitation light capable of multiphoton excitation through a scanning unit, and detects the observation light emitted from the sample by the detection unit without scanning by the scanning unit,
On the optical path of the observation light to the detection means for detecting the observation light,
A first light shielding means having a property of shielding light in the same wavelength region as the excitation light and not having a property of selectively transmitting the observation light ;
A second light shielding means having a property of shielding light in the same wavelength range as the excitation light and not having a property of selectively transmitting the observation light ,
An incident angle of at least a part of the excitation light that passes through the first light shielding unit and enters the second light shielding unit is an incident angle to the first light shielding unit. Are differently configured scanning microscopes.
前記第1の遮光手段と前記第2の遮光手段との間に、前記第1の遮断手段を透過した光を集光するレンズを備える
請求項1に記載の走査型顕微鏡。 The first light shielding means and the second light shielding means have the same performance,
The scanning microscope according to claim 1, further comprising a lens that collects light transmitted through the first blocking unit between the first blocking unit and the second blocking unit.
請求項1に記載の走査型顕微鏡。 At least one light shielding surface of the light shielding surface of the first light shielding means and the light shielding surface of the second light shielding means is an optical axis of an optical system including the first light shielding means and the second light shielding means. The scanning microscope according to claim 1, wherein the scanning microscope is arranged to be inclined with respect to the scanning microscope.
請求項1に記載の走査型顕微鏡。 The scanning microscope according to claim 1, wherein the first light shielding unit and the second light shielding unit have substantially the same light shielding band and have different light shielding characteristics with respect to an incident angle.
請求項1乃至5のいずれか一項に記載の走査型顕微鏡。The scanning microscope according to any one of claims 1 to 5.
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